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KR101814888B1 - 5-아미노레불린산 고수율 균주 및 이의 제조방법과 응용 - Google Patents

5-아미노레불린산 고수율 균주 및 이의 제조방법과 응용 Download PDF

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KR101814888B1
KR101814888B1 KR1020157024407A KR20157024407A KR101814888B1 KR 101814888 B1 KR101814888 B1 KR 101814888B1 KR 1020157024407 A KR1020157024407 A KR 1020157024407A KR 20157024407 A KR20157024407 A KR 20157024407A KR 101814888 B1 KR101814888 B1 KR 101814888B1
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얀헤 마
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톈진 인스티튜트 오브 인더스트리얼 바이오테크놀로지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스
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Abstract

본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성이고 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하고, 예를 들면 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소이며, 및/또는 상기 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소를 약화시키고, 예를 들면 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 활성이며, 및/또는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 ALA 생성 균주의 구축방법을 공개한다. 본 발명은 상기 방법을 사용하여 구성된 ALA 고수율 균주와 상기 균주를 사용하여 ALA을 제조하는 방법을 더 공개한다.

Description

5-아미노레불린산 고수율 균주 및 이의 제조방법과 응용{5-AMINOLEVULINIC ACID HIGH-YIELD BACTERIAL STRAIN, PREPARATION METHOD AND USES THEREOF}
본 발명은 유전자 공학와 미생물 발료 기술분야에 관한 것이다. 구체적으로 말하면 본 발명은 5-아미노레불린산의 고수율 균주 및 이의 제조방법과 응용에 관한 것이다.
5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA)은 생물체가 헴(heme), 엽록소, 비타민 B12 등의 테트라피롤(tetrapyrrole) 화합물을 합성하는 전구체이고, 테트라피롤 화합물은 시토크롬, 헤모글로빈, 엽록체단백질 등의 주요한 구성부분이고, 생명활동 중에서 중요한 역할을 한다. ALA는 분해가능하고 무독이며 잔류가 없는 등 특징을 구비하므로, 의학, 농업, 축산업, 일용화학품 등 기술분야에서의 전망이 개활하고, 하나의 중요한 고부가가치의 바이오기반의 화학제이다. ALA은 차세대 광역학 약물로서 암 치료, 종양 진단과 피부병의 치료 등에 사용될 수 있고, 식물 성장 조절제로서, ALA는 화훼, 작물, 야채의 성장을 대폭 촉진시킬 수 있고, 작물, 과일, 야채의 품질을 제고시킬 수 있으며, 동물 사료 첨가제로서, ALA은 동물의 신진대사와 면연력을 향상시킬 수 있다. 최근 몇 년간, ALA은 또 화장품 및 보건식품에 사용되는 주요한 첨가성분으로 개발되었고, 관련 제품은 이미 출시되어 판매하고 있다.
하지만, 현재 ALA은 주로 화학적 합성방법으로 제조되고, 이는 반응단계가 많고, 전환율이 낮으며, 생산원가가 높고, 에너지 소모가 많으며, 제조과정에서 유독원료를 사용하고, 환경오염이 엄중하는 것과 가격이 고가행진하는 등 결점이 있다. 현재 중국시장에서, ALA 염산염의 공장원가는 약 1.7~1.9만원/킬로그램이고, 시약급 판매가격은 2000원/그람에 달한다. 제조원가가 고가행진하는 상황하에서, 이는 ALA이 널리 보급되는 것을 제한하는 중요한 요인으로 되었다.
사회와 과학기술의 발전에 따라, 화학적 합성법을 고효율적이고 깨끗한 생물학적 발효법으로 대체하여 ALA를 생성하는 것이 사람들이 연구하는 중점이다. 현재 미생물을 이용하여 ALA를 생성하는 방법은 주요로 2가지가 있다. 첫번째는 광합성 세균에 대하여 돌연변이 육종을 하고 ALA를 많이 생성하는 돌연변이체를 선택하여 특정 배지에서 배양하며, 높은 농도의 ALA를 축적하는 것이다. 하지만 당해 방벙은 발효주기가 길고, 조건의 제어가 복잡하며, 기질과 억제제의 첨가도 생산원가를 증가시킨다. 두번째는 대사공학 기술을 사용하여 미생물의 대사경로를 개조하고, ALA의 합성을 강화시켜 ALA의 과량 축적을 실현하는 것이다. 미생물이 ALA을 합성하는 경로에는 주로 2가지가 있다. 하나는 ALA 합성효소의 작용하에서 숙시닐 CoA와 글리신(Glycine)을 전구체로 하여 ALA를 합성하는 것이고, 이를 C4 경로라고 부르며, 다른 하나는 글루타밀 tRNA(Glutamyl-tRNA)를 전구체로 하고 2단계의 반응을 거쳐 ALA를 합성하며, 이를 C5 경로라고 부른다. Xie 등(Xie L, Hall D, Eiteman MA, Altman E, Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63(3): 267-273)은 로도박터 스페로이드스의 ALA 합성효소를 발현시키는 야생형 대장균MG1655를 사용하여, 발효조건이 최적화된 후, ALA의 생산량은 5.2g/L에 도달하였다. 린??핑 등(CN200710068168.6, CN201210013562.0)은 로도박터 스페로이드스의 ALA 합성효소 유전자를 대장균Rosetta 2(DE3)에서 발현시키고, 발효공법이 최적화된 후, ALA의 생산량은 6.6g/L에 도달하였으며, 진일보로 최적화된 후 15L의 발효탱크에서 생산량이 9.4g/L에 도달하였고, 이는 현재 문헌에서 보도된 최고 생산량이다. 상기의 연구는 모두 비교적 간단한 C4 경로를 선택하였고, 주요로 대장균 중에서 외인성의 ALA 합성효소를 발현시키고, 또 풍부한 LB 배지에 기질인 숙신산과 글리신 및 다운스트림 대사경로의 억제제를 첨가하여 실현하였다. 비록 상기 방법의 ALA의 생산량은 이미 비교적 높은 수준에 도달하였지만 LB 배지의 사용 및 기질과 억제제의 첨가는 발효공법의 제어가 복잡해 질 뿐만아니라, 생산원가의 증가를 초래하여, 대규모 산업 응용을 제한하였다. Shin 등(Shin JA, Kwon YD, Kwon OH, Lee HS, Kim P, J Microbiol Biotechnol, 2007, 17(9): 1579-1584)은 로도박터 스페로이드스의 ALA합성효소를 발현시키는 대장균 중에서 대중균 자신의 NADP 의존형의 말산효소를 공동발현하였고, 이는 혐기성 조건에서, 숙신산을 포함하지 않은 풍부한 배지 중에서 ALA의 생산량을 향상시킬 수 있지만, ALA의 향상수준에 있어서, 이의 전체 생산은 여전히 매우 낮고, 생산수요에 도달하지 못한다. Kang 등(Kang Z, Wang Y, Gu P, Wang Q, Qi Q, Metab Eng, 2011, 13(5): 492-498)은 대장균 중에서 최적화로 개조된 C5 경로 및 ALA 수송단백질의 발현을 사용하여, 5 L의 발효탱크에서 ALA의 생산량은 4.13g/L에 도달하였고, 또한 글루코스(glucose)를 주요 탄소원으로 하는 합성배지를 사용하여 ALA를 발효 생성하는 것을 실현하엿지만, 발효 주기가 길며, 또한 글루코스의 전환율이 비교적 낮아, 0.168g/g(몰비는 약 0.23) 밖게 안된다. 비록 상기 연구들은 ALA합성기질의 세포내 공급에 대하여 일부 시도를 하였지만, 전체적인 효과가 나쁘기 때문에, 현재까지 ALA 합성에 대한 기질 공급은 보편적으로 사용하는 것은 여전히 직접 외인을 첨가하는 방식이고, 특히 현재의 ALA 합성 중에서 제일 흔히 사용하는 C4합성경로에 있어서, C4 경로의 재조합 박테리아를 사용하여 염가의 글루코스를 주요 탄소원으로 하는 배지 중에서 ALA를 발효 생성하는 보도를 아직 보지 못하였다.
