KR101781965B1

KR101781965B1 - 항-ｉｌ-12/ｉｌ-23 항체

Info

Publication number: KR101781965B1
Application number: KR1020117005918A
Authority: KR
Inventors: 아담 윌리엄 클라크; 안소니 제라드 도일; 필립 안소니 제닝스; 린 도로시 폴턴; 호이 이 와이; 앤드류 제임스 파우; 조지 콥시다스
Original assignee: 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2017-09-27
Also published as: NZ590816A; EA201170323A1; IL245547A0; US20160264661A1; EA026110B1; JP5623401B2; TN2011000052A1; EP2326668B1; KR20110043761A; CA2733642A1; KR20160116056A; TWI501776B; IL210903A0; AU2009281713A1; ZA201100711B; CN102177178B; CN102177178A; EP2326668A4; WO2010017598A1; JP2011530298A

Abstract

본 발명은 인간 IL-12 및 IL-23에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 단량체(인간 IL-12p40) 및 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 인간 IL-12p40에 결합하며, 상기 항체는 인간 IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합 및 인간 IL-23R에 대한 인간 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는다.

Description

항-ＩＬ-12/ＩＬ-23 항체{ANTI-IL-12/IL-23 ANTIBODIES}

이 출원은 2008년 8월 14일자 호주 특허 출원번호 2008904178 및 2008년 8월 14일자 미국 특허 출원번호 61/089028와 관련 있으며, 이에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원 각각의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 출원은 인간 IL-12 및 IL-23에 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 명세서에 저자가 인용한 공개문헌에 대한 서지 사항은 명세서의 끝부분에 알파벳 순으로 기록되어 있다.

본 명세서에서 모든 종래 기술에 대한 언급이, 이러한 종래 기술이 임의 국가에서 공통적인 일반 지식의 일부분을 형성한다는 것을 인정하는 것이거나 또는 임의 형태의 제안은 아니며, 그렇게 받아들여서는 안된다.

인터루킨-12(또한, 세포독성 림프구 성숙 인자 또는 자연 사살 세포 자극 인자라고도 함)는 75 kDa의 이형이량체 단백질이다. 이것은, 클래스 I 사이토카인과 유사한, 4개의 α 나선 번들로 구성된, p35 서브유닛으로 이루어져 있다. p35에서 C63에 C-말단 아미노산 11개는 이황화 결합 루프라고 지칭되는데, 그 이유는 이 영역에 p40의 C177과의 체인간 이황화 결합을 비롯하여, IL-12의 다른 서브유닛인 p40과 접하는 다수의 잔기들이 포함되어 있기 때문이다. p40 서브유닛은 성장 호르몬 수용체(GHR)와 같이 다른 클래스 I 수용체의 세포외 도메인과 비슷하게 폴딩(folding) 된다.

p40 서브유닛에는 D1, D2 및 D3로 표시되는 3개의 도메인이 있다. 각 도메인은 β-시트 구조이며, D2 도메인에는 C177 체인간 이황화 결합이 포함되어 있다. 또한, D2 상에는 N-결합된 당화 부위(GlcNAc-GlcNAc-만노스이며, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민임)가 있다(Yoon et al. 2000 Embo J 19 3530-41).

인터루킨-23은, 인터루킨-6 나선형 사이토카인 패밀리 구성원을 컴퓨터를 이용한 프로파일로 유추하여 서열 데이타베이스를 검색함으로써, 보다 최근(2000년)에 발견되었다. 이러한 검색을 통해, IL-23p19 (p19)로 칭해지는 새로운 사이토카인 서브유닛이 발견되었다. 이 서브유닛은 IL-12p40과 공동-발현되어, 인터루킨-23(IL-23)이라고 하는 이형이량체 단백질을 분비한다. IL-23p19는 4개의 나선 번들을 포함하고 있다는 점에서 IL-12p35와 유사한 것으로 생각된다(Oppmann et al. 2000 Immunity 13 715-25).

타겟 세포 타입 상에서의 IL-12의 특이적인 효과는, IL-12Rβ1(Chua et al. 1994 J Immunol 153 128-36) 및 IL-12Rβ2(Presky et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 14002-7)로 구성된 IL-12R 복합체에 의해 매개된다. 타겟 세포 타입 상에서의 IL-23의 특이적인 효과는 IL-12Rβ1 및 IL-23R (Parham et al. 2002 J Immunol 168 5699-708)로 구성된 IL-23R 복합체에 의해 매개된다.

IL-12 및 IL-23과 IL-12Rβ1의 결합은, 공통된 p40 서브유닛을 통해 매개된다. 이는, IL-12Rβ1과의 결합에 대해 IL-12와 경쟁하는 p40 서브유닛(p80)의 동형이량체를 이용한 경쟁 실험으로 입증되었다. 그러나, p80은 IL-12과 IL-12Rβ2의 결합에는 작용하지 않았다(Presky et al. 1996 Ann N Y Acad Sci 795 390-3).

p35 서브유닛 또는 IL-12의 이형이량체 인터페이스는 IL-12Rβ2에 대한 결합에 관여하므로, IL-12 복합체에 IL-12 선택성을 부여한다(Trinchieri et al. 2003 Immunity 19 641-4). 마찬가지로, p19 또는 IL-23의 이형이량체 인터페이스도 IL-23R 결합에 관여하므로, IL-23R 복합체에 IL-23 선택성을 부여한다.

IL-12R 및 IL-23R 복합체의 시그널링은 밝혀져 있다. IL-12R은 야누스 키나제(JAK) - 신호 전달자 및 신호 전달의 전사 경로의 활성자(STAT: signal transducer and activator of transcription)를 활성화한다. IL-12의 실제 세포 효과는 주로 STAT4 활성화에 기인한다(Kaplan et al. 1996 Nature 382 174-7). IL-12Rβ2 상에 STAT4 결합부가 있는데, 이는 이 수용체가 시그널링에 중요함을 의미한다(Yao et al. 1999 Arch Biochem Biophys 368 147-55). 또한, IL-12에 대한 T_H1 세포의 반응성과 IL-12Rβ2의 발현의 상관 관계도 입증되었다(Rogge et al. 1997 J Exp Med 185 825-31). IL-23R은 JAK-STAT 경로처럼 IL-12R과 유사한 복합체를 활성화한다. STAT3는 IL-23R과의 IL-23의 결합에 의해 STAT4 보다 훨씬 두드러지게 유도되며, 형성되는 다른 DNA-결합성 STAT 전사 인자 복합체들도 다르다(Parham, Chirica et al. 2002 J Immunol 168 5699-708).

IL-12 및 IL-23은 그 생물학적 효과가 서로 다르다. IL-12는 활성화된 염증 세포(단핵구, 대식세포, 호중구, 소교세포, 수지상 세포)에 의해 분비된다. IL-12는 주로 림프구 효과에 대해 연구되었지만, 다른 타입의 세포에도 영향을 미친다. 염증 반응이 이루어지는 동안에, IL-12는 NK 세포와 T 세포가 인터페론-γ (IFN-γ)를 생산하도록 유도한다. 그 후, IL-12는 어쩌면 IFN-γ와 조합하여, T 세포가 T_H1 세포로 분화되도록 유도한다. 이러한 반응은 세포성 면역 시스템을 자극하여, 병원체에 대한 대식 세포의 살상 효과와 CD8+ T 세포의 증식을 최대화한다(Trinchieri 2003 Nat Rev Immunol 3 133-46). IL-12의 과다 생산은 증강된 전염증성 활성 및 자가면역성의 전형적인 조직 손상과 관련있다(Leonard et al. 1997 Crit Rev Immunol 17 545-53). 미통제 형태의 IL-12 생산은 다음과 같은 질환과 관련있다: 자가면역 질환들 중에서도, 특히 건선 (Yawalkar et al. 1998 J Invest Dermatol 111 1053-7; de Rie 1999 Dermatology 199 101; Shaker et al. 2006 Clin Biochem 39 119-25), 크론 질환 (Neurath et al. 1995 J Exp Med 182 1281-90; Simpson et al. 1998 J Exp Med 187 1225-34; Camoglio et al. 2002 Eur J Immunol 32 261-9), 다발성 경화증 (Fassbender et al. 1998 Neurology 51 753-8; Laman et al. 1998 J Neuroimmunol 86 30-45), 류마티스 관절염 (Kim et al. 2000 Clin Exp Immunol 119 175-81; Leung et al. 2000 J Immunol 164 6495-502). 이러한 질환에서의 IL-12의 역할은 명확하지 않지만, T_H1 반응의 과분극화가 관련있을 수 있는 것으로 생각된다(Gordon et al. 2005 Curr Opin Gastroenterol 21 431-7).

IL-23은 활성화된 인간 대식 세포 뿐만 아니라 수지상 세포에 의해서도 분비된다(Verreck et al. 2004 Proc Natl Acad Sci U S A 101 4560-5). IL-23은 주로 기억 T-세포에 작용하며, IL-23에 반응하여 IL-17을 분비하는 뮤라인 비장 세포의 능력에서 확인된 바와 같이, IL-17A 및 IL-17F의 조절을 통해 자가면역 질환을 촉진시키는 것으로 간주되고 있다. 인간의 경우, IL-23/IL-17 경로가 존재하며, IL-23은 IL-21, IL-22, IFN-γ, IL-17과 함께 TNF-α, 모든 전염증성 사이토카인에 대해 동등한 우수한 유도제(inducer)인 것으로 확인되었다. 시험관내 IL-6 및 TGF-β1은 나이브(naive) T-세포가 새롭게 발견된 T-세포 경로(T_H17)로 가게 한다(Zhou et al. 2007 Nat Immunol 8 967-74). 이러한 세포는 또한 IL-21의 분비를 통해 오토크린 방식으로 구동된다. 마지막으로, IL-23 및/또는 IL-1β는 이러한 T_H17 반응으로 세포를 유지시키는 것으로 생각된다(검토로 Dong 2008 Nat Rev Immunol 8 337-48 참조). 또한, T_H17 반응에서 상향 조절되는 것으로 입증된 전사인자 RORγt도 관심의 대상이다(Chen et al. 2007 Arthritis Rheum 56 2936-46).

IL-12 및 IL-23 둘다 공통된 서브유닛을 포함하고 있어, 질환의 원인을 오직 한가지 인터루킨 또는 다른 것의 과다 생산으로만 돌리기 어렵다. 그러나, 연구를 통해 IL-23 비통제가 다음과 같은 질환과 관련있는 것으로 나타났다: 다른 자가면역 질환 중에서도 건선(Lee et al. 2004 J Exp Med 199 125-30; Torti et al. 2007 J Am Acad Dermatol 57 1059-68), 크론 질환(Neurath 2007 Nat Med 13 26-8) 및 다발성 경화증(Cua et al. 2003 Nature 421 744-8).

IL-12p40은 단량체로서(IL-12p40) 또는 이황화 결합에 의해 2개의 p40 서브유닛이 서로 묶여 있는 동형이량체(IL-12p80)로서 분비될 수 있다(Gillessen et al. 1995 Eur J Immunol 25 200-6). 이러한 p40 종들은 뮤라인 충격 모델에서 IL-12와 비교하여 50배 이상으로(Gillessen, Carvajal et al. 1995 Eur J Immunol 25 200-6), 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)에서는 10-20배 이상으로(D'Andrea et al. 1992 J Exp Med 176 1387-98) 많이 분비된다. IL-12p80은 IL-12p40 보다 20배 이상으로 시험관내에서 IL-12 활성을 길항할 수 있다(Gillessen, Carvajal et al. 1995 Eur J Immunol 25 200-6). 재조합 IL-12p80은 IL-12β1에 결합하는 것으로 입증되었다(Wang et al. 1999 Eur J Immunol 29 2007-13).

재조합 뮤라인 IL-12p80(rmIL-12p80)이 IL-12Rβ1에 대한 생체내 및 시험관내 결합에 대해 IL-12/23과 경쟁하는 것으로 입증되었기 때문에, IL-12p40/p80은 IL-12/23 수용체 복합체의 길항제로 간주된다(Mattner et al. 1993 Eur J Immunol 23 2202-8; Gillessen, Carvajal et al. 1995 Eur J Immunol 25 200-6; Gately et al. 1996 Ann N Y Acad Sci 795 1-12). 또한, 동형이랑체는 뮤라인 모델에서 IL-12 매개의 쇼크를 방지하는 것으로 입증되었다(Mattner et al. 1997 Infect Immun 65 4734-7). IL-23 매개의 면역 기능 조사에서, IL-12p40은 IL-12Rβ1에 경쟁적으로 결합함으로써 IL-23 유발성 사이토카인 생산을 해친다(Shimozato et al. 2006 Immunology 117 22-8). 최근 들어, IL-12p40 또는 IL-12p80은 다른 생물학적 기능에도 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다. 가장 먼저 확립된 IL-12p80의 활성들 중 한가지는, 대식세포에 대한 화학주성(chemoattractant)이다. IL-12Rβ2 또는 IL-12p35 결핍성 대식세포가 아닌, IL-12Rβ1 결핍성 대식세포가, rmIL-12p80에 대해 감소된 화학주성 반응을 보이는데, 이는, IL-12Rβ1이 IL-12Rβ2의 부재시에 IL-12p80에 대한 반응을 매개할 수 있으며, IL-12p80 활성이 IL-12과 독립적임을 의미한다(Russell et al. 2003 J Immunol 171 6866-74). 또한, IL-12p80은 수지상 세포(DC)의 이동의 유도제로서 작용할 수 있다. IL-12p40-결핍성 DC는 마이코박테리아에 반응하여 폐에서 림프절로 이동할 수 없다. IL-12p35 및 IL-23p19 둘다가 없어도, 마이코박테리아에 의해 활성화된 DC가 케모카인에 반응하여 이동하는 능력과, T-세포 확장을 유도하는 능력 2가지 모두에 영향을 미치지 않았다는 것은, IL-12p40에 대한 이러한 고유 역할을 드러내는 것이다(Khader et al. 2006 J Exp Med 203 1805-15). 또한, IL-12p40과 IL-12p80은 폐에서 염증 반응을 매개하는 것으로 알려져 있으며, CD8⁺ T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 것으로 확인되었다(Cooper et al. 2007 Trends Immunol 28 33-8).

IL-12 및 IL-23은 다양한 질환과 관련있기 때문에, IL-12 및/또는 IL-23 활성을 저해하기 위한 몇가지 치료 전략이 설계되었다. 가장 먼저 언급된 몇가지 항체들은 IL-12로 면역화된 마우스의 하이브리도마에 의해 분비되는 뮤라인 단일클론 항체들이다(Strober et al. PCT Publication No. WO 97/15327; Gately et al. WO99/37682 A2, Neurath, Fuss et al. 1995 J Exp Med 182 1281-90). 인간을 치료하기 위해 이들 뮤라인 항체를 사용하는 것은 마우스 면역글로블린을 인간에게 투여하여 생기는 문제들로 인해 한계가 있다. 이러한 문제들은, 마우스 면역글로불린에 대한 자가-항체의 생성과, 이로 인한 혈청에서 이의 제거와 모든 치료 효과의 무효화이다. 인간 항-마우스 항체(HAMA)로 알려져 있는 이러한 효과는 뮤라인 서열이 항체의 가변부로만 한정된 키메라 항체의 출현으로 일부 해결되었다(Junghans et al. 1990 Cancer Res 50 1495-502; Brown et al. 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88 2663-7). IL-12에 결합하는 키메라 항체가 개시되었다(Perritt et al. PCT 공개번호 WO 02/097048A2). 보다 더 인간에 가까운 항체는, 공여체 뮤라인 항체의 상보성 결정 부위를 포함하며, 인간 수용체 항체로부터 유래된 가변성 프래임워크 영역을 포함하는, '인간화된 항체'이다(Jones et al. 1986 Nature 321 522-5, Winter 미국 특허 5,225,539, Queen et al. 미국 특허 5,693,761). IL-12 및 IL-23에 대한 이러한 '인간화된' 항체가 Lacy 등의 WO 07/005608에 개시되었다. 최근들어, 인간 기원(Winter et al. 미국 특허 7,306,907; MacCafferty et al. 미국 특허 5,969,108) 또는 인간 면역글로불린 트랜스유전자를 가진 마우스로부터 유래된 디스플레이 라이브러리로부터 기원한 완전한 인간 항체가 개시되었다(Tomizuka et al. 미국 특허 7,041,870; Kucherlapati et al. 미국 특허 5,939,598). Salfeld 등(미국 특허 6,9141,28)은 IL-12에 대한 완전한 인간 항체들을 개시하였다.

IL-12, IL-23, IL-12p40 및 IL-12p80과의 상호작용을 기반으로 5가지의 폭넓은 항체 클래스가 예측되었다(도 1). 제1 항체 클래스는, IL-12p40 단량체 및 IL-12p80 동형이량체와 더불어 IL-12 및 IL-23에 존재하는 IL-12p40과 특이적으로 상호작용하는 것이다(도 1.1). 제2 항체 클래스는, IL-12p35와 특이적으로 상호작용하는 것이다(예로, Devergne et al. 2001 Am J Pathol 159 1763-76에 항체 G161-566가 언급됨; 도 1.2). 제3 항체 클래스는, IL-12와 특이적으로 상호작용하지만, IL-23, IL-12p35 및 IL-12p40과는 특이적으로 상호작용하지 않는 것이다(예로, D'Andrea, Rengaraju et al. 1992 J Exp Med 176 1387-98에 항체 20C2가 언급됨; 도 1.3). 제4 항체 클래스는, IL-23p19와 특이적으로 상호작용하는 것이다(Presta et al. WO 2007/027714에 예시되어 있음; 도 1.4). 제5 항체 클래스는, IL-23 상에 노출되어 있지만 IL-12 상에서는 IL-12p35 서브유닛에 의해 가려지는, IL-12p40 서브유닛의 서열을 이용하여, IL-23p40과 특이적으로 상호작용하지만 IL-12p40과는 상호작용하지 않는 것이다(예, Benson et al. 미국 특허 7,247,711; 도 1.5). 본 발명은 IL-12p40, IL-12p80, IL-12 및 IL-23과 특이적으로 결합하는 제1 항체 클래스의 새로운 형태를 개시한다(도 1.1).

