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KR101831977B1 - 상피세포 성장인자의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

상피세포 성장인자의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도 Download PDF

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KR101831977B1
KR101831977B1 KR1020150119794A KR20150119794A KR101831977B1 KR 101831977 B1 KR101831977 B1 KR 101831977B1 KR 1020150119794 A KR1020150119794 A KR 1020150119794A KR 20150119794 A KR20150119794 A KR 20150119794A KR 101831977 B1 KR101831977 B1 KR 101831977B1
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Abstract

본 발명은 다음 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 피부를 구성하는 상피세포(keratinocyte) 및 섬유아세포(fibroblast)의 증식활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다:X1-Leu-X2-Glu-X3-Glu-X4, 상기에서 X1 : Met, Ile, Phe, His, Lys, Arg, Glu, 또는 Ile, X2 : Lys ,Arg, His, 또는 Asn, X3 : Trp ,Gly His, Tyr, 또는 Arg, X4 : Leu ,Asp, Asn, 또는 Phe. 본 발명의 피부세포 증식 펩타이드는 천연형 EGF와 비교하였을 때 피부세포 증식능력이 동일함과 동시에, 저분자량의 특징을 가지고 있어 피부 투과도가 매우 우수한 장점이 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 EGF 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 의약, 의약외품 및 화장품 등에 적용될 수 있다.

Description

상피세포 성장인자의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도{A peptide having activity of Epidermal growth factor activity and production method therefor}
본 발명은 상피세포 성장인자의 활성을 가지는 펩타이드와 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 저분자량 구조로 인해 피부투과도가 높으며, 안정성이 증가되어 천연형 보다 개선된 상피세포 성장인자 펩타이드 및 이를 포함하여 피부재생능력이 강화된 화장료 조성물에 대한 것이다.
EGF는 53개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 이황화결합(disulfide bond)을 가지는 분자량 6,045 달톤의 폴리펩타이드(Cohen, S., J. Bio1. Chem. 237:1555-1562, 1962; Savage, C.R., J. Bio1. Chem. 247:7612-7621, 1972)이며, 1953년 미국의 스텐리 코헨(S. Cohen)에 의하여 처음 발견되어 기능이 밝혀졌다. 주요 기능으로는 EGF 수용체와 결합하여 상피세포와 간엽세포를 포함한 다양한 세포들에 반응하여 상피세포 및 진피세포의 증식 촉진, 진피 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 증식촉진 등이 있다. 이러한 효과로 인하여 EGF는 다양한 적용분야 중에 스킨케어(skin care) 분야에서 가장 많이 사용되고 있다.
나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 EGF를 포함한 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다. 보통 25세를 지난 피부는 성장인자가 감소해 신진대사나 세포의 재생 능력이 점점 늦어지면서 주름이 생겨나게 된다. 건강한 젊은이의 피부 재생 주기는 약 4주간이지만 25세를 지난 피부는 6주로 주기가 늦어져서 피부세포의 재생 능력이 떨어지고 각질층이 두꺼워지면서 피부의 노화 현상이 진행된다. EGF는 세포막에 위치하고 있는 EGF 수용체에 결합하여 신호를 전달함으로써 피부를 구성하는 상피세포와 섬유아세포의 성장 및 분열을 유도하여 피부의 재생을 촉진을 하는 것으로 밝혀져 있으며(Sporn, M. B. et al., Nature. 313:745-747, 1985; Sporn M. B. et al., N. Engl. J. Med. 303:878-880, 1980) 피부세포(NIH3T3 cell line)을 이용한 실험에서도 미량만으로도 성장을 촉진하는 우수한 효과를 나타내었다.
따라서 적절한 전달 수단을 이용하여 피부에 EGF를 적용하게 되면 상피세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진하게 되고, 섬유아세포의 증식은 섬유아세포가 생산하는 진피 구성성분인 콜라겐 및 엘라스틴의 합성을 촉진하게 되어 피부재생을 돕고 연령과 함께 저하하는 피부 본래의 기능을 회복할 수 있다. 이에 따라 EGF는 미국 화장품협회(CTFA)의 국제 화장품 원료집(ICID)에 등재되었으며, 한국을 포함한 다양한 국가에서 화장품 원료로 사용되고 있다.
또한 EGF의 세포재생 기능은 당뇨병성 족부궤양 치료, 화상치료, 창상치료, 위궤양치료, 각막손상치료, 각종 절개수술, 미용목적의 박피수술, 노화된 피부의 개선 등 다양한 분야에 적용되고 있다(미합중국 특허 제140998호; Carpenter et al., Experimental Cell Research. 164:1-10, 1986; Kirkegaard, P. et al., Gastroenterology. 85:1277-1283, 1983; Konturek, S. J. et al., Gastroenterology. 81:438-443, 1981).
