KR101800366B1 - Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma - Google Patents
Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma Download PDFInfo
- Publication number
- KR101800366B1 KR101800366B1 KR1020150101915A KR20150101915A KR101800366B1 KR 101800366 B1 KR101800366 B1 KR 101800366B1 KR 1020150101915 A KR1020150101915 A KR 1020150101915A KR 20150101915 A KR20150101915 A KR 20150101915A KR 101800366 B1 KR101800366 B1 KR 101800366B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer
- egfr
- kit
- probe
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 title claims description 104
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 82
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 147
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 206010071975 EGFR gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 103
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 37
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 9
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 claims description 9
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 claims description 5
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 claims description 5
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 4
- 229960001686 afatinib Drugs 0.000 claims description 3
- ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(O[C@@H]3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims description 3
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 41
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 22
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 19
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 19
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 5
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 8
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 3
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 235000019809 paraffin wax Nutrition 0.000 description 3
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 229940084651 iressa Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940120982 tarceva Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ULXXDDBFHOBEHA-ONEGZZNKSA-N Afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(OC3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011885 in vitro diagnostic (IVD) kits Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003246 quinazolines Chemical class 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a composition for detecting epithelial cell growth factor receptor gene mutation and a kit comprising the same, and more particularly, to a primer and a probe set composition for detecting epithelial cell growth factor receptor gene mutation, an EGFR gene mutation detection And a kit for detecting an EGFR gene mutation comprising a primer / probe set of a part of the composition of the present invention. The primer / probe set of the present invention can predict the prognosis of the cancer patient's response to the therapeutic agent, not only the diagnosis but also the metastasis or recurrence of the cancer, so it is possible to judge the necessity of the administration of the chemotherapeutic agent, And can be usefully used for purposes of monitoring cancer metastasis or recurrence.
Description
본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting epithelial cell growth factor receptor gene mutation and a kit comprising the same, and more particularly, to a primer and a probe set composition for detecting epithelial cell growth factor receptor gene mutation, an EGFR gene mutation detection And a kit for detecting an EGFR gene mutation comprising a primer / probe set of a part of the composition of the present invention.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.Cancer refers to a group of abnormal cells caused by continuous division and proliferation by destroying the balance between cell division and death by various causes, and is also called a tumor or neoplasm. It generally develops in more than 100 parts of the body, including organs, white blood cells, bones, lymph nodes, etc., and develops into serious symptoms through the phenomenon of invasion into surrounding tissues and metastasis to other organs.
암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어, 현재 임상에서 사용되는 각종 암에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가지의 어려움을 겪고 있는데, 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료제로 변경을 고려하는데, 결국 치료 개시 시기에 임상의가 환자에게 적절한 치료제를 선택하지 못하였다면, 그만큼 효과적인 치료에 이르는데, 시간이 그만큼 지체하게 되며, 병의 진행, 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다. Cancer therapy is being developed continuously, and dozens of therapies for various cancers currently used in clinical trials are available. However, until now, clinicians are suffering from two difficulties. First, it takes several weeks for the therapeutic effect to take effect. In other words, the therapeutic effects of anticancer drugs can not be judged within a few days, but they gradually appear over several weeks, so it takes a long time to judge the prescription drug to be ineffective. If the treatment is not effective enough, the patient will be considered for other types of treatment. If the clinician can not select the appropriate treatment for the patient at the time of initiation of treatment, the time will be delayed And the prognosis of the disease.
두 번째 어려움은 치료제에 치료 반응을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어, 유방암 치료제인 라파티닙(lapatinib)은 HER2 단백질의 수치가 높고 (HER2 양성) EGRF 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나 전이성의 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면, 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 혹은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.The second difficulty is that there are a number of patients who do not respond to the treatment. For example, lapatinib, a breast cancer treatment, has been shown to have therapeutic effects when high levels of HER2 protein (HER2 positive) and low levels of EGRF protein are present. However, metastatic HER2 negative breast cancer did not respond to lapatinib, indicating that lapatinib was ineffective. These results suggest that patients with breast cancer need to know precisely whether they are HER2 negative or positive before treatment, so that appropriate treatment can be selected.
따라서, 치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을 지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다. Therefore, if the therapeutic response to the therapeutic agent and its side effects can be predicted in advance, it will be possible to lower the dropout rate of the drug and improve the compliance of the drug due to the wrong selection of the drug. It will also avoid the time it takes for the drug to take effect and the risk of side effects that the patient may experience.
한편, EGFR은 erbB 수용체 부류의 단백질 티로신 인산화효소의 일종이다. 성장 인자 리간드, 예컨대 표피 성장 인자 (EGF: epidermal growth factor) 결합시, 상기 수용체는 또 다른 EGFR 분자와 동종 이량체를 형성할 수 있거나, 또는 또 다른 부류 구성원, 예컨대 erbB2(HER2), erbB3(HER3), 또는 erbB4(HER4)와 이종 이량체를 형성할 수 있다.EGFR, on the other hand, is a type of protein tyrosine kinase of the erbB receptor family. Upon binding of a growth factor ligand, such as an epidermal growth factor (EGF), the receptor may form a homodimer with another EGFR molecule or another class member such as erbB2 (HER2), erbB3 (HER3 ), Or erbB4 (HER4).
erbB 수용체의 동종 및/또는 이종 이량체의 형성은 세포내 도메인에서 중요 티로신 잔기의 인산화를 결과로 생성하고, 세포 증식 및 생존에 관여하는 많은 세포내 신호 전달 경로의 자극을 유도한다. erbB 부류 신호 전달의 탈조절은 증식, 침윤, 전이, 혈관형성 및 종양 세포 생존을 조장하며, 그리고 폐암, 두경부암 및 유방암을 비롯한 많은 인간 암에서 기술되어 있다.The formation of homologous and / or heterodimeric erbB receptors results in the phosphorylation of key tyrosine residues in the intracellular domain and induces the stimulation of many intracellular signaling pathways involved in cell proliferation and survival. Deregulation of erbB class signaling promotes proliferation, invasion, metastasis, angiogenesis and tumor cell survival and is described in many human cancers, including lung, head and neck cancer and breast cancer.
그러므로, erbB 부류가 항암 약물 개발을 위한 합리적인 표적을 대표하고, 제피티닙(IRESSA™), 엘로티닙(TARCEVA™)을 비롯한, EGFR을 표적하는 다수의 제제가 현재 임상적으로 이용될 수 있다. 2004년에는 EGFR에서 활성화 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고되었다(Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39). 가장 일반적인 EGFR 활성화 돌연변이인 L858R 및 delE746_A750은 야생형(WT: wild type) EGFR에 비하여 소분자 티로신 키나제 억제제, 예컨대 제피티닙 및 엘로티닙에 대한 반응성과 관련이 있는 점이 알려져 있다. 궁극적으로, 제피티닙 또는 엘로티닙을 사용하는 요법에 대한 획득 내성이 예를 들면 게이트키퍼 잔기 T790M의 돌연변이에 의해 발생하는데, 상기 돌연변이는 임상적으로 내성을 띠는 환자 중 50%에서 검출되는 것으로 보고된 바 있다.Therefore, a number of agents that currently represent a reasonable target for the development of anti-cancer drugs and that target EGFR, including zetitib (IRESSA (TM), TARCEVA (TM), are currently clinically applicable. In 2004, activation mutations in EGFR were reported to be correlated with responses to zetti-nip therapy in non-small-cell lung cancer (NSCLC) (Science [2004] Vol. 304, 1497-500 And New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39). It is known that the most common EGFR activating mutations, L858R and delE746_A750, are associated with responsiveness to small molecule tyrosine kinase inhibitors such as zetytipine and erotinib as compared to wild-type (WT) wild-type EGFR. Ultimately, acquisition tolerance for therapies using zetti nip or elotinib is caused, for example, by mutation of the gatekeeper residue T790M, which is detected in 50% of clinically resistant patients It has been reported.
이와 같이, EGFR 돌연변이의 존재는 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 EGFR 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.Thus, the presence of the EGFR mutation acts as a strong predictor of drug sensitivity in response to EGFR kinase inhibitors such as zetitibe or elotinib, and therefore an effective and rapid detection method of the EGFR mutation is required for an optimal therapeutic approach .