이러한 제1 항체 클래스가 IL-12/23 수용체 - 리간드 복합체를 저해하여 이에 대한 길항 효과를 발휘하는 방법에 대해 몇가지 정보가 알려져 있다. Giles-Komar 등(WO 2006/069036)은, IL-12p40의 1-88 아미노산 잔기들에 특이적인 항-IL-12p40 항체를 개시하였다. 이 항체는, 또한, IL-12 및 IL-23과 IL-12Rβ1의 상호작용을 특이적으로 저해하는 것이 특징이다(Papp et al. 2008 Lancet 371 1675-84). 마찬가지로, 문헌에 IL-12/23과 IL-12Rβ1의 상호작용을 저해하는 다른 항체도 개시되었다(Ding et al. 2008 Curr Opin Investig Drugs 9 515-22). 본 발명은 새로운 작용 메카니즘을 통해 IL-12/23 수용체 - 리간드 복합체를 저해하는 항체를 개시한다(도 2.3). 이러한 새로운 작용 메카니즘에는, IL-12/IL-12Rβ2 상호작용 및 IL-23/IL-23R 상호작용의 선택적인 중화 단계가 포함된다. 이 메카니즘은 IL-12Rβ1과의 IL-12/23의 결합을 중화시키지 않는다는 점에서, 기존의 (상기한) 항체와는 다르다. 이러한 항체들은 또한, IL-12Rβ1에 대한 IL-12p40/p80의 결합은 저해하지 않고, 따라서 숙주 방어 기작에서의 IL-12p40/80의 역할 수행을 저해하지 않으며, 그로 인해 다른 IL-12/23 항체에 비해 이들 항체의 안전성 프로파일을 잠재적으로 높일 수 있다는 점에서, 새롭다. 새로운 작용 메카니즘을 가진 이러한 항체들은 IL-12/23과 관련된 질병의 치료를 개선시킬 수 있으며, 안전성 문제를 완화시킬 수 있다. 부가적으로, 이들 항체는 IL-12 및 IL-23, IL-12p40 또는 IL-12p80의 천연 길항제를 저해하지 않기 때문에, 개선된 효능을 가질 수 있었다. 이로 인해, 항체 및 IL-12p40 또는 IL-12p80 모두 길항제로서 기능할 수 있으며, 그래서 항체를 단독 투여한 경우에 비해 저해 수준을 높일 수 있을 것이다.

WO 97/15327

WO

9937682

A2

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본 발명은, 인간 IL-12 및 인간 IL-23에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하며, 단량체(인간 IL-12p40) 및 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 인간 IL-12p40에 결합하며, IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합 및 IL-23R에 대한 인간 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는, 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그것의 특정 부분 또는 변이체의 사용을 포함하는, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 한가지 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 질환의 증상을 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 항체는 시료내 IL-12, IL-23, IL-12p40 또는 IL-12p80의 존재를 검출 또는 측정하는데 사용할 수 있다. 본 방법은 시료에 상기 항체를 첨가하는 단계 및 시료에 존재하는 IL-12, IL-23, IL-12p40 또는 IL-12p80에 대한 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 특성을 보다 충분하게 이해시킬 수 있도록, 본 발명의 다양한 형태들은 하기 도면과 실시예를 참조하여 설명될 것이다.

도 1: 항-IL-12/23 항체의 여러가지 클래스. 도 1.1) IL-12, IL-23, IL-12p40 및 IL-12p80의 p40 서브유닛에 결합하는 항체; 도 1.2) IL-12의 p35 서브유닛에 결합하는 항체; 도 1.3) 이형이량체로서 IL-12의 p35 및 p40 서브유닛에 결합하는 항체; 도 1.4) IL-23의 p19 서브유닛에 결합하는 항체; 도 1.5) IL-23, IL-12p40 및 IL-12p80에는 존재하지만 IL-12에는 없는 p40에 결합하는 항체.
도 2: IL-12/23 수용체 상호작용. IL-12는 IL-12Rβ1과 IL-12Rβ2에 결합한다. IL-23은 IL-12Rβ1과 IL-23R에 결합한다. IL-12p40은 IL-12Rβ1에 결합한다. IL-12p80은 IL-12Rβ1에 결합한다. 도 2.1) IL-12 및 IL-23의 서브유닛. 도 2.2) IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합을 저해하는 항체. 도 2.3) IL-12Rβ2에 IL-12의 결합과, IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 저해하는 항체.
도 3: PMA204 및 항체 1은 IL-12 (A), IL-23 (B), IL-12p40 (C) 및 IL-12p80 (D)에 ELISA에 의해 측정된 바에 따라 농도 의존적인 방식으로 결합한다.
도 4: PMA204 및 항체 1은 IL-12Rβ2(A)과 IL-12의 결합 및 IL-23R(B)과 IL-23의 결합을 중화한다.
도 5: PMA204 및 항체 1은 IL-12Rβ1(A)과 IL-12의 결합 및 IL-12Rβ1(B)과 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는다.
도 6: PMA204 및 항체 1은 IL-12Rβ1(A)과 IL-12p40의 결합 및 IL-12Rβ1(B)과 IL-23의 결합을 저해하지 않는다.
도 7: 항체 1은 IL-12Rβ1으로 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포주에 대한 IL-12p40(A), IL-12(B), IL-23(C)의 결합을 저해하지 않는다. 양성 대조군인 항체 202.1은 이 세포주에 대한 IL-12p40, IL-12 및 IL-23의 결합을 농도 의존적인 방식으로 저해한다.
도 8: 항체 1은 IL-12Rβ1으로 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포주에 결합된 IL-12p40 (A), IL-12 (B) 및 IL-23 (C)에 결합하여 복합체를 형성한다. 양성 대조군인 202.1은 이러한 복합체를 형성할 수 없었다.
도 9: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA 데이타.
도 10: 여러가지 밴드 패턴을 보이는 항체 1, 3, 4, 7 및 비교 항체의 SDS-PAGE 젤.
도 11: NK-92 세포에 의해 분비되는 IL-12 유도성 IFN-γ의 저해를 보여주는, PMA204, 항체 1, 항체 50, 항체 68 및 항체 80.
도 12: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 13: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 14: 항체 80 및 항체 136은 뮤라인 비장세포에 의한 IL-23 유도성 IL-17의 저해를 보인다.
도 15: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 16: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 17: 항체 80 및 항체 136은 인간 PBMC에 의해 분비되는 IL-12 유도성 IFN-γ의 저해를 나타낸다.
도 18: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 19: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 20: IL-12 및 IL-23에 대한 다양한 항체의 결합을 보여주는 ELISA.
도 21: 항체 136과 PMA204가 IL-12(A) 및 IL-23(B)과의 결합에 대해 경쟁함을 보여주는 경쟁적인 SPR 실험.
도 22: 항체 136과 PMA202가 IL-12(A) 및 IL-23(B)과의 결합에 대해 경쟁하지 않음을 보여주는 경쟁적인 SPR 실험.
도 23: PMA204 및 항체 202.1이 IL-12 또는 IL-23과의 결합에 대해 경쟁하지 않음을 보여주는 경쟁적인 ELISA 실험. PMA204 및 항체 136은 IL-12 및 IL-23과의 결합에 대해 경쟁한다.
도 24: 항체 80 및 항체 136은, 테스트한 항체의 최고 농도에서도 저해하지 않는 것으로 입증된 항체 202.1과 비교하여, IL-12과 IL-12Rβ2(A)의 결합 및 IL-23과 IL-23R (B)의 결합을 중화한다.
도 25: PMA204 및 항체 1은 IL-12와 IL-12Rβ1(A)의 결합 및 IL-23과 IL-12Rβ1(B)의 결합을 중화하지 않는다. 항체 202.1은 IL-12과 IL-12Rβ1(A)의 결합 및 IL-23과 IL-12Rβ1(B)의 결합에 대한 농도 의존적인 저해를 나타낸다.
도 26: 다양한 인간화된 친화성 성숙 항체들은 뮤라인 비장세포로부터의 IL-23 유도성 IL-17 분비를 저해하지 않는다. 친화성 성숙된 인간화 선두(lead) 항체 2 그룹을 나타내며, 이는 항체 80(A) 및 항체 136(B)을 기초로 함.
도 27: 마우스에 IL-23을 경피 투여한 지 6일 후 건선과 비슷한 피부 염증이 발병한다. A) 이소형 대조군의 투여는 피부 염증을 예방하지 않지만, 항체 80 및 항체 136은 낮아진 임상 수치에 의해 입증된 바와 같이 이러한 모델에서 염증을 경감시켰다. B) 조직학적 수준에서, IL-23을 6일간 진피내 투여한 후 상피 비후화가 이루어진다. 항체 80 및 항체 136을 이용한 치료로, 이러한 상피 비후화가 개선되었지만, 이소형 대조군 항체를 이용한 치료에서는 이루어지지 않았다.
도 28: 다양한 인간화된 및 친화성 성숙 항체들은 뮤라인 비장세포로부터의 키메라 IL-12 유도성 IFN-γ 분비를 저해하였다. 친화성 성숙된 인간화 선두(lead) 항체 2 그룹을 나타내며, 이는 항체 80(A) 및 항체 136(B)을 기초로 함.
도 29: 키메라 IL-12를 반복 주사한 마우스에서는 혈청내 IFN-γ 수치가 상승하였다. 항체 80 또는 항체 136을 투여한 경우, 혈청내 IFN-γ 수치는 이소형 대조군 항체를 이용한 치료 경우 보다 상대적으로 낮았다.
도 30: (A) 샌드위치 ELISA에서 항체 80으로 재조합 IL-23을 검출할 수 있다. (B) 샌드위치 ELISA에서, SAC로 자극된 PBMC에 의해 생산된 천연 생산된 IL-23을 항체 80으로 검출할 수 있다.
도 31: ELISA에 측정시, 항체 80은 IL-23WT 단백질에 강하게 결합하지만, IL-23 돌연변이인 D265A과 R266A에 대한 결합은 감소되었다.

본 발명의 발명자들은 IL-12에 대한 항체 패널을 제조하였다. 이들 항체의 스크리닝에서, 놀랍게도, 특정 서브세트의 항체가 인간 IL-12 및 IL-23에 결합하여, IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23R에 대한 IL-23의 결합은 저해하지만, IL-12Rβ1에 대한 IL-12, IL-23, IL-12p40 또는 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, IL-12 및 IL-23의 활성은 이전에는 달성하지 못했던 방식으로 변형시킬 수 있었다.

따라서, 본 발명은, 인간 IL-12 및 인간 IL-23에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하며, 단량체(인간 IL-12p40) 및 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 인간 IL-12p40에 결합하며, IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합 및 인간 IL-23R에 대한 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는, 항체를 제공한다.

바람직한 구현예로, 상기 항체는, 인간 IL-12 및/또는 인간 IL-23에 대한 결합에 대해, PMA204 (서열번호 6)의 서열을 가진 중쇄 가변부를 포함하는 항체 및/또는 PMA204 (서열번호 7)의 서열을 가진 경쇄 가변부를 포함하는 항체와 경쟁한다.

본원에서, "경쟁한다"는 테스트 화합물을 PMA204와 동일한 농도로 사용하였을 때 ELISA로 테스트한 바에 의하면 IL-12, IL-23 또는 IL-12p40에 대한 PMA204의 결합을 적어도 10%까지 감소시킨다는 것을 의미한다.

본 발명은, 서열번호 1에 기재되고 하기에 제공된 서열을 가지는, IL-12 및 IL-23에 존재하는 IL-12p40에 결합하는, 항체 또는 그것의 변이체를 제공한다:

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

바람직한 구현예에서, 항체가 결합되는 에피토프는 서열 vqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisv (서열번호 65)내에 있다. 특히, 항체는 인간 IL-12p40 (서열번호 1)에서 Asp 265에 결합한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 인간 IL-23 (서열번호 66)에 결합하는 항체 결합 도메인을 포함하며, 항체의 인간 IL-23 (서열번호 66)에 대한 결합 수준이, 항체의 돌연변이 IL-23 D265A (서열번호 75)에 대한 결합 수준 보다 높은, 항체를 제공한다.

또한, 상기 항체는, 단량체(인간 IL-12p40) 및 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 인간 IL-12p40에 결합하며, IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합 및 인간 IL-23R에 대한 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는다.

본 발명은, IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 선택적으로 중화함으로써 한가지 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 증상을 치료하는데 사용할 수 있는 항체를 제공한다.

본 발명은 하기 중에서 선택되는 3가지 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다:

CDRHC1 DYYX₁H, X₁ = M 또는 L;

CDRHC2 WIDPENGDTEX₂APKFQG, X₂ = Y, H, 또는 S;

CDRHC3 X₃KELRYFDV, X₃ = C, A, N, D, E, Q, G, H, I, L, P 또는 V.

본 발명은, 하기에서 선택되는 3가지 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다:

CDRLC1 RAX₄X₅SISINLH,

X₄ = S 또는 P;

X₅ = Q 또는 R;

CDRLC2 FAX₆QSX₇S,

X₆ = S or R;

X₇ = I 또는 T;

CDRLC3 QQSNSX₈PLT,

X₈ = W 또는 F

본 발명은 하기에서 선택되는 3가지 중쇄 CDR 서열:

CDRHC1 DYYX₁H,

X₁ = M 또는 L;

CDRHC2 WIDPENGDTEX₂APKFQG,

X₂ = Y, H, 또는 S;

CDRHC3 X₃KELRYFDV,

X₃ = C, A, N, D, E, Q, G, H, I, L, P 또는 V.

및 하기에서 선택되는 3가지 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다:

CDRLC1 RAX₄X₅SISINLH,

X₄ = S 또는 P;

X₅ = Q 또는 R;

CDRLC2 FAX₆QSX₇S,

X₆ = S 또는 R;

X₇ = I 또는 T;

CDRLC3 QQSNSX₈PLT,

X₈ = W 또는 F

본 발명은 하기 서열들 중 하나로 구성되는 면역글로불린 중쇄 가변부를 포함하는 항체를 제공한다:

서열번호:　6, 서열번호 62, 서열번호 114, 서열번호 142, 서열번호 28, 서열번호 87, 서열번호 115, 서열번호 143, 서열번호 29, 서열번호 88, 서열번호 116, 서열번호 144, 서열번호 30, 서열번호 90, 서열번호 117, 서열번호 145, 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 118, 서열번호 146, 서열번호 33, 서열번호 92, 서열번호 119, 서열번호 147, 서열번호 34, 서열번호 93, 서열번호 120, 서열번호 148, 서열번호 35, 서열번호 94, 서열번호 122, 서열번호 149, 서열번호 36, 서열번호 95, 서열번호 124, 서열번호 150, 서열번호 38, 서열번호 96, 서열번호 125, 서열번호 151, 서열번호 39, 서열번호 97, 서열번호 126, 서열번호 152, 서열번호 40, 서열번호 99, 서열번호 127, 서열번호 153, 서열번호 41, 서열번호 100, 서열번호 128, 서열번호 154, 서열번호 42, 서열번호 101, 서열번호 129, 서열번호 155, 서열번호 43, 서열번호 102, 서열번호 130, 서열번호 156, 서열번호 44, 서열번호 103, 서열번호 131, 서열번호 157, 서열번호 45, 서열번호 104, 서열번호 132, 서열번호 158, 서열번호 53, 서열번호 105, 서열번호 133, 서열번호 159, 서열번호 54, 서열번호 106, 서열번호 134, 서열번호 160, 서열번호 55, 서열번호 107, 서열번호 135, 서열번호 161, 서열번호 56, 서열번호 108, 서열번호 136, 서열번호 162, 서열번호 57, 서열번호 109, 서열번호 137, 서열번호 163, 서열번호 58, 서열번호 110, 서열번호 138, 서열번호 164, 서열번호 59, 서열번호 111, 서열번호 139, 서열번호 165, 서열번호 60, 서열번호 112, 서열번호 140, 서열번호 166, 서열번호 61, 서열번호 113, 서열번호 141 및 서열번호 167.

본 발명은 하기 서열 중 하나로 구성되는 면역글로불린 경쇄 가변부를 포함하는 항체를 제공한다:

서열번호 7, 서열번호 169, 서열번호 181, 서열번호 193, 서열번호 32, 서열번호 170, 서열번호 182, 서열번호 194, 서열번호 37, 서열번호 171, 서열번호 183, 서열번호 195, 서열번호 42, 서열번호 172, 서열번호 184, 서열번호 196, 서열번호 46, 서열번호 173, 서열번호 185, 서열번호 197, 서열번호 47, 서열번호 174, 서열번호 186, 서열번호 198, 서열번호 48, 서열번호 175, 서열번호 187, 서열번호 199, 서열번호 49, 서열번호 176, 서열번호 188, 서열번호 200, 서열번호 50, 서열번호 177, 서열번호 189, 서열번호 201, 서열번호 51, 서열번호 178, 서열번호 190, 서열번호 52, 서열번호 179 및 서열번호 192.