지금 사용되고 있는 EGF는 인간 상피세포 성장인자(hEGF)의 성공적 클로닝(Smith, J. et al., Nucleic Acids Res. 10, 4467-4482, 1982) 이후에, 대장균 등 다양한 세포를 이용하여 유전자 재조합 방법으로 생산하여 분리정제 과정을 통하여 순수한 EGF를 공급하고 있다(Urdea, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465, 1983; Oka, T, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7212-7216, 1985). 하지만 생산 공정상의 비용부담으로 인하여, 유사 기능을 가지고 있는 기존 고시 원료와 천연물에 비하여 단가가 높은 편에 속한다.
그리고 EGF는 화장품 제형에서 사용되는 수용성 제형 및 유통 온도 등에서 불안정하여 장기간 활성을 유지하기 어려우며(Manning, et al., Pharmaceutical Res. 6:903-917, 1989), 또한 분자량이 상대적으로 커서(>5,000 달톤) 피부 투과율이 낮고, 체내 반감기가 수 분 정도로 짧다고 알려져 있다.
따라서 EGF의 기능은 유지하며 안정성 및 피부투과성이 증가된 대체물질의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 EGF와 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 EGF 보다 안정성이 우수하고 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 제조하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아래와 같은 아미노산의 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 EGF 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다:
일반식 1:
X1-Leu-X2-Glu-X3-Glu-X4
상기 식에서,
X1 : Met, Ile, Phe, His, Lys, Arg, Glu, 또는 Ile
X2 : Lys ,Arg, His, 또는 Asn
X3 : Trp ,Gly His, Tyr, 또는 Arg
X4 : Leu ,Asp, Asn, 또는 Phe 잔기인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하기 일반식 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다:
일반식 1:
X1-Leu-X2-Glu-X3-Glu-X4
상기 일반식에 있어서, X1 : Met 또는 Ile이고, X2 : Lys 또는 Arg이며, X3 : Trp 또는 Gly이고, X4 : Leu 또는 Asp 잔기인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기
상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기;
X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기;또는
X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드의 C-말단에 Arg 잔기를 추가로 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 펩타이드의 서열은 서열번호 1 내지 32 중 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 본 발명의 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 있는 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 아세틸기, 아미드기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 아스코르브산기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 보호기가 결합되어 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 (a) 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount)의 상기 본 발명의 펩타이드; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 피부 상태의 개선의 효능 또는 활성을 가지는 것이 바람직하고, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 아토피 질환의 개선, 피부보습 개선, 검버섯 개선 또는 여드름 개선인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 EGF 유래 펩타이드의 경우 단백질 분자모델링 기술을 이용하여 EGF와 EGF 수용체와의 활성에 중요한 부위를 선정한 후, 각 아미노산 잔기에 대한 돌연변이를 설정하여 이에 따른 에너지 계산을 수행하여 비교한 결과, 더 강한 interaction을 나타내는 서열을 선택할 수 있었다. 이 분자모델링 결과를 입증하기 위하여 가상화 기술을 통하여 만들어진 펩타이드 서열을 합성하여 세포증식활성을 비교하였다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면 EGF와 EGF 수용체의 구조(PDB : 1IVO)에서의 EGF 구조에서 41번 아르지닌부터 51번 글루타민산까지의 구조를 기반으로 펩타이드의 homology modeling 등을 이용하여 결실된 52번 루이신과 53번 아르기닌을 복구하여 좀 더 올바른 EGF의 구조를 유도하였다. 위의 방식으로 제작된 EGF의 41번부터 53번까지의 구조 기반으로 점돌연변이 및 결실 돌연변이를 in silico(컴퓨터 가상화)기술을 이용하여 제작하였고 이를 수용체와의 도킹 실험을 통하여 더 강한 결합을 가지는 펩타이드의 서열을 발견할 수 있었다.
본 발명의 바람직한 구현예의 따르면 46번 아스파틱산의 메사이오닌, 아이소루이신,페닐알라닌, 히스티딘,라이신,아르기닌,그루탐산,아이소루이신으로 치환; 48번 라이신의 아르기닌,히스티딘,,아스파라진으로 치환 또는 사용; 50번 트립토판의 글라이신,히스티딘, 타이로신,아르기닌으로의 치환 또는 사용; 52번 루이신의 아스파틱산, 아스파라진, 페닐알라닌으로 치환 또는 사용이 가능한 헵타펩타이드(일반식 1) 또는 옥타펩타이드를 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연 EGF 보다 매우 우수한 안정성을 나타내지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 향상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 1의 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 있는 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 아스코르브산기아세틸기, 아미드기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)등 으로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다. 이러한 보호기는 본 발명의 펩타이드의 안정성을 증가시키는 역할을 한다.
