KR101794836B1

KR101794836B1 - 당귀, 천궁 및 육계를 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상의 개선을 위한 조성물

Info

Publication number: KR101794836B1
Application number: KR1020170037152A
Authority: KR
Inventors: 조형권; 김혜수; 김성연; 장보윤; 전창현; 김대성; 유진주; 김효진; 김정영; 이진욱
Original assignee: 유한회사한풍제약
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: KR20170116948A

Abstract

본 발명은 당귀, 천궁 및 육계를 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상의 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하되, 50~200 mg/kg/day (마우스 5주령 경구투여 기준) 투여함으로써 갱년기 증상을 개선할 수 있는 효능을 보유한 조성물에 관한 것이다.

Description

당귀, 천궁 및 육계를 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상의 개선을 위한 조성물{A COMPOSITION OF ANGELICAE GIGANTIS RADIX, CNIDII RHIZOMA AND CINNAMOMI CORTEX FOR TREATING MENOPAUSE AND PARTIAL ANDROGEN DEFICIENCY IN AGING MALE}

본 발명은 당귀, 천궁 및 육계를 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상의 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은, 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하되, 50~200 mg/kg/day (마우스 5주령 경구투여 기준) 투여함으로써 갱년기 증상을 개선할 수 있는 효능을 보유한 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 갱년기(climacteric)란 내분비 증후군의 일종으로 난소기능의 전반적이고 점진적인 감소가 일어나 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 과도기를 말하며, 갱년기의 한 과정으로 난소기능의 정지 후에 일어나는 생리의 영구적인 정지인 폐경(menopause)이 오게 된다.

폐경기에는 에스트로겐 생성의 감소, 난포자극호르몬(follicular stimulating hormone, FSH) 및 황체화호르몬(luteininzing hormone, LH)의 상승 등 호르몬의 변화에 따라 급만성 증상이 나타날 수 있다.

이러한 갱년기의 증상으로는 초기에는 열성 홍조(hot flush), 야간 발한(night sweat), 빈맥 또는 두통 등의 혈관성 변화에 의한 증상과 근육통, 관절통 및 요통과 같은 근골격계 증상이 나타나고 폐경 수년 내에 빈뇨 또는 요실금과 같은 비뇨생식기 변화에 의한 증상이 나타나며 폐경 수년 후에는 기억력 감퇴, 우울증, 집중력 감퇴 및 현기증과 같은 뇌신경계 변화에 의한 증상이 나타난다.

여성의 갱년기 증상을 개선하기 위한 치료법으로 호르몬 대체요법, 비스테로이드계 제제에 의한 치료법 등이 개발되어 있으며, 그 중에 에스트로겐을 투여하는 호르몬 대체요법이 가장 효과적인 방법으로 알려져있다. 그러나 상기 치료요법에 따라 장기간 약물을 사용하면 자궁내막암, 유방암, 고혈압, 혈전증, 담뇨계 결석 등을 일으킬 수 있으며, 또한 월경성 출혈이 나타날 수 있고, 난소 과잉자극 등의 부작용으로 인하여 의사의 처방 없이는 복용할 수 없다는 문제점이 있다.

이러한 약물의 치료요법에 의한 문제점을 극복하기 위하여 천연 생약을 주성분으로 하는 여성 갱년기 증상의 개선제의 개발이 시도되고 있다.

또한, 남성은 여성과 같은 폐경이 없지만 40~50세 이후부터는 남성호르몬 분비가 서서히 감소하고 테스토스테론에 대한 표적세포의 민감성도 감소하므로 여성과 같은 여러가지 갱년기 증상들이 나타나게 된다.

또한, 남성과 여성 모두 갱년기 증상으로 인하여 골밀도가 떨어지게 되어 골다공증의 위험성이 생기므로, 갱년기 증상을 개선할 수 있으면서 장기 복용할 경우에도 부작용없는 천연약물이 보다 시급한 상황이다.

한편, 선행특허문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0486365호에는 갱년기 증후군 개선용 조성물이 제시되어 있다. 개략적으로 검토해보면, 대두추출물 및 홍삼추출물에 당귀, 작약 및 감초 추출물과 비타민을 혼합한 조성물을 주요 특징으로 하고 있다. 본 발명과 대비하여 보면, 당귀가 공통되게 사용되고 있으나, 육계 및 천궁에 대해서는 기재된바가 없다.

