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KR101795999B1 - Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체 - Google Patents

Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체 Download PDF

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KR101795999B1
KR101795999B1 KR1020150136069A KR20150136069A KR101795999B1 KR 101795999 B1 KR101795999 B1 KR 101795999B1 KR 1020150136069 A KR1020150136069 A KR 1020150136069A KR 20150136069 A KR20150136069 A KR 20150136069A KR 101795999 B1 KR101795999 B1 KR 101795999B1
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KR
South Korea
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crispr
primer
beta
gene
microglobulin
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KR1020150136069A
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신명근
최현정
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전남대학교산학협력단
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Publication date
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Abstract

본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법 및 이에 사용되는 시발체는 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 선택적으로 정확히 제거되도록 특별히 디자인됨으로써, 비표적 유전자에는 영향을 주지 않으면서 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거되어 제거 효율이 현저하게 향상되는 효과가 있다.

Description

CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체{Primer for Beta2-Microglobulin gene remove using CRISPR/CAS9 system}
본 발명은 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체(Primer)에 관한 것이다.
1970년대 DNA의 특정 서열을 인지해 자르는 제한효소가 발견될 것을 시작으로 유전자 조작기술은 시대에 시대를 거듭하여 급격하게 발전해 왔다. 하지만 제한효소를 활용한 유전자 조작기술은 그 한계가 명확했다. 구체적으로, 제한효소는 6~8 개 정도의 인식할 수 있는 유전자 서열의 길이가 매우 짧아, 약 46(4,096) 개의 순서쌍 밖에 구분하지 못하는 문제가 존재했다. 반면에 CRISPR/CAS9 시스템은 이러한 한계가 없어 이론적으로 인간 이상의 고등 생명체에도 적용 가능하다.
CRISPR/CAS9 시스템은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 nuclease로 구성된다. 이러한 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드(Plasmid) DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃(knock-out)이 가능하다.
CRISPR/CAS9 시스템은 불과 몇 년 전에 과학자들에 의해 발견된 것으로, 박테리아 등 단세포 유기체가 박테리오파지로부터 스스로를 지키는 아주 오래된 방법이다. 유기체가 박테리오 파지의 DNA를 잘라 자신의 유전자에 붙여 기억하여 적응면역을 통해 살아남는 것으로 수백만 년에 걸쳐 진화되었고, 이것이 연구실에서 유기체의 DNA를 빠르게 편집할 수 있는 간단하고 명쾌한 방법으로 연구되었다.
구체적으로, 본래의 CRISPR/CAS9 시스템은 박테리아가 이전에 침입했던 바이러스의 DNA 일부를 자신의 유전체에 저장해둔 후, 바이러스가 침입할 때에 그 정보를 다시 꺼내어 바이러스 DNA만을 찾아 절단하는 데 쓰는 박테리아의 자기보호 메커니즘이다. 이를 유전체공학에 이용함으로써, 특정 유전자의 염기서열을 찾아가는 시발체(Primer)를 제작해 절단 효소인 Cas9 효소와 짝을 이루어 표적이 되는 DNA 염기서열에 달라붙어 DNA 절단이 일어난다. 따라서 DNA 복원(수선) 과정에서 돌연변이가 발생하게 된다.
따라서 CRISPR/CAS9 시스템이 발견되기 전까지 DNA 편집은 정교한 연구실, 다년간의 경험, 막대한 금액이 있어야 가능하여 실질적으로 적용할 수 있는 범위가 매우 작은 문제가 있었으나, CRISPR/CAS9 시스템에 의해 이러한 문제가 획기적으로 해결되었다.
이에 따라 CRISPR/CAS9 시스템은 줄기세포 및 체세포에서 유전병의 원인이 되는 돌연변이를 교정하거나 항암 세포치료제를 개발하는 도구가 될 것으로 큰 기대를 모으고 있다.
따라서 CRISPR/CAS9 시스템은 비용이 저렴하고 사용이 용이하여 유전학 연구의 혁명이라 할 정도로 수백 수천 개의 연구소에서 크리스퍼 편집 프로젝트가 수행되고 있다. 대규모 연구기관들에서는 크리스퍼 관련 특허를 점진적으로 쌓아가고 있으며, 공공 부문과 민간 부문에서 또한 크리스퍼 프로젝트로 연구비로 막대한 예산을 투자하고 있다.