본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 상기 일반식 1의 펩타이드의 C-말단은 아미노기로 변형되어 있으며, 이는 펩타이드의 안정성을 증가시키는 작용을 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 EGF-유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 피부 염증, 급만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성 단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름과 같은 피부 질환의 예방 또는 치료에 이용된다. 또한, 본 발명의 조성물은 창상 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or Burise)을 포함하고, 개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(Avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 EGF-유래 펩타이드의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 상술한 EGF-유래 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 EGF-유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 EGF-유래 펩타이드는 천연 EGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 EGF-유래 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장료 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 상술한 본 발명의 EGF 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 피부투과도가 개선된 상피세포성장인자의 펩타이드를 포함한 화장료 조성물을 첨부한 도면을 참고로 하여 이하 상세히 기술되는 실시예에 의하여 그 특징들을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 EGF 펩타이드들이 포함된 화장료 조성물은 펩타이드들의 피부투과도의 향상으로 인하여 천연형 EGF를 첨가한 화장료 조성물보다 뛰어난 피부재생 효과를 보인다.
도 1은 in silico modeling 기법을 이용하여 각각 아미노산 잔기의 돌연변이를 주었을 때의 도킹에너지 비교 결과를 나타낸 그림,
도 2는 펩타이드와 수용체의 결합시 각 아미노산 잔기의 도킹에너지 기여도를 나타낸 그림,
도 3은 아미노산 잔기의 돌연변이의 따른 세포증식실험을 나타낸 그림,
도 4는 각 펩타이드들의 컴퓨터 시뮬레이션 방법을 통한 결합에너지 계산수치를 나타낸 그림,
도 5는 각 펩타이드들의 NIH-3T3세포 증식능 비교 그림,
도 6은 세포증식능 평가를 통하여 헵타펩타이드와 천연형 EGF의 안정성을 비교한 그림,
도 7은 세포증식능 평가를 통하여 옥타펩타이드와 천연형 EGF의 안정성을 비교한 그림,
도 8은 시간에 따른 헵타펩타이드의 피부투과도 측정결과를 나타낸 그림,
도 9는 시간에 따른 옥타펩타이드의 피부투과도 측정결과를 나타낸 그림,
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 분자 모델링
PDB(Protein data bank)에 등록된 EGF와 EGF receptor의 구조인 1IVO와 복합체의 논문(OGISO, Hideo, et al. Cell, 110.6: 775-787,2002.)을 이용하여 interaction site에 대한 분석을 실시한다. 이중 EGF receptor와 강하게 결합하는 41R부터 51E의 구조를 취한 후 PDB 구조에 누락된 Leu과 Arg를 각각 52번 53번에 붙이고, 이를 Felxpepdock(Raveh B, et al,. Proteins 78:2029-40,2010.)을 이용하여 도킹을 진행한다. 이후 PIC(Protein interaction Calculator)를 이용, 각각의 interaction의 에너지, RMSD(root-mean-square deviation) 및 경향성을 분석한다. 이러한 경향성을 토대로 아미노산 잔기들의 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이 등을 가상화 기술을 통하여 펩타이드 후보군을 제작한 후 이를 Flexpepdock을 이용하여 분석한다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에 나타나있는 돌연변이들을 기반으로 펩타이드와 수용체의 결합시 각 아미노산 잔기의 도킹에너지의 기여도를 분석하여 아미노산잔기의 뮤테이션의 중요도를 평가하였다(도 2). 이러한 펩타이드들이 실제로 세포활성을 갖는지 확인하기 위하여 NIH-3T3세포 증식능 실험을 진행하였다(도 3). 세포증식능 실험의 자세한 설명은 실시예 5에서 설명하기로한다.. 이러한 분석결과를 기반으로 표 1에 나와 있는 서열을 결정하였고 이에 따른 에너지를 계산하였다(도 4).