상기 내용을 종합해 보면, 본 기술분야에서는 고효율적이고, 원가가 낮으며, 오염이 적은 ALA의 제조방법을 시급히 개발해야 한다.
본 발명은 높은 수준의 5-아미노레불린산 생성 균주를 구축하는 방법 및 이에 상응하게 얻은 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1양태에서, 본 발명은,
5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성이고 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 도입하는 단계; 및/또는
상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조효소 A(succinyl coenzyme a)의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성을 약화시키는 단계를 포함하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법을 제공한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase) 또는 피루브산 카르복시화 효소(pyruvate carboxylase)이고, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소(succinate dehydrogenase)이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키는 것은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 방법, 및/또는 피루브산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 것은 동종 또는 이종 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소의 코딩 유전자를 발현시키는 방법, 및/또는 상기 균주 중의 상기 코딩 유전자의 복사수를 증가시키는 방법, 및/또는 상기 코딩 유전자의 프로모터(Promoter)를 개조하여 전사속도를 강화시키는 방법, 및/또는 상기 코딩 유전자의 메신저 RNA를 휴대한 번역조절 영역을 수정하여 번역강도를 강화시키는 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 약화는 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소가 결실되는 것을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소를 약화시키는 것은, 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 코딩 유전자를 일부 또는 전부 녹아웃(knockout)시키거나, 유전자가 돌연변이되어 불활성화되거나, 유전자의 프로모터 또는 번역조절 영역을 개변시켜 이로 하여금 전사 또는 변역이 약화되거나, 유전자 서열을 개변시켜 이로 하여금 mRNA의 안정성이 약화되거나 효소 구조가 불안정하게 되는 등 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 또는 외인성의5-아미노레불린산의 합성경로를 도입하는 단계를 더 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키는 것은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산 합성효소를 도입하는 것이다.
다른 구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성의5-아미노레불린산 합성효소를 도입하는 단계와, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 활성을 강화시켜 숙시닐 탈수소 효소를 녹아웃시키는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 획득한 균주의 5-아미노레불린산의 생산량을 측정하는 단계를 더 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법으로 획득한 5-아미노레불린산 생성 균주는 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법으로 획득한 5-아미노레불린산 생성 균주는 호기성 조건에서 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성할 수 있다.
다른 구체적인 실시형태에서, 5-아미노레불린산 생성 균주 자체는 5-아미노레불린산 합성능력을 구비한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 단계를 더 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 것은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 유전자를 녹아웃시키는 것을 통하여 실현할 수 잇다.
다른 양태에서, 본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 단계, 또는 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 인입하는 단계를 포함하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성이 강화되거나 또는 외인성이고 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 외인성의 관련 효소를 포함하고, 및/또는
상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성이 약화된 5-아미노레불린산 생성 균주를 제공한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소이고, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
다른 구체적인 실시형태에서, 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로도 강화된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 균주의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성이 강화되거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산 합성효소를 포함한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성이 강화되거나 외인성의5-아미노레불린산 합성효소를 포함하고, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 활성이 강화되거나 외인성의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소를 포함하여 숙신산 탈수소 효소를 녹아웃시킨다.
다른 구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주는 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 (Corynebacterium glutamicum), 로도박터 스페로이드스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 등으로부터 선택된다.
다른 구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성이 약화된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 유전자는 녹아웃된다.
다른 양태에서, 본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성이 약화되고, 또한 상기 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로가 강화되거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 포함하는 5-아미노레불린산 생성 균주를 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 CGMCC No.6588을 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 균주 또는 CGMCC No.6589를 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 균주로부터 선택되는 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주를 제공한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주는 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 생성할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주가 5-아미노레불린산을 생성하는 생산량은 7g/L보다 높다.
다른 바람직한 실시형태에서, 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주가 5-아미노레불린산을 생성하는 글루코스 전환율은 0.35(몰비)보다 높고, 바람직하게는 0.45(몰비)보다 높으며, 제일 바람직하게는 0.5(몰비)보다 높다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주는 외인성 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주는 호기성 조건에서 외인성 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성한다.
제4 양태에서, 본 발명은,
제2 또는 제3 양태의 5-아미노레불린산 생성 균주를 배양하여 5-아미노레불린산을 얻는 단계1); 및
단계1)의 발효배양 시스템으로부터 5-아미노레불린산을 얻는 단계2)를 포함하는 5-아미노레불린산을 생성하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 5-아미노레불린산을 생성하는 방법으로 획득한 5-아미노레불린산의 생산량은 7g/L보다 높다.
다른 바람직한 실시형태에서, 5-아미노레불린산을 생성하는 방법은 숙신산을 별도로 첨가하지 않는 상황하에서도 5-아미노레불린산의 높은 생상량을 실현할 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은,
숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 억제제를 포함하는 배지 중에서 5-아미노레불린산을 생성하는 균주를 배양하여, 5-아미노레불린산을 얻는 단계1); 및
단계1)의 배양 시스템으로부터 5-아미노레불린산을 얻는 단계2)를 포함하는 5-아미노레불린산을 생성하는 방법을 더 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
제6 양태에서, 본 발명은 5-아미노레불린산을 생성하고 및/또는 5-아미노레불린산을 전구체로 하는 다운스트림 산물을 생성하기 위한 본 발명의 제2 또는 제3 양태의 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주의 용도를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 다운스트림 산물은 ALA를 전구체로 하는 헴(heme) 또는 비타민 B12이다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 모든 기술특징은 하기(예를 들면 실시예)에서 구체적으로 설명한 모든 기술특징과 모두 서로 조합할 수 있어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 편폭으로 인해 여기서 일일이 설명하지 않는다.
본 발명은 높은 수준의 5-아미노레불린산 생성 균주를 구축하는 방법 및 이에 상응하게 얻은 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도1은 ALA의 생산량을 향상시킨 본 발명의 기술적 해결수단을 나타내는 모식도이다.
도2는 본 발명이 사용하는 발현벡터의 유전자 지도이다.
도3은 ALA의 생산량을 향상시킨 본 발명의 진일보의 기술적 해결수단을 나타내는 모식도이다.
도4는 pZWA1과 pZWA2의 재조합 벡터를 나타내는 구성 모식도이다.
발명자는 광범위하고 철저한 연구를 거쳐, 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키면 상기 생성 균주의 5-아미노레불린산의 생산량을 대폭 향상시킬 수 있는 것을 예기치 않게 발견하였고, 발명자는 상기 생성 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소를 약화시켜도 획득한 생성 균주의 5-아미노레불린산의 생산량을 향상시킬 수 있는 것을 더 발견하였으며, 진일보로, 발명자는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제와 말산효소의 활성을 약화시키면 5-아미노레불린산의 생산량을 현저히 향상시키는 것을 발견하였고, 상기 수단 중의 어느 2가지 또는 3가지를 결합시키면 생성 균주의 5-아미노레불린산의 생산량을 진일보로 향상시킨다. 이런 기초상에서 본 발명을 와성하였다.
