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KR101884394B1 - Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses thereof - Google Patents

Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses thereof Download PDF

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Publication number
KR101884394B1
KR101884394B1 KR1020170013933A KR20170013933A KR101884394B1 KR 101884394 B1 KR101884394 B1 KR 101884394B1 KR 1020170013933 A KR1020170013933 A KR 1020170013933A KR 20170013933 A KR20170013933 A KR 20170013933A KR 101884394 B1 KR101884394 B1 KR 101884394B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
recombinant
thrombolytic enzyme
present
enzyme
gly
Prior art date
Application number
KR1020170013933A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
이정섭
박정은
임도성
조영희
안철
임가은
Original Assignee
조선대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract

The present invention relates to a recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii, a composition for thrombolysis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient, a method for decomposing thrombus by treating the composition with an object containing thrombus, a method for producing a recombinant thrombolytic enzyme using a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme, the recombinant thrombolytic enzyme produced by the method, a health food composition and a pharmaceutical composition for preventing or ameliorating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient. The recombinant thrombolytic enzyme of the present invention may be effectively used for the treatment and prevention of thrombosis or similar diseases.

Description

비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소 및 이의 용도{Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses thereof}Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio frissini and uses thereof < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래의 재조합 혈전분해 효소, 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 함유하는 혈전분해용 조성물, 상기 조성물을 혈전을 포함하고 있는 개체에 처리하여 혈전을 분해하는 방법, 상기 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 재조합 혈전분해 효소를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 혈전분해 효소, 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio vulnificus and to its use, and more particularly to a recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, A composition for thrombolysis comprising a degrading enzyme as an active ingredient, a method for decomposing thrombi by treating the composition with an object containing thrombus, a recombinant vector containing the gene encoding the recombinant thrombolyticase, A method for producing a recombinant thrombolytic enzyme using microorganisms, a recombinant thrombolytic enzyme produced by the method, a health functional food composition for preventing or improving thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient, Prevention or prevention of thrombosis with enzyme as active ingredient For relates to a pharmaceutical composition.

혈전을 용해하는 단백질 분해효소는 작용기작에 따라 크게 두 분류로 나눌수 있다. 한 부류는 혈전에 직접 작용하여 용해시키는 단백질 분해효소이며, 다른 한 부류는 플라스미노겐(plasminogen)을 활성화시켜 플라스민(plasmin)을 만드는 단백질 분해효소이다. 혈전의 원인인 피브린 응괴(fibrin clot)를 용해시키는 대표적인 단백질 분해효소로는 파파인(papain), 트립신(trypsin), 브리나제(brinase), 플라스민(plasmin) 등을 들 수 있으며, 플라스미노겐을 활성화 시키는 효소로는 조직 타입 플라스미노겐 활성화제(tissue-type plasminogen activator, tPA), 유로키나아제 타입 플라스미노겐 활성화제(urokinase-type plasminogen activator, uPA), 스트렙토키나제(streptokinase) 등이 있다.Proteolytic enzymes that dissolve thrombosis can be classified into two types depending on the mechanism of action. One class is a proteolytic enzyme that acts directly on the thrombus to dissolve it, and the other class is a proteolytic enzyme that activates plasminogen to produce plasmin. Examples of the proteolytic enzymes that dissolve the fibrin clot which is the cause of the thrombus include papain, trypsin, brinase, plasmin, etc., and plasminogen Activated enzymes include tissue-type plasminogen activator (tPA), urokinase-type plasminogen activator (uPA), and streptokinase.

현재 임상에서 사용되는 혈전분해 효소에는 tPA, uPA 등이 있으나 uPA는 경구투여가 가능한 장점이 있지만 혈전에 대한 선택성이 낮아 전신출혈이 발생하는 등 부작용이 많고, tPA는 혈전에 대해 선택성은 높지만 반감기가 짧고 가격이 비싼 단점이 있다. 따라서 다양한 생물자원으로부터 부작용이 적고 혈전용해에 특이적인 고역가의 혈전분해효소를 개발하는 연구는 여전히 중요한 분야이다.Currently, there are tPA and uPA in the clinical use, but uPA has the advantage of being able to be administered orally, but there are many side effects such as systemic hemorrhage due to low selectivity to thrombus, tPA is highly selective for thrombus, There is a drawback that it is short and expensive. Therefore, research on developing high-fibrinolytic enzymes specific for thrombolysis is still an important field with few side effects from various biological resources.

현재, 부작용을 최소화하고 혈전분해 효소를 대량생산할 수 있으며, 구강투여가 가능한 혈전분해 효소를 개발하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나, 이에 대한 산업화는 극히 미미한 실정이다.Currently, various studies have been conducted to minimize the side effects, to mass-produce thrombolytic enzymes, and to develop thrombolytic enzymes capable of oral administration, but the industrialization thereof is extremely limited.

한편, 한국공개특허 제2002-0079719호에는 '신규한 바실러스 메카테리움 제이비-42와 이로부터 생산되는 신규 혈전 분해효소'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1217713호에는 '목이버섯 유래 혈전분해 효소의 발효 생산방법 및 그의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소 및 이의 용도에 관해서는 기재된 바가 없다.Korean Patent Publication No. 2002-0079719 discloses a novel Bacillus mechatellium jbi-42 and a novel thrombolytic enzyme produced therefrom. Korean Patent No. 1217713 discloses a novel thrombolytic enzyme derived from thymus mushroom-derived thrombolytic enzyme And a method for producing the fermentation product of the present invention, and a method for producing the fermentation product, and a use thereof. However, the recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio vulnificus of the present invention and its use are not disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소가 피브리노겐의 Aα, Bβ 또는 γ 사슬을 선택적으로 자르며, 피브린과 인간 혈장에서 형성된 피브린 중합체 또한 효율적으로 잘 분해하며, 직접적인 피브린 용해에 의해 피브린 응괴를 효율적으로 분해하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and the present inventors have found that a recombinant thrombolytic enzyme derived from vibrio rhubarb may selectively cleave A ?, B? Or? Chains of fibrinogen and fibrin polymer formed in fibrin and human plasma And the fibrin clusters are efficiently decomposed by direct fibrin dissolution, thus completing the present invention.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래의 재조합 혈전분해 효소를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 함유하는 혈전분해용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a thrombolytic composition comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 혈전을 포함하고 있는 개체에 처리하여 혈전을 분해하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for decomposing thrombus by treating the above composition with an object containing thrombus.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 재조합 혈전분해 효소를 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a recombinant thrombolytic enzyme using a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 혈전분해 효소를 제공한다.The present invention also provides a recombinant thrombolytic enzyme produced by the above method.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.The present invention also provides a health functional food composition for preventing or ameliorating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

본 발명의 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소는 피브린 및 피브리노겐을 분해하는 신규한 혈전분해 효소로, 혈전증 또는 이와 유사한 질환의 치료 및 예방에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.The recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio vulnificus of the present invention is a novel thrombolytic enzyme that degrades fibrin and fibrinogen, and can be effectively used for the treatment and prevention of thrombosis or similar diseases.

