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KR101878274B1 - 암 치료용 암 용해성 아데노바이러스 - Google Patents

암 치료용 암 용해성 아데노바이러스 Download PDF

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KR101878274B1
KR101878274B1 KR1020117029097A KR20117029097A KR101878274B1 KR 101878274 B1 KR101878274 B1 KR 101878274B1 KR 1020117029097 A KR1020117029097 A KR 1020117029097A KR 20117029097 A KR20117029097 A KR 20117029097A KR 101878274 B1 KR101878274 B1 KR 101878274B1
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펀다시오 인스티튜트 드’인베스티가시오 바이오메티칼 드 벨리비티게 (아이디벨)
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Abstract

본 발명은 게놈에 삽입된, 히알루로니다제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 암 용해성 아데노바이러스에 관한 것이다. 이 아데노바이러스는 종양 덩어리에 보다 효율적으로 퍼지며, 그래서 암 용해 효과는 증가된다. 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스를 혈관내로 주입하면, 종양 체적의 감퇴가 이루어진다. 따라서, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스는 암 또는 암의 전암성 상태의 치료에 사용가능하다.

Description

암 치료용 암 용해성 아데노바이러스{ONCOLYTIC ADENOVIRUSES FOR TREATING CANCER}
본 발명은 의학 분야, 보다 구체적으로는 종양 분야 및 특히 바이러스요법 분야에 관한 것이다.
현행 암 치료는 주로 화학요법, 방사선 요법 및 수술을 기본으로 한다. 초기 단계의 암은 치유율이 높지만, 대부분의 진행된 암인 경우, 수술로는 근절할 수 없거나, 또는 투여되는 방사성 또는 화학요법제의 용량이 정상 세포에 대한 독성으로 인해 제한적이기 때문에, 치유불가능하다. 이런 상황을 개선시키기 위해, 암 치료의 효능과 선택성을 높이고자 하는 생물공학적 전략이 개발되고 있다. 특히 유전자 치료법과 바이러스요법은 암에 대한 치료 목적으로 바이러스를 사용한다. 유전자 치료법에서, 바이러스는 복제되지 않으면서 치료 유전자 물질의 비히클 또는 벡터로서 제공되도록 변형된다. 반면, 바이러스요법은 종양 세포에서만 선택적으로 복제하고 증식하는 바이러스를 이용한다. 바이러스요법에서, 종양 세포는 치료 유전자의 작용에 의해서라기 보다는 내부에서의 바이러스의 복제에 의해 야기되는, 세포병리 효과에 의해 사멸한다. 종양 세포에서 우선되는 복제를 온코트로피즘(oncotropism)이라고 하며, 종양의 세포 용혈을 암 용해(oncolysis)라고 한다. 엄격한 의미에서, 종양에서 선택적으로 복제하는 바이러스를 암 용해성(oncolytic)이라고 하며, 넓은 의미에서, 암 용해성이라는 용어는 심지어 선택성은 없더라도 종양 세포를 용해시킬 수 있는 모든 복제-적합 바이러스에 적용될 수 있다. 이러한 설명에서, 암 용해성이라는 용어는 2가지 의미로 사용된다.
암의 바이러스요법은 유전자 치료법 보다 일찍 시도되었다. 바이러스를 이용한 종양 치료에 대한 최초의 보고는 지난 세기 초기로 거슬러 올라간다. 1921년, De Pace는 자궁 경부암에 토끼 바이러스를 접종한 후 종양의 관해 결과를 수득하였다. 그 후, 다수 타입의 바이러스들을 치료를 위해 종양에 주사하였다. 자율적인(autonomous) 파르보바이러스, 소수포성 구내염 바이러스 및 레오바이러스 등의 천연 온코트로피즘을 나타내는 바이러스들이었다. 그외 바이러스들도 종양에서 선택적으로 복제하도록 유전자 조작할 수 있다. 예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)는 종양 세포와 같이 활발하게 증식하는 세포에서는 불필요한 효소 활성인 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자를 제거함으로써 온코트로픽이 된다. 그러나, 아데노바이러스가, 이의 낮은 병원성과 높은 종양 세포 감염성으로 인해, 바이러스요법과 암의 유전자 치료법에 보다 흔히 사용되는 바이러스이다.
아데노바이러스에서는 51가지의 인간 혈청형이 동정되었으며, 이들은 A에서 F까지 6개의 그룹으로 분류된다.
C 그룹에 속하는, 아데노바이러스 인간 5형(Ad5)은 36 kb의 선형 DNA를 팩킹하는 단백질 20면체 캡시드로 구성된 바이러스이다. 성인에서는 Ad5 감염시 일반적으로 증상이 없지만, 어린이의 경우 일반적인 감기와 결막염을 유발한다. 일반적으로, Ad5는 상피 세포에 감염하며, 자연 감염 경로에서는 기관지 상피 세포에 감염한다. 바이러스는 캡시드의 12개의 정상부에서 안테나처럼 길게 뻗어나온 바이러스 단백질인 섬유질과, 콕사키-아데노바이러스 수용체(CAR)라고 하는 세포간 접착에 관여하는 세포성 단백질의 상호작용에 의해 세포로 도입된다. 바이러스 DNA가 핵 내부에 도달하면, 바이러스의 초기 유전자는 순차적으로 전사되기 시작한다(E1 -> E4). 발현되는 첫번째 바이러스 유전자는 초기 영역 1A(E1A)의 유전자들이다. E1A는 세포성 단백질 Rb에 결합하여, E2F를 방출하며, 이것은 E2, E3 및 E4와 같은 다른 바이러스 유전자들의 전사와, 세포 주기를 활성화하는 세포 유전자들의 전사를 활성화한다. 한편, E1B는 p53에 결합하여 세포 주기를 활성화하고 감염된 세포의 세포자살을 방지한다. E2는 바이러스 복제에 참가하는 단백질을 코딩하며; E3는 항바이러스 면역 반응을 저해하는 단백질을 코딩하며; E4는 바이러스 RNA 운반에 참여하는 단백질을 코딩한다. 초기 유전자들의 발현이 바이러스 DNA의 복제를 유도하게 되고, DNA가 복제되면, 주요 후기 프로모터가 활성화되면서, 차별적인 스플라이싱이 이루어진 후 캡시드를 형성하는 구조 단백질을 코딩하는 전체 RNA를 만드는, 메신저 RNA의 전사가 추진된다.
암 용해성 아데노바이러스의 설계와 관련하여 고려되는 중요한 측면 2가지가 있다: 선택성과 효능. 종양 세포에 대한 선택성을 수득하기 위해, 3가지 전략이 사용되고 있다: 정상 세포에서의 복제에서는 필수적이지만 종양 세포에서는 필요없는 바이러스 기능의 제거; 종양-선택적인 프로모터를 이용하여 복제를 개시하는 바이러스 유전자의 통제; 및 숙주 세포의 감염에 관여하는 바이러스 캡시드 단백질의 변형. 이들 유전자 변형으로, 상당한 수준의 선택성이 획득되며, 종양 세포에서의 복제 효능은 정상 세포에서의 복제 효능의 10000배 월등하다. 암 용해 효능과 관련하여, 또한, 몇가지 유전자 변형이 이를 높이는 것으로 언급되었다. 이러한 변형으로는, a) 예컨대 E1B19K 소거, E3-11.6K(ADP) 과다 발현 또는 E3/19K 단백질의 원형질막내 위치화에 의한, 바이러스의 방출 증가; 및 b) 암 용해성 아데노바이러스의 게놈에 치료 유전자를 삽입하여, "무장된 암 용해성 아데노바이러스(armed oncolytic adenovirus)"의 제조. 이 경우에, 치료 유전자는 방관자 효과(즉, 비-감염된 이웃 세포를 사멸시킴)로 프로드럭의 활성화, 종양에 대한 면역계의 활성화, 세포자살의 유도, 혈관신생의 저해, 또는 세포외 기질의 제거 등에 의해, 비-감염된 종양 세포의 사멸을 매개해야 할 것이다. 이럴 경우, 치료 유전자의 발현 방식과 시기는 치료학적 접근법의 최종적인 성과에 중요할 것이다.
과거 10년 동안, 특히 두경부암, 난소암, 결장직장암, 췌장암 및 간세포암 환자에게 여러가지 암 용해성 아데노바이러스를 투여해왔다. 이들 아데노바이러스는 임상 실험에서 안전성 프로파일이 매우 우수하였다. 독감 유사 증상 및 트랜스아미나제 수준 증가 등의 검출되는 부작용들은, 바이러스를 고용량으로 전신 투여한 후에도 충분히 허용되는 수준이었다(D. Ko et al., "Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses", Oncogene 2005, vol. 24, pp. 7763-74; and T. Reid et al., "adenoviral Intravascular agents in cancer patients: lessons from clinical trials", Cancer Gene Therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). 재조합 아데노바이러스의 투여로 종양 증식의 부분적인 억제가 유도되었지만, 종양의 완전한 근절은 달성되지 않았고, 단기간 경과 후 종양은 빠르게 재증식하였다. 이러한 결과들은, 주입된 아데노바이러스가 단순히 종양의 일부들에만 분배되어, 비감염된 세포가 신속하게 계속 증식함으로써, 제한된 항종양 반응이 발생되었기 때문일 가능성이 있다. 최근 연구에서, 암 용해성 아데노바이러스의 인간 이종이식 종양에서의 복제는 종양의 완전한 근절에 이르진 못했지만 전신 투여 후 100일까지 지속되는 것으로 관찰되었다(H. Sauthoff et al., "Intratumoural spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumours: virus persists and spreads systemically at late time points ", Human Gene Therapy 2003, vol. 14, pp. 425-33). 이러한 낮은 항종양 효과는, 부분적으로는, 종양에서 결합 조직과 세포외 기질(ECM)이 종양내 아데노바이러스의 전파를 방지하기 때문이다.