또한, 대한민국 공개특허공보 특2003-0033473호에는 부인병 개선용 조성물이 제시되어 있다. 개략적으로 검토해보면, 당귀, 천궁, 백작약, 백출, 복령, 옥수수수염, 사삼, 건강, 율무, 홍화씨 및 황기의 혼합 추출물을 주요 특징으로 하고 있다. 본 발명과 대비하여 보면, 선행기술은 부인병 개선을 목적으로 한다는 점에서 기술과제 및 효과가 상이한 것은 물론 당귀 및 천궁은 공통되게 사용되고 있으나 육계에 대한 것은 기재된 바가 없다.

대한민국 등록특허공보 제10-0486365호(2005.04.29. 공고) 대한민국 공개특허공보 특2003-0033473호(2003.05.01. 공개)

본 발명의 과제는 천연물질을 이용하여 갱년기 증상을 개선시킬 수 있는 효능을 보유한 조성물을 제공하는 것이다.

특히, 갱년기에 나타날 수 있는 호르몬 변화 및 골 석회화를 방지할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은, 당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상을 개선하기 위한 약학적 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에서, 상기 혼합 추출물은 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 혼합 추출물의 농도는 마우스 5주령 경구투여 기준으로 50~200 mg/kg/day인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 혼합 추출물은, 자궁 무게와 자궁속막 기능층 두께를 증가시키는 효능, 골밀도를 증가시키는 효능, ALP를 감소시키는 효능, 골 형성 바이오마커(biomarker)의 발현을 감소시키는 효능, 혈중 에스트로겐을 증가시키는 효능 및 난포자극 호르몬 과 황체 자극 호르몬을 감소시키는 효능을 보유하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 증상을 개선하기 위한 식품 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물은 자궁 무게와 자궁속막 기능층 두께를 증가시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 골밀도를 증가시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 ALP를 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 골 형성 바이오마커(biomarker)인 BALP, CTX-1 및 osteocalcin를 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 혈중 에스트로겐을 증가시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 난포자극 호르몬 및 황체 자극 호르몬을 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

도 1 및 도 2는 자웅성 랫트의 3개월간 골밀도 변화량을 나타내는 도면이다.
도 3은 자웅성 랫트의 ALP 변화량을 나타내는 도면이다.
도 4는 난소절제 모델에서 몸무게 변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 난소절제 모델에서 자궁 무게 변화를 나타내는 도면이다.
도 6은 난소절제 모델에서 자궁 내막 조직의 변화를 나타내는 도면이다.
도 7 및 도 8은 난소절제 모델에서 대퇴 골밀도 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 난소절제 모델에서 ALP 변화량을 나타내는 도면이다.
도 10은 난소절제 모델에서 BALP, CTX-1, osteocalcin 변화를 나타내는 도면이다.
도 11은 난소절제 모델에서 혈중 에스트로겐 변화를 나타내는 도면이다.
도 12는 난소절제 모델에서 난포자극호르몬 및 황체자극호르몬의 변화를 나타내는 도면이다.
도 13은 에스트로겐 활성능 평가를 나타내는 도면이다.
도 14는 에스트로겐 수용체 발현 평가를 나타내는 도면이다.

실시예 1. 당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물

본 발명은, 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물을 유효성분으로 사용한다. 일 예로, 당귀 50g, 천궁 25g 및 육계 25g에 30% 에탄올 10배수를 넣어 85~95℃로 3시간씩 2회 추출하여 여과하고 여과된 액은 60℃ 이하에서 감압농축 및 건조하여 26~27g의 건조 엑스를 얻을 수 있다.

본 발명의 실험예에 근거하여 유효 농도를 준비한다. 바람직하게, 50~200 mg/kg/day (마우스 5주령 경구투여 기준)를 유효 농도로 사용한다. 약학적 조성물에는 혼합 추출물의 유효 농도가 유지되게끔 약학적 첨가제가 첨가된다.

실시예 2. 당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물

본 발명의 실험예에 근거하여 유효 농도를 준비한다. 바람직하게, 50~200 mg/kg/day (마우스 5주령 경구투여 기준)를 유효 농도로 사용한다. 건강기능식품 조성물에는 상기 유효 농도가 적절히 유지되게끔 식품학적 첨가제가 첨가된다.

