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KR101862135B1 - 신규한 디노익산 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 디노익산 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR101862135B1
KR101862135B1 KR1020160108162A KR20160108162A KR101862135B1 KR 101862135 B1 KR101862135 B1 KR 101862135B1 KR 1020160108162 A KR1020160108162 A KR 1020160108162A KR 20160108162 A KR20160108162 A KR 20160108162A KR 101862135 B1 KR101862135 B1 KR 101862135B1
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KR
South Korea
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present
compound
bone
bone diseases
composition
Prior art date
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KR1020160108162A
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Inventor
조창수
Original Assignee
농업회사법인 휴림황칠(주)
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Publication date
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Priority to PCT/KR2016/010751 priority patent/WO2018038313A1/ko
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 화합물의 제조방법, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있으며, 천연물 유래의 화합물로서 합성 의약품에 비하여 독성이나 기타 부작용의 염려가 없는 안전한 치료제를 제공할 수 있다. 또한, 신규 화합물을 제공하며, 이는 골 질환 치료에 효과가 있는 것으로서 새로운 골 질환의 치료제로 이용될 수 있다.

Description

신규한 디노익산 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel diynoic acid compound and pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising the same}
본 발명은 화학식 1로 표시되는 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 화합물의 제조방법, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법에 관한 것이다.
골의 재형성은 기계적 스트레스와 호르몬 조절에 반응하여 골을 유지하도록 살아가면서 지속적으로 발생한다. 통상적인 골량을 유지하기 위하여, 밀접하게 결합된 과정을 통해 골은 파골세포에 의하여 재흡수되고 새로운 골기질이 조골세포에 의해 축적된다. 많은 일반적인 골 질환에서 보듯이, 이러한 과정에서의 불균형은 파골세포에 의한 과다한 골 재흡수 및 골의 연약성의 증가를 유도할 수 있다.
파골세포는 그의 주위에 존재하는 T-cell, fibroblast, osteoblast 등에서 분비 되는 호르몬에 의해 조혈모전구체 또는 골수성전구체로부터 분화되는 것으로 알려져 있다. 파골세포의 분화과정에 있어서, RANKL에 의한 신호 전달과정이 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. RANKL은 조골세포, 활성화된 T세포 및 기질세포에서 생성되고, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)와 함께 파골세포의 형태변화, 생존 및 골 흡수를 활성화 시킨다. RANKL이 수용체인 RANK에 결합되면, RANK의 세포질 도메인으로 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6)가 모여들고, 이에 따라 NF-κB와 JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38(p38 MAP kinase), 및 ERK(extracellular signal-regulated kinase)를 포함하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달 경로가 활성화된다. 활성화된 NF-κB는 하류에 있는 c-Fos와 NFATc1의 발현을 유도하는데, 이들은 RANKL에 의한 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 아울러, 이러한 파골세포의 분화과정은 IL-1, Il-3, PGE 등의 염증성 사이토카인에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다.
최종적으로 분화된 파골세포는 다핵화 세포(multi-nulceated)의 형태를 띄고, 뼈를 흡수할 부위에 결합하여 액틴(actin), 빈컬틴(vinculin) 등을 이용하여 실링존(sealing zone)을 형성하여 주위와 밀폐하게 된다. 이후 이곳에 수소 이온을 펌핑하여 pH를 낮추어 하이드록시아파타이드 성분을 녹이게 되고 뼈의 10% 정도를 차지하는 콜라겐 성분을 분해하기 위해서 MMP-9 혹은 카뎁신 K와 같은 단백질분해효소를 분비하게 된다. 이같이 최종 분화된 파골세포는 타르타르산이 있는 조건에서 활성을 보이는 phosphatase(tartrate-resistant acid phosphatase: TRAP)를 특이적으로 발현하는 것으로 알려져 있으므로, TRAP의 활성을 측정함으로써 파골 세포분화를 확인할 수 있다.