본 발명은 인간 중쇄 억셉터 프래임워크를 더 포함하는 항체를 제공한다. 특히, 항체에서, 상기 프래임워크는 서열번호 202, 서열번호 205, 서열번호 208, 서열번호 203, 서열번호 206, 서열번호 209, 서열번호 204 및 서열번호 207로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 인간 경쇄 억셉터 프래임워크를 더 포함하는 항체를 제공한다. 특히, 항체에서, 상기 프래임워크는 서열번호 210, 서열번호 213, 서열번호 216, 서열번호 211, 서열번호 214, 서열번호 212 및 서열번호 215로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 2가지 면역글로불린 가변부를 포함하는 항체로서, 상기 2가지 면역글로불린 가변부는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 제공한다:

서열번호 6 & 서열번호 7 서열번호 115 & 서열번호 190

서열번호 6 & 서열번호 169 서열번호 115 & 서열번호 192

서열번호 28 & 서열번호 179 서열번호 115 & 서열번호 193

서열번호 29 & 서열번호 179 서열번호 115 & 서열번호 194

서열번호 30 & 서열번호 179 서열번호 115 & 서열번호 195

서열번호 31 & 서열번호 32 서열번호 115 & 서열번호 196

서열번호 33 & 서열번호 179 서열번호 115 & 서열번호 197

서열번호 34 & 서열번호 51 서열번호 115 & 서열번호 198

서열번호 34 & 서열번호 47 서열번호 115 & 서열번호 199

서열번호 35 & 서열번호 179 서열번호 115 & 서열번호 200

서열번호 36 & 서열번호 37 서열번호 115 & 서열번호 201

서열번호 38 & 서열번호 179 서열번호 116 & 서열번호 173

서열번호 38 & 서열번호 51 서열번호 116 & 서열번호 174

서열번호 38 & 서열번호 32 서열번호 116 & 서열번호 175

서열번호 38 & 서열번호 47 서열번호 116 & 서열번호 176

서열번호 38 & 서열번호 52 서열번호 116 & 서열번호 177

서열번호 39 & 서열번호 179 서열번호 117 & 서열번호 173

서열번호 40 & 서열번호 179 서열번호 117 & 서열번호 174

서열번호 41 & 서열번호 42 서열번호 117 & 서열번호 175

서열번호 43 & 서열번호 179 서열번호 117 & 서열번호 176

서열번호 44 & 서열번호 179 서열번호 117 & 서열번호 177

서열번호 44 & 서열번호 51 서열번호 118 & 서열번호 178

서열번호 44 & 서열번호 32 서열번호 118 & 서열번호 179

서열번호 44 & 서열번호 47 서열번호 119 & 서열번호 178

서열번호 44 & 서열번호 52 서열번호 119 & 서열번호 179

서열번호 45 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 51

서열번호 45 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 189

서열번호 53 & 서열번호 41 서열번호 119 & 서열번호 46

서열번호 54 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 47

서열번호 55 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 48

서열번호 56 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 49

서열번호 57 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 50

서열번호 58 & 서열번호 42 서열번호 119 & 서열번호 51

서열번호 59 & 서열번호 179 서열번호 119 & 서열번호 52

서열번호 60 & 서열번호 179 서열번호 120 & 서열번호 178

서열번호 61 & 서열번호 42 서열번호 120 & 서열번호 179

서열번호 62 & 서열번호 42 서열번호 122 & 서열번호 176

서열번호 87 & 서열번호 7 서열번호 124 & 서열번호 176

서열번호 88 & 서열번호 7 서열번호 125 & 서열번호 176

서열번호 90 & 서열번호 7 서열번호 126 & 서열번호 176

서열번호 91 & 서열번호 7 서열번호 127 & 서열번호 176

서열번호 92 & 서열번호 7 서열번호 128 & 서열번호 176

서열번호 93 & 서열번호 7 서열번호 129 & 서열번호 176

서열번호 94 & 서열번호 7 서열번호 130 & 서열번호 176

서열번호 95 & 서열번호 7 서열번호 131 & 서열번호 176

서열번호 96 & 서열번호 7 서열번호 132 & 서열번호 176

서열번호 97 & 서열번호 7 서열번호 133 & 서열번호 176

서열번호 99 & 서열번호 7 서열번호 134 & 서열번호 176

서열번호 100 & 서열번호 7 서열번호 135 & 서열번호 176

서열번호 101 & 서열번호 7 서열번호 136 & 서열번호 176

서열번호 102 & 서열번호 7 서열번호 137 & 서열번호 176

서열번호 103 & 서열번호 7 서열번호 138 & 서열번호 176

서열번호 104 & 서열번호 7 서열번호 139 & 서열번호 176

서열번호 105 & 서열번호 7 서열번호 140 & 서열번호 176

서열번호 106 & 서열번호 171 서열번호 141 & 서열번호 176

서열번호 106 & 서열번호 172 서열번호 142 & 서열번호 176

서열번호 107 & 서열번호 171 서열번호 143 & 서열번호 176

서열번호 107 & 서열번호 172 서열번호 144 & 서열번호 176

서열번호 108 & 서열번호 171 서열번호 145 & 서열번호 176

서열번호 108 & 서열번호 172 서열번호 146 & 서열번호 176

서열번호 109 & 서열번호 170 서열번호 147 & 서열번호 176

서열번호 110 & 서열번호 171 서열번호 148 & 서열번호 176

서열번호 111 & 서열번호 172 서열번호 149 & 서열번호 176

서열번호 112 & 서열번호 169 서열번호 150 & 서열번호 176

서열번호 113 & 서열번호 173 서열번호 151 & 서열번호 176

서열번호 113 & 서열번호 174 서열번호 152 & 서열번호 176

서열번호 113 & 서열번호 175 서열번호 153 & 서열번호 189

서열번호 113 & 서열번호 176 서열번호 154 & 서열번호 189

서열번호 113 & 서열번호 177 서열번호 155 & 서열번호 189

서열번호 113 & 서열번호 176 서열번호 156 & 서열번호 189

서열번호 114 & 서열번호 173 서열번호 157 & 서열번호 189

서열번호 114 & 서열번호 174 서열번호 158 & 서열번호 189

서열번호 114 & 서열번호 175 서열번호 159 & 서열번호 189

서열번호 114 & 서열번호 176 서열번호 160 & 서열번호 189

서열번호 114 & 서열번호 177 서열번호 161 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 173 서열번호 161 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 174 서열번호 162 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 175 서열번호 162 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 176 서열번호 163 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 177 서열번호 163 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 181 서열번호 164 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 182 서열번호 164 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 183 서열번호 165 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 184 서열번호 165 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 185 서열번호 166 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 186 서열번호 166 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 187 서열번호 167 & 서열번호 189

서열번호 115 & 서열번호 188 서열번호 167 & 서열번호 179

서열번호 115 & 서열번호 189 서열번호 168 & 서열번호 189

본 발명은, 인간 억셉터 프래임워크에 키(key) 잔기 위치에 하나 이상의 프래임워크 영역 아미노산 치환을 포함하며, 상기 키 잔기는 CDR에 인접한 잔기, 당화부 잔기, 빈도가 낮은 잔기(rare residue), 인간 IL-12의 p40 서브유닛과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 캐논 잔기(canonical residue), 중쇄 가변부와 경쇄 가변부 사이의 교량 잔기(contact residue), 베니어 영역(Vernier zone) 내부 잔기, 및 코티아-정의에 따른 VH 도메인 CDR1과 카바트-정의에 따른 제1 중쇄 프래임워크 간에 중첩되는 영역내 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 상기 인간 억셉터 프래임워크는 하나 이상의 프래임워크 영역 아미노산 치환을 포함하며, 이때 상기 프래임의 아미노산 서열이 상기 인간 억셉터 프래임워크 서열과 65% 이상 동일하며, 상기 인간 억셉터 프래임워크와 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명은, 컨센서스 인간 VH 도메인인 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 컨센서스 인간 VL 도메인인 항체를 제공한다.

본 발명은, 인간 억셉터 프래임워크가 하나 이상의 프래임워크 영역 아미노산 치환을 포함하며, 상기 프래임워크의 아미노산 서열이 상기 인간 억셉터 프래임워크의 서열과 65% 이상 동일하며, 상기 인간 억셉터 프래임워크와 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 항체를 제공한다.

본 발명은, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE 및 IgA로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 비-인간 영장류의 중쇄 면역글로불린 불변부를 포함하는, 항체에 관한 것이다.

본 발명은, 카파 또는 람다로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 비-인간 영장류의 경쇄 면역글로불린 불변부를 포함하는, 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명의 항체 제조 방법을 제공한다:

(i) 동물을 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p40의 단편으로 면역화하여, 제1 패널의 항체를 수득하는 단계;

(ii) 상기 제1 패널의 항체들로부터 인간 IL-12 및 인간 IL-23에 결합하는 항체를 선별하여, 제2 패널의 항체로 취하는 단계; 및

(iii) 상기 제2 패널의 항체들로부터, 단량체(인간 IL-12p40) 및 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 p40에 결합하며, 인간 IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합과 인간 IL-23R에 대한 인간 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는, 항체를 선별하는 단계.

또한, 본 발명은, 단계 (ii)에서 서열: vqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisv (서열번호 65)을 가지는 펩타이드에도 결합하는 항체를 선별하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명의 항체를 제조하는 다른 방법을 제공한다:

(i) 동물을, 서열: vqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisv (서열번호 65)을 가지는 펩타이드로 면역화하여, 제1 패널의 항체를 수득하는 단계;

(ii) 상기 제1 패널의 항체들로부터 인간 IL-12 및 인간 IL-23에 결합하는 항체를 선별하여, 제2 패널의 항체를 취하는 단계; 및

(i) 인간 항체 디스플레이 라이브러리를 수득하여, 제1 패널의 항체를 취하는 단계;

(iii) 상기 제2 패널의 항체들로부터, 단량체(인간 IL-12p40) 및/또는 동형이량체(인간 IL-12p80)로서 존재하는 p40에 결합하며, 인간 IL-12Rβ2에 대한 인간 IL-12의 결합과 인간 IL-23R에 대한 인간 IL-23의 결합은 저해하지만, 인간 IL-12Rβ1에 대한 인간 IL-12, 인간 IL-23, 인간 IL-12p40 또는 인간 IL-12p80의 결합은 저해하지 않는, 항체를 선별하는 단계.

본 발명은 본 발명의 VH 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 하기 서열 중에서 선택되는 서열을 가지는 것이 바람직하다:

서열번호 217 서열번호 254 서열번호 282 서열번호 310

서열번호 218 서열번호 255 서열번호 283 서열번호 311

서열번호 219 서열번호 257 서열번호 284 서열번호 312

서열번호 220 서열번호 258 서열번호 285 서열번호 313

서열번호 222 서열번호 259 서열번호 286 서열번호 314

서열번호 223 서열번호 260 서열번호 287 서열번호 315

서열번호 224 서열번호 261 서열번호 289 서열번호 316

서열번호 225 서열번호 262 서열번호 291 서열번호 317

서열번호 227 서열번호 263 서열번호 292 서열번호 318

서열번호 228 서열번호 264 서열번호 293 서열번호 319

서열번호 229 서열번호 266 서열번호 294 서열번호 320

서열번호 230 서열번호 267 서열번호 295 서열번호 321

서열번호 232 서열번호 268 서열번호 296 서열번호 322

서열번호 233 서열번호 269 서열번호 297 서열번호 323

서열번호 234 서열번호 270 서열번호 298 서열번호 324

서열번호 242 서열번호 271 서열번호 299 서열번호 325

서열번호 243 서열번호 272 서열번호 300 서열번호 326

서열번호 244 서열번호 273 서열번호 301 서열번호 327

서열번호 245 서열번호 274 서열번호 302 서열번호 328

서열번호 246 서열번호 275 서열번호 303 서열번호 329

서열번호 247 서열번호 276 서열번호 304 서열번호 330

서열번호 248 서열번호 277 서열번호 305 서열번호 331

서열번호 249 서열번호 278 서열번호 306 서열번호 332

서열번호 250 서열번호 279 서열번호 307 서열번호 333

서열번호 251 서열번호 280 서열번호 308 서열번호 334

서열번호 252 서열번호 281 서열번호 309 서열번호 335

본 발명은 본 발명의 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 하기 서열 중에서 선택되는 서열을 가지는 것이 바람직하다:

서열번호 221 서열번호 338 서열번호 350 서열번호 362

서열번호 226 서열번호 339 서열번호 351 서열번호 363

서열번호 231 서열번호 340 서열번호 352 서열번호 364

서열번호 235 서열번호 341 서열번호 353 서열번호 365

서열번호 236 서열번호 342 서열번호 354 서열번호 366

서열번호 237 서열번호 343 서열번호 355 서열번호 367

서열번호 238 서열번호 344 서열번호 356 서열번호 368

서열번호 239 서열번호 345 서열번호 357 서열번호 369

서열번호 240 서열번호 346 서열번호 358 서열번호 370

서열번호 241 서열번호 347 서열번호 359

서열번호 336 서열번호 348 서열번호 361

또한, 본 발명은 개체에게 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선 관절염, 골 감소, 기도 과민증, 만성 폐색성 폐 질환, 탈수초 질환, 건선, 다발성 경화증, 진피 과민증, 급성 및 만성 이식 거부 반응, 동종이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질환, 전신 경화증, 홍반성 전신 루푸스, 자가면역성 장 염증 질환, 비뇨기과 염증 질환, 심혈관 질환, 맥관염, 주기적인 발열(periodic fever), 포도당 대사 장애, 폐 질환, 암, 치근막염, 포진성 기질 각막염(herpetic stromal keratitis), 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 수막염, 수술 외상, 자가면역성 혈액 장애, 알츠하이머 질환, 유육종증, 간경변, 간염(자가면역성 간염 포함), 원발성 담즙성 경변, 포도막염, 갑상선염, 죽상경화증, 탈모증, 윌슨 질환, 사구체 신염 및 이상 지질 혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은, 또한, 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 및/또는 본원에 기술된 바와 같이, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 한가지 이상의 IL-12 및/또는 IL-23의 증상 및/또는 필요에 따라 수많은 여러가지 증상을 조절하기 위해, 치료하기 위해, 또는 경감시키기 위해, 관련 질환 또는 치료 증상 이전에, 이후에 또는 수행 중에, 치료학적 유효량으로 투여하는, 방법 또는 조성물 중의 1종 이상의 항체, 그의 특정 부분 또는 변이체를 제공한다.

본 발명은, 신경 장애 및 관련 장애, 예컨대 비제한적으로, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 홍반성 전신 루푸스, 크론 질환, 궤양성 직장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염 경피증, 이식 편색 숙주 질환, 장기 이식 거부 반응, 장기 이식과 관련있는 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상경화증, 파종성 혈관내 응고증(disseminated intravascular coagulation), 가와사키 질환, 그레이브 질환, 신장증 증후군, 만성 피로 증후군, 베거너 육아종증, 헤노호-쉔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척추염, 애디슨 질환, 산발성, 1형 다분비선 결핍증 및 2형 다분비선 결핍증, 슈미츠 증후군, 성인(급성)호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청음성의 관절병증, 관절병증, 레이터 질환, 건선성 관절병증, 궤양성 질장 관절병증, 장병증성 관절병증, 클라미디아, 관절병증과 관련된 예르시나 및 살모넬라, 척추관절염, 아테롬성 질환/동맥 경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소증(Coombs positive haemolytic anaemia), 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근육통성 뇌척수염/로얄 프리 질환(Royal Free Disease), 만성 점막 피부 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 특발성 자가면역성 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(common varied immunodeficiency)(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심장근육병증, 여성 불임, 난소 장애, 조기 난소 부전(premature ovarian failure), 섬유화 폐 질환, 원인미상의 섬유화 폐포염, 염증후 간질 폐 질환(post-inflammatory interstitial lung disease), 간질성 폐렴, 간질성 폐 질환 관련 결합 조직 질환, 폐 질환 관련 혼성 결합 조직 질환, 간질성 폐 질환 관련 전신 경화증, 간질성 폐 질환 관련 류마티스 관절염, 간질성 폐 질환 관련 전신 홍반성 루푸스, 퍼스는, 폐 질환, 간 질환 관련 피부근육염/다발성 근육염, 폐 질환 관련 쇼그렌 질환, 폐 질환 관련 강직성 척추염, 폐 질환 관련 미만성 혈관염(vasculitic diffuse lung disease), 폐 질환 관련 폐혈철증(haemosiderosis associated lung disease), 약물-유도성 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사성 섬유증, 폐쇄성 세기관지염(bronchiolitis obliterans), 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환(lymphocytic infiltrative lung disease), 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역성 간염, 1형 자가면역성 간염(고전적 자가면역 질환 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역성 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 질환 매개의 저혈당증, 흑색 극세포증으로 인한 B형 인슐린 내성(type B insulin resistance with acanthosis nigricans), 부갑상선 기능 저하증, 장기 이식과 관련된 급성 면역 질환, 장기 이식과 관련된 만성 면역 질환, 변형성 관절증(osteoarthrosis), 원발성 경화 담관염(primary sclerosing cholangitis), 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구 감소증(idiopathic leucopaenia), 자가면역 호중구 감소증, 신장병 NOS, 사구체신염(glomerulonephritide), 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 루푸스(discoid lupus erythematosus), 남성 특발성 불임 또는 NOS, 정자 자가면역성, 다발성 경화증(모든 서브타입), 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 결합 조직 질환으로 인한 이차적 폐 고혈압(pulmonary hypertension secondary to connective tissue disease), 굿파스튜어 증후군, 결절성 다발 동맥염의 폐 증상(pulmonary manifestation of polyarteritis nodosa), 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸 질환, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야수 질환/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종으로 인한 자가면역성 갑상선 기능저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종(primary myxoedema), 수정체성 포도막염(phacogenic uveitis), 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변, 알코올-유발성 간 손상, 콜레오사타티스(choleosatatis), 특이성 간 질환(idiosyncratic liver disease), 약물-유도성 간염, 비-알코올성 지방간염(Non-alcoholic Steatohepatitis), 알레르기 및 천식, B그룹의 연쇄구균(GBS) 간염, 정신 장애(예, 우울증 및 정신분열증), T_H2 타입 및 T_H1 타입 매개 질환, 급성 및 만성 통증(여러가지 형태의 통증), 및 암, 예컨대 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장, 조혈 악성 종양(백혈병과 림프종), 아베타리포프로테미아(Abetalipoprotemia), 말단 청색증(Acrocyanosis), 급성 및 만성 건선성 또는 감염성 프로세스, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 체장염, 급선 신부전, 선암(adenocarcinomas), 공중 이소성 박동(aerial ectopic beats), AIDS 치매 복합증, 알코올-유도성 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부반응, 알파-1-항트립신 결핍증, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 척수 전각 세포 변성(anterior horn cell degeneration), 항 cd3 요법, 항인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥루(arteriovenous fistula), 기능 장애(ataxia), 심방 세동(atrial fibrillation)(지속성 또는 발작성), 심방 조동(atrial flutter), 방실 차단(atrioventricular block), B 세포 림프종, 골 이식 거부반응, 골수 이식(BMT) 거부 반응, 각차단(bundle branch block), 버킷 림프종, 화상, 심장 부정맥, 심장 마비 증후군(cardiac stun syndrome), 심장 종양, 심근증, 심폐 바이패스 염증 반응, 연골 이식 거부 반응, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란성 또는 다소성 심방 빈맥(chaotic or multifocal atrial tachycardia), 화학 요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병증, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 만성 실리실레이트 중독(chronic salicylate intoxication), 결장직장암, 울혈 심장 부전, 결막염, 접촉 피부염, 폐성심(cor pulmonale), 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트 - 야콥 병, 문화,배양 음성 패혈증(culture negative sepsis), 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 두부 손상 치매(Dementia pugilistica), 탈수초 질환, 뎅그열 출혈성 발열, 피부염, 피부 질환, 당뇨병(diabetes, diabetes mellitus), 당뇨벙셩 죽상경화성 질환, 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 확장성 울혈성 심근증(dilated congestive cardiomyopathy), 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유발되는 약물 유발성 운동 장애, 약물 민감증(drug sensitivity), 부종, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염증, 피부홍통증(erythromelalgia), 추체외로계 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구 포식성 림프조직구 증후군(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis), 태아 흉선 이식 거부 반응(fetal thymus implant rejection), 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 질환, 곰팡이 패혈증, 가스 괴저, 위궤양, 사구체 신장염, 임의 기관 또는 조직의 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 할레로르덴-스파츠 질환(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부 반응, 혈색소증(hemachromatosis), 혈액 투석(hemodialysis), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome)/혈전용해성 혈소판 감소성 자반증(thrombolytic thrombocytopenic purpura), 출혈, 간염 (A), 히스 번들 부정맥(His bundle arrythmias), EQV 감염/HIV 신경변증, 호지킨 질환, 과운동성 장애(hyperkinetic movement disorder), 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족성 장애(hypokinetic movement disorder), 시상하부-뇌하수체-부식 축 검사(hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation), 특발성 애디슨병, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증(Asthenia), 소아 척수 근육 위축증(infantile spinal muscular atrophy), 대동맥 염증, A형 인플루엔자, 이온화 방사선 노출, 홍채 모양체염/포도막염/안 신경염, 허혈성-재관류 손상, 허혈성 뇌졸증, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척수 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부반응, 레지오넬라(legionella), 리슈마니아증(leishmaniasis), 나병(leprosy), 피질척수계의 손상, 지방부종(lipedema), 간 이식 거부반응, 림프수종(lymphedema), 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증(malignant histiocytosis), 악성 흑색종, 뇌막염, 수악구균혈증(meningococcemia), 대사성/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다발 체계 장애(mitochondrial multiple system disorder), 혼성 결합 조직 질환(mixed connective tissue disease), 단일클론 감마글로불린혈증(monoclonal gammopathy), 다발성 골수종, 다발성 체계 변성(multiple systems degeneration)(멘셀 데예린 - 토마스 시-드라거 및 마차도-요셉), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 미코박테리아 아비움 인트라셀룰라레(mycobacterium avium intracellulare), 결핵균(mycobacterium tuberculosis), 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome), 심근 경색(myocardial infarction), 심근 허혈성 장애(myocardial ischemic disorder), 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma), 신생아 만성 폐 질환(neonatal chronic lung disease), 신장염, 신장증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근위축증(neurogenic I muscular atrophy), 호중구 감소성 열(neutropenic fever), 비호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 그 줄기의 폐색, 폐색성 동맥 장애, okt3 요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관 복원 시술(vasectomy reversal procedure), 장기 비대증(organomegaly), 골다공증, 췌장 이식 거분 반응, 췌장 암종, 부수종양성 증후군(paraneoplastic syndrome)/악성 종양으로 인한 고칼슘혈증(hypercalcemia of malignancy), 부갑상선 이식 거부 반응(parathyroid transplant rejection), 골반 염증 질환(pelvic inflammatory disease), 통년성 비염(perennial rhinitis), 심낭 질환(pericardial disease), 말초 죽상경화성 질환(peripheral atherlosclerotic disease), 말초 혈관 장애(peripheral vascular disorder), 복막염(peritonitis), 악성 빈혈(pernicious anemia), 폐포자충 폐렴(Pneumocystis carinii pneumonia), 폐렴, POEMS 중후군(다발신경병증, 장기 비대증, 내분비선 이상(endocrinopathy), 단일클론 감마글로불린혈증 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프 후 증후군, MI 후 카디오토미 증후군(post-MI cardiotomy syndrome), 자간전증(preeclampsia), 진핵성 핵성 마비(Progressive supranucleo Palsy), 원발성 폐 고혈압(primary pulmonary hypertension), 방사성 요법, 레이노드 현상 및 질환, 레프섬 질환(Refsum's disease), 규칙적인 협소 QRS 빈맥(regular narrow QRS tachycardia), 신혈관성 고혈압(renovascular hypertension), 제한성 심근병증(restrictive cardiomyopathy), 육종, 경피증, 노인 무도병(senile chorea), 루이 소체 타입의 노인성 치매(Senile Dementia of Lewy body type), 혈청 음성 관절증, 쇼크, 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 피부 동종이식 거부반응, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부반응, 고형암, 특이적인 부정맥(specific arrythmias), 척추 운동실조(spinal ataxia), 척수 소뇌 변성증(spinocerebellar degeneration), 연쇄상 구균 근염(streptococcal myositis), 소뇌의 구조적 손상, 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 실신, 심혈관계의 매독(syphilis of the cardiovascular system), 전신 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 유년기 개시 전신 류마티스 관절염(systemic onset juvenile rheumatoid arthritis), T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관 확장증(Telangiectasia), 폐쇄 혈전 혈관염(thromboangitis obliterans), 혈소팡 감소증(thrombocytopenia), 독성, 이식, 외상/출혈, M형 과민 반응, IV형 과민증, 불안정 협심증(unstable angina), 요독증, 요패혈증, 두드러기, 심장 판막 질환(valvular heart disease), 정맥류성 정맥(varicose vein), 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염증, 활성 뇌염(vital encephalitis)/무균성 뇌막염(aseptic meningitis), 활력-관련 혈구 탐식증(vital-associated hemaphagocytic syndrome), 베르니케-코르사코프(Wernicke-Korsakoff) 증후군, 윌슨 질환, 임의 장기 또는 조직의 이종 이식 거부 반응의 증상을, 조절, 치료 또는 경감시키기 위해, 치료학적 유효량으로 투여하는, 방법 또는 조성물의, 1종 이상의 항체, 그것의 특정 부분 또는 변이체를 추가로 제공한다.