실험예 1. 자웅성 동물모델을 활용한 갱년기 증상 개선 효능

[실험방법]

(1) 실험동물의 사육 및 시료 처리

실험동물은 체중 170g(자성), 120g(웅성)의 Sparague-Dawley 계통의 5주령 랫트를 아무것도 취하지 않은 대조군, 에스트로겐 투여군 및 후보약제(HPC 3, 당귀:천궁:육계=2:1:1 혼합 중량비)를 섭취한 실험군으로 나누어 각각 암컷 5마리와 수컷 5마리를 실험에 이용하였다. 사육기간 중에는 일반사료에서 식물성 에스트로겐 성분을 제거한 AIN-76사료(하기의 표1 참조)와 증류수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 매일 같은 시간에 실험군에는 생리식염수에 녹인 후보약제를 투여하고, 대조군은 동일량의 생리식염수를 3개월간 경구투여 하였고, 에스트로겐 투여군에는 생리식염수와 에스트로겐을 10 μg/kg 투여하였다.

조성	일반사료(g/kg)	AIN-76
Casein DL-Methionine Cornstarch Sucrose Cellulose Soybean Oil Corn Oil Salt Mix Vitamin Mix Dyetrose L-Cystine t-Butylhydroquinone Choline Bitartrate	200.00 - 397.486 100.00 50.00 70.00 - 35.00 10.00 132.00 3.00 0.014 2.50	200.00 3.00 150.00 500.00 50.00 - 50.00 35.00 10.00 - - - 2.00

(2) 골밀도 변화량 측정

동물용 골밀도 측정기 InAlyzer (medikors社)를 활용하여 12주동안, 4주 간격으로 척추(lumbar), 대퇴(femur)의 BMD 변화량을 측정하고 모든 실험 종료 후 발골된 실험동물의 대퇴(femur)의 BMD 변화량을 측정하였다.

(3) ALP 변화량 측정

모든 시험 종료 후 수득한 혈청을 활용하여 ALP의 유도 정도를 혈액생화학장비 (7170S, Hitachi, Tokyo, Japan)를 활용 하여 측정하였다.

[실험결과]

(1) 골밀도 변화

12주 동안 4주 간격으로 측정한 자웅성 랫트의 lumbar BMD는 투여에 따른 그룹 간의 차이를 관찰할 수 없었다. 그러나 12주차 대퇴 BMD의 경우 에스트로겐 10 μg/kg 투여 그룹에서 대조군과 비교하여 유의적 증가를 나타내었다. 후보약제인 HPC 3 200mg/kg의 투여 그룹에서도 12주차 BMD증가를 나타내었다. (도 1 참조)

실험종료 후 실험동물의 대퇴를 적출하고 골밀도를 측정한 결과 에스트로겐 10 μg/kg 투여 그룹의 BMD는 좌측과 우측 각각 0.2603±0.0187, 0.2577±0.0161 g/cm²으로 에서 대조군(0.2157±0.198, 0.2273±0.003 g/cm²)과 비교하여 20, 13.3%의 유의적 증가를 나타내었다. 후보약제인 HPC 3의 BMD는 0.2511±0.0003, 0.2569±0.0002 g/cm²으로 대조군과 비교하여 16.4, 13.02%의 유의적 증가를 나타내었다. (도 2 참조)

(2) ALP 변화량 측정

12주간의 실험 종료 후 측정한 ALP는 자웅성 랫트 대조군의 경우 각각 87.5±9.57, 44.0±16.6 U/L 이었고, 에스트로겐 10 μg/kg 투여 그룹은 37.0±13.36, 34.2±7.27 U/L으로 대조군과 비교하여 60.8, 15.9%의 유의적 감소를 나타내었다. 자성 랫트의 경우 HPC 3 투여군은 67.75±12.6 U/L 으로 대조군과 비교하여 22.5%의 유의적 감소를 나타내었으나, 웅성 랫트에서는 HPC 3의 투여에 따른 유의적 차이는 관찰되지 않았다.(도 3 참조)

실험예 2. 난소절제 동물모델을 활용한 갱년기 증상 개선 효능

[실험방법]

(1) 난소 절제 시술 및 동물 사육

Ketamine(Keara 100 mg/kg)과 2% Xylazine(Rumpun 0.15 ml/kg)로 전신 마취하고 통법에 따라 제모 및 무균 처리(10% povine-iodine scrub followed by 70% alcohol wipe)하였다. 실험동물 등쪽 중앙에 1 cm 가량의 절개를 시행한 뒤 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 난소 절제를 양측으로 시행하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강 내로 재위치 시킨 후 봉합용 실로 층별 봉합하였다.(OVX). 난소 비(非)절제그룹(SHAM)의 경우 난소는 적출하지 않고 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(Sham operation)을 시행하고 시술 1 주일 후 회복 과정을 거쳐 실험을 수행하였다.