상술한 바와 같은, 파골세포는 생체내의 골대사에 있어서 중요한 역할을 수행하지만, 다양한 원인에 의하여 과다하게 분화될 경우, 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환이 유발될 수 있는데, 이러한 질환으로는 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease), 전이성 골암(metastatic bone cancers) 등을 들 수 있다.
상기와 같은 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하며, 따라서 이에 대한 치료제로는 크게 골흡수 억제제 및 골형성 자극제가 있다. 일반적으로 상기 골흡수 억제제 또는 골형성 자극제 등의 골 질환 치료제는 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적어야 하며, 투여의 번거로움을 해결하기 위하여 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로, 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 한편, 상기 골 질환 치료제 중 조골세포를 활성화 시킴으로써 골형성을 촉진하는 골형성 자극제에 대한 연구가 보다 활발하게 진행되고 있으나, 골형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않는다. 한편 현재 사용되고 있는 파골세포의 활성을 억제하는 골 질환 치료제로는 데노수맙(Denosumab; Prolia™, Amgen®) 등이 있으며 이외에도 다양한 약물들이 개발되고 있으나, 약물치료는 장기간 지속되어야 함을 고려할 때 아직 부작용 등이 충분히 검증되지 않았으며, 파골세포의 정확한 메커니즘은 아직까지 밝혀지지 않은 상태이다.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 구체적으로는, 하기 화학식 1로 표시되는 (9Z, 16S)-16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산((9Z, 16S)-16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016082702279-pat00001
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 신규한 디노익산 화합물로서, 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 화합물로 명명된다. 본 발명의 화합물은 일반적인 화학 합성에 의해서도 수득할 수 있으나, 바람직하게는 상기 화합물은 황칠(Dendropanax morbifera)과 같은 천연물로부터 분리한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 황칠 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 황칠은 황칠나무의 뿌리, 줄기, 꽃, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추출한 것 일 수 있고, 또는 황칠나무의 지상부인 줄기, 꽃, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 황칠나무의 잎을 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 황칠로부터 신규한 디노익산 화합물을 분리해냈으며, 상기 화합물의 분자량 측정, 분자식 추정 및 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR) 분석법에 의한 구조 확인 결과, (9Z, 16S)-16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 화합물임을 확인하였다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물 및 입체이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 상기 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "황칠"은 우리나라의 남부해안 지역과 제주도 등에서 자생하는 쌍떡잎 식물이며, 두릅나무과의 상록교목인 황칠나무(Dendropanax morbifera)는 겨울에도 낙엽이지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠이라고 한다. 황칠나무 추출물의 항암 활성 및 항산화 활성 등의 생리활성은 일부 제한적으로 보고 되어 있고, 식품 첨가제 및 건강기능성 보조 식품 등 식품에 이용되고 있다(Kim H.R., et al.. Chemical characteristics of the leaves and the seeds of Korean Dendropanax (Dendropanax morvifera Lev.). J. Korean Soc . Agric . Chem . Biotechnol. 43: 63-66(2000), Park S.N., et al.. Cellular antioxidant activity and whitening effects of dendropanax morbifera leaf extracts, 한국미생물생명공학회지, 41(4):407-415,2013). 본 발명에서 상기 황칠은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 지상부, 뿌리, 종자를 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 추출용매는 당업계에서 통상적으로 사용하는 추출용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 부탄올일 수 있다. 상기 추출용매는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 감수 분량의 2 내지 20배 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 10배 첨가할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 5배 첨가할 수 있다. 상기 추출의 방법은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 열탕 추출, 열수추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출의 방법을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 열탕 추출 또는 냉침 추출 방법을 사용할 수 있다. 추출 시 추출용매의 온도는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 20 내지 100℃일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상온일 수 있다. 추출시간은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 12시간 내지 10일일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5일 내지 8일일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 7일일 수 있다. 추출횟수는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 1 내지 5회일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3회일 수 있다. 상기와 같은 추출의 조건을 이용하여 황칠을 추출, 여과하고, 여과액을 농축 및 동결건조하여 황칠 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계이다.
