KR101861716B1 - 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해서 OsCYP21-4 유전자가 식물의 산화적 스트레스와 고 농도 염의 환경 스트레스 내성 기작에 관여하는 유전자임을 알 수 있으며, 이를 유용작물에 도입하여 환경 스트레스 내성 작물 개발에 유용한 유전자로서 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
Description
본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다. 환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초, 그리고 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여한다.
식물을 비롯한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 지구 환경의 악화에 따라 발생하는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투성 충격(osmotic shock)과 같은 각종 환경 스트레스를 받게 된다. 그중에서도 높은 염 농도는 독성의 Na+ 이온 축적, 삼투스트레스, 산화 스트레스의 원인이 되어 작물의 생산성 감소, 성장저해를 유발한다. 세포 내 이온과 물 항상성(homeostasis)의 급격한 변화를 초래하여 심할 경우 식물이 죽게 된다. 수분 부족으로 인한 건조 스트레스 또한 작물의 생산성을 감소시키는 주된 요인이 된다. 식물은 이러한 수분, 염 또는 산화 스트레스에 대한 방어기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다.
한국공개특허 제1281072호에서는 'ＯｓＦＫＢＰ１６－３ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0695072호에는 '비생물성 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 스트레스 유도성 OsAsr1 유전자 및 단백질'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 OsCYP21-4 유전자가 여러 환경적 스트레스에 반응하여 발현이 증가함을 qRT-PCR로 확인하였다. 여러 환경 스트레스 중 산화적 스트레스와 염 스트레스에 대한 OsCYP21-4 유전자의 기능을 분석하기 위해 OsCYP21-4 과발현 형질전환 벼를 제작하였다. 식물체의 표현형 분석을 통해 벼에서 산화적 스트레스와 염 스트레스 처리시 OsCYP21-4 과발현체의 강한 내성을 확인하였으며 또한 생체 크기, 생체량 측정과 산화적 스트레스 관련 효소 활성 정도의 생리학적 분석을 통해서도 산화적 스트레스와 염 스트레스에 대한 내성을 확인하였다. OsCYP21-4 유전자의 과발현이 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsCYP21-4(cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 벼 이뮤노필린 OsCYP21-4 유전자는 PPIase 보존적 아미노산 잔기를 가지고 있지 않았으며, 합성 기질을 이용한 인 비트로(in vitro) 실험에서도 PPIase 활성도가 없음이 확인되었다. 또한 여러 환경 스트레스에 의해 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 상시 발현을 유도하는 35S 프로모터를 이용하여 OsCYP21-4 유전자 과발현 형질전환 벼 식물체를 제작하였다. OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환식물체를 이용하여 OsCYP21-4 유전자가 산화적 스트레스와 고농도 염 스트레스의 환경 스트레스에 반응하였고, 벼의 환경 스트레스 내성 증진에 기여함을 입증하였다. 본 발명을 통해서 OsCYP21-4 유전자가 식물의 산화적 스트레스와 고 농도 염의 환경 스트레스 내성 기작에 관여하는 유전자임을 알 수 있으며, 이를 유용작물에 도입하여 환경 스트레스 내성 작물 개발에 유용한 유전자로서 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
도 1은 여러 가지 스트레스에 반응하는 벼 OsCYP21-4 유전자의 발현 변화를 semi RT-PCR 및 qRT-PCR로 분석한 결과 도면이다. A) 벼의 발달시기 및 조직별 OsCYP21-4 유전자발현 분석 결과. 1W, 2W, 6W, 벼 종자 발아 후 1주, 2주 그리고 6주된 식물체; En, endosperm; Ro, root; Sh, sheath; St, stem; Le, leaf. B) 여러 스트레스 처리 시간별 OsCYP21-4 유전자발현 분석으로 고농도 염, 건조, 산화적 스트레스 유발 물질인 H2O2 (Hydrogen peroxide)와 MV (Methyl viologen), 열, 그리고 ABA 식물호르몬 처리 후, 시간에 따른 OsCYP21-4 유전자발현 분석. qRT-PCR은 3번의 반복실험에 대한 기준 에러 값으로 계산하였으며, OsACT1 유전자 발현값으로 보정하여 cDNA 값을 정량함.