도 1은 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래 혈전분해 효소의 재조합단백질 생산을 위한 유전자 클로닝 단계를 도시한 것으로, PCR을 통해 1,827bp 크기의 해당 유전자 부위를 증폭시키고, FLAG-ATS 벡터의 Eco RⅠ 자리에 유전자를 삽입하여 재조합 혈전분해 효소 생산을 위한 플라스미드 구축 과정을 도식화한 그림이다.
도 2는 재조합 혈전분해 효소의 정제 및 분리과정을 설명한 그림으로, A와 B는 각각 Hitrap Q 컬럼과 Source 15Q 4.6/100 PE 컬럼을 이용한 이온교환크로마토그래피, C는 Sepedex G-75 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피의 결과이고, D는 각각의 분리 단계별 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리한 결과이다. ●, 단백질 농도(흡광도); ○, 단백질분해 활성.
도 3은 본 발명의 재조합 혈전분해 효소(rvFMP)에 의한 피브리노겐 절단 패턴을 분석한 그림이다.
도 4는 본 발명의 재조합 혈전분해 효소에 의한 피브린 중합체 분해능을 상대적인 혼탁도를 측정하여 정량한 그래프이다.
도 5는 플라스민과 본 발명의 재조합 혈전분해 효소의 피브린 평판 분해능을 비교, 분석한 결과이다.
도 6은 정상인의 혈장(plasma)에서 형성된 피브린 중합체에 대한 분해능을 상대적인 혼탁도를 측정하여 분석한 결과이다.
도 7은 FeCl3에 의한 경동맥 혈전 모델에서 rvFMP의 항 혈전 효과를 확인한 것으로, A는 식염수를 처리한 혈관의 모습이며, B는 FeCl3로 혈전을 유발시킨 혈관의 모습이고, C는 유로키나제 전처리 후 FeCl3로 혈전을 유발시킨 혈관의 모습이고, D는 rvFMP 전처리 후 FeCl3로 혈전을 유발시킨 혈관의 모습을 보여주는 사진이다.
FIG. 1 shows a gene cloning step for the production of a recombinant protein of Vibrio furnissii- derived thrombolytic enzyme. The amplified gene region of 1,827 bp in size was amplified by PCR, and Eco RI of FLAG-ATS vector And a plasmid construction procedure for producing a recombinant thrombolytic enzyme by inserting a gene into the plasmid.
FIG. 2 is a graph illustrating the purification and separation process of recombinant thrombolytic enzyme, wherein A and B are ion exchange chromatography using a Hitrap Q column and a Source 15Q 4.6 / 100 PE column, and C is a size using Sepedex G-75 column Excretion chromatography, and D is the result of separation of each of the separation step-wise proteins on an SDS-PAGE gel. ●, protein concentration (absorbance); ○, proteolytic activity.
3 is an analysis of the fibrinogen cleavage pattern by the recombinant thrombolytic enzyme (rvFMP) of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the relative turbidity measured by measuring the fibrin polymer degrading ability by the recombinant thrombolytic enzyme of the present invention.
FIG. 5 shows the results of comparing and analyzing the fibrin plate resolution of plasmin and the recombinant thrombolytic enzyme of the present invention.
FIG. 6 shows the results of analyzing the relative turbidity of a fibrin polymer formed in plasma of a normal person.
FIG. 7 shows the anti-thrombotic effect of rvFMP in the carotid artery thrombosis model by FeCl 3 , where A is a blood vessel treated with saline, B is a blood vessel causing thrombosis with FeCl 3 , C is a blood vessel treated with urokinase pretreatment FeCl 3 , and D is a photograph showing blood vessels that caused thrombosis with FeCl 3 after pretreatment with rvFMP.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래의 재조합 혈전분해 효소를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

용어 "혈전"이란, 혈관 속이나 심장 속에서 혈액 성분이 국소적으로 응고해서 생기는 응어리를 뜻하며, 일반적으로 혈전은 혈소판, 피브린, 적혈구 및 백혈구로 이루어진다. 혈전은 크게 동맥혈전과 정맥혈전으로 나누는데, 그 구성성분의 비율은 모든 혈액의 경우가 동일하지 않으며, 피브린망 내에 주로 혈소판이나 다른 혈구가 선택적으로 존재한다. 혈전은 피브린 분해효소인 플라스민(plasmin)에 의해 용해된다.The term "thrombus" refers to a core caused by local coagulation of blood components in a blood vessel or heart. In general, thrombus consists of platelets, fibrin, red blood cells and white blood cells. Thrombosis is largely divided into arterial and venous blood. The proportion of its components is not the same for all blood types, and platelets or other blood cells are mainly present in the fibrin network. Thrombosis is solved by the fibrinolytic enzyme plasmin.

본 발명에서 "혈전분해 효소"는 피브린에 직접 작용하여 피브린을 분해하는 효소를 의미한 것으로, 혈전용해효소, 피브린 분해효소 또는 단백질분해효소라는 표현과 상호 교차적으로 사용이 가능하며, 모두 동일한 개념으로 해석될 수 있다.The term "thrombolytic enzyme" in the present invention means an enzyme that acts directly on fibrin to degrade fibrin. It can be used interchangeably with the expression of thrombolytic enzyme, fibrinolytic enzyme or proteolytic enzyme, . ≪ / RTI >

본 발명에 따른 재조합 혈전분해 효소의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 단백질을 말한다.The range of the recombinant thrombolytic enzyme according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a functional equivalent of the protein. "Functional equivalent" means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably at least 70% or more, Refers to a protein having a homology of at least 95% and exhibiting substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 1.

바람직하게, 본 발명의 재조합 혈전분해 효소는 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래의 혈전분해 효소로, 메탈로프로테아제(metalloprotease)의 특성이 있으며, 분자량이 35 kDa 이고, 효소 활성의 최적 pH는 7.0이며, 최적 활성 온도는 50℃이다. 또한, 본 발명의 혈전분해 효소는 피브리노겐(fibrinogen)의 Aα, Bβ 또는 γ 사슬을 선택적으로 자르며, 피브린(fibrin)과 인간 혈장(plasma)에서 형성된 피브린 중합체 또한 효율적으로 잘 분해하며, 직접적인 피브린 용해에 의해 피브린 응괴(fibrin clot)를 효율적으로 분해하는 특성을 가지고 있다.Preferably, the recombinant thrombolytic enzyme of the present invention is a thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii . The recombinant thrombolytic enzyme has metalloprotease characteristics, a molecular weight of 35 kDa, and an optimum pH of enzyme activity of 7.0 , And the optimum activation temperature is 50 캜. In addition, the thrombolytic enzyme of the present invention selectively cleaves A?, B? Or? Chain of fibrinogen, efficiently decomposes fibrin polymer formed in fibrin and human plasma, And the fibrin clot is efficiently decomposed by the fibrin clot.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 함유하는 혈전분해용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a thrombolytic composition comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

본 발명의 재조합 혈전분해 효소는 피브리노겐의 Aα, Bβ 또는 γ 사슬을 선택적으로 자르며, 피브린과 인간 혈장에서 형성된 피브린 중합체 또한 효율적으로 잘 분해하며, 직접적인 피브린 용해에 의해 피브린 응괴를 효율적으로 분해하는 특성을 가지고 있어, 혈전을 효율적으로 분해할 수 있다.The recombinant thrombolytic enzyme of the present invention selectively cleaves the A?, B? Or? Chain of fibrinogen and efficiently decomposes the fibrin polymer formed in fibrin and human plasma and efficiently decomposes the fibrin clot by direct fibrinolysis And can effectively decompose thrombus.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 혈전을 포함하고 있는 개체에 처리하여 혈전을 분해하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for decomposing thrombus by treating the above composition with an object containing thrombus.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 처리하여 혈전이 분해될 수 있는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미하며, 예를 들면, 인간을 제외한 포유류를 의미한다.The term "individual" as used in the present invention means all animals such as human, monkey, dog, goat, pig or rat which can decompose thrombus by treating the composition of the present invention. For example, it means.

