KR101883803B1

KR101883803B1 - 식물 및 식물 세포에서 알파-갈락토시다제의 발현용 핵산 작제물

Info

Publication number: KR101883803B1
Application number: KR1020137021693A
Authority: KR
Inventors: 아비도르 슐만; 우리 하나니아; 탈리 키즈너; 요셉 샤알티엘
Original assignee: 프로탈릭스 리미티드
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2018-07-31
Also published as: EP2665814B1; SI3272861T1; EP3272861A1; IL227552B; WO2012098537A8; JP2014506450A; CN103443270B; CY1122794T1; US9732333B2; KR20140015330A; US20130295065A1; JP5913372B2; BR112013018516B1; WO2012098537A1; IL227552A0; RS60129B1; CA2824791A1; CN103443270A; ES2774190T3; EP2665814A1

Abstract

핵산 발현 작제물이 제공되며, 더 상세하게는, 식물 세포에서 인간 알파-갈락토시다제를 발현하기 위한 핵산 작제물, 상기 핵산 작제물을 발현하고, 상기 인간 알파-갈락토시다제를 생산하는 세포, 및 이들의 용도가 제공된다.

Description

식물 및 식물 세포에서 알파-갈락토시다제의 발현용 핵산 작제물{Nucleic acid construct for expression of alpha-galactosidase in plants and plant cells}

본 발명은, 이의 특정 구체예에서, 핵산 발현 작제물에 관한 것이고, 전체 다 그런 것은 아니지만 상세하게는 식물 세포에서 α-갈락토시다제를 발현하기 위한 핵산 작제물, 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 세포는 상기 핵산 작제물과 인간 α-갈락토시다제를 발현한다.

파브리 병은 리소조말 효소 α-갈락토시다제 A (α-Gal A)의 활성 결핍에 의해 야기되는 X-염색체 관련 리소조말 축적 병이다. 전형적인 파브리 병 환자는 통상적으로 1 % 미만의 α-Gal A 활성을 가지며, 말단에서의 극심한 통증(말단지각이상증), 소한증, 각막 및 수정체 변화, 피부 병변 (혈관각화종), 신부전, 심혈관계 질환, 폐부전, 신경게 증상 및 뇌졸중을 위시한 많은 범위의 증상들을 나타낸다. 비정형 파브리 병에서, 잔존 효소 활성을 가지고 있는 개인은 노년에 증세를 나타내며, 그 증상들은 보통 하나 또는 몇 개 기관에 한정된다. 여성에서의 임상 증세들은 무작위적 X-염색체 불활성화 때문에 매우 크게 달라진다. 비록 보유자들이 공통적으로 일생에 거쳐 증상을 보이지 않더라도, 많은 사람들이 발병된 남성과 같이 다양하고 극심한 임상 증상을 나타낸다. 드 듀브 (De Duve)는 없어진 리소좀 효소를 외부의 생물학적 활성 효소로 대체하는 것이 리소조말 축적 병의 치료하는 데 실용적인 접근 방식이 될 수 있다는 것을 처음 제시하였다 [Fed Proc. 23:1045 (1964)].

효소 대체 요법용의 재조합 α-갈락토시다제 A는 곤충 (sf9) 세포 (참조 미국 특허 제 7,011,831호), 인간 섬유아세포 (참조 미국 특허 제6,395,884호) 및 식물 세포 (참조 미국 특허 제6,846,968 호 및 WO2008/132743)에서 생성되었다. 재조합 a-Gal A (아갈시다제 베타 [Fabrazyme®]: Genzyme Corporation, Cambridge, Mass; 아갈시다제 알파 [Replagal®]: Shire Human Genetic Therapies Corporation, Cambridge, Mass)를 사용한 임상 시험이 수행되었고, 상기 약물 둘 다는 임상 사용이 허가되었다. 2009년 현재, 2000 명 이상의 환자가 상기 두 제형 중 하나로 치료되었고, 일반적으로, 둘 다 안정성과 효능이 확인되었다 (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis. 2009;4:21).

임상 연구에 따르면, 상기 이용가능한 재조합 효소 조성물은 환자 내성, 면역성, 용법 섭생, 및 임상 효능에 있어서 다른 것으로 나타났다 (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis. 2009;4:21). 기존의 재조합 효소에 대한 다른 단점은 비용으로, 이는 건강 보험 시스템에 막재한 경제적 부담을 줄 수 있다. 포유 동물 세포 배양, 생물반은기 또는 곤충세포에서 생성시, 이러한 재조합 효소들의 높은 비용은 복잡한 정제 및 개질 방식, 및 기존 치료에 요구되는 상대적으로 많은 양의 치료제로부터 기인하는 것이다. 그러므로, α-갈락토시다제의 비용을 낮추어, 이러한 생명을 구하는 치료가 이를 원하는 모든 사람에게 허용되는 시급한 요구가 있다.

안정성, 바이러스 감염, 면역 반응, 생산율과 비용의 문제를 해결하기 위해, 인간 리소좀 효소들을 형질전환 (transgenic) 식물에서 생성할 수 있다. 미국 특허 번호 제 2002/0088024호는 쌀-아밀라제 ER 표적화 신호 펩타이드, 및 세포내로 효율적으로 발현하고 분비하는 C-말단 부분이 잘려진, 인간 α-갈락토시다제 암호화 서열을 사용하여, 재조합 인간 α-갈락토시다제를 식물 세포에서 발현하는 것을 교시하고 있다.

WO 97/10353는, 상처-유도 MeGA 프로모터 및 회수용 FLAG 태그를 사용하여, 식물에서 리소조말 효소, 특히, IDUA 및 글루코세레브로시다제를 생산하는 것을 설명하고 있다. WO 97/10353는 재조합 인간 α-갈락토시다제을 발현하는 특이적 작제물에 대한 지침을 제공하지 않고 있다.

크래머 (Cramer) 등 (Curr. Topics Trans. 1999 Plants 95-118)은 식물, 즉 담배잎의 세포 내막계 (IF)에서 글루코세레브로시다제 및 IDUA를 WO 97/10353에서와 유사한 방식으로 발현하는 방법을 검토하였고, 일반적인 식물 발현을 서술하였지만, 인간 재조합 α-갈락토시다제의 발현에 대한 지침을 제공하지 않고 있다.

미국 특허 번호 제 2006-0204487호에는, 효과적인 글리코실화 및 글리칸 리모델링 용의 재조합 폴리펩타이드 (특히, 글루코세레브로시다제)를 타겟하기 위한 다양한 전략을 사용하여 인간 리보조말 효소를 식물에서 발현하는 방법을 교시하고 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다제를 특정 작제물로부터 클로닝하고 발현시키는 것은 개시되어 있지 않다.

WO2007/010533는 재조합 생물활성 분자, 예를 들어, 인간 글루코세레브로시다제 및 인간 α-갈락토시다제와 같은 리소조말 효소를 발현시키는 식물 세포를 투여하는 것을 교시하고 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다제의 클로닝과 발현은 개시되어 있지 않다.

WO2008/132743는 인간 α-갈락토시다제 암호화 서열을 식물 발현 벡터로 클로닝하는 것과 이를 담배 식물에 발현하여, 생물학적 활성의 전장 글리코실화된 α-갈락토시다제 효소를 나타내고 이는 섬유아세포로 흡수된 것을 설명하고 있다. 그러나, 임상 조건 하에서 향상된 약동력학을 가지는 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 발현하고 생산하는 데 더 증가된 효율의 더욱 진전된 α-갈락토시다제 발현 벡터가 필요하다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 인간 α-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 애기장대 (Arabidopsis) ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 N-말단에서 번역적으로 용합되고 및 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 소포체 잔류 신호 펩타이드에 C-말단에서 번역적으로 융합되는 핵산 발현 작제물을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, N-말단 글리신 잔기를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질로서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질 소포체 잔류 신호 펩타이드에 C-말단에서 번역적으로 융합되는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 서열은 서열번호 22를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열은 서열번호 4에 설정되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 작제물은 서열번호 5에 설정된 소포체 표적화 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 소포체 잔류 신호 펩타이드는 서열번호 6에 설정되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 작제물은 서열번호 19에 설정된 소포체 잔류 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 서열은 서열번호 2에 설정된 서열을 가진다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 1에 설정된 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 서열의 코돈 용법은 니코티아 타바쿰 (Nicotinia tabaccum)에 최적화되어 있다.

본 발명의 특정 구체예의 특정 관점에 따라서, 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 분리된 세포를 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포는 인간 α-갈락토시다제 효소를 재조합적으로 생산한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제는 N-말단 글리신 잔기를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포는 식물세포이다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 식물세포는 담배 세포이다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 담배 세포는 BY-2 세포이다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 적어도 하나의 노출된 만노스 잔기를 가지도록 재조합적으로 생산된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 적어도 하나의 코어 β-(1,2) 자일로스 또는 적어도 하나의 코어 α-(1,3) 퓨코스 또는 둘 다를 가지도록 재조합적으로 생산된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산 작제물은 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 세포이다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 본 발명에 따른 세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 성장시켜 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성하는 단계; 및 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 상기 세포로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포는 세포 배양 배지에서 배양된 분리된 세포이다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 배양은 일회용 생물반응기에서 수행된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은, 서열번호 16에 설정된 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 활성 성분으로서 본 발명의 인간 α-갈락토시다제 단백질, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 활성성분으로서 본 발명의 세포, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 활성성분으로서 본 발명의 일 군의 인간 α-갈락토시다제 단백질들, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 일 군의 인간 α-갈락토시다제 단백질들의 주된 글리칸 구조들은 만노스 4-β-(1,2) 자일로스 (M4X); 만노스 3-β-(1,2) 자일로스-α-(1,3) 퓨코스 [Fc(3)M3X] 및 만노스 8 (M8)인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명의 약학적 조성물을 대상물에 투여하는 것을 포함하는, 파브리 병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 아홉개의 만노스 잔기를 포함하며 그 중 세 개 잔기가 노출된 글리칸 구조를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 아홉개 만노스 잔기를 포함하고, 그 중 세 개 잔기가 노출된 글리칸 구조를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질은 상기 조성물의 일군의 인간 α-갈락토시다제 단백질들의 0.5%, 0.8%, 1.0%, 1.3%, 2% 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 파브리병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 대상체에서 파브리 병의 치료용 의약물을 제조하는, 본 발명의 인간 α-갈락토시다제 단백질의 용도를 제공한다.

다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어들은 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자에 공통적으로 이해되는 바와 같은 의미를 지닌다. 비록 본 명세서에서 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법과 물질들이 본 발명의 구체예의 실제 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예증적인 방법 및/또는 물질들은 하기에 설명되어 있다. 모순되는 경우, 정의를 포함한 본 발명의 명세서는 조정될 것이다. 또한, 사용된 물질, 방법 및 실시예들은 설명하기 위한 것일 뿐이고, 필수적으로 제한하려고 의도된 것이 아니다.

본 발명의 특정 구체예는, 본 명세서에서, 첨부 도면을 참조하여 예증의 방식으로써 설명된다. 구체적으로 도면을 참조하면, 나타난 특정 상세점들은 예를 들기 위해, 및 본 발명의 실시예들을 예증적으로 설명하기 위한 것으로 강조된다. 이 점에 있어서, 도면에서 나타난 설명들은 본 발명의 실시예가 실행되는 방식을 당해분야의 숙련자들에게 명확하게 한다.

도 1은 본 발명의 핵산에 의해 암호화된 α-갈락토시다제 아미노산 서열(서열번호 1, 하부 서열), 및 천연 신호 리더 펩타이드(서열번호 3, 붉은 색으로 강조된)를 포함하는 천연 인간 α-갈락토시다제 단백질의 아미노산 서열(GenBank: X05790, 상부 서열)의 배열을 나타낸다. 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열 (서열번호 4)은 녹색으로 강조된다. SEKDEL 소포체 잔류 신호 펩타이드(서열번호 6)는 상기 식물-발현된 단백질의 C-말단에 위치한다. 성숙한 천연 α-갈락토시다제 효소 단백질 서열(서열번호 7)은 노란색으로 강조되어 있다.
도 2는 식물에서 다양한 인간 α-갈락토시다제 작제물의 발현 수준을 나타내는 SDS-PAGE 젤의 스캔 도면이다. 다양한 인간 α-갈락토시다제 작제물로 적용된 N. benthamaina 식물 잎의 추출물을 12% SDS-PAGE 환원 젤 상에서 분리하고, 쿠마시 블루로 염색하여 단백질을 가시화하였다. 레인 1= 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열(사과 펙티나제 신호 펩타이드=서열번호 9)을 가진 α-갈락토시다제를 암호화하는 작제물(서열번호8)의 발현 생성물. 레인 2= ABPI 소포체 표적화 신호 서열(ABPI 신호 펩타이드 = 서열번호 4)을 가진 α-갈락토시다제를 암호화하는, 서열번호 2의 발현 생성물. 레인 3= 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열(서열번호 9)을 가진 서열번호 12를 암호화하는 서열번호 11의 발현 생성물. 레인 4= 음성 (α-갈락토시다제 암호화 서열이 없는) 대조군. 레인 2 상의 특출난 밴드(화살표)는 성숙한 재조합 α-갈락토시다제 단량체 (서열번호 21)의 크기에 상응한다. 쿠마시 염색된 밴드는 풍부한 α-갈락토시다제 단백질을 나타낸다:
도 3은 다양한 인간 α-갈락토시다제 작제물을 발현하는 식물의 추출물에서 촉매 활성의 수준을 나타내는 히스토그램이다. 엔. 벤타마이나(N. benthamaina) 식물의 잎들로 다양한 인간 α-갈락토시다제 작제물을 하기와 같이 도입하였다: A= 서열번호 8, 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열(사과 펙티나제 신호 펩타이드 = 서열번호 9)을 가진 α-갈락토시다제 단백질을 암호화. B= 서열번호 2, ABPI 소포체 표적화 신호 서열(ABPI 신호 펩타이드 = 서열번호 4)을 가진 α-갈락토시다제 단백질을 암호화. C= 서열번호 13, 엔도키티나제 B 소포체 표적화 신호 서열(엔도키티나제 signal 단백질 = 서열번호 14)을 가진 α-갈락토시다제 단백질을 암호화. D= 서열번호 11, 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열(사과 펙티나제 신호 서열 = 서열번호 9)을 가진 α-갈락토시다제 단백질(서열번호 12)을 암호화. 각각의 식물의 잎을 활성 분석 완충액(activity assay buffer)에서 추출하였고, 촉매 활성을 p-니트로페닐알파-D-갈락토피라노시드(pNP-alpha-D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, 독일)를 가수분해 기질로서 사용하여 측정하였다. p-니트로페놀레이트 발색단의 생성은 405nm에서 감시하였다;
도 4는 인간 혈장 (37℃)에서 잔류 촉매 활성으로 측정한, 두 개 식물 재조합 인간 α-갈락토시다제의 안정성을 비교한 그래프이다. 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열을 가진 서열번호 12를 암호화하는 서열변호 11로 형질전환된 엔. 벤타마이나 식물 잎에서 얻은 α-갈락토시다제 (흰 사각형) 및 ABPI 소포체 표적화 신호 서열을 가지는 α-갈락토시다제 (서열번호 1)를 암호화화는 서열번호 2로 형질전환된 엔. 벤타마이나의 잎에서 얻은 α-갈락토시다제 (검은 사각형)를 식물 분쇄, 솔트 아웃, 및 크로마토그래피로 정제하고, 인간 혈장에서, 37℃에서 1 시간까지 항온처리하여 생체 내 약동력학을 모사 실험하였다. 샘플을 지정된 간격으로 PNP-G 분석하여 α-갈락토시다제 촉매 활성에 대하여 분석하였다. 서열번호 1을 발현하는 엔. 벤타마이나 식물의 잎에서 얻은 α-갈락토시다제 (검은 사각형)가 더 높은 안정성을 보이는 것에 주목하라;
도 5는 식물 세포 발현된 α-갈락토시다제 (검은 사각형)의 촉매 활성의 안정성을 인간 세포 배양물에서 발현된 상업적 인간 재조합 α-갈락토시다제 (Replagal®, 흰 삼각형)의 것과 비교한 그래프이다. ABPI 소포체 표적화 신호 서열을 가지는 α-갈락토시다제 (서열번호 1)를 암호화하는 서열번호 2를 발현하는 BY2 세포의 미정제 추출물 (검은 사각형) 및 포유 동물 세포 배양액에서 발현된 인간 재조합 α-갈락토시다제 (Replagal®, 흰 삼각형)를 혈장에서 37℃로 1 시간까지 항온처리하여 생체 내 약동학을 모사 실험하였다. 샘플을 지정된 간격으로, PNP-G 분석으로 α-갈락토시다제 촉매 활성에 대하여 분석하였다. 식물 세포 발현 및 인간 세포 발현 효소의 유사한 안정성에 주목하라;
도 6은 식물 발현된 α-갈락토시다제(검은 사각)와 인간 세포 배양액에서 발현된 상업적 인간 재조합 α-갈락토시다제(Replagal®, 흰 삼각형) 간의 촉매 활성의 안정성을 비교한 그래프이다. ABPI 소포체 표적화 신호 서열을 가지는 α-갈락토시다제(서열번호 1)를 암호화하는 서열번호 2을 발현하는 BY2 세포의 미정제 추출물(검은 사각) 및 포유 동물 세포 배양액에서 발현된 인간 재조합 α-갈락토시다제(Replagal®, 흰 삼각형)를 리소좀 환경 [산성 (Ph 4.6)]을 모사한 조건하에서 37℃에서 11일까지 항온처리하였다. 샘플을 항온처리시, 지정된 간격에서, PNP-G 분석으로 α-갈락토시다제 촉매 활성에 대해 분석하였다. 식물 발현된 및 포유동물 발형된 효소의 안정성은 9 일까지 유사한 것에 주목하라;
도 7은 식물 세포 발현된 α-갈락토시다제의 글리코실라제 분해 생성물에서 글리칸 구조물의 분포를 나타내는 크로마토그램이다. ABPI 소포체 표적화 신호 서열을 가지는 α-갈락토시다제(서열번호 1)를 암호화하는 서열번호 2를 발현하는 BY2 세포의 추출물 샘플을 환원시키고, 알킬화하고 SDS-PAGE에서 분리하였다. 단백질 밴드를 취하여 트립신 절단 후 PNGase A와 PNGase F 둘 다로 절단하는 글리칸 분석을 실시하였다. 결과로 나타난 자유 글리칸들을 추출하고, 정제하고, 형광 시약 안트라닐아미드 (2AB)로 표지하고, TSK 젤 Amide 80 표준 상(normal phase) HPLC를 이용하여 분리하고, 형광 검출기를 이용하여 검출하였다. 5.9 및 8.9GU (84.55 분과 108.05 분)에서의 주요 피크, 및 112.35에서 M9의 소 피크를 주목하라;
도 8은 글리칸 프로파일을 나타낸, 즉 식물 세포 발현된 α-갈락토시다제를 도 7의 크로마토그램에서 표시된 개별 글리칸들의 백분율 면적으로 나타낸, 표이다. 각 독립적 분석 (A와 B)의 동일한 프로파일에 주목하라.