도 2는 벼 이뮤노필린 OsCYP21-4 유전자의 상동체 유전자를 Brachypodium, 옥수수, 보리, 애기장대, 배추, 유채, 차축조, 포도에서 동정하여 단백질 서열을 배열하였으며, 벼를 포함한 다른 종들에서도 PPIase 보존적 아미노산 잔기를 가지고 있지 않음을 확인함.
도 3은 protease-coupled peptide assay를 통한 OsCYP21-4 단백질의 PPIase 활성도 측정 결과를 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4의 C-말단에 His가 융합된 pET28b 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환 후, IPTG를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 Nickel-NTA 아가로스 컬럼을 이용하여 OsCYP21-4 재조합 단백질을 분리 정제한 결과. Un (No induction), IPTG를 첨가하지 않아 재조합 단백질의 발현이 유도되지 않은 대장균으로부터 수거한 단백질 전기영동사진; In (Induction), 재조합 단백질의 발현 유도를 위해 IPTG를 첨가한 대장균으로부터 수거한 단백질 전기영동사진; Pu (Purified fraction), 정제된 분획 분획. B) 정제된 OsCYP21-4 단백질의 농도별 시간에 따른 PPIase 활성도 측정 결과. PPIase 활성도는 분광광도계 흡광도 390 nm에서 측정. 시험관에서 측정 결과, 히스톤(Histone)이 C 말단에 결합된 OsCYP21-4 단백질은 활성도를 보이지 않음. 대조구로 CypD 정제 단백질을 사용함.
도 4는 OsCYP21-4 유전자의 과발현 형질전환체 제작을 위한 재조합 유전자와 과발현 벼 식물 형질전환체에서의 재조합유전자 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과이다. A) pCAMBIA1300 벡터의 T-DNA 영역에서의 35S 프로모터에 의한 OsCYP21-4 ORF (1-235 aa) 유전자를 재조합한 도식 그림. LB, T-DNA 왼쪽 보더; 35S-P, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터; hptII, 하이그로마이신 저항성 유전자; T-NOS, 노팔린 합성효소 종결자; RB, T-DNA 오른쪽 보더. B) 벼 작물에 OsCYP21-4 과발현 재조합유전자 형질전환 후 생산된 T3 세대 형질전환체에서의 OsCYP21-4 유전자 발현정도 분석 결과. OsACT1 유전자 발현값으로 보정하여 OsCYP21-4 mRNA 발현 정도를 정량화 함. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체.
도 5는 OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 고 농도 염 스트레스에 대한 내성을 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 유식물체의 고 농도 염 스트레스 내성 표현형. 형질전환 식물체 선별을 위해 하이그로마이신 (50 mg/L)이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아 후 고 농도 염이 함유된 1/2 MS 배지로 옮겨 5일 후의 표현형. Normal, 고 농도 염이 첨가되지 않은 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진; 100 mM NaCl, 100 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진; 150 mM NaCl, 150 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진. B, C) 상기 A 그림의 염 스트레스 내성 표현형 정량화 분석을 위한 벼 식물체의 상대적인 뿌리 길이 측정 그래프 및 식물체 전체 생체량 측정 그래프. 각 독립 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. D) 200 mM NaCl, 200 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진. E) 상기 D 그림의 염 스트레스 내성 표현형 정성화 분석을 위한 벼 식물체 잎에서의 DAB 염색 정도를 보여 주는 사진. F, G) 상기 D 그림의 고 농도 염 스트레스 조건에서 벼 식물체의 상대적인 POD (peroxidase)와 APX (Ascorbate peroxidase) 활성도 측정. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. *, p < 0.1; **, p < 0.01, t-test에 의한 P value 값.