한편, 대부분의 암은 시기와 빈도의 차이는 있지만, 이웃 조직에 침투하고 림프관 또는 혈관을 통해 이동하여 종양세포가 다른 곳에 자리 잡아 퍼지는 전이 현상이 일어날 수 있다. 전이는 암으로 인한 사망의 90%를 차지하는데 침투와 전이는 매우 복잡한 과정이며, 그것의 유전적-생화학적 요인은 아직 잘 알려지지 않았다. 암 전이는 크게 림프성 전이와 혈액성 전이로 구분하고 있는데, 원발부위에서 먼 장기로의 전이는 대부분 혈액성 전이로 일어난다고 알려져 있다. 암 환자에게서 전이가 발생하면 어느 부위에 암 세포가 정착하여 증식하고 있는지 진단하기 어려울 뿐만 아니라 혈액을 통해 전신으로 암 세포가 빠르게 퍼질 수 있어 병의 예후가 매우 좋지 못하다. 따라서, 암 환자 또는 암의 1차적인 치료가 완료된 환자에서 암의 전이 또는 재발을 방지하기 위해서는 지속적인 모니터링이 필요하며, 이러한 모니터링은 환자의 삶의 질을 침해하지 않는 한도에서 최대한 간단하고 신속하게 수행될 필요성이 있다. On the other hand, most cancers, although different in timing and frequency, can penetrate into neighboring tissues and migrate through lymphatic vessels or blood vessels, resulting in metastatic spread of tumor cells elsewhere. Metastasis accounts for 90% of cancer deaths. Penetration and metastasis are very complex processes, and their genetic-biochemical factors are not yet well-known. Cancer metastasis is largely divided into lymphatic metastasis and hematogenous metastasis. It is known that most metastasis to the distant organs from the origin of the tumor is due to hematogenous metastasis. When a metastasis occurs in a cancer patient, it is difficult to diagnose which part of the cancer cell is colonized and proliferates, and the prognosis of the disease is not good because the cancer cell can spread rapidly through the blood. Therefore, continuous monitoring is necessary to prevent cancer metastasis or recurrence in cancer patients or patients whose primary treatment of cancer has been completed, and this monitoring should be performed as simple and quick as possible without infringing the quality of life of the patient There is a need to be.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
이에, EGFR 돌연변이를 간편하고 신속하게 검출하여, EGFR 관련 암 환자의 약물치료 전략을 선택하거나, 암의 전이 또는 재발을 방지하기 위한 모니터링 수단으로 이용할 필요성이 있고, 본 발명자들은 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출하는 시스템, 특히 환자의 혈액 내 cfDNA에 적용시키기 적합한 프라이머/프로브 세트를 발굴하고, 이에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, there is a need to detect EGFR mutation easily and rapidly, to select a drug therapy strategy for EGFR-related cancer patients, or to use as a monitoring means to prevent cancer metastasis or recurrence. The present invention has been completed based on the finding of a primer / probe set suitable for application to cfDNA in a patient's blood, and a kit suitable for the primer / probe set.
따라서, 본 발명의 목적은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer and a probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting mutation of EGFR gene comprising a composition of the present invention and a kit for detecting mutation of EGFR gene comprising a partial primer / probe set of the composition of the present invention.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides primer and probe set composition for detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.In order to accomplish another object of the present invention, there is provided a kit for detecting mutation of EGFR gene comprising a composition of the present invention and a primer / probe set of a part of the composition of the present invention.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. The following references provide one of the skills with a general definition of the terms used in the specification of the present invention: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2nd ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); And Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 23, 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17, 24 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 28, 29, 32 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다.The present invention relates to a primer and a probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation, comprising a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: The reverse primer of SEQ ID NO: 10, the reverse primer of SEQ ID NO: 10, the forward primer of SEQ ID NO: 13, the reverse primer of SEQ ID NO: 14 and the reverse primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2, the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, and the reverse primer of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 17, 24 to 27, The reverse primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, and the reverse primer of SEQ ID NO: 6 and the polyline of the probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 28, 29, A polynucleotide comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of nucleotide sets.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. 2004년, EGFR에서의 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고 (Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39)된 이래로 많은 관련 EGFR 돌연변이가 확인되었다. 상기 EGFR 저해제는 바람직하게는 엘로티닙 (erlotinib), 제피티닙 (gefitinib) 또는 아파티닙 (Afatinib) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .The composition of the present invention may preferably be for predicting the responsiveness of an EGFR inhibitor to treatment. In 2004, a mutation in EGFR was reported to correlate with the response to zepitibem therapy in non-small-cell lung cancer (NSCLC) (Science [2004] Vol. 304, 1497-500 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39), many relevant EGFR mutations have been identified. The EGFR inhibitor may be, but is not limited to, erlotinib, gefitinib or Afatinib.
본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In the present invention, the term " primer " means an oligonucleotide in which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, that is, the presence of a polymerizing agent such as a nucleotide and a DNA polymerase, It can act as a starting point for synthesis under pH conditions. Preferably, the primer is a deoxyribonucleotide and is a single strand. The primers used in the present invention may include naturally occurring dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primers may also include ribonucleotides.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.The primer should be long enough to be able to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizing agent. The suitable length of the primer is determined by a number of factors, such as the temperature, the application, and the source of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a sufficiently stable hybrid complex with the template. The term " annealing " or " priming " means that the oligodeoxynucleotide or nucleic acid is apposited to the template nucleic acid, which polymerizes the nucleotide to form a complementary nucleic acid molecule to the template nucleic acid or a portion thereof .
본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질 (HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐 (quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다. In the present invention, " probe " is designed as a kind of taqman probe used for quantitative PCR. Preferably, a fluorescent material (HEX, VIC, FAM dye) is attached to the probe, and BHQ1 can be used as a quencher on the 3 'side of all the probes. The TaqMan probe is an oligonucleotide tagged with the 5 'end as a fluorescent substance and the 3' end as a quencher. The TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but there is a quencher at the 3 'end of the probe However, if the TaqMan probe hybridizes to the template due to the 5 '→ 3' exonuclease activity of the Taq DNA polymerase in the next step of extension, the fluorescent material is separated from the probe and is inhibited by the quencher And fluorescence is emitted quantitatively by the principle of the fluorescence emitted by the PCR reaction.
본 발명에서의 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 PCR 반응 용액 및 표준 PCR 반응 용액에 대해서 동일한 서열로 사용되며, 각각 독립적으로 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 23, 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17, 24 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 28, 29, 32 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The primers and probes specific for the genomic DNA gene mutation in the present invention may be one for detecting mutations in the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene. Preferably, the primers and probes specific for the genomic DNA gene mutation are used in the same sequence for the PCR reaction solution and the standard PCR reaction solution, and each independently have the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, The reverse primer of SEQ ID NO: 8, the polynucleotide set of the probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18 to 23, 30, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10, the forward primer of SEQ ID NO: A reverse primer of SEQ ID NO: 14 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31, 36 to 38, a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: Reverse primers and SEQ ID NOs: 15 to 17, 24 to 27 A forward primer of SEQ ID NO: 12, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, and a group consisting of SEQ ID NOs: 28, 29 and 32 to 35 And a set of polynucleotides of the probe selected in SEQ ID NO.
PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ??쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며, 바람직하게는 각 미분화된 작은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. The measurement of the PCR reaction can be performed according to a method known in the art, but can be measured by an optical quantitative analysis system using a probe labeled with a reporter fluorescent dye and / or a quencher fluorescent dye, Preferably by measuring the fluorescence value for each PCR reaction of each undifferentiated droplet.
구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치 (예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.Specifically, since the probe is combined with FAM, HEX, VIC fluorescent dye (fluorescent substance) or EvaGreen fluorescent dye, it can be performed by measuring fluorescence thereon. This process can be performed by a commercially available detector (for example, Droplet Reader from biorad), which detects the droplet fluorescence signal of each sample in the apparatus, counts the number of positive and negative droplets, and automatically Analysis can be completed.
이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.In this case, probes to be added to the PCR reaction solution and probes to be added to the standard PCR reaction solution for detection may be respectively associated with different fluorescent materials.
한편, 본 발명은 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.Meanwhile, the present invention provides a kit for detecting EGFR gene mutation comprising the primer / probe set of the present invention.
본 발명이 상기 키트는, background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (blocker)를 추가적으로 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include an oligomer (blocker) designed to prevent non-specific binding of a mutation detection probe to a wild-type sequence using a wild-type sequence corresponding to a mutation position to reduce background noise have.
본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.The kit of the present invention can be preferably used for the detection of mutations of the EGFR gene by PCR reaction using the primer / probe set of the present invention. The kit of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art used for PCR or detection thereof. The kit of the present invention may further comprise a tube, a well plate, an instructional material describing a method of use and the like to be used for mixing the components as necessary.
아울러, 본 발명의 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (investigation use only) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx 키트도 포함된다.In addition, the kit of the present invention may be a research use only (RUO) or an investigation use only (IVD) kit. IVD kits also include IVD-CDx kits.
한편, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 21, 23 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The reverse primer of SEQ ID NO: 7, the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the poly primer of the probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 18 to 21, 23 and 30, A kit for detecting EGFR gene mutation comprising a set of nucleotides as an active ingredient.