펩타이드 1 MLKEWEL 펩타이드 17 MLKEWELR
펩타이드 2 MLKEWED 펩타이드 18 MLKEWEDR
펩타이드 3 MLKEGEL 펩타이드 19 MLKEGELR
펩타이드 4 MLKEGED 펩타이드 20 MLKEGEDR
펩타이드 5 MLREWEL 펩타이드 21 MLREWELR
펩타이드 6 MLREWED 펩타이드 22 MLREWEDR
펩타이드 7 MLREGEL 펩타이드 23 MLREGELR
펩타이드 8 MLREGED 펩타이드 24 MLREGEDR
펩타이드 9 ILKEWEL 펩타이드 25 ILKEWELR
펩타이드 10 ILKEWED 펩타이드 26 ILKEWEDR
펩타이드 11 ILKEGEL 펩타이드 27 ILKEGELR
펩타이드 12 ILKEGED 펩타이드 28 ILKEGEDR
펩타이드 13 ILREWEL 펩타이드 29 ILREWELR
펩타이드 14 ILREWED 펩타이드 30 ILREWEDR
펩타이드 15 ILREGEL 펩타이드 31 ILREGELR
펩타이드 16 ILREGED 펩타이드 32 ILREGEDR
표 1은 본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열 표(펩타이드 1 내지 32는 각각 서열번호 1 내지 32에 해당)
실시예 2: Met-Leu- Lys - Glu -Trp- Glu -Leu( EGF 헵타펩타이드 )의 합성
상기의 서열을 갖는 펩타이드 제작을 위해, 먼저 Fmoc-Rink 아미드 레진(GL Biochem사, Cat No. 49001) 10 mmole을 반응용기에 넣고, 메틸렌 클로라이드 (MC) 50 ml를 가하여 20분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호용액(20%의 피페리딘/DMF) 60 ml를 반응용기에 넣고 30분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하고 DMF로 3회, MC로 1회 세척하였다. 새로운 반응기에 50 ml의 DMF 용액을 넣고 이어, Nsc-Leu-OH 15mmole, HoBt 15 mmole 및 HBTU 15 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 용해시켰다. 용해된 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고, 20mmole의 DIPEA(N,N'-Diisopropyl ethylamine)를 넣고 2시간 동안 상온에서 교반하며 반응시켰다.
반응액을 제거하고, DMF 용액으로 3회 5분씩 교반하여 미반응 잔류물을 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저테스트(Ninhydrine test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Leu-Rink 아미드 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 세척하고, 다시 한번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여, Nsc-Glu(tBu)-OH, Nsc-Trp(Boc)-OH, Nsc-Glu(tBu)-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Met-OH 순으로 연쇄 반응을 시킨 후 탈보호용액(20%의 피페리딘/DMF) 60 ml를 반응용기에 넣고 30분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하고 DMF로 3회, MC로 1회 세척하였다. DMF 60ml(20%-Acetic anhydride)를 넣고 상온에서 30분간 교반하면서용액을 제거하고 DMF로 3회, MC로 3회 세척하고, 질소 공기를 흘려 건조하여 Met-Leu-Lys(Boc)-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Glu(tBu)-Leu-Rink 아미드 레진을 제조하였다.
제조된 아미드 레진을 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 미리 조제한 탈루용액(TFA 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸 5%, 페놀 5%, EDT 2.5% 및 TIS1%) 100 ml을 넣은 후, 상온에서 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 여과한 다음, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고, 300 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심 분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 건조하여 정제 전 헵타펩타이드 (Met-Leu-Lys-Glu-Trp-Glu-Leu-NH2) 를 수득하였다. 정제 전 헵타펩타이드를 ID 5cm preparative LC를 통해 정제 및 동결건조하여 분말형태로 수득하였다. 정제 후 얻은 분말은 HPLC로 분석하여 순도와 질량 값을 측정하였다.
실시예 3: Met-Leu- Lys - Glu -Trp- Glu -Leu- Arg ( EGF 옥타펩타이드 )의 합성
상기의 서열을 갖는 펩타이드 제작을 위해, 먼저 Fmoc-Rink 아미드 레진(GL Biochem사, Cat No. 49001) 10 mmole을 반응용기에 넣고, 메틸렌 클로라이드 (MC) 50 ml를 가하여 20분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호용액(20%의 피페리딘/DMF) 60 ml를 반응용기에 넣고 30분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하고 DMF로 3회, MC로 1회 세척하였다. 새로운 반응기에 50 ml의 DMF 용액을 넣고 이어, Nsc-Arg(Pbf)-OH 15mmole, HoBt 15 mmole 및 HBTU 15 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 용해시켰다. 용해된 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고, 20mmole의 DIPEA (N,N'-Diisopropyl ethylamine)를 넣고 2시간 동안 상온에서 교반하며 반응시켰다.
반응액을 제거하고, DMF 용액으로 3회 5분씩 교반하여 미반응 잔류물을 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저테스트(Ninhydrine test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Arg(Pbf)-Rink 아미드 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 세척하고, 다시 한번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여, Nsc-Leu-OH, Nsc-Glu(tBu)-OH, Nsc-Trp(Boc)-OH, Nsc-Glu(tBu)-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Met-OH 순으로 연쇄 반응을 시킨 후 탈보호용액(20%의 피페리딘/DMF) 60 ml를 반응용기에 넣고 30분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하고 DMF로 3회, MC로 1회 세척하였다. 질소 공기를 흘려 건조하여 Met-Leu-Lys(Boc)-Glu(tBu) -Trp(Boc)-Glu(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Rink 아미드 레진을 제조하였다.