암 용해성 아데노바이러스가 종양내로 효과적으로 전파되기 어렵다는 점은, 또한, 독소루비신, 탁솔, 빈크리스틴 또는 메토트렉세이트와 같은 그외 항종양 약물에서도 언급되었다. 많은 연구들에서, 종양 세포의 화학요법제 내성에 있어 ECM의 작용을 입증하였다(BP Toole et al., "Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells ", Seminars in Cancer Biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). 종양 및 기질 세포는 콜라겐, 프로테오글리칸과, 종양 내부로 마크로분자의 이동을 어렵게하는 그외 분자로 구성된 매트릭스를 만들어내고, 이를 조립한다. 히알루론산(HA)은 치료 약물에 대한 종양 세포의 내성에 관여하는 ECM의 주요 구성 성분들 중 하나이다. HA는 매우 다양한 악성 조직들에서 과다 발현되며, 다수의 경우에 HA 수준은 종양 진행의 예후 인자이다. HA의 수용체 CD44와 RHAMM의 상호작용은 종양의 생존과 침습성을 증가시킨다. 또한, HA는 세포 접착 및 이동을 유도함으로써 종양 전이를 촉진시킬 수 있으며, 면역계에 대한 방어를 촉진시킬 수 있다.
한편, 히알루론산과 종양 세포 간의 상호작용의 저해는, 다수 약물에 대한 내성을 복원시킨다. 여러가지 연구들에서, 히알루로니다제(HA를 분해하는 효소)가 흑색종, 카포시 육종, 두경부암 및 대장암의 간 전이가 있는 환자들에서 다양한 화학요법제의 활성을 높인다는 것이 나타났다. 히알루로니다제의 작용 기전은 여전히 모르지만, 세포 생존과 관련된 시그널링 경로의 저해 결과라기 보다는, 일반적으로 세포 접착 경계 감소, 세포간 압력 감소 및 종양내 항종양 약물의 침투성 개선이 원인일 것으로 생각되고 있다.
최근, 종양내 주입에 의한 히알루로니다제와 암 용해성 아데노바이러스의 공동-투여가, 종양 진행을 약화시킨다는 것이 확인되었다(S. Ganesh et al., "Intratumoural coadministration of hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in mestastasic tumour models", Clin Cancer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41). 이들 연구들에서, 암 용해성 아데노바이러스는 4번의 종양내 주입으로 투여되며, 히알루로니다제는 모든 치료 기간 동안 2일 마다 종양내로 투여된다. 이러한 투여 요법은, 대부분의 종양이 종양내 주입 접근성이 좋지 않기 때문에, 거의 사용되지 않는다. 산재된 질환(전이)을 가진 환자에서는 가네쉬와 동료 학자들에 의해 제시된 치료가 유익하지 않았다.
지금까지의 노력에도 불구하고, 암 치료에 유효한 새로운 치료 접근법의 탐색이 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은, 게놈에 히알루로니다제 유전자를 함유하고 있는 복제성 아데노바이러스가, 종양 덩어리로 보다 효율적으로 배분되는 것을, 확인하게 되었다. 암 용해성 아데노바이러스에 의한 히알루로니다제의 발현으로, 종양의 세포외 기질의 일부인 히알루론산이 분해된다. 히알루론산이 분해되면 종양에서의 세포간 압력이 낮아지고, 아데노바이러스 전파에 대한 종양의 내성이 낮아지게 되며, 그래서, 종양 덩어리내에서 바이러스의 세포에서 세포로의 전파가 향상된다. 이러한 개선된 전파는 암 용해 효능 증가로 전환된다. 본 발명자들은, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스의 혈관내 주입으로, 종양 체적이 축소된다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스는 암의 치료에 유용하다. 또한, 히알루로니다제 유전자의 발현은 바이러스 복제나 암 용해성 아데노바이러스의 세포독성에도 영향을 미치지 않는다.
앞서 언급한 바와 같이, 암 용해성 아데노바이러스와 가용성 히알루로니다제의 종양내 공동-투여가, 암 용해성 아데노바이러스의 항종양 효능을 높인다는 것이 개시되었다. 그러나, 본 발명 이전에는, 암의 치료를 위한 임의의 암 용해성 아데노바이러스에 히알루로니다제 유전자가 도입되지 않았다.
실시예에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스의 종양내 생체내 투여는, 히알루로니다제의 삽입 없이도, 아데노바이러스 조절에 대한 항종양 효과를 개선시킨다(도 7 참조). 또한, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스를 혈관내 주입하였을 때(도 8 및 도 9 참조), 가네쉬 등의 원고의 도 2에 제시된 결과와 비교하여, 훨씬 강한 종양 증식 저해가 본 발명의 아데노바이러스에서 관찰된다. 이는, 본 발명의 치료가 더 유효하다는 것을 의미한다. 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스(ICOVIR17)를 주입한 마우스의 종양에서는, 아데노바이러스 대조군 ICOVIR15를 주입한 종양과 비교하여, 매우 광범위한 괴사 면적, 작은 생존 세포 영역 및 바이러스 복제가 보여지는 크고 많은 센터들이 관찰된다.
또한, 본 발명의 아데노바이러스는 투여되는 용량이 더 적다: Ganesh et al. (상기 참조)에서는, 1x1010의 바이러스 입자를 4번 종양내 주사로 투여하지만, 본 발명에서는, 2x109의 바이러스 입자를 1회 혈관내 용량으로 투여한다. 이는, 20배의 용량 감소를 의미하며, 단일 투여의 우월성을 나타낸다. 이러한 방법에서, 가네쉬 등은 실험 전 기간 동안 2일 마다 히알루로니다제를 종양내 투여한다. 또한, 아데노바이러스는 치료 개시시에 종양내로 투여된다. 이러한 바이러스 및 히알루로니다제의 종양내 투여는, 대부분의 종양의 경우 종양내 투여하기에는 접근성이 좋지 않기 때문에, 클리닉에서는 거의 이용할 수 없다. 아마도, 히알루로니다제와 아데노바이러스의 가용성 조합-투여는 2가지 성분이 함께 유기체내 산재된 종양 세포에 도달할 확율이 낮기 때문에, 전신 경로로는 행해지지 않는다.
본 발명은, 바이러스 복제가 이루어지는 부위와 시기에 히알루로니다제가 발현되게 한다. 이러한 히알루로니다제의 발현은 종양 덩어리 전체로의 바이러스 분포를 개선시키고 항종양 효능을 높인다. 동물에서 높은 치료 효능으로 조정된 용량을 무독성으로 투여하는 것이 가능하다.
본 발명에서, 암 용해성 아데노바이러스는 표적 종양 세포에 도달한다. 내부에서, 바이러스가 복제하고, 이의 캡시드 단백질이 발현되며, 동시에 아데노바이러스 게놈내에 코딩된 히알루로니다제가 발현된다. 이 히알루로니다제는 세포 주변을 둘러싼 세포외 매질로 방출되도록 변형된 것이다. 세포외 매질에서, 히알루로니다제는 기질을 파괴하여, 복제된 아데노바이러스가 주변 종양 세포로 감염되는 것을 돕는다.
즉, 본 발명의 측면들은 게놈에 삽입된 히알루로니다제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 암 용해성 아데노바이러스에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "암 용해성 아데노바이러스"는 복제할 수 있거나, 또는 종양 세포에서 복제-적격 아데노바이러스를 의미한다. 이 설명에서, 암 용해성 아데노바이러스 및 복제성 아데노바이러스는 동의어이다. 그러나 이는 표적 세포에서 복제할 수 없기 때문에, 비-복제성 아데노바이러스와는 구분된다. 비-복제성 아데노바이러스는, 목적이 무손상 세포내에서 치료 유전자를 발현하지만 세포의 용혈이 목적은 아니기 때문에, 표적 세포에 유전자의 담체로서 유전자 유법에 사용된다. 실제, 암 용해성 아데노바이러스의 치료학적 작용은, 표적 세포, 특히 제거할 종양 세포에서 복제하여 세포 용혈시키는 능력을 기반으로 한다.
본 발명의 다른 측면은, 치료학적 유효량의 암 용해성 아데노바이러스를, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 약제로서 이용하기 위한 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 등의 포유류에서 암 또는 암의 전-암성(pre-malignant) 형태를 치료하기 위한, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 등의 포유류에서 암 또는 암의 전-암성 형태의 치료용 약제를 제조하기 위한, 암 용해성 아데노바이러스의 용도에 관한 것이다. 치료는 종양내에서의 이들 암 용해성 아데노바이러스의 복제를 기초로 한다. 다른 예로, 본 발명의 이러한 측면은, 암 용해성 아데노바이러스를 유효량으로 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 사람 등의 포유류에서의, 암 또는 암의 전암 형태의 치료 방법으로 발전시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스의 구축을 위한 아데노바이러스 게놈과 재조합할 수 있는 셔틀 벡터에 관한 것이다. 이 벡터는, 아데노바이러스의 말단 반복 서열("역순의 말단 반복(inverted terminal repeat)", ITR), 효소 히알루로니다제를 코딩하는 서열의 발현을 촉진시키는 서열, 상기 효소를 코딩하는 서열 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 암 용해성 아데노바이러스는 인간에 감염되는 것으로 의미되는 인간 아데노바이러스이다. 특히, 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 51 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. "유도체"는 2종 이상의 상이한 혈청형의 아데노바이러스의 재조합 아데노바이러스 하이브리드, 예컨대 혈청형 5의 아데노바이러스와, 혈청형 3의 아데노바이러스의 섬유질의 재조합 아데노바이러스 하이브리드를 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 인간 암 용해성 아데노바이러스는 혈청형 5이다.