또한, 본 발명은 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 및 39로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10, the forward primer of SEQ ID NO: 13, the reverse primer of SEQ ID NO: 14, As an active ingredient, an EGFR gene mutation detecting kit.
또한 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a polynucleotide set of the forward primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2, the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, and the probes selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15 to 17 and 40 A kit for detecting EGFR gene mutation which is contained as an active ingredient.
또한, 본 발명은 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 32 내지 35 및 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 11, the reverse primer of SEQ ID NO: 12, the forward primer of SEQ ID NO: 13, the reverse primer of SEQ ID NO: 14, As an active ingredient, an EGFR gene mutation detecting kit.
본 발명의 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것이다. The kit of the present invention is used in qPCR (quantitative PCR) or digital PCR method.
본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 EGFR의 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA, 또는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. The template applicable to the kit of the present invention can be used without restriction as long as mutation detection of EGFR is necessary and PCR reaction is possible. Preferably, the kit of the present invention comprises DNA isolated from FFPE (formalin fixed paraffin embedded) A cDNA synthesized from a tissue-derived RNA by a reverse transcription reaction, or a cfDNA (cell-free DNA) isolated from blood as a template.
인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다. CfDNA circulating in human plasma has been studied in a variety of physiological and pathological conditions such as inflammatory disorders, oxidative stress and malignant tumors. The precise mechanism involved in the release of cfDNA into the bloodstream is unclear, but seems likely to be a synergistic effect of apoptosis, cellular necrosis and active release from cells. CfDNA circulating through blood vessels is a potentially useful biomarker. DNA levels and fragmentation patterns present interesting potential for diagnostic and prognostic prediction purposes. In particular, the biomarker can be detected easily and rapidly without deteriorating the quality of life because the biomarker can be easily detected from the patient's blood.
생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.The tissue obtained from the patient after biopsy is usually fixed with formalin (formaldehyde) or the like. The immobilized biological sample is generally dehydrated and embedded in a solid support such as paraffin, and the sample thus prepared is called an FFPE sample. Nucleic acids in the FFPE sample, especially DNA, are present in immobilized cells and are either fragmented or cross-linked by formalin, so it is necessary to remove the paraffin and dissolve the fixed cells to elute the DNA and other nucleic acids in the cells.
본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.In the present invention, the term " paraffin " comprehensively refers to a foraging medium of a biological sample used in all analyzes including morphological, immunohistochemical and enzymatic histochemical analysis. That is, the paraffin in the present invention may be a petroleum-based paraffin wax alone, and may be any one selected from the group consisting of all kinds of petroleum-based paraffin waxes, May be included. Herein, the petroleum paraffin wax refers to a mixture of hydrocarbons which are solid at room temperature derived from petroleum.
일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.In general, a specimen of a cancer patient treated with FFPE is cut into a thickness of 5 to 10 μm using a rotary microtome, and then a nucleic acid containing DNA is isolated through a commercially available nucleic acid separation kit for FFPE or a device utilizing the same . Kits / devices for separating nucleic acids from FFPE include, for example, the Tissue Preparation System from Siemens and VERSANT tissue preparation reagents.
아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다. In addition, the kit of the present invention can be used as a template for DNA isolated from blood circulating CTC (circulating tumor cell) or cDNA synthesized by reverse transcription from the CTC-derived RNA. CTC is a tumor cell found in the peripheral blood of a malignant tumor patient. Because CTC plays an important role in the process of metastasis, CTC is considered to be crucial in the study and diagnosis of cancer, but the number of circulating tumor cells in the peripheral blood is very rare, and there are fewer than a dozen There is a need for a detection system that requires a degree of sensitivity to detect tumor cells.
본 발명에서 치료 반응성은 암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 "반응성"이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 아울러, 상기 “반응성”에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수도 있다. Therapeutic reactivity in the present invention can be defined as "responsive" for a therapeutic agent if the growth rate is inhibited as a result of contact with the therapeutic agent compared to its growth in the absence of contact with the therapeutic agent. The growth of cancer can be measured in various ways, for example, the expression of a tumor marker suitable for the size of the tumor or its tumor type can be measured. In addition, the above " reactivity " may indicate an increase in survival time on a significant survival curve.
암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 "비반응성"이다. 위에서 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 비반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.Cancer is "non-responsive" to the therapeutic agent unless the growth rate is suppressed or suppressed to a very low extent as a result of contact with the therapeutic agent as compared to its growth not in contact with the therapeutic agent. As noted above, cancer growth can be measured in a variety of ways, for example, the expression of tumor markers suitable for the size of the tumor or its tumor type can be measured. Non-responsive measures can be assessed using additional criteria beyond the growth size of the tumor, including the patient's quality of life, metastasis, and the like.
암 치료제에 대한 치료 반응성으로 EGFR (epidermal growth factor receptor)의 저해제에 대한 치료 반응성일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 암은 폐암, 유방암, 방광암, 위암일 수 있다.The therapeutic response to cancer therapy may be therapeutic response to an inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR), and thus the cancer of the present invention may be lung cancer, breast cancer, bladder cancer, stomach cancer.
EGFR은, 종양유전자(oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물이다. erbB 또는 ErbB1은 수많은 암 발생에 있어 중요 인자로 알려진 원발암유전자(protooncogenes)인 ERBB 군의 하나이다. 폐암을 포함하여, 유방암, 방광암, 위암 등에서 EGFR의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다.EGFR is a protein product of the oncogene erbB or ErbB1. ErbB or ErbB1 is one of the ERBB family of protooncogenes, which is known to be an important factor in the development of many cancers. It has been observed that the expression of EGFR is increased in breast cancer, bladder cancer, stomach cancer and the like, including lung cancer.
폐암, 유방암, 방광암, 위암 등의 상피세포암을 치료하기 위하여 다양한 EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 특히 제피티닙(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd., 상표명 "IRESSA"), 엘로티닙(Erlotinib)(Genentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., 상표명 "TARCEVA")와 아파티닙(Afatinib)(Boehringer Ingelheim GmbH corp., 상품명 “GIOTRIF”)이 대표적인 약물이다. 제피티닙과 엘로티닙은 퀴나졸린계 화합물로서, EGFR의 티로신 키나제 활성을 저해하여 인산화를 억제함으로써 세포성장을 막는다.A variety of EGFR target drugs have been developed to treat epithelial cancers such as lung cancer, breast cancer, bladder cancer and stomach cancer, and in particular, have been developed for the treatment of various EGFR target drugs such as Gefitinib (AstraZeneca UK Ltd., trade name "IRESSA"), Erlotinib , Inc. and OSI Pharmaceuticals, Inc., trade name "TARCEVA") and Afatinib (Boehringer Ingelheim GmbH corp., Trade name "GIOTRIF"). Zetytipine and elotinib are quinazoline compounds that inhibit tyrosine kinase activity of EGFR and inhibit phosphorylation thereby inhibiting cell growth.
본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며, 더 바람직하게는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다. The nucleic acid isolated from the sample of the present invention is preferably a genomic DNA, more preferably a genomic DNA presumed to have a mutation.
본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 EGFR 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.The compositions or kits of the invention can preferably be used for EGFR mutation detection in automated or semi-automated methods. In the above, automation can be achieved by injecting a sample (sample); Relocation or movement of a substrate (e.g., tube, plate) that has been extracted, separated, or reacted; Reagent, buffer stock, replenishment; Means that all or most of the process, except equipment maintenance, takes place through means other than human (for example, a robot).
본 발명의 조성물 또는 키트는 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 있어서 각 시료에 대해서 우수한 돌연변이 검출능을 보였으며, 이는 종래의 비교 제품에 비해서도 더 우수한 것이었다.The composition or kit of the present invention showed excellent mutation detection ability in detecting each mutation in the EGFR gene mutation, which was superior to conventional comparative products.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). For reference, the above-mentioned nucleotide and protein work can be referred to the following references (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al Inc., San Diego, Calif. (1990), < RTI ID = 0.0 > Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., ≪ Diagnostic 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol., 158: 419 -29 (2001)).
본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.The primer / probe set of the present invention can predict the prognosis of the cancer patient's response to the therapeutic agent, not only the diagnosis but also the metastasis or recurrence of the cancer, so it is possible to judge the necessity of the administration of the chemotherapeutic agent, And can be usefully used for purposes of monitoring cancer metastasis or recurrence.
도 1은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 구성(MMX 1 내지 4)을 나타낸 것으로, 각 MMX에 포함되는 프로브 및 검출 가능한 EGFR 변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 분석적 민감도를 측정하기 위해 돌연변이율을 희석하여 키트의 민감도를 직선성으로 수행한 결과이다.(A: MMX 1, B: MMX 2).