용어정의
본문에서 사용하는 용어 ‘외인성’은 어떤 체계 중에 원래 존재하지 않은 물질을 포함한 것을 가르킨다. 예를 들면, 전환 등 방식을 통하여 어떤 균주 중에 상기 균주에 원래 존재하지 않는 효소의 코딩 유전자를 인입하여, 상기 균주 중에서 상기 효소를 발현시키면, 상기 효소는 상기 균주에 대하여 ‘외인성’인 것이다.
본문에서 사용하는 용어 ‘강화’는 증가, 향상, 증대 또는 어떤 종류의 단백질을 상승시키는 것을 가르킨다. 예를 들면 효소의 활성이다. 본 발명의 지도와 선행기술을 감안하면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본문에서 사용하는 ‘강화’는 응당 효소의 이종성의 코딩 유전자를 발현하는 것을 통하여 이의 활성을 강화시키는 것을 포함하는 것을 쉽게 이해할 것이다. 구체적인 실시형태에서, 효소의 활성을 강화시키는 것은 효소의 내인성 또는 이종성의 코딩 유전자를 발현시키고, 및/또는 상기 코딩 유전자의 복사수를 증가시키며, 및/또는 상기 코딩 유전자의 프로모터를 개조하여 전사속도를 강화시키고, 및/또는 상기 코딩 유전자의 메신저RNA를 휴대한 번역조절 영역을 수정하여 번역강도를 강화시키며, 및/또는 코딩 유전자 자체를 수정하여 mRNA의 안정성, 단백질 안정성, 단백질을 해제하는 피드백 저해를 강화시키는 등 방법을 통하여 실현할 수 있다.
유사하게, 본문에서 사용하는 용어 ‘약화’는 저하, 위축, 감소 또는 어떤 종류의 단백질을 완전히 소멸하는 것을 가르킨다. 예를 들면 효소의 활성이다. 구체적인 실시형태에서, 효소의 활성을 약화시키는 것은 효소의 코딩 유전자를 일부 또는 전부 녹아웃(knockout)시키거나, 유전자가 돌연변이되어 전부 또는 일부가 불활성화되거나, 유전자의 프로모터 또는 번역조절 영역을 개변시켜 이로 하여금 전사 또는 변역이 약화되거나, 유전자 서열을 개변시켜 이로 하여금 mRNA의 안정성이 약화되거나 효소 구조가 불안정하게 되는 등 방법을 통하여 실현할 수 있다.
본문에서 사용하는 용어 ‘옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소’는 옥살로아세테이트의 합성과 관련된 것이지만, 옥살로아세테이트의 합성에 대하여 촉진, 향상, 증가 등 긍정적인 역할을 하는 효소를 가르킨다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소(ppc) 도는 피루브산 카르복시화 효소(pyc)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이 밖에, 본 발명의 지도와 선행기술을 감안하면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 효소가 균주 중에서 옥살로아세테이트의 합성량을 촉진, 향상, 증가시킬 수만 있으면 본 발명은 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 다양한 유래의 관련 효소를 사용할 수 있는 것을 쉽게 이해할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 사용하는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소는 대장균에서 유래된 것이고, 피루브산 카르복시화 효소는 근류균에서 유래된 것이다.
본문에서 사용하는 용어 ‘숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소’는 숙시닐 보조 효소 A를 기질로 사용하여 기타 물질을 합성하여, 숙시닐 보조 효소 A의 효소를 소모하는 것을 가르킨다. 구체적인 실시형태에서, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본문에서 사용하는 용어 ‘5-아미노레불린산의 합성경로’는 미생물 중에서 5-아미노레불린산을 생성하는 구체적인 경로를 가르키고, 그 중에는 다양한 효소를 포함하고, 예를 들면 5-아미노레불린산 합성효소, 글루타밀-tRNA 합성효소, 글루타밀-tRNA 환원효소 또는 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노기전이효소(Glutamate-1-semialdehyde aminotransferase) 등등이다. 유사하게, 본문에서 사용하는 용어 ‘5-아미노레불린산의 합성경로가 강화됨’은 5-아미노레불린산의 합성경로의 관련 효소에 관한 것이고, 예를 들면 5-아미노레불린산 합성효소, 글루타밀-tRNA합성효소, 글루타밀-tRNA환원효소 또는 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노기전이효소의 활성이 강화되는 것을 가르킨다. 바람직한 실시형태에서, 상기 효소는 로도슈도모나스 팔루스트리스의 5-아미노레불린산 합성효소에서 유래된 것이다.
본 발명의 5-아미노레불린산 생성 균주
본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성이 강화되거나 외인성의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하고, 및/또는 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성이 감소된 5-아미노레불린산 생성 균주를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
기타 실시형태에서, 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로도 강화되거나 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 포함한다. 따라서, 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로가 강화되거나 5-아미노레불린산의 합성경로를 포함하고, 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성이 강화되거나 또는 외인성의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하며, 및/또는 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성이 약화된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 균주 중의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성이 강화되거나 또는 외인성의5-아미노레불린산 합성효소를 포함하고, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 활성이 강화되거나 외인성의 피루브산 카르복시화 효소를 포함하여 숙신산 탈수소 효소를 녹아웃시킨다.
다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성이 약화된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 유전자가 녹아웃된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 많은 균주가 5-아미노레불린산을 생성할 수 있는 것을 알고 있다. 이러한 균주는 비록 상이하지만, 이들이 5-아미노레불린산을 합성하는 합성 시스템, 합성 경로는 유사하다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 지도와 선행기술을 감안하면 본 발명의 균주는 5-아미노레불린산을 생성하기 위한 어떠한 균주도 될 수 있고, 상기 균주는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(Corynebacterium glutamicum), 로도박터 스페로이드스(Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 CGMCC No.6588을 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 대장균 균주를 제공한다. 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 CGMCC No.6589를 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 대장균 균주이다.
본 발명의 균주는 전구체인 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 생성할 수 있고, 5-아미노레불린산의 생산량은 7g/L보다 높다. 이 밖에, 본 발명의 균주를 사용하여 5-아미노레불린산을 생산하는 글루코스 전환율은 0.35(몰비)보다 높고, 바람직하게는 0.45(몰비)보다 높으며, 제일 바람직하게는 0.5(몰비)보다 높다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 균주는 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 균주는 호기성 조건에서 5-아미노레불린산을 생성할 수 있어, 종래 기술수준의 발효탱크 등 설비에 대하여 개조하지 않아도 되므로, 산업화 수준에서의 확대에 이롭다.
따라서, 본 발명의 균주는 더 낮은 원가로 편리하게 5-아미노레불린산을 제조할 수 있다.
본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 균주는 5-아미노레불린산을 생성할 수 있을 뿐만아니라, 5-아미노레불린산을 전구체로 하는 다양한 다운스트림 산물도 생성할 수 있는 것을 응당 알아야 한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 다운스트림 산물은 ALA를 전구체로 하는 헴 또는 비타민 B12이다.