본 발명은, 이의 특정 구체예에 따라, 식물세포에서 인간 α-갈락토시다제의 재조합 발현용 발현 벡터, 식물세포에서 이의 발현 방법, 및 이에 의해 생성된 인간 α-갈락토시다제에 관한 것이다.

본 발명은 그 적용에 있어서 하기 설명에서 설정되거나 실시예에 의해 예시된 특정 상세 사항에 필수적으로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명은 다른 구체예로 되거난 다양한 방식으로 실행되거나 실시될 수 있다.

본 발명자들은 식물 세포에서의 인간 α-갈락토시다제 재조합 발현용 발현 벡터를 수립하고, 담배 식물 및 식물 세포를 상기 벡터로 형질 전환시키고, 상기 식물과 세포 배양물로부터 촉매적으로 활성인 인간 α-갈락토시다제를 분리하였다. 상기 발현된 재조합 인간 α-갈락토시다제는 생체 내 투여시 정상적으로 맞닥뜨리는 상황을 모사한 조건 하에서 바람직한 촉매 활성을 보유하고 있었고, 이는 다른 식물에서 유도된 재조합 인간 α-갈락토시다제에 비해서 향상된 모의 약동학적 특성과, 포유동물에서 발현된 재조합 인간 α-갈락토시다제 (Replagal®)와 유사한 특성을 보인다.

따라서, 본 발명의 일 관점에 따라서, 핵산 발현 작제물로서, 인간 α-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 N-말단에서 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 번역적으로 융합되고 및 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합되는 핵산 발현 작제물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “인간 α-갈락토시다제 단백질”은 인간 a-갈락토시다제 A (a-D-갈락토시드 갈락토하이드롤라제; EC 3.2.1.22; a-Gal A) 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 성숙한 인간 α-갈락토시다제 단백질로서, 서열번호 7 (성숙 인간 A-Gal)에서 설정된 아미노산 서열을 가진다. 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호의 것과 다른 아미노산 서열을 가지는 개질된 인간 α-갈락토시다제 단백질일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 암호화된 개질된 인간 α-갈락토시다제 단백질의 비제한적 일예는 서열번호 16(G-A-Gal)이다. 다른 비제한적 예에서, 발현 벡터에 의해 암호화된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 16 또는 서열번호 21와 같이, N-말단 글리신 잔기 (G)를 가지는, 및 서열번호 7 및 서열번호 20과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, N-말단 글리신 잔기가 없는 α-갈락토시다제 단백질 둘 다를 포함하는 인간 α-갈락토시다제 단백질들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 N-말단에서 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 번역적으로 융합되고 상기인간 α-갈락토시다제 단백질은 또한 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “N-말단에서 번역적으로 융합되는” 또는 “ C-말단에서 번역적으로 융합되는”은 일반적으로 재조합 발현의 결과로서, 상기 성숙한 인간 α-갈락토시다제 단백질의 N-말단 또는 C-말단 아미노산에 지시된 펩타이드가 펩타이드 결합을 통해 공유결합적으로 부착되는 것을 뜻한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열”은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 옥신 결합 단백질 (Uni-Prot Accession No. P33487)의 리더 펩타이드 서열을 지칭하는 것으로, 이는 발현된 단백질을 식물 세포 내의 소포체로 지향할 수 있게 한다. 일 구체예에서, 상기 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열은 서열번호 4에 설정된 바와 같은 33 아미노산 폴리펩타이드이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 “소포체 잔류 신호 펩타이드”는 폴리펩타이드의 N- 또는C-말단에 존재할 때, 그 폴리펩타이드를 골지체로부터 회수하여 소포체에 남겨지게 하는 펩타이드 서열을 지칭한다 (참고 Rayon 등., Journal of Experimental Botany, Vol. 49, No. 326, pp. 1463-1472, 1998; 및 Neumann, 등 Annals of Botany, 2003;92:167-180). 일 구체예에서, 상기 소포체 잔류 신호 펩타이드는 KDEL (서열번호 17) 또는 SEKDEL (서열번호 6)이다. 다른 적절한 식물 소포체 신호들이 당해 분야에 공지되어 있다(참조 Pagny 등, Journal of Experimental Botany, Vol. 50, pp. 157-64).

따라서, 본 발명의 일 구체예에 따라서, N-말단에서 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 번역적으로 융합된 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질 및 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 1에 설정된 아미노산 서열을 가진다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “핵산 서열”은 단일 또는 이중 나선 핵산 서열을 지칭하는 것으로서, RNA 서열, 상보 폴리뉴클레오타이드 서열(cDNA), 게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오타이드 서열(예, 상기 것들의 조합)의 형태로 분리되고 제공되는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 “상보 폴리뉴클레오타이드 서열”은 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 메신저 RNA를 역전사한 결과 얻어진 서열을 지칭한다. 그러한 서열은 후속적으로 DNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관 내에서 증폭될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열”은 염색체로부터 유도된 (분리된) 서열을 지칭하며, 따라서, 염색체의 연속된 부분을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “복합 폴리뉴클레오타이드 서열”은 적어도 부분적으로 상보성이고 및 적어도 부분적으로 게놈성인, 서열을 지칭한다. 복합 서열은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 데 필요한 엑손성 서열들은 물론 이들 사이에 위치한 인트론성 서열을 포함할 수 있다. 상기 인트론성 서열들은 다른 유전자들을 포함한 임의 출처에서 유래될 수 있고, 전형적으로 보존된 스플라이싱 신호 서열들을 포함할 수 있다. 그러한 인트론성 서열들은 시스 작용 발현 조절 요소(regulatory element)를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 발현에 최적화되어 있다. 그러한 서열 개질의 예는, 목적하는 식물종에서 통상적으로 발견되는, 더 가깝게 접근하는 정도까지 변형된 G/C 함량 및 통상적으로 코돈 최적화로 불리우는, 식물종에서 비정형적으로 발견되는 코돈의 제거함을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, N-말단에서 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질 및 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 코돈 용법은 니코티아나 토바쿰(Nicotiana tobacuum) 또는 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)에 최적화되어 있다.

용어 “코돈 최적화”는 목적하는 식물 내에서의 코돈 용법에 접근되어 있는 구조 유전자 또는 이의 단편물 내에서 사용하기에 적절한 DNA 뉴클레오타이드를 선택하는 것을 지칭한다. 그러므로, 최적화된 유전자 또는 핵산 서열은 천연 또는 자연적으로 발생된 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 그 식물체 내에서 통계적으로 선호되거나 통계적으로 바람직한 코돈을 이용하도록 변형된 유전자를 지칭한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 통상 DNA 수준에서 확인되고, 식물종에서 발현되기에 최적화된 암호화 부위는 임의의, 예를 들어, Sardana 등(1996, Plant Cell Reports 15:677-681)에서 설명된 바와 같은 적절한 방식을 사용하여 결정된다. 이러한 방법에서, 코돈 용법의 표준 편차, 즉 코돈 용례 이탈의 범위는 고도로 발현된 식물 유전자들의 것에 상대적인 천연 유전자의 각 코돈 용법의 제곱 비례 편차를 발견한 후, 평균 제곱 편차를 계산함으로써 산정될 수 있다. 사용된 식은 다음과 같다: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, 여기서, Xn은 고도로 발현된 식물체에서 코돈의 용법 빈도 n을 나타내고, Yn은 목적 유전자에서 코돈 용법의 빈도 n을 지칭하며, N은 목적 유전자에서 코돈의 총 수를 나타낸다. 쌍자엽 식물의 고도로 발현된 유전자로부터 얻은 코돈 용법의 표는 Murray 등의 데이터(1989, Nuc Acids Res. 17:477-498)를 사용하여 수집된다.

특정 식물 세포 유형에 대한 바람직한 코돈 용법에 따른 핵산 서열을 최적화시키는 한 방법은 임의의 외부 통계적 계산을 수행하지 않고, 일본에서 NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) DNA 뱅크를 통해 코돈 용법 데이터베이스(Codon Usage Database)에서 온라인으로 제공해주는 것과 같은 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) or (dot) jp/codon/) 코돈 최적화 테이블을 직접 사용하는 것에 기반할 수 있다. 상기 코돈 용법 데이터베이스는 많은 상이한 종에 대한 코돈 용법 표를 포함하며, 각 코돈 용법 표는 Genbank에 있는 데이터에 기반하여 통계적으로 확인된 것이다.

상기 표들을 사용하여 특정 종 (예를 들어, 쌀)에서 각 아미노산에 대하여 가장 바람직한 또는 가장 선호되는 코돈을 결정함으로써, 목적의 단백질을 암호화하는 천연 발생 뉴클레오타이드 서열은 특정 식물 종의 것에 코돈 최적화될 수 있다. 이것은, 특정 종에서 낮은 통계적 발생을 가지는 코돈을, 하나의 아미노산에 관하여, 통계적으로 더욱 선호되는 상응하는 코돈과 치환함으로써 실행된다. 그러나, 하나 이상의 덜 선호되는 코돈을 선택하여 존재하는 제한 부위를 삭제하거나, 잠재적으로 유용한 접점에서 새로운 것을 창출하거나(5’ 및 3’ 말단에서 신호 펩타이드나 종결 카세트를 첨가하고, 내부 위치는 같이 세그먼트를 절단하고 스플라이스 하는 데 사용하여 정확한 전장 서열을 생성할 수 있다), 또는 mRNA 안정성 또는 발현에 부정적으로 영향을 끼치는 뉴클레오타이드 서열들을 제거할 수 있다.

바람직한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 이미, 임의의 개질 전에, 특정 식물 종에서 통계적으로 선호도는 코돈에 상응하는 많은 코돈들을 포함할 수 있다. 그러므로, 천연 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화는, 특정 식물체에 대하여, 바람직한 뉴클레오타이드 서열 내에서 어느 코돈이 통계적으로 선호되지 않는 것인지를 결정하는 것, 및 특정 식물체의 코돈 용법 표에 따라 이러한 코돈들을 개질하여 코돈 최적화 유도물을 생성하는 것을 포함한다. 개질된 뉴클레오타이드 서열은, 상기 개질된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질이 상응하는 천연 발생 또는 천연 유전자에 의해 암호화된 단백질보다 더 높은 수준에서 생성된다면, 식물 코돈 용법에 완전히 또는 부분적으로 최적화된 것이다. 코돈 용법을 변경함으로써 합성 유전자를 제작하는 것은 PCT 특허 출원 제93/07278호에 설명되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 18에 설정된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 본 발명의 다른 구체예에 따라서, 상기 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열은 서열번호 5에 설정된 바와 같은 핵산 서열에 의해 암호화된다. 본 발명의 다른 구체예에 따라서, 상기 소포체 잔류 신호 펩타이드는 서열번호 19에 설정된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 본 발명의 다른 구체예에 따라서, 상기 N-말단에서 애기장대 ABPI 소포체 표적화 신호 서열에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질 및 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 2에 설정된 핵산 서열에 의해 암호화된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “핵산 발현 작제물”은 본 발명의 특정 구체예의 핵산(예, 서열번호 2), 및 숙주 식물 세포에서 핵산의 전사를 지시하는 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다. 더 자세한 적합한 형질전환 방법은 하기에 제공된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 본 발명의 핵산 서열, 및 식물 숙주 세포에서 상기 핵산 서열의 전사를 지시하는 프로모터 포함하는 핵산 발현 작제물을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.

암호화 핵산 서열은, 조절 서열이 그에 연결된 암호화 서열 상에서 조절 효과를 작동할 수 있다면, 조절 서열(예, 프로모터)에 “작동가능하게 연결”된다.