제조된 아미드 레진을 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 미리 조제한 탈루용액(TFA 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸 5%, 페놀 5%, EDT 2.5% 및 TIS1%) 100 ml을 넣은 후, 상온에서 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 여과한 다음, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고, 300 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심 분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 건조하여 정제 전 옥타펩타이드 (Met-Leu-Lys-Glu-Trp-Glu-Leu-Arg-NH2)를 수득하였다. 정제 전 옥타펩타이드를 ID 5cm preparative LC를 통해 정제 및 동결건조하여 분말형태로 수득하였다. 정제 후 얻은 분말은 HPLC로 분석하여 순도와 질량 값을 측정하였다.
실시예 4: 다른 펩타이드들의 합성
펩타이드 1 ~32번까지의 서열을 갖는 펩타이드 제작을 위해 상기 실시예 2와 3과 동일한 방법으로 합성하되, 아미노산은 서열에 부합되는 아미노산을 사용하였다. 또한 상기 표 1의 펩타이드에 N-말단 및 C-말단에 있는 아미노산 잔기에 아세틸기, 아미드기, 아스코르브산기를 양말단에 합성한후 이를 분석하였다. 합성된 펩타이드들의 순도와 질량값을 HPLC로 분석 측정하였다(표 2).
펩타이드 순도 (%) 질량 값 　 　 순도 (%) 질량 값
펩타이드 1 95.2 948.1 　 펩타이드 17 87 1104.3
펩타이드 2 92.1 950 　 펩타이드 18 91.1 1106.2
펩타이드 3 91.6 818.9 　 펩타이드 19 95.2 1098.2
펩타이드 4 96.7 820.9 　 펩타이드 20 92.1 975.1
펩타이드 5 98.1 976.1 　 펩타이드 21 90.5 1132.3
펩타이드 6 91.3 978 　 펩타이드 22 98.2 1134.2
펩타이드 7 90.3 847 　 펩타이드 23 95.4 1003.1
펩타이드 8 94.2 848.9 　 펩타이드 24 93.4 1005.1
펩타이드 9 91 930.1 　 펩타이드 25 91.1 1086.3
펩타이드 10 91.1 932 　 펩타이드 26 90.1 1088.2
펩타이드 11 89.3 800.9 　 펩타이드 27 96.2 957.1
펩타이드 12 88.6 802.8 　 펩타이드 28 89.2 959
펩타이드 13 93.4 958.1 　 펩타이드 29 96.2 1114.3
펩타이드 14 96.2 960 　 펩타이드 30 91.2 1116.2
펩타이드 15 91.1 828.9 　 펩타이드 31 90.3 985.1
펩타이드 16 90.9 830.8 　 펩타이드 32 90.6 987
Ac-펩타이드1-NH2 92.3 1007.1 　 Ac-펩타이드17-NH2 96.5 1163.3
Ac-펩타이드2-NH2 98.2 1009 　 Ac-펩타이드18-NH2 92.3 1165.2
Ac-펩타이드3-NH2 94.2 877.9 　 Ac-펩타이드19-NH2 95.7 1157.2
Ac-펩타이드4-NH2 91.6 879.9 　 Ac-펩타이드20-NH2 97.6 1034.1
Ac-펩타이드5-NH2 98.2 1035.1 　 Ac-펩타이드21-NH2 91.3 1191.3
Ac-펩타이드6-NH2 90.8 1037 　 Ac-펩타이드22-NH2 93.4 1193.2
Ac-펩타이드7-NH2 89.3 906 　 Ac-펩타이드23-NH2 92.3 1062.1
Ac-펩타이드8-NH2 92.1 907.9 　 Ac-펩타이드24-NH2 97.5 1064.1
Ac-펩타이드9-NH2 98.4 989.1 　 Ac-펩타이드25-NH2 91.7 1145.3
Ac-펩타이드10-NH2 94.2 991 　 Ac-펩타이드26-NH2 96.4 1147.2
Ac-펩타이드11-NH2 98.5 859.9 　 Ac-펩타이드27-NH2 86.6 1016.1
As-펩타이드 1-NH2 92.3 1123.2 　 As-펩타이드 17-NH2 96.5 1279.4
As-펩타이드 2-NH2 98.2 1125.1 　 As-펩타이드 18-NH2 92.3 1281.3
As-펩타이드 3-NH2 94.2 994 　 As-펩타이드 19-NH2 95.7 1273.3
As-펩타이드 4-NH2 91.6 996 　 As-펩타이드 20-NH2 97.6 1150.2
As-펩타이드 5-NH2 98.2 1151.2 　 As-펩타이드 21-NH2 91.3 1307.4
As-펩타이드 6-NH2 90.8 1153.1 　 As-펩타이드 22-NH2 93.4 1309.3
As-펩타이드 7-NH2 89.3 1022.1 　 As-펩타이드 23-NH2 92.3 1178.2
As-펩타이드 8-NH2 92.1 1024 　 As-펩타이드 24-NH2 97.5 1180.2
As-펩타이드 9-NH2 98.4 1105.2 　 As-펩타이드 25-NH2 91.7 1261.4
As-펩타이드 10-NH2 94.2 1107.1 　 As-펩타이드 26-NH2 96.4 1263.3
As-펩타이드 11-NH2 98.5 976 　 As-펩타이드 27-NH2 86.6 1132.2
As-펩타이드 12-NH2 96.2 977.9 　 As-펩타이드 28-NH2 90.6 1134.1
As-펩타이드 13-NH2 89.2 1133.2 　 As-펩타이드 29-NH2 89.1 1289.4