도 6은 CYP21-4 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 H2O2 산화적 스트레스에 대한 내성을 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 유식물체의 H2O2 산화적 스트레스 내성 표현형. 형질전환 식물체 선별을 위해 하이그로마이신(50 mg/L)이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아 후 10 mM 및 30 mM H2O2가 함유된 1/2 MS 배지로 옮겨 5일 후의 표현형. B) 상기 A 그림에 대한 H2O2 처리 산화적 스트레스 내성 정량화 분석을 위한 벼 유식물체의 신초 길이 측정 그래프. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. *, p < 0.1; **, p < 0.05, t-test에 의한 P value 값. C, D) 상기 A 그림의 H2O2 처리 산화적 스트레스 조건에서 벼 식물체의 상대적인 POD (peroxidase)와 APX (Ascorbate peroxidase) 활성도 측정. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. **, p < 0.05, t-test에 의한 P value 값.
도 2는 벼 이뮤노필린 OsCYP21-4 유전자의 상동체 유전자를 Brachypodium, 옥수수, 보리, 애기장대, 배추, 유채, 차축조, 포도에서 동정하여 단백질 서열을 배열하였으며, 벼를 포함한 다른 종들에서도 PPIase 보존적 아미노산 잔기를 가지고 있지 않음을 확인함.
도 3은 protease-coupled peptide assay를 통한 OsCYP21-4 단백질의 PPIase 활성도 측정 결과를 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4의 C-말단에 His가 융합된 pET28b 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환 후, IPTG를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 Nickel-NTA 아가로스 컬럼을 이용하여 OsCYP21-4 재조합 단백질을 분리 정제한 결과. Un (No induction), IPTG를 첨가하지 않아 재조합 단백질의 발현이 유도되지 않은 대장균으로부터 수거한 단백질 전기영동사진; In (Induction), 재조합 단백질의 발현 유도를 위해 IPTG를 첨가한 대장균으로부터 수거한 단백질 전기영동사진; Pu (Purified fraction), 정제된 분획 분획. B) 정제된 OsCYP21-4 단백질의 농도별 시간에 따른 PPIase 활성도 측정 결과. PPIase 활성도는 분광광도계 흡광도 390 nm에서 측정. 시험관에서 측정 결과, 히스톤(Histone)이 C 말단에 결합된 OsCYP21-4 단백질은 활성도를 보이지 않음. 대조구로 CypD 정제 단백질을 사용함.
도 4는 OsCYP21-4 유전자의 과발현 형질전환체 제작을 위한 재조합 유전자와 과발현 벼 식물 형질전환체에서의 재조합유전자 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과이다. A) pCAMBIA1300 벡터의 T-DNA 영역에서의 35S 프로모터에 의한 OsCYP21-4 ORF (1-235 aa) 유전자를 재조합한 도식 그림. LB, T-DNA 왼쪽 보더; 35S-P, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터; hptII, 하이그로마이신 저항성 유전자; T-NOS, 노팔린 합성효소 종결자; RB, T-DNA 오른쪽 보더. B) 벼 작물에 OsCYP21-4 과발현 재조합유전자 형질전환 후 생산된 T3 세대 형질전환체에서의 OsCYP21-4 유전자 발현정도 분석 결과. OsACT1 유전자 발현값으로 보정하여 OsCYP21-4 mRNA 발현 정도를 정량화 함. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체.