히알루로니다제는 히알루론산을 분해하는 효소 패밀리이다. 인간의 경우, 특성과 위치가 다른 히알루로니다제를 코딩하는 유전자 3종을 가지고 있다. 이소형인 Hyal1과 Hyal2는 대부분의 조직들에 존재하고 있다. Hyal1은 인간 혈장에서 가장 많은 형태이다. Hyal3는 골수와 고환에 존재하고 있지만, 이의 기능은 잘 특정화되지 않았다. 히알루로니다제 PH20은 고환에서 고도로 발현되며, 정자에 의한 난모 세포의 수정 과정에 참여한다. 히알루로니다제 PH20은 원형질막과 정자의 내부 선체막(internal acrosomal membrane)에 고정되어 있으며, 적운형(히알로룬산이 다량 존재)의 세포외 기질을 통과하여 난모 세포의 투명한 영역에 도달하는 침투하는 능력을 정자에게 부여한다. 첨체 반응(acrosomal reaction) 동안에, 정자의 막에 고정된 히알루로니다제 일부는 효소적으로 처리되어, 선체막으로부터 방출되는 단백질의 가용성 형태가 된다. 또한, 히알루로니다제는 뱀, 거미, 전갈 및 벌의 독소의 전파 인자로서 동정되었다.
특정 구현예에서, 효소 히알루로니다제는 포유류의 고환 히알루로니다제이며, 보다 구체적으로는 인간 고환 히알루로니다제이다. 인간 고환 히알루로니다제 (GenBank GeneID: 6677)는 또한 SPAM1 또는 정자 점착 분자 1, 및 PH-20로서 알려져 있다. 막 단백질 PH20은 중성 pH에서 활성을 보이는 포유류 히알루로니다제 패밀리에 속하는 유일한 효소이다. 이를 코딩하는 유전자는, 단백질의 이소형 1(GenBank access number NP_003108.2)을 코딩하는 더 긴, 변이체 1과, 변이체 1과 비교하여 3' 변형 영역에 다른 스플라이싱 신호를 사용하여, C-말단이 더 짧은 이소형 2(GenBank access number NP_694859.1)를 만드는, 변이체 2인, 2개의 전사 변이체들 만들어낸다.
본 발명의 특정 구현예에서, 효소 서열은 카르복시 말단 막-결합 도메인에 해당되는 서열이 제거되어, 가용성 효소를 만든다(도 2 참조). 이 카르복시 말단 도메인을 제거하면, 세포외 매질로의 히알루로니다제가 분비된다. 따라서, 이로써, 중성 pH에서 효소 활성을 나타내는 분비된 히알루로니다제를 발현하는, 암 용해성 아데노바이러스를 수득하였다. 구체적인 구현예에서, 아데노바이러스 게놈에 삽입된 서열은, 서열번호 1을 코딩하는 것이다. 보다 구체적인 구현예에서, 삽입된 서열은 서열번호 2이다.
다른 구현예에서, 효소의 서열은 암 용해성 아데노바이러스에서 아데노바이러스 섬유질의 뉴클레오티드 서열 뒤에 삽입된다.
다른 특정 구현예에서, 효소의 발현은 동물 세포에서 프로모터 활성에 의해 조절된다. 특히, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, SV40 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 프로모터, 인간 IL-4 프로모터, IFN 프로모터, E2F 프로모터 및 인간 GM-CSF 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 효소의 발현을 조절하는 프로모터는, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(도 1 (a), MLP, "주요 후기 프로모터")의 경우에서와 같이, 아데노바이러스의 천연의 것일 수 있다. 또한, 프로모터는 효소를 코딩하는 서열 다음에 삽입할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터이다.
본 발명의 복제성 아데노바이러스는 종양 세포에서 선택적인 복제를 투여하는 변형을 게놈 서열내에 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 조직-특이적인 프로모터 또는 종양-특이적인 프로모터의 삽입으로 달성된다. 이 프로모터는 E1a, E1b, E2, 및 E4의 군의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절한다. 구체적으로, 프로모너는, E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원(PSA) 프로모터, 알파-페토단백질 프로모터, COX-2 프로모터, 뿐만 아니라 저산소증 유도 인자(HIF-1)에 대한 결합부와 같은 결합부에 대한 수종의 전사 인자, Ets 전사 인자, 종양 세포독성 인자(tcf), E3F 전사 인자 또는 Sp1 전사 인자에 의해 형성된 인공 프로모터들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 프로모터는 E1a의 발현을 조절한다.
종양에서 선택적인 복제를 달성하기 위한 다른 변형은 레니토블라스토마(RB) 경로를 차단하는 E1A 기능의 제거이다. E4 및 E4orf6/7 등의 pRb와 직접 상호작용하는 다른 바이러스 유전자는, 종양 세포에서 선택적인 복제를 제거할 후보체들이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 암 용해성 아데노바이러스 ICOVIR17은 히알루로니다제의 유전자의 동시 포함, pRB과 E1a의 상호작용에 작용하는 Δ24 결손, E1a의 발현을 조절하기 위한 E1a의 내인성 프로모터내 4개의 E2F1 결합부 및 1개의 Sp1 결합부의 삽입, 및 마지막으로, 및 바이러스의 감염성을 높이기 위해 아데노바이러스 섬유질내 RGD 펩타이드의 삽입이 특징적이다. 본 발명의 바람직한 구현예는 ICOVIR17이다.
종양에서의 선택적인 복제를 달성하기 위한 또다른 변형은, 바이러스-부속 RNA(VA-RNA)를 코딩하는 아데노바이러스 유전자의 제거이다. 이들 RNA는 인터페론의 항바이러스 활성을 차단시키며, 결손시, 아데노바이러스는 인터페론에 의한 저해에 더 민감해지게 된다. 종양 세포는 인터페론 경로의 단절이 특징적이기 때문에, 이러한 아데노바이러스는 종양 세포에서 정상 수준으로 복제한다. 따라서, 다른 구체적인 구현예에서, 종양에서의 선택적인 복제로 아데노바이러스의 E1a, E1b, E4 및 VA-RNA의 군에 속하는 하나 이상의 유전자내 돌연변이가 달성된다. 바람직하게는, 돌연변이는 E1a에서이다.
종양에서의 선택적인 복제를 달성하기 위한 이들 2가지 전략들은 서로를 배제하진 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 감염성을 높이거나 또는 종양 세포에 존재하는 수용체에 이를 직접 인가하기 위한 변형을 이의 캡시드내에 포함한다. 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 캡시드 단백질은, 감염성을 높이거나 또는 종양 세포에서 바이러스를 수용체로 향하게 하는, 리간드를 포함하도록 유전전으로 변형된 것이다. 또한, 아데노바이러스의 종양 표적화는, 한쪽은 바이러스에 다른 쪽은 종양 리간드에 결합하는 2중 기능의 리간드를 이용하여 달성할 수 있다. 한편, 혈중 아데노바이러스의 지속성을 높여, 산재된 종양 결절까지의 도달 확률을 높이기 위해, 캡시드를 폴리에틸렌-글리콜과 같은 폴리머로 피복할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 암 용해성 아데노바이러스는, 아데노바이러스 섬유질내 KKTK 헤파란 설페이트 결합 도메인을 도메인 RGDK로 치환함으로써, 감염성을 높이거나, 또는 표적 세포에 대한 지향성을 높이도록 변형된 캡시드를 가진다. 예로, 이러한 특징 ICOVIR17RGDK를 가진 아데노바이러스의 구축을 설명한다.
다른 구체적인 구현예에서, 아데노바이러스는 히알루로니다제를 코딩하는 서열의 단백질로의 번역을 최적화하는 서열을 포함한다.
다른 구체적인 구현예에서, 아데노바이러스는 히알루로니다제를 코딩하는 서열의 발현을 촉진시키는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 이 서열은, RNA의 프로세싱을 허용하는 스플라이싱 서열, IRES 서열("내부 리보존 도입부") 및 피코르나바이러스의 서열 2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 특정 구현예에서, 암 용해성 아데노바이러스는, 암 유전자 치료 분야에서, 암 용해성 아데노바이러스의 종양 세포에 대한 세포독성을 높이기 위해 일반적으로 사용되는, 게놈에 삽입되는 그외 유전자들을 포함한다. 이들 중 일부는 티미딘 키나제 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 프로세포자살 유전자, 면역-자극 유전자, 종양 억제자 또는 프로드럭 활성화 유전자이다.
아데노바이러스 게놈에서의 이러한 변형은 서로를 배제하지 않는다. 아데노바이러스 게놈을 조작하기 위한 몇가지 방법들이 있다. 유전자 변형된 아데노바이러스를 구축하는 방법은 유전자 치료법 분야와 아데노바이러스를 이용한 바이러스 요법 분야에 잘 확립되어 있다. 보다 일반적으로 사용되는 방법은, 먼저 변형할 아데노바이러스 영역을 포함하는 플라스미드내에서의 원하는 유전자 변형의 구축과, 박테리아에서의 바이러스 게놈의 나머지를 포함하는 플라스미드를 이용한 상동적인 재조합 수행을 기본으로 한다.
본 발명의 대상인 히알루로니다제 유전자를 포함하는 아데노바이러스는, 유전자 치료법 및 바이러스요법 분야에서 일반적으로 사용되는 세포주, 예컨대 HEK-293 및 A549 세포에서 증식하고 증폭한다. 바람직한 증식 방법은 아데노바이러스의 복제를 허용하는 세포주의 감염에 의한 것이다. 폐 선암종 세포주 A549가 이러한 특징을 가진 세포주의 일예이다. 증식은, 다음과 같은 방식으로 예컨대 수행된다: A549 세포를 플라스틱 세포 배양 플레이트에 접종하고, 세포 당 바이러스 입자 100개로 감염시킨다. 2일 후, 바이러스 생산을 반영하는 세포병리 효과가 세포의 클로스터링 및 라운딩으로서 관찰된다. 세포를 시험관으로 회수한다. 이를 5분간 1000g에서 원심분리한 후, 세포 펠렛을 3회 동결 및 해동하여 세포를 파괴한다. 수득되는 세포 추출물을 5분간 1000 g에서 원심분리하고, 바이러스가 함유된 상층액을 세슘 클로라이드 농도 구배 상에 주입하고, 1시간 동안 35000 g로 원심분리한다. 농도 구배로 수득한 바이러스 밴드를 다른 세슘 클로라이드 농도 구배에 주입하고, 다시 16시간 동안 35000g로 원심분리한다. 바이러스 밴드를 외수하고, PBS-10% 글리세롤에서 투석한다. 투석한 바이러스를 분액하여 -80℃에 보관한다. 바이러스 입자의 수와 플라그 형성 단위의 정량화는 표준 프로토콜에 따라 수행한다. 글리세롤이 5%로 함유된 포스페이트 완충화된 염수(PBS)는 아데노바이러스 보관을 위한 표준 제형이다. 바이러스의 안정성을 향상시키는 새로운 제형도 개시되었다. 암 치료에 사용하기 위한 히알루로니다제 유전자를 포함하는 아데노바이러스의 정제 방법은, 암의 바이러스요법 및 유전자 치료법에서 사용되는 다른 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터에 대해 기술된 것과 동일하다.