본 발명의 범위에 친화성 성숙된 항-IL-12/IL-23 항체가 포함된다.

항체의 친화성 성숙화를 위한 수많은 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법 대부분은 돌연변이 유발에 의해 다양한 단백질 패널 또는 라이브러리를 제조한 다음, 개선된 친화성을 선별 및/또는 스크리닝하는 일반적인 전략을 기초로 한다. 돌연변이 유발은 대개 DNA 수준에서, 예컨대 에러 유발성(error prone) PCR(Thie 2009)에 의해, 유전자 셔플링(Kolkman 2001)에 의해, 돌연변이 유발 화합물 또는 방사선 조사에 의해, 에러 유발성 복제 장치를 이용한 '돌연변이' 균주를 사용함으로써(Greener 1996), 또는 천연 친화성 숙성 방치를 이용하는 체세포 과 돌연변이화 방법(Peled 2008)에 의해 수행된다. 또한, 돌연변이 유발은, 예컨대 Qβ 리플리카제(replicase)(Kopsidas 2006)를 사용함으로써 RNA 수준에서도 수행할 수 있다. 개선된 변이체 단백질을 스크리닝할 수 있는 라이브러리-기반의 방법들은 파지, 효모, 리보솜, 박테리아 또는 포유류 세포와 같이 다양한 디스플레이 기법을 기초로 할 수 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(Benhar 2007).　 친화성 성숙은, 다수의 지정되고/예측된 방법들에 의해, 예컨대 부위 특이적인 돌연변이 유발 또는 3D 단백질 모델링 탐색에 의해 인도되는 유전자 합성으로 달성할 수 있다(예, Queen 1989; 또는 미국 특허 제 6,180,370호 또는 제 5,225,539호).

즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 IL-12p40에 결합하는 항원 결합 도메인을 제조하는 방법을 제공한다:

a. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 모체 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가, 결손, 치환 또는 삽입함으로써, 상기 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체를 제공하는 단계, 및 선택적으로, 상기 제공되는 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여, 하나 이상의 VH/VL 조합을 제공하는 단계로서, 상기 모체 VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 상기에 정의된 CDR들의 한 세트인 단계; 및

b. 상기 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인, 또는 상기 VH/VL 조합 또는 조합들을 테스트하여, 인간 IL-12p40에 대한 항체 항원 결합 도메인을 동정하는 단계.

상기 모체 VH 도메인은 하기에 나타낸 VH 도메인 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다: 서열번호:　6, 서열번호 62, 서열번호 114, 서열번호 142, 서열번호 28, 서열번호 87, 서열번호 115, 서열번호 143, 서열번호 29, 서열번호 88, 서열번호 116, 서열번호 144, 서열번호 30, 서열번호 90, 서열번호 117, 서열번호 145, 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 118, 서열번호 146, 서열번호 33, 서열번호 92, 서열번호 119, 서열번호 147, 서열번호 34, 서열번호 93, 서열번호 120, 서열번호 148, 서열번호 35, 서열번호 94, 서열번호 122, 서열번호 149, 서열번호 36, 서열번호 95, 서열번호 124, 서열번호 150, 서열번호 38, 서열번호 96, 서열번호 125, 서열번호 151, 서열번호 39, 서열번호 97, 서열번호 126, 서열번호 152, 서열번호 40, 서열번호 99, 서열번호 127, 서열번호 153, 서열번호 41, 서열번호 100, 서열번호 128, 서열번호 154, 서열번호 42, 서열번호 101, 서열번호 129, 서열번호 155, 서열번호 43, 서열번호 102, 서열번호 130, 서열번호 156, 서열번호 44, 서열번호 103, 서열번호 131, 서열번호 157, 서열번호 45, 서열번호 104, 서열번호 132, 서열번호 158, 서열번호 53, 서열번호 105, 서열번호 133, 서열번호 159, 서열번호 54, 서열번호 106, 서열번호 134, 서열번호 160, 서열번호 55, 서열번호 107, 서열번호 135, 서열번호 161, 서열번호 56, 서열번호 108, 서열번호 136, 서열번호 162, 서열번호 57, 서열번호 109, 서열번호 137, 서열번호 163, 서열번호 58, 서열번호 110, 서열번호 138, 서열번호 164, 서열번호 59, 서열번호 111, 서열번호 139, 서열번호 165, 서열번호 60, 서열번호 112, 서열번호 140, 서열번호 166, 서열번호 61, 서열번호 113, 서열번호 141 또는 서열번호 167.

상기 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인은 CDR 돌연변이 유발에 의해 제공될 수 있다.

이러한 방법에 있어서, 하나 이상의 VL 도메인은, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 모체 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 서열을 부가, 결손, 치환 또는 삽입함으로써, 각각이 상기 모체 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VL 도메인을 제조함으로써 제공되며, 상기 모체 VL 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 전술한 CDR들의 한가지 VL 세트이다.

상기 모체 VL 도메인은 하기로 나타낸 VL 도메인 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다: 서열번호 7, 서열번호 169, 서열번호 181, 서열번호 193, 서열번호 32, 서열번호 170, 서열번호 182, 서열번호 194, 서열번호 37, 서열번호 171, 서열번호 183, 서열번호 195, 서열번호 42, 서열번호 172, 서열번호 184, 서열번호 196, 서열번호 46, 서열번호 173, 서열번호 185, 서열번호 197, 서열번호 47, 서열번호 174, 서열번호 186, 서열번호 198, 서열번호 48, 서열번호 175, 서열번호 187, 서열번호 199, 서열번호 49, 서열번호 176, 서열번호 188, 서열번호 200, 서열번호 50, 서열번호 177, 서열번호 189, 서열번호 201, 서열번호 51, 서열번호 178, 서열번호 190, 서열번호 52, 서열번호 179 또는 서열번호 192.

상기 모체 VL 도메인의 아미노산 변이체인 상기 VL 도메인은 CDR 돌연변이 유발에 의해 제공될 수 있다.

항체 항원 결합 도메인은, IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자의 구성 성분으로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인간 IL-12p40에 결합하는 항원 결합 도메인의 제조 방법을 제공한다:

a. VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산, 또는 각 VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산 레퍼토리를 제공하는 단계로서, 상기 VH 도메인은 서열번호:　6, 서열번호 62, 서열번호 114, 서열번호 142, 서열번호 28, 서열번호 87, 서열번호 115, 서열번호 143, 서열번호 29, 서열번호 88, 서열번호 116, 서열번호 144, 서열번호 30, 서열번호 90, 서열번호 117, 서열번호 145, 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 118, 서열번호 146, 서열번호 33, 서열번호 92, 서열번호 119, 서열번호 147, 서열번호 34, 서열번호 93, 서열번호 120, 서열번호 148, 서열번호 35, 서열번호 94, 서열번호 122, 서열번호 149, 서열번호 36, 서열번호 95, 서열번호 124, 서열번호 150, 서열번호 38, 서열번호 96, 서열번호 125, 서열번호 151, 서열번호 39, 서열번호 97, 서열번호 126, 서열번호 152, 서열번호 40, 서열번호 99, 서열번호 127, 서열번호 153, 서열번호 41, 서열번호 100, 서열번호 128, 서열번호 154, 서열번호 42, 서열번호 101, 서열번호 129, 서열번호 155, 서열번호 43, 서열번호 102, 서열번호 130, 서열번호 156, 서열번호 44, 서열번호 103, 서열번호 131, 서열번호 157, 서열번호 45, 서열번호 104, 서열번호 132, 서열번호 158, 서열번호 53, 서열번호 105, 서열번호 133, 서열번호 159, 서열번호 54, 서열번호 106, 서열번호 134, 서열번호 160, 서열번호 55, 서열번호 107, 서열번호 135, 서열번호 161, 서열번호 56, 서열번호 108, 서열번호 136, 서열번호 162, 서열번호 57, 서열번호 109, 서열번호 137, 서열번호 163, 서열번호 58, 서열번호 110, 서열번호 138, 서열번호 164, 서열번호 59, 서열번호 111, 서열번호 139, 서열번호 165, 서열번호 60, 서열번호 112, 서열번호 140, 서열번호 166, 서열번호 61, 서열번호 113, 서열번호 141 및 서열번호 167로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계;

b. 상기 출발 핵산 또는 출발 핵산 레퍼토리를, 아미노산 서열의 돌연변이화에 의해 코딩되거나 제조된 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들과 조합하여, 상기 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들을 상기 출발 핵산 또는 출발 핵산 레퍼토리내 VH 도메인에 삽입함으로써, VH 도메인을 코딩하는 핵산 산물 레퍼토리를 제공하는 단계; 상기 핵산 산물 레퍼토리를 발현시켜, VH 도메인 산물을 제조하는 단계;

c. 선택적으로, 상기 VH 도메인 산물을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계;

d. 인간 IL-12p40에 대한 항원 결합 도메인을 선별하는 단계;

e. VH 산물 도메인과 선택적으로는 VL 도메인을 포함하는, 상기 항원 결합 도메인 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인간 IL-12p40에 결합하는 항원 결합 도메인을 제조하는 방법을 제공한다:

a. VL 도메인을 코딩하는 출발 핵산, 또는 각 VL 도메인을 코딩하는 출발 핵산 레퍼토리를 제공하는 단계로서, 상기 VL 도메인은 서열번호 7, 서열번호 169, 서열번호 181, 서열번호 193, 서열번호 32, 서열번호 170, 서열번호 182, 서열번호 194, 서열번호 37, 서열번호 171, 서열번호 183, 서열번호 195, 서열번호 42, 서열번호 172, 서열번호 184, 서열번호 196, 서열번호 46, 서열번호 173, 서열번호 185, 서열번호 197, 서열번호 47, 서열번호 174, 서열번호 186, 서열번호 198, 서열번호 48, 서열번호 175, 서열번호 187, 서열번호 199, 서열번호 49, 서열번호 176, 서열번호 188, 서열번호 200, 서열번호 50, 서열번호 177, 서열번호 189, 서열번호 201, 서열번호 51, 서열번호 178, 서열번호 190, 서열번호 52, 서열번호 179 및 서열번호 192로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계;

b. 상기 출발 핵산 또는 출발 핵산 레퍼토리를, 아미노산 서열의 돌연변이화에 의해 코딩되거나 제조된 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들과 조합하여, 상기 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들을 상기 출발 핵산 또는 출발 핵산 레퍼토리내 VL 도메인에 삽입함으로써, VL 도메인을 코딩하는 핵산 산물 레퍼토리를 제공하는 단계; 상기 핵산 산물 레퍼토리를 발현시켜, VL 도메인 산물을 제조하는 단계;

c. 선택적으로, 상기 VL 도메인 산물을 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 단계;

d. 인간 IL-12p40에 대한 항원 결합 도메인을 선별하는 단계;

이러한 방법에 있어서, 상기 공여체 핵산은, 상기 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 HCDR3의 돌연변이화에 의해 제조될 수 있다. 상기 공여체 핵산은 또한 핵산의 랜덤 돌연변이화에 의해 제공될 수 있다.

본 발명의 항체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 매우 다양한 범주의 항체 분자들로부터 선별될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 면역글로불린 분자, 단일클론 항체(mAb), 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 인간화된 항체, 인간화된 합성 항체(synhumanised antibody), 영장류화된 항체(primatised antibody), 도메인 항체, 카멜리드(camelid) 유래의 항체 단편, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, 이황화 결합된 Fv, 다이바디(diabody), 다가 항체(multivalent antibody), 이중 특이성의 항체(dual specific antibody), 2 특이성 항체(bispecific antibody), 면역글로불린의 불변부 결합 도메인 및 항원 결합 도메인이 이식된 단백질 스캐폴드(예, Qiu et al. 2007 Nat Biotechnol 25 921-9), 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은, 당해 기술 분야에 공지된 사항과 조합하여, 본원에 기술되고 실시할 수 있는, 항체 조성물, 상기 항체를 코딩하는 핵산 및 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제형, 디바이스, 형질전환 동물, 형질전환 식물 및 이의 제조 및 사용 방법으로 확장된다.

본 발명은, 하나 이상의 특정된 서열, 도메인, 영역 또는 이들의 변이체를 포함하는, 특이적인 항체 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이에 상보적이거나, 또는 이에 혼성화하는, 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명은, 상기 항체 유래의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 및/또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포, 뿐만 아니라 이러한 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조 및/또는 이용 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, (a) 본원에 기술된 핵산 및/또는 항체를 코딩하는, 분리된 항체, 특정 부분 또는 이의 변이체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는, 한가지 이상의 조성물을 제공한다. 상기 담체 또는 희석제는, 공지된 방법에 따라, 선택적으로 제약학적으로 허용가능할 수 있다. 상기 조성물은 또한 선택적으로 하나 이상의 다른 화합물, 단백질 또는 조성물을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 숙주 세포를, 항체 또는 그것의 변이체가 회수가능한 양으로 발현되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 항체 또는 그것의 변이체를 발현시키는 한가지 이상의 방법을 제공한다.