도 5는 OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 고 농도 염 스트레스에 대한 내성을 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 유식물체의 고 농도 염 스트레스 내성 표현형. 형질전환 식물체 선별을 위해 하이그로마이신 (50 mg/L)이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아 후 고 농도 염이 함유된 1/2 MS 배지로 옮겨 5일 후의 표현형. Normal, 고 농도 염이 첨가되지 않은 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진; 100 mM NaCl, 100 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진; 150 mM NaCl, 150 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진. B, C) 상기 A 그림의 염 스트레스 내성 표현형 정량화 분석을 위한 벼 식물체의 상대적인 뿌리 길이 측정 그래프 및 식물체 전체 생체량 측정 그래프. 각 독립 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. D) 200 mM NaCl, 200 mM 고 농도 염이 첨가된 1/2 MS 배지에서 5일 자란 벼 식물체 사진. E) 상기 D 그림의 염 스트레스 내성 표현형 정성화 분석을 위한 벼 식물체 잎에서의 DAB 염색 정도를 보여 주는 사진. F, G) 상기 D 그림의 고 농도 염 스트레스 조건에서 벼 식물체의 상대적인 POD (peroxidase)와 APX (Ascorbate peroxidase) 활성도 측정. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. *, p < 0.1; **, p < 0.01, t-test에 의한 P value 값.
도 6은 CYP21-4 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 H2O2 산화적 스트레스에 대한 내성을 나타내는 도면이다. A) OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 유식물체의 H2O2 산화적 스트레스 내성 표현형. 형질전환 식물체 선별을 위해 하이그로마이신(50 mg/L)이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아 후 10 mM 및 30 mM H2O2가 함유된 1/2 MS 배지로 옮겨 5일 후의 표현형. B) 상기 A 그림에 대한 H2O2 처리 산화적 스트레스 내성 정량화 분석을 위한 벼 유식물체의 신초 길이 측정 그래프. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. *, p < 0.1; **, p < 0.05, t-test에 의한 P value 값. C, D) 상기 A 그림의 H2O2 처리 산화적 스트레스 조건에서 벼 식물체의 상대적인 POD (peroxidase)와 APX (Ascorbate peroxidase) 활성도 측정. WT, wild-type (Dongjin); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP21-4 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30 개체의 식물체를 사용하였으며 3 반복에 대한 기준 에러값으로 계산됨. **, p < 0.05, t-test에 의한 P value 값.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsCYP21-4(cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 가뭄(건조), 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 OsCYP21-4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OsCYP21-4 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 OsCYP21-4 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 OsCYP21-4 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.
본 발명의 OsCYP21-4 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 동물세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsCYP21-4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 상기 OsCYP21-4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.
상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성, 바람직하게는 염 또는 산화 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하기 위한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다. 상기 OsCYP21-4 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 식물체의 염 또는 산화 스트레스 내성을 증가시키는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 벼의 발달시기와 조직에 따른