도 3은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 분석적 민감도를 측정하기 위해 돌연변이율을 희석하여 키트의 민감도를 직선성으로 수행한 결과이다.(A: MMX 3, B: MMX 4).
도 4는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 42종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과인 동시에 각 MMX에 포함되는 EGFR mutation site에만 검출함을 보인 결과이다(A: MMX 1, B: MMX 2).
도 5는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 42종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과인 동시에 각 MMX에 포함되는 EGFR mutation site에만 검출함을 보인 결과이다(A: MMX 3, B: MMX 4).
도 6은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 reference FFPE DNA에서 돌연변이를 검출한 결과이다(A: exon 19 E746-A750 del 검출, B: L858R 검출, C: T790M 검출, D: G719S 검출).
도 7은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 임상환자 중 한명(환자 5, patient #5)의 cfDNA로부터 EGFR 변이를 검출한 결과를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 임상환자 9명의 cfDNA로부터 EGFR 변이를 검출한 결과 및 FFPE로부터 EGFR 변이를 검출한 결과를 정리하여 비교한 결과표이다(A: 결과 비교표, B: ddPCR 결과 데이터)
도 9는 임상검체인 FFPE 샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트와 기허가 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)의 동등성을 ddPCR을 통해 평가한 결과이다(A: MMX1, B: MMX2).
도 10은 임상검체인 FFPE 샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트와 기허가 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)의 동등성을 ddPCR을 통해 평가한 결과이다(A: MMX3, B: MMX4). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the constitutions (
Figure 2 shows the result of linearity of the kit sensitivity by diluting the mutation rate in order to measure the analytical sensitivity of the EGFR mutation detection kit comprising the probe and the primer of the present invention (A:
FIG. 3 shows the results of linearity of the kit sensitivity by diluting the mutation rate in order to measure the analytical sensitivity of the EGFR mutation detection kit comprising the probe and the primer of the present invention (A:
FIG. 4 shows the results of confirming whether the EGFR mutation detection kit containing the probe and the primer of the present invention can detect 42 kinds of EGFR mutation sites and detecting only EGFR mutation sites contained in each MMX A:
FIG. 5 shows the results of confirming whether the EGFR mutation detection kit containing the probe and primer of the present invention can detect 42 kinds of EGFR mutation sites and detecting only EGFR mutation sites contained in each MMX A:
6 is a result of detecting mutation in a reference FFPE DNA using the EGFR mutation detection kit comprising the probe and the primer of the present invention (A:
FIG. 7 shows the results of detection of EGFR mutation from cfDNA in one of the clinical patients (
FIG. 8 is a table summarizing the results of detection of EGFR mutation from cfDNA of 9 clinical patients and detection of EGFR mutation from FFPE using an EGFR mutation detection kit containing the probe and primer of the present invention (A: Result comparison table, B: ddPCR result data)
Fig. 9 shows the results of evaluating the equivalence of the EGFR mutation detection kit containing the probe and primer of the present invention and the licensed product Cobas (R) EGFR kit (Roche Molecular Diagnostics) using the FFPE sample as a clinical sample (d: MMX1, B: MMX2).
10 shows the results of evaluating the equivalence of the EGFR mutation detection kit containing the probe and the primer of the present invention and the licensed product Cobas® EGFR kit (Roche Molecular Diagnostics) using the FFPE sample as a clinical sample through ddPCR (A: MMX3, B: MMX4).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1>≪ Example 1 >
혈장에서 cell free DNA (cfDNA)의 분리Isolation of cell-free DNA (cfDNA) from plasma
혈장 cfDNA는 순환 핵산 제조 키트 (QIAGEN)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 분리하였다. 환자의 혈액을 3000rpm에서 10분동안 원심분리하여, 세포 파편을 조심하면서 혈장 1ml 를 15 ml 튜브로 이동시켰다. 이 샘플에, 용해 완충액 800 ㎕와 재구성한 프로테아제 K 100 ㎕를 혼합하였다. 짧게 볼텍싱한 후, 튜브를 60℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 결합 완충액 1.8ml을 샘플에 혼합한 다음, 짧게 볼텍싱 한 후, 얼음에 5분간 반응시킨다. 순환 핵산 키트에 구비된 진공 연결관을 진공 펌프에 장착 시킨 후, 컬럼과 통과 분획 튜브를 진공 연결관의 상부에 결합시켰다. 통과 분획 튜브에 샘플을 집어 넣고, 진공펌프를 가동시켜 컬럼 안의 샘플을 통과시켰다. 컬럼을 씻어주기 위하여 세척 용액 700㎕를 통과 분획 튜브에 넣고, 다시 진공펌프를 가동시켜 컬럼을 세척하였다. 통과 분획 튜브와 진공 연결관은 버리고, 필터를 새로운 콜렉션 튜브에 결합시켰다. 컬럼 안의 세척용액을 완전히 제거 하기 위하여 14000rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 컬럼을 새로운 콜렉션 튜브에 결합시키고 56℃에서 10분간 컬럼을 건조시켰다. 컬럼을 새로운 1.5ml 마이크로 튜브로 옮기고, 컬럼의 중앙에 용출완충액 50㎕를 넣고, 실온에서 1분간 인큐베이션 시켰다. 그 이후 14000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리 하여 DNA샘플을 용출 시켰다. 사용하기 전까지 4℃에 저장하거나 또는 장기간 보관하는 경우에는 -70℃에서 동결시켰다.Plasma cfDNA was isolated using a circulating nucleic acid production kit (QIAGEN) according to the manufacturer's recommendations. The blood of the patient was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and 1 ml of plasma was transferred to a 15 ml tube while taking care of the cell debris. To this sample, 800 μl of the lysis buffer and 100 μl of the reconstituted protease K were mixed. After brief vortexing, the tubes were incubated at 60 DEG C for 30 minutes. 1.8 ml of binding buffer is mixed into the sample, vortexed briefly, and reacted on ice for 5 minutes. After attaching the vacuum connection tube provided in the circulating nucleic acid kit to the vacuum pump, the column and the passing fraction tube were connected to the upper part of the vacuum connection tube. The sample was put into a passing fraction tube and a vacuum pump was run to pass the sample in the column. To wash the column, 700 μl of washing solution was put in the passing fraction tube, and the vacuum pump was operated again to wash the column. The passing fraction tube and the vacuum connector tube were discarded and the filter was attached to a new collection tube. And centrifuged at 14000 rpm for 3 minutes to completely remove the washing solution in the column. After centrifugation, the column was coupled to a new collection tube and the column was dried at 56 < 0 > C for 10 minutes. The column was transferred to a new 1.5 ml microtube, and 50 용 of elution buffer was added to the center of the column, followed by incubation at room temperature for 1 minute. Thereafter, the DNA sample was eluted by centrifugation at 14000 rpm for 1 minute at room temperature. It was stored at 4 ° C until use or at -70 ° C for long-term storage.
<실시예 2>≪ Example 2 >
표준 물질 벡터의 제작Production of standard material vector
디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 표준 물질 벡터 (mini-clone으로 명명)를 제작하였다. mini-clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 DNA 단편은 pIDTSmart Amp 벡터의 universal link sequence 사이에 삽입하고, 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환 (transformation) 시켰다.Standard material vectors (named mini-clones) were constructed to validate designed primers and probes, and to make the reference material required for ddPCR performance. The mini-clone was first synthesized in about 300 bp of the EGFR mutation region, ie, the probe site in the middle of each exon. The synthesized DNA fragment was inserted between the universal link sequence of pIDTSmart Amp vector and the clone was transformed into E. coli DH5α cells.
circular form 또는 super-coiled form으로 존재하는 표준물질 벡터를 선형화시켜 ddPCR (droplet digital PCR) 시 효율을 극대화시키기 위하여 표준물질 벡터에 제한효소를 처리하였다. 표준물질 벡터 (Miniclone DNA) ClaI 제한효소를 37도씨에서 30분간 반응 후, 반응산물을 정량 후 -20도씨에서 사용 전까지 보관하였다.In order to maximize the efficiency of ddPCR (droplet digital PCR) by linearizing a standard material vector in a circular form or a super-coiled form, the restriction enzyme was treated with a reference material vector. Standard vector (Miniclone DNA) ClaI restriction enzyme was reacted at 37 ° C for 30 min. After the reaction product was quantified, it was stored at -20 ° C until use.