본 발명은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 외인성의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하고, 및/또는 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소를 약화시키는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법을 더 공개한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소이고, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키는 것은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 방법, 및/또는 피루브산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
진일보로 바람직한 실시형태에서, 상기 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소의 활성을 강화시키는 것은 이종 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소의 코딩 유전자를 발현시키는 방법, 및/또는 상기 균주 중의 상기 코딩 유전자의 복사수를 증가시키는 방법, 및/또는 상기 코딩 유전자의 프로모터를 개조하여 전사속도를 강화시키는 방법, 및/또는 상기 코딩 유전자의 메신저 RNA를 휴대한 번역조절 영역을 수정하여 번역강도를 강화시키는 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약화는 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소가 결실되는 것을 포함한다. 진일보로 바람직한 실시형태에서, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소를 약화시키는 것은, 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 코딩 유전자를 일부 또는 전부 녹아웃시키거나, 유전자가 돌연변이되어 전부 또는 부분적으로 불활성화되거나, 유전자의 프로모터 또는 번역조절 영역을 개변시켜 이로 하여금 전사 또는 변역이 약화되거나, 유전자 서열을 개변시켜 이로 하여금 mRNA의 안정성이 약화되거나 효소 구조가 불안정하게 되는 등 방법 중의 하나 또는 조합을 통하여 실현할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 도입하는 것을 더 포함한다. 따라서, 구체적인 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 인입하는 것과, 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 외인성의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하는 것과, 및/또는 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성을 약화시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산 합성효소의 활성을 강화시키거나 외인성의 5-아미노레불린산 합성효소를 도입하는 것과, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소를 강화시켜 숙시닐 탈수소 효소를 녹아웃시키는 것을 포함한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 것을 더 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 약화시키는 것은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 유전자를 녹아웃시키는 것을 통하여 실현할 수 있다.
진일보로 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법은 획득한 균주의 5-아미노레불린산의 생산량을 측정하는 것을 더 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법으로 획득한 5-아미노레불린산 생성 균주는 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 5-아미노레불린산을 높은 수준으로 생성할 수 있다.
본 발명의 지도와 선행기술을 감안하면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명은 출발균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 도입하는 것과, 및/또는 상기 출발균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성을 약화시키는 것과, 및/또는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 및/또는 말산효소의 활성을 감소시키는 것을 통하여 상기 균주가 5-아미노레불린산을 생성하는 능력을 향상시키는 것을 응당 더 알아야 한다. 따라서, 상기 수단 또는 이들 중의 임임의 2가지 또는 3가지의 조합을 통하여 균주를 구축 또는 개조시켜, 5-아미노레불린산의 생산량을 향상시키는 방법 또는 이로부터 얻은 균주는 모두 응당 본 발명의 권리범위 내에 속하고, 본 발명의 권리범위는 실시예에서 사용한 구체적인 실시형태와 획득한 균주에 한정되지 않는다.
본 발명의 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법 및 획득한 균주의 기초상에서, 본 발명은 본 발명의 균주를 배양하여 5-아미노레불린산을 얻는 단계1); 및 단계1)의 발효배양 시스템으로부터 5-아미노레불린산을 얻는 단계2)를 포함하는 5-아미노레불린산을 생성하는 방법을 진일보로 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산을 생성하는 방법으로 획득한 5-아미노레불린산의 생산량은 7g/L보다 높다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 5-아미노레불린산을 생성하는 방법은 숙신산을 별도로 추가하지 않고 단지 글루코스를 탄소원으로 사용한다.
본 발명의 제시와 지도를 감안하면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 5-아미노레불린산의 생성 균주의 배양 시스템에 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 억제제를 첨가하여도 5-아미노레불린산의 생산량을 향상시키는 것을 더 알 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소이다.
본 발명의 이점
1. 본 발명의 균주는 당분의 전환율을 향상시켜, ALA 합성의 필수 기질 중의 숙시닐 보조 효소 A의 합성을 증가하여, ALA의 생산량을 향상시켰다.
2. 본 발명의 균주를 사용하여 ALA를 제조할 경우 전구체인 외인성의 숙신산을 첨가하지 않아도 되므로, 생산과정이 기질인 숙신산의 첨가에 대한 의존과 LB와 같은 비싼 배지의 사용으로부터 벗어나게 되어, 생산원가가 크게 감소되었다.
이하 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 진일보로 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 한정하기 위함은 아니다. 다음의 실시예에서 구체적인 조건을 밝히지 않은 실험방법은 일반적으로 Sambrook 등, 분자클론:실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 언급된 조건과 같은 통상적인 조건에 따르거나 제조사에서 건의한 조건에 따라 실행한 것이다.
재료와 방법
본 발명의 실시예에서 사용한 DNA 폴리메라아제(polymerase)는 북경 TransGen 회사에서 구매한 Fastpfu이고, 제한성 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 DNA 연결 효소 등은 모두 Fermentas 회사에서 구매한 것이며,
효모분말과 펩톤(peptone)은 영국 Oxoid의 제품을 구매하였고, 글리신과 IPTG는 Promega 회사에서 구매하였으며, 5-ALA와 p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-dimethylaminobenzaldehyde) 등은 Sigma 회사에서 구매하였고, 한천가루와 항생소는 북경solarbio 회사에서 구매하였으며, 글루코스, 빙초산, 과염소산, 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid), 아세틸아세톤(acetylacetone), 클로로포름(Chloroform) 및 기타 흔히 사용하는 시약은 모두 중국에서 구매하였다.
플라스미드 추출 키트와 아가로오스겔 전기영동 추출 키트는 모두 상해 sangon에서 구매하였고, 관련 조작은 모두 엄격하게 설명서를 따라 실행하였으며,
플라스미드 구성의 염기 서열측정 검증은 BGI회사에서 완성하였고,
DH5α 수용성 세포는 북경 TransGen에서 구매하였다.
LB 배지 성분에는5g/L의 효모분말, 10g/L의 펩톤, 10g/L의 NaCl, 고체 배지에 첨가한 2%의 한천가루를 포함한다.
항생소 농도는 100 μg/mL의 암피실린(ampicillin), 30 μg/mL의 카나마이신(kanamycin)이다.
ALA의 검측방법에 있어서, 200μL의 회석된 발효액에 100μL의 pH 4.6인 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충액을 첨가한 다음, 5μL의 아세틸아세톤를 첨가하고, 100℃의 배스(bath)로 15min 항온 배양시키며, 실온까지 냉각시킨 후 등체적의 Ehrlish’s 시약(42mL의 빙초산, 8mL의 70%인 과염소산, 1g의 디메틸아미노벤즈알데히드(dimethylaminobenzaldehyde))을 첨가하여 균일하게 혼합시키며, 발색 10min 후 553nm 파장에서의 흡광도를 측정한다.
글루코스 분석방법은 중국 산동과학기술원에서 생산한 SBA-40D 바이오센서 분석기로 측정한다.
실시예1. 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 결실돌연변이체와 숙신산 탈수소 효소 결실돌연변이체의 구축
대장균 유전자의 녹아웃은 전형적인 Red 재조합 방법을 사용하고, 관련 문헌을 참조하여 실행하였으며, 구체적인 조작은 다음과 같다. 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소의 구조 유전자인 sucCD 유전자의 녹아웃에 있어서, 우선 NCBI에서 공포한 대장균 MG1655의 게놈(genome) 서열 및 보조 벡터 pKD13의 서열에 따라 프라이머(primer) sucCD-1과 sucCD-2를 설계하고(구체적인 서열은 프라이머 서열표를 참조바람), pKD13을 템플릿으로 하여 증폭시켜 sucCD 유전자의 업스트림, 다운스트림 상동 암의 Kan 내성 유전자 세그먼트를 얻는다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min동안이고, 94℃에서 20s, 64℃에서 20s, 72℃에서 1min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. PCR 산물이 겔 추출된 후 MG1655/pKD46의 균주를 전기충격으로 형질전환시키고, 수용성 세포의 제조와 전환과정은 J. Sambrook 등이 편집한 〈분자 클론실험 지침서〉를 참고하였다. 형질전환체는 sucCD-3과 sucCD-4 프라이머를 사용하여 PCR 검증을 실행하였고, 야생형 균주 세그먼트의 크는 2267bp이며, sucCD 유전자가 결실된 균주 중의 타겟밴드(target band)의 크기는 1558bp이고, 밴드 크기에 따라 sucCD 결실돌연변이체를 선택하여 ZPEcA1으로 명명한다.