상기 유기용매는 고체, 기체, 액체를 녹일 수 있는 액체 유기 화합물로서, 당업계에서 통상적으로 사용하는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 클로로포름, 아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 아세톤, 아세토니트릴, 벤젠 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
상기 컬럼 크로마토그래피는 고정상 알갱이를 크로마토관에 기둥 모양으로 채워서 넣고 진행하는 크로마토그래피법으로서, 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으며, 바람직하게는 상기 충진제는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(toyopearl) 또는 XAD 수지를 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에서 상기 (c) 단계는 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계이다.
상기 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)는 컬럼, 컬럼에 채우는 고정상의 충진제 그리고 장치의 개선, 개량에 의해 고속 및 고성능의 분리가 가능해진 크로마토그래피 방법으로서, 최종적으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 화합물의 파골세포 생성 억제 효과를 측정한 결과, 다른 화합물보다 본 발명에 따른 화합물의 파골세포 생성 억제 효과가 매우 유의적으로 우수한 것을 확인하였고(도 4 및 도 5), 특히 농도 의존적으로 파골세포 형성을 억제하였다(도 6). 또한, 세포 독성을 측정한 결과, 본 발명에 따른 화합물은 모든 농도에서 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다(도 7).
본 발명에서 사용된 용어, "골 질환"은 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 골량 저하 질환을 포함한다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 열화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미하는 것으로, 암세포에 의해 활성화되는 파골세포에 의한 골손실도 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 상기 골 질환은 이에 한정되지 않으나, 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질병일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 골다공증 또는 골감소증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 용어, "골다공증"은 골량이 감소하고 질적인 변화로 인해 골절이 일어날 가능성이 있는 상태를 의미하며, "골감소증"이란 골다공증의 초기 증세를 의미한다. 일반적으로 골밀도 수치(T 수치)를 기준으로 -1.0 내지 -2.5인 경우 골감소증, -2.5 이상인 경우 골다공증으로 분류한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 골 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 골 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로, 일일 투여량은 바람직하게는 황칠 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 100 mg/kg일 수 있으며, 보다 바람직하게는 30 내지 80 mg/kg일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 화장료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 골 질환 의심 개체는 골 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 골 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 골 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 골 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 동물에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 동물의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있으며, 천연물 유래의 화합물로서 합성 의약품에 비하여 독성이나 기타 부작용의 염려가 없는 안전한 치료제를 제공할 수 있다. 또한, 신규 화합물을 제공하며, 이는 골 질환 치료에 효과가 있는 것으로서 새로운 골 질환의 치료제로 이용될 수 있다.
도 1의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 1의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 분획물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 분획물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9의 화학식을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 6의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2의 세포 독성 여부를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 - 황칠나무 추출물 및 이의 분획물의 제조 >
실시예 1 : 황칠나무 추출물 및 이의 분획물의 제조
건조된 황칠나무(Dendropanax morbifera) 지상부 5 kg을 추출용기에 넣고, 70% 메탄올을 50 L 가하여 7일 동안 냉침시켜 추출하고 여과하였다. 상기 수득한 추출액은 진공회전증발기를 이용하여 감압농축 하였다. 상기 추출 및 농축 과정을 2회 반복하여 황칠나무 추출물을 950 g 수득하였다.
상기 수득한 황칠나무 메탄올 추출물을 5 L의 증류수에 현탁시킨 후, 동량의 에틸아세테이트로 추출하는 과정을 3회 반복하였고, 얻어진 추출액을 감압 농축하여 258 g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 상기 추출 과정으로부터 수득한 여액을 동량의 n-부탄올로 3회 반복하여 추출하고 추출액을 감압 농축하여 부탄올 분획물 159 g을 얻었다.