임의의 적합한 프로모터 서열은 본 발명의 핵산 작제물에 의해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 조직-특이성 또는 유도성 프로모터이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “식물 발현성”은 거기에 첨가되거나 포함된 임의의 조절 인자를 포함하는 프로모터 서열을 지칭하는 것으로, 식물 세포, 조직 또는 기관, 바람직하게는 단자엽 또는 쌍자엽 식물세포, 조직 또는 기관에서 발현을 적어도 유도, 부여, 활성화 또는 향상시킬 수 있다. 그러한 프로모터들은 구성적일 수, 예를 들어, 다수 조직에서 고도의 유전자 발현을 지시할 수 있는 것이거나, 조직 특이성, 예를 들어, 특정 조직 또는 조직에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 것이거나, 유도성, 예를 들어, 자극하에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 것이거나, 또는 키메릭(chimeric), 예를 들어 적어도 두 개 상이한 프로모터의 부분으로 형성된 것이다.

본 발명의 구체예의 방법에 유용한 바람직한 프로모터의 예는 표 I, II, III 및 IV에 제시되어 있다.

본 발명의 구체예를 수행하는 데 사용되는 구성성 프로모터의 예

*유전차 출처*	*발현 양상*	*참조문헌*
액틴	구성성	McElroy 등, Plant Cell, 2: 163-171, 1990
CAMV 35S	구성성	Odell 등, Nature, 313: 810-812, 1985
CaMV 19S	구성성	Nilsson 등., Physiol. Plant 100:456-462, 1997
GOS2	구성성	de Pater 등, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992
유비퀴틴	구성성	Christensen 등, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
쌀 사이클필린	구성성	Bucholz 등, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994
Maize H3 히스톤	구성성	Lepetit 등, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992
액틴 2	구성성	An 등, Plant J. 10(1);107-121, 1996

본 발명의 구체예를 수행하는 데 사용되는 씨드(seed) 선호 프로모터의 예

*유전차 출처*	*발현 양상*	*참조문헌*
씨 특이성 유전자	씨앗	Simon, 등., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, etal.,J.Biol.Chem.262:12202,1987.;Baszczynski,등., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
브라질 너트 알부민	씨앗	Pearson' 등., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992.
레구민	씨앗	Ellis, 등.Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988
글루텔린 (쌀)	씨앗	Takaiwa, 등., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, 등., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987
제인	씨앗	Matzke 등 Plant Mol Biol, 143).323-32 1990
napA	씨앗	Stalberg, 등, Planta 199: 515-519, 1996
밀 LMW 및 HMW, 글루테닌-1	내배유	Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2,
밀 SPA	씨앗	Albani 등, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997
밀 a, b 및 g 글리아딘류	내배유	EMBO3:1409-15, 1984
보리 ltrl 프로모터	내배유
보리 B1, C, D 호르다인	내배유	Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996
보리 DOF	내배유	Mena 등, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998
Biz2	내배유	EP99106056.7
합성 프로모터	내배유	Vicente-Carbajosa 등., Plant J. 13: 629-640, 1998
쌀 프롤라민 NRP33	내배유	Wu 등, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998
쌀-글로불린 Glb-1	내배유	Wu 등, Plant Cell Physiology 398) 885-889, 1998
쌀 OSH1	배	Sato 등, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122
쌀 알파-글로불린 REB/OHP-1	내배유	Nakase 등. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997
쌀 ADP-글루코스 PP	내배유	Trans Res 6:157-68, 1997
옥수수 ESR 유전자 군	내배유	Plant J 12:235-46, 1997
수수 감마-카피린	내배유	PMB 32:1029-35, 1996
KNOX	배	Postma-Haarsma 등, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999
쌀 올레오신	배 및 알루톤	Wu 등, J. Biochem., 123:386, 1998
해바라기 올레오신	씨앗 (배 및 마른 씨앗)	Cummins, 등, Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992

본 발명의 구체예를 수행하는 데 사용되는 꽃 특이성 프로모터의 예

*유전차 출처*	*발현 양상*	*참조문헌*
AtPRP4	꽃	www.salus. medium.edu/m mg/tierney/html
chalene synthase (chsA)	꽃	Van der Meer, 등., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990.
LAT52	꽃밥	Twell 등 Mol. Gen Genet. 217:240-245 (1989)
apetala- 3	꽃

본 발명의 구체예를 수행하는 데 사용되는 대안적 쌀 프로모터

*PRO* #	*유전자*	발현
PR00001	메탈로티오네인 Mte	배 + 유합조직의 전달층
PR00005	추정된 베타-아밀라제	배의 전달 층
PR00009	추정된 셀룰로즈 신타제	뿌리에서 약하게
PR00012	리파제 (추정)
PR00014	트란스퍼라제 (추정)
PR00016	펩티딜 시스-트란스 이소머라제 (추정)
PR00019	미정
PR00020	prp 단백질 (추정)
PR00029	노듈린(noduline) (추정)
PR00058	프로테아제 저해체 Rgpi9	씨앗
PR00061	베아 엑스판신 EXPB9	어린 꽃에서 약하게
PR00063	구조l단백질	어린 조직+유합조직+배
PR00069	자일로시다제 (추정)
PR00075	프롤라민 10Kda	내배유에서 강하게
PR00076	알레르겐 RA2	내배유에서 강하게
PR00077	프롤라민 RP7	내배유에서 강하게
PR00078	CBP80
PR00079	전분 분지 효소 I
PR00080	메탈로티오네인-유사 ML2	배 + 유합조직의 전달층
PR00081	추정된 카페오일-CoA 3-0 메틸트란스퍼라제	새싹순
PR00087	프롤라민 RM9	내배유에서 강하게
PR00090	프롤라민 RP6	내배유에서 강하게
PR00091	프롤라민 RP5	내배유에서 강하게
PR00092	알레르겐 RA5
PR00095	추정된 메티오인 아미노펩티다제	배
PR00098	ras-관련 GTP 결합 단백질
PR00104	베타 엑스판신 EXPB1
PR00105	글리신이 풍부한 단백질
PR00108	메탈로티오네인 유사 단백질 (추정)
PR00110	RCc3 강한 뿌리
PR00111	우클라시아닌 3-유사 단백질	약한 분별 중심/ 줄기 생장점
PR00116	26S 프로테아좀 조절 입자 비-ATPase 서브유닛 11	매우 약한 분역조직 특이성
PR00117	추정된 40S 리보좀 단백질	내배유에서 약하게
PR00122	엽록소 a/lo-결합 단백질 전구체 (Cab27)	새순에서 매우 약하게
PR00123	추정된 원엽록소 리덕타제	잎에서 강하게
PR00126	메탈로티오네인 RiCMT	강한 분별 중심 줄기 생장점
PR00129	GOS2	강함, 구성적
PR00131	GOS9
PR00133	키티나제 Cht-3	매우 약함, 생장점 특이적
PR00135	알파-글로불린	내배유에서 강하게
PR00136	알라닌 아미노트란스퍼라제	내배유에서 약하게
PR00138	사이클린 A2
PR00139	사이클린 D2
PR00140	사이클린 D3
PR00141	사이클로필린 2	새싹과 씨앗
PR00146	수크로즈 신타제 SS1 (보리)	배지, 구성적
PR00147	트립신 저해체 ITR1 (보리)	내배유에서 약하게
PR00149	인트론을 가진 유비퀴틴 2	강함, 구성적
PR00151	WSI18	배 및 스트레스
PR00156	HVA22 유사체 (추정)
PR00157	EL2
PR00169	아쿠아포린	어린 식물에서 배지 구성적
PR00170	고도의 이동 군 단백질	강한 구성성
PR00171	가역적으로 글리코실화된 단백질 RGP1	약한 구성성
PR00173	세포질 MDH	새싹
PR00175	RAB21	배 및 스트레스
PR00176	CDPK7
PR00177	Cdc2-1	생장점에서 매우 약하게
PR00197	수크로스 신타제 3
PRO0198	OsVP1
PRO0200	OSH1	어린 나무 생장점에서 매우 약하게
PRO0208	추정된 클로로필라제
PRO0210	OsNRT1
PRO0211	EXP3
PRO0216	포스페이트 트랜스포터 OjPT1
PRO0218	올레오신 18kd	호분 + 배
PRO0219	인트론없는 유비퀴틴 2
PRO0220	RFL
PRO0221	옥수수 UBI 델타 인트론	미검출
PRO0223	글루텔린-1
PRO0224	프롤라민 RP6 프로모터의 단편물
PRO0225	4xABRE
PRO0226	글루텔린 OSGLUA3
PRO0227	BLZ-2_단편 (보리)
PR00228	BLZ-2_장편g (보리)

특정 구체예에 따라서, 본 발명에서 유용한 프로모터는 형질전환 후 작제물 삽입체의 과발현이 수행되는 강한 구성성 프로모터이다. 특정 구체예에서, 상기 프로모터는 애기장대 액틴 2 (ACT2) 프로모터이다 (수탁 번호: U41998, 상기 표 I 참조).

본 발명의 특정 구체예의 핵산 작제물은 적절한 선택성 마커 및/또는 복제 시점을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 따라서, 사용된 핵산 작제물은 셔틀벡터이고, 이는 E. coli (여기서 상기 작제물은 적절한 선택적 마커 및 복제 시점을 포함하는)에서 번식할 수 있고, 및 세포에서 번식될 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 작제물은, 예를 들어, 플라스미드, 바크미드(bacmid), 파지미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다.

본 발명의 특정 구체예의 핵산 작제물은 식물 세포를 안정적으로 또는 일시적으로 형질전화시키는 데 사용될 수 있다. 안정한 형질전환에서, 상기 핵산은 식물 게놈에 통합되며, 그러한 것으로서, 안정한 및 유전적인 특성을 나타낸다. 일시적 형질전환에서, 외부 폴리뉴클레오타이드는 형질전환된 세포에 의해 발현되지만, 게놈상으로 통합되지 않고, 그러한 것으로 일시적인 특성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 특정 관점에 따라서, 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 분리된 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “분리된 세포”는 자연적인 환경으로부터, 예를 들어, 식물로부터 적어도 부분적으로 분리된 세포를 지칭한다. 특정 구체예에서, 상기 분리된 세포는 전체 식물의 식물 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 분리된 세포는 식물 세포, 예를 들어, 배양중인 식물 세포이다.

용어 “식물”은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 전체 식물, 식물의 조상 및 자손, 및 씨앗, 싹, 줄기, 뿌리 (괴경 포함), 및 식물 세포, 조직 및 기관을 포함하는 식물 부분을 망라한다. 상기 식물은 현탁 배양액, 배아, 분열조직 부위, 유합 조직, 잎, 배우체, 포자체(sporophytes), 꽃가루, 및 소포자를 포함하는 임의의 형태로 있을 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물들은 녹색식물 문에 속하는 모든 식물을 포함하고, 특히, 아카시아 종, 에이서 종., 개다래 종., 칠엽수 spp., 아가티스 아우스트랄리스(Agathis australis), 알비키아 아마라 (Albizia amara), 알소필라 트리칼라 (Alsophila tricolor), 안드로포곤 종(Andropogon spp)., 아라키스(Arachis) 종, 아레카 카테추 (Areca catechu), 아스텔리아 프라그란스 (Astelia fragrans), 아스트라갈루스 사이서 (Astragalus cicer), 바익카아에아 프루리주다 (Baikiaea plurijuga), 베툴라 종, 브라시카 종, 부루구이에라 김노리자 (Bruguiera gymnorrhiza), 부르케아 아프리카나 (Burkea Africana), 부테아 프론도사 (Butea frondosa), 카다바 파리노사 (Cadaba farinose), 칼라안드라 (Calliandra) 종, 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis), 칸나 인디카 (Canna indica), 카피시컴 (Capsicum) 종, 카시아 (Cassia) 종, 센트로에마 푸베센스 (Centroema pubescens), 카쿠멜레스 (Chacoomeles) 종, 신나모뭄 카시아 (Cinnamomum cassia), 코페아 아라비카 (Coffea arabica), 콜로포스페르뭄 모파네 (Colophospermum mopane), 코로닐리아 바리아 (Coronillia varia), 코토에아스터 세로티나 (Cotoneaster serotina), 크라타에구스 (Crataegus) 종, 쿠쿠미스(Cucumis) 종, 쿠프레수스 (Cupressus) 종, 시아테아 데알바타 (Cyathea dealbata), 시도니나 오브롱가(Cydonia oblonga), 크립토메리아 자포니카 (Cryptomeria japonica), 심보포곤 (Cymbopogon) 종, 신테아 데알바타 (Cynthea dealbata), 신도니아 오블롱가 (Cydonia oblonga), 달베르기아 몬네타리아 (Dalbergia monetaria), 다발리아 디바리카타 (Davallia divaricata), 데스모디움 (Desmodium) 종, 딕소니아 스쿠알로사 (Dicksonia squarosa), 디베테로포곤 암플렉텐스 (Dibeteropogon amplectens), 디오클레아 (Dioclea) 종, 돌리코스 (Dolichos) 종, 도리크니움 렉툼 (Dorycnium rectum), 에티노클로아 피라미달리스 (Echinochloa pyramidalis), 엔라피아 (Ehraffia) 종, 엘레우신 코라카나 (Eleusine coracana), 에라그레스티스 (Eragrestis) 종, 에리스리나 (Erythrina) 종, 유칼립푸스 (Eucalypfus) 종, 유클레아 스킴페리 (Euclea schimperi), 유랄리아 비/로사 (Eulalia vi/losa), 파고피룸 (Pagopyrum) 종, 페이조아 셀로우라나 (Feijoa sellowlana), 프라가리아 (Fragaria) 종, 플레밍기아 (Flemingia) 종, 프레이시네티아 반크슬리 (Freycinetia banksli), 게나니움 투베르기 (Geranium thunbergii), 진아고 빌로바 (GinAgo biloba), 글리신 자반니카 (Glycine javanica), 글리리시디아 (Gliricidia) 종, 고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum), 글레빌레아 (Grevillea) 종, 구이보르티아 콜레스페르마 (Guibourtia coleosperma), 헤디사룸 (Hedysarum) 종, 헤마피아 알티시마 (Hemaffhia altissima), 헤테로포곤 콘포푸스 (Heteropogon contoffus), 호르데움 불라레 (Hordeum vulgare), 히파레니아 루파 (Hyparrhenia rufa), 하이페리쿰 에렉툼(Hypericum erectum), 하이페펠리아 이솔루테 (Hypeffhelia dissolute), 인디고 인카마타 (Indigo incamata) 이리스 (Iris) 종, 렙타레나 피롤리폴리아 (Leptarrhena pyrolifolia), 레프페디자 (Lespediza) 종, 레투카 (Lettuca) 종, 레우카에나 루코세팔라 (Leucaena leucocephala), 로우데티아 심플렉스 (Loudetia simplex), 로투누스 바이네슬리 (Lotonus bainesli), 루투스 (Lotus) 종, 마크로틸로마 악실라레 (Macrotyloma axillare), 말루스 (Malus) 종, 마니호트 에스쿨렌타 (Manihot esculenta), 메티카고 살리바 (Medicago saliva), 메타세쿠오이아 글립토스트로보이데스 (Metasequoia glyptostroboides), 무사 사피엔툼 (Musa sapientum), 니코티아눔 (Nicotianum) 종, 오노브라키스 (Onobrychis) 종, 오르니토푸스 (Ornithopus) 종, 오리자 (Oryza) 종, 펠토푸룸 아프리카눔 (Peltophorum africanum), 페니세툼 (Pennisetum) 종, 페르세아 그라티시마 (Persea gratissima), 페투니아 (Petunia) 종, 파세올루스 (Phaseolus) 종, 페닉스 카나리엔시스 (Phoenix canariensis), 포르미움 쿠키아눔 (Phormium cookianum), 포티아나 (Photinia) 종, 피세아 글라우카 (Picea glauca), 피누스 (Pinus) 종, 피섬 사티밤 (Pisum sativam), 포도카르푸스 토타라 (Podocarpus totara), 포곤나르트리아 프렉키(Pogonarthria fleckii), 포고나프리아 스쿠아로사 (Pogonaffhria squarrosa), 포풀루스 (Populus) 종, 프로소피스 시네라리아 (Prosopis cineraria), 수도추가 멘지에시 (Pseudotsuga menziesii), 프테로로비웅 스텔라툼 (Pterolobium stellatum), 피루스 콤무니스 (Pyrus communis), 쿠에르쿠스 (Quercus) 종, 라피올렙시스 움벨라타 (Rhaphiolepsis umbellate), 로팔로스틸리스 사피다 (Rhopalostylis sapida), 루스 나탈렌시스 (Rhus natalensis), 리베스 그로술라리아 (Ribes grossularia), 리베스(Ribes) 종, 로비나아 수도아카시아 (Robinia pseudoacacia), 로사(Rosa) 종, 루부스 (Rubus) 종, 살릭스 (Salix) 종, 스키카키리움 산구이네움 (Schyzachyrium sanguineum), 스시아도피티스 베피실라타 (Sciadopitys vefficillata), 세쿠올이아 셈페르비렌스 (Sequoia sempervirens), 세쿠오이아덴드론 기간테움 (Sequoiadendron giganteum), 소르굼 비콜라 (Sorghum bicolor), 스피나시아 (Spinacia) 종, 스포로볼루스 핌브리아투스 (Sporobolus fimbriatus), 스티부루스 알로쿠로이데스 (Stiburus alopecuroides), 스틸로산토스 후밀리스 (Stylosanthos humilis), 타데하기 (Tadehagi) 종, 탁소디움 디스티쿰 (Taxodium distichum), 템메다 트리안드라 (Themeda triandra), 트리폴리움 (Trifolium) 종, 트리티쿰 (Triticum) 종, 추가 헤테로필라 (Tsuga heterophylla), 바시니움 (Vaccinium) 종, 비시아 (Vicia) 종, 비티스 비니페라 (Vitis vinifera), 오타소니아 피라미다타 (Watsonia pyramidata), 잔테데스키아 아에티오피카 (Zantedeschia aethiopica), 제아 마이스 (Zea mays), 아마란스, 아티초크, 아스파라거스, 브로콜리, 브루셀 싹, 양배추, 카놀라, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 콜라드 그린스, 아마, 케일, 편두, 오일 평지씨, 오크라, 양파, 감자, 쌀, 대두, 딸기, 사탕 무우, 사탕 수수, 해바라기, 토마토, 스쿼시 차, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 땅콩, 완두, 렌즈통과 알팔파, 면, 평지씨, 카놀라, 후추, 해바라기, 담배, 가지, 유칼립투스, 나무, 관상수, 다년생 풀, 및 마초 작물을 포함하는 목록으로부터 선택된 여물 콩과 식물, 관상용 식물, 식량 작물, 나무, 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 대안적으로 조류(algae) 및 다른 비녹색식물문을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 식물 또는 식물 세포는 쌀, 옥수수, 밀, 보리, 땅콩, 감자, 참깨, 올리브 나무, 팜유, 바나나, 대두, 해바라기, 카놀라, 사탕수수, 알팔파, 수수, 콩과식물 (콩, 땅콩), 아마, 루피너스, 평지씨, 담패, 포플러, 및 면과 같은, 작물 식물 또는 작물 식물의 세포이다.