sdhAB의 녹아웃에 있어서, 우선 NCBI에서 공포한 대장균 MG1655의 게놈서열 및 보조 벡터pKD13에 따라 프라이머 sdhAB-1과 sdhAB-2를 설계하고, pKD13을 템플릿으로 하여 증폭시켜 sdhAB 유전자의 업스트림, 다운스트림 상동 암의 Kan 내성 유전자 세그먼트를 얻는다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min동안이고, 94℃에서 20s, 64℃에서 20s, 72℃에서 1min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. PCR 산물이 겔 추출된 후 MG1655/pKD46의 균주를 전기충격 형질전환시키고, 수용성 세포의 제조와 전환과정은 J. Sambrook 등이 편집한 〈분자 클론실험 지침서〉를 참고하였다. 형질전환체는 sdhAB-3과 sdhAB-4 프라이머를 사용하여 PCR 검증을 실행하였고, 야생형 균주 세그먼트의 크기는 2553bp이며, sucCD 유전자가 결실된 균주 중의 타겟밴드의 크기는 1408bp이고, 밴드 크기에 따라 sdhAB 결실돌연변이체를 선택하여 ZPEcA2으로 명명한다.
실시예2. 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 ppc와 ALA 합성효소의 공동발현 플라스미드의 구축
NCBI에서 공포한 대장균 MG1655의 게놈 서열에 따라 프라이머ppc-F와 ppc-R를 설계하고, 대장균 MG1655 게놈을 템플릿으로 하여 PCR 증폭시켜 자신의 프로모터를 휴대한 ppc 유전자 세그먼트를 얻는다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min동안이고, 94℃에서 20s, 60℃에서 20s, 72℃에서 1.5min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. ppc 유전자 세그먼트가 추출된 후 HindIII으로 처리하는 동시에, ALA 합성효소를 휴대한 플라스미드 pZGA24(pZGA24 구축은 하기와 같은 참고문헌을 참조바람, 꿔쇼페이 등, 5-아미노레불린산 탈수효소 결실의 재조합 대장균을 사용하여 5-아미노레불린산을 합성, 천진기술대학학보, 2012, 27(4):1-6)도 상기 효소로 처리하고, 벡터 와 세그먼트가 추출된 후 T4 연결효소로 연결시키며, DH5α 수용성 세포를 전환시키고, Amp를 포함하는 LB 플레이트를 도포하며, 양성 클론을 골라 플라스미드를 추출하여 효소 절단 검증을 실행하고, 서열측정이 정확한 재조합 플라스미드를 pZPA6으로 명명한다.
실시예3. 피루브산 카르복시화 효소 pyc와 ALA 합성효소가 공동발현된 플라스미드의 구축
BioBrick 중의 프로모터 BBa_J23105의 서열과 NCBi에서 공포한 근류균 CFN42의 게놈서열에 따라 프라이머 pyc-1와 pyc-2를 설계하고, 근류균 CFN42의 게놈을 템플릿으로 하여 PCR 증폭시켜 구성성 프로모터(constitutive promoter) 서열을 휴대한 pyc 유전자 세그먼트를 얻는다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min이고, 94℃에서 20s, 60℃에서 20s, 72℃에서 2min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. 타겟 세그먼트가 추출된 후 포스포릴라아제(phosphorylase)로 처리하고 동시에, pWSK29 벡터를 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) PvuII로 처리한 후 다시 탈인산화 효소로 처리하고, 획득한 벡터 세그먼트와 인산화된 pyc 유전자 세그먼트를 T4 연결효소로 연결시키며, DH5α 수용성 세포를 전환시키고, Amp를 포함하는 LB 플레이트를 도포하며, 양성 클론을 골라 플라스미드를 추출하여 효소 절단 검증을 실행하고, 서열측정이 정확한 재조합 플라스미드를 pSLS33으로 명명한다.
상기 pSLS33의 서열에 따라 프라이머 pyc-F와 pyc-R를 설계하고(구체적인 서열은 프라이머 서열표를 참조바람), pSLS33을 템플릿으로 하여 증폭시켜 구성성 프로모터를 포함하는 pyc 유전자 세그먼트를 얻는다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min동안이고, 94℃에서 20s, 60℃에서 20s, 72℃에서 2min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. 동시에 pZGA24 벡터 서열에 따라 프라이머 pA-1와 pA-2를 설계하고, pZGA24를 템플릿으로 하여 ALA 합성효소 유전자를 포함하는 pTrc-hemA 벡터를 역 PCR 증폭시키며, PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 2min동안이고, 94℃에서 20s이고, 60℃에서 20s, 72℃에서 3min동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min동안 연장시킨다. Pyc 유전자 세그먼트가 추출된 후 엔도뉴클레아제(endonuclease) SmaI로 소화 처리하고, 또 T4 연결효소로 역 증폭되고 정제된 pZGA24 벡터로 연결시키며, 연결산물이 DH5α 수용성 세포를 전환시키고, Amp를 포함하는 LB 플레이트를 도포하며, 양성 클론을 골라 플라스미드를 추출하여 효소 절단 검증을 실행하고, 서열측정이 정확한 재조합 플라스미드를 pZPA7로 명명한다.
Figure 112015086888312-pct00001
주의: 이탤릭 볼드체 부분은 동종 암 서열이고, 밑줄 부분은 효소 절단 위치임
실시예4. 재조합 균주의 구축 및 ALA의 생산량의 비교
상기 구성된 재조합 플라스미드pZGA24, pZPA6과 pZPA7을 야생형 대장균 MG1655 및 sucCD결실돌연변이체ZPEcA1와 sdhAB 결실돌연변이체 ZPEcA2으로 각각 전환시키고, Amp내성 LB 플레이트를 도포하며, 하룻밤 배양시킨 후 양성 클론을 골라 플라스미드를 추출하여 검증하고, 재조합 균주 MG1655/pZGA24, ZPEcA1/pZGA24, ZPEcA2/pZGA24, MG1655/pZPA6, ZPEcA1/pZPA6, ZPEcA2/pZPA6, MG1655/pZPA7, ZPEcA1/pZPA7과 ZPEcA2/pZPA7을 각각 얻는다.
상기 재조합 박테리아의 단집락을 100 μg/mL의 암피실린을 함유한 5mL의 LB 용액의 배지에 각각 접종시켜, 37℃에서, 220rpm으로 12 h 배양시킨다. 초기 OD가 0.05로 50mL의 발효배지를 전송 포함한 250mL의 에를렌마이어 플라스크에 따라, 37℃에서 220rpm으로 2.5h 배양시킨 후, 최종 농도가 25μM의 IPTG를 첨가하고, 19h 유도 배양시킨 후 발효액을 수집하며, ALA의 농도를 측정한다. 여기서 발효배지는 소량의 효모분말을 첨가한 M9배지이고, 주요 성분은12.8g/L의 Na2HPO4·12H2O, 3.0g/L의 KH2PO4, 0.5g/L의 NaCl, 1.0g/L의 NH4Cl, 2mM 의 MgSO4, 0.1mM 의 CaCl2, 10g/L의 글루코스, 2g/L의 효모분말, 4g/L의 글리신이고, 암피실린의 농도는 100μg/mL이다. ALA의 측정과 글루코스의 분석방법은 ‘재료와 방법’부분에 설명한 것과 같다.