본 발명은, 항체를 코딩하는 핵산에, 엄격한 조건 하에 혼성하는 핵산 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 핵산을 포함하는, 하나 이상의 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 핵산에 의해 코딩되는 분리된 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 핵산을 포함하며, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터, HSV tk 프로모터, pgk 프로모터, 인간 면역글로불린 프로모터, 및 EF-1α 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프로모터를 선택적으로 더 포함하는, 항체 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는, 선택적으로, 메토트렉세이트(MTX), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 그린 형광 단백질(GFP), 네오마이신(G418) 또는 글루타민 신테타제(GS) 중 1종 이상으로 선택되는, 하나 이상의 선별 유전자 또는 그것의 일부분을 더 포함할 수 있다. 본 발명은, 또한, 이러한 분리된 핵산을 포함하는 포유류 숙주 세포를 포함하며, 선택적으로는, 상기 숙주는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HwpG2, PerCP, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불멸화 세포 또는 형질전환된 세포로부터 1종 이상 선택된다.

또한, 본 발명은, 1종 이상의 항체와, 담체 또는 희석제, 선택적으로는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하며, 및/또는 TNF 길항제, 항류마티스 약물, 근육 이완 약물, 마약성 약물(narcotic drug), 비-스테로이드성 항-염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코스티코스테로이드제, 동화 스테로이드, IL-23 제제, IL-12 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 설사제(antidiarrheal), 진해제, 구토 방지제, 궤양 치료제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴, 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 면역화제(immunising agent), 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물(hormone replacement drug), 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 산동제(mydriatic), 조절마비제(cycloplegic), 알킬화제, 항대사산물, 유사분열 저해제(mitotic inhibitor), 방사성 의약품(radiopharmaceutical), 항우울제, 항조제(antimanic agent), 항정신병약, 불안 완화제, 최면제, 교감 신경 흥분제, 자극제, 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 천식 약물, 베타 작용제, 흡입성 스테로이드, 루코트리엔 저해제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(dornase alpha), 사이토카인 및 사이토카인 길항제 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물 또는 단백질을 추가로 포함하는, 한가지 이상의 항체 조성물의 한가지 이상의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 면역 관련 증상 또는 감염 관련 증상을 조절하는 유효량으로 1종 이상의 항체를 세포, 조직, 장기 또는 동물에 접촉시키거나 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로는, 상기 동물이 영장류, 선택적으로 원숭이 또는 인간인, 상기 세포, 조직, 장기 또는 동물에서 IL-12/23 증상을 치료하는 한가지 이상의 방법을 제공한다. 상기 방법은, 선택적으로, 상기 유효량이 상기 세포, 조직, 장기 또는 동물의 kg 당 약 0.001-100 mg일 수 있다. 이러한 방법은, 또한 상기 접촉 또는 투여가 정맥내, 근육내, 볼루스, 복막내, 피하(subcutaneous), 호흡기에, 흡입, 국소, 코, 질, 직장, 볼, 설하, 코내, 피하(subdermal) 및 경피 중에서 선택되는 한가지 이상의 방식에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법은, 또한, TNF 길항제, 항류마티스 약물, 근육 이완 약물, 마약성 약물(narcotic drug), 비-스테로이드성 항-염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코스티코스테로이드제, 동화 스테로이드, IL-23 제제, IL-12 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 설사제(antidiarrheal), 진해제, 구토 방지제, 궤양 치료제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴, 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 면역화제(immunising agent), 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물(hormone replacement drug), 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 산동제(mydriatic), 조절마비제(cycloplegic), 알킬화제, 항대사산물, 유사분열 저해제(mitotic inhibitor), 방사성 의약품(radiopharmaceutical), 항우울제, 항조제(antimanic agent), 항정신병약, 불안 완화제, 최면제, 교감 신경 흥분제, 자극제, 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 천식 약물, 베타 작용제, 흡입성 스테로이드, 루코트리엔 저해제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(dornase alpha), 사이토카인 및 사이토카인 길항제 중에서 1종 이상 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 단백질의 치료학적 유효량을 포함하는, 한가지 이상의 조성물을, 접촉 또는 투여 전에, 동시에 또는 투여 후에, 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 1종 이상의 항체, 및 멸균수, 멸균 완충수로부터 선택되는 1종 이상의 제형화제, 또는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 보존제, 또는 이들의 혼합물을, 수계 희석제 중에서 포함하는, 1종 이상의 제형을 포함하며, 선택적으로는, 단백질의 농도는 약 0.1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이며, 상기 제형은 추가로 1종 이상의 등장제 또는 1종 이상의 생리학적으로 허용가능한 완충제를 더 포함한다.

또한, 본 발명은, 포장 물질과 본 발명의 1종 이상의 항체의 용액 또는 동결건조된 형태를 포함하는 용기를 포함하는, 인간의 제약학적 용도를 위한 1종 이상의 제조 물품을 제공하며, 선택적으로, 상기 용기가 멀티-유즈(multi-use) 투약을 위한 마개가 있는 유리 또는 플라스틱 용기이며, 추가로 상기 용기가 구멍을 뚫을 수 있으며 정맥내, 근육내, 볼루스, 복막내, 피하(subcutaneous), 국소, 호흡기에, 흡입, 코, 질, 직장, 볼, 설하, 코내, 피하(subdermal) 또는 경피 투여에 사용할 수 있는 블리스터 팩(blister pack)이며; 추가적으로, 상기 용기가 정맥내, 근육내, 볼루스, 복막내, 피하(subcutaneous), 호흡기에, 흡입, 코, 질, 국소, 직장, 볼, 설하, 코내, 피하(subdermal) 또는 경피 전달 디바이스 또는 시스템의 구성 성분이며; 상기 용기가 정맥내, 근육내, 볼루스, 복막내, 피하(subcutaneous), 호흡기에, 흡입, 국소, 코, 질, 직장, 볼, 설하, 코내, 피하(subdermal) 또는 경피 전달을 위한, 주입기 또는 펜형 주입기(pen-injector) 디바이스 또는 시스템의 구성 성분이다.

또한, 본 발명은, 상기 인간 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는, 숙주 세포, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 본 발명의 1종 이상의 항체를 제조하는 한가지 이상의 방법을 제공하며, 선택적으로는, 상기 숙주 세포는 포유류 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이며, 상기 형질전환 동물은 포유류이며, 상기 형질전환 포유류는 염소, 소, 양, 말 및 비-인간 영장류 중에서 선택된다.

본 발명은, 또한, (a) 조절, 치료 또는 요법이 필요한, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게, 1종 이상의 결합 단백질을 포함하는 조성물 또는 약학 조성물을 유효량으로 투여하는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 투여하기 전에, 동시에 및/또는 투여한 후에, 면역 관련 치료제, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약성 제제, 비-스테로이드성 항-염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코스티코스테로이드제, 동화 스테로이드, 신경 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 설사제, 진해제, 구토 방지제, 궤양 치료제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴, 필그라스팀, 사르그라모스팀, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사산물, 유사분열 저해제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조제, 항정신병약, 불안 완화제, 최면제, 교감 신경 흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입성 스테로이드, 루코트리엔 저해제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파, 사이토카인 및 사이토카인 길항제 중에서 선택되는 1종 이상을 추가로 투여하는 단계를 포함하는, 한가지 이상의 IL-12/23 매개 장애를 치료하기 위한 한가지 이상의 방법을 제공한다.

IL-12p40은 단백질 IL-12와 IL-23에 존재하며, IL-12p40 단량체 및 IL-12p80 동형이량체로서 존재한다. 본 발명은 IL-12, IL-23, IL-12p40, IL-12p80에 결합하는 항체에 관한 것으로, 이 항체는 IL-12p40 서브유닛을 포함하는 새롭게 발견될 임의의 단백질에 결합할 가능성이 있다. 본 항체는, IL-12p40에는 특이적으로 결합하지만, IL-12p35 또는 IL-12p19에는 결합하지 않는다. 또한, 본 발명은 치료학적 용도를 비롯한 상기 항체의 조성물, 제형, 방법, 디바이스 및 용도를 제공한다.

일 구현예에 있어서, 항체는 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합을 중화시킬 수 있는데, 이 항체는 IL-12의 p40/p35 인터페이스 위치에 결합하는 것으로 생각된다. 다른 구현예에서, 항체는, p19/p40 인터페이스 위치에서의 상호작용을 통해 매개되는 것으로 보이는, IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 저해시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23의 IL-23R 결합을 저해할 수 있다. 항체는, p35 또는 p19와의 인터페이스에 가까운 위치에서 IL-12p40과 결합함으로써, IL-12 및/또는 IL-23이 이의 대응되는 수용체에 결합하는 것을 저해한다.

본 발명은, IL-12p40/80 둘다에 결합하지만, IL-12p40 또는 IL-12p80의 IL-12Rβ1과의 결합은 중화시키지 않는, 항체를 개시한다. IL-12 또는 IL-23 시스템의 조절은, 이들 단백질이 IL-12Rβ1에 결합하는 것이 여전히 자유롭기 때문에, 항체의 존재 하의 IL-12p40/80 서브유닛을 통해 여전히 이루어질 수 있다. 다음과 같은 작동 방법의 이점은, IL-12 및 IL-23 시스템의 천연 조절자(IL-12p40/p80)들이, IL-12 및 IL-23의 길항제로도 작용하는 항체와 더불어 계속적으로 경쟁할 것이라는 점이다. 그래서, 치료제로 사용하였을 때 항체의 효능을 더 높이는 본 발명의 작동 방법을 통해, 듀얼 길항제 시스템을 확립할 수 있다. 또한, IL-12p40/80의 생물학적 기능을 저해하지 않는 항체를 이용한다는 점에서 안전성 프로파일의 개선 가능성이 있다. IL-12p40/80은 최근들어 IL-12/IL-23 경로의 길항제로서 작용하고 조절한다는 점 외에도 다양한 역할을 하는 것으로 입증되었다. 항체는 대식 세포에 대한 화학주성제로서, 그리고 병원체 기회 감염시의 DC 이동 유도제로서 작용하는 IL-12p40/80을 방해하지 않을 것이다. 이러한 점들은 항체의 치료제로서의 투여시의 안전성 프로파일을 개선시킬 수 있다.

이하 언급된 모든 과학 인용문, 특허, 특허 출원 및 제조사의 기술 설명서들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

명세서 전반에 "포함한다"라는 용어 또는 이의 "포함한다" 또는 "포함하는" 등의 변형 용어는, 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 암시하는 것으로 이해될 것이며, 어떠한 다른 요소 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아니다.

다르게 언급되어 있지 않은 한, 본 발명은 다양할 수 있는 구체적인 제형 성분들, 제조 방법, 투약 요법 등으로 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나("a", "an")" 및 "그것("the")"은 문맥상 명확하게 다르게 지시되어 있지 않은 한, 복수의 형태도 포함하는 것임을 유념하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나"는 한개 뿐만 아니라 2 이상을 포함하며, "하나"로 지칭되는 것은 한개 뿐만 아니라 2 이상을 포함하며, "그것"은 하나 뿐만 아니라 2 이상을 포함한다.

용어 "폴리펩타이드"는 본원에서 아미노산으로 이루어진 임의의 폴리머 체인을 의미한다. 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 상호 호환적으로 사용되며, 또한 아미노산으로 이루어진 폴리머 체인을 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 절편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포괄한다. 폴리펩타이드는 단량성이거나 폴리머성일 수 있다.

용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는, 이것이 파생된 기원 또는 소스에 의해, 본래의 천연 상태에서 수반하는 천연적으로 조합된 성분들이 조합되어 있지 않거나; 동일 종으로부터 유래된 다른 단백질이 실질적으로 없거나; 다른 종으로부터 유래된 세포로부터 발현되거나; 또는 천연적으로는 형성되지 않는, 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 즉, 화학 합성되거나, 또는 천연적으로 기원한 세포와는 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩타이드는, 천연적으로 이의 조합된 성분들로부터 "분리"된 것이다. 또한, 단백질은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 단백질 정제 기법을 이용한 분리에 의해, 천연적으로 조합된 성분들이 실질적으로 없게 할 수 있다. 용어 "회수"는 본원에서 예컨대 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 단백질 정제 기법을 이용한 분리에 의해, 화학 종들, 예컨대 폴리펩타이드에 천연적으로 조합된 성분이 실질적으로 없게 하는 과정을 의미한다.

용어 "인간 IL-12"(본원에서 hIL-12 또는 IL-12로 약칭함)는 본원에서 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포와 같이, 항원 제시 세포에 의해 주로 분비되는 인간 사이토카인을 포함한다. 이 용어는, 이황화 결합으로 서로 연결된 35 kD 서브유닛(p35) 및 40 kD 서브유닛(p40)을 포함하는 이형이량체 단백질을 포함한다. 이형이량체성 단백질은 "p70 단백질"로 언급된다. 용어 인간 IL-12는 재조합 인간 IL-12 (rhIL-12)를 포함하는 것으로 의도되며, 이는 표준적인 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있다. IL-12는 최신 구성원이 IL-35인 인터루킨 패밀리에 속하며, 이는 IL-12p35 서브유닛을 공유하고 있다(Niedbala et al. 2007 Eur J Immunol 37 3021-9). 최근 IL-35의 발견은, 앞으로 발견된 IL-12p40 및 IL-12p35 두가지에 대한 더 많은 형태들이 있을 가능성이 있음을, 시사한다. 본 발명에 기술된 항체들이 IL-12p40 형태들을 포함하는 신규로 발견되는 모든 단백질에 결합할 것으로 추측하는 것이 논리적이다.

용어 "인간 IL-23" (본원에서, hIL-23 또는 IL-23으로 약칭됨)은 본원에서, IL-12 및 IL-27을 비롯한 5종의 이러한 이형이량체성 사이토카인의 패밀리에 속하는 이형이량체성 인간 사이토카인을 포함한다(Trinchieri et al. 2003 Immunity 19 641-4). 이 용어는, 이황화 결합으로 서로 연결된 p19 및 p40 서브유닛들로 구성되는, 이형이량체성 단백질을 포함한다. 용어 인간 IL-23은 재조합 인간 IL-23 (rh IL-23)을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 표준적인 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있다.

용어 "IL-12/23"은 본원에서 인간 IL-12 및 IL-23을 함께 지칭한다.

용어 "IL-12p40"은 "IL-23p40"과 동일하며, 또한, 본원에서는 간단하게 "p40" 및 "p40 서브유닛"으로 언급되며, 인간 사이토카인 IL-12 (p40)의 40 kD 서브유닛과 인간 사이토카인 IL-23의 40 kD 서브유닛을 포함한다.

용어 "IL-12p80"은 또한 본원에서 간단하게 "p80"으로 언급되며, 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 이량체 단백질을 형성하는, 인간 사이토카인 IL-12 (p40)의 2개의 단량체성 40 kD 서브유닛들을 포함한다.

용어 "IL-12p35"은 또한 본원에서 간단하게 "p35"로 언급되며, 인간 사이토카인인 IL-12 (p70) 및 IL-35의 35 kD 서브유닛을 포함한다.

용어 "IL-23p19"는, 또한, 본원에서 간단하게, "p19"로 언급되며, 인간 사이토카인 IL-23의 19 kD 서브유닛을 포함한다.

IL-12R 복합체는, 본원에서 IL-12Rβ1으로 사용되는 IL-12 수용체 베타 1 및 본원에서 IL-12Rβ2로 사용되는 IL-12 수용체 β2로, 명명되는, 2개의 서브유닛으로 구성되며, 이들 모두 IL-12의 고친화성 결합 및 시그널링에 필요하다. 이 IL-12R은 먼저 PHA-활성화된 림프모구와 IL-2 활성화된 NK 세포 상에서 특정화되었다(Chizzonite et al. 1992 J Immunol 148 3117-24; Chua et al. 1994 J Immunol 153 128-36). IL-12Rβ2가 Tyk2/JAK2 및 STAT4 경로를 통한 시그널링을 담당하여, 세포를 T_H-1 경로(IFN-γ 분비)로 유도하는 것으로 확인되었다(Presky et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 14002-7; Watford et al. 2004 Immunol Rev 202 139-56). 그 후, IL-12Rβ1이 Tyk2와 STAT3를 인산화함으로써 시그널링에 참여하는 것으로 확인되었다(Zou et al. 1997 J Biol Chem 272 6073-7).

IL-23R 복합체는, 2개의 서브유닛들, IL-12R 복합체에 존재하는 IL-12Rβ1과 본원에서 IL-23R로 기재된 IL-23 수용체로 구성된다. IL-23R에 IL-23이 결속(engagement)되면, JAK2 자가인산화와 IL-23R의 인산화가 발생된다. 그 결과, STAT3 뿐만 아니라, STAT1, STAT4 및 STAT5의 국지화와 인산화가 이루어진다(Parham et al. 2002 J Immunol 168 5699-708).

본원에서 "생물 활성"은 사이토카인의 선천적인 생물학적 특성들 모두를 지칭한다. IL-12의 생물학적 특성으로는, IL-12Rβ1 및/또는 IL-12Rβ2의 결합; IFN-γ 분비 유도, 및 항원-특이적인 1형 T 헬퍼(T_H1) 및 2형 T 헬퍼(T_H2) 림프구 간의 균형 조절이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. IL-23의 생물학적 특성으로는, IL-12Rβ1 및/또는 IL-23R의 결합, IFN-γ 생산 유도, IL-17 생산 유도, IL-21 생산 유도, IL-22 생산 유도, T_H17 세포 분화 및 수지상 세포의 항원-제시 기능 활성화, 및 기억 T 세포의 선택적인 증폭 유도가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본원에서, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종들과의 상호 작용에 대해서, 상기 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조(예, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존됨을 의미하며, 예컨대, 항체가 일반적으로 단백질이 아닌 특이적인 단백질 구조를 인지하여 결합하는 것을 의미한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체가 포함된 반응에서, 에피토프 A(또는 유리형, 비표지된 A)를 포함하는 분자의 존재는, 상기 항체에 결합되는 표지된 A의 양을 줄일 것이다.

용어 "항체"는, 광의적으로는, 본원에서 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인, 4개의 폴리펩타이드 체인으로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징들을 보유한, 이의 임의의 기능적 단편, 돌연변이, 변이체 또는 유도체를 의미한다. 이러한 돌연변이, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이의 구현예는 하기에서 논의되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

전장 길이의 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변부(본원에서는 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부로 구성된다. 상기 중쇄 불변부는 3가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각 역쇄는 경쇄 가변부(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프래임워크 영역(FR)로 지칭되는, 보존성이 더 높은, 영역이 산재된, 상보성 결정부(CDR)로 칭해지는, 과가변성 영역들로, 더욱 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 이는 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순으로 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 배열되어 있다. 면역글로불린 분자는 임의 타입(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브타입일 수 있다.