OsCYP21
-4 유전자발현 및 다양한 스트레스 처리에 반응하는
OsCYP21
-4 유전자의 발현특성
벼의 발달시기별 그리고 조직별 OsCYP21-4 유전자의 발현 차이를 확인하기 위하여 1주(1W), 2주(2W) 그리고 6주(6W) 된 벼 식물체로부터 배유(En), 뿌리(Ro), 신초(Sh), 줄기(St), 잎(Le) 조직으로 나누어 총 RNA를 추출하였다. MMLV Reverse Transcriptase (Invitrogen 사)를 이용해 추출한 RNA 2 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였으며, 이를 qRT-PCR 분석에 사용하였다. OsCYP21-4 유전자의 발현을 확인하기 위한 특이적 프라이머로 정방향 (5'-ATG GCG AGG ATA AAG CCG AAG CAA TTG-3' : 서열번호 3) 및 역방향 (5'-TCA GCT CAA AGC TTG CTG TTT TAG CGT GAT G-3' : 서열번호 4) 프라이머를 이용하였고, 발현량 보정을 위한 OsActin1 프라이머는 정방향 (5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3' : 서열번호 5) 및 역방향 (5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3' : 서열번호 6) 프라이머를 각기 사용하였다. OsCYP21-4 유전자는 모든 조직에서 발현되었으며, 특히 1주 된 식물체에서는 뿌리에서 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. 2주 및 6주 된 식물체에서는 다른 조직에 비해 줄기 조직에서 발현이 낮았으며, 6주 된 식물체에서는 잎 조직에서의 발현이 다른 조직에 비해 높은 것을 확인하였다 (도 1A). 다양한 스트레스 처리에 의한 OsCYP21-4 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 종자 발아 후 7일 된 벼 유식물체에 200 mM NaCl, 건조, 10 mM H2O2, 10 μM MV (methyl viologen)의 산화적 스트레스, 42℃ 고온 스트레스 및 식물호르몬 ABA를 처리하여 시간대 별로 RNA를 추출하였다. MMLV Reverse Transcriptase (Invitrogen 사)를 이용해 추출한 RNA 2 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였으며, 이를 qRT-PCR 분석에 사용하였다. OsCYP21-4 유전자발현은 고농도 염 스트레스, ABA 처리시 가장 강하게 증가하였으며 고농도 염 처리시 3 시간째 12배 이상 증가하고, 가뭄 또는 ABA 처리시 24 시간째 10배 이상 증가하였다. 고온 스트레스 및 산화적 스트레스 10 mM H2O2 와 10 μM MV (methyl viologen) 처리에 의해서도 약 4-6배 정도 발현이 증가하였다가 점차 줄어드는 것을 확인하였다(도 1B). 유전자 발현 분석을 통하여 OsCYP21-4 유전자는 식물체 대부분의 조직에서 발현되고 있으며, 다양한 스트레스에 의하여 유전자발현이 유도 조절되는 특성이 있음을 확인하였다.
실시예
2.
OsCYP21
-4 유전자의 염기서열 구조
벼 이뮤노필린 유전자 분류군에 속하는 OsCYP21-4 유전자는 235개의 아미노산으로 구성되어 있으며 단지 하나의 PPIase(peptidyl prolyl isomerase) 도메인만을 갖고 있으나 PPIase의 활성을 갖기 위한 보존적 아미노산 서열을 갖고 있지 않았다(Ahn et al., 2010 BMC Plant Biology 10:253). 벼 이외의 다른 종, Brachypodium, 옥수수, 보리, 애기장대, 배추, 유채, 차축조, 포도에서 이뮤노필린 OsCYP21-4 유전자의 상동체 유전자를 동정하여 단백질 서열을 배열한 결과 다른 종들에서도 PPIase 보존적 아미노산 잔기를 가지고 있지 않는 것으로 보아 OsCYP21-4를 포함한 여러 종의 CYP21-4 단백질은 PPIase 활성을 보이지 않는 것으로 예측되었다(도 2).
실시예
3.
OsCYP21
-4 단백질의
PPIase
활성 확인
OsCYP21-4 단백질의 PPIase 활성을 확인하기 위하여 protease-coupled peptide 분석 방법으로 측정하였다. pET28b 벡터에 OsCYP21-4 ORF(1-235aa) 부분을 삽입하여 OsCYP21-4 유전자 C-말단에 His(Histidine)이 융합된 재조합 플라스미드를 대장균(E. coli)에 형질전환시켰다. IPTG를 첨가하여 OsCYP21-4 단백질의 발현을 유도한 후 nickel-NTA 아가로스 컬럼을 사용해 OsCYP21-4 단백질을 정제 획득하였다(도 3A). OsCYP21-4 단백질의 PPIase 활성은 펩타이드 기질과 cis-에서 trans- 로 전환된 펩타이드 기질을 잘라내는 키모트립신(chymotypsin) 그리고 정제된 OsCYP21-4 단백질을 농도별로 반응시킨 뒤 흡광도 390nm에서 반응 시간에 따라 측정되었다. OsCYP21-4 단백질의 농도를 50, 100, 200 nM로 증가시켰으나, OsCYP21-4 단백질이 첨가되지 않은 무처리 대조구(Blank)와 흡광도 값은 동일하였다(도 3B). 이 때 CypD 단백질은 PPIase 활성을 갖는 양성 대조구로 사용하였다(도 3B). 이상의 실시예로부터 OsCYP21-4 단백질은 시험관 내에서 프롤린 이소머라제(proline isomerase)로서의 활성을 보이지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예
4.