그러나 아직까지는 CRISPR/CAS9 시스템을 실제로 인체에 적용하기에 여러 가지 문제들을 갖고 있다. 예컨대 CRISPR/CAS9 시스템을 인체에 실질적으로 활용하기 위해서는 안전성이 매우 중요하며, 구체적으로 표적 유전자가 확실히 제거되어야 하며, 표적 유전자 외의 유전자는 영향을 받지 않아야 한다. 이는 CRISPR/CAS9 시스템이 표적 유전자의 염기서열과 유사한 비표적 염기서열에도 변이를 일으킬 가능성이 있기 때문이며, 이러한 가능성에 의해 예상치 못한 돌연변이 또는 예상 불가능한 치명적인 문제가 발생할 수 있는 위험 또는 잠재적 위험이 제거되어야 함을 의미한다.
특히 표적 유전자에만 특이적이면서 정교하게 유전자를 편집하기 위한 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 기술은 복잡하고 어려운 상황에 있다. 따라서 종양을 포함한 인체 질병의 원인 기전을 밝히는 연구, 나아가 인체에 전반적으로 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하기 위해서는 표적 유전자에만 특이적이면서 정교하게 적용되어야 한다.
그러므로 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하여 베타2-마이크로글로불린(Beta2-microglobulin, B2MG) 유전자를 규명하거나, 나아가 궁극적으로 다른 유전자 서열에는 영향을 주지 않고 베타2-마이크로글로불린 유전자가 발현되지 못하도록 하기 위해서는 이에 적합하도록 특별히 디자인된 시발체 및 상기 시발체에 적합한 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 조건이 필요하다.
한국공개특허 KR2015-0091052A (2015.08.07)
상기의 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거되는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 비표적 유전자에는 영향을 주지 않으면서, 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만을 특이적으로 정확하게 제거되는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 시발체(Forward primer)인 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린(Beta2-Microglobulin) 유전자 제거용 시발체를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 2의 역방향 시발체(Reverse primer)인 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 1 및 2의 시발체를 CRISPR/CAS9 시스템이 적용된 플라스미드 내에 삽입하는 단계, b) 상기 a) 단계의 시발체가 삽입된 플라스미드를 수용성 세포(Competent cell)에 형질전환(Transformation)하는 단계 및 c) 상기 b) 단계의 형질전환된 수용성 세포를 대상 세포에 형질주입(Transfection)하여 베타2-마이크로글로불린 유전자를 제거하는 단계를 포함하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 예에 있어서, CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 포함하는 표적 치료제, 분석 키트 또는 유전자 제거 키트 등을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체는 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 선택적으로 정확히 제거되도록 특별히 디자인됨으로써, 비표적 유전자에는 영향을 주지 않으면서 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거되어 제거 효율이 현저하게 향상되는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 본 발명의 서열번호 1 및 2의 시발체가 플라스미드에 삽입되었음을 전기영동밴드 및 직접염기서열 분석을 통해 측정한 결과와 상기 플라스미드를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에 따른 형질주입된 대상 세포를 Western blot으로 측정하여 베타2-마이크로글로불린 유전자의 제거 효율(Relative intensity of band)을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1(B2M), 비교예 1(B2M-2), 비교예 2(B2M-3), 비교예 3(B2M-4) 및 비교예 4(B2M-5)에 따른 형질주입된 대상 세포를 Western blot으로 측정하여 베타2-마이크로글로불린 유전자의 제거 효율(Relative intensity of band)을 나타낸 도면이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 상세히 설명한다.
본 발명에 기재되어 있는 도면은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명에서 특별한 언급 없이 불분명하게 사용된 %의 단위는 중량%를 의미한다.
종래까지는 CRISPR/CAS9 시스템을 실제로 인체에 적용하기에는 여러 가지 문제들을 갖고 있으며, 예컨대 CRISPR/CAS9 시스템이 표적 유전자의 염기서열과 유사한 비표적 염기서열에도 변이를 일으킬 가능성이 있으며, 특히 표적 유전자에만 특이적이면서 정교하게 유전자를 제거하기 어려운 문제가 따른다.