As-펩타이드 14-NH2 87.6 1135.1 　 As-펩타이드 30-NH2 96.2 1291.3
As-펩타이드 15-NH2 92.3 1004 　 As-펩타이드 31-NH2 95.3 1160.2
As-펩타이드 16-NH2 95.7 1005.9 　 As-펩타이드 32-NH2 94.2 1162.1
Pl-펩타이드 1-NH2 92.3 1213.5 　 Pl-펩타이드 17-NH2 96.5 1369.7
Pl-펩타이드 2-NH2 98.2 1215.4 　 Pl-펩타이드 18-NH2 92.3 1371.6
Pl-펩타이드 3-NH2 94.2 1084.3 　 Pl-펩타이드 19-NH2 95.7 1363.6
Pl-펩타이드 4-NH2 91.6 1086.3 　 Pl-펩타이드 20-NH2 97.6 1240.5
Pl-펩타이드 5-NH2 98.2 1241.5 　 Pl-펩타이드 21-NH2 91.3 1397.7
Pl-펩타이드 6-NH2 90.8 1243.4 　 Pl-펩타이드 22-NH2 93.4 1399.6
Pl-펩타이드 7-NH2 89.3 1112.4 　 Pl-펩타이드 23-NH2 92.3 1268.5
Pl-펩타이드 8-NH2 92.1 1114.3 　 Pl-펩타이드 24-NH2 97.5 1270.5
Pl-펩타이드 9-NH2 98.4 1195.5 　 Pl-펩타이드 25-NH2 91.7 1351.7
Pl-펩타이드 10-NH2 94.2 1197.4 　 Pl-펩타이드 26-NH2 96.4 1353.6
Pl-펩타이드 11-NH2 98.5 1066.3 　 Pl-펩타이드 27-NH2 86.6 1222.5
Pl-펩타이드 12-NH2 96.2 1068.2 　 Pl-펩타이드 28-NH2 90.6 1224.4
Pl-펩타이드 13-NH2 89.2 1223.5 　 Pl-펩타이드 29-NH2 89.1 1379.7
Pl-펩타이드 14-NH2 87.6 1225.4 　 Pl-펩타이드 30-NH2 96.2 1381.6
Pl-펩타이드 15-NH2 92.3 1094.3 　 Pl-펩타이드 31-NH2 95.3 1250.5
Pl-펩타이드 16-NH2 95.7 1096.2 　 Pl-펩타이드 32-NH2 94.2 1252.4
표 2는 펩타이드군을 HPLC로 분석하여 순도와 질량을 분석한 표
(Ac-아세틸기, As-아스코르빌기, Pl-팔미토일기)
실시예 5 : NIH-3 T3 섬유아세포에 대한 성장효과 분석
본 발명의 펩타이드들에 대한 섬유아세포의 성장효과를 분석하기 위해, NIH-3T3 섬유아세포주를 이용한 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 분석법을 이용하여 측정하였다. NIH-3T3 세포는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 열처리된 10% BCS(bovine calf serum), 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium) 배지(D-MEM high Glucose,with L-glutamine, Sodium Pyruvate, USA)를 이용하여 유지하였다. 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 2 x 103 세포가 되도록 NIH-3T3 세포를 분주하고 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 0.5% BCS, 페니실린 1%를 포함한 DMEM 배양액으로 배지를 교환한 뒤, 표준을 잡기위한 대조군(control)과 사람의 EGF, 그리고 여러 시료 펩타이드들을 물과 10% DMSO에 용해한 후 각각의 농도 별로 처리하고, 24시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT 용액(EZ-CYTOX, Cell Viability, Proliferation & Cytotoxicity Assay Kit, Dogen, KOR, Cat 786-213)을 첨가하고 1시간 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존상태를 측정하였다.(도 5) 이 때 펩타이드의 양끝 보호기의 유무에 따른 활성도 차이가 확인되지 않았다. 이에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
실시예 6 : 천연형 EGF 와 EGF 헵타펩타이드 , EGF 옥타펩타이드의 안정성 분석
본 발명에서 활성과 안정도를 고려하여 선정된 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드의 대한 안정성을 분석하기 위해 20 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충액에 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드를 1.1 ug/ml의 농도가 되도록 용해시켰다. 천연형 EGF와의 안정성 비교를 위하여 대장균으로부터 생산된 천연형 EGF도 20 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충액에 1.1 ug/ml의 농도가 되도록 용해시켰다. 그리고 각각 37℃ 환경에서 방치하여 일주일 간격으로 하였다. 이를 대상으로 실시예 4의 NIH-3T3 cell line을 이용한 세포증식능 실험을 진행하여 천연형 EGF와 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드의 안정성을 확인하였다. 이때 0일의 샘플 활성을 100% 기준으로 진행하였다.