다른 구체예에 따라서, 상기 식물 세포들은 담배 세포, 아그로박테리움 리조제네스 형질전환된 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 고추냉이 세포 및 당근 세포를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 담배 세포는 니코티아나 타바쿰 (니코티아나 타바쿰) L. cv Bright Yellow (BY-2) 세포 (Nagata 등, Int Rev Cytol 1992; 132:1-30)와 같은 담배 세포 주로부터 유래되지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 식물 세포들은 고체 표면 상에서의 배양 (예를 들어, 플라스틱 배양 용기 또는 플레이트와 같은) 또는 현탁액 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적절한 배양 방법의 임의의 형태에 따라 배양될 수 있다. BY-2 및 당근 세포와 같은 특정 세포는 현탁액으로 배양하고 성장될 수 있다는 것에 주목한다. 현탁액으로 식물세포를 배양하는 적절한 장비와 방법은 당해 분야에, 예를 들어, 국제 특허 출원 PCT WO98/13469, WO2005/080544 및 WO2007/010533 호에 설명된 바와 같이 공지되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포들은 니코티아나 벤타미아나를 포함하나 이에 한정되지 않는 전체 담배 식물의 세포 또는 식물 조직이다.

단자엽 및 쌍자엽 식물 둘 다로 외부 유전자를 도입하는 여러 방법들이 있다 (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto 등., Nature (1989) 338:274-276).

외부 DNA를 식물 게놈성 DNA로 안정적으로 통합하게 하는 주요 방법들은 두 가지 주된 방식을 포함한다:

(i)아그로박테리움-매개 유전자 전달: Klee 등. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

(ii)직접적인 DNA 흡수: Paszkowski 등., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; DNA를 원형질로 직접 흡수 하는 방법, Toriyama, K. 등. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. 식물 세포를 간단히 전기 쇼크 함으로써 DNA 흡수를 유도: Zhang 등. Plant cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm 등. Nature (1986) 319:791-793. 입자 충격으로써 식물 세포 또는 조직으로 DNA 주입, Klein 등. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe 등. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; 마이크로피펫을 사용하는 것으로서: Neuhaus 등., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; 세포 배양물, 배아, 또는 유합조직의 유리 섬유 또는 실리콘 카바이드 휘스커 형질 전환, 미국 특허 제 5,464,765 호 또는 DNA를 발아 화분과 직접 배양함, DeWet 등. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

아그로박테리움 시스템은 식물 게놈성 DNA로 통합되는 일정한 DNA 세그먼트를 포함하는 플라스미드 벡터의 사용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종과 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 달라진다. 다양하게 사용된 방식은 전체 식물 분화를 개시하는 데 좋은 원천을 제공하는 임의의 식물 외식편을 사용하여 수행될 수 있는 잎 디스크 방법이다. 참조, 예, Horsch 등. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. 다른 방법은 아그로박테리움 전달 시스템과 진공 침윤을 병행 사용한다. 상기 아그로박테리움 시스템은 특히 형질 전환 쌍자엽 식물을 창출하는 데 유용하다.

식물 세포로 DNA를 직접 전달하는 다양한 방법이 있다. 전기천공법에서는, 원형질은 강한 전기장에 잠시 노출시킨다. 미세 주입법에서는, 매우 작은 마이크로피펩을 사용하여 DNA를 세포로 직접적으로 기계적으로 주입시킨다. 미세입자 충돌법에서, DNA는 황산 마그네슘 결정 또는 텅스텐 입자와 같은 미세 투사물 상에 흡수되고, 상기 미세 투사물은 물리적으로 세포 또는 식물 조직으로 가속 도입된다.

안정한 형질 전환 후에, 식물 증식을 실행한다. 식물 증식의 가장 공통적인 방법은 씨앗에 의한 것이다. 씨앗 증식에 의핸 재생은 그러나, 씨앗이 멘델 법칙에 지배를 받는 유전적 다양성에 따라 식물에 의해 생성되는 관계로, 이형접합성으로 인해, 작물의 균일성이 없다는 결점을 가진다. 기본적으로, 각 씨앗은 유전적으로 다르고, 각각은 그 자신의 특수한 특징을 가지고 성장할 것이다. 따라서, 재생된 식물이 부모 형질전환 식물과 동일한 특징과 특성을 가지도록 형질전환된 식물이 생성되게 하는 것이 바람직하다. 그러므로, 형질전환된 식물은 미세증식으로 재생되어, 형질전환된 식물의 빠르고, 일치된 재생을 제공하는 것이 바람직하다.

미세증식은 선택된 부모 식물 또는 경작물로부터 절취된 단일 조직 편으로부터 새로운 세대의 식물을 성장시키는 방법이다. 이러한 방법은 상기 융합 단백질을 발현하는 바람직한 조직을 가지는 식물을 대량 생산할 수 있게 한다. 생성된 신세대 식물은 원 식물과 유전적으로 동일하고 그 특성 모두를 가진다. 미세증식법은 단기간 내에 양질의 식물 물질을 대량 생산할 수 있게 하고, 원래의 형질 전환 또는 형질변형된 식물의 특성을 보존하면서 선택된 재배물을 빠르게 증식시킬 수 있게 한다. 클로닝 식물의 장점은 식물 증식의 속도와, 생산된 식물의 질과 균일성이다.

미세증식법은 다단계 방법으로서 단계 사이에 배양 배지 또는 성장 조건의 변경을 요한다. 따라서, 미세증식법은 4개 기본 단계를 포함한다: 단계 1, 처음 조직 배양; 단계 2, 조직 배양 증식; 단계 3, 분화 및 식물 형성; 및 단계 4, 온실 재배 및 단련. 단계 1의 시초 조직 재배 동안, 조직 배양이 확립되고 오염물이 없는 것으로 확인된다. 단계 2 동안, 시초 조직 배양물은 총분한 수의 조직 샘플이 생산되어 생산 목표가 달성될 때까지 증식된다. 단계 3 동안에는, 단계 2에서 성장한 조직 샘플을 개별 식물체로 나누어 성장시킨다. 단계 4에서, 형질전환된 식물체를 단련시키기 위해 온실로 옮겨 여기서, 식물체의 빛에 대한 내성이 서서히 증가하여 자연적 환경에서도 성장할 수 있게 된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 형질전환 식물은 잎 세포, 분열조직 세포 또는 전체 식물의 일시적 형질전환에 의해서 발생된다.

일시적 형질전환은 전술한 직접적인 DNA 전달 방법 중 임의의 것 또는 변형된 식물 바이러스를 사용한 바이러스성 감염에 의해 실행될 수 있다.

식물 숙주의 형질 전환에 유용한 것으로 나타난 바이러스들은 CaMV, 담배 모자이크 바이러스(TMV), 브롬(brome) 모자이크 바이러스(BMV) 및 콩 공통(Bean Common) 모자이크 바이러스(BV 또는 BCMV)를 포함한다. 식물 바이러스들을 사용한 식물의 형질전환은 미국 특허 제 4,855,237호(빈 골든 모자이크 바이러스; BGV), EP-A 67,553(TMV), 일본 공개 출원 제63-14693호(TMV), EPA 194,809(BV), EPA 278,667(BV); 및 Gluzman, Y. 등., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988)에 설명되어 있다. 식물을 포함한 많은 숙주에서 외부 DNA를 발현시키는 데 사용되는 슈도바이러스 입자들은 WO 87/06261에 설명되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 일시적 형질전환에 사용된 바이러스는 비독성이고, 따라서, 감소된 성장율, 모자이크, 윤문병, 잎말이병, 황변, 줄무늬병, 발진 형성, 종양 형성, 및 점식 (pitting)과 같은 심각한 증상을 야기할 수 없다. 적절한 비독성 바이러스는 자연 발생적 비독성 바이러스 또는 인공적으로 약독화된 바이러스일 수 있다. 바이러스 약독화는 부치명적 (sub-lethal) 가열, 화학 처리를 또는 예를 들어, Kurihara and Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on 등. (1992), Atreya 등. (1992) and Huet 등. (1994)에 의해 설명된 바와 같은 직접적인 돌연변이화 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 발명을 사용하여 수행될 수 있다.

적절한 바이러스 균주들은 예를 들어, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)과 같은 이용가능한 출처로부터 또는 감염된 식물로부터 분리함으로써 얻어질 수 있다. 감염된 식물 조직으로부터 바이러스를 분리하는 것은, 예를 들어, Foster and Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology (humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998에서 설명된 바와 같이, 당해 분야에서 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 간략히, 고농도의 적절한 바이러스를 함유하는 것으로 믿어지는 감염된 식물의 조직, 바람직하게는 어린 잎과 꽃받침을 완충액(예, 인산 완충액)에 갈아서 바이러스 감염된 즙을 만들고 이는 후속적인 접종에 사용될 수 있다.

식물에서 비-바이러스성 핵산 서열을 도입하고 발현시키기 위한 식물 RNA 바이러스의 제조는 상기 참조문헌은 물론 Dawson, W. O. 등, Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu 등. EMBO J. (1987) 6:307-311; French 등. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu 등. FEBS Letters (1990) 269:73-76; 및 미국 특허 번호 제 5,316,931호에 의해 확인된다.

상기 바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 바이러스 자체를 적절히 개질시킬 수 있다. 또는, 상기 바이러스를 외부 DNA로 바람직한 바이러스성 벡터를 제작하는 데 쉬운 세균성 플라스미드로 먼저 클론할 수 있다. 다음 상기 바이러스를 플라스미드로부터 추출한다. 상기 바이러스가 DNA 바이러스일 경우, 세균성 복제 시점을 상기 바이러스 DNA에 부착하여 이를 세균에 의해 복제한다. 이러한 DNA를 전사 및 번역함으로써 바이러스 DNA를 감싸는 코트 단백질을 생산할 것이다. 상기 바이러스가 RNA 바이러스인 경우, 상기 바이러스를 통상 cDNA로서 클론하여 플라스미드에 삽입시킨다. 다음, 상기 플라스미드를 사용하여 모든 작제물을 만든다. 다음, 상기 RNA 바이러스는, 상기 플라스미드의 바이러스 서열을 전사하고 이 바이러스 유전자를 번역하여 코트 단백질을 생성하고 이는 바이러스 RNA를 감쌈으로써 생성된다.

일 구체예에서, 상기 천연 코트 단백질 암호화 서열이 비천연 식물 바이러스성 코트 단백질 암호화 서열인 바이러스성 폴리뉴클레오타이드로부터 제거되고, 및 비천연 프로모터, 바람직하게는, 식물 숙주세포에서 발현할 수 있고, 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드를 패킹할 수 있고, 및 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드에 의해 숙주에 대한 전신적 감염을 확고히 할 수 있는, 비천연적 코트 단백질을 암호화하는 서열의 게놈하위성(subgenomic) 프로모터가 삽입된, 식물 바이러스 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 대안적으로, 상기 코트 단백질 유전자는 그 내부에 비천연적 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입시킴으로써 불활성화될 수 있어, 단백질이 생성된다. 상기 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 추가 비천연적 게놈하위성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 각각의 비천연적 게놈하위성 프로모터는 식물 숙주에서 인접한 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열들을 전사 또는 발현할 수 있고 서로 및 천연 게놈하위성 프로모터들과 재조합할 수 없다. 비천연 (외부) 폴리뉴클레오타이드 서열들은, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열이 포함된다면, 천연 식물 바이러스성 게놈하위성 프로모터 또는 천연 및 비천연 식물 바이러스성 게놈하위성 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다. 상기 비천연 폴리뉴클레오타이드 서열들이 게놈하위성 프로모터의 제어하에서, 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 소정의 생성물을 생성한다.

제 2 구체예에서, 비천연 코트 단백질 암호화 서열 대신에, 상기 천연 코트 단백질 암호화 서열을 비천연 코트 단백질 게놈하위성 프로모터 중 하나에 인접하게 위치시키는 것을 제외하고 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드를 제1 구체예와 같이 제공한다.