이에 따라 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여, CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 유전자 제거, 즉, 표적 유전자만을 선택적으로 정확히 제거하여 녹-아웃(knock-out)시켜 표적 유전자에 의한 특성의 발현을 효과적으로 억제하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린(Beta2-Microglobulin) 유전자 제거 방법 및 이에 사용되는 시발체(Primer)를 제공하는 것이다. 따라서 표적 유전자만이 선택적으로 정확히 제거되도록 상기 시발체를 특별이 디자인함으로써, 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 효율이 현저히 향상되는 효과가 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법은 a) 서열번호 1 및 2의 시발체를 CRISPR/CAS9 시스템이 적용된 플라스미드 내에 삽입하는 단계, b) 상기 a) 단계의 시발체가 삽입된 플라스미드를 수용성 세포(Competent cell)에 형질전환(Transformation)하는 단계 및 c) 상기 b) 단계의 형질전환된 수용성 세포를 대상 세포에 형질주입(Transfection)하여 베타2-마이크로글로불린 유전자를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1의 정방향 시발체(Forward primer)는 CACCGACCCAGACACATAGCAATTC이다.
본 발명의 서열번호 2의 역방향 시발체(Reverse primer)는 AAACGAATTGCTATGTGTCTGGGTC이다.
본 발명의 일 예에 있어서, 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호2의 역방향 시발체는 베타2-마이크로글로불린 염기서열의 일 부분과 상보적인 염기서열을 하나 또는 둘 이상이 포함된 것일 수 있다. 일반적인 분자생물공학에 있어서, 대상되는 유전자의 상보적인 염기서열을 무작위 또는 임의적으로 디자인된 시발체를 사용할 경우, 인식 및 작용이 가능하므로 문제되지 않을 수 있지만, CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법의 경우에는 상술한 바와 같이, 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거되기 어려운 문제가 존재한다. 하지만 본 발명의 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호2의 역방향 시발체는 모두 CRISPR/CAS9 시스템에 적용됨으로써, 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거될 수 있는 효과가 있다. 뿐만 아니라 비표적 유전자에는 영향을 주지 않으므로, 예컨대 유사한 비표적 염기서열에도 변이를 일으키지 않아 안정성이 현저히 향상되는 효과가 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체는 상기 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법에 적용됨으로써, 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만을 선택적으로 정확히 제거하여 녹-아웃(knock-out)시켜 베타2-마이크로글로불린 유전자에 의한 특성의 발현이 억제되게 된다. 따라서 베타2-마이크로글로불린 유전자에 의한 특성의 역할을 규명하는 데에 적극적으로 이용될 수 있으며, 나아가 궁극적으로 예컨대 종양에서 베타2-마이크로글로불린 표적 치료제 개발에 적용 및 응용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 포함하는 표적 치료제, 분석 키트 또는 유전자 제거 키트 등을 예시할 수 있으며, 본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법을 포함하는 유전자 치료 방법(종양 치료 방법 등)을 예시할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 a) 단계의 플라스미드는 CRISPR/CAS9 시스템이 적용(조작)된 플라스미드라면 제한되지 않으며, 예컨대 도 1에 표시되는 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 등이 예시될 수 있다. 상기 도 1의 플라스미드가 본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법에 사용될 경우, 본 발명의 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체가 상기 a) 단계에서 플라스미드 내에 보다 정확하게 삽입될 수 있으며, 이후 상기 b) 단계에서 플라스미드를 포함하는 수용성 세포만을 선택 분별하여 효과적으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라, 이후 c) 단계에서 대상 세포에 형질주입 효율이 보다 향상될 수 있어 바람직하다. 하지만 이는 바람직한 일 예일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 c) 단계의 대상 세포는 베타2-마이크로글로불린 유전자 서열을 포함하는 것이거나, 베타2-마이크로글로불린 유전자에 의한 특성을 가지는 것이거나, 상기 특성의 유무를 식별하기 위한 대상이 되는 것이거나 또는 생체모델로서 특성 및 역할 규명 등의 연구에 사용되는 것이라면 제한되지 않으며, 예컨대 인체 유래 대장암세포주(HCT-116 등)가 예시될 수 있다.