본 발명에서 사용되는 용어 "처리"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.As used herein, the term "treatment" means providing a composition of the invention to a subject in any suitable manner.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 재조합 혈전분해 효소를 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a recombinant thrombolytic enzyme using a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme.

본 발명의 상기 방법은 구체적으로, (a) 본 발명의 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양물 또는 배양상등액으로부터 재조합 혈전분해 효소를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Specifically, the method of the present invention comprises: (a) culturing a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding a recombinant thrombolytic enzyme of the present invention; And (b) recovering the recombinant thrombolytic enzyme from the culture or the culture supernatant of step (a).

본 발명에 따른 상기 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme according to the present invention may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. In addition, homologues of the nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 . "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.In the present invention, the term "vector" means a nucleic acid molecule capable of carrying other nucleic acid to which it is linked. One type of vector, "plasmid" refers to a circular double-stranded DNA loop in which additional DNA fragments can be ligated.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.The vector of the present invention can direct expression of a gene encoding a target protein operatively linked, which is referred to as an "expression vector. &Quot; Generally, in the use of recombinant DNA technology, the expression vector is in the form of a plasmid.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 대장균을 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로 pET28a 벡터를 예로들 수 있으며, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 예로 들 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL 프로모터, AOD 프로모터 등을 사용할 수 있다.When the E. coli is used as a host, the expression vector may be a pET28a vector. When yeast is used as a host, the expression vector may be YEp13, YCp50, pRS, pYEX-based vectors, and the like. As the promoter, for example, GAL promoter, AOD promoter and the like can be used.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다.In addition, the expression vector may include a fragment for suppressing expression, having various functions for suppressing, amplifying, or inducing expression of a target gene, a marker for selecting a transformant, a gene resistant to antibiotics, A gene encoding a signal for the purpose of secretion of a secreted protein, and a customized fusion factor suitable for a hung-off protein.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.In the present invention, the term "transformation" means that DNA is introduced into a host cell so that DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.

본 발명에서 형질전환 방법은 본 발명의 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다.Transformation methods in the present invention can be carried out by transforming the expression vector of the present invention by methods known in the art, including, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, But are not limited to, phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, , A spiropalat method, or a lithium acetate method, and transformed into a host cell.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자의 도입효율이 우수하고, 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.The host cell used for the transformation according to the present invention may be any host cell well known in the art. However, the present invention is not limited to the host cell having excellent introduction efficiency of the gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme of the present invention, Efficient hosts may be used, including, for example, bacteria, fungi, yeast, plant or animal (e.g., mammalian or insect) cells.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신)등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.The medium for culturing the transformant of the present invention and the culture conditions can be appropriately selected depending on the host cell. The nutrient medium preferably contains an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source which is necessary for growth of the host cell. Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, sucrose, and methanol. Examples of the inorganic or organic substance include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquer, peptone, casein, bovine extract, soybean bag, and potato extract. (Nutrients such as sodium chloride, calcium chloride, sodium dihydrogenphosphate, inorganic salts such as magnesium chloride, vitamins, and antibiotics (tetracycline, neomycin, ampicillin, and kanamycin). During the culture, the conditions such as the temperature, the pH of the medium and the incubation time can be appropriately adjusted so as to be suitable for cell growth and mass production of the protein.

상기 재조합 혈전분해 효소를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 혈전분해 효소를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.The step of recovering the recombinant thrombolytic enzyme can be carried out by a conventional biochemical separation technique or by separating and purifying the thrombolytic enzyme in an immuno-friendly manner using an antibody against one part or another part of the protein. Another method may be purification by affinity tagging with a protein sequence and using antibodies or other materials with a suitably high affinity for these tags. Typical biochemical separation techniques include, but are not limited to, treatment with protein precipitants (salting-out), centrifugation, ultrasound disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, And various chromatographies such as chromatography. Typically, proteins having high purity can be separated by using them in combination.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 혈전분해 효소를 제공한다.The present invention also provides a recombinant thrombolytic enzyme produced by the above method.

본 발명의 재조합 혈전분해 효소는 피브리노겐의 Aα, Bβ 또는 γ 사슬을 선택적으로 자르며, 피브린과 인간 혈장에서 형성된 피브린 중합체 또한 효율적으로 잘 분해하며, 직접적인 피브린 용해에 의해 피브린 응괴를 효율적으로 분해하는 특성을 가지고 있다.The recombinant thrombolytic enzyme of the present invention selectively cleaves the A?, B? Or? Chain of fibrinogen and efficiently decomposes the fibrin polymer formed in fibrin and human plasma and efficiently decomposes the fibrin clot by direct fibrinolysis Have.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.The present invention also provides a health functional food composition for preventing or ameliorating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

용어 "혈전증"이란 혈전에 의해 발생되는 질환을 말하며, 혈전색전증이라고도 하는데, 특히 혈전에 의해 혈관이 막힌 질환을 일컫는다. 혈전증의 발병 원인으로는 혈류의 느림, 응고 과다, 혈관 손상의 세 가지 경우가 대표적이며, 이 세 가지 원인이 단독으로 혹은 복합적으로 작용하여 혈전증의 직접적인 원인이 된다. 혈전증의 증상으로는 혈전증이 발생한 장기의 위치 및 발생한 혈관의 종류에 따라 매우 다양한 증상이 발생할 수 있는데, 동맥 혈전증의 경우 혈액이 제대로 공급되지 못하여 말초 혈류가 부족할 때 발생할 수 있는 허혈 증상이 주를 이루고, 정맥 혈전증의 경우 혈액이 말초까지는 도달하였으나 심장으로 되돌아오지 못하여 발생할 수 있는 울혈 혹은 충혈 증상이 주를 이룬다.The term "thrombosis" refers to a disease caused by a thrombus, which is also referred to as a thromboembolism. The causes of thrombosis are three of the following: slow blood flow, excessive coagulation, and vascular injury. These three causes are directly or indirectly caused by thrombosis. Symptoms of thrombosis include a wide variety of symptoms, depending on the location of the organs in which the thrombosis has occurred and the type of blood vessels that are developed. In the case of arterial thrombosis, ischemic symptoms that may occur when the blood is not properly supplied and peripheral blood flow is insufficient In the case of venous thrombosis, congestion or congestion may occur due to the blood reaching the periphery but not returning to the heart.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 혈전분해 효소를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food to which the thrombolytic enzyme can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, soups, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health functional foods in a conventional sense.

또한, 본 발명은 상기 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme as an active ingredient.

본 명세서에서 사용된 "치료"라는 용어는 혈전증 또는 이와 유사한 질환에서 본 발명의 혈전분해 효소에 의한 혈전의 용해를 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 적용할 수 있는 질환으로는, 뇌혈전, 뇌색전증 등의 뇌질환, 폐색전, 폐경색증 등의 폐질환, 하지심부정맥 혈전증, 보행장애, 혈류장해성 빈혈, 동맥경화성괴저증, 신경통, 고지혈증 등의 말초신경계질환, 신성고혈합, 신장병, 신부전 등의 신장질환, 협심증, 허혈성심장질환, 심근경색 등의 심장계 질환 등을 포함한다.The term "treatment ", as used herein, refers to dissolution of thrombus by thrombolytic enzyme of the present invention in thrombosis or similar diseases. Examples of diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention can be applied include brain diseases such as cerebral thrombosis, cerebral embolism, pulmonary diseases such as obstructive pulmonary disease, pulmonary infarction, deep vein thrombosis, gait disorder, blood flow obstructive anemia, Peripheral neurological diseases such as neuralgia and hyperlipemia, renal diseases such as renal hypertension, kidney disease, renal failure, angina pectoris, ischemic heart disease, and cardiac diseases such as myocardial infarction.