본 발명의 암 용해성 아데노바이러스는 포유류, 바람직하게는 인간에게 투여할 수 있다. 암 용해성 아데노바이러스의 투여 목적은, 비제한적인 예로서 흑생종, 췌장암, 대장암 및 폐암 등의 치료 목적이다. 또한, 이는 종양의 전암성 단계에서 암 용해성 아데노바이러스의 투여가 고려된다.
암 용해성 아데노바이러스는 약학적으로 허용되는 형태로 투여되는 것으로 이해된다. 당해 기술 분야의 전문가는 표준 공정을 이용하여 적절한 용량을 정할 수 있다. 용량은 치료받는 환자에서 종양의 감소가 이루어지기 위한 암 용해성 아데노바이러스의 유효량인 것으로 이해된다. 바이러스는 종양에 직접 또는 종양이 위치된 강에, 종양의 혈관 구조에, 종양 주변에, 또는 환자의 혈관내 전신 주입에 의해 투여된다. 바람직하게는, 투여는 전신 투여이다.
본 발명에 기술된 바이러스를 암 치료용으로 사용하기 위한 프로토콜은 아데노바이러스를 이용한 바이러스요법 및 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료법 분야에서 사용되는 공정과 동일하다. 유전자 치료법 분야에서 비-암 용해성 및 암 용해성 아데노바이러스의 사용에 대한 많은 경험들이 축적되어 있다. 배양, 동물 모델 및 인간의 임상 실험에서 종양 세포의 치료에 대한 다수의 공개문헌들이 있다. 시험관내에서 배양물에 세포를 처리하기 위해, 전술한 포뮬레이션들 중 임의의 방식으로 정제된 아데노바이러스는 종양 세포의 감염을 달성하기 위해 배양 배지에 부가된다. 동물 모델이나 환자에서 종양을 치료하기 위해, 아데노바이러스를 종양 또는 종양이 위치한 신체 강내에 주입함으로써 국소 영역으로, 또는 혈류에 주입함으로써 전신 투여할 수 있다.
본 발명의 암 용해성 아데노바이러스는 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 조성물로서 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 특정한 투여 방식에 따라 조성물을 적정할 것이다. 조성물은, 종양에 대한 유일한 제제로서, 또는 화학요법제나 치료 유전자가 삽입된 벡터 등의 다른 치료 물질과 조성물로서, 암 용해성 아데노바이러스를 포함할 수 있다. 또한, 암 용해성 아데노바이러스 요법을 방사선치료와 병용할 수 있다.
다르게 명시되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 바와 동일하거나 비슷한 방법과 물질을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 명세서와 청구항에서, 용어 "포함한다" 및 이의 변형 형태는 다른 기술적 특성, 첨가제, 구성 요소 또는 단계를 배제하는 의도는 아니다. 본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 특징들은, 본원의 검정시 당해 기술 분야의 당업자에게 명확해지거나, 또는 본 발명의 실시를 통해 습득할 수 있다. 아래 구체적인 구현예들과 도면은 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1 (a)는 히알루로니다제 유전자 PH20을 포함하며 발현하는 특징을 가지는 암 용해성 아데노바이러스의 구조를 나타낸다. 아데노바이러스 AdwtRGD-PH20은 아데노바이러스 섬유질 유전자 다음에 삽입된 단백질 PH20의 유전자를 포함한다. 단백질 PH20 유전자의 발현은 단백질 PH20 유전자 앞에 아데노바이러스(SA)의 스플라이싱 어셉터 IIIa의 삽입을 통해 아데노바이러스의 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 조절된다. 이 유전자의 단백질 번역은, 번역 개시 서열 앞에 코자크 서열(k)의 도입으로 인해 최적화된다. 아데노바이러스 ICOVIR15 및 ICOVIR17은 종양-선택적인 복제 아데노바이러스이다. 이는 특징적으로 E1a의 내인성 프로모터에 4개의 E2F 결합부와 1개의 Sp1 결합부를 가지고 있다. 또한, 2개의 바이러스들에는 펩타이드 RGD-4C가 삽입되는 바이러스 섬유질의 변형된 버전과 폴리펩타이드 체인의 아미노산 121-129가 제거된(Δ24 돌연변이) E1A 단백질의 돌연변이 버전이다. 또한, ICOVIR17은 AdwtRGD-PH20 아데노바이러스에서와 같이 삽입된 히알루로니다제 PH20 유전자를 포함한다. (b)는 뉴클레오티드 419-422의 서열을 치환하는 아데노바이러스 AdΔ24RGD에 삽입된 서열을 나타낸다. 이 삽입은, 인자 E2F-1에 4개의 결합부와 Sp1 인자에 1개의 결합부를 삽입하여 만든다. "nt 385-419" 및 "nt 422-461"와 같이 밑줄 친 서열은 AdΔ24RGD의 천연형이다. (c)는 ICOVIR15 및 AdwtRGD (서열번호 4)의 게놈에, 게놈 ICOVIR17 및 AdwtRGD-PH20에 삽입된 완전 카세트를 나타낸다. 스플라이신 어셉터 IIIa, kozak, 및 폴리아데닐화 (polyA) 서열을 표시한다. 단백질 PH20 코딩 서열은 코자크에서 폴리아데닐화 서열까지의 서열이다. 도 1은 실시예 3과 관련있다.
도 2는 PH20 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 Kyte-Doolittle의 알고리즘에 따른 하이드로패틱 플롯(hydropathic plot)을 나타낸다. 단백질 PH20은 조장의 원형질막과 선체막에 존재하는 막 단백질이다. (a) 아미노산 서열은 막내 단백질의 고정을 담당하는 소수성 서열(서열 밑줄)이다. 본 발명에서, 바이러스에 의해 발현되는 PH20 단백질은 결손된 소수성 꼬리를 나타낸다. 컷 포인트는 원 안에 표시한다. 이러한 결손에 의해 단백질 PH20은 세포외 매질로 배출된다. (b) Kyte-Doolittle에 의한 PH20 단백질의 말단 아미노산 100개의 하이드로패틱 플롯. 화살표는 제거된 소수성의 시작부를 나타낸다.
도 3은 히알루로니다제 PH20의 유전자를 포함하는 암 용해성 아데노바이러스가 히알루로니다제 활성을 나타내는 가용성 단백질을 발현함을 나타낸 것이다. 겔은, 히알루로니다제 PH20을 발현하는 바이러스의 상층액과 인큐베이션한 히알루론산 샘플을 절단하면, 다양한 크기의 올리고당이 만들어짐을 보여준다. 대조군 아데노바이러스(AdwtRGD 및 ICOVIR15)의 상층액과 인큐베이션한 샘플은 비-절단된 히알루론산을 나타낸다. 도 3은 실시예 4와 관련있다.
도 4는 히알루로니다제 PH20 유전자의 삽입 및 발현이 종양 선택적인 복제성-아데노바이러스의 복제를 간섭하지 않음을 보여준다. 세포주 A549 (a) 및 SKMel28 (b) 유래의 세포에 암 용해성 아데노바이러스 ICOVIR15 및 ICOVIR17 (PH20유전자 함유 측면에서 ICOVIR15와 상이함)을 감염시키고, 세포 추출물내 바이러스의 양(총 바이러스, X 축, TU/ml)을 여러 시간대에(Y축, 감염 후 경과 시간) 측정하였다. 그래프에서, 바이러스 생산 속도가 양쪽 바이러스에서 동일한 것으로 나타나, 히알루로니다제 PH20 유전자의 삽입 및 발현이, 아데노바이러스 ICOVIR17에서 바이러스 복제에 영향을 미치지 않음을 의미한다. 도 4는 실시예 5와 관련있다.
도 5는 히알루로니다제 PH20 유전자를 포함하며 발현하는, 암 용해성 아데노바이러스의 시험관내 암 용해 효능을 보여준다. 히알루로니다제 PH20을 발현하는 아데노바이러스(ICOVIR17)의 암 용해성 활성을 히알루로니다제 PH20 유전자가 없는 유사한 암 용해성 바이러스(ICOVIR15)의 활성과, 히알루론산을 다량 발현하는 2종의 종양 세포주, SKMel28 (a) 및 PC3 (b)에서 비교하였다. 바이러스가 유도한 세포병리 효과(CPE)는 감염된 세포의 단일 층(BCA 방법으로 측정)에서의 단백질 수준 감소로서 측정된다. 세포를 96웰 플레이트에 10000 세포/웰로 접종하였다. 다음날, 세포에 바이러스 연속 희석물을 감염시켰다. 감염된 세포를 5일간 인큐베이현하고, PBS로 헹군 다음, 웰에 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 그 결과, 2가지 바이러스에서 세포독성 그래프가 동일하였기 때문에, 히알루로니다제 PH20의 시험관내 발현이 아데노바이러스의 암 용해성 활성을 향상시키지 못하는 것으로 나타났다. TU/세포에 대한 세포 생존율%을 그래프로 작성하였다. 도 5는 실시예 5와 관련있다.