용어 항체의 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합부"는, 본원에서, 항원(예, IL-12)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한, 항체 또는 단백질의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은, 전장 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 항체의 구현예들은, 또한, 2중 특이적인(bispecific), 듀얼 특이적인(dual specific) 또는 멀티-특이적인 포맷일 수 있으며; 이는 2가지 이상의 여러가지 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체의 용어 "항원-결합부"에 포함되는 결합 단편들의 예로는, (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 1 가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2 가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 V_L 및 V_H 영역으로 구성되는 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는, dAb 단편 (Ward et al. 1989 Nature 341 544-6, Winter et al., PCT publication WO 90/05144 Al, 본원에 원용에 의해 포함됨); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부(CDR)가 있다. 또한, Fv 단편의 2 개 도메인, V_L 및 V_H가 분리된 유전자에 의해 암호화 되지만, V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 단일 쇄 Fv (scFv)로 알려진 1 가 분자를 형성하는 단일 단백질 체인으로서 만들 수 있게 합성 링커(linker)에 의한 재조합 방법을 이용하여 이를 연결할 수 있다; (예, Bird et al. 1988 Science 242 423-6; Huston et al. 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83). 이러한 단쇄 항체들은 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 단일 쇄 항체의 다른 형태들, 예컨대 다이아바디 (diabody)도 포함된다. 다이아바디는, V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄로 발현되지만, 너무 짧아 2 개 도메인을 동일한 쇄 상에서는 쌍을 이루게 할 수 없는 링커를 사용하여, 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2 개의 항원 결합 부위를 생성하도록 강제된, 2가, 2중 특이적인 항체이다(예, Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al., 1994, Structure, 2:1121-1123). 이러한 항체 결합부들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. New York. 790 pp., ISBN 3-540-41354-5).

본원에서, 용어 "항체 구조체"는 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된, 하나 이상의 본 발명의 항원 결합부를 포함하는, 폴리펩타이드를 지칭한다. 링커 폴리펩타이드는, 펩타이드 결합에 의해 연결된 2 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 이를 사용하여 하나 이상의 항원 결합부를 연결시킨다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예, Holliger et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 6444-8).

면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변부 아미노산 서열들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 그 예를 하기에 나타낸다.

인간 중쇄 IgG₁ 불변 도메인(또는 이의 유도체, 예, NCBI 수탁 번호: P01857)

ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

인간 경쇄 카파 불변 도메인(예, NCBI 수탁 번호: P01834)

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

인간 경쇄 람다 불변 도메인(예, NCBI 수탁 번호: P01842)

QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

또한, 항체 또는 그것의 항원-결합 부위는, 항체 또는 항체 부위와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 공유적 또는 비공유적 조합에 의해 형성된, 더 큰 면역유착(immunoadhesion) 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역유착 분자의 예로는, 사량체 scFv (tetrameric scFv) 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘의 코어 영역의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al., 1995 Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101), 및 2 가이며 바이오틴화된(biotinylated) scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al., 1994 Mol. Immunol., 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')₂ 단편과 같은 항체 부위는, 전체 항체를 파파인 또는 펩신으로 각각 분해하는 것과 같은 통상적인 기법으로 전체 항체로부터 만들 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부분 및 면역유착 분자들은 본 명세서에 기술된 바와 같이 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.

"분리된 항체"는, 본원에서, 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것으로 의도된다(예, hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체에는 hIL-12 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는, 다른 종들로부터 IL-12 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가진다. 또한, 분리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화합물이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에서, 용어 "인간 항체"는 인간 생식선(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변부와 불변부를 가진 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를, 예컨대 CDR 및 특히 CDR3에 포함할 수 있다(예, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프래임워크 서열에 이식되어진, 항체를 포함하는 것으로는 의도되지 않는다.

본원에서, 용어 "재조합 인간 항체"는, 숙주 세포에 형질감염시킨 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현시킨 항체, 재조합, 조합(combinatorial) 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(Hoogenboom 1997 Trends Biotechnol 15 62-70; Azzazy et al. 2002 Clin Biochem 35 425-45; Gavilondo et al. 2000 Biotechniques 29 128-32, 134-6, 138 passim Hoogenboom et al. 2000 Immunol Today 21 371-8), 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 동물(예, 마우스)로부터 유래된 항체(예, Taylor et al. 1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95, Little et al. 2000 Immunol Today 21 364-70), 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 과정이 수반되는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는, 모든 인간 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부를 가진다. 그러나, 특정 구현예에 있어서, 이러한 재조합 인간 항체에 대해 시험관내 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열의 형질전환 동물을 사용하는 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이 유발)을 수행하며, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련있지만, 생체내에서는 인간 항체 생식선 레퍼토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.

용어 "키메라 항체"는, 인간 불변부에 연결된 뮤라인 중쇄 및 경쇄 가변부를 가지는 항체와 같이, 어떤 종으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변부 서열과, 다른 종으로부터 유래된 불변부 서열을 포함하는, 항체를 지칭한다.

용어 "CDR-이식된 항체"는, 어떤 종으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변부 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열은 다른 종의 CDR 서열로 치환된 항체, 예컨대, 뮤라인 CDR 하나 이상(예, CDR3)이 인간 CDR 서열로 치환되어진, 뮤라인 중쇄 및 경쇄 가변부를 가지고 있는 항체를 지칭한다.

용어 "인간화된 항체"는, 비-인간(예, 마우스)로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변부 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부분이 보다 "인간과 유사하게", 즉 인간 생식선 가변 서열과 더욱 유사하게 변형된, 항체를 지칭한다. 인간화된 항체의 한가지 타입은, 인간 CDR 서열이 비-인간 VH 및 VL 서열에 도입되어 대응되는 비-인간 CDR 서열로 치환된, CDR-이식된 항체이다.

"카바트 넘버링(Kabat numbering)", "카바트 정의" 및 "카바트 표시"는 본원에서 상호 호환되게 사용된다. 당해 기술 분야에서 인식되고 있는, 이들 용어들은, 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변부에서 다른 아미노산 잔기들 보다 가변성이 높은(즉, 과가변성) 아미노산 잔기들의 번호를 매기는 체계를 지칭한다(Kabat et al. 1971 Ann N Y Acad Sci 190 382-93 and Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 중쇄 가변부에서, 과가변성 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 31번에서 35번까지이고, CDR2의 경우에는 아미노산 위치 50번에서 65번까지이고, CDR3의 경우에는 아미노산 위치 95에서 102번까지이다. 경쇄 가변부의 과가변부는, CDR1이 아미노산 위치 24번에서 34번까지, CDR2가 아미노산 위치 50번에서 56번까지, CDR3은 아미노산 위치 89번에서 97번까지이다.

본원에서, 용어 "억셉터" 및 "억셉터 항체"는 하나 이상의 프래임워크 영역의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%이거나 코딩하는, 항체 또는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "억셉터"는 불변부(들)를 제공하거나 코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "억셉터"는 프래임워크 영역 및 불변부(들) 중 하나 이상을 제공하거나 코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "억셉터"는 하나 이상의 프래임워크 영역의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%이거나 또는 코딩하는 인간 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 구현예과 관련하여, 억셉터는, 인간 항체의 한 곳 이상의 특정 부위에 존재하지 않는, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 억셉터 프래임워크 영역 및/또는 억셉터 불변부(들)는, 예를 들어, 생식선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능 항체(예, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 항체, 개발 중인 항체, 또는 상업적으로 시판되는 항체)로부터 유래하거나 수득할 수 있다. 본원에서, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내에 있는 상보성 결정부를 지칭한다. 중쇄 및 중쇄의 각 가변부에, 각각의 가변부에 대해, CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정되는, 3개의 CDR이 있다. 본원에서, 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변부에 존재하는 3개의 CDR 그룹을 지칭한다. 이러한 CDR들의 정확한 경계는 여러가지 시스템에 따라 다르게 정해진다. 카바트에 의해 개시된 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))은, 항체의 임의의 가변부에 적용가능한 명확한 잔기 번호 지정 시스템 뿐만 아니라 3가지 CDR들을 정하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 코티아와 공동 연구자(Chothia et al. 1987 J Mol Biol 196 901-17; Chothia et al. 1989 Nature 342 877-83)들은, 카바트 CDR 내부의 특정 서브-영역들이, 아미노산 서열 수준에서 매우 높은 다양성을 갖지만, 거의 동일한 펩타이드 벡본 구조를 취하고 있다는 것을 발견하였다. 이러한 서브-영역들은, Ll, L2 및 L3 또는 Hl, H2 및 H3로 표시되는데, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄를 의미한다. 이러한 영역들은 코티아 CDR로 지칭될 수 있는, 이 코티아 CDR은 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 가진다. 또 다른 CDR 경계에 대한 정의들은 엄격하게 전술한 시스템들 중 한가지를 따르지 않을 수 있으며, 특정 잔기, 또는 잔기의 그룹, 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 크게 영향을 주지 않는다는, 예측이나 실험적 사실 측면에서, 짧아지거나 길어질 수 있지만, 카바트 CDR과 중첩될 것이다. 본원에서 사용되는 방법은, 이러한 시스템들 중 임의의 시스템에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있지만, 바람직한 구현예에서 카바트 또는 코티아에 따라 정의된 CDR을 이용한다.

본원에서, 용어 "캐논(canonical)" 잔기는 코티아 등에 따라 정해지는 바와 같이, 특정 캐논 CDR 구조를 한정하는, CDR 또는 프래임워크내 잔기를 지칭하며, 원용에 의해 본원에 포함된다(Chothia and Lesk 1987 J Mol Biol 196 901-17; Chothia et al. 1992 J Mol Biol 227 799-817). 코티아 등에 따르면, 다수 항체들의 CDR에서 중요한 부분들은, 아미노산 서열 수준에서 다양성은 높지만, 거의 동일한 펩타이드 벡본 구조를 가진다. 각각의 캐논 구조에는 대부분 루프를 형성하는 아미노산 잔기들로 구성된 연속한 세그먼트에서 펩타이드 벡본의 비틀림 각도 세트를 명시하고 있다.

본원에서, 용어 "공여체" 및 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 공여 항체는, 프래임워크 영역이 수득되거나 유래된 항체와는 다른 종으로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체와 관련하여, 용어 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-인간 항체를 지칭한다. 본원에서, 용어 "프래임워크" 또는 "프래임워크 서열"은 CDR을 빼고 남은 가변부의 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 한정은, 여러가지 시스템에 의해 정할 수 있기 때문에, 프래임워크 서열의 의미는 여러가지 해석에 따라 달라진다. 6가지의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2 및 -L3, 및 중쇄의 CDR-H1, -H2 및 H3) 역시 경쇄 및 중쇄 상의 프래임워크 영역은 각 체인에서 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나뉘어지는데, CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3는 FR3과 FR4 사이에 위치되어 있다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 서브-영역을 명시하지 않고, 다르게 지칭되는 프래임워크 영역은 단일의 천연적으로 형성되는 면역글로불린 체인의 가변부 내에 있는 조합된 FR들을 표시한다. 본원에서, FR은 4가지 서브-영역을 나타내며, FR들은 프래임워크 영역을 구성하는 4가지 서브-영역들 중 2 이상을 의미한다.

본원에서, 용어 "생식선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재정렬 및 돌연변이를 유도하는 성숙 과정을 겪지 않는, 림프구 이외의 세포에 의해 코딩되는 면역글로불린 서열을 의미한다(예, Shapiro et al. 2002 Crit Rev Immunol 22 183-200; Marchalonis et al. 2001 Adv Exp Med Biol 484 13-30). 본 발명의 다양한 구현예들에 의해 제공되는 이점들 중 한가지는, 생식선 항체 유전자들이 성숙 항체 유전자에 비해 종에서 개체의 특징적인 필수적인 아미노산 서열 구조를 보존하고 있을 가능성이 높고, 그래서 그 종에 치료적으로 사용하였을 때 외래 기원으로 인지될 가능성이 낮다는 인식으로부터 발생한다.

본원에서, 용어 "키" 잔기는 항체, 특히 인간화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 보다 강한 영향력을 가지는 가변부내에 있는 특정 잔기를 지칭한다. 키 잔기로는 다음과 같은 잔기 하나 이상이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적인 당화 부위(N- 또는 O-당화 부위일 수 있음), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 캐논 잔기, 중쇄 가변부와 경쇄 가변부 사이의 교량 잔기, 베니어 영역(Vernier zone)내 잔기, 및 코티아 정의에 따른 VH 도메인 CDR1과 카바트 정의에 따른 제1 중쇄 프래임워크 간에 중첩되는 영역내 잔기.

본원에서, 용어 "인간화된 항체"는, 대상 항체에 면역특이적으로 결합하며 실질적으로 인간 항체의 아미노산 서열을 가지는 프래임워크(FR) 영역과 실질적으로 비-인간 항체의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정부(CDR)를 포함하는, 항체, 또는 상기 항체의 변이체, 유사체, 유도체 또는 단편이다. 본원에서, CDR과 관련하여 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 CDR을 지칭한다. 인간화된 항체는, 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 하나 이상, 통상적으로는 2 이상, 또는 실질적으로 전체를 포함하며, 이때 비-인간 면역글로블린(즉, 공여 항체)에 대응되는 CDR 전체 또는 실질적으로 전부와, 프래임워크 영역들의 전체 또는 실질적으로 전체는, 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 또한 면역글루불린 불변부(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변부를 적어도 일부분 이상 포함한다. 일부 구현에에서, 인간화된 항체는, 경쇄 뿐만 아니라 중쇄의 적어도 가변부를 포함한다. 또한, 항체는, 경쇄의 C_Hl, 힌지, C_H2, C_H3, 및 C_H4 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 인간화된 경쇄만 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄만 포함한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 경쇄의 인간화된 가변 도메인 및/또는 인간화된 중쇄만 포함한다.

인간화된 항체는, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비룻한 임의의 클래스의 면역글로불린과, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 제한되지 않는 임의의 이소형 중에서 선택할 수 있다. 인간화된 항체는 2가지 이상의 클래스 또는 이소형으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있으며, 특정 불변 도메인을 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 원하는 작용자 기능을 최적화하기 위해 선별할 수 있다.

인간화된 항체의 프래임워크 및 CDR 영역들은 모 서열과 정확하게 대응되지 않아도 되며, 예컨대 공여 항체 CDr 또는 컨센서스 프래임워크는 1개 이상의 아미노산 잔기에 의한 치환, 삽입 및/또는 결손에 의해 돌연변이화가 이루어져, 돌연변이된 부위에서는 상기 CDR 또는 프래임워크 잔기가 상기 공여 항체나 컨센서스 프래임워크 중 어느 하나와 대응되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 그러나, 이러한 돌연변이들은 광범위한 것은 아닐 것이다. 통상, 인간화된 항체 잔기의 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상은 모 FR 및 CDR 서열에 대응될 것이다. 본원에서, 용어 "컨센서스 프래임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열내 프래임워크 영역을 지칭한다. 본원에서, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련된 면역글로불린 서열 패밀리에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산(또는 뉴클레오티드)으로 구성된 서열을 지칭한다(예, Winnaker, From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린 패밀리에서, 컨센서스 서열내 각 위치에는 본 패밀리내 그 위치에서 가장 많이 나타나는 아미노산이 점유하고 있다. 만일 2개의 아미노산이 동일하게 빈번하게 나타난다면, 그중 어느 하나를 컨센서스 서열에 포함시킬 수 있다. 본원에서, "베니어" 영역은 Foote et al. 1992 J Mol Biol 224 487-99에 기술된 바와 같이 CDR 구조를 조절하여 항원에 대한 피팅성(fit)을 미세 조절할 수 있는, 프래임워크 잔기의 서브세트를 지칭한다. 베니어 영역의 잔기들은 CDR의 기초가 되는 층을 형성하며, CDR의 구조와 항체의 친화성에 영향을 줄 수 있다.

본원에서, 용어 "중화"는 항체가 사이토카인에 특이적으로 결합하였을 때 사이토카인의 생물 활성을 중화하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 중화 항체는 IL-12 및/또는 IL-23에 결합하여 IL-12 및/또는 IL-23의 생물 활성을 저해시키는 중화 항체이다. 바람직하게는, 중화 항체는 IL-12 및/또는 IL-23에 결합하여, IL-12 및/또는 IL-23의 생물 활성을 적어도 약 50%, 60%, 80%, 85% 또는 그 이상으로 감소시킨다. 본원에서, 용어 "저해"는 항체가 사이토카인에 특이적으로 결합하였을 때 사이토카인의 생물 활성의 감소를 의미한다. 중화 항체에 의한 IL-12 및/또는 IL-23의 생물 활성 저해는, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 IL-12 및/또는 IL-23 생물 활성의 한가지 이상의 지표를 측정함으로써, 평가할 수 있다. 예를 들어, IL-12 PHA 분석에서의 인간 피토헴어글루틴 블라스트 증식의 저해, 또는 인간 IL-12 수용체 결합 분석에서의 수용체 결합 저해를 들 수 있다(실시예 참조).

용어 "활성"은 항원에 대한 항체, 예컨대 IL-12 항원에 결합하는 항-IL-12 항체의 결합 특이성/친화성과 같은 활성, 및/또는 항체의 중화력, 예컨대 IL-12에 결합하여 hIL-12의 생물 활성을 저해하는 항-IL-12 항체의 중화력, 예컨대 인간 IL-12 수용체 결합 분석 또는 시험관내 IL-12 PHA 분석에서의 PHA 블라스트 증식 저해 또는 수용체 결합성 저해를 포함한다.

용어 "에피토프"는 T 세포 수용체나 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 폴리펩타이드 결정기를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 등의 분자의 화학 활성의 표면 그룹핑을 포함하며, 특정 구현예에서는, 특이적인 3차 구조 특징들, 및/또는 특이적인 전하 특징들을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 한 부분이다. 특정 구현예에서, 항체는 이의 타겟 항원을 단백질들 및/또는 마크로분자들의 복합체 혼합물 형태에서 선호적으로 인지할 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.

본 발명은 또한 항원 제시 세포(APC)내 IL-12/23의 활성을 저해하는 항체를 제공하며, 상기 APC로는 대식세포, 소교세포, 혈관사이 포식세포(mesangial phagocyte), 활액 A 세포, 줄기 세포 전구체, 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 수지상 세포, B 세포 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 APC는 여러 조직들, 예를 들어 피부, 상피, 간, 비장, 뇌, 척추, 흉선, 골수, 연골 활액, 신장, 혈액 등에 존재할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 APC는 또한 혈액 뇌 장벽 외부 또는 내부로 제한될 수 있다.