실시예 2: 황칠나무 추출물로부터 유효성분의 분리 및 동정
상기 실시예 1로부터 제조한 황칠나무 추출물로부터 9종의 화합물을 분리하였으며, 이들 화합물의 구조식과 명칭을 도 3에 나타내었다.
구체적으로는, 상기 수득한 분획물 중 에틸아세테이트 분획물 220 g을 취하여, 디클로로메탄/메탄올 혼합 용액을 이동상으로 흘려주되 디클로로메탄/메탄올 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 4개의 분획 (제1분획~제5분획)을 획득하였다.
수득한 제2분획 (20 g)을 재차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (50:1~1:1))를 실시하여 5개의 분획 (제21분획~제25분획)으로 나누었다. 이 중, 제21분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 흰색 분말을 얻었고 이 분말을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: 디클로로메탄/메탄올 (40:1))를 실시하여 화합물 3 (10.0 mg)과 화합물 4 (14.5 mg)를 분리하였다. 또한, 제22분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 화합물 5 (120.0 mg)을 얻었으며, 재결정 후 남은 모액은 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (용매: n-헥산/에틸아세테이트(50:1~1:1))를 실시하여 5개의 소분획 (제221분획~제225분획)으로 나누었다. 제224분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 흰색 분말을 얻었고, 1H NMR과 13C NMR을 통하여 화합물 6과 화합물 7이 1:3.5의 비율로 섞여있는 혼합물 (490.7 mg)임을 확인하였다.
상기 수득한 제3분획 (34 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (10:1~1:1))를 실시하여 5개의 분획 (제31분획~제35분획)으로 나누었다. 이 중, 제32분획을 재차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (30:1~5:1))로 두 차례 더 정제하여 흰색분말 70.0 mg을 얻었고, 1H NMR과 13C NMR을 통하여 화합물 8과 화합물 9가 1:1 의 비율로 섞여있는 혼합물임을 확인하였다. 제34분획은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (20:1~1:1))를 실시한 뒤, 70% 메탄올 (이동상)로 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리/정제하여 화합물 1 (201.0 mg) 및 화합물 2 (112.0 mg)를 각각 얻었고, 화합물 1은 신규화합물임을 확인하였다. 분리된 각각의 화합물들은 1H-NMR 및 13C-NMR을 사용하여 구조를 확인하였다.
< 실험예 >
실험예 1 : 황칠나무 추출물 및 이의 분획물의 파골세포의 생성 억제 효과
5주령의 수컷 ICR 마우스를 구입하여 대퇴골(fermur) 및 경골(tibia)을 취하고 항생제(100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM으로 세척하여 골수세포(bone marrow cell)를 획득하였다. 상기 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/ml)를 포함하는 α-MEM에 1일간 배양하였다. 비부착(non-adherent) 골수세포를 페트리접시에 분주하고 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 3일간 배양하였다. 비부착세포를 세척한 후 부착세포(adherent cell)를 골수-유래 마크로파지(bone marrow-derived macrophage; BMM)로 사용하였다. BMM 세포를 RANKL(10 ng/ml) 및 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 DMSO 또는 실시예 1로부터 제조한 황칠나무 추출물 또는 이의 분획물을 농도별(1, 3 및 10 μg/ml)로 처리하여 4일간 배양하였다. 음성대조군은 RANKL 및 실시예 1을 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 다핵성 파골세포(multinucleated osteoclast)를 3.7% 포르말린으로 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 세포를 TRAP 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 다핵성 파골세포를 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 염색으로 가시화하여 이를 도 1의 A(추출물 결과), 및 도 2의 A(분획물 결과)에 도시하였고, 황칠나무 추출물 농도에 따른 TRAP 활성을 측정하여 이를 도 1의 B(추출물 결과), 및 도 2의 B(분획물 결과)에 나타냈다.