도 6은 히알루로니다제 PH20을 발현하는 암 용해성 아데노바이러스의 생체내 항종양 활성을 나타낸 것이다. 인간 흑색종 세포(SKMel28)를 Balb/c의 흉선이 없는 마우스의 각 옆구리에 접종하였다. 종양이 평균 크기 150 mm3가 되면, PBS 또는 1x108 형질전이 단위의 AdwtRGD-PH20을 주입하였다(10 종양/군). (a) 그래프는 투여 후 시간(일)에 따른 0일 대비 각 군에서의 평균 종양 증식(%)을 나타낸다. 그 결과, 히알루로니다제 PH20 유전자를 발현하는 암 용해성 아데노바이러스가 대조군(PBS) 대비 통계적으로 유의한 더 높은 항종양 활성을 가지는 것으로 나타났다, p<0.00001. AdwtRGD-PH20을 주입한 종양들은 100% 주입 후 27일째에 10% 내지 50%의 체적 감소가 있었지만, PBS 주입한 군에서의 감소율은 0%이었다. (b) PBS 또는 AdwtRGD-PH20을 주입한 종양에서의 히알루론산의 양은 면역조직화합법으로 실험 종료시에 분석하였다. 사진은 AdwtRGD-PH20을 주입한 종양에서 대조군 종양 대비 히알루론산의 양이 더 적음을 보여준다. 도 6은 실시예 6.1에 관한 것이다.
도 7은 히알루로니다제 PH20이 종양내 투여 후 암 용해성 아데노바이러스의 항종양 효과를 개선시킴을 보여준다. 인간 흑색종 세포(SKMel28)를 흉선이 없는 Balb/c 마우스의 각 등쪽 옆구리에 접종하였다. 종양의 평균 체적이 130 mm3 크기가 되면, 여기에 PBS 또는 1x108 형질전이 단위의 ICOVIR15 또는 ICOVIR17을 단회 투여로 주입하였다(10 종양/그룹). (a) 그래프는, 투여 후 시간(일)에 따른 0일 대비 각 군에서의 평균 종양 증식(%)을 나타낸다. 히알루로니다제 PH20을 발현하는 암 용해성 아데노바이러스(ICOVIR17)이 히알루로니다제를 발현하지 않는 대조군 바이러스(ICOVIR15) 보다 더 우수한 항종양 활성을 나타낸다. (b) 42일간의 처리 후, 마우스를 안락사시켜, 종양을 회수하여 무게를 측정하였다. 표는 실험 종료시의 종양 체적, 종양 증식 및 종양의 무게를 종합하여 나타낸 것이다. ICOVIR17이 주입된 종양에서는 ICOVIR15가 주입된 종양(* p<0.05)과 PBS 주입한 종양(# p<0.05) 보다 종양의 무게가 유의하게 낮았다. 그 결과, 바이러스가 세포 단일층을 통과하여 어려움없이 퍼질 수 있는, 시험관내에서 수득한 결과와는 다르게, 생체내 결과는, 세포외 기질이 바이러스의 전파를 방해하지 않는 종양내에서, 히알루로니다제 PH20의 발현이 암 용해성 아데노바이러스의 항종양 효능을 증가시키는 것으로 나타났다. 도 7은 실시예 6.2에 관한 것이다.
도 8은 히알루로니다제 PH20의 발현이 전신 투여 후 암 용해성 아데노바이러스의 항종양 효능을 개선시킴을 보여준다. 인간 흑색종 세포(SKMel28)를 흉선이 없는 Balb/c 마우스의 각 등쪽 옆구리에 접종하였다. 종양의 평균 체적이 100 mm3이 되면, 여기에 PBS 또는 5x1010 입자수의 ICOVIR15 또는 ICOVIR17(PH20으로 무장된 ICOVIR15)을 혈관내로 주입하였다(8-10 종양/그룹). (a) 그래프는, 투여 후 시간(일)에 따른 0일 대비 각 군에서의 평균 종양 증식(%)을 나타낸다. 그 결과, ICOVIR17에 의해 유도된 종양 증식의 억제는 대조군(ICOVIR15)에서 유도된 억제 보다 유의하게 높기 때문에(* p<0.00001), 히알루로니다제 PH20의 발현은, 아데노바이러스의 암 용해성 효능을 증가시키는 것으로 나타났다. (b) 사진은 실험 종료시(48일)에 추출된 종양내 아데노바이러스 ICOVIR15 및 ICOVIR17의 분포를 보여준다. 암 용해성 아데노바이러스 ICOVIR17을 주입한 마우스의 종양에서는 매우 광범위한 괴사 영역(큰 화살표), 작은 생존 세포 존재 영역(v), 및 크고 많은 수의 바이러스 복제 센터(얇은 화살표로 표시된 그린 형광 영역)가, 아데노바이러스 대조군 ICOVIR15를 주입한 종양과 비교하여, 나타났다. 도 8은 실시예 6.3에 관한 것이다.
도 9는 효소 히알루로니다제 PH20을 발현하는 아데노바이러스의 항종양 전신 활성 증가가 한가지 종양 타입으로 국한되지 않음을 보여준다. (a) 그래프는, 투여 후 시간(일) 경과 따른 0일 대비 각 군에서의 췌장암 NP-18의 평균 증식을 보여준다. #는 14일 - 30일간 PBS 처리한 종양 대비 유의함(p < 0,02)을 의미하며; &는 14일 -30일간 PBS 처리한 종양 대비 유의함(p < 0,05)을 의미하며; *는 12일 - 30일 간의 ICOVIR15 처리한 종양 대비 유의함(p < 0,02)을 의미한다. (b) 사진은 30일째의 종양 NP-18에서의 아데노바이러스 ICOVIR15 및 ICOVIR17의 분포를 보여준다. *, p < 0.01: ICOVIR15 처리한 종양 대비. "% p.a."는 양성 부위%이다. 도 9는 실시예 6.4에 관한 것이다.
도 10 (a)는 암 용해성 ICOVIR17 및 ICOVIR17RGDK의 구조를 나타낸 것이다. (b)는 ICOVIR17RGDK에서의 섬유질의 변형된 버전의 아미노산 서열이다. 밑줄은 인간 아데노바이러스 5형 섬유질의 천연형과 상이한 아미노산 91RGDK94이다. 도 10은 실시예 8에 관한 것이다.
도 11은 폐 선암종 A549(a) 및 췌장 선암종 NP-18(b)인, 2종의 종양 세포주에서의 2종의 아데노바이러스(ICOVIR17 및 ICOVIR17RGDK)의 암 용해 활성을 나타낸 것이다. 세포 생존율 % vs TU/세포. 도 11은 실시예 9에 관한 것이다.
실시예
실시예 1. 암 용해성 아데노바이러스의 구축
히알루로니다제 PH20을 포함하는 2종의 암 용해성 아데노바이러스: 아데노바이러스 AdwtRGD-PH20 및 ICOVIR17을 구축하였다.
A549 세포주 게놈을 주형으로 이용하여 다양한 엑손을 PCR 증폭함으로써, 히알루로니다제 PH20의 cDNA를 입수한 다음, MfeI 제한효소 부위를 포함하는 특이적인 측면 프라이머들을 이용하여 이들 엑손을 연결시켰다. 수득되는 단편을 MfeI으로 자르고, 셔틀 플라스미드 pNKFiberRGD (RGD로 변형된 아데노바이러스 섬유질의 서열 함유)에 삽입하여, 플라스미드 pNKFiberPH20을 제작하였다. 플라스미드 pNKFiberPH20에 클로닝한 PH20에 해등되는 cDNA는 서열번호 2이다. 서열번호 2는 개시 코돈(ATG)에서 1467번 위치까지의 단백질 PH20(이소형, GenBank access number NP_694859.1)에 대한 코딩 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 유전자은행 서열의 1468 - 1527의 뉴클레오티드 서열은 막에 단백질을 고정시키는 단백질의 소수성 꼬리를 코딩한다. 이 서열은 삭제되었고, 서열번호 2는 보이지 않는다. 뉴클레오티드 1468 다음에, 번역 종결 코돈 TAA를 부가하였다.
실시예 2. AdwtRGD-PH20 아데노바이러스의 구축: 아데노바이러스 AdwtRGD-PH20을 제작하기 위해, 플라스미드 pVK50cau(섬유질내 SwaI 제한효소 부위가 있는 Ad5의 완전 서열 포함)의 아데노바이러스 섬유질의 유전자를 섬유질 유전자로 효모에서의 상동성 재조합으로 치환한 다음, NotI/KpnI으로 잘라 플라스미드 pNKFiberPH20으로부터 히알루로니다제 PH20 유전자를 수득하였다.
플라스미드 pAdwtRGD-PH20을 PacI으로 절단하여, 주요 후기 프로모터의 조절 하에 히알루로니다제 PH20의 발현 및 아데노바이러스 섬유질에 트리-펩타이드 RGD의 포함이 특징적인 아데노바이러스 AdwtRGD-PH20을 제작하고, HEK293 세포에 형질전환하였다. 기존에 언급된 아데노바이러스 AdwtRGD는, 아데노바이러스 섬유질에 트리-펩타이드를 포함하는 특징이 있다(M. Majem et al., "Control of E1A to under an E2F-1 to promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD", Cancer Gene Therapy 2006, vol. 13, pp. 696-705). AdwtRGD는, RGD로 변형된 섬유질을 가진 Ad5의 전체 게놈을 포함하는 플라스미드 pVK503을, PAcI으로 자르고, 293 세포에 형질전환하여, 구축하였다(I. Dmitriev et al., "An adenovirus receiving-independent vector with genetically modified fibres demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus cell entry mechanism", J. Virol. 1998, vol. 72, pp. 9706-13).