본 발명에서 제공하는 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.The composition provided herein may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or diluent that does not irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier for the composition to be formulated into a liquid solution include sterilized and suitable for the living body such as saline, sterilized water, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여된다. 투여방법은 특별히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 가령, 성인의 경우 1일 0.00001 내지 0.1mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 투여방법 및 환자의 나이, 건강, 체중, 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과 등의 요인에 따라 적절하게 변화될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention are administered by a suitable route of administration according to the formulation form. The method of administration is not particularly limited, and it can be administered by contents, external application, and injection. Injections can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, and the like. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the administration route and the period, but can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in the case of an adult, 0.00001 to 0.1 mg / kg per day may be administered. The administration can be carried out once a day or divided into several times. The dosage may be appropriately changed depending on factors such as the method of administration and the age, health, weight, nature and degree of symptoms of the patient, kind of simultaneous treatment, frequency of treatment, and desired effect.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 비브리오균 유래 단백질 분해효소 유전자의 클로닝Example 1. Cloning of proteolytic enzyme gene derived from Vibrio germ

비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) KCCM41679 균주로부터 전체 게놈 DNA를 분리하고, 이미 알려진 비브리오 프루니씨균 ATCC35016 유래의 메탈로프로테아제 유전자 염기서열을 기초로 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 증폭시켰다. 이때 사용한 프라이머 염기 서열은 다음과 같으며 발현 벡터로의 클로닝을 위해 정방향과 역방향 프라이머에 Eco RI 제한효소 자리(밑줄 표시)를 삽입하여 디자인하였다.The entire genomic DNA was isolated from the strain Vibrio furnissii KCCM41679, and the gene was amplified by a polymerase chain reaction based on the metalloprotease gene sequence derived from the already known Vibrio vulnificus ATCC35016. The primer sequences used were as follows. EcoRI restriction sites (underlined) were inserted into forward and reverse primers for cloning into expression vectors.

정방향 프라이머: 5'-CAAGCTTCTCGAGAATTCATGAAAACATTACAAC-3' (서열번호 3)Forward primer: 5'-CAAGCTTCTCGA GAATTC ATGAAAACATTACAAC-3 '(SEQ ID NO: 3)

역방향 프라이머: 5'-TGCAGGTACCCGGGAATTCTTAGTCCAGACGCAG-3' (서열번호 4)Reverse primer: 5'-TGCAGGTACCCGG GAATTC TTAGTCCAGACGCAG-3 '(SEQ ID NO: 4)

유전자 증폭을 위한 PCR 반응조건은 95℃에서 1분 변성, 55℃에서 40초 결합, 72℃에서 2분 30초 동안 신장반응을 25회 반복하였다. 증폭된 유전자 산물의 크기는 1,827bp이며, Eco RI을 이용하여 절단한 후 pFLAG-ATS 벡터에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환하여 형질전환체를 얻었고, 이때 얻어진 재조합 플라스미드를 pFLAG-ATS-vFMP라 명명하였다(도 1).The PCR reaction conditions for gene amplification were 1 minute denaturation at 95 ° C, binding at 55 ° C for 40 seconds, and extension at 72 ° C for 2 minutes and 30 seconds. The size of the amplified gene product was 1,827 bp. After digestion with Eco RI, the product was cloned into pFLAG-ATS vector and transformed into E. coli DH5α to obtain a transformant. The obtained recombinant plasmid was named pFLAG-ATS-vFMP (Fig. 1).

실시예 2. 재조합 혈전분해 효소의 정제Example 2. Purification of recombinant thrombolytic enzyme

재조합 혈전분해 효소(이하 rvFMP)의 발현을 위해 대장균 DH5α 균주를 이용하였고, 재조합 플라스미드 pFLAG-ATS-vFMP를 함유하고 있는 단일 클론을 100㎍/ml의 암피실린 항생제를 포함하고 있는 50ml LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 10ml의 배양액을 500ml의 신선한 항생제 포함 LB 배지에 접종하고, A600에서 0.8에 이를 때까지 배양하였다. 배양 후 단백질 발현 유도를 위해 0.2mM IPTG(isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 37℃에서 12시간 동안 처리한 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포를 100ml의 용출 완충액(30mM Tris-HCl(pH 8.0), 20% 수크로스, 1mM EDTA, 0.3mg/ml 라이소자임, 1mM PMSF)에 녹이고 4℃에서 30분간 반응시킨 후 용출 완충액에 담긴 세포를 13,000rpm 에서 20분간 원심분리하여 상층액만을 모은 다음 70% 황산암모늄(ammonium sulfate)을 이용하여 농축한 후, 두 가지 종류의 이온교환 크로마토그래피(Hitrap Q column과 Source 15 Q 4.6/100 PE column)와 크기 배제 크로마토그래피(Superdex G-75 column)를 이용하여 분리하였고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하여 정제된 단백질이 35kDa과 32kDa의 크기로 존재하고 있음을 확인하였다(도 2).E. coli strain DH5? Was used for expression of recombinant thrombolytic enzyme (hereafter rvFMP), and a single clone containing the recombinant plasmid pFLAG-ATS-vFMP was inoculated into 50 ml of LB medium containing 100 μg / ml of ampicillin antibiotic And incubated overnight at 37 ° C. Then, the inoculated culture medium of 10ml of fresh LB medium containing antibiotics of 500ml and was cultured at A 600, until it reaches 0.8. After incubation, 0.2 mM IPTG (isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside) was treated at 37 ° C. for 12 hours to induce protein expression, and cells were collected using a centrifuge. The collected cells were dissolved in 100 ml of elution buffer (30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% sucrose, 1 mM EDTA, 0.3 mg / ml lysozyme, 1 mM PMSF) and reacted at 4 ° C for 30 minutes. Cells Was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes to collect only the supernatant. The supernatant was concentrated using 70% ammonium sulfate and then subjected to two types of ion exchange chromatography (Hitrap Q column and Source 15 Q 4.6 / 100 PE column ) And size exclusion chromatography (Superdex G-75 column). It was confirmed that the purified protein was loaded on SDS-polyacrylamide gel to have a size of 35 kDa and 32 kDa (FIG. 2).

실시예 3. 피브리노겐(fibrinogen) 분해능 측정Example 3 Measurement of Fibrinogen Resolution

본 발명의 재조합 혈전분해 효소(rvFMP)의 피브리노겐 분해 능력을 측정하였다. 피브리노겐 30㎍에 0.5㎍의 rvFMP를 넣어 37℃에서 0, 10, 30, 60. 180, 300 및 600초간 반응을 시킨 후 1,10-phenanthroline으로 반응을 종결시켰다. 그 후 반응물들을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 확인하였다.The fibrinogen degrading ability of the recombinant thrombolytic enzyme (rvFMP) of the present invention was measured. 30 μg of fibrinogen was added to 0.5 μg of rvFMP and reacted at 37 ° C. for 0, 10, 30, 60, 180, 300 and 600 seconds, and terminated with 1,10-phenanthroline. The reactions were then confirmed on a 12% SDS-polyacrylamide gel.