본 발명에서의 검출 대상의 PCR 증폭 후의 수준은 대상 시료에 따라 전체적으로 차이가 있을 수 있으므로 돌연변이에 특이적인 프라이머/프로브에 의한 증폭여부의 판별을 위한 기준이 필요하다. 표준 물질 벡터는 이를 위한 것으로 게놈 DNA 유전자 변이를 포괄하는 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드가 통상의 벡터에 형질전환된 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하여 pIDTSmart Amp 벡터에 삽입하여 사용할 수 있다. In the present invention, the level after PCR amplification of an object to be detected may be entirely different depending on the sample to be tested, so a criterion for discriminating whether amplification by a primer / probe specific for a mutation is necessary. For this purpose, the reference material vector can be obtained by transforming a polynucleotide of 100 to 350 bp covering a genomic DNA gene mutation into an ordinary vector. Preferably, the reference material vector of the present invention can be used by inserting about 300 bp in the pIDTSmart Amp vector in the region where the mutation occurred in each exon of EGFR, i.e., the probe position as the center.
바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp의 DNA 단편을 포함하는 벡터일 수 있으며, 이는 대장균 등의 숙주세포에 형질전환하여 증폭, 추출 후 사용될 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 엑손 18의 경우, EGFR 유전자 (genbank accession no. NG_007726) 의 159701에서 160100번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 19의 경우, EGFR 유전자의 160501에서 160900번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 20의 경우, EGFR 유전자의 167101에서 167500번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 21의 경우, EGFR 유전자의 177551에서 177930번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드 DNA 단편을 pIDTSmart Amp 벡터에 삽입한 것일 수 있다.Preferably, the reference material vector of the present invention may be a vector containing a DNA fragment of about 300 bp in which a mutation has occurred in each exon of EGFR, that is, a probe position in the middle, which is transformed into a host cell such as Escherichia coli Amplification, and extraction. More preferably, the reference material vector of the present invention is a polynucleotide of 100 to 350 bp in position 159701 to 159701 of the EGFR gene in the case of
<실시예 3>≪ Example 3 >
프라이머/프로브 디자인 및 선발Primer / probe design and selection
폐암 관련 유전자인 EGFR의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호 (http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전자의 exon별 프라이머를 primer3 프로그램을 사용하여 EGFR-21을 제외한 나머지는 forward가 intron부분과 overlapping될 수 있도록 디자인하였다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 58~60℃로 하였으며 GC%는 40~60%로 디자인하였다.In order to develop a biomarker for EGFR, a lung cancer-related gene, the mutation position was confirmed based on the cosmic number (http://cancer.sanger.ac.uk).
프로브는 조건을 충족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다. 5‘ wild type 프로로브에는 HEX/FAM reporter fluorescence를 부착하였으며, 5’ mutant probe에는 FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출가능하도록 하였다. 모든 프로브의 3' 쪽에는 quencher로 BHQ1를 사용하였다. EGFR exon 18, 19, 20, 21번에 각각 3, 12, 6, 3개의 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 allele specific을 갖고 있으며 대부분의 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.The probes were designed with the taqman probe to select those that met the criteria. HEX / FAM reporter fluorescence was attached to the 5 'wild type prolove, and FAM dye was attached to the 5' mutant probe to detect the amplification. BHQ1 was used as a quencher on the 3 'side of all probes. 3, 12, 6, and 3 probes were designed and synthesized on
한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 시퀀스를 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 시퀀스에 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다. In order to reduce the background noise, a blocker oligomer was constructed so that the probe for mutation detection could not be non-specifically bound to the wild type sequence by using a wild type sequence corresponding to the mutation position.
디자인된 프라이머(표 1)와 프로브(표 2), blocker oligomer(표 3)의 정보는 다음과 같다.The information of the designed primer (Table 1), probe (Table 2), and blocker oligomer (Table 3) are as follows.
<실시예 4><Example 4>
프라이머 및 프로브의 돌연변이 검출능Mutation detection ability of primer and probe
ddPCR 장비로 QX200™ Droplet digital PCR system (Bio-RAD, USA)을 이용하였다. 샘플 준비로는 MMX1, MMX2, MMX3, MMX4 mixture가 있는 8-strip PCR tube에 20 ul씩 분주하였고 각 tube에 Ultrapure Water (NTC), Positive control (PC), 환자 검체로부터 추출한 template DNA 를 1ul씩 넣었다. 상기 MMX1, MMX2, MMX3 및 MMX4 mixture에 대한 정보는 하기 표 4에 기재하였다. 또한, 각 MMX에 포함된 프라이머 및 프로브에 대한 구체적인 정보를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다. The QX200 ™ Droplet digital PCR system (Bio-RAD, USA) was used as a ddPCR instrument. For the preparation of the samples, 20 μl of each was added to 8-strip PCR tubes containing MMX1, MMX2, MMX3 and MMX4 mixture. Ultrapure water (NTC), positive control (PC) and template DNA . Information on the MMX1, MMX2, MMX3 and MMX4 mixtures is shown in Table 4 below. Specific information on primers and probes contained in each MMX is shown in Tables 5 and 6 below.
8-Strip PCR tube cap을 닫고 Vortexing 한 후 Spin down 하였고 실온에서 10분간 Incubation 하였다. 준비된 샘플은 Droplets Generation 단계로 8-Channel Electronic Pipette을 이용하여 8-Strip PCR Tube 에서 20ul를 취하여 Cartridge의 sample well에 Loading하였다. Droplet generation Oil을 70ul씩 Cartridge의 Oil loading well에 Loading 한 후 Droplet Generator Gasket의 위아래를 구분하여 장착하고 QX200™ Droplet Generator넣어 작동시켰다. Droplet generation 과정에서 만들어진 Droplet을 8-Channel multi-pipet을 이용하여 40ul를 96 well plate로 옮겨 준 후 Pierceable Foil Heat Seal (BIO-RAD, 181-4040)의 붉은색 선이 아래로 가도록 plate위에 덮고 PX1™ PCR Plate Sealer (180℃, 5초 sealing)에 넣고 Sealing 하였다. PCR reaction Veriti 96-Well Thermal Cycler를 이용하였고 PCR 반응이 끝난 후 반응된 증폭된 PCR산물을 FAM과 HEX로 구분하여 Reading 하게 하였다. 결과산물은 Bio-RAD 가 제공하는 QuantaSoft® sofware으로 수행하였다. 8-Strip PCR tubes were capped, vortexed, spin down and incubated at room temperature for 10 min. The prepared samples were loaded into a sample well of a cartridge by taking 20ul of 8-Strip PCR tube using an 8-channel Electronic Pipette as a droplet generation step. Droplet Generation Oil was loaded into the oil loading well of the cartridge by 70ul each, and the droplet generator gasket was mounted on the top and bottom of the gasket, and the QX200 ™ Droplet Generator was put into operation. Droplet generated in the process of droplet generation was transferred to a 96-well plate using an 8-channel multi-pipet, and the plate was covered with a red line of Pierceable Foil Heat Seal (BIO-RAD, 181-4040) ™ PCR Plate Sealer (180 ° C, 5 sec. Sealing) and sealed. PCR reaction Verity 96-Well Thermal Cycler was used. After PCR reaction, amplified PCR product was separated into FAM and HEX. The resulting product was performed with QuantaSoft® sofware supplied by Bio-RAD.
한편, 상기 표 4에 기재한 MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR mutation site를 도 1에 나타내었다.On the other hand, the EGFR mutation sites which can be detected by the
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 EGFR 변이 검출 키트(이하 “EGFR IVD 키트”라 함)는 상기 MMX 1 내지 4을 모두 포함하고 있으며, 각각의 구성들은 EGFR 42개의 mutation site를 검출할 수 있음을 보여주고 있다. 이들은 또한 FAM과 HEX로 mutation을 구분할 수 있다. 예를 들어, 도 1의 MMX1에서 19 del 은 FAM으로 sample의 quality를 측정하기 위해 wild type HEX probe를 이용하였다. 따라서 각각 FAM과 HEX로 mutation의 종류를 구분하였다. As shown in Fig. 1, the EGFR mutation detection kit (hereinafter referred to as " EGFR IVD kit ") of the present invention includes all of the
또한 기존 논문에 발표된 자료를 근거로 하여 EGFR tyrosine kinase inhibitor 약재들(엘로티닙, 제피티닙, 아파티닙)의 약효 발현과 관련된 mutation site를 표시하였으며 붉은색은 약에 대해 저항성을 보이는 EGFR 변이를 나타낸 것이며 노란색은 약에 효과를 보이는 EGFR 변이를 나타내고 있다. In addition, based on the data published in the previous paper, mutation sites related to the efficacy of EGFR tyrosine kinase inhibitor medicines (elotinib, zetitib and apatipin) were shown, and the red color was EGFR mutant And yellow indicates the EGFR mutation that is effective for the drug.