실시예 3. 아데노바이러스 ICOVIR17의 구축: 아데노바이러스를 제작하기 위해, 아데노바이러스 플라스미드 pICOVIR17을 사용하였다. 이 플라스미드를 제작하기 위해, pICOVIR15 유래의 아데노바이러스 섬유질 유전자를 효모에서의 상동적인 재조합에 의해 섬유질 유전자로 치환한 다음, 플라스미드 pAdwtRGD-PH20 유래의 히알루로니다제 PH20 유전자를 SpeI/PacI으로 절단하였다.
아데노바이러스 ICOVIR15는 E1a 단백질 코딩 서열에 Δ24 결손이 특징인 아데노바이러스 AdΔ24RGD로부터 유래한다. 이 결손은 E1a와 pRB의 상호작용에 영향을 미친다. 또한, AdΔ24RGD는 바이러스의 감염성을 높이기 위한 아데노바이러스 섬유질에 펩타이드 RGD의 삽입을 포함한다. 이러한 2가지 변형은 K. Suzuki et al., "Conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency", Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6에 기술되어 있다. AdΔ24RGD로부터, 4개의 E2F-1 결합부와 1개의 Sp1 결합부를 E1a의 발현을 조절하기 위한 내인성 E1a 프로모터에 삽입하였다. 이러한 방식으로 ICOVIR15를 수득하였다. 이러한 삽입은 게놈의 419-422 서열을 4개의 E2F-1 결합부와 1개의 Sp1 결합부를 가진 서열로 치환하여 이루어지며, 그래서 최종 서열은 서열번호 3 및 도 1(b)에 나타낸 것이다 (b). 이 단계를 수행하기 위해, pEndK/Spe 플라스미드의 E1A 프로모터에 특이적인 돌연변이를 유발하여, 고유한 BsiW I 제한효소 부위를 만들었다(J.E. Carette et al., "Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells", Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). Sp1 결합부는, 서로 혼성화되는, 프라이머 Sp1F (5' - GTACGTCGACCACAAACCCC GCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3' 서열번호 5) 및 Sp1R (5' -GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3' 서열번호 6)을 이용하여, BsiWI-cut 플라스미드를 연결함으로써, 플라스미드 pEndK/Spe에서, BsiW I 부위내에 도입하였다. 서로 혼성화되는 결합성 프라이머들 E2FF2 (5' - GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3' 서열번호 7) 및 E2FR2 (5' - GTACTTCGAACCACTTTTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3' 서열번호 8)을 이용하여 E2F 결합부를 도입하여, 플라스미드 pEndK415Sp1E2F2를 제작하였다. 다음으로, 효모에서 플라스미드 복제의 필수 인자(센트로미어, 자율 복제부 ARS, 및 선별 마커 URA3)를 포함하는 서열 CAU를, 효모에서 상동성 재조합으로 도입하여, 플라스미드 pEndK415Sp1E2F2CAU를 제작하였다. 마지막으로, KpnI으로 절단한 플라스미드 pEndK415Sp1E2F2CAU와 아데노바이러스 AdΔ24RGD의 아데노바이러스 게놈 간의 상동성 재조합을 효모에서 수행하여, pICOVIR15cau를 제작하였다. PacI-절단한 pICOVIR15cau를 HEK293 세포에 형질전환하여, ICOVIR15를 수득하였다.
ICOVIR15와 동일한 변형 + 아데노바이러스 섬유질 유전자 뒤쪽에 히알루로니다제 유전자의 삽입을 포함하는, ICOVIR17 바이러스는, 플라스미드 pICOVIR17을 Pac I으로 자르고 이를 HEK293 세포에 형질전환시켜, 제작하였다. AdwtRGD-PH20 및 ICOVIR17 게놈의 정확한 구조는, HindIII으로 절단하여 검증하였다. 또한, HP20 유전자의 영역을 특이적인 프라이머로 서열분석하였다.
ICOVIR17 및 AdwtRGD-PH20 게놈에 삽입된 전체 카세트를, ICOVIR15 및 AdwtRGD 게놈과 비교하여 도 1(c) 및 서열번호 4에 나타낸다. PH20 단백질을 코딩하는 서열은 코자크 서열과 폴리아데닐화 서열 사이에 들어간다.
실시예 4. 히알루로니다제 PH20 유전자를 포함하는 아데노바이러스에 의한 히알루로니다제 활성을 가진 가용성 단백질의 발현
히알루로니다제 PH20 유전자를 포함하는 아데노바이러스가 히알루로니다제 활성을 가진 가용성 단백질을 발현함을 입증하기 위해, A549 세포주의 배양물에, 바이러스 AdwtRGD, AdwtRGD-PH20, ICOVIR15 또는 ICOVIR17을, 80% 이상의 감염을 허용하는 감염 다중도(multiplicity of infection)(20 M.O.I.)를 이용하여 감염시켰다. 감염 후 24시간 후에, 감염 배지를 신선한 배지로 바꾸었다. 그런 후, 다시 24시간 후, 신선한 배지(또는 상층)를 회수하여, Amicon Extreme (Millipore, Billerica, the USA)에서 제조사의 지침에 따라 여과하여 농축하였다. 농축된 상층액을 0.1 M NaCl 및 0.05% BSA가 포함된 포스페이트 완충액(pH6) 중에 히알루론산(1.5 mg/ml) 용액과 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절단된 히알루론산을 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분석하였다(M. Ikegami-Kawai et al., "Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity", Analytical biochemistry 2002, vol. 311, pp. 157-65). 히알루론산 절단으로 인한 올리고당 산물들을 30분간 Alcian Blue 용액 중에 겔 매트릭스로 고정하였다. 마지막으로, 올리고당을 질산은으로 염색하였다. 그 결과는 도 3에 나타낸다. 그 결과, 히알루로니다제 PH20 유전자가 포함된 아데노바이러스(AdwtRGD-PH20 및 ICOVIR17)로 감염된 세포의 상층액에는 히알루론산을 이당류 반복 단위 50개 이상으로 이루어진 올리고당 5개 이상으로 절단할 수 있는 가용성 단백질(증가된 분자량의 다당류)이 함유되어 있음이 확인되었다.
실시예 5. 히알루로니다제 PH20 유전자를 발현하는 암 용해성 아데노바이러스에 의해 매개되는, 바이러스 복제 및 시험관내 세포독성의 효과 부재
히알루로니다제 PH20 유전자의 삽입이 바이러스 복제에 영향을 미치지 않음을 검증하기 위해, A549 및 SKMel-28 종양 세포주에 암 용해성 아데노바이러스 ICOVIR15 또는 ICOVIR17을 감염시켰다. 감염 4시간 후, 감염 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 전체 세포 추출물을 감염 후 다양한 시간대에 회수하고, 이를 3번 동결-해동하여, 바이러스를 분리시켰다. 세포 추출물내 바이러스의 양을 HEK293의 감염 및 항-헥손 염색에 의해 결정하였다(전술함 M. Majem). 그 결과는 도 4에 나타낸다. 히알루로니다제 PH20의 삽입은, 바이러스가 아데노바이러스 대조군과 동일하게 복제하므로, 아데노바이러스 ICOVIR17의 복제에 영향을 미치지 않았다.
암 용해성 아데노바이러스의 세포독성에 대한 히알루로니다제 PH20 발현의 효능을 시험관내에서 입증하기 위해, PC3 및 SKMel-28 종양 세포 유래의 세포에, 바이러스 ICOVIR15 또는 ICOVIR17의 연속 희석물을 감염시켰다. 감염 후 5일 및 6일 후에, 각각, 세포 생존의 지표로서의 단백질의 양을 스펙트로포토미터로 평가하였다. 그 결과는 도 5에 나타낸다. 이들 2종의 종양 세포주에서의 ICOVIR17의 용해 활성은 ICOVIR15의 활성과 동일하였는데, 이는 히알루로니다제 PH20의 발현이 심험관내에서 임의의 암 용해성 이점을 제공하지 않음을 의미한다.
실시예 6. 히알루로니다제 PH20 유전자를 포함하는 복제성 아데노바이러스의 종양을 효율적으로 치료하기 위한 용도
6.1. 생착한 SKMel-28 종양이 있는 Balb/c의 흉선이 없는 마우스를 이용하여 생체내 실험을 행하였다. SKMel-28 세포주의 종양 세포 총 5 x 106개를 마우스의 각 옆구리에 피하 주입하였다. 21일 후, 종양이 있는 마우스(종양 체적 150 mm3)를 다른 실험 군으로 분할하였다(군 당 n=10). 대조군의 종야에는 염수 완충액(20 ㎕)을 1회 종양내로 주입하였다. AdwtRGD-PH20 처리 마우스군에는 종양 당 바이러스를 1x108 형질전이 단위로 (20 ㎕) 종양내 주사하였다(= 2x109 바이러스 입자 또는 vp). 종양을 캘리퍼로 2일 또는 3일마다 측정하고, 종양 체적을 식: V (mm3) = A (mm) x B2 (mm2) x p/6(A: 더 긴 것 또는 가로 길이, B: 횡단 길이)에 따라 계산하였다. 도 6은, 치료 개시(0일) 대비 종양 증식율이다. 그 결과는 평균 ± S.E.로 나타내었다. 결과들 간의 통계학적 유의성 차이는, 매칭되지 않는 데이타에 대한 비모수 Mann-Whitney 검정으로 계산하였다. 증식 그래프는 분산 분석으로 비교하였다. 결과는 p<0.05이면 유의한 것으로 간주하였다. 아데노바이러스 AdwtRGD-PH20을 이용한 종양의 치료시, 처리한 종양의 100%가 퇴화되었다. 종양 증식%은 주입 후 첫째날 이후로 대조군 대비 현저하게 작아졌다. 실험 종료시의 종양 분석에서, AdwtRGD-PH20을 주입한 종양의 세포외 기질에 존재하는 히알루론산의 양 감소가 나타났다.