이하 본 발명의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법을 상세히 설명하나, 하기에 기재되는 단계 또는 과정이 본 발명에 제한 해석되지 않음은 물론이다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 a) 단계는 서열번호 1 및 2의 시발체를 CRISPR/CAS9 시스템이 적용된 플라스미드 내에 삽입하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적인 일 예로, 상기 a) 단계는 a1) 제한효소로 플라스미드의 일 부분을 절단하여 분리하는 단계, a2) 상기 일 부분이 절단되어 분리된 플라스미드를 탈인산화하는 단계 및 a3) 서열번호 1 및 2의 시발체들을 어닐링(Annealing)하여 상기 탈인산화된 플라스미드에 리게이션(ligation)하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 b) 단계는 상기 a) 단계의 시발체가 삽입된 플라스미드를 수용성 세포에 형질전환하는 단계를 포함할 수 있다. 이렇게 본 발명의 시발체들이 삽입된 플라스미드를 수용성 세포에 형질전환시킴으로써, 이후, c) 단계의 대상 세포에 형질전환이 가능하게 한다. 또한 상기 b) 단계에 의해 상기 플라스미드를 포함하는 수용성 세포를 배양 등의 과정을 거쳐 증폭시킬 수 있다. 뿐만 아니라 추가적으로 감염주를 이용하여 상기 수용성 세포를 상기 감염주의 면역 특성을 발현시키는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 선택 분별하는 단계를 더 거쳐 효과적으로 상기 플라스미드를 포함하는 수용성 세포를 수득할 수 있다. 또한 이후 c) 단계의 대상 세포에 상기 플라스미드를 형질주입하는 단계에 의해 베타2-마이크로글로불린 유전자가 제거됨으로써, 대상 세포 또는 대상 세포를 포함하는 생물체의 베타2-마이크로글로불린에 의한 직/간접적인 특성 발현을 억제할 수 있다.
구체적인 일 예로, 상기 b) 단계와 상기 c) 단계 사이, 플라스미드로 형질전환된 세포를 선택 분별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대 카르베니실린(Carbenicillin) 등의 감염주를 이용하여 상기 감염주의 면역 특성을 발현시키는 유전자 서열을 포함하도록 미리 플라스미드를 사용함으로써, 본 발명의 시발체들이 삽입된 플라스미드를 포함하는 수용성 세포를 선택적으로 선별 및 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 c) 단계는 대상 세포 내에 플라스미드를 형질주입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 시발체들이 삽입된 플라스미드를 대상 세포에 형질주입하기 위한 방법은 공지된 다양한 방법이 있으므로, 제한되지 않고 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체와 상기 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법에 이용될 경우, 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 선택적으로 정교하게 제거될 수 있다. 예컨대 다양한 인체 유래 세포주 및 제브라피쉬 등의 생체 모델에서 베타2-마이크로글로불린의 역할을 규명하는데 이용할 수 있으며, 나아가 궁극적으로 종양, 암 등의 표적 대상의 베타2-마이크로글로불린 표적 치료제 개발(베타2-마이크로글로불린 유전자 표적 치료제, 유전자 제거 키트, 유전자 분석 키트 등)에도 적용 및 응용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
BbsI 제한효소를 이용하여 플라스미드(pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9)의 상기 제한효소가 적용되는 부위를 절단한 후 분리하였다. 구체적으로, NEB buffer 2.1 2 ㎕, BbsI 1 ㎕, plasmid 5.1 ㎕ 및 증류수(Distilled water, DW) 11.9 ㎕를 37℃에서 2 시간 동안 배양한 후, 전기영동(1 ㎕ loading)으로 확인한 다음, 상용화된 키트(Kit)를 이용하여 PCR purification 시행하였다.
다음, 분리된 플라스미드 DNA(DNA of plasmid)를 탈인산화하였다. 구체적으로, DNA of plasmid 17 ㎕, Shrimp alkaline phosphatase(SAP) 1 ㎕, SAP 10x buffer 2 ㎕를 37℃에서 5 분 동안 반응시킨 후, 65℃에서 5 분 동안 반응시키는 조건으로 수행하였다.
다음, 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체를 어닐링(Annealing)하였다. 구체적으로, 각각의 시발체 1 ㎕, H+ buffer 3 ㎕, 증류수 45 ㎕를 100℃에서 3 분 동안 반응시킨 후, 70℃에서 5분 동안 반응시키는 조건으로 수행하였다.