도 6과 7에서 볼 수 있듯이 일주일 간격으로 샘플링된 결과에서 천연형 EGF의 활성은 일주일이 지남에 따라 급격하게 떨어져 35일이 경과 된 날에 0일째 기준 60%정도의 활성을 보이는 반면에 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드의 활성은 미미하게 떨어져 35일이 경과 된 후에도 80%이상의 활성을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 천연형 EGF에 비하여 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드의 안정도가 보다 뛰어나다는 것을 알 수 있었다. 표 3에 각 펩타이드들의 시간에 따른 안정도 측정한 결과를 표기하였다. 이때 보호기의 유무에 따라 안정도가 유의하게 증가하는 양상은 보였으나 큰 차이가 나타나지 않았다. 이에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다
Day
펩타이드 		0 7 14 21 28 35
펩타이드 1 100 92 88 84 81 79
펩타이드 2 100 91 89 85 81 79
펩타이드 3 100 92 89 87 86 82
펩타이드 4 100 91 87 86 84 83
펩타이드 5 100 92 85 85 84 84
펩타이드 6 100 91 90 85 84 83
펩타이드 7 100 92 91 87 86 86
펩타이드 8 100 91 91 88 83 81
펩타이드 9 100 93 93 89 85 84
펩타이드 10 100 91 90 86 82 80
펩타이드 11 100 93 89 87 83 82
펩타이드 12 100 91 88 86 83 81
펩타이드 13 100 90 88 87 85 83
펩타이드 14 100 90 89 88 86 84
펩타이드 15 100 89 86 86 84 82
펩타이드 16 100 93 89 87 86 82
평균값 100 91.3 89 86.6 84.1 82.3
　 　 　 　 　 　 　
펩타이드 17 100 95 88 86 85 83
펩타이드 18 100 94 89 88 86 85
펩타이드 19 100 95 94 90 88 86
펩타이드 20 100 91 90 89 88 87
펩타이드 21 100 93 90 88 83 81
펩타이드 22 100 94 88 86 84 82
펩타이드 23 100 90 88 86 83 80
펩타이드 24 100 93 92 91 87 89
펩타이드 25 100 94 92 91 86 87
펩타이드 26 100 92 90 90 84 87
펩타이드 27 100 93 90 88 85 82
펩타이드 28 100 90 86 86 82 80
펩타이드 29 100 96 94 92 88 87
펩타이드 30 100 93 90 89 82 80
펩타이드 31 100 91 90 88 83 81
펩타이드 32 100 90 87 85 83 83
평균값 100 92.7 89.8 88.3 85.3 83.7
천연형 EGF 100 83 75 70 65 62
천연형 EGF 100 83 75 70 65 62
표 3은 각 펩타이드들의 시간에 따른 안정도(%)를 나타낸 표
실시예 7: 천연형 EGF 와 EGF 헵타펩타이드 , EGF 옥타펩타이드의 피부투과도 테스트
본 발명의 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드에 대한 피부투과도를 확인하기 위하여 인공피부 Neoderm E (테고사이언스)와 PBS(Sigma사. Cat No. P-5368)을 준비하였다. Franz cell에 자기교반봉 (magnetic bar)을 넣고 5 ml PBS를 넣어준다. Franz cell위에 Neoderm E의 각질층(stratum corneum)이 위쪽을 향하도록 올린다. Neoderm E의 위에 Franz cell 뚜껑을 올리고 고정쇠(clamp)로 완전히 고정시킨 후, Franz cell service system에 Franz cell을 위치시킨다. Neoderm E위에 천연형 EGF와 EGF 헵타펩타이드, EGF 옥타펩타이드 각각 50 ug/ml의 시료 중에 500 ul 넣은 후 파라필름(parafilm)으로 봉인 하고 600 rpm에서 교반기를 작동한다. 주사기를 이용하여 8시간, 12시간 별로 샘플링하여 분석할 시료를 150 ul씩 취하여 ELISA kit를 이용하여 농도를 측정하였다. 이 때 보호기의 유무에 따라 피부투과도에 있어서 눈에 띄는 차이가 나타나지 않았다. 이에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
Time
펩타이드 		8Hr 12Hr 8Hr 12Hr
펩타이드 1 3.9 5.1 　 펩타이드 17 3.8 5.2
펩타이드 2 3.8 5.6 　 펩타이드 18 4 5.1
펩타이드 3 3.7 5 　 펩타이드 19 4.2 4.5
펩타이드 4 3.4 4.5 　 펩타이드 20 3.6 4.3
펩타이드 5 3.8 4.5 　 펩타이드 21 3.8 4.8
펩타이드 6 3,6 4.6 　 펩타이드 22 4.1 4.7
펩타이드 7 3.7 4.7 　 펩타이드 23 4.1 4.3
펩타이드 8 3.7 4.9 　 펩타이드 24 3.6 4.9
펩타이드 9 3.6 5.2 　 펩타이드 25 3.5 4.8
펩타이드 10 3.5 4.8 　 펩타이드 26 3.9 4.6
펩타이드 11 3.8 4.9 　 펩타이드 27 3.9 5
펩타이드 12 3.6 4.9 　 펩타이드 28 4 5.1
펩타이드 13 3.7 4.7 　 펩타이드 29 3.9 4.6
펩타이드 14 3.6 4.8 　 펩타이드 30 4.1 4.9
펩타이드 15 3.9 5 　 펩타이드 31 4.1 5.1
펩타이드 16 3.8 4.9 　 펩타이드 32 4 4.9
평균값 3.7 4.8 　 평균값 3.9 4.8
천연형 EGF 0.63 0.7 　 　 　 　
표 4는 시간에 따른 펩타이드들의 피부투과도를 나타낸 표
<110> PnP Biopharm Co., Ltd. <120> A peptide having activity of Epidermal growth factor activity and production method therefor <130> HY151024 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 1 Met Leu Lys Glu Trp Glu Leu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 2 Met Leu Lys Glu Trp Glu Asp 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 3 Met Leu Lys Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 4 Met Leu Lys Glu Gly Glu Asp 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 5 Met Leu Arg Glu Trp Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 