제3 구체예에서, 상기 천연 코트 단백질 유전자가 그 게놈하위성 프로모터에 인접되고, 하나 이상의 비천연 게놈하위성 프로모터가 상기 바이러스성 폴리뉴클레오타이드로 삽입된 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 삽입된 비천연 게놈하위성 프로모터는 식물 숙주에서 인접 유전자를 전사하거나 발현할 수 있고 서로 그리고 천연 게놈하위성 프로모터들과 재조합할 수 없다. 비천연 폴리뉴클레오타이드 서열을 비천연 게놈하위성 식물 바이러스성 프로모터들에 인접하게 삽입하여 상기 서열들이 게놈하위성 프로모터의 제어하에서 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 원하는 생성물을 만들 수 있다.

제4 구체예에서, 상기 천연 코트 단백질 암호화 서열이 비천연 코트 단백질 암호화 서열에 의해 대체된 것을 제외하고는, 제3 구체예에서와 같이, 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 바이러스성 벡터들은 상기 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 코트 단백질에 의해 막으로 둘러싸여 재조합 식물 바이러스를 생성한다. 상기 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 식물 바이러스를 사용하여 적절한 숙주 식물을 감염시킨다. 상기 재조합 식물 바이러스성 폴리뉴클레오타이드는 숙주에서, 복제될 수 있고, 전신적으로 확산되며, 외부 유전자(들) (외인성 폴리뉴클레오타이드)를 전사 또는 발현할 수 있어 원하는 단백질을 생성한다.

바이러스를 식물에 접종하는 기술은 Foster and Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology(Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, New York, 1985; and Kado and Agrawa, eds. “Principles and Techniques in Plant Virology”, Van Nostrand-Reinhold, New York에서 찾아볼 수 있다.

이에 더하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 엽록체 게놈으로 도입되어 엽록체 발현을 가능하게 한다.

외부 핵산 서열을 엽록체의 게놈에 도입하는 기술은 공지되어 있다. 이러한 기술은 하기 과정을 포함한다. 먼저, 식물 세포를 화학적으로 처리하여 세포당 엽록체의 수를 약 하나로 감소시킨다. 다음, 적어도 하나의 외부 폴리뉴클레오타이드 분자를 엽록체로 도입할 목적으로 외부 폴리뉴클레오타이드를 입자 충돌법으로 세포내로 도입한다. 외부 폴리뉴클레오타이드를 선택하여 동종 재조합을 통해 엽록체 게놈으로 통합되도록 하고, 이는 엽록체에 내재되어 있는 효소에 의해 용이하게 수행된다. 이를 위해, 상기 핵산 서열은, 목적의 유전자 외에, 엽록체 게놈으로부터 유도된 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함한다. 또한, 상기 외부 폴리뉴클레오타이드는 선택성 마커를 포함하며, 이는 순차적인 선택 과정으로써, 그러한 선택 후에 엽록체 게놈의 복사물 모두 또는 거의 모두가 상기 외부 폴리뉴클레오타이드를 포함하게 되는 것을 확인하는 데 사용된다. 이러한 기술과 관련된 추가적인 상세한 사항들은, 본 명세서에 참조로 통합되어 있는 미국 특허 번호 제 4,945,050호; 및 5,693,507호에서 발견된다. 폴리펩타이드는 따라서, 엽록체의 단백질 발현 시스템에 의해 생성될 수 있고, 및 엽록체의 내막으로 통합될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 방법은 상기 색산을 발현하는 식물 세포를 성장시키는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 식물 세포는 전체 식물체의 부분으로서, 또는 식물 세포 배양물에서 성장될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 식물 세포는 생물 반응기에서 무균 현탁 배양으로 성장될 수 있다. 본 발명의 식물 세포 현탁 배양에 적합한 생물 반응기 및 식물 세포를 현탁 배양으로 성장시키는 방법은 자세히 설명되어 있고, 이중에서도, 미국 특허 번호 제 6,391,638호와 7,951,557호, 및 PCT WO98/13469, WO2005/080544, WO2007/010533, WO2008/135991 및 WO2008/132743에 설명되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 전적으로 설정되어 있는 것처럼, 참조로서 본 명세서에 통합되어 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하기 위해, 핵산 서열을 발현하는 식물체 또는 식물 배양물을 포함한다. 일단 식물 세포나 전체 식물에 내에서 발현되면, 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 인간 α-갈락토시다제 단백질의 수준은 활성 분석, 인간 α-갈락토시다제 단백질을 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하는 웨스턴 블랏, 효소-연계 면역 흡수 측정법 (ELISA), 방사면역측정법 (RIA), 면역조직화학법, 면역세포화학법, 면역형광법 등과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

핵산 서열로부터 전사된 RNA의 식물체 내에서의 수준을 결정하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 노던 블랏 분석, 역전사 폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR) 분석 (정량적, 반-정량적, 또는 실시간 RT-PCR 포함) 및 RNA-인 시튜 하이브리드화를 포함한다.

본 발명의 발현된 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 글리칸 분석하면 상기 폴리펩타이드가 식물 세포에서 글리코실화되어, 이는 노출된 만노즈 및 식물 특이성 글리칸 잔기를 가지는 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성함을 나타내고 있다(참조 하기 실시예 IV). 따라서, 본 발명의 특정 구체예에 따라서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 적어도 하나, 임의로 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개, 또는 임의로 적어도 네 개 이상의 코어 β-(1,2) 자일로스 잔기를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 적어도 하나, 임의로 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개 또는 임의로 적어도 네 개 이상의 코어α-(1,3) 푸코스 잔기를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 적어도 하나, 임의로 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개, 또는 임의로 적어도 네 개 이상의 말단 β(1-2)N 아세틸글루코사민을 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 적어도 하나, 임의로 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개, 또는 임의로 적어도 네 개 이상의 노출된 만노스 잔기를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성한다. 특정 일 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 아홉개의 만노스 잔기(M9)를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성하며, 이 중 적어도 하나, 임의로 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개는 노출된 만노스 잔기이다. 일 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포는 적어도 하나의 노출된 만노스 잔기, 적어도 하나의 코어 β-(1,2) 자일로스 잔기 및 적어도 하나의 α-(1,3) 푸코스 잔기를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성한다.

또한, 본 발명의 특정 구체예에 따라서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포에 의해 생성된 복수개의 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자들을 포함하는 조성물을 제공하는 데, 여기서, 상기 복수개의 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자들의 가장 주된 글리칸 구조들은 만노스 3-β-(1,2) 자일로스-α-(1,3) 푸코스 [Fc(3)M3X] 및/또는 만노스 4-β-(1,2) 자일로스 (M4X); 및 만노스 8 (M8)이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 글리칸 구조체들, 만노스 3-β-(1,2) 자일로스-α-(1,3) 푸코스 [Fc(3)M3X] 및/또는 만노스 4-β-(1,2) 자일로스 (M4X)는 복수개로 있는 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자의 프로파일 중에서 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 70%, 약 80%를 포함하고, 상기 글리칸 구조 만노스 8(M8)은 상기 복수개로 있는 분자의 프로파일 중 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% or 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 70%, 약 80%를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포에 의해 생성된 복수개의 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자를 포함하는 바, 상기 복수개의 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자들은 아홉개 만노스 잔기의 글리칸 구조를 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질 분자의 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6 %, 약 0.7 %, 약 0.8 %, 약 0.9 %, 약 1.0 %, 약 1.1 %, 약 1.2 %, 약 1.3 %, 약 1.4 %, 약 1.5 %, 약 1.75 %, 약 2.0 %, 약 2.5 %, 약 3.0 %, 약 3.5 %, 약 4.0 %, 약 4.5 %, 약 5.0 % 이상을 포함하며, 이들 중 적어도 하나, 임의로, 적어도 두 개, 임의로 적어도 세 개는 노출된 만노스 잔기이다.

본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포에 의해 생성된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 천연 인간 α-갈락토시다제 효소의 것과 동일한 α-갈락토시다제 촉매 활성을 가지는 것으로 나타났다. 본 발명의 재조합 α-갈락토시다제를, 효소 대체 요법을 위해 투여될 때의 효소의 생체 내 환경을 모사한 조건에 노출시키면, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포에 의해 생성된 인간 α-갈락토시다제 단백질이 포유동물 세포에서 발현된 재조합 인간 α-갈락토시다제 (Replagal®)의 것과 유사한 약동력학 특성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다(실시예 3 및 도 2와 3을 참조하라).

따라서, 본 발명의 발현 벡터를 발현하는 세포에 의해 생성된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 약학적 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 대상체에서 파브리병의 치료와 예방에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 인간 α-갈락토시다제 단백질을 발현하는 세포는 대상체에서 파브리 병을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 인간 단백질을 재조합적으로 발현하는 식물세포의 제조 및 투여 방법은 당해 분야에, 예를 들어, Shaaltiel 등의 PCT WO2007/010533에 공지되어 있다.

따라서, 본 발명의 다른 관점에 따라서, C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질을 활성성분으로서, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 N-말단 글리신 잔기를 가진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 16에 설정된 아미노산 서열을 가진다. 특정 구체예에서, 상기 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 21에 설정된 아미노산을 가진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, a “약학적 조성물”은 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 활성 성분과 생리적으로 적합한 담체 및 부형제와의 제조물을 지칭한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.

여기서, 용어 “활성 성분”은 생물학적 효과를 담당하는 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 지칭한다.

이후, 서로 교환하여 사용할 수 있는 용어 “생리적 허용 담체” 및 “약학적 허용 담체”는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐지하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 보조제 (adjuvant)는 이러한 용어에 속한다.

본 명세서에서, 용어 “부형제”는 약학적 조성물에 첨가되어 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다. 제한없는 부형제의 예는 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 다양한 당류, 및 전분류, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름, 및 폴리에틸렌 글리콜류를 포함한다.

약물의 제형 및 투여 기술은 “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾아볼 수 있고, 이는 참조로써 본 명세서에 기입된다.

적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비강, 장내, 또는 비경구 전달을 포함할 수 있고, 근육내, 피하, 및 골수내 주사는 물론 척추강내, 직접적 심실내, 심장내, 예를 들어, 우 또는 좌심실강내로, 관상동맥내로, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 포함한다.

중추신경계 (CNS)로의 약물 전달에 대한 통상적인 방법은: 신경외과 전략(예, 뇌내 주사 또는 뇌심실내 주입); BBB의 내재적인 전달 경로들 중 하나를 개발하기 위한 일환으로서 약제의 분자적 조작(예, 내막 세포 표면 분자에 친화력을 가지는 전달 펩타이드를, 그 자체로는 BBB를 통과할 수 없는 제제와 조합하여 포함하는 키메라성 융합 단백질의 생산); 제제의 지질 용해성을 높이도록 고안된 약학적 전략(예, 수용성 제제를 지질 또는 콜레스테롤 담체와 접합); 및 고장력 파괴에 의한 BBB의 온전성에 대한 일시적 파괴(만니톨 용액을 목동맥으로 주입 또는 안지오텐신 펩타이드와 같은 생물학적 활성 제제의 사용으로부터 결과된)를 포함한다. 그러나, 이러한 전략들 각각은, 침습적 외과 과정과 연계된 내재적인 위험, 내부 전달 시스템에 내재된 제한에 의해 부과되는 크기 제한, CNS의 외부에서는 활성적일 수 있는 담체 모티프로 구성된 키메라성 분자의 전신적 투여와 관련된 잠재적으로 원하지 않는 생물학적 부작용, 및 BBB가 파괴된 뇌의 부위 내에서 뇌 손상의 있음직한 위험으로 이는 최적 전달 방법이 아니게 하는 것과 같은 한계를 가진다.

대안적으로, 상기 약학적 조성물을 전신적 방식이 아닌 국소적으로, 예를 들어, 약학적 조성물을 환자의 조직 부위로 직접 주사하는 것을 통해서 투여할 수 있다.

용어 “조직”은 기능 또는 기능들을 수행하도록 고안된 세포들로 구성된 유기체의 부분을 지칭한다. 예를 들면, 뇌조직, 망막, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 뼈, 연골, 접합 조직, 피 조직, 근육 조직, 심장 조직, 뇌 조직, 혈관 조직, 신장 조직, 폐 조직, 생식 조직, 조혈 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 특정 구체예의 약학적 조성물들은 당해 분야에 공지된 공정으로, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용애, 과립화, 당의정 만들기, 가루화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 과정의 방식으로 제조할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라 사용된 약학적 조성물은 따라서 약학적으로 사용될 수 있게 되는 제조물로 활성성분을 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제와 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적 허용 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.

주사의 경우, 상기 약학적 조성물의 활성 성분은 수용액으로, 바람직하게는, 행크액, 링거 액 또는 생리염 완충액과 같은 생리적 양립 완충액에서 제형화될 수 있다. 경점막 투여를 위해서, 침투될 장애물에 적절한 침투제를 제형에 사용한다. 그러한 침투제는 일반적으로 당해분야에 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 상기 활성 성분은 조건적으로 본 발명에 따른 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생성하는 전체 세포의 투여를 통해서 제형화될 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 상기 활성 성분 및/또는 상기 세포를 공지된 약학적 허용 담체와 조합하여 약학적 조성물을 생성함으로써 제형화될 수 있다. 그러한 담체들은 상기 세포 및/또는 약학적 조성물이 정제, 알약, 당의정 중심물 (dragee core), 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액, 등으로서 환자에 의해 경구 섭취 용으로서 제형화될 수 있게 한다. 경구 투여용으로 사용시, 전체 세포 및 세포 분획은 미가공 또는 가공된 것으로 (예, 동결건조, 동결, 건조, 등)으로 사용될 수 있다.

경구용의 약학적 제제들은 고형 부형제를 사용하여, 조건적으로는, 필요시 적절한 보조제를 첨가한 후 결과된 혼합물을 갈고 및 과립 혼합물을 가공하여 정제나 당의 중심물을 얻음으로써 제조될 수 있다. 적절한 부형제는 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류와 같은 충전제; 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카보메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 제조물; 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 생리적 허용 중합체이다. 필요시, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알진산, 또는 소듐 알지네이트와 같은 염과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다.

당의정 중심물을 적절한 코팅물이 제공될 수 있다. 이를 위해, 조건적으로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 산화 티타늄, 락커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는 농축된 당용액을 사용할 수 있다. 색소 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가하여 확인하기 위해 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합들을 특정화할 수 있다.

경구적으로 사용할 수 있는 약학적 조성물들은 젤라틴으로 만든 압입 캡슐은 물론, 젤라틴 및, 글리세롤이나 소르비톨과 같은 가소제로 만든, 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 압입 캡슐은 활성 성분을, 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 조건적으로 안정화제와 혼합하여 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 상기 활성 성분은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜류와 같은 적절한 액체에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구용의 모든 제형은 선택된 투여 경로에 적합한 용량으로 있어야 한다.

부칼 투여의 경우, 상기 조성물은 통상적으로 만든 정제나 로젠지의 형태일 수 있다.

비강 흡입에 의한 투여용으로, 본 발명의 특정 구체예에 따른 용도의 활성 성분은, 압축된 팩이나 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로, 적절한 추진체, 예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하여 편리하게 전달될 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계측된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 캡슐 및 디스펜서에서 사용하기 위한, 예를들어 젤라틴의 카트리지는 화합물 및 락토즈나 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 분막 혼합물을 포함하는 것으로 제형화될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 약학적 조성물은 비경구 투여용, 예, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 용량 형태, 예, 앰퓰, 또는 조건적으로 첨가된 방부제를 가진 다용량 용기의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 오일성이나 수성 담체의 에멀전일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다.