6.2. 다른 실험에서, 치료는 ICOVIR15 또는 ICOVIR17을 종양내 주입하여 수행하였다. 인간 흑색종 세포주 SKMel-28의 종양을 흉성이 없는 마우스 Balb/C nu/nu에 이식하고, 확립되면, 여기에 PBS 또는 1x108 형질전이 단위의 바이러스 ICOVIR15 또는 ICOVIR17 (= 2x109 바이러스 입자 또는 vp)을 종양내로 처리하였다. 그 결과는 도 7에 나타낸다. ICOVIR17 처리시 대조군(PBS)과 현저하게 상이한 종양 증식 저해을 보여주는, 암 용해성 활성이 확인되었다, p<0.05. 실험 종료시, 종양을 적출하여 무게를 측정하였다. 도 7의 표는, 실험 종료시의 평균 종양 체적, 종양의 증식율 및 종양의 무게를 나타낸다. ICOVIR17을 주입한 종양의 무게는 대조군에서의 종양 무게 보다 현저하게 낮았다, PBS (# p<0.05) 및 ICOVIR15 (* p<0.05).
6.3. 다른 실험에서, ICOVIR15 또는 ICOVIR17의 전신 주입으로 치료를 실시하였다. 인간 흑색종 세포주 SKMel-28의 종양을 흉선이 없는 마우스 Balb/C nu/nu에 이식하였고, 확립되면, 동물에 꼬리 정맥 주사를 통해 PBS 또는 ICOVIR15 또는 ICOVIR17의 5x1010개의 바이러스 입자를 투여하였다. 그 결과는 도 8에 나타낸다. ICOVIR17 처리시 대조군과는 유의하게 상이한 종양 증식 억제를 발생시키는 암 용해성 활성이 확인되었다, PBS (# p<0.0001) 및 ICOVIR15 (* p<0.00001). 실험 종료시에, 종양을 적출하여 OCT에서 동결하였다. OCT에서 동결시킨 종양의 여러가지 섹션들에 알파-헥손 항체(아데노바이러스 캡시드 단백질)을 처리하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌로 대조 염색하였다. ICOVIR17의 항종양 활성은, 주입하고 48일 후에 수득한 종양에서 평가한, 종양내 수준에서의 아데노바이러스의 복제와 상화 관련있었다. ICOVIR17 처리한 종양에서는, ICOVIR15를 주입한 종양 대비, 넓은 괴사 영역, 보다 우수한 바이러스 분포 및 보다 작은 생존 세포 존재 지역이 확인되었다.
6.4. 다른 실험에서, 인간 췌장 선암종 세포주 NP-18 유래의 종양을 이식한 흉선이 없는 Balb/C nu/nu 마우스에 ICOVIR15 또는 ICOVIR17을 전신 주입하여, 치료를 실시하였다. 종양이 확립되어 평균 체적 60 mm3이 되면, 동물에 꼬리 정맥을 통해 PBS 또는 ICOVIR15 또는 ICOVIR17의 5x1010개의 바이러스 입자를 처리하였다(10 종양/군). 그 결과는 도 9에 나타내었으며, 히알루로니다제 PH20 효소를 발현하는 아데노바이러스의 항종양 활성 증가가 한가지 종양 타입에 국한되지 않음을 보여준다. 도 9 (a)는 히알루로니다제 PH20 발현이 또한 PBS 군과 바이러스 대조군(ICOVIR15) 대비 아데노바이러스의 암 용해 효능을 증가시킴을 보여준다. #는 14일 - 30일간 PBS 처리한 종양 대비 유의함(p < 0.02)을 의미하며; &는 14일 -30일간 PBS 처리한 종양 대비 유의함(p < 0.05)을 의미한다. *는 12일 - 30일간 ICOVIR15 처리한 종양 대비 유의함(p < 0.02)을 의미한다. 30일째에, 종양을 적출하여 OCT에서 동결하였고, 나중에 알파-헥손 항체로 처리하고 DAPI로 대조염색하였다.
ICOVIR17의 종양내 복제 수준을 정량하기 위해, 각 종양의 5곳의 생존 영역을 항-헥손 염색으로 분석(군 당 동물 7/10)하고, 양성인 영역의 면적%를 컴퓨터 처리한 영상 분석(software ImageJ)으로 측정하였다. 이 분석의 결과는 도 9 (b)에 나타내었으며, 여기에서 ICOVIR17 처리한 NP-18 종양이 ICOVIR15 처리한 종양 보다 아데노바이러스 염색된 영역이 유의하게 더 넓은 것으로 나타났다(*, 유의성 p<0.01).
실시예 7. 히알루로니다제 유전자를 발현하는 암 용해성 아데노바이러스의 독성 프로파일
히알루로니다제 유전자의 삽입이 혈관내 투여시 암 용해성 아데노바이러스에 의해 유도되는 독성 패턴을 실질적으로 변형시키지 않는다는 것을 검증하기 위해, 시리안 햄스터(Mesocricetus auratus)를 인간 아데노바이러스의 복제를 허용하는 동물 모델이므로 사용하였다. 햄스터는 인간 아데노바이러스의 복제를 허용하는 동물 모델이다. 암컷의, 면역 컴피턴트의 5주령 동물을 사용하였다(5-6마리의 동물/군). 이들 동물에게 단회 용량으로 ICOVIR15 또는 ICOVIR17 4 x 1011 vp를 0일에 PBS 300 ㎕ 중에 두부 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 대조군에는 동량의 PBS를 주사하였다. 투여한 지 5일 후, 동물을 안락사시키고, 총 혈액과 혈청을 심장 천공에 의해 각각으로부터 수득하여, 간 독성의 파라미터(AST 및 ALT 효소)를 측정하고, 유세포 측정(혈구도)에 의해 여러가지 혈액 세포 개체군을 계수하였다. 동시에, 동물의 간을 수득하여, 4% 파라포름알데하이드 중에 헤마톡실린/에오신 염색을 위해 고정하였다.
간 독성 실험의 결과는, 2가지 바이러스 모두 이 모델에서의 간 염증을 어느 정도의 수준을 유도하며, AST 및 ALT 트랜스아미나제 수준이 증가됨을 보여주었다. 그러나, ICOVIR15 또는 ICOVIR17 처리한 동물 간에는 차이가 관찰되지 않았다. 혈액 수준에서, 2가지 바이러스 모두 호중구, 호염기구 및 단구 개체군의 증가를 야기할 뿐만 아니라 대조군 동물 대비 혈소판 카운트 감소가 나타났으나, ICOVIR15와 ICOVIR17 간의 차이는 없었다.
실시예 8. 바이러스 ICOVIR17RGDK의 구축
이 바이러스를 제작하기 위해, 아데노바이러스 플라스미드 pICOVIR17RGDK를 사용하였다. 이 플라스미드에서, 천연형 아데노바이러스 5의 섬유질 유전자는, 헤파란-설페이트 결합 도메인이 변형된 버전으로 치환되었다(폴리펩타이드 서열에서 아미노산 91KKTK94를 91RGDK94로 치환함). pICOVIR17RGDK 플라스미드는, pICOVIR17의 NdeI 부분 절단 산물과 EcoRI-절단한 pBSattKKT 플라스미드(N. Bayo et al. "Replacement of adenovirus type 5 fibre shaft heparan sulphate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumour infectivity and targeting". Human Gene Therapy 2009, vol. 20, pp 1214-21에 기술된 바와 같이, 아데노바이러스 섬유질의 변형된 버전 함유) 간의 효모에서의 상동성 재조합에 의해 구축하였다.
도 10은 ICOVIR17RGDK에서의 변형 91RGDK94 의 위치와 아데노바이러스에서의 섬유질 단백질의 전체 서열을 나타낸 것이다. 아데노바이러스 ICOVIR17은, 단백질의 knob 도메인의 H1-로프(진화적으로 비-보존되며 아데노바이러스 캡시드에 많이 노출되는 과가변성 루프)에 펩타이드 RGD-4C (Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys가 삽입되어 있음; CDCRGDCFC, 서열번호 10)가 있는, 아데노바이러스 섬유질 유전자의 변형을 포함한다. ICOVIR17RGDK는 전체적으로 섬유질 유전자를 제외하고는 ICOVIR17과 유사하며, ICOVIR17RGDK 섬유질은, 단백질의 시프트 도메인내 아미노산 91KKTK94의 고친화성의 인테그린-결합 펩타이드 91RGDK94와의 치환시, 유일하게 야생형 인간 5형 아데노바이러스와만 다르다(서열번호 9).
실시예 9. ICOVIR17RGDK 캡시드 변형이 있는 아데노바이러스의 암 용해 효능
도 11에 나타낸 바와 같이, ICOVIR17RGDK에 존재하는 캡시드 변형은 히알루로니다제 PH20 유전자를 포함하며 발현하는 암 용해성 아데노바이러스의 시험관내 세포독성을 변형시키지 않는다. 히알루로니다제 PH20을 발현하는 2종의 아데노바이러스(ICOVIR17 및 ICOVR17RGDK)의 암 용해 활성을 폐 선암종 유래의 A549세포(도 11 (a))와 췌장 선암종 유래 NP-10(도 11 (b))인 2가지 종양 세포주에서 비교하였다. 바이러스에 의해 유도되는 세포병리 효능은 감염된 세포 단일층에서의 단백질양 감소로서 측정하였다(BCA 방법). 2종의 종양 세포주의 세포를 96웰 플레이트에 10000개의 세포/웰로 접종하였다. 다음날, 세포에 바이러스의 연속 희석물을 감염시켰다. 감염된 세포를 6일간 인큐베이션하고, PBS로 헹군 다음, 웰내 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 그 결과, 시험관내에서 캡시드 변형은 아데노바이러스의 암 용해 활성을 유의하게 변화시키지 않는 것으로 나타났다.