그 결과 rvFMP가 10초 이내에 피브리노겐의 Aα와 Bβ를 완전히 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, γ의 경우 rvFMP에 저항성이 더 높으나 20분 후에는 완전히 분해되는 것을 확인할 수 있었다(도 3).As a result, it was confirmed that rvFMP completely decomposed A? And B? Of fibrinogen within 10 seconds, and γ was more resistant to rvFMP but completely decomposed after 20 minutes (FIG. 3).

실시예 4. 혈전분해능 측정Example 4. Measurement of thrombolysis ability

rvFMP의 혈전분해능을 측정하기 위해 96-웰 플레이트에 피브리노겐 90㎍에 17.7U의 트롬빈(thrombin) 10㎕를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 피브린 중합체를 형성시킨 후 2, 4 및 6㎍의 rvFMP과 2㎍의 플라스민(plasmin)을 각각 첨가하여 37℃에서 1시간동안 흡광도 A350을 측정하였다. 피브리노겐에 트롬빈을 첨가하여 형성시킨 피브린 중합체의 혼탁도를 100%로 하였고, rvFMP 또는 플라스민을 첨가한 용액의 상대적인 혼탁도를 분석하였다. 이는 용액의 혼탁도 감소를 통해 본 발명의 rvFMP의 피브린 중합체 분해능을 평가하는 것이다.In order to measure the thrombotic resolution of rvFMP, 10 μl of thrombin (17.7 U) was added to a 96-well plate of fibrinogen and reacted at 25 ° C for 1 hour to form a fibrin polymer. Then, 2, 4 and 6 μg rvFMP and 2 의 of plasmin were added, respectively, and the absorbance A 350 was measured at 37 캜 for 1 hour. The turbidity of the fibrin polymer formed by adding thrombin to fibrinogen was taken as 100%, and the relative turbidity of the solution containing rvFMP or plasmin was analyzed. This is to evaluate the ability of the rvFMP of the present invention to degrade the fibrin polymer by reducing the turbidity of the solution.

그 결과, 본 발명의 rvFMP가 모든 처리 농도에서 플라스민보다 더 뚜렷한 혼탁도 감소능을 지니고 있음을 확인하였고, 이는 rvFMP의 피브린 용해 효능이 플라스민보다 상대적으로 더 크다는 것을 의미했다(도 4).As a result, it was confirmed that the rvFMP of the present invention had a turbidity lowering ability more pronounced than that of plasmin at all treatment concentrations, which means that the fibrinolytic effect of rvFMP is relatively larger than that of plasmin (Fig. 4).

실시예 5. 피브린(fibrin) 분해능 측정Example 5. Measurement of fibrin resolution

rvFMP의 피브린 분해능은 피브린 평판법(fibrin plate)법을 이용하여 측정하였다. 1% 피브리노겐 2ml에 1% 아가로스 2ml을 섞고 17.7U의 플라스민 70㎕를 넣어 피브린 플레이트를 제작하였다. 그 후, 직경 5mm의 구멍을 뚫고, 구멍 안에 2㎍의 플라스민, 2㎍의 rvFMP, Tris-HCl(pH 7.5)를 넣고 37℃에서 5시간동안 활성화 시킨 후 투명환의 크기를 측정하였다. 최종적으로 투명환의 크기는 플라스민은 0.7cm, rvFMP는 1.1cm의 크기를 나타내어, rvFMP가 플라스민보다 2.5배 피브린 분해능이 좋은 것으로 확인되었다(도 5).The fibrin resolution of rvFMP was measured using the fibrin plate method. 2 ml of 1% fibrinogen and 2 ml of 1% agarose were mixed and 70 ml of 17.7 U of plasmin was added to prepare a fibrin plate. Thereafter, a hole having a diameter of 5 mm was drilled, and 2 μg of plasmin, 2 μg of rvFMP, and Tris-HCl (pH 7.5) were placed in the hole and activated at 37 ° C. for 5 hours. Finally, the size of the transparent ring was 0.7 cm for plasmin and 1.1 cm for rvFMP, and it was confirmed that rvFMP had better fibrin resolution 2.5 times than plasmin (Fig. 5).

실시예 6. 인간 혈장(plasma)를 이용한 혈전 분해능 측정Example 6 Measurement of thrombolytic activity using human plasma

rvFMP의 인간 혈장에서의 혈전 분해능을 측정하기 위해 96-웰 플레이트에 인간 혈장 90㎍에 17.7U의 트롬빈 10㎕를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 피브린 중합체를 형성시킨 후 2, 4 및 6㎍의 rvFMP와 2㎍의 플라스민을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 흡광도 A350을 측정하였다. 정상인의 혈장에 트롬빈을 첨가하여 형성시킨 피브린 중합체의 혼탁도를 100%로 하여, 상대적인 혼탁도를 분석하였다. 용액의 혼탁도가 감소되는 것은 용액 내 피브린의 분해에 따른 것이므로, 혼탁도 변화를 관찰하여 본 발명의 rvFMP의 혈전 분해능을 측정할 수 있다.In order to measure the thrombolytic ability of rvFMP in human plasma, 10 μl of 17.7 U of thrombin was added to 90 μg of human plasma in a 96-well plate and reacted at 25 ° C. for 1 hour to form a fibrin polymer. Then, 2, 4 and 6 by the addition of plasmin of the ㎍ rvFMP 2㎍ and for 2 hours at 37 ℃ was measured for absorbance a 350. The turbidity of the fibrin polymer formed by adding thrombin to plasma of a normal person was determined as 100%, and the relative turbidity was analyzed. Since the decrease in the turbidity of the solution is due to the decomposition of fibrin in the solution, the thrombolytic ability of the rvFMP of the present invention can be measured by observing the turbidity change.

그 결과, 본 발명의 rvFMP를 4 및 6㎍ 첨가한 경우에는 플라스민보다 더 뚜렷한 혼탁도 감소가 확인되었고, 이는 인간 혈장에서 rvFMP의 피브린 용해 효능이 플라스민보다 상대적으로 더 크다는 것을 의미하였다(도 6).As a result, when 4 and 6 μg of the rvFMP of the present invention were added, a marked decrease in turbidity was confirmed as compared with that of plasmin, which means that the fibrinolytic effect of rvFMP in human plasma was relatively larger than that of plasmin 6).

실시예 7. 염화제2철(FeClExample 7. Ferric chloride (FeCl 33 )에 의한 경동맥 혈전증 동물 모델에서 항혈전 효과 분석Analysis of Antithrombotic Effect in Animal Model of Carotid Thrombosis

FeCl3에 의해 유발된 혈관 손상 모델은 생체 내 혈전 형성을 연구하는데 널리 사용된다. 본 발명의 rvFMP의 항혈전/항응고 효과를 확인하기 위해, FeCl3에 의한 경동맥 혈전증 동물 모델을 사용하였다.The vascular injury model induced by FeCl 3 is widely used to study thrombus formation in vivo. To confirm the antithrombotic / anticoagulant effect of rvFMP of the present invention, an animal model of carotid thrombosis by FeCl 3 was used.