6 Met Leu Arg Glu Trp Glu Asp 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 7 Met Leu Arg Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 8 Met Leu Arg Glu Gly Glu Asp 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 9 Ile Leu Lys Glu Trp Glu Leu 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 10 Ile Leu Lys Glu Trp Glu Asp 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 11 Ile Leu Lys Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 12 Ile Leu Lys Glu Gly Glu Asp 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 13 Ile Leu Arg Glu Trp Glu Leu 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 14 Ile Leu Arg Glu Trp Glu Asp 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 15 Ile Leu Arg Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 16 Ile Leu Arg Glu Gly Glu Asp 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 17 Met Leu Lys Glu Trp Glu Leu Arg 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 18 Met Leu Lys Glu Trp Glu Asp Arg 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 19 Met Leu Lys Glu Gly Glu Leu Arg 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 20 Met Leu Lys Glu Gly Glu Asp Arg 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 21 Met Leu Arg Glu Trp Glu Leu Arg 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 22 Met Leu Arg Glu Trp Glu Asp Arg 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 23 Met Leu Arg Glu Gly Glu Leu Arg 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 24 Met Leu Arg Glu Gly Glu Asp Arg 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 25 Ile Leu Lys Glu Trp Glu Leu Arg 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 26 Ile Leu Lys Glu Trp Glu Asp Arg 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 27 Ile Leu Lys Glu Gly Glu Leu Arg 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 28 Ile Leu Lys Glu Gly Glu Asp Arg 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 29 Ile Leu Arg Glu Trp Glu Leu Arg 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 30 Ile Leu Arg Glu Trp Glu Asp Arg 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 31 Ile Leu Arg Glu Gly Glu Leu Arg 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 32 Ile Leu Arg Glu Gly Glu Asp Arg 1 5

Claims (23)

  1. 하기 일반식 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드:
    [일반식 1]
    X1-Leu-X2-Glu-X3-Glu-X4
    상기 일반식에 있어서, X1 : Met 또는 Ile이고, X2 : Lys 또는 Arg이며, X3 : Trp 또는 Gly이고, X4 : Leu 또는 Asp임.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Met 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Lys 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Trp 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Leu 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 X1은 Ile 잔기, X2는 Arg 잔기, X3는 Gly 잔기, X4는 Asp 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 펩타이드의 C-말단에 Arg 잔기를 추가로 포함하는 펩타이드.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 32에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  20. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 있는 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 아세틸기, 아미드기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 아스코르브산기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  21. (a) 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount)의 상기 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 펩타이드; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
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