OsCYP21
-4 유전자 과발현 형질전환체 생산
OsCYP21-4의 과발현 형질전환체 생산을 위해 35S 프로모터가 도입된 pCAMBIA1300 벡터에 OsCYP21-4 특이적 프라이머인 정방향 (5'-GAA TTC ATG GCG AGG ATA AAG CCG AAG CAA TTG-3' : 서열번호 7) 및 역방향 (5'-GGA TCC TCA GCT CAA AGC TTG CTG TTT TAG CGT GAT G-3' : 서열번호 8) 프라이머를 사용하여 pCAMBIA-OsCYP21-4 재조합 플라스미드를 제작하였다 (도 4A). OsCYP21-4 유전자가 벼의 유전체 내에 삽입되도록 형질전환시킨 후, 하이그로마이신 항생제를 이용해 OsCYP21-4 유전자 과발현 형질전환체 T3 세대를 선발하였다. 벼 식물체에서 삽입된 외래 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 3개의 독립적 과발현체(OE1, OE2, OE3)와 대조구인 동진 일반벼 WT (wild type) 식물체로부터 총 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 RT-PCR 분석한 결과, 3개 독립 라인의 형질전환체가 모두 대조구에 비해 강한 OsCYP21-4 유전자가 발현되고 있음을 확인하였다 (도 4B). RT-PCR의 cDNA 정량화를 위해 벼 actin1 유전자의 프라이머인 정방향 (5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3' : 서열번호 5) 및 역방향 (5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3' : 서열번호 6) 프라이머를 사용하였다. 따라서 벼에서 생산한 각 3개의 독립 라인 형질전환체를 OsCYP21-4 유전자 기능분석을 위한 재료로 사용하였다.
실시예
5.
OsCYP21
-4
과발현체를
이용한 고 농도 염 스트레스 내성 확인
OsCYP21-4 과발현 형질전환체를 이용하여 고 농도 염 스트레스에 대한 내성을 분석하였다. 벼에서 OsCYP21-4 과발현 형질전환체의 염 스트레스 내성 표현형을 분석하기 위하여 3일 된 벼 유식물체에 100 mM, 150 mM, 200 mM NaCl을 5일간 처리하였다. 대조구는 1/2 MS 배지에서 3일간 발아시키고 과발현체는 하이그로마이신이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아시켜 선별한 후, 고농도 염이 함유된 배지로 옮긴 뒤 5일째의 표현형을 관찰하였다. 정상조건에서 자란 경우 과발현체와 대조구의 생장에 차이가 없었으며, 고농도의 염 스트레스 처리 시 대조구에서는 식물체 생장이 크게 저하되는 표현형을 나타났다. 과발현체에서도 염이 처리되지 않은 정상조건보다 생장이 저해되었지만, 대조구에 비해 식물체의 지하부 뿌리가 더 잘 자라는 스트레스 내성 표현형을 나타내었다 (도 5A 및 5D). 100 mM, 150 mM 고농도 염 스트레스 처리 후, 과발현체와 대조구 식물체의 뿌리 길이와 생체량을 측정한 결과 과발현체의 뿌리 길이와 생체량이 대조구에 비해 약 20% 이상 증가한 것을 확인하였다 (도 5B 및 5C). 또한 ROS 생성 정도를 알아보기 위해, 벼의 대조구와 과발현 식물체의 잎을 고 농도 염 처리 후 DAB 염색하였다. DAB 처리시 염색이 강하게 될수록 잎에 존재하는 ROS의 농도는 높음을 나타낸다. 과발현체와 대조구의 식물체 잎에 DAB 염색을 한 결과 염이 처리되지 않은 정상상태에서는 염색 정도가 동일하였으나, 200 mM 고 농도 염이 처리된 경우, 과발현체 잎이 대조구 잎보다 염색 정도가 약한 것으로 보아 과발현체의 잎이 대조구의 잎보다 더 적은 양의 ROS를 보유함을 확인하였다 (도 5E). 또한 산화적 스트레스에 관여하는 POD (Peroxidase) 또는 APX (Ascobate Peroxidase) 효소들의 활성을 측정한 결과, 고농도 염 스트레스 처리시 대조구보다 과발현체에서 높게 나타났다 (도 5F 및 5G). 이를 통해 OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 식물체의 염 스트레스 내성 표현형을 입증하였다.