난소절제 후 시판제품인 백수오궁 200mg/kg 과 후보약제 HPC 3를 농도별 (50, 100, 200mg/kg)을 섭취한 실험군으로 나누어 갱년기 개선능을 평가하였다. 사육기간 중에는 AIN-76사료와 증류수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 실험군에는 매일 같은 시간에 생리식염수에 녹인 후보약제를 물질을 투여하고, 대조군에는 동일량의 생리식염수를 3개월간 경구투여하였다.

(2) 골밀도 변화량 측정

동물용 골밀도 측정기 InAlyzer (medikors社)를 활용 하여 12주동안, 4주 간격으로 척추(lumbar), 대퇴(femur)의 BMD 변화량을 측정하고 모든 실험 종료 후 발골된 실험동물의 대퇴(femur)의 BMD 변화량을 측정하였다.

(3) ALP 변화량 측정

모든 실험 종료후 수득한 혈청을 활용하여 ALP의 유도 정도를 혈액생화학장비 (7170S, Hitachi, Tokyo, Japan)를 활용 하여 측정하였다

(4) BALP, Collagen type 1, Osteocalcin 측정

모든 실험 종료 후 분리된 혈청을 대상으로 BALP, Collagen type 1, Osteocalcin ELISA kit 을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 각 변화량을 측정하였다.

(5) 에스트라디올 측정

4주 간격으로 안와정맥채혈을 수행하여 혈청을 수득하였다. 실험 종료시, 에테르 마취 후 개복하여 복대정맥으로 혈액을 채취하고, heparin 처리된 튜브로 옮겨 담고 2,500rpm(4℃)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 대상으로 Testosterone, Estradiol ELISA kit (ADI-065, 174; Enzo Life Sciences, U.S.A.)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 혈중 성호르몬 함량을 측정하였다.

(6) LH/FSH 측정

모든 실험 종료후 분리된 혈청을 대상으로 LH/ FSH ELISA kit 을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 각 변화량을 측정하였다.

(7) 조직학적 검사

동물실험 완료 후, 얻은 난소 조직을 filter paper에 편평하게 부착하여 4% 포르말린 용액에 4시간 동안 고정시킨 뒤, 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 조직절편기를 이용하여 5 μm 두께로 절단하여 슬라이드에 붙였다. 조직 절편은 xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고 alcohol과 증류수로 함수시킨 뒤, 피부 조직 관찰을 위해 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 수행하여 현미경 관찰하였다.

[실험결과]

(1) 몸무게 변화

난소절제에 의해 몸무게 증가가 확인되었다(ovx 그룹). 반면, SHAM 및 에스트로겐 투여한 그룹에서는 난소절제그룹과 비교하여 유의적 감소를 나타내었다. HPC 3 투여그룹에서는 난소절제그룹과의 유의적 차이는 관찰되지 않았다.(도 4 참조)

(2) 자궁 무게 및 조직학적 변화

난소절제에 의해 자궁무게 감소가 확인되었다(ovx 그룹). 반면, 에스트로겐 투여한 그룹에서는 난소절제그룹과 비교하여 유의적 감소를 나타내었다. HPC 3 고농도 및 백수오궁 투여군에서 난소절제 그룹과 유의적 차이를 나타내었다 (도 5 참조). 자궁에서 호르몬에 영향을 받는 부분은 자궁 속막 기능층으로서 에스트로겐의 영향이 없는 난소절제 그룹에서는 자궁의 두께가 얇아진것을 확인할 수 있었다. HPC 3는 농도 의존적으로 자궁속막 기능층 두께를 증가시켰다.(도 6 참조)

(3) 골밀도 변화

12주 동안 골밀도 변화를 관찰하였다. 8주차까지는 유의적 증가는 관찰되지 않았으나, 12주차에 난소절제에 의한 Femur(대퇴)의 골밀도 감소가 유발되었다. 에스트로겐 10ug/kg 투여 그룹의 Femur 골밀도는 유의적 증가를 나타내었다. 실험약물 HPC 3 고농도 및 백수오궁에 의한 Femur의 골밀도의 유의적 증가가 관찰되었다.(도 7 참조)