다음, 분리된 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9에 어닐링된 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체를 삽입(Ligation)하였다. 구체적으로, DNA of plasmid １ ㎕, 각각의 시발체 0.5 ㎕ , 1.5 μL EB buffer, Mighty Mix 3 ㎕를 상온에서 12 분 동안 반응시키는 조건으로 수행하였다.
다음, 시발체가 삽입된 플라스미드 DNA를 수용성 세포(Competent cell)에 형질전환(Transformation)하였다. 구체적으로, DHα competent cell 50 ㎕에 시발체가 삽입된 플라스미드 DNA를 6 ㎕씩 분주 후, 얼음에서 20 분 동안 반응시킨 후, 42℃ 물수조에서 90초 동안 반응시킨 후, 얼음에서 2분 동안 반응시키는 조건으로 수행하였다. 이어서 LB broth 150 ㎕를 분주한 다음, 37℃ 물수조에서 30 분 동안 배양하였다. 이어서 카르베니실린(Carbenicillin)이 함유된 LB 고체 배지에 상기 배양된 혼합액을 150 ㎕씩 bead rolling하여 spreading한 다음, 37℃ 배양기에서 12 시간동안 배양하였다. 이어서 상기 고체 배지에서 8 개의 콜로니(Colony)를 선택하여, 각각을 카르베니실린이 함유된 LB broth(LB broth 40 ㎖, carbenicillin 40 ㎕)에 풀어준 뒤, 37℃ shaker 배양기에서 12 시간 동안 배양하였다. 또한 상기 배양된 혼합액에서 Plasmid DNA를 추출한 후, 형질전환이 제대로 되었는지 전기영동및 직접염기서열 분석을 통하여 측정하였다. 구체적으로, 제한효소 XbaI과 SacII로 자른 후 전기영동상 밴드를 확인(7117bp/1392bp)하였으며, 이의 결과는 도 1이 도시되어 있다.(조건: NEB buffer 1 ㎕, BSA (10x) 1 ㎕, XbaI 0.4 ㎕, Sac II 0.4 ㎕, DNA of plasmid 1 ㎕, 증류수 6.2 ㎕를 37℃에서 1 시간 동안 반응)
다음, 인체 유래 대장암세포주(HCT-116)를 대상 세포로 하여 형질주입(Transfection)한 후, Western blot으로 베타2-마이크로글로불린 유전자가 제대로 제거되었는지 확인하였으며, 이의 결과는 도 2 및 도 3에 도시되어 있다.
구체적으로, 상기 형질주입 방법은 다음과 같다. 냉동 보관된 HCT-116 Cell stock을 37℃ water bath에서 해동하여 DMEM 배지(10% FBS (HyClone, GE Healthcare Life Science, Logan, USA), 1% P/S) 4 ㎖에 해첨가한 후 1,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 다시 DMEM 배지 10 ㎖를 첨가하여 100 mm dish에 12 시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거한 후 PBS로 세척(Washing)하고, 0.5% trypsin 2 ㎖를 첨가한 후 인큐베이터(5% CO2 incubator에서 37℃)에 5 분 동안 반응 시킨 다음, DMEM 배지 4 ㎖를 첨가하여 1000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 새로운 DMEM 배지 7 ㎖를 첨가하여 cell counting 한 후, 60 mm dish tissue culture plate에 3×106/㎖ (confluence 80 %) 농도의 HCT-116 cell을 분주한 다음 인큐베이터(5% CO2 incubator에서 37℃)에서 12 시간 동안 배양하였다. 배양된 cell의 배지를 P/S(antibiotics)가 없고 FBS만 첨가된 DMEM 배지 4 ㎖로 교체하였다. Plasmid DNA, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 및 OPTI-MEM(Thermo Fisher Scientific)을 준비한 후, 두 개의 EP tube 각각에 OPTI-MEM 배지 500 ㎕씩 분주한 다음 1번 tube에는 20 ㎕의 Lipofectamin 2000을, 2번 tube에는 8 ㎍의 plasmid DNA을 넣어 mixture를 만든 후, 1번 mixture를 2번 mixture tube에 첨가하여 혼합하였다. 최종 mixture는 실온에서 25 분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 mixture를 상기 DMEM 배지 4 ㎖로 교체된 배양된 cell의 tissue culture plate에 조금씩 투하하여 첨가한 후, 인큐베이터(5% CO2 incubator에서 37℃)에서 18 시간 이상 배양하여 Western blot으로 베타2-마이크로글로불린 유전자가 제대로 제거되었는지 확인하였다.