모든 동물실험은 조선대학교 실험동물운영위원회의 승인을 받은 실험방법에 따라 수행되었다(승인번호 : CIACUC2016-A0027). 본 발명에서는 Sprague-Dawley (SD) 쥐(이하 SD-렛트)를 사용하였다. SD-렛트는 스테인리스강 케이지에 넣어 순화기간을 거친 후, 통제된 조건(22±2℃, 12 시간 낮/밤 주기)하에 유지되었으며 음식물과 물은 자유식이를 하였다. 0.9㎎/㎏의 rvFMP를 생리식염수 완충용액에 섞어 SD-렛트의 꼬리 정맥에 주사하여 5일간 관찰하였다. 마취 마스크를 이용하여 3% 이소플루란에 노출시킨 후 동물이 마취가 되면, 70% 아산화 질소와 1.5% 이소플루란 그리고 30% 산소를 섞어 마취를 지속시키고 수술과정 내내 마취를 유지시켰다. SD-렛트에게 FeCl3 시약을 이용하여 혈전을 일으키기 10분 전에 유로키나제(urokinase) (4,000IU/kg ; 8 mg/kg), 또는 rvFMP (0.9 mg/kg)를 각각 투여하였고, 혈전을 유발하지 않은 대조구 동물에는 0.9% 식염수를 투여하였다. 아래턱 목 부근의 피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 오른쪽 경동맥을 노출시켰다. 혈전의 형성은 4% FeCl3 용액에 적신 2매의 여과지(6mm × 6mm)를 혈관에 덮어 유도하였다. 10분후에 여과지를 걷어내고 혈전을 포함하는 경동맥을 노출시키고 혈관부분(길이 20mm)을 절단하였다. 잘라낸 혈관을 4℃에서 4% 파라포름알데히드로 하루 동안 고정시키고, 혈관의 단면을 확인하기 위해 현미경하에서 혈관을 잘라 rvFMP에 의한 항 혈전효과를 확인하였다.All animal experiments were carried out according to the experimental method approved by Chosun University Experimental Animal Management Committee (approval number: CIACUC2016-A0027). In the present invention, Sprague-Dawley (SD) rats (hereinafter referred to as SD-rats) were used. The SD-Rette was kept under controlled conditions (22 ± 2 ° C, 12-hour day / night cycle) after being subjected to a purifying period in a stainless steel cage and the food and water were free-diet. 0.9 mg / kg of rvFMP was mixed with physiological saline buffer solution and injected into the tail vein of SD-rat for 5 days. After exposure to 3% isoflurane using an anesthesia mask, the animals were anesthetized and anesthesia was maintained throughout the surgical procedure by mixing 70% nitrous oxide, 1.5% isoflurane and 30% oxygen. SD-rats were treated with urokinase (4,000 IU / kg; 8 mg / kg) or rvFMP (0.9 mg / kg) 10 minutes before thrombolysis with FeCl 3 reagent, Control animals received 0.9% saline. The right carotid artery was exposed and the skin and muscles near the jaw were cut and the vagus nerve was not injured. The formation of thrombus was induced by covering two blood filter paper (6 mm x 6 mm) impregnated with 4% FeCl 3 solution in a blood vessel. Ten minutes later, the filter paper was removed, the carotid artery containing the thrombus was exposed, and the blood vessel portion (length 20 mm) was cut. The cut blood vessels were fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C for one day, and blood vessels were cut under a microscope to confirm the antithrombotic effect by rvFMP in order to confirm the cross section of the blood vessels.