실험종료 후 실험동물의 대퇴를 적출하고 골밀도를 측정하였다. 난소절제군 (0.2832±0.0210 g/cm²)은 대조군 (0.3532 ±0.0120 g/cm²) 대비 대퇴 골밀도가 24% 감소되었다. 에스트로겐 10 μg/kg 투여 그룹의 BMD는 0.3403±0.3301 g/cm²으로 대조군과 비교하여 20%의 유의적 증가를 나타내었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 0.3201±0.0330 g/cm²으로 난소절제군 대비 13%의 증가율을 보였다. 후보약제인 HPC 3은 농도별로 각각 0.2893±0.0382, 0.3013±0.0143, 0.3203±0.0031 g/cm²으로 난소절제군과 비교하여 각각 2.1, 6.4, 13.1%의 증가를 나타내었다. 그 중 HPC 3 200mg/kg에서 유의적 증가가 나타났다.(도 8 참조)

(4) ALP 변화량 측정

4주 간격으로 0~12주 동안 ALP를 측정하였다. 난소 절제 1주차부터 SHAM 그룹 대비 유의적 증가가 관찰되었다. 에스트로겐 10 μg/kg 투여군은 1달 후부터 SHAM과 비슷한 수준의 ALP량을 나타내었다.

백수오궁 200mg/kg 및 HPC 3 100mg/kg 투여 2달 후부터 난소절제그룹 대비 유의적 감소를 나타냈다. 투여 3개월 후 SHAM그룹 (46.5±4.0 U/L) 대비 난소절제 그룹(89.0±4.0 U/L) 은 47.7% 증가되었다. 반면 에트스트로겐 투여 그룹은 50.0±1.0 U/L로 난소절제그룹 대비 43.7% 혈중 ALP량이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 62.0±4.0 U/L로 난소절제그룹 대비 30.3% 감소되었다. 후보약제 HPC 3는 50 mg/kg (82.4±1.2 U/L), 100mg/kg (73.5±2.4 U/L), 200mg/kg (63.03±6.03 U/L)농도 별로 각각 7.5, 18.7, 29.1%로 100mg/kg부터 유의적 감소를 나타냈다.(도 9 참조)

(5) 골 형성 biomarker 발현 측정

실험종료 후 혈청을 분리하여 골관련 지표인, BALP, CTX-1 및 osteocalcin을 측정하였다. (도 10 참조).

BALP은 SHAM그룹 (102.0±8.1 ng/mL) 대비 난소절제 그룹 156.2±10.8 ng/mL은 47.7% 증가되었다. 반면 에트스트로겐 투여 그룹은 98.2±5.2 ng/mL로 난소절제그룹 대비 37.1% 혈중 BALP량이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 120.9±7.9 ng/mL로 난소절제그룹 대비 22.5% 감소되었다. 후보 약제 HPC 3는 50mg/kg (134.2±2.4 ng/mL), 100mg/kg (124.5±4.2 ng/mL), 200mg/kg (117.5±3.4 ng/mL)농도 별로 각각 2.8, 19.3, 24.7% 감소를 나타냈다. 그중 200mg/kg에서 유의적 감소를 나타냈다.

CTX-1은 SHAM그룹 (80.0±4.3 ng/mL) 대비 난소절제 그룹 120.0±6.2 ng/mL은 33.3% 증가되었다. 반면 에트스트로겐 투여 그룹은 92.1±1.5 ng/mL로 난소절제그룹 대비 23.3% 혈중 CTX-1량이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 105.2±4.2 ng/mL로 난소절제그룹 대비 12.5% 감소되었다. 후보 약제인 HPC 3는 50mg/kg (118.3±2.4 ng/mL), 100mg/kg (107.5±1.2 ng/mL), 200mg/kg (105.0±4.2 ng/mL) 농도별로 각각 1.7, 10.8, 12.5% 감소를 나타냈다. 그중 100, 200mg/kg에서 유의적 감소를 나타냈다.