매개 재조합 박테리아의 ALA의 생산량 결과는 표2에 도시된 바와 같고, 대조 균주 MG1655/pZGA24에서 ALA의 생산량은 단지 1.06g/L이며, sucCD 또는 sdhAB가 결실된 ZPEcA1/pZGA24와 ZPEcA2/pZGA24 균주에서 ALA의 생산량은 각각 1.33g/L와 1.45g/L이고, 초기 균주보다 각각 25%와 37%을 향상시켜, 대장균 중의 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 활성이 일부 또는 전부 결실되면 ALA의 생산량을 향상시킬 수 있다는 것을 표시한다. ppc를 발현한 MG1655/pZPA6 균주와 pyc를 발현한 MG1655/pZPA7 균주에서 ALA의 생산량은 각각 2.52g/L와 2g/L에 도달하고, 각각 초기 균주의 2.38배와 1.89배이므로, 결과는 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 강화시키면 ALA의 생산량을 현저히 제고시키는 것을 표시한다. 하지만 sucCD 또는 sdhAB가 결실 ,또는 ppc 또는 pyc가 과량으로 표현된 ZPEcA1/pZPA6, ZPEcA2/pZPA6, ZPEcA1/pZPA7과 ZPEcA2/pZPA7 균주에서 ALA의 생산량은 각각 2.43g/L, 3.08g/L, 2.12g/L와 2.66g/L에 도달하였고, 모두 대응되는 대조 균주보다 높아, sucCD 또는 sdhAB의 결실과 ppc 또는 pyc의 과량 발현은 일정한 시너지 효과가 있으며, ALA의 생물 합성을 촉진시킬 수 있는 것을 표시한다. 여기서, sdhAB의 결실 또는 ppc를 발현한 ZPEcA2/pZPA6균주에서 ALA의 생산량은 제일 높고, 대조 균주 MG1655/pZGA24의 2.91배이며, 글루코스 전환율도 최고인 0.47(몰비)에 도달 하였으며, 초기 균주의 2.57배이다. 그러나 본 발명의 균주를 사용하여 발효탱크에서 발효할 경우, ALA의 생산량은 7g/L 이상에 도달할 수 있어, 중국 국내의 비교적 높은 수준에 도달하였다. 상기 실험결과는 대장균에서 외인성 ALA 합성효소를 발효시킨 기초상에서, 한편으로 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 활성을 일부 또는 전부 결실시키고, 한편으로 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 발현을 강화시키면 ALA의 생산량을 크게 향상시킨다는 것을 표시한다.
상기 재조합 균주 MG1655/pZPA6과 ZPEcA2/pZPA6 균주는 2012년 9월 18일에 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터(북경시 조양구 베이천 서쪽로 1호원 3호)에 이미 수탁되었고, 수탁번호는 각각 CGMCC No.6588과 CGMCC No.6589이다.
Figure 112015086888312-pct00002
실시예5. BW25113 균주에서 중복 측정
재조합 균주의 구축에 있어서, 상기 플라스미드pZGA24, pZPA6과 pZPA7을 대장균 BW25113(대조 균주 BW25113으로서 CGSC (미국 예일대학 대장균 수탁센터)에서 유래됨) 및 상응한 sucC 결실 돌연변이체 JW0717 (숙시닐 보조 효소 A의 합성효소β서브 유닛(sucC)이 결실된 JW0717 균주와 sdhA결실 돌연변이체JW0713 (JW0717와 JW0713은 모두 Keio Collection 대장균 단일 유전자 결실 균주뱅크에서 유래됨, National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1111 Yata, Mishima, Shizuoka, 411-8540 Japan)으로 전환시키고, Amp 내성 LB 플레이트를 도포하며, 하룻밤 배양시킨 후 양성 클론을 골라 플라스미드를 추출하여 검증하고, 재조합 균주BW25113/pZGA24, JW0717/pZGA24, JW0713/pZGA24, BW25113/pZPA6, JW0717/pZPA6, JW0713/pZPA6, BW25113/pZPA7, JW0717/pZPA7과 JW0713/pZPA7을 각각 얻는다.
매개 재조합 박테리아의 진탕플라스크 발효 및 ALA과 글루코스 측정방법은 상기와 같고, 표3의 결과를 참조하면, 표로 알수 있는 바, 매개 재조합 박테리아와 상응한 MG1655재조합 박테리아의 생산량 및 변화는 기본적으로 일치하며, 생산량이 제일 높은 것은 sdhA가 결실되고 또한 ppc가 발현된 JW0713/pZPA7균주이고, ALA의 생산량은 3.21g/L에 도달하며, 글루코스 전환율은 0.56(몰비)까지 도달하여, 본 발명이 제공한 방법은 대장균 기타 균주에도 적용되는 것을 표시한다.
Figure 112015086888312-pct00003
실험결과로부터 알 수 있는 바, 본 발명이 제공한 방법을 사용하면, 글루코스를 주요 탄소원으로 하는 배지에서 진탕플라스크 발효하는 과정에서, 재조합 박테리아에서 ALA의 생산량은 3.08g/L에 도달하고, 단일 균체 ALA의 생산량은 0.76g/L/OD에 도달하며, 각각 초기 균주의 2.91배와 2.59배이고, 글루코스의 전환율은 0.47(mol/mol)에 도달하며, 초기 균주의 2.57배이다. 본 발명이 제공한 방법을 사용하여 구성한 재조합 박테리아 및 이를 사용하여 ALA를 생성하는 방법은 숙신산의 첨가에 대한 의존과 비싼 LB 배지의 사용으로부터 벗어나게 되어, 우수한 산업적 적용 전망과 경제적 가치를 구비한다.
실시예6. 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제와 말산효소의 활성이 강화딘 재조합 균주의 구축 및 ALA의 생산량의 비교
발명자는 실시예1~실시예5에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제(코딩 유전자pck)와 말산효소(코딩 유전자 maeB)의 활성이 강화된 재조합 균주를 구성하였고 또 이들의 ALA의 생산량을 측정하였다.
우선, 실시예2와 유사한 방법을 사용하였고, 하기 표4에 도시된 프라이머를 사용하여 대장균 MG1655의 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 코딩 유전자pck를 클론시키고, 또한 pZGA24 벡터 위에 연결시켜, 획득한 재조합 플라스미드를 pZPA12으로 명명한다.
다음, NCBI에서 공포한 대장균MG1655의 게놈서열에 따라 하기 표4에 도시된 프라이머 maeB-F와 maeB-R를 설계하고, 대장균 MG1655 게놈을 템플릿으로 하여, PCR 증폭시켜 말산 탈수소 효소의 코딩 유전자maeB를 얻는다. 타겟 세그먼트는 T4폴리뉴클레오티드 인산화 효소(polynucleotide kinase)를 사용하여 인산화 처리를 시킨 후 상기 역증폭시켜 얻은 pZGA24벡터 세그먼트와 연결시킨다. 전환을 거쳐, 효소 절단 및 서열 검증이 정확한 재조합 벡터를 pZPA14으로 명명한다.