실시예 1의 황칠나무 추출물 및 이의 분획물은 모두 농도 의존적으로 파골세포의 생성을 억제하는 것을 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있다. 황칠나무 메탄올 추출물은 3 ㎍/㎖의 농도부터 매우 유의적으로 파골세포의 생성을 억제하였고, 황칠나무 메탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물 및 n-부탄올 분획물은 10 ㎍/㎖ 농도부터 유의적으로 억제하였으며, 에틸 아세테이트 분획물의 억제효과가 n-부탄올 분획물보다 눈에 띄게 더 좋았다.
상기 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, RANKL처리군에 대비한 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다. ###은 음성대조군과 RANKL처리군을 비교하였을 때 나타난 유의성(p <0.001)을 나타낸다.
실험예 2 : 황칠나무 추출물 유래 화합물의 파골세포의 생성 억제 효과
<2-1> 화합물 1~9의 파골세포 생성 억제 효과
실시예 2에서 분리된 화합물 1~9의 파골세포 생성 억제 효과를 확인하고자, 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하였고, 화합물 1~9는 각각 10 μM, 30 μM의 농도로 처리하였다. TRAP 염색 결과는 도 4에, TRAP 활성 측정 결과는 도 5에 기재하였다. 도 4에서 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 및 7은 파골세포 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있지만, 다른 화합물들은 유의적으로 억제하지 못하므로 파골세포 생성 억제 효과가 없다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 5에서 화합물 1, 2 및 3은 10 μM, 30 μM 농도 모두에서 유의적으로 파골세포 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있고, 특히 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제효과가 매우 유의적으로 우수한 것을 확인할 수 있다.
유의성 검정은 상기 실험예 1의 검정 방법과 동일하게 실시하였다.
<2-2> 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제 효과
상기 실시예 2에서 분리된 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제 효과를 더 자세히 확인하고자 농도를 세분화하여 실험을 재실시하였다. 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하였고, 화합물 1 및 2는 각각 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM 의 농도로 처리하였다. TRAP 염색 결과는 도 6의 A에 도시하였고, TRAP 활성 측정 결과는 도 6의 B에 도시하였다.
화합물 1(화학식 1) 및 2(화학식 2)는 상기 실험예 2-1의 결과와 동일하게 농도 의존적으로 파골세포 형성을 억제하였고, 상기 두 화합물은 모두 1 μM 농도부터 유의적으로 파골세포 형성을 억제하였다. 또한, 50% 활성 억제 농도(IC50)는 화합물 1 및 2가 각각 2.41μM, 3.11μM 인 것으로 산출되었다.
실험예 3 : 화합물 1 및 2의 세포 독성 여부
화합물 1 및 2의 세포 독성 여부를 확인하기 위해, LDH cytotoxicity assay를 수행하였다. LDH는 세포손상도가 클수록 그 수치가 높다. BMM 세포를 30 ng/ml의 M-CSF와 10 ng/ml의 RANKL이 포함된 배지를 이용하여 1 X 105/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 분주한 후, 화합물 1 및 2를 각각 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM의 농도로 상기 well에 처리하여 4일 동안 배양하였다. 그 후, 배지 상층액 50 ㎕와 LDH 기질용액(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega) 50 ㎕를 30분간 실온에서 반응시킨다. 반응을 정지시키기 위해 stop solution(1M acetic acid)을 50 ㎕씩 첨가한 다음, Microplate ELISA reader로 490nm 파장에서 흡광도를 측정하여 화합물의 세포독성 유무를 확인하였고, 그 결과를 도 7에 도시하였다.
상기 도 7에서, 화합물 1 및 2는 모든 농도에서 대조군과 유사한 LDH 활성을 보이는바, 세포 독성이 없다는 것을 알 수 있다.

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  7. 하기 화학식 1로 표시되는 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물을 포함하는 의약외품 조성물.

    [화학식 1]
    Figure 112017097196868-pat00010

  8. 삭제
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 16-아세톡시-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetoxy-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid) 화합물을 포함하는 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017097196868-pat00011
  10. 삭제
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