Osteocalcin은 SHAM그룹 (62.1±4.2 ng/mL) 대비 난소절제 그룹 87.2±8.2 ng/mL은 28.7% 증가되었다. 반면 에트스트로겐 투여 그룹은 65.2±1.4 ng/mL로 난소절제그룹 대비 25.3% 혈중 osteocalcin량이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 75.1±5.2 ng/mL로 난소절제그룹 대비 13.8% 감소되었다. 후보 약제인 HPC 3는 50mg/kg (82.4±2.4 ng/mL), 100mg/kg (75.4±2.4 ng/mL), 200mg/kg (68.5±2.24ng/mL)농도 별로 각각 5.2, 13.4, 18.4% 감소를 나타냈다. 그중 200mg/kg에서 유의적 감소를 나타냈다.

(6) 혈중 에스트로겐 농도

4주 간격으로 0~12주 동안 혈중 에스트로겐 농도를 측정하였다. 난소 절제 1주차부터 SHAM 그룹 대비 유의적 증가가 관찰되었다. 에스트로겐 10 μg/kg 투여 1달 후부터 SHAM과 비슷한 수준의 혈중 에스트로겐량을 나타냈다. 백수오궁은 투여 3개월 후부터 유의적 증가를 나타냈다. HPC 3 200mg/kg 투여 2달후 부터 난소절제그룹 대비 유의적 증가를 나타냈다. 투여 3개월 후 SHAM그룹 (62.8±4.03 pg/mL) 대비 난소절제 그룹(32.0±2.03 pg/mL) 은 96.2% 감소되었다. 반면 에스트로겐 투여 그룹은 70.0±4.03 pg/mL로 난소절제그룹 대비 118.6% 혈중 에스트로겐량이 증가되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 43.03±3.03 pg/mL로 난소절제그룹 대비 34.3% 감소되었다. 후보 약제인 HPC 3는 50mg/kg (42.4±2.4 pg/mL), 100mg/kg (43.4±3.4 pg/mL), 200mg/kg (56.2±14.3 pg/mL) 농도 별로 각각 32.7, 31.4, 61.8%로 모든 농도에서 유의적 증가를 나타냈다. (도 11 참조)

(7) 혈중 LH (난포자극 호르몬) 및 FSH (황체 자극 호르몬) 측정

실험종료 후 혈청을 분리하여 난포자극 호르몬 및 황체 자극 호르몬을 측정하였다.(도 12 참조)

난포자극 호르몬 측정 결과, SHAM그룹 (210±4.6 ng/mL) 대비 난소절제 그룹 295.4±10.4 ng/mL은 28.8% 증가되었다. 반면 에스트로겐 투여 그룹은 245.2±6.2 ng/mL로 난소절제그룹 대비 16.9% 혈중 난포자극호르몬량이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 262.3±5.0 ng/mL로 난소절제그룹 대비 11.1% 감소되었다. 후보 약제인 HPC 3는 50mg/kg (283.4±2.2 ng/mL), 100mg/kg (267.4±3.4 ng/mL), 200mg/kg (258.2±2.1 ng/mL) 농도별로 각각 1.7, 5.4, 12.5% 감소를 나타냈다. 그중 200mg/kg에서 유의적 감소를 나타냈다.

황체 자극 호르몬 측정 결과, SHAM그룹 (62.4±2.1 ng/mL) 대비 난소절제 그룹 114.0±2.0 ng/mL은 45.2% 증가되었다. 반면 에스트로겐 투여 그룹은 68.3±5.2 ng/mL로 난소절제그룹 대비 40.1% 혈중 황체자극호르몬이 감소되었다. 기존 제품인 백수오궁의 경우 82.0±2.1 ng/mL로 난소절제그룹 대비 28.1% 감소되었다. 후보 약제인 HPC 3는 50mg/kg (106.2±2.1 ng/mL), 100mg/kg (94.2±3.4 ng/mL), 200mg/kg (80.5±4.0 ng/mL) 농도별로 각각 3.3, 14.7, 31.6% 감소를 나타냈다. 그중 200mg/kg에서 유의적 감소를 나타냈다.

실험예 3. 에스트로겐 활성 확인을 위한 E-스크린 분석 및 에스트로겐 수용체 활성 측정

[실험방법]

(1) 세포 배양

10％ FBS와 0.01mg/mL의 bovine insulin, 항생제(100 unit/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin)를 첨가한 RPMI 1640 배지로 3∼4일마다 배지를 교환하고 7일마다 계대 배양을 통하여 사용했다. MDA-MB231 cell은 10％ FBS와 항생제(100 unit/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640 배지로 4∼5일마다 배지를 교환하고 6∼7일마다 계대 배양을 통하여 사용했다.