Figure 112015086888312-pct00004
주의: 밑줄 부분은 효소 절단 위치임
실시예4와 유사한 방법을 사용하여, 상기 구성된 재조합 플라스미드 pZPA12와 pZPA14를 야생형 대장균 MG1655로 전환시켜, 재조합 균주 MG1655/pZPA12와 MG1655/pZPA14를 얻는다. 다음 실시예4와 유사한 방법을 사용하여, 매개 재조합 박테리아의 ALA의 생산량을 측정하고, 결과는 하기의 표6을 참조바란다.
Figure 112015086888312-pct00005
상기 표로부터 알 수 있는바, PCK와 MaeB를 발현한 설계 균주 MG1655/pZPA12와 MG1655/pZPA14의 ALA의 생산량은 대조 균주MG1655/pZGA24보다 각각 46%와 17% 감소되었다. 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제 pck의 활성이 강화되었지만 균주의 ALA의 생산량을 향상시키는 기술적 효과를 발생시키지 않았다.
실시예7. pck 또는 maeB 유전자를 녹아웃시키는 것이 ALA의 생산량에 대한 영향
실시예9의 결과를 기반으로, 본 발명자는 pck 또는 maeB의 유전자 결실이 ALA 합성에 대한 영향을 진일보로 연구하였다.
ALAS와 PPC의 공동 발현 벡터 pZPA6을 Kelio Collection(National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1111 Yata, Mishima, Shizuoka, 411-8540 Japan)의 단일 유전자 결실에서 유래한 균주JW3366(pck 유전지 결실 균주)과 JW2447(maeB 유전자 결실 균주)에 각각 도입시켜, 검증을 거쳐 정확한 설계 균주 JW3366/pZPA6과 JW2447/pZPA6을 얻는다. 실시예5에서 획득한 BW25113/pZPA6을 대조로 하여, 15g/L의 글루코스와 4g/L의 글리신을 초기 첨가한 발효 배지에서 발효시켜 상기 재조합 균주가 ALA을 생산하는 능력을 검증한다. 발효과정에서 12 h 발효시킨 후 5g/L의 글루코스와 2g/L의 글리신을 추가 첨가한다. 발효 결과는 하기의 표7에 도시된 바와 같이, 25 h 발효시킨 후 JW3366/pZPA6의 ALA의 생산량은 4.84g/L에 도달하였고 동시에, 글루코스 전환율은 0.51mol/mol에 도달하였으며, 대조 균주 BW25113/pZPA6보다 각각 29%와 20.8%가 향상되었고, JW2447/pZPA6의 ALA의 생산량은 약간 하락하였지만, 전활율은 7.8%가 향상되엇다.
상기 결과는 pck 또는 maeB 유전자의 결실은 ALA의 축적에 유리하고, 특히 pck 유전자를 녹아웃시키는 것은 ALA의 축적과 글루코스 전환율의 향상에 유리하다는 것을 표시한다.
Figure 112015086888312-pct00006
실시예8. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 발현 벡터의 구성 및 발효 검증
NCBI에서 공포한 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) ATCC 17001의 ALA 합성효소의 코딩 유전자의 서열(GenBank: JQ048720.1)에 따라, 프라이머 hemA-F(프라이머 서열: GGCGAATTCAAGGAGATATAGATATGAATTACGAAGCCTATTTCCGCCGT; SEQ ID NO: 21)와 hemA-R(프라이머 서열: TATACCCCGGGTCAGGCCGCCTTGGCGAGAC; SEQ ID NO: 22)를 설계한다. pZGA24 벡터(pZGA24의 구성은 다음과 같은 참고문헌을 참조바람, 꿔쑈페이 등, 천진과학기술대학 학보, 2012, 27(4)：1-6)를 템플릿으로 하여 PCR 증폭을 거쳐 타겟 유전자 hemA를 얻고, PCR 증폭 시스템은 하기와 같다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 10min이고, 94℃에서 20s, 65℃에서 30s, 72℃에서 40s동안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min으로 연장시킨다. 타겟 세그먼트는 EcoRI와 SmaI로 이중 효소 절단처리시킨 다음, DNA 연결 효소의 작용하에서 획득한 세그먼트와 동일하게 효소 절단 처리된 플라스미드 pEC-XK99E를 연결시키고, 또한 연결 산물을 DH5α 수용성 세포에 전환시키며, 카나마이신 내성 플레이트를 도포하여 하룻밤 배양시키고, 양성 클론을 골라 세균 집락 PCR 검증을 실행시키며, 검증이 정확한 형질전환체는 서열측정 검증을 실행시켜, 정확한 재조합 벡터를 pZWA1(도4)로 명명한다.
다음, NCBI에서 공포한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소의 코딩 유전자 ppc의 서열(GenBank: BA000036.3)에 따라, 프라이머 Cg-ppc-F (ATACCCCGGGAAGGAGATATAGATATGACTGATTTTTTACGCGATGAC; SEQ ID NO: 23)와 Cg-ppc-R(GCTCTAGACTAGCCGGAGTTGCGCAGCGCAGT; SEQ ID NO: 24)를 설계한다. ATCC 13032 게놈을 템플릿으로 하여 PCR 증폭을 거쳐 타겟 유전자를 얻고, PCR 증폭 시스템은 다음과 같다. PCR 증폭 파라미터는 94℃에서 10min이고, 94℃에서 20s, 65℃에서 30s, 72℃ 에서 2min도안 30번 순환시키며, 72℃에서 5min으로 연장시킨다. 타겟 세그먼트는 SmaI와 XbaI로 이중 효소 절단처리시킨 다음, DNA 연결 효소의 작용하에서 획득한 세그먼트와 동일하게 효소 절단 처리된 pZWA1 벡터를 연결시키고, 또한 연결 산물을 DH5α 수용성 세포에 전환시키며, 카나마이신 내성 플레이트를 도포하여 하룻밤 배양시키고, 양성 클론을 골라 세균 집락 PCR 검증을 실생시키며, 검증이 정확한 형질전환체는 서열측정 검증을 실행시켜, 정확한 재조합 벡터를 pZWA2(도4)로 명명한다.
상기 재조합 벡터 pZWA1과 pZWA2 및 대조 공벡터 pEC-XK99E를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032로 전환시켜, 재조합 균주ATCC13032/pEC-XK99E, ATCC13032/ pZWA1과 ATCC13032/pZWA2를 얻는다.
상기 재조합 박테리아의 단집락을 25μg/mL의 카나마이신과 24g/L의 글루코스를 포함한 10mL의 LB 용액 배지에 각각 접종시켜, 30℃에서 200rpm으로 12h 배양시킨다. 초기 OD가 0.3로 50mL의 발효배지를 전송 포함한 500mL의 에를렌마이어 플라스크에 따라, 30℃에서 200rpm으로 3h 배양시킨 후 최종 농도가 100μM의 IPTG를 첨가하고, 32h 유도 배양시킨 후 발효액을 수집하며, ALA의 농도를 측정한다. 여기서 진탕플라스크 발효배지의 배합방법은 50g/L의 Glu, 10g/L의 (NH4)2SO4, 1g/L의 MnSO4, 1.5g/L의 K2HPO4, 0.6g/L의 MgSO4, 1g/L의 옥수수 침지액, 4g/L의 글리신, 31.395g/L의 MOPS이고, pH를 7.0로 조정한다. 카나마이신최종 농도는 25μg/mL이다. ALA의 검측과 글루코스의 분석방법은 ‘재료와 방법’부분에서 설명한 것과 같다.