비경구 투여용의 약학적 조성물은 수용해성 형태로 있는 활성성분 제조물의 수용액을 포함한다. 또한, 상기 활성 성분의 현탁액은 적절한 기름 또는 물 기반 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매나 담체들은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올리에이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 조건적으로, 상기 현탁액은 또한 활성 성분의 용해도를 높여 고도의 농축 용액을 제조할 수 있게 하는 적절한 안정화제 또는 제제를 포함할 수 있다.

대안적으로, 상기 활성 성분은 사용 전에 적절한 담체, 예, 멸균, 무발열물질(pyrogen-free) 수성 기반 용액과 구성되는 분말 형태로 있을 수 있다.

본 발명의 특정 구체예의 약학적 조성물은 또한 좌약 또는 정체 관장약과 같이, 코코아 버터나 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제를 사용하여 직장 조성물로 제형화될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예의 맥락에 사용하는 데 적합한 약학적 조성물들은 상기 활성 성분들이 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 포함되는 조성물을 포함한다. 더 상세하게는, 치료적 유효량은 병(예, 파브리병)의 증상을 예방하고, 약화시키고 또는 개선시키거나, 또는 치료되는 대상물의 생존을 연장하는 데 효과적인 활성 성분(α-갈락토시다제)의 양을 뜻한다.

치료적 유효량의 결정은 특히 본 명세서에서 제공된 상세 내용에 비추어 당해분야의 숙련자의 능력 안에 있다.

본 발명의 방법에 사용된 임의의 제조물에 대해, 상기 치료적 유효량 또는 용량은 처음에는 시험관 내 및 세포 배양 분석법에서 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 원하는 농도나 역가를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에서 설명된 상기 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관 내, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 단계에 의해 결정될 수 있다. 이러한 시험관내 및 세포 배양 분석과 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하는 용도의 용량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 용량은 사용된 용법 형태 및 이용된 투여 경로에 의존하여 변화할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 감한하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예컨대, Fingl, 등., 1975, in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1을 참조하라).

투여 용량 및 간격은 생물학적 효과를 유도하거나 억제하는 데 충분한, 활성 성분의 혈청 및 세포 수준 (최소 효과 농도, MEC)을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각 제조물에 대하여 변할 수 있지만, 시험관 내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 용량은 개별 특성과 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 분석법을 사용하여 혈중 농도를 결정할 수 있다.

치료될 상태의 심각성과 응답성에 의존하여, 투약하는 것은 단회 또는 복수회 투여일 수 있고, 치료 기간은 수일 내지 수 주 또는 치료가 수행되거나 질병 상태의 감소가 완수될 때까지 지속된다.

투여될 조성물의 양은, 물론, 치료될 대상체, 병의 심각성, 투여 방식, 처치의의 판단 등에 의존하게 될 것이다.

본 발명의 특정 구체예의 조성물은, 필요시, FDA 승인 키트와 같이, 상기 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 용량 형태를 포함할 수 있는 팩이나 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 상기 팩은, 금속 또는 예를 들어, 블리스터 팩과 같이 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 지침서가 동반될 수 있다. 상기 팩이나 디스펜서는 또한 용기에 붙어있는, 약품의 제조, 사용 또는 판매를 관장하는 정부기관에 의해 발행된 형태로 게시문이 제공될 수 있는 데, 상기 게시문은 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 대한 기관의 승인을 나타낸다. 그러한 게시문은, 예를 들어, 미국 식약청에서 승인된 라벨의 형태로서, 약물의 처방에 대한 것이거나 또는 승인된 생산품의 삽입물 형태일 수 있다. 양립할 수 있는 약학 담체로 제형된 본 발명의 제조물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적당한 용기에 수납하고, 및 전술한 바대로 지정된 상태의 치료에 대한 라벨을 붙일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 필요한 대상체에 파브리병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점에 따라서, 필요한 대상체에 파브리병을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에, 활성성분으로서 C-말단에서 소포체 잔류 신호 펩타이드에 번역적으로 융합된 인간 α-갈락토시다제 단백질, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학적 조성물의 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 N-말단 글리신 잔기를 가진다. 다른 구체예에서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 16에 설정된 아미노산 서열을 가진다.

용어 “치료”는 병리(질병, 장애 또는 상태)의 발달을 저해하고, 예방하고 또는 정지시키는 것 및/또는 병리의 감소, 후퇴 또는 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 당해분야의 숙련자는 다양한 방법론과 분석법을 사용하여 병리의 발달을 산정하고, 유사하게, 다양한 방법론과 분석법을 사용하여 병리의 감소, 후퇴 또는 퇴행을 산정할 수 있다는 것을 이해한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “예방”은 병에 대해 위험이 있지만, 아직 병을 가지는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 병, 장애 또는 상태가 일어나지 않도록 유지하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “대상체”는 포유동물, 바람직하게는 병에 걸릴 수 있는 임의의 나이의 인간을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 용어는 상기 병리를 발전시킬 위험이 있는 개인을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료 섭생법”은 필요한 대상체(예컨대, 병을 가진 것으로 진단된)에 제공되는 치료 유형, 용량, 스케줄 및/또는 치료기간을 특정화하는 치료 계획을 지칭한다. 선택된 치료 섭생법은 최고의 임상 결과 (예컨대, 병의 완전한 치유)를 결과하도록 예상되는 공격적인 것, 또는 병리의 증상을 완화시키지만, 병리의 불완전한 치유를 결과하는 더 온화한 것일 수 있다. 특정의 경우, 더 공격적인 치료 섭생법이 대상체에 불쾌함 또는 역작용(예컨대, 건강한 제소나 조직에 손상)과 연계될 수 있다는 것을 알게 된다. 치료의 유형은 외과적 간섭(예컨대, 병소, 병든 세포, 조직 또는 기관의 제거), 세포치환요법, 국소 또는 전신적 양태의 치료 약물의 투여(예컨대, 수용체 작용제, 길항제, 호르몬, 화학요법 제제), 외부 출처(예컨대, 외부 빔) 및/또는 내부 출처(예컨대, 브라키요법(brachytherapy)을 사용하여 방사 요법에 노출, 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 치료의 용량, 스케줄 및 기간은 병의 심각성, 및 선택된 치료 유형에 의존하여 변할 수 있고, 및 당해 분야의 기술자는 치료 용량, 스케줄 및 기간으로 치료 유형을 조정할 수 있다.

본 출원으로부터 특허가 성숙되는 동안, 많은 관련 벡터, 프로모터 요소, 식물 세포 및 담체들이 개발될 것으로 예상되었고, 및 본 명세서에서 제공되는 용어들은 그러한 새로운 기술 모두를 선험적으로 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “약”은 ±10 %를 지칭한다.

용어 “포함하다”, “포함하는”, “내포하다”, “내포하는”, “가지다” 및 이들의 연관어들은 “포함하지만 그에 한정되지 않는다”는 뜻이다.

용어 “~ 구성된”은 “포함하지만 그에 한정되지 않는다”는 뜻이다.

용어 “본질적으로 ~ 구성된”은 상기 조성물 방법 또는 구조체가 추가의 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있으나, 상기 추가의 성분, 단계 및/또는 부분들이 청구된 조성물, 방법 또는 구조체의 기본 및 신규 특성을 현저히 변경하지 않는다는 조건에서를 뜻한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 “일”, “하나” 및 “상기”는 명확히 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조물을 포함한다. 예를 들어, 용어 “일 화합물” 또는 “적어도 하나의 화합물”은 혼합물을 위시한 복수개의 화합물을 포함할 수 있다.

본 출원서를 통틀어, 본 발명의 다양한 구체예들이 범위 형태로 제공될 수 있다. 범위 형태의 설명은 단지 편의와 간편함을 위한 것이고 본 발명의 범위 상에서 불변적인 제한으로서 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기술은 모든 가능한 부차 범위는 물론 그 범위 내의 개별적 수치적 가치를 특정하게 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6 과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같이 부차 범위는 물론 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 크기와 관계없이 적용된다.

수치적 범위가 나타날 때마다, 이는 나타난 범위 내의 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 의미된다. 용어 제1 지시 숫자와 제2 지시 숫자 “간의 범위” 및 제1 숫자 “부터” 제2 숫자 “까지 범위”는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 제1 및 제2 지시 숫자 및 그 사이의 모든 분수 정수 숫자를 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “방법”은 주어진 암무를 완수하기 위한 방식, 수단, 기술 및 과정을 지칭하는 것으로, 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 전문가에 공지된 그러한 방식, 수단, 기술 및 과정 또는 그에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 과정으로부터 쉽게 개발된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료하는”은 상태의 진행을 폐지하거나, 실질적으로 저해하거나, 늦추거나 역전시키거나, 상태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선시키거나 또는 상태의 임상적 또는 심미적 증상의 발현을 실질적으로 방지하는 것을 포함한다.

명확하게 하기 위해, 개별 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정한 특징은 또한 단일 구체예에서 조합적으로 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 역으로, 간편함을 위해 단일 구체예에서 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 분니적으로 또는 임의의 적절한 부차 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구체예에 적합한 것으로서 제공될 수 있다. 다양한 구체예에서 설명된 특정 특징은 그 구체예가 그러한 요소 없이 작동되지 않는 것이 아니라면, 그러한 구체예의 필수적인 특징으로 간주되지 않는다.

위에서 서술된 것 및 하기 청구항에서 청구되는 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예 및 관점은, 하기 실시예에서 실험적으로 지지될 것이다.

실시예

하기 실시예를 참조하며, 이는 상기 설명과 함께 본 발명의 특정 구체예를 비 제한적 방식으로 설명한다.

일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 발명에서 유용한 실험 과정은, 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 그러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 참조, 예를 들어, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook 등., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren 등. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 4,683,202호; 4,801,531호; 5,192,659호 및 5,272,057호에 설정된 바와 같은 방법론; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용가능한 면역측정법이 특허 및 과학 문헌에 설명되어 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 제3,791,932호; 3,839,153 호; 3,850,752 호; 3,850,578 호; 3,853,987 호; 3,867,517 호; 3,879,262 호; 3,901,654 호; 3,935,074 호; 3,984,533 호; 3,996,345 호; 4,034,074 호; 4,098,876 호; 4,879,219 호; 5,011,771 호 및 5,281,521 호; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1, 2, 317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); 이들 모두는 본 명세서에서 전체 설정된 것과 같이 참조됨으로 기입된다. 다른 일반적인 참조문헌은 이러한 문서를 통틀어 제공된다. 여기서의 과정은 당해 분야에 공지된 것으로 믿어지고, 독자의 편의상 제공된다. 본 명세서에 포함된 모든 정보는 참조함으로 기입된다.

실시예 I: 식물 α- 갈락토시다제 발현 작제물의 제작

인간 α-갈락토시다제 단백질 (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790)를 암호화하는 cDNA는 GENEART AG (Regensburg, 독일)에 의해 최적화 및 합성되었다. 리더 펩타이드 (소포체 표적 신호 펩타이드)없는 코돈 용법은 니코티아나 타바쿰 유전자의 코돈에 편향되어 있다. 최적화 과정 중에, 하기 시스-작용 서열 모티프들을 피하였다: 내부 TATA-박스, 키(chi)-부위 및 리보좀 입구 부위, AT가 많거나 (AT-rich) 또는 GC가 많은 (GC-rich) 서열 단편, RNA 불안정성 요소 (“킬러 모티프”), 반복 서열 및 RNA 이차 구조, 스플라이스 공여 (비밀) 및 수용 부위, 분기점. 또한, 매우 높은 (>80%) 또는 매우 낮은 (<30%) GC 함량의 부위를 피하였다.

전장 인간 α-갈락토시다제 단백질(GenBank: X05790)의 천연 인간 α-갈락토시다제 리더 펩타이드(소포체 표적 신호 펩타이드) (도 1, 붉은 색으로 있는 처음 31 개 아미노산)의 뉴클레오타이드 서열을 애기장대 ABPI 단백질의 33개 아미노산 소포체 표적화 신호 서열 (리더 펩타이드)을 암호화한 뉴클레오타이드 서열 (도 1에서 녹색으로 표시, 서열번호 4)로 대체하였다. 이러한 신호 펩타이드는 α-갈락토시다제를 분비 경로에 효율적으로 표적화시키는 것을 제공하며, 일단 상기 단백질이 소포체로 이동한다면, 신호 펩티다제에 의해 상기 폴리펩타이드로부터 절단된다. 소포체 잔류 신호 SEKDEL(서열번호 6)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 19)을 3’말단에서 cDNA 서열에 첨가하여, 골지체로부터 발현된 단백질을 회수하게 하며 그 단백질을 소포체에 효과적으로 유지하게 한다. 서열번호 2는 발현된 재조합 인간 α-갈락토시다제의 완전한 암호화 서열을 표시하며(서열번호 1), 이는 N-말단 ABPI 소포체 표적화 신호 서열, 인간 α-갈락토시다제 단백질 및 상기 SEKDEL 소포체 잔류 신호를 포함한다.

실시예 II : 식물체에서 재조합 인간 α- 갈락토시다제의 발현

엔. 벤타미아나 (N. benthamiana )에서의 일시적 발현 시스템

이 경우, 형질전환 식물체에 대한 대안으로서 식물 바이러스성 벡터의 사용을 결정하여, 성숙된 전체 식물체에서, 빠른 고도의 일시적 단백질 발현을 가능하게 하였다.

목표 단백질을 강한 게놈하위성 바이러스성 코트 단백질 프로모터로부터 발현시켰다. 상기 시스템은 아그로박테리움에 의해 식물체로 전달되는 바이러스성 벡터의 일시적인 증폭 (아그로감염에 의한)에 달려있고, 여기서 상기 식물 기증성 프로모터 및 바이러스 리플리콘을 암호화하는 cDNA T-DNA로서 아그로박테리움에서 식물 세포로 전달된다. 상기 T-DNA는 식물 프로모터에 의해 식물체 내에서 전사되어 자가 복제를 개시하는 생물학적 활성 바이러스 RNA를 생성한다.

일시적 발현을 위해, 이전에 전술한 바와 개발된 (Gleba 등., Vaccine 23 2042-2048, 2005) 시스템에 기반한 3 벡터 재조합 시스템을 사용하였다. α-갈락토시다제 cDNA를 벡터 중 하나에 삽입하고, 나머지 두 개는 전체 바이러스 리플리콘의 제작용 유전자(RdRp 및 인테그라제)를 포함하였고, 따라서 자가 복제를 개시할 수 있는 생물학적 활성 바이러스 RNA를 생성한다.

전체 식물체의 형질감염 -

과립성 저방출 비료 (Scott Marysville, OH)가 보충된 상업적 토양 혼합물 (Givaat Ada, IL)에서 엔. 벤타미아나 식물을 24℃-25℃에서 장주광법(16 시간 명 / 8 시간 암) 아래에서 발아시키고 성장시켰다.

아그로박테리아를 전기천공 (2500V, 5msec) [den Dulk-Ra, A. and Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]을 사용하여 pICH20866-alpha-GAL 기반 리플리콘 벡터 시스템으로 형질전환시켰다. 당해분야에 공지된 방법을 사용한 진공 침투에 의해 식물체를 3 가지 ICON 플라스미드를 함유하는 아그로박테리아로 침투시켰다. 간략하게, 모든 식물 지상기관을 세균성 현탁액에 침전시킴으로써 5-6 주된 엔. 벤타미아나 식물이 침투되었고, 진공 챔버에 두었다. 마이너스 (-) 0.8 바 진공을 1 분간 적용한 후, 빠르게 상압으로 되돌렸다. 식물을 동이한 조건하에서 5-7 일간 추가로 온실에서 키웠다.