<4-2> EGFR 돌연변이 검출능<4-2> EGFR mutation detection ability
상기 표 4에 기재된 EGFR IVD 키트의 성능을 검증하기 위해 negative control (NC)인 Non template control (NTC), positive control (PC)로 Human genomic DNA (Promega corp, USA)을 사용하였고 실험 샘플로는 표준물질인 40개의 miniclone을 사용하였다. 표준물질 40개를 사용한 이유는 EGFR kit가 42개의 mutation site를 검출할 수 있지만 이 중 3개의 사이트는 동일한 sequencing을 포함하고 있기 때문이다.Human genomic DNA (Promega corp, USA) was used as a non-template control (NTC) and positive control (PC) as a negative control (NC) to verify the performance of the EGFR IVD kit described in Table 4 above. 40 miniclone were used. The reason for using 40 reference materials is that the EGFR kit can detect 42 mutation sites, but three sites contain the same sequencing.
상기 EGFR 변이 검출 키트 민감도를 특정하기 위해 각각의 miniclone들은 PC로 사용된 gDNA와 spiking하여 1, 0.5, 0.1 및 0.02%가 되게 희석하였다.To identify the sensitivity of the EGFR mutation detection kit, each miniclone was spiked with gDNA used as PC to dilute to 1, 0.5, 0.1 and 0.02%.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 2에 나타낸 바와 같이, MMX 1 내지 4가 혼합된 PCR mixture를 사용하여 민감도를 측정한 결과, 24개의 mutation site에서는 0.02% 까지의 높은 민감도를 보였으며, 나머지 16개의 mutation site는 0.1%에서 검출이 되었다. As shown in FIG. 2, the sensitivity of the PCR mixture mixed with
즉, 상기 EGFR IVD 키트의 최소 검출농도가 0.1 내지 0.02%임을 알 수 있었다. That is, the minimum detection concentration of the EGFR IVD kit was 0.1 to 0.02%.
<실시예 5>≪ Example 5 >
EGFR IVD 키트의 돌연변이 검출 시험Mutation detection test of EGFR IVD kit
본 발명의 EGFR IVD 키트가 EGFR 엑손 18 내지 21의 42개 mutation site를 검출할 수 있는지 알아보기 위해 40개의 표준물질을 이용하였으며 또한 cancer의 특징 중의 하나인 heterozygote을 감안하여 miniclone을 wildtype인 gDNA와 50%로 spiking 하여 샘플을 준비하였다. 본 시험에 사용된 DNA양은 12 ng/sample 이며 모든 40개의 샘플들은 MMX1 내지 4와 각각 반응시켜 ddPCR을 수행하였다.40 standard reference materials were used to determine whether the EGFR IVD kit of the present invention could detect 42 mutation sites of
이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 3에 나타낸 바와 같이, MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR 변이들만 검출되었으며, 프로브를 포함한 mixturer간의 교차반응은 보이지 않았다. 도 3에서, NTC와 gDNA를 기준으로 cut-off를 설정하여 그 위로 나온 푸른색이나 녹색 droplet들이 검출되면 변이가 검출된 것이며, 도 3에서 각각의 푸른색 또는 녹색 droplet이 의미하는 변이의 종류를 도 1에 기재한 clone number로 표시하였다. As shown in FIG. 3, only the EGFR mutations detectable by
<실시예 6>≪ Example 6 >
EGFR IVD 키트를 이용한 reference FFPE DNA에서 돌연변이 검출Mutation detection in reference FFPE DNA using EGFR IVD kit
본 발명의 EGFR IVD 키트는 ddPCR에 적용이 가능하다. 한편, ddPCR의 장점은 qPCR과 달리 절대 정량이 가능하다는 것이다. 즉, 넣어준 DNA양을 genome equivalence (GE) 전환하여 DNA copy수를 계산할 수 있다. 따라서 정확한 mutation frequency를 갖고 있는 FFPET (Horizon, UK)를 사용하여 EGFR IVD kit의 성능을 증명하기 위해 ddPCR을 수행하였다.The EGFR IVD kit of the present invention is applicable to ddPCR. On the other hand, the advantage of ddPCR is that absolute quantification is possible, unlike qPCR. In other words, we can calculate the number of DNA copies by converting the amount of inserted DNA into genome equivalence (GE). Therefore, ddPCR was performed to demonstrate the performance of the EGFR IVD kit using FFPET (Horizon, UK) with an accurate mutation frequency.
Multi plex로 exon 19del, L858R, T790M 그리고 G719S를 포함하고 있는 Horizon reference FFPET를 사용하였고 기존에 있던 mutant frequency 뿐만 아니라 더 정확한 정량분석을 위해 각각 1/2로 희석하여 실험을 수행하였다.We used Horizon reference FFPET, which contains exon 19del, L858R, T790M and G719S as a multi-plex, and diluted to 1/2 as well as the existing mutant frequency for more accurate quantitative analysis.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 6에 나타낸 바와 같이, 실험 결과가 예상했던 카피수와 거의 일치하여 ddPCR based EGFR IVD kit가 매우 정확도가 높음을 증명하였다. 즉, 도 6의 X축이 FFPE 샘플의 tumor 함량을 나타내며, 그래프의 Y축이 본 발명의 EGFR IVD 키트로 검출한 돌연변이의 카피수를 나타낸다. 1000GE backgroud는 1000 copy를 의미하므로 각각의 FFPE 샘플이 포함하는 tumor %와 거의 일치하는 카피수를 본 발명의 EGFR IVD 키트가 검출해내고 있다는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, the results of the experiments showed that the ddPCR-based EGFR IVD kit was highly accurate. That is, the X axis in FIG. 6 represents the tumor content of the FFPE sample, and the Y axis of the graph represents the number of mutations detected by the EGFR IVD kit of the present invention. 1000GE backgroud means 1000 copies. Therefore, it can be seen that the EGFR IVD kit of the present invention detects a copy number almost identical to the tumor% contained in each FFPE sample.
상기한 결과를 통해, 카피수를 정량적으로 알 수 있는 reference FFPE로 각 해당하는 mutation frequency에 따라 EGFR IVD 키트는 반 정량적(semi-quantitation)으로 EGFR 돌연변이 분석이 가능한 키트라는 것을 확인할 수 있었다. Based on the above results, it can be confirmed that the EGFR IVD kit is a kit capable of EGFR mutation analysis by semi-quantitation according to each mutation frequency with a reference FFPE that can quantitatively determine the number of copies.
<실시예 7>≪ Example 7 >
cfDNA 또는 FFPE 샘플을 이용한 결과 비교Comparison of results using cfDNA or FFPE samples
혈액에서 cfDNA를 분리하여 ddPCR로 분석한 것과 같은 환자에서 얻은 FFPE 샘플을 이용하여 PNA 기법과 sanger sequencing 방법으로 수행 했을시 결과를 비교하였다. 즉, 상기 EGFR IVD 키트의 성능실험 중 Plasma에서 추출한 cfDNA를 검출할 수 있는지를 보기 위해 IRB로 협약된 지역병원에서 전이 (4기) 또는 재발 (병기없음)인 환자로부터 혈액을 채취하였다. 이미 병원에서는 이 환자들의 조직(FFPE)을 이용하여 PNA 또는 sequencing으로 검사하였으나 정확한 검사결과를 비교하기 위해 blind test로 진행하였다. We compared the results obtained with the PNA technique and the sanger sequencing method using FFPE samples obtained from patients such as ddPCR analysis of cfDNA isolated from blood. That is, blood samples were taken from a patient who had metastasis (stage 4) or recurrence (no stage) in a local hospital that was contracted with IRB to see if cfDNA extracted from Plasma could be detected during the performance test of the EGFR IVD kit. In the hospital, the patient's tissues (FFPE) were used for PNA or sequencing, but the blind test was performed to compare the results.
채취한 혈액은 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 1ml 정도의 plasma에서 QIAamp Circulating Nucleic acid kit를 이용하여 cfDNA를 분리하였다. 분리된 cfDNA는 평균 0.7ng/ul의 농도이며 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트로 검출하기 위해 이중 3ul를 사용하였다. 이는 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트는 약 2ng의 샘플량에서도 EGFR 변이 검출이 가능하다는 것을 보여주고 있다. The collected blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and cfDNA was isolated using a QIAamp Circulating Nucleic acid kit in 1 ml of plasma. The isolated cfDNA had an average concentration of 0.7 ng / ul and used double 3 ul for detection with the EGFR IVD kit according to the present invention. This shows that the EGFR IVD kit according to the present invention is capable of detecting EGFR mutation even at a sample amount of about 2 ng.
이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 8에 나타낸 바와 같이, 9명의 임상환자 샘플을 EGFR IVD 키트로 테스트해본 결과 cfDNA에서 검출된 EGFR 변이는 FFPE sample에서 검출된 EGFR 변이 결과와 일치하였다. 즉, 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트는 FFPE sample에서 뿐만 아니라 환자의 혈액에서 분리한 cfDNA에서도 EGFR 돌연변이의 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 8, a sample of nine clinical patients was tested with the EGFR IVD kit and the EGFR mutation detected in cfDNA was consistent with the EGFR mutation detected in the FFPE sample. That is, the EGFR IVD kit according to the present invention can detect EGFR mutations not only in the FFPE sample but also in the cfDNA isolated from the patient's blood.