실시예
6.
OsCYP21
-4
과발현체를
이용한
산화적
스트레스 내성 확인
OsCYP21-4 유전자발현 분석 결과 산화적 스트레스 시 유전자 발현이 증가하였다(도 1B). 또한 고농도의 염 처리시 과발현 형질전환들이 대조구보다 낮게 ROS가 생성되었으며, 산화 관련 효소의 활성이 높게 나타났다(도 5E, 5F 및 5G). 이러한 결과를 기반으로 OsCYP21-4 과발현 형질전환체를 이용하여 산화적 스트레스에 대한 내성을 분석하였다. 대조구는 1/2 MS 배지에서 3일간 발아시키고 과발현체는 하이그로마이신이 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아시켜 선별하였다. 선별한 3일 된 벼 유식물체에 30 mM H2O2을 5일간 처리한 후, 표현형을 관찰하였다. 정상조건에서 자란 경우, 과발현체가 대조구의 생장보다 약간 잘 자랐으나 의미있는 차이를 보이지는 않았다. 고농도의 H2O2 산화적 스트레스 처리 시, 대조구에서는 식물체 생장이 크게 저하되는 표현형을 나타났다. 과발현체에서도 H2O2가 처리되지 않은 정상조건보다 생장이 저해 되었지만, 대조구에 비해 식물체의 신초(shoot) 부위가 더 잘 자라는 산화적 스트레스 내성 표현형을 나타내었다 (도 6A). 도 6A의 표현형을 정량적으로 측정하기 위하여 과발현체와 대조구 식물체의 신초 길이를 측정한 결과, 과발현체의 신초 길이가 대조구에 비해 약 20-30% 이상 증가한 것을 확인하였다 (도 6B). 또한 산화적 스트레스에 관여하는 POD (Peroxidase) 또는 APX (Ascobate Peroxidase) 효소들의 활성을 측정한 결과, 고 농도 H2O2 산화적 스트레스 처리시, 대조구보다 과발현체에서 높은 효소 활성을 나타났다 (도 6C 및 6D). 이를 통해 OsCYP21-4 유전자가 과발현된 벼 식물체의 산화적 스트레스 내성 표현형을 입증하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> OsCYP21-4 gene from rice for increasing environmental stress
resistance of plant and uses thereof
<130> PN16003
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
atggcgagga taaagccgaa gcaattgcta attcaaagca agacgaagaa ggccccaaca 60
cggatcagtt actccactat cgttacttgg aacctaattg ttatcttggt tgcgctatcc 120
ctctatgcta cctacaggca ttggcatcac aggccaatgc tcgagactga aatggatctc 180
cctcgtgctg agcatgttgg aagatctgag gattccacga agactagtag accaagctat 240
gcggttattg atactgccaa aggctcaatt actatagaaa tttacaaaga tgcttctgct 300
gatgttgtgg atagatttgt tagcttgtgc aagagtaacc attttaaagg aatgccgttt 360
cgtcatgtca tcaaaaactt tgtaattcaa gggggtgatt tcgatttcaa tggtgctgcc 420
caggaatgga tactgaaagc caaagccagt ggagaaaacg ctctaagtcc aaagcacgag 480
gcattcatga tcgggactac gaagaatcct aataataaag gatttgatct ttttatcaca 540
actgctccaa ttcctgactt gaatgacaag cttgttgtat ttgggcaagt tatcaatgga 600
caagatattg ttcaggagat cgaagaagtt gatactgatg agcattacca gccaaaaacc 660
cctatcggca tactcaacat cacgctaaaa cagcaagctt tgagctga 708
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Ala Arg Ile Lys Pro Lys Gln Leu Leu Ile Gln Ser Lys Thr Lys
1 5 10 15
Lys Ala Pro Thr Arg Ile Ser Tyr Ser Thr Ile Val Thr Trp Asn Leu
20 25 30
Ile Val Ile Leu Val Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Thr Tyr Arg His Trp
35 40 45
His His Arg Pro Met Leu Glu Thr Glu Met Asp Leu Pro Arg Ala Glu
50 55 60
His Val Gly Arg Ser Glu Asp Ser Thr Lys Thr Ser Arg Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Ala Val Ile Asp Thr Ala Lys Gly Ser Ile Thr Ile Glu Ile Tyr Lys
85 90 95
Asp Ala Ser Ala Asp Val Val Asp Arg Phe Val Ser Leu Cys Lys Ser
100 105 110
Asn His Phe Lys Gly Met Pro Phe Arg His Val Ile Lys Asn Phe Val
115 120 125
Ile Gln Gly Gly Asp Phe Asp Phe Asn Gly Ala Ala Gln Glu Trp Ile
130 135 140
Leu Lys Ala Lys Ala Ser Gly Glu Asn Ala Leu Ser Pro Lys His Glu