담배 식물 추출물:

침투 5일 후에 니코티아나 벤타미아나 잎의 샘플을 모으고, SDS-PAGE용 라엠리 (Laemmli) 완충액에서, 또는 식물 발현된 단백질의 촉매 활성 분석용 활성 분석 완충액 (20mM 시트르산, 30 mM 인산 나트륨, 0.1% BSA 및 0.67% 에탄올, pH 4.6.)에서 추출하였다.

담배 식물 추출물 정제:

식물 추출물로부터 얻은 인간 α-갈락토시다제 단백질을 이단계 황산 암모늄 차등 침전법(“솔팅 아웃”: 제1 단계 0.57M; 제2 단계 2.27M) 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(페닐 650 M 수지) 및 양이온 교환 크로마토그래피하여 정제하였다.

엔. 토바쿰 BY2 세포에서의 안정한 발현

아그로박테리움 매개 형질전환은 외부 유전자를 식물 세포 게놈에 도입하는데 널리 사용된다. 이러한 기술은 플라스미드 DNA 세그먼트, 즉 전달된 DNA (T-DNA)를 숙주 세포 게놈에 전달함으로써 식물세포를 형질전환시키는 아글박테리움의 자연적인 능력에 기반한다. 이러한 방식으로, 외부 유전자와 조절 인자로 구성된 T-DNA 분자는 식물 게놈으로 무작위로 도입된다. 통합 위치는 물론 유전자 삽입체의 복제 수가 조절되지 않고, 따라서 형질전환 과정은 전달된 유전자의 다양한 발현 수준을 가진 세포들로 구성된 형질전환 세포들의 “풀 (pool)”을 초래하게 된다. 후속적으로, 상기 형질전환 ‘풀’은 클론 분리에 사용된다. 클론 분리는 많은 단일 세포주를 확립하는 결과를 낳고, 이로부터 최고 발현 수준의 외부 유전자를 가지는 클론을 선택한다.

BY2 현탁 배양물은 α-GAL 유전자 및 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (NPTII) 선택 유전자를 함유한 벡터를 가지는아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 균주와 48 시간 공동 배향하였다.

다음, 상기 세포를 50mg/L 가나마이신 및 250mg/L 세포탁심으로 보충된 배지에 유지하였다. NPTII 유전자는 가나마이신에 대한 내성을 부여하고, 따라서 NPTII 양성 BY2 세포만이 이러한 선택 배지에서 살아남는다. 세포탁심을 사용하여 아그로박테리움을 선택적으로 죽이고, 상기 식물 세포는 이러한 항생제에 내성이다. 일단 잘 성장하는 형질전환 세포 현탁액을 확립한 후, 이를 개별 세포주를 거르고 분리하는 데 사용하였다. 개별 세포주를 선택하기 위해, 고도로 희석한 세포 현탁액의 분획물을 고형 BY-2 배지에 도말하였다. 다음 상기 세포를 작은 유합조직이 발달할 때까지 성장시켰다. 다음 각 유합조직을 액체 배양액에 재현탁시켰다. 다음 세포 샘플을 취하여 α-GAL 수준에 대하여 평가하였다. 상대적으로 높은 α-GAL 활성 수준을 나타내는 세포주를 다음 α-GAL 수준에 대하여 재분석 및 비교하고, 후보 α-GAL 발현주를 마지막으로 선택하여 끝냈다.

담배 세포 추출물:

인간 α-갈락토시다제 단백질을 발현하는 형질전환된BY2 100 mg을 20mM EDTA 2mM DTT and 2mM PMSF를 함유하는 200 ul의 20mM 인산염 완충액 0.5M, pH=7.2에서 5 분간 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 함유하는 상청액을 수집하였다 [미정제 추출물]. 미정제물 내의 α-갈락토시다제 촉매 활성을 PNP-G 분석법으로 결정하였다.

PNP -G 분석법

p-니트로페닐알파-D-갈락토피라노시드 (pNP-알파-D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, 독일)을 가수분해 기질로 사용하여 α-갈락토시다제 갈락토시드 하이드롤라제 활성을 측정하였다. 분석 완충액은 pH 4.6이고 20 mM 구연산, 30 mM 인산 나트륨, 0.1 % BSA 및 0.67 % 에탄올을 포함하였다. 샘플(50 μl)들을 150 μl 분석 완충액으로 항온처리하였다. 상기 기질 (pNP-알파-D-Gal)을 첨가하여 (30 μL) 8 mM p-NP-alpha-D Gal의 최종 농도를 만들었다. 반응 혼합물을 37℃에서 90 분간 처리하였다. 90 분 후, 각 웰에 100 μl 탄산 나트륨 (2M)을 첨가함으로써 반응물을 식혀 반응을 종결하고 p-니트로페놀레이트 발색단을 생성하였다. 결과는 405 nm에서 측정한 흡광도로 계산하였다.

식물 발현된 인간 α- 갈락토시다제의 개질: 형질전환된 식물로부터 얻은 단백질 생성물을 서열분석하여, 특정의 경우, ABPI 신호를 절단시, 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질은 성숙한 α-갈락토시다제 단백질의 N 말단에서 신호 펩타이드의 마지막 아미노산 글리신을 보유한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질은 N-말단에서 신호 펩타이드의 글리신이 없든지(예, 서열번호 20, 서열번호 22에서와 같은 암호화 서열) 또는 N-말단에서 글리신을 포함한다(예, 서열번호 21, 서열번호 23에서와 같은 암호화 서열).

식물 발현된 인간 α- 갈락토시다제의 글리칸 분석: 형질전환된 식물체로부터 얻은 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질 생성물의 샘플을 환원시키고, DTT와 요오도아세트아미드로 알킬화시키고 및 12.5% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 정확한 분자량에 상응하는 밴드를 잘라내고, 단백질을 추출하고, 트립신 절단 후 PNGase A와 PNGase F 둘 다로 절단하는 것으로 구성된 글리칸 분석을 수행하였다. PNGase A 절단은 모든 N-연결 글리칸을 방출하고 PNGase F는 α 1-3 코어 푸코스를 포함하는 것을 제외하고 모든 글리칸류를 방출한다.

자유 글리칸들을 추출하고, 정제한 후, 형광 시약 안트라닐아미드(2AB)로 표지한 다음, 과량의 2AB를 제거하였다.

TSK 젤 아미드 80 정상 상 HPLC를 사용하여 글리칸류를 분리하고 형광 검출기를 사용하여 검출하였다. 덱스트란 가수분해물을 글루코스 단위 (GU) 값을 계산하는 데 사다리 마커로서 사용하였다. PNGase A 절단의 크로마토그램에서의 상대적인 피크 면적을 계산함으로써 글리칸 프로필을 작성하였다. 양쪽의 엔도글리코시드 절단에 의해 발견되고 다양한 엑소글리코시드 절단에 기초한 피크들의 GU 값을 계산함으로써 글리칸 배치를 확립하였다.

결과들:

상이한 α-갈락토시다제 작제물간에 비교하면, ABPI 소포체 표적화 신호 서열(서열번호 4)을 인간 재조합 α-갈락토시다제 폴리펩타이드에 첨가하는 것은 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열(서열번호 10에 의해 암호화된 바와 같은 사과 펙티나제 ER 표적화 신호 서열) (서열번호 8 또는 10에 의해 암화화된 바와 같은α-갈락토시다제-사과 펙티나제 ER 신호 펩타이드-단백질)을 가지고 발현된 α-갈락토시다제 서열, 또는 엔도키티나제 B 소포체 표적화 신호 서열(엔도키티나제 신호 단백질, 서열번호 14, 서열번호 15에 의해 암호화된 바와 같은)을 가지고 발현된 α-갈락토시다제 단백질에 비해 일시적으로 발현하는 엔. 벤타미아나 식물에서 향상된 상기 재조합 단백질 발현을 나타낸다는 것이 밝혀졌다(도 2, 레인 2). 촉매활성을 분석하면(상기 참조) 도 2에 나타난 증가된 단백질은, 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열을 가지고 발현된 α-갈락토시다제 서열 또는 엔도키티나제 B 소포체 표적화 신호 서열(엔도키티나제 신호 단백질, 서열번호 14, 서열번호 15에 의해 암호화된)을 가지고 발현된 α-갈락토시다제 단백질에 비해, 잎 kg 당 효소 활성이 동시적으로 증가된 것을 나타낸다는 것이 확인된다(도 3, B 칸).

ABPI 소포체 표적화 신호 서열(예. 서열번호 1, 서열번호 2에 의해 암호화된)을 가지는 인간 α-갈락토시다제 단백질을 발현하는 형질전환된 담배 세포로부터 얻은 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질 생성물을 글리칸 분석하면, 높은 만노스 글리칸 구조물(예, 3 내지 6, 7, 8 또는 9개 만노스 잔기, 말단 만노스가 노출), 및 β-(1,2) 자일로스 및 α-(1,3) 푸코스와 같은 특징적인 식물체-특이성 글리칸류의 주된 글리칸 구조를 포함하는 글리칸 프로필이 나타난다(도 7). 상기 글리칸 프로필의 높은 백분율을 보이는 주된 글리칸 구조는 만노스 3- β-(1,2) 자일로스- α-(1,3) 푸코스 [Fc(3)M3X] 및/또는 만노스 4- α-(1,2) 자일로스 (M4X)를 가지는 30 %; 및 다른 약 30% 만노스 8 (M8) 글리칸류를 포함한다(도 8). 도 8은 형질전환된 세포로부터 얻은 단백질 샘플 내에서의 글리칸 구조물의 분포를 나타내는 예시적인 표이다. A-Gal A 및 A-Gal-B는 형질전환된 식물 세포로부터 얻은 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질 생성물의 두 개의 대표적인 분석물이다.

글리칸 구조는 복합 글리칸에 존재하는 당 잔기에 따라 더 구분될 수 있다. 표 V는 형질전환된 식물로부터 얻은 인간 α-갈락토시다제 단백질 생성물의 글리칸 구조를 특이 당에 따라 분배한 것을 상세히 나타낸다:

글리칸의 당 함량

글리칸 유형	총 글리칸의 %
푸코스 함유 글리칸	~35
자일로스 함유 글리칸	~50
높은 만노스 함량	~60
N-아세틸글루코사민 함유 글리칸	~10

따라서, 서열번호 2를 포함하는 작제물로부터 얻은, 담배 세포 배양물에서 발현된 인간 α-갈락토시다제 단백질 높은 함량의 특이적인 글리칸 구조 (푸코스 및 자일로스 성분을 함유), 및 높은 만노스 글리코실화를 특징으로 한다.

실시예 III -식물 발현된 인간 재조합 Α- 갈락토시다제의 생체내 환경에서의 안정성

식물 발현된 인간 재조합 α-갈락토시다제의 약동력학 특성을 추정하기 위해, 재조합 효소 제조물을 모사된 생체내 환경하에 노출시키고, 촉매 활성을 모니터하였다.

혈장내에서의 안정성:

혈장 내에서의 효소 활성 안정성은 재조합 식물 추출물 또는 식물 추출물로부터 정제된 α-갈락토시다제를 인간 혈장에 최종 1 μg/ml 농도 (예, 10 μl 추출물 또는 정제 α-갈락토시다제를 190 μl 인간 혈장에)로 첨가하고, 37℃에서 항온처리하고, 및 샘플 내에서 α-갈락토시다제 촉매 활성을 한 시간 동안에 걸쳐 설정된 간격으로 측정함으로써 평가되었다.

사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 서열 (서열번호 12)를 가진 α-갈락토시다제를 암호화하는, 서열번호 11로 형질전환된 엔. 벤타마이나 식물로부터 얻은 α-갈락토시다제 및 ABPI 소포체 표적화 신호 서열 (서열번호 1)을 가진 α-갈락토시다제를 암호화하는 서열번호 2로 형질전환된 엔. 벤타마이나 식물로부터 얻은 α-갈락토시다제를 비교하면 (도 4), 사과 펙티나제 소포체 표적화 신호 리더를 가진 작제물로부터 발현된 재조합 α-갈락토시다제 (도 4, 흰 사각형)에 비해 ABPI 소포체 표적화 신호 서열을 가진 작제물로부터 얻은 엔. 벤타미아나-발현 α-갈락토시다제(도 4, 검은 또는 굵은 사각형)가 명확하게 유리하다는 것을 나타낸다.

서열번호 21에 설정된 성숙한 재조합 α-갈락토시다제 단백질을 결과한, ABPI 소포체 표적화 신호 서열 (서열번호 1)를 가진 α-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 형질전환된 엔. 타바쿰 식물 세포에서 발현된 α-갈락토시다제(BY2)를 동물세포에서 발현된 α-갈락토시다제 (REPLAGAL™)과 비교하면, 혈장에서 한 시간동안 37℃에서 항온처리시 (도 5), 및 리소좀 유사 조건 하에서 9 일간 항온처리시 (pH=4.6 및 37℃, 도 6) 유사한 안정성의 효소 활성을 나타냈다. 모사된 생체 내 환경하의 이러한 유사성은 식물 세포 발현된 재조합 α-갈락토시다제가 동물세포 발현된, 임상 승인된 효소 (REPLAGAL™)에 비견되는 약동학적 특성을 가진다는 것을 제시하고 있다.