뿐만 아니라, 기허가 받은 기존의 EGFR kit들은 한 반응 당 약 25~50 ng을 요구하지만 본 발명의 EGFR IVD 키트는 일반적으로 3 ng 또는 적게는 1.5 ng의 샘플에서도 EGFR 변이를 검출 할 수 있으므로 cfDNA에서 EGFR 변이를 검출하기에 적합한 키트임을 알 수 있다. In addition, although conventional EGFR-licensed kits require about 25-50 ng per reaction, the EGFR IVD kit of the present invention can detect EGFR mutations in samples of 3 ng or less than 1.5 ng, Lt; RTI ID = 0.0 > EGFR < / RTI >
<실시예 8>≪ Example 8 >
기허가 받은 제품과의 동등성 평가Assessment of equality with licensed products
IRB가 협약된 병원으로부터 임상샘플을 얻어 EGFR IVD kit의 성능을 증명하기 위해 기허가 받은 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)과 동등성 평가를 위해 ddPCR을 수행하였다.To obtain clinical samples from the hospitals to which the IRB was accorded and to demonstrate the performance of the EGFR IVD kit, ddPCR was performed for the equality test with the licensed product Cobas® EGFR kit (Roche Molecular Diagnostics).
이에 대한 결과를 도 9 및 하기 표 7에 나타내었다. The results are shown in Fig. 9 and Table 7 below.
도 9와 관련하여, X축은 샘플로 NTC, gDNA, PC 및 환자 샘플들이며 gDNA (negative control)를 기준으로 cut-off를 하면 그 이상으로 보이는 형광은 positive로 검출된 것으로 간주할 수 있다. With reference to FIG. 9, the X-axis is NTC, gDNA, PC, and patient samples as a sample, and cut-off based on gDNA (negative control) can be regarded as more positive than fluorescence seen above.
MMX1에서 초록색 표시는 샘플의 quality를 측정하는 것으로 PCR 반응 유뮤를 판단하며, MMX1에서 FAM 표시가 나는 샘플들은 exon 19del mutant를 나타내고 MMX2의 HEX는 T790M이 검출된 환자를 의미한다. The green color in MMX1 indicates the presence of the PCR reaction by measuring the quality of the sample. In the MMX1 sample, the FAM-labeled sample indicates the exon 19del mutant and the MMX2 HEX indicates the T790M-detected patient.
도 9 및 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, Cobas® EGFR kit로 검출하였을 때 exon 19 del 변이로 검출된 환자샘플을 이용하였으며, EGFR IVD 키트로 실험을 수행한 결과 모든 샘플에서 Cobas® EGFR kit로 검출 결과와 동일하게 exon 19 del mutation으로 검출되는 것을 확인하여, EGFR IVD 키트의 정확도가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다. As shown in FIG. 9 and Table 7, patient samples detected with
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다. As described above, the primer / probe set of the present invention is capable of predicting the reactivity of a cancer patient to a therapeutic agent, not only diagnosis but also cancer metastasis or recurrence, For the purpose of presenting clues and for monitoring the transfer or recurrence of cancer.
<110> Gencurix Inc. Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma <130> NP15-0029 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C1-F1) <400> 1 tgaggatctt atgcgaa 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C1-R1) <400> 2 ctgtgcatgc cagggacctt 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C5-F15) <400> 3 gatcccaatg cgaaggtgag aaa 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C5-R18) <400> 4 cagcatgcaa agcagaaact ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C29-F1) <400> 5 aaaattcccg tcgcaatatc aa 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C29-R1) <400> 6 aggttcagag caacatggac 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-F1) <400> 7 ccctccagat gcgaagcc 18 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R1) <400> 8 cagccgatgc aaggg 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-F18) <400> 9 atctgcctca catgcctc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R16) <400> 10 tttgtgttcc atgccata 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-F17) <400> 11 ccacactaat tgacgtgcc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R14) <400> 12 ggtggaaatt ggtgaggc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C44-F1) <400> 13 acaccgcagc aattatgtca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C44-R1) <400> 14 tgcctcatgc cttctgcatg 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP2-2) <400> 15 tcaaagtgct aatttccggt gc 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP3-3) <400> 16 aaaagatcaa agtatgcagc tccg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP4-3) <400> 17 aaaagatcaa agtgctgaat tccg 24 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP22-1) <400> 18 catgcctatc aaggaatcga aagcca 26 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP31-1) <400> 19 ccgtcatgct caagtatctc cgaaagcca 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP33-1) <400> 20 ccgtcgctaa tgcaattccg aaagccaaca 30 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP20) <400> 21 cgctatcaag gaaatgcaag ccaaca 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP26) <400> 22 ttccaattgc tatcaaggtt gctt 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP28) <400> 23 tcccgtcatg ctcgcaacat ctccga 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP15-) <400> 24 ttcccgtcgc taaatggagc aat 23 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP19) <400> 25 aggaaccaac atctaattaa gccaa 25 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP21) <400> 26 cgctatatgc gaatcatctc cgaaagc 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP32) <400> 27 cgctatcaaa atgccatctc cgaaagc 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP30) <400> 28 cgctaatgca attccaacat ctccgaa 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP35) <400> 29 caaggaacat gcgaaagcca acaagga 27 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP36) <400> 30 gcatctgcat gccctccacc gt 22 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP37-Y) <400> 31 catgagatgc atgatgagct gca 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP38-2) <400> 32 tacgtgaatg ccatcgtgga ca 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP40-2) <400> 33 tggacaaccc atgccacgtg t 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP41) <400> 34 cgtggacggt aacatggacg tgt 23 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP42-2) <400> 35 caattgtgga cagcgtgg 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP45) <400> 36 cacaatgctt gggcgggcca a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP46) <400> 37 ccaaacagat gctgcggaag a 21 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP47) <400> 38 gattttggat gcgccaaact gctg 24 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP47-3) <400> 39 ttttgggcgt gccccaaact g 21 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP29) <400> 40 agagaagcaa cccactcgat gtgagttt 28 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP46-3) <400> 41 tggccaacca cagctgggtg 20 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex19-B1) <400> 42 cgtcgctatc aaccggaatt aagagaagca 30 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex21-B1) <400> 43 gattttgggc tgccgccaaa ct 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex18-B1) <400> 44 aagtgctggg ccctccggtg 20 <110> Gencurix Inc. Seoul National University R & DB Foundation <120> Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma <130> NP15-0029 <160> 44 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C1-F1) <400> 1 tgaggatctt atgcgaa 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer (C1-R1) <400> 2 ctgtgcatgc cagggacctt 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C5-F15) <400> 3 gatcccaatg cgaaggtgag aaa 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C5-R18) <400> 4 cagcatgcaa agcagaaact ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C29-F1) <400> 5 aaaattcccg tcgcaatatc aa 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C29-R1) <400> 6 aggttcagag caacatggac 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-F1) <400> 7 ccctccagat gcgaagcc 18 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-R1) <400> 8 cagccgatgc aaggg 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-F18) <400> 9 atctgcctca catgcctc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-R16) <400> 10 tttgtgttcc atgccata 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-F17) <400> 11 ccacactaat tgacgtgcc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C36-R14) <400> 12 ggtggaaatt ggtgaggc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C44-F1) <400> 13 acaccgcagc aattatgtca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (C44-R1) <400> 14 tgcctcatgc cttctgcatg 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP2-2) <400> 15 tcaaagtgct aatttccggt gc 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP3-3) <400> 16 aaaagatcaa agtatgcagc tccg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP4-3) <400> 17 aaaagatcaa agtgctgaat tccg 24 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP22-1) <400> 18 catgcctatc aaggaatcga aagcca 26 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP31-1) <400> 19 ccgtcatgct caagtatctc cgaaagcca 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP33-1) <400> 20 ccgtcgctaa tgcaattccg aaagccaaca 30 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP20) <400> 21 cgctatcaag gaaatgcaag ccaaca 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP26) <400> 22 ttccaattgc tatcaaggtt gctt 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP28) <400> 23 tcccgtcatg ctcgcaacat ctccga 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP15-) <400> 24 ttcccgtcgc taaatggagc aat 23 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP19) <400> 25 aggaaccaac atctaattaa gccaa 25 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP21) <400> 26 cgctatatgc gaatcatctc cgaaagc 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP32) <400> 27 cgctatcaaa atgccatctc cgaaagc 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP30) <400> 28 cgctaatgca attccaacat ctccgaa 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP35) <400> 29 caaggaacat gcgaaagcca acaagga 27 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP36) <400> 30 gcatctgcat gccctccacc gt 22 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP37-Y) <400> 31 catgagatgc atgatgagct gca 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP38-2) <400> 32 tacgtgaatg ccatcgtgga ca 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP40-2) <400> 33 tggacaaccc atgccacgtg t 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP41) <400> 34 cgtggacggt aacatggacg tgt 23 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP42-2) <400> 35 caattgtgga cagcgtgg 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP45) <400> 36 cacaatgctt gggcgggcca a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP46) <400> 37 ccaaacagat gctgcggaag a 21 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP47) <400> 38 gattttggat gcgccaaact gctg 24 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP47-3) <400> 39 ttttgggcgt gccccaaact g 21 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP29) <400> 40 agagaagcaa cccactcgat gtgagttt 28 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (EP46-3) <400> 41 tggccaacca cagctgggtg 20 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (E-ex19-B1) <400> 42 cgtcgctatc aaccggaatt aagagaagca 30 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (E-ex21-B1) <400> 43 gattttgggc tgccgccaaa ct 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (E-ex18-B1) <400> 44 aagtgctggg ccctccggtg 20
Claims (18)
i) the forward primer of SEQ ID NO: 9, ii) the reverse primer of SEQ ID NO: 10, iii) the forward primer of SEQ ID NO: 13, iv) the reverse primer of SEQ ID NO: 14 and v) (EGFR), which is used for qPCR (quantitative PCR) or digital PCR method, is used as a template and a cell-free DNA (cfDNA) separated from blood is contained as an active ingredient in a set of polynucleotides of probes. ) ≪ / RTI > primer and probe set composition for detecting gene mutation.