그 결과, 혈전을 유발시키지 않은 0.9% 식염수 처리구의 혈관에서는 혈액 내 혈전이 유발되지 않은 상태를 확인할 수 있었고(도 7A), FeCl3 처리구의 혈관 단면에서는 혈액이 응고되어 혈전이 형성된 것을 확인할 수 있었으며(도 7B), 항 혈전 효과에 대한 양성 대조구로 사용한 유로키나제 전처리구(도 7C) 및 본 발명의 rvFMP 전처리구(도 7D)에서는 혈전의 생성이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 유로키나제 처리구에 비해, 본 발명의 rvFMP를 투여한 동물 모델에서 혈전 생성 억제 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.As a result, it was confirmed that no blood clot was induced in the blood of the 0.9% saline-treated blood vessel that did not induce thrombus (FIG. 7A), and blood clot was formed due to coagulation of the blood vessel in the FeCl 3 treatment (Fig. 7B), the urokinase pretreatment group (Fig. 7C) used as a positive control for antithrombotic effect and the rvFMP pretreatment group of the present invention (Fig. 7D) In particular, it was confirmed that the anti-thrombotic effect was more excellent in the animal model in which rvFMP was administered than the urokinase-treated rats.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses thereof <130> PN17032 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 608 <212> PRT <213> Vibrio furnissii <400> 1 Met Lys Thr Leu Gln Arg Gln Val Lys Ala Tyr Ser Gln Ser Val Arg 1 5 10 15 Leu Trp Leu Ser Arg Phe Arg Gln Arg Asn Gly Ser Pro Ser Lys Thr 20 25 30 Val Val Ser Phe Ser Lys His Lys Trp His Lys Lys Ala Ala Ser Ser 35 40 45 Arg Leu Pro Met Ala Ile Arg Pro Ser Lys Pro Phe Asn Cys Pro Thr 50 55 60 Glu Lys Leu Lys Cys Val Ile Ser Ser Cys Ile Thr Ala Phe Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Thr Arg Arg Trp Phe Arg Pro Asn Arg Val Lys Gly Ser Pro Lys 85 90 95 Cys Arg Ala Gly Trp His Arg Ala Leu Lys Pro Met Leu Pro Pro Leu 100 105 110 Ser Arg Arg Ser Met Arg Ser Arg Pro Ser Pro Lys Gln Gln Thr Ile 115 120 125 Leu Ala Pro Pro Thr Arg His Leu Arg Gly Arg Ile Cys Arg Trp Lys 130 135 140 Ile Asn Arg Arg Tyr Leu Trp Cys Ala Trp Met Thr Ser Ser Arg His 145 150 155 160 Asn Trp Cys Ile Trp Leu Thr Ser Leu Trp Arg Pro Ile Arg Leu Arg 165 170 175 Val Phe Leu Leu His Asp Ala Asn Ser Gly Asp Val Val Lys Gln Trp 180 185 190 Asp Gly Leu Ala His Ala Glu Ala Thr Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn 195 200 205 Gln Lys Thr Gly Met Tyr Gln Tyr Gly Thr Asp Tyr Pro Gly Phe Ala 210 215 220 Val Ser Lys Thr Gly Ser Thr Cys Thr Met Leu Ser Ser Ala Val Lys 225 230 235 240 Thr Val Asp Leu Lys Asn Lys Thr Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Ser Tyr 245 250 255 Asp Cys Asn Asn Ser Ser Asn Tyr Asn Asp Tyr Lys Ala Val Asn Gly 260 265 270 Ala Tyr Ser Pro Leu Asn Asp Ala His Tyr Phe Gly Lys Val Val Phe 275 280 285 Asp Met Tyr Asn Asp Trp Leu Asn Thr Ser Pro Leu Thr Phe Gln Leu 290 295 300 Thr Met Arg Val His Tyr Gly Ser Asn Tyr Glu Asn Ala Phe Trp Asp 305 310 315 320 Gly Ser Ala Met Thr Phe Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Phe Tyr Pro Leu 325 330 335 Val Asp Ile Asn Val Ser Ala His Glu Val Ser His Gly Phe Thr Glu 340 345 350 Gln Asn Ser Gly Leu Val Tyr Glu Gly Met Ser Gly Gly Ile Asn Glu 355 360 365 Ala Tyr Ser Asp Ile Ala Gly Glu Ala Ala Glu Tyr Tyr Met Arg Gly 370 375 380 Ser Val Asp Trp Val Val Gly Ser Asp Ile Phe Lys Ser Ser Gly Gly 385 390 395 400 Leu Arg Tyr Phe Asp Thr Pro Ser Lys Asp Gly Ser Ser Ile Asp His 405 410 415 Ala Ser Gln Tyr Tyr Ser Gly Ile Asp Val His His Ser Ser Gly Val 420 425 430 Phe Asn Arg Ala Phe Tyr Leu Leu Ser Asn Lys Gln Gly Trp Asp Val 435 440 445 Arg Lys Gly Phe Glu Val Phe Ala Val Ala Asn Gln Leu Tyr Trp Thr 450 455 460 Pro Asn Ser Thr Phe Asp Glu Gly Ala Cys Gly Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480 Gln Asp Leu Gly Tyr Asn Val Asn Asp Val Thr Ala Ala Phe Thr Thr 485 490 495 Val Gly Val Asn Ser Ser Cys Ser Val Asp Ser Gly Asn Glu Leu Val 500 505 510 Lys Gly Gln Pro Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Ala Gly Ser Glu Ser 515 520 525 Phe Tyr Thr Phe Thr Val Asn Ser Ala Thr Thr Ala Thr Val Ser Ile 530 535 540 Ser Ser Gly Ser Gly Asp Val Asp Leu Tyr Val Lys Ala Gly Ser Lys 545 550 555 560 Pro Thr Thr Ser Ser Trp Asp Cys Arg Pro Tyr Arg Ser Gly Asn Asn 565 570 575 Glu Gln Cys Ser Ile Ser Ala Val Ala Gly Thr Thr Tyr His Val Met 580 585 590 Leu Lys Gly Tyr Ser Ala Tyr Leu Pro Gly Val Thr Leu Arg Leu Asp 595 600 605 <210> 2 <211> 1827 <212> DNA <213> Vibrio furnissii <400> 2 atgaaaacat tacaacgtca agttaaagct tactcgcagt cggtacggtt atggctttcc 60 cggtttcggc agcgcaatgg gtcgccgtcg aagacagtgg tcagtttcag caaacataag 120 tggcacaaaa aggcagcatc gtcacgcctg ccaatggcta tcaggccatc aaaaccattc 180 aactgcccaa cggaaaagtt aaagtgcgtt atcagcagtt gtatcacggc gttccggtat 240 tcaacacggc ggtggtttcg accgaatcga gtaaagggat caccaaagtg cagggcagga 300 tggcacaggg cattgaagcc gatgttgcca ccgttaagcc gacgctcgat gagaagcagg 360 ccatcgccaa agcagcagac aattttagcg ccgccaacgc gtcatttacg gggcaggatc 420 tgccgatgga aaatcaatcg gcggtattta tggtgcgctt ggatgaccag cagcaggcac 480 aactggtgta tctggttaac ttctttgtgg cgtccgatac gcctgcgcgt ctttctactt 540 catgatgcca acagtggcga cgtggtgaaa cagtgggatg gtttggcgca cgcggaagcg 600 acgggcactg gccctggcgg taaccagaaa acaggcatgt atcaatacgg caccgattat 660 ccgggatttg cggtgagtaa aaccggttca acctgtacca tgctgagttc tgcggtcaaa 720 accgtagacc taaagaacaa aacatcaggc acgacagcct acagctacga ctgtaacaac 780 agcagtaact acaacgatta caaagcggtg aatggtgcct attcgccgct caatgacgcc 840 cactacttcg gtaaagtggt gttcgacatg tacaacgatt ggttgaatac ctcgccgctg 900 acgtttcagc taaccatgcg tgtgcattac ggcagcaatt atgagaacgc gttctgggat 960 ggctctgcca tgacgtttgg tgacggctat tcaacctttt atccgctggt ggacatcaac 1020 gtgagtgcgc acgaagtcag ccatggcttt actgagcaaa actcaggtct ggtatatgaa 1080 ggtatgtcag gcggtatcaa cgaagcctac tcggatatcg cgggcgaagc ggcggaatac 1140 tacatgcgcg gttcggtaga ctgggtggtc ggcagcgaca tctttaagtc gtccggcggc 1200 ctgcgctact tcgatacgcc gtcgaaagat ggcagctcga ttgatcacgc ttctcagtac 1260 tacagcggca tcgacgtgca ccattcaagc ggtgtgttca accgtgcgtt ctacttgctt 1320 tcgaacaaac aaggttggga tgtgcgcaaa ggttttgaag tgtttgccgt ggcaaaccaa 1380 ctctactgga cgccaaacag cacctttgat gaaggcgcgt gtggtgtggt gaaagctgcg 1440 caagatttgg gttacaacgt caatgatgtg actgcggcct ttaccacggt tggcgtgaac 1500 tcgtcatgtt ctgtggattc tggcaatgaa cttgttaaag gccaacccgt gactggtctt 1560 tctggttctg cgggttctga atcgttctac acctttacgg tgaacagcgc gacaaccgcg 1620 acggtctcga tcagttctgg ttcgggtgat gtggatctgt acgtgaaagc gggcagtaaa 1680 ccgaccacca gttcttggga ttgccgtcca tatcgttcgg gcaataacga gcagtgttcg 1740 atctcggctg ttgcaggcac cacgtatcac gtgatgctga aaggctacag cgcctatttg 1800 cccggtgtga cgctgcgtct ggactaa 1827 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caagcttctc gagaattcat gaaaacatta caac 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcaggtacc cgggaattct tagtccagac gcag 34 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses          the <130> PN17032 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 608 <212> PRT <213> Vibrio furnissii <400> 1 Met Lys Thr Leu Gln Arg Gln Val Lys Ala Tyr Ser Gln Ser Val Arg   1 5 10 15 Leu Trp Leu Ser Arg Phe Arg Gln Arg Asn Gly Ser Pro Ser Lys Thr              20 25 30 Val Val Ser Phe Ser Lys His Lys Trp His Lys Lys Ala Ala Ser Ser          35 40 45 Arg Leu Pro Met Ala Ile Arg Pro Ser Lys Pro Phe Asn Cys Pro Thr      50 55 60 Glu Lys Leu Lys Cys Val Ile Ser Ser Cys Ile Thr Ala Phe Arg Tyr  65 70 75 80 Ser Thr Arg Arg Trp Phe Arg Pro Asn Arg Val Lys Gly Ser Pro Lys                  85 90 95 Cys Arg Ala Gly Trp His Arg Ala Leu Lys Pro Met Leu Pro Pro Leu             100 105 110 Ser Arg Arg Ser Ser Arg Ser Ser Pro Ser Ser Lys Gln Gln Thr Ile         115 120 125 Leu Ala Pro Pro Thr Arg His Leu Arg Gly Arg Ile Cys Arg Trp Lys     130 135 140 Ile Asn Arg Arg Tyr Leu Trp Cys Ala Trp Met Thr Ser Ser Arg His 145 150 155 160 Asn Trp Cys Ile Trp Leu Thr Ser Leu Trp Arg Pro Ile Arg Leu Arg                 165 170 175 Val Phe Leu Leu His Asp Ala Asn Ser Gly Asp Val Val Lys Gln Trp             180 185 190 Asp Gly Leu Ala His Ala Glu Ala Thr Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn         195 200 205 Gln Lys Thr Gly Met Tyr Gln Tyr Gly Thr Asp Tyr Pro Gly Phe Ala     210 215 220 Val Ser Lys Thr Gly Ser Thr Cys Thr Met Leu Ser Ser Ala Val Lys 225 230 235 240 Thr Val Asp Leu Lys Asn Lys Thr Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Ser Tyr                 245 250 255 Asp Cys Asn Asn Ser Ser Asn Tyr Asn Asp Tyr Lys Ala Val Asn Gly             260 265 270 Ala Tyr Ser Pro Leu Asn Asp Ala His Tyr Phe Gly Lys Val Val Phe         275 280 285 Asp Met Tyr Asn Asp Trp Leu Asn Thr Ser Pro Leu Thr Phe Gln Leu     290 295 300 Thr Met Arg Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Glu Asn Ala Phe Trp Asp 305 310 315 320 Gly Ser Ala Met Thr Phe Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Phe Tyr Pro Leu                 325 330 335 Val Asp Ile Asn Val Ser Ala His Glu Val Ser His Gly Phe Thr Glu             340 345 350 Gln Asn Ser Gly Leu Val Tyr Glu Gly Met Ser Gly Gly Ile Asn Glu         355 360 365 Ala Tyr Ser Asp Ile Ala Gly Glu Ala Ala Glu Tyr Tyr Met Arg Gly     370 375 380 Ser Val Asp Trp Val Val Gly Ser Asp Ile Phe Lys Ser Ser Gly Gly 385 390 395 400 Leu Arg Tyr Phe Asp Thr Pro Ser Lys Asp Gly Ser Ser Ile Asp His                 405 410 415 Ala Ser Gln Tyr Tyr Ser Gly Ile Asp Val His His His Ser Ser Gly Val             420 425 430 Phe Asn Arg Ala Phe Tyr Leu Leu Ser Asn Lys Gln Gly Trp Asp Val         435 440 445 Arg Lys Gly Phe Glu Val Phe Ala Val Ala Asn Gln Leu Tyr Trp Thr     450 455 460 Pro Asn Ser Thr Phe Asp Glu Gly Ala Cys Gly Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480 Gln Asp Leu Gly Tyr Asn Val Asn Asp Val Thr Ala Ala Phe Thr Thr                 485 490 495 Val Gly Val Asn Ser Ser Cys Ser Val Asp Ser Gly Asn Glu Leu Val             500 505 510 Lys Gly Gln Pro Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Ala Gly Ser Glu Ser         515 520 525 Phe Tyr Thr Phe Thr Val Asn Ser Ala Thr Thr Ala Thr Val Ser Ile     530 535 540 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser. 545 550 555 560 Pro Thr Thr Ser Ser Trp Asp Cys Arg Pro Tyr Arg Ser Gly Asn Asn                 565 570 575 Glu Gln Cys Ser Ser Ser Ala Val Ala Gly Thr Thr Tyr His Val Met             580 585 590 Leu Lys Gly Tyr Ser Ala Tyr Leu Pro Gly Val Thr Leu Arg Leu Asp         595 600 605 <210> 2 <211> 1827 <212> DNA <213> Vibrio furnissii <400> 2 atgaaaacat tacaacgtca agttaaagct tactcgcagt cggtacggtt atggctttcc 60 cggtttcggc agcgcaatgg gtcgccgtcg aagacagtgg tcagtttcag caaacataag 120 tggcacaaaa aggcagcatc gtcacgcctg ccaatggcta tcaggccatc aaaaccattc 180 aactgcccaa cggaaaagtt aaagtgcgtt atcagcagtt gtatcacggc gttccggtat 240 tcaacacggc ggtggtttcg accgaatcga gtaaagggat caccaaagtg cagggcagga 300 tggcacaggg cattgaagcc gatgttgcca ccgttaagcc gacgctcgat gagaagcagg 360 ccatcgccaa agcagcagac aattttagcg ccgccaacgc gtcatttacg gggcaggatc 420 tgccgatgga aaatcaatcg gcggtattta tggtgcgctt ggatgaccag cagcaggcac 480 aactggtgta tctggttaac ttctttgtgg cgtccgatac gcctgcgcgt ctttctactt 540 catgatgcca acagtggcga cgtggtgaaa cagtgggatg gtttggcgca cgcggaagcg 600 acgggcactg gccctggcgg taaccagaaa 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ttaccacggt tggcgtgaac 1500 tcgtcatgtt ctgtggattc tggcaatgaa cttgttaaag gccaacccgt gactggtctt 1560 tctggttctg cgggttctga atcgttctac acctttacgg tgaacagcgc gacaaccgcg 1620 acggtctcga tcagttctgg ttcgggtgat gtggatctgt acgtgaaagc gggcagtaaa 1680 ccgaccacca gttcttggga ttgccgtcca tatcgttcgg gcaataacga gcagtgttcg 1740 atctcggctg ttgcaggcac cacgtatcac gtgatgctga aaggctacag cgcctatttg 1800 cccggtgtga cgctgcgtct ggactaa 1827 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caagcttctc gagaattcat gaaaacatta caac 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcaggtacc cgggaattct tagtccagac gcag 34