본 발명은, 분리된 항체, 재조합 항체 및/또는 합성 항체, 그것의 특정 부분 또는 변이체 뿐만 아니라 하나 이상의 항체를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물과 코딩 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 이러한 항체, 그것의 특정 부분 또는 변이체는 특이적인 전장 길이의 항체 서열, 그것의 도메인, 단편 및 특정 변이체와, 상기 핵산, 항체 및 그것의 특정 부분 또는 변이체를 제조 및 이용하는 방법, 뿐만 아니라, 치료 조성물, 방법 및 디바이스를 제공한다.

본 발명에 사용할 수 있는 항체는, 선택적으로는, 증상의 탁월한 완화 및 저독성이 우수한, 장기간의 환자 치료력으로 특정화된다. 낮은 면역원성 및/또는 고친화성, 뿐만 아니라 그외 적합한 특성들이 수득되는 치료 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은 치료 받은 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만에서의 유의한 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응 형성, 및/또는 치료 받은 환자에서 저역가 형성으로 정의된다(이중 항원 효소 면역분석에서 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만; Elliott et al. 1994 Lancet 344 1125-7).

본 발명의 분리된 핵산은 1종 이상의 항체, 그것의 단편 또는 특정 변이체의 제조에 이용할 수 있으며, 세포, 조직, 기관 또는 동물(포유류 및 인간 포함됨)에서 사용하여, 한가지 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 병태를 조절, 치료, 완화, 발병 예방을 보조, 또는 증상을 경감시킬 수 있다.

이러한 방법은, 1종 이상의 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물을 유효량으로, 증상, 효과 또는 메카니즘의 조절, 치료, 완화, 예방 또는 경감이 필요한, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게, 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은, 해당 기술 분야에 공지되어 있거나, 본원에 기술된, 공지 방법을 이용하여 수행하고 결정된 바와 같이, 1회 또는 다회 투여 당 약 0.001 - 500 mg/kg의 양을 포함하거나, 또는 2회 또는 다회 투여 당 0.01-5000 ㎍/ml의 혈청 농도를 달성하는 양을 포함하거나, 또는 임의의 유효한 범위나 범위내 수치를 포함할 수 있다.

IL-12p20 서브유닛에 특이적인 항체들은, 분리된 IL-12p40, IL-12 또는 IL-23 단백질이나 또는 이의 일부분(합성 펩타이드와 같은 합성 분자 포함됨) 등의 적합한 면역원성 항원에 대해서 만들 수 있다. 면역원성 항원의 제조와 단일클론 항체의 제조는 임의의 적절한 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 다양한 방법들이 개시되어 있으며(예, Kohler et al. 1975 Nature 256 495-7 and Kohler et al. 1976 Eur J Immunol 6 511-9; Galfre et al. 1977 Nature 266 550-2; Koprowski et al., 미국 특허 4,172,124; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (예, Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F. M. et al., Eds., John Wiley & Sons: New York, N.Y., Chapter 11, (1991-2003)), 이들 각각의 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다. 통상적으로는, 적합한 불멸 세포주(예, 골수종 세포주, 예컨대 Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등, 또는 헤테로골수종, 그것의 융합 산물, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포나 융합 세포, 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 다른 세포주가 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 예로, www.atcc.org, www.lifetech.com 등을 참조하며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함됨)를, 항원 생산 세포, 예컨대 비제한적으로 분리되거나 클로닝된 비장 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄의 불변, 가변, 프래임워크 또는 CDR 서열을, 내인성 또는 이종성 핵산으로서, 재조합 또는 내인성의, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말, 양(ovine, sheep), 염소, 영장류, 진핵 생물, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA나 RNA, 엽록체 DNA나 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥의, 혼성화된 등의 형태로, 또는 이의 임의 조합 형태로서, 발현하는 임의의 다른 세포와 융합하여, 하이브리도마를 제조한다. 예로, 상기 Ausubel 문헌과 Colligan, Immunology, supra, chapter 2를 참조하며, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함된다.

항체 생산 세포는, 대상 항원으로 면역화된 인간, 또는 적합한 다른 동물의, 말초 혈액, 또는 바람직하게는 비장이나 림프절로부터 수득할 수 있다. 임의의 적합한 다른 숙주 세포를, 본 발명에 따른, 항체, 상기 항체의 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종의 또는 내인성 핵산을 발현하는데, 이용할 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는, 선별 배양 조건이나 적합한 다른 공지 방법을 이용하여 분리하고, 제한 희석 또는 세포 분류나 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝할 수 있다. 원하는 특이성을 가진 항체를 생산하는 세포는 적합한 분석(예, ELISA)에 의해 선별할 수 있다.

필수 특이성을 가진 항체를 생산 또는 분리하는 다른 적합한 방법들을 이용할 수도 있으며, 그러한 방법으로는, 펩타이드 또는 단백질 라이브러리로부터 재조합 항체를 선별하는 방법(예, 비제한적으로, 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리; 예, Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys에서 시판됨). 예로, EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; U.S. Ser. No. 08/350260(May 12, 1994); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US594/1234; WO92/18619; WO96/07754; (Scripps); WO96/13583, WO97/08320 (MorphoSys); WO95/16027 (BioInvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); 미국 특허 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); 또는 확률적으로 제조된 펩타이드 또는 단백질 미국 특허 5,723,323, 5,763,192, 5,814,476, 5,817,483, 5,824,514, 5,976,862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, now Applied Molecular Evolution (AME), 각각은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함됨), 또는 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 및/또는 본원에 기술된, 인간 항체의 레퍼토리를 제조할 수 있는, 형질전환 동물의 면역화를 이용하는 방법(예, SCID mice, Nguyen et al. 1997 Microbiol Immunol 41 901-7; Sandhu et al. 1996 Crit Rev Biotechnol 16 95-118; 각각의 문헌과 관련 특허 및 출원들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 기법들로는, 리보좀 디스플레이(Hanes et al. 1997 Proc Natl Acad Sci U S A 94 4937-42; Hanes et al. 1998 Proc Natl Acad Sci U S A 95 14130-5); 단일 세포 항체 생산 기법(예, 선택된 림프구 항체 방법 ("SLAM") 미국 특허 5,627,052, Wen et al. 1987 Eur J Immunol 17 887-92; Babcook et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 7843-8); 겔 마이크로액적(gel microdroplet) 및 유세포 측정(Powell et al. 1990 Biotechnology (N Y) 8 333-7); One Cell Systems, Cambridge, Mass.; (Gray et al. 1995 J Immunol Methods 182 155-63;Kenney et al. 1995 Biotechnology (N Y) 13 787-90); B-세포 선택 (Steenbakkers et al. 1994 Mol Biol Rep 19 125-34; Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988), 각 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

인간에서의 생체내 항체 이용을 위해서는, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는, 항체의 여러가지 부분들이 서로 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이며, 예컨대 뮤라인 단일클론 항체로부터 유래된 가변부와 인간 면역글로불린 불변부를 가진 항체이다. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예로, Morrison (1985); Oi (1986); Gillies (1989); 미국 특허 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397을 참조한다.

예컨대, 공개 공보 EP 0983303A1, WO 2000/34317, 및 WO 98/52976에 기술된 방법을 이용하여 제조되는 서열 변이체를 가지는, 탈-면역화된 항체는, 본 발명의 범위에 포함되며 본 발명의 방법 실시에 사용가능하다.

마우스 또는 다른 비-인간 단일클론 항체에 고유한 면역원성 반응과 알레르기 반응을 최소화하고, 그로 인해 투여되는 항체의 효능과 안전성을 높이기 위해, 본 발명의 범위에 포함되는 다른 방법으로는, "베니어링(veneering)"이 있다. 용어 "베니어링된 항체(veneered antibody)"는, 천연 프레임워크 영역의 폴딩 구조를 모두 실질적으로 유지하는, 항원 결합부를 포함하는, 이종 분자를 제공하기 위해, 예컨대 마우스의 중쇄 또는 경쇄 가변부로부터 유래된 프래임워크 영역의 잔기를 인간 프래임워크 영역의 잔기로 선택적으로 치환시킨 것을 의미한다. 베니어링 기법은, 항원 결합부의 리간드 결합 특징들을 항원 결합 표면내에 위치한 중쇄 및 경쇄 CDR 세트들의 구조와 상대적인 배치에 의해 주로 결정한다는 해석을 기반으로 한다(Davies (1990)). 따라서, 항원 결합 특이성은, CDR 구조, 이들의 서로간의 상호작용 및 나머지 V 영역 도메인의 나머지 부분과의 상호작용이 면밀히 유지된 인간화된 항체에서만 보존된다. 베니어링 기법을 이용함으로써, 면역계가 쉽게 접하는 바깥쪽(예, 용매 접근가능한) 프래임워크 영역 잔기는, 인간 잔기로 선택적으로 치환하여, 면역원성이 약한 베니어링된 표면 또는 실질적으로 면역원성이 없는 베니어링된 표면 중 어느 하나를 포함하는 하이드리드 분자를 제공한다.

또한, 본 발명의 범위는 인간화된 항-IL-12/IL-23 항체로 확장된다. "인간화된"은 비-인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 최소한의 서열을 포함하는, 항-IL-12/IL-23 항체의 형태를 의미한다. 인간화된 항체는 대부분은 수여체의 과가변부(또한, 상보성 결정부 또는 CDR이라고 함) 유래의 잔기들이 마우스, 랫, 토끼 또는 인간을 제외한 영장류와 같이 원하는 특이성, 친화성 및 능력(capacity)을 가진 비-인간 종들(공여 항체)의 과가변부 유래의 잔기로 치환된, 인간 면역글로불린(수여 항체)이다.

본 발명의 범위에 포함되며, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한, 인간화된 항체는, 예를 들어, 본원에 기술된 PMA204 단일클론 항체와 같은 비-인간화된 항체에 의해 표시되는 특징과 유사한 결합 특징을 가질 수 있다.

인간화는, 기본적으로는, 설치류나 돌연변이 설치류의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응되는 서열로 치환함으로써, 윈터 및 공동 연구자들의 방법(Jones (1986); Riechmann (1988); Verhoeyen (1988)) 에 따라 수행할 수 있다. 또한, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 5,859,205를 참조한다.

항체는 예컨대 CDR-이식(EP 239400; PCT publication WO 91/09967; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링 또는 재표면화(resurfacing) (EP 592106; EP 519596; Padlan (1991); Studnicka (1994); Roguska (1994)) 및 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565,332)을 비롯한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간화시킬 수 있다.

일부 경우에서는, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 가변부의 프래임워크 영역내에 존재하는 잔기들을 대응되는 비-인간 잔기로 치환한다(예, Queen et al. 미국 특허 5,585,089; 미국 특허 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370; 또한 예로, Riechmann (1988) 참조).

슈퍼인간화(Superhumanization)는, 항원 특이성을 부여하는 CDR('공여체')을, 상기 '공여체' CDR과 구조적으로 동일하거나 비슷한 인간 CDR을 발현하는 것으로 알려져 있는 인간의 생식선 프래임워크 서열('수여체')에 이식하는, 인간화 방법이다(Tan 2002, see also International Publication No. WO 2004/006955). 이 방법은, 체세포 돌연변이를 포함할 수 있는 서열이 아닌, 인간 게놈의 V 유전자 서열에 의해 코딩되는 프래임워크를 이용함으로써, 면역원성 감소를 강화하는 잠재력을 가진다. 또한, 이 방법은 공여체와 수여체 CDR 간의 구조 상동성에 중점을 둠으로써, 친화성 유지 가능성을 강화한다.

또한, 인간화된 항체들은, 수여체 항체나 공여체 항체에서는 발견되는 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이러한 변형들은, 항체 성능(예, 원하는 친화성 습득)을 보다 개량시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는, 비-인간 면역글로불린에 대응되는 과가변부 전체 또는 실질적으로 전체와 프래임워크 영역 전체 또는 실질적으로 전체가 인간 면역글로불린 서열인, 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다.

또한, 인간화된 항체는, 선택적으로, 면역글로불린 불변부(Fc), 전형적으로는, 인간 면역글로불린의 불변부의 적어도 일부분을 포함하게 될 것이다. 상세한 내용은 Jones (1986); Riechmann (1988); 및 Presta (1992)를 참조한다. 즉, 이러한 "인간화된" 항체는 온전한 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종 유래의 대응되는 서열로 치환되어진, 항체를 포함할 수 있다. 실제, 인간화된 항체는, 전형적으로, 일부 CDR 잔기와, 어쩌면 일부 프래임워크 잔기가 설치류 항체내 유사 부위로부터 유래된 잔기로 치환된, 인간 항체이다. 예로, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참조한다. 또한, 인간화된 항체와, 미리 정해진 항원에 대한 개선된 친화성을 가진 인간화된 항체 제조 기법이 개시되어 있는, 미국 특허 6,180,370, 및 국제 출원 WO 2001/27160을 참조한다.

인간 항체는, 인간 면역글로불린 서열 유래의 항체 라이브러리를 이용하는 전술한 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 미국 특허 4,444,887 및 4,716,111; PCT 공개공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.

선택된 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체는, "유도 선별(guided selection)"이라고 하는 기법을 이용하여 제작할 수 있다. 이러한 방법에서, 선택된 비-인간 단일클론 항체, 예컨대 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인지하는 온전한 인간 항체의 선별을 유도한다(Jespers (1988)).

또한, 기능성의 내인성 면역글로불린을 발현하진 못하지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 동물을 이용하여, 인간 항체를 제작할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 랜덤으로 또는 상동성 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입할 수 있다. 다른 예로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 뿐만 아니라, 인간 가변부, 불변부 및 다양성 부분(diversity region)을 마우스 배아 줄기 세포에 도입할 수 있다.

인간 항체를 제조하는 이러한 기법에 대한 검토로, Lonberg & Huszar (1995)를 참조한다. 이러한 인간 항체 및 인간 단일클론 항체의 제조 기법과 이들 항체의 제조 프로토콜에 대한 상세한 논의 사항에 대해서는, PCT 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 0598877; 미국 특허 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 5,939,598; 6,075,181; 및 6,114,598을 참조한다.

항원성을 낮추기 위해, 인간화된 항체 제조에 사용할 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 둘다를 선정할 수 있다. 이른바 "최상의 적합(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에서 스크리닝한다. 설치류에 가장 근접한 인간 서열을 인간화된 항체의 인간 프래임워크(FR)로 수용한다(Chothia and Lesk 1987 J Mol Biol 196 901-17; Sims et al. 1993 J Immunol 151 2296-308, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함됨). 다른 방법에서는, 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹에 속하는 모든 인간 항체들의 컨센서스 서열로부터 유래되는 특정 프래임워크를 이용한다. 동일한 프래임워크는 몇가지 상이한 인간화된 항체들에도 사용할 수 있다(Carter et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89 4285-9; Presta et al. 1993 J Immunol 151 2623-32, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함됨).

또한, 항체는, 선택적으로, 인간화될 수 있으며, 항원에 대한 고친화성 또는 다른 유익한 생물학적 특성을 유지할 수 있다. 이를 위해, 바람직한 방법에 따르면, 모 서열과 다양한 개념 상의 인간화된 산물들을 모 서열과 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용한 분석 프로세스에 의해 인간화된 항체를 제작한다. 3차원 면역글로불린 모델은 상업적으로 구입가능하며, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택한 면역글로불린 서열 후보체의 가능한 3차원 형태 구조를 밝혀 표시하는 컴퓨터 프로그램도 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 이용한 조사로, 후보 면역글로불린 서열의 기능성에 있어 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있는데, 즉, 후보 면역글로불린의 항원 결합력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기들을 컨센서스 서열과 유입 서열로부터 선택 및 조합하여, 타겟 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은, 원하는 항체 특징을 달성할 수 있다. 통상, CDR 잔기들은 항원 결합성에 대한 영향력 발휘에 직접적으로, 매우 실질적으로 관여한다.

인간 항체, 특히 인간 단일클론 항체는, 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체 제조를 위한, 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 예컨대, Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)에 기술되어 있으며, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함된다.

다른 구현예로, 전술한 기법 외에도, 파지 디스플레이 기법을 이용하여, 면역화되지 않은 공여체의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 제조할 수 있다. 이 기법에 대한 비제한적인 예로, 항체 V 도메인 유전자를 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형의 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자 어느 하나에 인-프래임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성의 항체 단편으로 나열시킨다. 필라멘트형의 입자에는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피가 포함되어 있기 때문에, 항체의 기능성 특성을 기초로 선별하면, 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선별되게 된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 여러가지 형태로 수행할 수 있는데, 그 예로 Johnson 1993 Current Opinions in Structural Biology 3 564-571을 참조하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함된다.

파지 디스플레이에 몇가지 소스의 V-유전자 세그먼트를 사용할 수 있다. 클락슨 등(Clackson et al. 1991 Nature 352 624-8)은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자들의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 어레이를 분리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여체 유래의 V 유전자의 레포토리를 구축하고, 다양한 항원 어레이에 대한 항체들을 기본적으로 Marks et al. 1991 J Mol Biol 222 581-97, 또는 Griffiths et al. 1993 Embo J 12 725-34에 기술된 기법에 따라 분리할 수 있으며, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함된다.

자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 변화들 중 일부는 높은 친화성을 부여할 것이며, 이후의 항원 감염시 높은 친화성의 표면 면역글로불린을 표시하는 B 세포가 선호적으로 복제되고 분화되게 될 것이다. 이러한 자연 과정은 "체인 셔플링"이라고 하는 기법을 적용함으로써 모방할 수 있다(Marks et al. 1992 Biotechnology (N Y) 10 779-83). 이 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득한 "일차" 인간 항체의 친화성은, 중쇄 및 경쇄의 V 영역의 유전자를, 면역화되지 않은 공여체로부터 수득한 V 도메인 유전자들의 천연 변이체(레퍼토리) 레퍼토리로 순차적으로 치환하여, 개선시킬 수 있다. 이러한 기법으로 친화성이 nM 수준인, 항체 및 항체 단편들을 제조할 수 있다.

매우 큰 규모의 항체 레포토리를 제조하는 전략이 Waterhouse et al (Waterhouse et al. 1993 Nucleic Acids Res 21 2265-6)에 의해 게시되었다. 또한, 유전자 셔플링을 사용하여, 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있는데, 이때 인간 항체는 출발 물질인 설치류 항체와 비슷한 친화성과 특이성을 가진다. "에피토프 임프린팅"이라고도 하는 이러한 방법에 있어서, 파지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 설치류 항체들의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자를, 인간 V 도메인 유전자들의 레퍼토리로 치환하여, 설치류-인간 키메라를 제작한다. 항원을 이용한 선별로, 기능성 항원결합부를 복원할 수 있는 인간 가변 도메인을 분리하며, 즉, 에피토프가 파트너의 선정을 좌우(임프린팅)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 치환하기 위해 이러한 과정을 반복한다면, 인간 항체가 수득된다(예, PCT WO 93/06213). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 다르게, 이러한 기법은 설치류 오리진의 프래임워크 또는 CDR 잔기가 없는, 완전한 인간 항체를 제공해준다.