[비교예 1]
실시예 1에서 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체 대신 각각 베타2-마이크로글로불린 염기서열의 일 부분과 상보적인 염기서열을 포함하는 서열번호 3의 정방향 시발체(CACCGCATACTCATCTTTTTCAGT)를 및 서열번호 4의 역방향 시발체(AAACACTGAAAAAGATGAGTATGC)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하였으며, 이의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
[비교예 2]
실시예 1에서 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체 대신 각각 베타2-마이크로글로불린 염기서열의 일 부분과 상보적인 염기서열을 포함하는 서열번호 5의 정방향 시발체(CACCGCTACTCTCTCTTTCTGGCC)를 및 서열번호 6의 역방향 시발체(AAACGGCCAGAAAGAGAGAGTAGC)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하였으며, 이의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
[비교예 3]
실시예 1에서 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체 대신 각각 베타2-마이크로글로불린 염기서열의 일 부분과 상보적인 염기서열을 포함하는 서열번호 7의 정방향 시발체(CACCGACATGTAAGCAGCATCATGG)를 및 서열번호 8의 역방향 시발체(AAACCCATGATGCTGCTTACATGTC)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하였으며, 이의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
[비교예 4]
실시예 1에서 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체 대신 각각 베타2-마이크로글로불린 염기서열의 일 부분과 상보적인 염기서열을 포함하는 서열번호 9의 정방향 시발체(CACCGTGTTTGATGTATCTGAGCAG)를 및 서열번호 10의 역방향 시발체(AAACCTGCTCAGATACATCAAACAC)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하였으며, 이의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 본 발명의 서열번호 1 및 2의 시발체가 플라스미드에 삽입되었음을 전기영동밴드 및 직접염기서열 분석을 통해 측정한 결과와 상기 플라스미드를 나타낸 것으로, CRISPR/CAS9 시스템이 적용된 플라스미드에 본 발명의 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체가 제대로 삽입되었음을 확인할 수 있다.
도 2는 실시예 1에 따른 형질주입된 대상 세포를 Western blot으로 측정하여 베타2-마이크로글로불린 유전자의 제거 효율(Relative intensity of band)을 나타낸 것으로, 베타2-마이크로글로불린 유전자가 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있다.
도 3은 실시예 1(B2M), 비교예 1(B2M-2), 비교예 2(B2M2-3), 비교예 3(B2M-4) 및 비교예 4(B2M-5)에 따른 형질주입된 대상 세포를 Western blot으로 측정하여 베타2-마이크로글로불린 유전자의 제거 효율(Relative intensity of band)을 나타낸 것으로, 대상되는 유전자의 상보적인 염기서열을 무작위 또는 임의적으로 디자인된 일반적인 시발체를 사용할 경우, Relative intensity of band의 값이 본 발명의 시발체를 사용한 경우에 비하여 약 2 배 정도 차이나는 것을 알 수 있으며, 이로부터 일반적으로 디자인된 시발체를 사용할 경우 표적 유전자인 베타2-마이크로글로불린 유전자만이 특이적으로 정확하게 제거되지 않는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
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Claims (7)

  1. 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체를 포함하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체.
  2. 삭제
  3. a) 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체를 CRISPR/CAS9 시스템이 적용된 플라스미드 내에 삽입하는 단계,
    b) 상기 a) 단계의 시발체가 삽입된 플라스미드를 수용성 세포에 형질전환하는 단계 및
    c) 상기 b) 단계의 형질전환된 수용성 세포를 인체로부터 분리된 대상 세포에 형질주입하여 베타2-마이크로글로불린 유전자를 제거하는 단계를 포함하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 포함하는 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거 키트.
  6. 제1항의 CRISPR/CAS9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체를 포함하는 유전자 분석 키트.
  7. 삭제
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