Claims (9)

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 비브리오 프루니씨(Vibrio furnissii) 유래의 재조합 혈전분해 효소.A recombinant thrombolytic enzyme derived from Vibrio furnissii consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서, 상기 혈전분해 효소는 피브리노겐의 Aα, Bβ 또는 γ 사슬을 선택적으로 분해하는 것을 특징으로 하는 재조합 혈전분해 효소.The recombinant thrombolytic enzyme according to claim 1, wherein the thrombolytic enzyme selectively degrades the A?, B? Or? Chain of fibrinogen. 제1항 또는 제2항의 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 함유하는 혈전분해용 조성물.A composition for thrombolysis comprising the recombinant thrombolytic enzyme of claim 1 or 2 as an active ingredient. 제3항의 조성물을 혈전을 포함하고 있는 인간을 제외한 개체에 처리하여 혈전을 분해하는 방법.A method for decomposing thrombus by treating the composition of claim 3 except for a human containing thrombus. (a) 제1항의 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양물 또는 배양상등액으로부터 재조합 혈전분해 효소를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 혈전분해 효소의 생산 방법.
(a) culturing a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme of claim 1; And
(b) recovering the recombinant thrombolytic enzyme from the culture or the culture supernatant of the step (a).
제5항에 있어서, 상기 재조합 혈전분해 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 혈전분해 효소의 생산 방법.[Claim 6] The method according to claim 5, wherein the gene encoding the recombinant thrombolytic enzyme comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 제5항의 방법에 의해 생산된 재조합 혈전분해 효소.A recombinant thrombolytic enzyme produced by the method of claim 5. 제1항 또는 제7항의 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.A health functional food composition for preventing or improving thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme of claim 1 or 7 as an active ingredient. 제1항 또는 제7항의 재조합 혈전분해 효소를 유효성분으로 포함하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis comprising the recombinant thrombolytic enzyme of claim 1 or 7 as an active ingredient.
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Med Microbiol Immunol, 1989, Vol. 178, pp. 279-287.
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