(2) 에스트로겐 활성 측정

에스트로겐 활성에 의한 세포증식 효과의 측정은 Soto et al.(1995)의 방법(Soto et al., The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens: anupdate on estrogenic enviromental pollutants. Envirom Health Pers, 103, 113∼22, 1995).을 일부 변형하여 적용했다. MCF-7과 MDA-MB 231 cell는 배지 중의 에스트로겐 활성을 나타내는 성분을 배제하기 위하여, 10％ charcoal treated FBS을 함유한 phenol red를 포함하지 않는 RPMI 1640 medium으로 96 wellplate에 well당 2×103개를 seeding하고 24시간 후 test medium (5％ charcoal dextran treated FBS를 함유한 phenol-red를 포함하지 않는 RPMI 1640)으로 교환한 후, 각 후보약제를 처리했다. 후보약제 처리후 MTT 염료를 활용하여 시험물질의 에스트로겐성 작용을 확인했다.

(3) human ER reporter assay

에스트로겐 활성을 확인하기 위하여 에스트로겐 수용체에 대한 실험(reporter assay)을 수행했다. 인디고 바이오사이언스(Indigo Bioscience)사의 human ER reporter assay kit 에 최종 소재를 4시간 처리하였고, 양성 대조군으로는 17-에스트라디올 (17-estradiol) 1 nM을 사용했다. 에스트라디올은 에스트로겐 수용체의 리간드로 작용하는데, 특히 ERα(Estrogen Receptor α) 및 ERβ(Estrogen Receptor β)에 작용했다. 음성대조군( (-)군에 해당)에는 추출물과 동일한 볼륨의 증류수를 첨가했다.

[실험결과]

(1) 에스트로겐 활성 측정

시료의 에스트로겐 활성 확인은 아무런 처치도 하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 환산했다. 에스트로겐 수용체(ER)가 내재적으로 발현되어 있는 MCF-7 세포에서 양성대조군인 estrogen 0.05mM에서는 118.3 ± 8.72 %가 유의적으로 증가되었다. HPC 3는 25~100 μg/mL에서 대조군 대비 유의적으로 세포 생존율이 증가되었다. ER이 발현되지 않은 MDA-MB231에서 양성대조군인 estrogen 0.05mM는 109.4 ± 7.56 %가 유의적으로 증가되었다. HPC 3는 25, 50 μg/mL에서 대조군 대비 유의적으로 세포 생존율이 증가되었다.(도 13 참조)

(2) 에스트로겐 수용체 발현 측정

양성대조군인 estrogen 6.4pM에서 ERα는 2.36 ± 0.49 %, ERb는 2.93± 0.12 %로 유의적으로 증가되었다. HPC 3 50, 100μg/mL 처리군은 대조군 대비 유의적 증가를 나타내며, 에스트로겐과 유사한 활성을 나타냈다. (도 14 참조)

Claims

당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물로서,
상기 혼합 추출물은 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물이고,
상기 혼합 추출물의 농도는 마우스 5주령 경구투여 기준으로 50~200 mg/kg/day이며,
상기 혼합 추출물은, 자궁 무게와 자궁속막 기능층 두께를 증가시키는 효능, 골밀도를 증가시키는 효능, ALP를 감소시키는 효능, 골 형성 바이오마커(biomarker)의 발현을 감소시키는 효능, 혈중 에스트로겐을 증가시키는 효능 및 난포자극 호르몬 과 황체 자극 호르몬을 감소시키는 효능을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, 갱년기 증상을 개선하기 위한 약학적 조성물.
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당귀, 천궁 및 육계의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물로서,
상기 혼합 추출물은 당귀, 천궁 및 육계를 1.5~2.5:1:1의 중량비로 혼합한 후에 추출한 추출물이고,
상기 혼합 추출물의 농도는 마우스 5주령 경구투여 기준으로 50~200 mg/kg/day이며,
상기 혼합 추출물은, 자궁 무게와 자궁속막 기능층 두께를 증가시키는 효능, 골밀도를 증가시키는 효능, ALP를 감소시키는 효능, 골 형성 바이오마커(biomarker)의 발현을 감소시키는 효능, 혈중 에스트로겐을 증가시키는 효능 및 난포자극 호르몬 과 황체 자극 호르몬을 감소시키는 효능을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, 갱년기 증상을 개선하기 위한 식품 조성물.