본 발명이 특정 구체예와 연계되어 설명되었지만, 많은 대안, 개질 및 변경이 당해 분야의 숙련자에게 명백하다는 것은 명확하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 사상과 범위 내에 있는 그러한 대안, 개질 및 변경을 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원서는 각 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원서가 특정적으로 및 개별적으로 참조되어 본 명세서에 기입되는 것과 같은 정도로, 그 전체로서 참조됨으로 본 명세서에 기입된다. 또한, 본 명세서에서의 임의의 참조물의 인용이나 확인은 그러한 참조물이 본 발명에 선행기술로서 이용된다는 허락으로 해석되어서는 안된다. 단락 제목이 사용된 정도로, 이들은 필수적인 제한으로 해석되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. Shulman, Avidor Hanania, Uri Kizhner, Tali Shaaltiel, Yosef <120> NUCLEIC ACID CONSTRUCT FOR EXPRESSION OF ALPHA-GALACTOSIDASE IN PLANTS AND PLANT CELLS <130> 51336 <150> PCT/IL2011/000209 <151> 2011-03-02 <150> US 61/434,499 <151> 2011-01-20 <150> US 61/434,503 <151> 2011-01-20 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant Alpha-Gal fused with ABPI and an ER signal peptide (ABPI+AGAL+SEKDEL) <400> 1 Met Ile Val Leu Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ile Val Val 1 5 10 15 Val Phe Ser Val Ala Leu Leu Leu Phe Tyr Phe Ser Glu Thr Ser Leu 20 25 30 Gly Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His 35 40 45 Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser 50 55 60 Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser 65 70 75 80 Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys 85 90 95 Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro 100 105 110 Gln Arg 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240 gagggatgga aggatgctgg atatgagtac ctctgcatcg atgattgctg gatggctcca 300 caaagagatt ctgagggaag gcttcaagct gatccacaaa ggttcccaca tggaattagg 360 caactcgcta actacgttca ctctaaggga cttaagcttg gaatctacgc tgatgtggga 420 aacaagactt gtgctggatt tccaggatct ttcggttact acgatatcga tgctcagact 480 tttgctgatt ggggagtgga tcttcttaag ttcgatggat gctactgtga ttctcttgag 540 aacctcgctg atggttataa gcacatgtct ctcgctctta atagaactgg acgttccatt 600 gtgtattctt gcgagtggcc actttacatg tggccattcc agaagccaaa ctacactgag 660 attaggcaat actgcaacca ttggaggaac ttcgctgata ttgatgattc ctggaagtct 720 atcaagtcca tccttgattg gacttcattc aatcaagaac gtattgtgga tgttgctgga 780 cctggtggat ggaatgatcc agatatgctc gtgattggaa actttggact ttcttggaac 840 cagcaagtta ctcaaatggc tctctgggct attatggctg ctccactctt catgtctaac 900 gatcttaggc acatttctcc acaagctaag gctttgctcc aggataagga tgtgattgct 960 atcaaccagg atccacttgg aaagcaagga taccaactta ggcagggtga taattttgag 1020 gtttgggaga ggccactttc tggacttgct tgggctgttg ctatgattaa caggcaagag 1080 attggaggac caaggtctta cactattgct gtggcttctc ttggaaaggg tgttgcttgt 1140 aatccagctt gcttcattac tcagcttttg ccagtgaaga ggaagcttgg attttacgag 1200 tggacttcta ggcttaggtc acacattaac ccaactggaa ctgtgcttct tcagctcgag 1260 aacactatgc agatgtctct taaggatttg ctctccgaga aggatgagct t 1311 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human A-Gal leader sequence <400> 3 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Arabidopsis derived ABPI endoplasmic reticulum targeting signal peptide <400> 4 Met Ile Val Leu Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ile Val Val 1 5 10 15 Val Phe Ser Val Ala Leu Leu Leu Phe Tyr Phe Ser Glu Thr Ser Leu 20 25 30 Gly <210> 5 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Coding sequence for ABPI ER target signal peptide <400> 5 atgattgtgc tttctgtggg atctgcttct tcttctccaa ttgtggtggt gttctctgtg 60 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acctcgctga tggttataag 540 cacatgtctc tcgctcttaa tagaactgga cgttccattg tgtattcttg cgagtggcca 600 ctttacatgt ggccattcca gaagccaaac tacactgaga ttaggcaata ctgcaaccat 660 tggaggaact tcgctgatat tgatgattcc tggaagtcta tcaagtccat ccttgattgg 720 acttcattca atcaagaacg tattgtggat gttgctggac ctggtggatg gaatgatcca 780 gatatgctcg tgattggaaa ctttggactt tcttggaacc agcaagttac tcaaatggct 840 ctctgggcta ttatggctgc tccactcttc atgtctaacg atcttaggca catttctcca 900 caagctaagg ctttgctcca ggataaggat gtgattgcta tcaaccagga tccacttgga 960 aagcaaggat accaacttag gcagggtgat aattttgagg tttgggagag gccactttct 1020 ggacttgctt gggctgttgc tatgattaac aggcaagaga ttggaggacc aaggtcttac 1080 actattgctg tggcttctct tggaaagggt gttgcttgta atccagcttg cttcattact 1140 cagcttttgc cagtgaagag gaagcttgga ttttacgagt ggacttctag gcttaggtca 1200 cacattaacc caactggaac tgtgcttctt cagctcgaga acactatgca gatgtctctt 1260 aaggatttgc tctccgagaa ggatgagctt 1290 <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Apple Pectinase ER 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gttggggata tacgctgatg tgggaaacaa aacctgtgct 420 ggatttcctg gttccttcgg ctattacgat attgacgcac aaacctttgc tgattgggga 480 gttgacctcc ttaaattcga tggctgttac tgtgattcac ttgagaatct cgccgacggt 540 tataagcaca tgtctctcgc tttgaacagg actggaagga gcatagtcta ctcctgtgaa 600 tggccacttt acatgtggcc tttccagaag ccaaactaca ctgagattag gcagtattgc 660 aaccactggc gtaattttgc cgatatcgac gattcttgga agtccatcaa gagcattctg 720 gattggacat ccttcaatca ggaaaggatt gtggatgttg ctggacctgg tggatggaat 780 gatcctgaca tgttggtgat agggaacttt ggtctctcat ggaatcagca agttacccaa 840 atggcactct gggctattat ggctgcacca ctcttcatgt ctaacgacct caggcatatc 900 tcacctcaag caaaggcatt gctgcaagac aaagacgtca ttgccattaa ccaggaccct 960 cttgggaagc aaggttatca acttcgtcaa ggcgataact ttgaagtgtg ggagagacca 1020 ttgtctggac ttgcttgggc tgttgccatg attaataggc aagaaatcgg tggcccaaga 1080 agttatacaa tcgctgttgc aagtcttgga aaaggtgtcg cttgtaatcc tgcctgtttc 1140 attactcagc tcctgcctgt gaaaagaaag ttggggttct atgaatggac ttcaagactc 1200 aggagccata ttaaccctac cggaacagtt 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Artificial sequence <220> <223> Basic endochitinase B ER targeting signal peptide amino acid sequence <400> 14 Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Glu Phe 20 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Basic endochitinase B ER targeting signal peptide coding sequence <400> 15 atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60 gaattc 66 <210> 16 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant mature Alpah-Gal protein sequence with N' terminal G <400> 16 Gly Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His 1 5 10 15 Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser 20 25 30 Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser 35 40 45 Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys 50 55 60 Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro 65 70 75 80 Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser 85 90 95 Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys 100 105 110 Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr 115 120 125 Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys 130 135 140 Asp Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala 145 150 155 160 Leu Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu 165 170 175 Tyr Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr 180 185 190 Cys Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser 195 200 205 Ile Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val 210 215 220 Asp Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile 225 230 235 240 Gly Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu 245 250 255 Trp Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His 260 265 270 Ile Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala 275 280 285 Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly 290 295 300 Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala 305 310 315 320 Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr 325 330 335 Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys 340 345 350 Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu 355 360 365 Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu 370 375 380 Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Endoplasmic reticulum retention signal peptide <400> 17 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 18 <211> 1194 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Optimized coding sequence for mature Alpah-Gal without ABPI or SEKDEL signal peptides <400> 18 cttgataatg gacttgctag gactccaact atgggatggc ttcattggga acgtttcatg 60 tgcaatctcg attgtcaaga ggaaccagat tcttgcattt ccgagaagct tttcatggaa 120 atggctgagc ttatggtttc tgagggatgg aaggatgctg gatatgagta cctctgcatc 180 gatgattgct ggatggctcc acaaagagat tctgagggaa ggcttcaagc tgatccacaa 240 aggttcccac atggaattag gcaactcgct aactacgttc actctaaggg acttaagctt 300 ggaatctacg ctgatgtggg aaacaagact tgtgctggat ttccaggatc tttcggttac 360 tacgatatcg atgctcagac ttttgctgat tggggagtgg atcttcttaa gttcgatgga 420 tgctactgtg attctcttga gaacctcgct gatggttata agcacatgtc tctcgctctt 480 aatagaactg gacgttccat tgtgtattct tgcgagtggc cactttacat gtggccattc 540 cagaagccaa actacactga gattaggcaa tactgcaacc attggaggaa cttcgctgat 600 attgatgatt cctggaagtc tatcaagtcc atccttgatt ggacttcatt caatcaagaa 660 cgtattgtgg atgttgctgg acctggtgga tggaatgatc cagatatgct cgtgattgga 720 aactttggac tttcttggaa ccagcaagtt actcaaatgg ctctctgggc tattatggct 780 gctccactct tcatgtctaa cgatcttagg cacatttctc cacaagctaa ggctttgctc 840 caggataagg atgtgattgc tatcaaccag gatccacttg gaaagcaagg ataccaactt 900 aggcagggtg ataattttga ggtttgggag aggccacttt ctggacttgc ttgggctgtt 960 gctatgatta acaggcaaga gattggagga ccaaggtctt acactattgc tgtggcttct 1020 cttggaaagg gtgttgcttg taatccagct tgcttcatta ctcagctttt gccagtgaag 1080 aggaagcttg gattttacga gtggacttct aggcttaggt cacacattaa cccaactgga 1140 actgtgcttc ttcagctcga gaacactatg cagatgtctc ttaaggattt gctc 1194 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Coding sequence for SEKDEL ER retention signal <400> 19 tccgagaagg atgagctt 18 <210> 20 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant A-Gal mature protein fused to SEKDEL without N' terminal G <400> 20 Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 1 5 10 15 Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys 20 25 30 Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln 65 70 75 80 Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys 180 185 190 Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile 195 200 205 Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly 225 230 235 240 Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp 245 250 255 Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile 260 265 270 Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile 275 280 285 Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe 340 345 350 Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu Ser Glu 385 390 395 400 Lys Asp Glu Leu <210> 21 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant A-Gal mature protein with N' terminal G and fused to SEKDEL <400> 21 Gly Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His 1 5 10 15 Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser 20 25 30 Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser 35 40 45 Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys 50 55 60 Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro 65 70 75 80 Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser 85 90 95 Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys 100 105 110 Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr 115 120 125 Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys 130 135 140 Asp Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala 145 150 155 160 Leu Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu 165 170 175 Tyr Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr 180 185 190 Cys Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser 195 200 205 Ile Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val 210 215 220 Asp Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile 225 230 235 240 Gly Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu 245 250 255 Trp Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His 260 265 270 Ile Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala 275 280 285 Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly 290 295 300 Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala 305 310 315 320 Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr 325 330 335 Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys 340 345 350 Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu 355 360 365 Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu 370 375 380 Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu Ser 385 390 395 400 Glu Lys Asp Glu Leu 405 <210> 22 <211> 1212 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Optimized coding sequence for mature A-Gal protein fused to SEKDEL without ABPI <400> 22 cttgataatg gacttgctag gactccaact atgggatggc ttcattggga acgtttcatg 60 tgcaatctcg attgtcaaga ggaaccagat tcttgcattt ccgagaagct tttcatggaa 120 atggctgagc ttatggtttc tgagggatgg aaggatgctg gatatgagta cctctgcatc 180 gatgattgct ggatggctcc acaaagagat tctgagggaa ggcttcaagc tgatccacaa 240 aggttcccac atggaattag gcaactcgct aactacgttc actctaaggg acttaagctt 300 ggaatctacg ctgatgtggg aaacaagact tgtgctggat ttccaggatc tttcggttac 360 tacgatatcg atgctcagac ttttgctgat tggggagtgg atcttcttaa gttcgatgga 420 tgctactgtg attctcttga gaacctcgct gatggttata agcacatgtc tctcgctctt 480 aatagaactg gacgttccat tgtgtattct tgcgagtggc cactttacat gtggccattc 540 cagaagccaa actacactga gattaggcaa tactgcaacc attggaggaa cttcgctgat 600 attgatgatt cctggaagtc tatcaagtcc atccttgatt ggacttcatt caatcaagaa 660 cgtattgtgg atgttgctgg acctggtgga tggaatgatc cagatatgct cgtgattgga 720 aactttggac tttcttggaa ccagcaagtt actcaaatgg ctctctgggc tattatggct 780 gctccactct tcatgtctaa cgatcttagg cacatttctc cacaagctaa ggctttgctc 840 caggataagg atgtgattgc tatcaaccag gatccacttg gaaagcaagg ataccaactt 900 aggcagggtg ataattttga ggtttgggag aggccacttt ctggacttgc ttgggctgtt 960 gctatgatta acaggcaaga gattggagga ccaaggtctt acactattgc tgtggcttct 1020 cttggaaagg gtgttgcttg taatccagct tgcttcatta ctcagctttt gccagtgaag 1080 aggaagcttg gattttacga gtggacttct aggcttaggt cacacattaa cccaactgga 1140 actgtgcttc ttcagctcga gaacactatg cagatgtctc ttaaggattt gctctccgag 1200 aaggatgagc tt 1212 <210> 23 <211> 1215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Optimized coding sequence for mature A-Gal protein with N' terminal G and SEKDEL <400> 23 ggccttgata atggacttgc taggactcca actatgggat ggcttcattg ggaacgtttc 60 atgtgcaatc tcgattgtca agaggaacca gattcttgca tttccgagaa gcttttcatg 120 gaaatggctg agcttatggt ttctgaggga tggaaggatg ctggatatga gtacctctgc 180 atcgatgatt gctggatggc tccacaaaga gattctgagg gaaggcttca agctgatcca 240 caaaggttcc cacatggaat taggcaactc gctaactacg ttcactctaa gggacttaag 300 cttggaatct acgctgatgt gggaaacaag acttgtgctg gatttccagg atctttcggt 360 tactacgata tcgatgctca gacttttgct gattggggag tggatcttct taagttcgat 420 ggatgctact gtgattctct tgagaacctc gctgatggtt ataagcacat gtctctcgct 480 cttaatagaa ctggacgttc cattgtgtat tcttgcgagt ggccacttta catgtggcca 540 ttccagaagc caaactacac tgagattagg caatactgca accattggag gaacttcgct 600 gatattgatg attcctggaa gtctatcaag tccatccttg attggacttc attcaatcaa 660 gaacgtattg tggatgttgc tggacctggt ggatggaatg atccagatat gctcgtgatt 720 ggaaactttg gactttcttg gaaccagcaa gttactcaaa tggctctctg ggctattatg 780 gctgctccac tcttcatgtc taacgatctt aggcacattt ctccacaagc taaggctttg 840 ctccaggata aggatgtgat tgctatcaac caggatccac ttggaaagca aggataccaa 900 cttaggcagg gtgataattt tgaggtttgg gagaggccac tttctggact tgcttgggct 960 gttgctatga ttaacaggca agagattgga ggaccaaggt cttacactat tgctgtggct 1020 tctcttggaa agggtgttgc ttgtaatcca gcttgcttca ttactcagct tttgccagtg 1080 aagaggaagc ttggatttta cgagtggact tctaggctta ggtcacacat taacccaact 1140 ggaactgtgc ttcttcagct cgagaacact atgcagatgt ctcttaagga tttgctctcc 1200 gagaaggatg agctt 1215

Claims

인간 α-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 발현 작제물에 있어서, 상기 인간 α-갈락토시다제 단백질은 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열을 가지는, 핵산 발현 작제물.
제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 2에 나타난 서열을 가지는, 핵산 발현 작제물.
제1항 또는 제2항의 핵산 발현 작제물을 포함하는 분리된 세포.
제3항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포인, 세포.
제4항에 있어서, 상기 식물 세포는 담배 세포 라인인, 세포.
제5항에 있어서, 상기 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 L. cv Bright Yellow (BY-2) 세포인, 세포.
재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 방법으로서,
제3항에 따른 세포를 제공하는 단계;
상기 세포를 성장시켜 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 단계; 및
상기 세포로부터 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 방법.
재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 방법으로서,
제6항에 따른 세포를 제공하는 단계;
상기 세포를 성장시켜 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 단계; 및
상기 세포로부터 상기 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 인간 α-갈락토시다제 단백질을 생산하는 방법.
활성 성분으로서 제3항에 따른 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 파브리 병 치료용 약학적 조성물.
활성 성분으로서 제6항에 따른 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 파브리 병 치료용 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포인, 약학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 식물 세포는 담배 세포 라인인, 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 L. cv Bright Yellow (BY-2) 세포인, 약학적 조성물.
필요로 하는 대상체에서 파브리 병을 치료하기 위한 의약물을 제조하기 위한, 제3항의 세포의 사용방법.
필요로 하는 대상체에서 파브리 병을 치료하기 위한 의약물을 제조하기 위한, 제6항의 세포의 사용방법.
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