145 150 155 160
Ala Phe Met Ile Gly Thr Thr Lys Asn Pro Asn Asn Lys Gly Phe Asp
165 170 175
Leu Phe Ile Thr Thr Ala Pro Ile Pro Asp Leu Asn Asp Lys Leu Val
180 185 190
Val Phe Gly Gln Val Ile Asn Gly Gln Asp Ile Val Gln Glu Ile Glu
195 200 205
Glu Val Asp Thr Asp Glu His Tyr Gln Pro Lys Thr Pro Ile Gly Ile
210 215 220
Leu Asn Ile Thr Leu Lys Gln Gln Ala Leu Ser
225 230 235
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
atggcgagga taaagccgaa gcaattg 27
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tcagctcaaa gcttgctgtt ttagcgtgat g 31
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
catgctatcc ctcgtctcga cct 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
cgcacttcat gatggagttg tat 23
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gaattcatgg cgaggataaa gccgaagcaa ttg 33
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ggatcctcag ctcaaagctt gctgttttag cgtgatg 37
Claims (10)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsCYP21-4(cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCYP21-4 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 산화 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법으로서,
산화 스트레스 조건에서 형질전환체의 신초 길이가 비형질전환체에 비해 20~30% 증가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsCYP21-4(cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 산화 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법으로서,
산화 스트레스 조건에서 형질전환체의 신초 길이가 비형질전환체에 비해 20~30% 증가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
- 제5항의 방법에 의해 제조된 산화 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
- 삭제
- 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 삭제
Priority Applications (1)
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| KR1020160031044A KR101861716B1 (ko) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020160031044A KR101861716B1 (ko) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR20170107280A KR20170107280A (ko) | 2017-09-25 |
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| KR1020160031044A KR101861716B1 (ko) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도 |
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| KR (1) | KR101861716B1 (ko) |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101402602B1 (ko) * | 2014-02-12 | 2014-06-03 | 한국생명공학연구원 | 벼 유래 OsCYP18-2 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 |
-
2016
- 2016-03-15 KR KR1020160031044A patent/KR101861716B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101402602B1 (ko) * | 2014-02-12 | 2014-06-03 | 한국생명공학연구원 | 벼 유래 OsCYP18-2 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ahn 등. BMC Plant Biology. Vol. 10, 페이지 1-22 (2010.11.18.)* |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170107280A (ko) | 2017-09-25 |
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