실시예 10. 히알루로니다제 유전자를 발현하는 암 용해성 아데노바이러스의 여러가지 세포독성 프로파일
히알루로니다제를 발현하는 암 용해성 아데노바이러스의 백그라운드에 대한 RGDK 변형의 영향을 평가하기 위해, 종양이 없는 면역-적격 Balb/C 마우스를 사용하였다. 6주령의 수컷을 사용하였다(7마리 동물/군). 동물에, PBS 150 ㎕ 중의 ICOVIR17 또는 ICOVIR17RGDK를 단회 용량 5 x 1010 vp로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 0일에 투여하였다. 투여 후 7일(2마리 동물/군) 및 12일(5마리 동물/군)에, 동물을 안락사시키고, 전체 혈액과 혈청을 심장 천공에 의해 각각으로부터 수득하여, 간 독성의 파라미터(AST 및 ALT 효소)를 측정하고, 유세포 측정(혈구도)에 의해 여러가지 혈액 세포 개체군을 계수하였다. 본 실험의 결과, 2가지 바이러스 모두 7일에 효소의 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 이 수준은 12일에 정상 수준으로 회복되었다. 낮은 간독성 경향은 ICOVIR17 군 대비 ICOVIR17RGDK를 주입한 동물의 군에서 관찰되었지만(약간 낮은 수준의 AST 및 ALT), ICOVIR17과 ICOVIR17RGDK 군 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 투여하고 12일 후, 동물의 혈액학적 프로파일과 관련하여, 림프구의 수가 PBS 및 ICOVIR17RGDK 동물 보다 ICOVIR17 처리된 동물에서 더 낮았던 것을 제외하고는, 백혈구 세포와 혈소판 수에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> FUNDACIO PRIVADA INSTITUT DINVESTIGACIO BIOMEICA DE BELLVITGE INSTITUT CATALA DONCOLOGIA <120> Oncolytic adenoviruses for treating cancer <130> P7609PC00 <150> ES200901201 <151> 2009-05-06 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 2 <211> 1473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA of the PH20 protein from the transcription start (ATG) to position 1467. The hydrofobic tail of the protein (nucleotides 1468-1527) has been deleted and it is not shown. The stop codon (TAA) has been added at the end. <400> 2 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctacaatg cttcaccctc cacactatct taa 1473 <210> 3 <211> 246 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence incorporated into Addelta24RGD adenovirus replacing its sequence from nucleotide 419 to 422. The first nucleotides 1-30 and the last 208-246 are from the wildtype Addelta24RGD. <400> 3 ccaggtgttt ttctcaggtg ttttccgcgt actcggcggc tcgtggctct ttcgcggcaa 60 aaaggatttg gcgcgtaaaa gtggttcgaa gtactcggcg gctcgtggct ctttcgcggc 120 aaaaaggatt tggcgcgtaa aagtggttcg aagtacgtcg accacaaacc ccgcccagcg 180 tcttgtcatt ggcgtcgacg ctgtacgggg tcaaagttgg cgttttatta ttatagtcag 240 ctgacg 246 <210> 4 <211> 1508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete cassette integrated into the genomes of ICOVIR17 and AdwtRGD-PH20 with respect to genomes ICOVIR15 and AdwtRGD. <400> 4 tactaagcgg tgatgtttct gatcagccac catgggagtg ctaaaattca agcacatctt 60 tttcagaagc tttgttaaat caagtggagt atcccagata gttttcacct tccttctgat 120 tccatgttgc ttgactctga atttcagagc acctcctgtt attccaaatg tgcctttcct 180 ctgggcctgg aatgccccaa gtgaattttg tcttggaaaa tttgatgagc cactagatat 240 gagcctcttc tctttcatag gaagcccccg aataaacgcc accgggcaag gtgttacaat 300 attttatgtt gatagacttg gctactatcc ttacatagat tcaatcacag gagtaactgt 360 gaatggagga atcccccaga agatttcctt acaagaccat ctggacaaag ctaagaaaga 420 cattacattt tatatgccag tagacaattt gggaatggct gttattgact gggaagaatg 480 gagacccact tgggcaagaa actggaaacc taaagatgtt tacaagaata ggtctattga 540 attggttcag caacaaaatg tacaacttag tctcacagag gccactgaga aagcaaaaca 600 agaatttgaa aaggcaggga aggatttcct ggtagagact ataaaattgg gaaaattact 660 tcggccaaat cacttgtggg gttattatct ttttccggat tgttacaacc atcactataa 720 gaaacccggt tacaatggaa gttgcttcaa tgtagaaata aaaagaaatg atgatctcag 780 ctggttgtgg aatgaaagca ctgctcttta cccatccatt tatttgaaca ctcagcagtc 840 tcctgtagct gctacactct atgtgcgcaa tcgagttcgg gaagccatca gagtttccaa 900 aatacctgat gcaaaaagtc cacttccggt ttttgcatat acccgcatag tttttactga 960 tcaagttttg aaattccttt ctcaagatga acttgtgtat acatttggcg aaactgttgc 1020 tctgggtgct tctggaattg taatatgggg aaccctcagt ataatgcgaa gtatgaaatc 1080 ttgcttgctc ctagacaatt acatggagac tatactgaat ccttacataa tcaacgtcac 1140 actagcagcc aaaatgtgta gccaagtgct ttgccaggag caaggagtgt gtataaggaa 1200 aaactggaat tcaagtgact atcttcacct caacccagat aattttgcta ttcaacttga 1260 gaaaggtgga aagttcacag tacgtggaaa accgacactt gaagacctgg agcaattttc 1320 tgaaaaattt tattgcagct gttatagcac cttgagttgt aaggagaaag ctgatgtaaa 1380 agacactgat gctgttgatg tgtgtattgc tgatggtgtc tgtatagatg cttttctaaa 1440 acctcccatg gagacagaag aacctcaaat tttctacaat gcttcaccct ccacactatc 1500 ttaataaa 1508 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Sp1F <400> 5 gtacgtcgac cacaaacccc gcccagcgtc ttgtcattgg cgtcgacgct 50 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Sp1R <400> 6 gtacagcgtc gacgccaatg acaagacgct gggcggggtt tgtggtcgac 50 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide E2FF2 <400> 7 gtacgtcggc ggctcgtggc tctttcgcgg caaaaaggat ttggcgcgta aaagtggttc 60 gaa 63 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide E2FR2 <400> 8 gtacttcgaa ccacttttac gcgccaaatc ctttttgccg cgaaagagcc acgagccgcc 60 gac 63 <210> 9 <211> 582 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence, amino acids 1-582, of the modified version of the fibre in ICOVIR17RGDK <400> 9 Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro 1 5 10 15 Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro 20 25 30 Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser 35 40 45 Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu 50 55 60 Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser 65 70 75 80 Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Arg Gly Asp Lys Ser Asn 85 90 95 Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu 100 105 110 Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr 115 120 125 Met Gly Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile 130 135 140 Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr 165 170 175 Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu 180 185 190 Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly 195 200 205 Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr 210 215 220 Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala 245 250 255 Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val 260 265 270 Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln 275 280 285 Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn 290 295 300 Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu 305 310 315 320 Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile 325 330 335 Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro 340 345 350 Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Ile Gly His Gly Leu Glu Phe 355 360 365 Asp Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe 370 375 380 Asp Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu 385 390 395 400 Thr Leu Trp Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Asp Leu Asn Ala 405 410 415 Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln 420 425 430 Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly Ser Leu Ala Pro 435 440 445 Ile Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg Phe Asp Glu 450 455 460 Asn Gly Val Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn 465 470 475 480 Phe Arg Asn Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Ala Val 485 490 495 Gly Phe Met Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser His Gly Lys Thr 500 505 510 Ala Lys Ser Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Thr 515 520 525 Lys Pro Val Thr Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Gln Glu Thr Gly 530 535 540 Asp Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Ser Met Ser Phe Ser Trp Asp Trp Ser 545 550 555 560 Gly His Asn Tyr Ile Asn Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Phe 565 570 575 Ser Tyr Ile Ala Gln Glu 580 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide RGD-4C which is inserted into region HI of the adenoviral fibre <400> 10 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5

Claims (21)

  1. 게놈에 삽입된, 히알루로니다제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는, 암 용해성 아데노바이러스(oncolytic adenovirus).
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 1형 내지 51형 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스는 혈청형 5형인 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 히알루로니다제 효소는 포유류 고환 히알루로니다제인 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 상기 히알루로니다제 효소는 인간 고환 히알루로니다제인 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 상기 효소 서열은 막-결합 도메인이 제거된 서열을 가지고 있어 가용성 효소를 만들어내는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소의 서열은 상기 암 용해성 아데노바이러스내에 아데노바이러스 섬유질(adenovirus fibre)의 뉴클레오티드 서열 뒤에 삽입되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 효소의 발현은 동물 세포에서 활성인 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, SV40 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 프로모터, 인간 IL-4 프로모터, IFN 프로모터, E2F 프로모터, 및 인간 GM-CSF 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는 조직 특이적인 프로모터 또는 종양 특이적인 프로모터를 포함하며,
    상기 프로모터는 종양내 선택적인 복제를 달성하기 위해 E1a, E1b, E2 및 E4의 군에 속하는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로모터는 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선 특이 항원 프로모터, 알파페토단백질 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  13. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 종양내 선택적인 복제를 달성하기 위해 E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 감염성을 높이거나 또는 종양 세포에 존재하는 수용체를 표적으로 하기 위한 변형을 캡시드에 포함하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  15. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 히알루로니다제를 코딩하는 서열의 단백질로의 번역을 최적화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  16. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 히알루로니다제를 코딩하는 서열의 발현을 촉진시키는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 상기 발현을 촉진시키는 서열은 RNA의 프로세싱을 허용하는 스플라이싱 어셉터 서열, IRES 서열 및 피코르나바이러스 2A 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  18. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 게놈에 삽입된 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 용해성 아데노바이러스.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 따른 암 용해성 아데노바이러스를 치료학적 유효량으로, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는, 암 또는 암의 전암성(pre-malignant) 상태의 치료용 약학 조성물.
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