표8의 진탕플라스크 발효 결과를 참조하면, 외인성 ALA 합성효소를 단독으로 발현한 ATCC13032/pZWA1 균주에서 ALA의 생산량은 1.31g/L이고, 글루코스 몰비 전환율은 0.052이다. 균주 ATCC13032/pZWA2에서 ALA의 생산량과 글루코스 몰비 전환율은 각각 1.95g/L와 0.077에 도달하고, ATCC13032/pZWA1 균주보다 모두 48%가 향상되어, 효과는 현저하다. 따라서, 본 발명이 제공한 ALA 생성 균주의 개조방법은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 등 발효산업에서 흔히 사용되는 미생물에도 적용된다.
Figure 112015086888312-pct00007
토론
본 발명자는 5-아미노레불린산의 합성경로를 기반으로, ALA를 생성하는 재조합 미생물을 타겟으로 하여, 이성적인 설계를 거쳐 숙주균의 글루시드 대사경로를 개조한 결과, 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성은 글루코스의 전환율과 ALA의 생산량을 현저히 향상시키는 것을 나타냈다. 구체적으로 말하면, 본 발명은 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소를 발현시키는 것을 통하여 옥살로아세테이트의 보충을 강화시켜, ALA의 생산량과 글루코스의 전환율을 대폭으로 향상시켰다.
본 발명자는 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 감소, 즉 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소와 숙신산 탈수소 효소의 활성을 감소시키는 것도 유사한 기술효과를 일으키는 것을 발견하였다. 생물학적 상식이 우리들에게 알려주는 바, 다중체 효소는 매개 서브 유닛의 밀접한 배합이야말로 완정한 생물학적 기능을 완성할 수있고, 어느 하나의 서브 유닛 서열 또는 구조 변화, 발현 수준 변화는 모두 효소의 전체 활성에 영향을 준다. 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소와 숙신산 탈수소 효소는 모두 다중체 효소이고, 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소는 2개의 서브 유닛을 포함하고, 각각 sucC, sucD 코딩으로 구성되고, 숙신산 탈수소 효소는 4개의 서브 유닛을 포함하며, 각각 sdhA, sdhB, sdhC와 sdhD 코딩으로 구성된다. 실시예4와 실시예5를 통하여, 발명자는 sucC와 sucD, sucC, sdhA과 sdhB, sdhA 유전자의 결실은 상은한 효소 불활성화를 초래하여, ALA합성에 유리한것을 실증하였다. 생물학적 상실에 근거하여 이러한 2개의 효소의 활성을 약화할 수 있는 유전자 조작 또는 기타 방법을 통하여, 예를 들면 외인성의 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소의 억제제를 첨가하여 양자의 활성을 억제 또는 감소시키는 것은 모두 ALA의 생물합성에 이롭다.
그리고 상가의 2가지 개조전략의 통합은 글루코스의 전환율과 ALA의 생산량을 더욱 크게 향상시켰고, 단지 ALA 합성효소를 발현시키는 대조 균주에 비해, 재조 후의 균주의 ALA의 생산량과 글루코스의 전환율은 각각 1.91배와 1.57배 향상하였으며, 본 발명의 균주를 사용하여 발효탱크 발효룰 실행할 경우, ALA의 생산량은 7g/L 이상에 도달하여, 우수한 수준에 도달하였다. 이 밖에, 본 발명의 개조바업은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 등 발효산업에서 흔히 사용하는 미생물에도 적용되고, 아주 좋은 보편성을 구비한다.
따라서, 본 발명이 제공한 균주와 방법은 ALA의 생산량과 글루코스의 전환율을 현저히 향상시켜, 기존의 ALA를 합성할 경우 숙신산의 첨가에 대한 의존과 LB 배지와 같은 비싸고 복합한 배지의 사용으로부터 벗어나게 되어, 생산원가를 대폭 감소하여, 우수한 산업화 전마을 구비한다.
발명자는 초기에 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제의 활성을 강화시키는 것도 옥살로아세테이트의 합성을 강화시켜, ALA의 합성에 필요하는 전구체량을 향상시시켜, ALA의 생산량을 향상시키는 작용을 일으킬 것으로 예상하였지만, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제의 활성을 향상시는 것이 예상의 기술효과를 일으키지 못하는 것을 구체적으로 증명하였다. 마찬가지로, 발명자는 말산효소의 활성을 강화시는 것도 ALA의 생산량의 향상을 실현하지 못하는 것을 더 발견하였다. 발명자는 진이보의 연구를 통하여, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제와 말산효소의 활성을 약화시키는 것이 도리어 ALA의 생산량을 현저히 향상시키는 것을 예기치 않게 발견하였다. 구체적을 말하면, 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제의 결실은 ALA의 생산량과 글루코스의 전환율을 대폭 향상시킬 수 있고, 말산효소의 결실도 글루코스의 전환율에 이롭다.
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 모두 본원 발명의 인용의 참고로서, 매 한편의 문헌이 단독으로 인용되어 참고된 것과 같다. 이 밖에 이해해야 할 것은, 본 발명의 상기 설명한 내용을 열독한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 대하여 다양한 개변 또는 수정을 할 수 있고, 이러한 등가 형식은 모두 본원 발명에서 청구한 특허청구범위에서 한정한 범위에 속한다.
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Claims (15)

  1. 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 생성 균주 중의 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성을 강화시키거나 또는 외인성(exogenous)이고 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase) 또는 피루브산 카르복시화 효소(pyruvate carboxylase)인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조효소 A(succinyl coenzyme A)의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성을 약화시키는 단계를 더 포함하고,
    상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소(succinate dehydrogenase)인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제(kinase), 말산(malicacid)효소 또는 이들의 조합의 활성을 약화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법.
  5. 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제의 활성을 약화시키는 단계; 및
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로를 강화시키거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주의 구축방법.
  6. 5-아미노레불린산 생성 균주에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소의 활성이 강화되거나 또는 외인성이고 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소를 포함하고,
    상기 옥살로아세테이트의 합성을 촉진시키는 관련 효소는 에놀피루빈산 인산 카르복시화 효소 또는 피루브산 카르복시화 효소인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소의 활성이 더 약화되고,
    상기 숙시닐 보조 효소 A의 다운스트림 대사경로의 관련 효소는 숙시닐 보조 효소 A의 합성효소 또는 숙신산 탈수소 효소인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로가 강화되거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 함유하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  9. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(Corynebacterium glutamicum), 로도박터 스페로이드스(Rhodobacter sphaeroides) 및 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  10. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제, 말산효소 또는 이들의 조합의 활성이 약화된 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  11. 5-아미노레불린산 생성 균주에 있어서,
    상기 5-아미노레불린산 생성 균주 중의 에놀피루빈산 인산 카르복시화 키나아제의 활성이 약화되고, 상기 균주 중의 5-아미노레불린산의 합성경로가 강화되거나 또는 외인성의 5-아미노레불린산의 합성경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 균주.
  12. CGMCC No.6588을 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 균주인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주.
  13. CGMCC No.6589를 수탁번호로 중국미생물균종수탁관리위원회 일반미생물센터에 수탁된 균주인 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산 생성 대장균 균주.
  14. 제6항 내지 제8항, 제11항, 제12항 및 제13항 중의 어느 한 항의 균주를 배양하여 5-아미노레불린산을 얻는 단계1); 및
    단계1)의 발효배양 시스템으로부터 5-아미노레불린산을 얻는 단계2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산을 생성하는 방법.
  15. 5-아미노레불린산, 5-아미노레불린산을 전구체로 하는 다운스트림 산물 또는 이들의 조합을 생성하기 위한 것을 특징으로 하는 제6항 내지 제8항, 제11항, 제12항 및 제13항 중의 어느 한 항에 따른 균주를 포함하는 조성물.
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