The primer and probe set composition according to claim 1, wherein the EGFR mutation detection is for predicting the responsiveness to an EGFR inhibitor.
3. The primer and probe set composition of claim 2, wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of erlotinib, gefitinib, and Afatinib.
2. The primer and probe set composition according to claim 1, wherein the probe is bound to a fluorescent material.
5. The primer and probe set composition according to claim 4, wherein the fluorescent material is at least one selected from the group consisting of HEX (hexachlorofluorescein), FAM (fluorescein amidite) and EverGreen dye.
A research use only (RUO) kit for detecting EGFR gene mutation comprising the primer and probe set composition of claim 1 as an active ingredient.
An IVD (investigation use only) kit for detecting EGFR gene mutation comprising the primer and probe set composition of claim 1 as an active ingredient.
A reverse primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14, a reverse primer of SEQ ID NO: 14, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31, 36 and 39 A kit for detecting mutations in EGFR gene using qPCR (quantitative PCR) or digital PCR using a cell-free DNA (cfDNA) isolated from blood as a template.
9. The kit of claim 8, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NO: 43.
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 32 내지 35 및 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition comprises a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 7, an inverted primer of SEQ ID NO: 8 and a group of SEQ ID NOs: 18 to 21, 23 and 30 A polynucleotide set of selected probes;
A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2, the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NOs: 15 to 17 and 40; And
A forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14, and a set of polynucleotides of probes selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 32 to 35 and 41 A primer and probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation in a sample, wherein the composition further comprises at least one set of polynucleotides.
A research use only (RUO) kit for detecting EGFR gene mutation comprising the primer and probe set composition of claim 10 as an active ingredient.
An IVD (investigation use only) kit for detecting EGFR gene mutation comprising the primer and probe set composition of claim 10 as an active ingredient.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150101915A KR101800366B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150101915A KR101800366B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170009603A KR20170009603A (en) | 2017-01-25 |
| KR101800366B1 true KR101800366B1 (en) | 2017-11-22 |
Family
ID=57991242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150101915A KR101800366B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101800366B1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102267326B1 (en) | 2020-03-24 | 2021-06-22 | 주식회사 젠큐릭스 | Method and kit for detecting coronavirus |
| KR20220102595A (en) | 2021-01-13 | 2022-07-20 | 에이비온 주식회사 | Prophylactic administration for respiratory virus comprising administrating interferon beta to a subject potentially infected by respiratory virus |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017204577A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 주식회사 젠큐릭스 | Composition for detecting epidermal cell growth factor receptor gene mutation, and kit comprising same |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140272953A1 (en) * | 2013-03-08 | 2014-09-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | EGFR Mutation Blood Testing |
| US20140288116A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Classification and Actionability Indices for Lung Cancer |
-
2015
- 2015-07-17 KR KR1020150101915A patent/KR101800366B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140272953A1 (en) * | 2013-03-08 | 2014-09-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | EGFR Mutation Blood Testing |
| US20140288116A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Classification and Actionability Indices for Lung Cancer |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf12/P120019c.pdf |
| Roma C., et al., BioMed Research International, Volume 2013, Article ID 385087, 9 pages (2013)* |
| Wang H, et al., the Journal of Molecular Diagnostics, Vol.15(1), pp.62-69, (2013. 1.) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102267326B1 (en) | 2020-03-24 | 2021-06-22 | 주식회사 젠큐릭스 | Method and kit for detecting coronavirus |
| KR20220102595A (en) | 2021-01-13 | 2022-07-20 | 에이비온 주식회사 | Prophylactic administration for respiratory virus comprising administrating interferon beta to a subject potentially infected by respiratory virus |
| WO2022154542A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | 에이비온 주식회사 | Prophylactic administration method against respiratory virus, comprising administering interferon-beta to potential respiratory virus-infected subject |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170009603A (en) | 2017-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Han et al. | Detection of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma specimens with different proportions of tumor cells using two methods of differential sensitivity | |
| US10968487B2 (en) | Oligonucleotides and methods for detecting KRAS and PIK3CA mutations | |
| CN110964814A (en) | Primers, compositions and methods for nucleic acid sequence variation detection | |
| KR101800366B1 (en) | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma | |
| KR102449693B1 (en) | The composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene(EGFR) and the EGFR mutation kit consisting of the compounds | |
| US20180187267A1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
| KR102600344B1 (en) | Composition for detecting mutations of KRAS gene and kit comprising the same | |
| CA2854659C (en) | Novel complex mutations in the epidermal growth factor receptor kinase domain | |
| KR101582944B1 (en) | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same | |
| KR20190038464A (en) | The composition for detecting mutations of RAS/BRAF and the kit consisting of the compounds | |
| Su et al. | Sensitive and selective detections of codon 12 and 13 KRAS mutations in a single tube using modified wild-type blocker | |
| KR102600347B1 (en) | Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same | |
| KR102353064B1 (en) | Composition for detecting copy number variation of HER2 and kit comprising the same | |
| EP3204510B1 (en) | Mutations in the epidermal growth factor receptor kinase domain | |
| KR101587939B1 (en) | Automated system for diagnosing responsiveness of treatment for lung cancer drug | |
| KR101850495B1 (en) | Method for diagnosing responsiveness of second line treatment for cancer patients using circulating tumor cells | |
| KR101778789B1 (en) | Method for diagnosing responsiveness of second line treatment for cancer patients using circulating tumor cells | |
| KR20210120737A (en) | The composition for detecting mutations of PIK3CA and the kit consisting of the compounds | |
| Ratna | Ultrasensitive molecular profiling of EGFR mutations in glioblastoma multiforme using a rapid & high-resolution digital PCR approach | |
| CN105506140A (en) | ROS1 fusion gene ARMS fluorescent quantitative PCR typing detection kit | |
| CN114774539A (en) | Primer, probe and kit for detecting polygene variation of colorectal cancer and application of primer, probe and kit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20150717 |
|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20150729 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20150717 Comment text: Patent Application |
|
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| PA0302 | Request for accelerated examination |
Patent event date: 20150820 Patent event code: PA03022R01D Comment text: Request for Accelerated Examination Patent event date: 20150717 Patent event code: PA03021R01I Comment text: Patent Application |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150908 Patent event code: PE09021S01D |
|
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20160316 Patent event code: PE09021S01D |
|
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20161027 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20160316 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I Patent event date: 20150908 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |
|
| AMND | Amendment | ||
| PX0901 | Re-examination |
Patent event code: PX09011S01I Patent event date: 20161027 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX09012R01I Patent event date: 20160816 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX09012R01I Patent event date: 20160108 Comment text: Amendment to Specification, etc. |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170117 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PX0701 | Decision of registration after re-examination |
Patent event date: 20170828 Comment text: Decision to Grant Registration Patent event code: PX07013S01D Patent event date: 20161226 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20161027 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX07011S01I Patent event date: 20160816 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20160108 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I |
|
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20171116 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20171116 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200925 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20211115 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20231030 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240930 Start annual number: 8 End annual number: 8 |