또한, 2중 특이성의 항체도 사용할 수 있으며, 이는 2가지 이상의 다른 항원에 대한 결합 특이성을 가지고 있는, 단일클론의, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이 경우, 결합 특이성들 중 한가지는 IL-12 및/또는 IL-23 단백질 중 한가지 이상에 대한 것이며, 다른 특이성은 임의의 다음 항원에 대한 것이다. 예컨대, IL-12/23 단백질과 하나 이상의 신경영양 인자(neurotrophic factor), 또는 2가지의 상이한 타입의 IL-12/23 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 2가지 특이성을 가진 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.

2중 특이성의 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 전통적으로, 2중 특이성의 항체의 재조합 생산은 2가지의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기본으로 하며, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein et al. 1983 Nature 305 537-40). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 배열로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 한가지만 올바른 2중 특이성 구조를 취하는, 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계들로 수행되는, 올바른 분자의 정제는 오히려 번거러우며, 수율도 낮다. 비슷한 공정들은 WO 93/08829 및 Traunecker et al. 1991 Embo J 10 3655-9에 게시되어 있으며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

다른, 보다 바람직한 방법에 있어서, 바람직한 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)을 가진 항체-가변 도메인을 면역글로불린 불변-도메인 서열과 융합한다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부분, 제2 중쇄 불변부(C_H2) 및 제3 중쇄 불변부(C_H3)를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 하나 이상의 융합체에 존재하는, 중쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는, 제1 중쇄 불변부(C_H1)를 가지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 중합체, 및 바람직한 경우에는, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를, 분리된 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체로 함께 형질감염시킨다. 이를 통해, 구축시 사용되는 3종의 폴리펩타이드 체인의 불균등한 비율들이 최적의 수율을 제공하는 경우, 일 구현예에서, 3종의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 2종 이상의 폴리펩타이드 체인을 다른 비율로 생산시 고수율이거나 또는 비율이 특별한 유효성이 없는 경우에는, 하나의 발현 벡터에 2 또는 전체 3개의 폴리펩타이드 체인에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다. 이러한 방법의 바람직한 구현예에서, 2중 특이성 항체는 한쪽 팔에 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 쪽 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는, 2중 특이적인 분자의 1/2에만 면역글로불린 경쇄가 존재하면 분리 방법이 쉬워지기 때문에, 원하지 않는 면역글로불린 체인 조합들로부터 원하는 2중 특이적인 화합물의 분리를 용이하게 해 준다. 2중 특이적인 항체 제조에 대한 추가적인 상세한 설명은, 예로, Suresh et al. 1986 Methods Enzymol 121 210-28을 참조한다.

항체는 2가지 기능성의 분자이며, 중쇄 및 경쇄 유래의 N-말단 가변 세그먼트들은, 항원의 표면 상의 특정 에피토프에 대한 친화성을 가진 3차원 구조를 제조하기 위한 특수 방식으로, 서로 조합되어 있다. 불변부 세그먼트는 항체의 혈청내 반감기 연장과 작용자 기능을 담당하며, 보체 결합, 식세포의 자극, 항체-의존적인 세포성 세포독성(ADCC) 및 과립구의 그래뉼 방출 촉발과 관련있다. 항-IL-12/23 항체는 ADCC 또는 CDC(보체로 인한 세포독성)와 같은 작용자 기능을 수행할 수 있는 것으로 볼 수 있다. 이는, IL-12가 항체가 결합하여 작용자 세포를 보충하게 하는 막 결합된 형태로 존재할 수 있는 것으로 확인되었기 때문이다(Quinones et al. 2000 J Exp Med 192 507-16). 다른 예로, 본 발명의 항체는 세포의 표면에 결합된 IL-12 또는 IL-23에 결합하여, 작용자 세포를 타겟 세포 표면으로 보급할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다(Vogel et al. 1996 Int Immunol 8 1955-62).

따라서, 항체의 치료학적 효용은, 항체-의존적인 세포성 세포독소, 보체-의존적인 세포독성, 혈청 반감기, 생물 분포 및 Fc 수용체에 대한 결합성과 같은 이의 기능적 특징들을 조절함으로써 높일 수 있다. 이러한 조절은, 단백질 조작, 당조작(glycoengineering) 또는 화학적 방법에 의해 달성할 수 있다. 치료학적 활용과 필요한 작용자 활성의 바람직한 수준에 따라, 이러한 활성들 중 임의 활성을 증가시키거나 낮추는 것이 유익할 수 있다. 현행 FC 강화 방법에 대한 검토 문헌으로, Carter 2006 Nat Rev Immunol 6 343-57; Presta 2006 Adv Drug Deliv Rev 58 640-56을 참조한다. 이러한 강화 방법은, Fc 수용체에 대한 친화성이 증가된 돌연변이를 정하기 위한, Fc 부분의 돌연변이(Shields et al. 2001 J Biol Chem 276 6591-604; Lazar et al. 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103 4005-10), 및 당화 프로파일이 조작된 세포에서의 항체 발현을 통한 글리칸 구조 조절(Yamane-Ohnuki et al. 2004 Biotechnol Bioeng 87 614-22; Li et al. 2006 Nat Biotechnol 24 210-5; Schuster et al. 2007 Biotechnol J 2 700-8) 단계를 포함할 수 있다.

항체 혈청 반감기와 생물분포를 조절하기 위한 많은 방법들은, 항체와, 이화 작용으로부터 IgG를 보호하는데 주된 역할을 하는 신생 Fc 수용체(FcRn) 간의 상호작용을 변형시키고, 항체 혈청 농도를 높게 유지시키는 것을 기본으로 한다. Dall'Acqua 등(2002)은, FcRn에 대한 결합 친화성을 강화하는 IgG1의 Fc 영역내에서 치환하여 혈청 반감기를 연장시키는 것을 기술하고 있으며, 또한, M252Y/S254T/T256E로의 삼중 치환을 이용한 ADCC 활성의 생체이용성 및 조절 강화를 입증하였다(Dall' Acqua 2006). 또한, 미국 특허 6,277,375; 6,821,505; 및 7,083,784를 참조한다. Hinton 등(2004, 2005)은, 생체내 반감기를 증가시키는 250번과 428번 위치에서의 불변부 도메인 아미노산의 치환을 언급하였다. 또한, 미국 특허 7,217,797을 참조한다. Petkova 등(2006)은 생체내 반감기를 증가시키는 307, 380 및 434번 위치에서의 불변부 도메인 아미노산의 치환을 언급하였다. 또한, Shields et al (2001) 및 WO 2000/42072를 참조한다. FcRn 결합 및 혈청 반감기를 비롯한, Fc 수용체에 대한 결합과, 이들 수용체에 의해 매개되는 이후의 기능을 조절하는, 불변 도메인 아미노산의 치환의 다른 예들은 미국 특허 출원 20090142340; 20090068175; 및 20090092599에 언급되어 있다.

항체 분자에 연결된 글리칸이 항체의 Fc 수용체와 글리칸 수용체과의 상호작용에 영향을 미치고, 그에 따라, 혈청 반감기를 비롯한 항체 활성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Kaneko Y et al, 2006; Jones AJ et al, 2007; Kanda Y et al, 2007). 그래서, 바람직한 항체 활성을 조절하는 특정 글리코형태(glycoform)가 치료적 유용성을 부여할 수 있다. 조작된 글리코형태를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 그 예로는 미국 특허 6,602,684; 7,326,681; 7,388,081; 및 WO 2008/006554가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 부가에 의한 반감기 연장은, 예컨대 Fishburn (2008)에 의해 검토된 바와 같이, 단백질을 혈청 반감기를 연장하기 위해 널리 사용되고 있다.

이종접합체(Heteroconjugate) 항체 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합체 항체는 공유 결합된 2개의 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예컨대 면역계 세포를 원하지 않는 세포로 표적화하고(미국 특허 4,676,980_, 그리고 HIV 감염을 치료하기 위한 목적(WO 91/00360; WO 92/00373; 및 EP 03089)으로 제안되었다. 이종접합체 항체는, 임의의 통상적인 가교 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 적합한 가교제들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 가교 기법들과 더불어 미국 특허 4,676,980에 기술되어 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 특정 부분이나 변이체는, 세포주, 혼성 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 제조한다. 결합성을 생산하는 불멸화된 세포는 적합한 방법들, 예컨대 인간 항체를 생산하는 세포와 이형골수종의 융합, 또는 엡스타인 바 바이러스 감염을 이용한 활성화된 인간 B 세포의 불멸화(Gustafsson et al. 1991 Hum Antibodies Hybridomas 2 26-32; Zanella et al. 1992 J Immunol Methods 156 205-15; Niedbala et al. 1998 Hybridoma 17 299-304)를 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 인간 항-인간 IL-12/23 단백질, 단편, 특정 부분 또는 변이체는, 본원에 개시되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 인간 항체 레퍼토리를 만들 수 있는, 형질전환 동물(예, 마우스, 랫, 햄스터, 인간을 제외한 영장류 등)의 면역화를 통해 제조할 수 있다. 인간 항체를 생산하는 세포는, 이러한 동물로부터 분리하고, 본원에 기술된 방법 등의 적합한 방법을 이용하여 불멸화한다.

인간 항원에 결합하는 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 마우스는 공지된 방법으로 만들 수 있다(예, Lonberg 등의, 미국 특허 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 및 5,789,650; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. 미국 특허 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Taylor, Carmack et al. 1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95; Tuaillon et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3720-4; Green et al. 1994 Nat Genet 7 13-21; Lonberg et al. 1994 Nature 368 856-9; Taylor et al. 1994 Int Immunol 6 579-91; Lonberg et al. 1995 Int Rev Immunol 13 65-93; Fishwild et al. 1996 Nat Biotechnol 14 845-51; Mendez et al. 1997 Nat Genet 15 146-56이 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 또는 기능적 재배열을 거칠 수 있는, 하나 이상의 인간 면역글로불린 위치에서 유래된 DMA를 포함하는 1종 이상의 트랜스유전자를 포함한다. 이러한 마우스에서의 내인성 면역글로불린의 위치를 파괴 또는 삭제하여, 내인성 유전자에 의해 코딩되는 항체 생산력을 동물에서 없앨 수 있다.

용어 "기능적으로 재배열된다"는 본원에서 V(D)J 재조합을 거쳐, 면역글로불린 체인(예, 중쇄, 경쇄)을 코딩하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 임의 부분을 형성하는, 면역글로불린 위치로부터 유래된 DNA 세그먼트에 대해 지칭된다. 기능적으로 재배열된 면역글로불린 유전자는 예컨대 뉴클레오티드 서열 분석, 유전자 세그먼트들 사이의 코딩 조인트에 어닐링할 수 있는 프로브를 이용한 혼성화(예, 서든 블롯팅, 노던 블롯팅), 또는 유전자 세그먼트들 사이의 코딩 조인트에 어닐링할 수 있는 프라이머를 이용한 면역글로불린 유전자의 효소적 증폭(예, 중합효소 연쇄 반응)과 같은 적합한 방법을 이용하여 직접 또는 간접적으로 동정할 수 있다. 세포가 특정 가변부를 포함하는 항체 또는 특정 서열을 포함하는 가변부를 생산하는지는, 적합한 방법을 이용하여 정할 수 있다. 일 예로, mRNA를 항체-생산 세포(예, 하이브리도마 또는 재조합 세포 또는 그외 적절한 소스)로부터 분리하여, 이를 이용하여 항체, 또는 이의 특정 부분이나 변이체를 코딩하는 cDNA를 생산할 수 있다. cDNA를 클로닝한 다음, 서열분석하거나 또는 대상 가변부의 일부분(예, CDR, 코딩 조인트)에 특이적으로 어닐링하는 제1 프라이머와 비-가변부 서열(예, C_H1, V_H)에 특이적으로 어닐링하는 제2 프라이머를 이용하여 (예, 중합효소 연쇄 반응, 다른 방법 및 적정 방법에 의해) 증폭시킬 수 있다.

비슷한 단백질이나 단편에 대한 특이적인 결합을 위한, 항체, 이의 특정 부분 또는 변이체를 스크리닝하는 것은, 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 이용하여 통상적으로 수행할 수 있다. 이러한 방법에는, 바람직한 기능 또는 구조를 가진 각 구성원에 대한 펩타이드의 대규모 콜렉션을 스크리닝하는 단계가 포함된다. 펩타이드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 디스플레이된 펩타이드 서열은, 3 내지 5000개, 또는 그 이상의 아미노산 길이이며, 종종 5-100개 아미노산 길이이며, 대게는 약 8 - 25개의 아미노산 길이이다. 펩타이드 라이브러리를 제조하는 직접적인 화학 합성 방법 외에도, 몇가지 재조합 DNA 방법들이 개시되어 있다. 한가지 유형은, 박테리오파지나 세포의 표면에 펩타이드 서열을 나열하는 방법이다. 각 박테리아파지 또는 세포에는 특별한 나열되는 펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있다. 이러한 방법들은 PCT 공개 공보 WO 91/17271, WO 91/18980, WO 91/19818 및 WO 93/08278에 기술되어 있다. 펩타이드 라이브러리를 제조하는 다른 시스템들은, 시험관내 화학 합성 및 재조합 방법 2가지 측면들을 가지고 있다. PCT 공개 공보 WO 92/05258, WO 92/14843, 및 WO 96/19256을 참조한다. 또한, 미국 특허 5,658,754; 및 5,643,768을 참조한다. 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen (Carlsbad, Calif.) 및 Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 예로, Enzon의, 미국 특허 4,704,692, 4,939,666, 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 5,518,889, 5,534,621, 5,656,730, 5,763,733, 5,767,260, 5,856,456; Dyax의, 미국 특허 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,837,500; Affymax의 미국 특허 5,427,908, 5,580,717; Cambridge Anitibody Technologies의 미국 특허 5,885,793; 미국 특허 5,750,373; Xoma, Colligan의 미국 특허 5,618,920, 5,595,898, 5,576,195, 5,698,435, 5,693,493, 5,698,417; Ausubel, supra; 또는 Sambrook를 참조하며, 상기 특허, 공개공보들은 각각 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 항체, 이의 특정 부분 및 변이체는, 또한, 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 핵산을, 이들 항체, 특정 부분 또는 변이체를 우유에 포함된 형태로 생산하는, 염소, 소, 말, 양 등과 같은 형질전환 동물 또는 포유류에, 제공함으로써, 제조할 수 있다. 이들 동물들은 공지된 방법을 이용하여 제공할 수 있다. 예로, 미국 특허 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489를 참조하나, 이들로 한정되지 않으며, 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 전체가 포함된다.

본 발명의 항체, 이의 특정 부분 및 변이체는, 또한, 식물의 일부분 또는 이로부터 배양된 세포에서 상기한 항체, 이의 특정 부분 또는 변이체를 생산하는, 형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예, 담배, 옥수수 및 선태류 등)를 제공하기 위한, 1종 이상의 항체, 이의 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 이용하여, 제조할 수 있다. 비제한적인 예로, 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담배 잎을 이용하여, 유도성 프로모터를 예컨대 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데, 성공하였다. 예로, Cramer et al. 1999 Curr Top Microbiol Immunol 240 95-118과 이 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다. 또한, 형질전환 옥수수를 사용하여, 상업적인 생산 수준으로 포유류 단백질을 발현시켰으며, 이때 생물 활성은 천연 기원으로부터 정제되거나 또는 다른 재조합 시스템에서 생산되는 활성과 동일하였다. 예로, Hood et al. 1999 Adv Exp Med Biol 464 127-47과 이 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다. 또한, 항체가 담배 종자 및 감자 덩이 줄기를 비롯한 형질전환 식물 종자로부터 대량으로 생산되었다. 예, Conrad et al. 1998 Plant Mol Biol 38 101-9와 이 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다. 또한, 이런 유저자 변형된 이끼 프로토플라스트에 의해 항체를 일시적으로 발현 및 분비시켰으며, 비변형된 항원 결합 친화성을 확인하였고, 대규몬 실험에서는 ADCC의 40배 강화가 확인되었다(Schuster, Jost et al. 2007 Biotechnol J 2 700-8). 따라서, 본 발명의 항체, 이의 특정 부분 및 변이체는 공지된 방법에 따라 형질전환 식물을 이용하여 제조할 수 있다. 예로, Whitelam et al. 1994 Biochem Soc Trans 22 940-4; Ma et al. 1995 Trends Biotechnol 13 522-7; Ma et al. 1995 Plant Physiol 109 341-6과 이들 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다. 상기 각 문헌들은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 항체는 인간 IL-12/23에 결합할 수 있으며 폭넓은 친화성(K_D)을 보인다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 1종 이상의 항체는 선택적으로 고친화성으로 인간 IL-12/23에 결합할 수 있다. 예컨대, 항체는 인간 IL-12/23 단백질에 K_D < 10^-9M, 또는 바람직하게는 K_D < 약 0.1-9.9 (또는 임의의 범위나 이에 포함된 수치) X 10^-10M, 10^-11, 10^-12, 10^-13또는 임의의 범위나 이에 포함된 수치로 결합할 수 있다. 항체의 항원 친화성 또는 항원항체 결합성(avidity)은 임의의 적절한 방법을 이용하여 실험으로 측정할 수 있다(예, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 문헌에 기술된 방법들). 특정 항체와 이의 결합 파트너의 친화성 측정치는, 여러가지 조건(예, 염 농도, pH)에 따라 변경될 수 있다. 즉, 친화성 측정 및 다른 항원 결합 파라미터(예, K_D, K_a, K_d)의 측정은, 바람직하게는 본원에 기술된 완충액과 같은 표준화된 완충액과 항체 및 결합 파트너의 표준화된 용액을 이용하여 수행한다.

본 발명의 분리된 핵산 분자는, 선택적으로 하나 이상의 인트론이 포함된 오픈 리딩 프래임(ORF)을 포함하는 핵산 분자, 예컨대 비제한적으로, 각각 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 같은 1종 이상의 CDR의 하나 이상의 특정 부분; 항체, 이의 특정 부분 또는 변이체의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 전술한 것과는 실질적으로 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축중(degeneracy)으로 인해 여전히 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 하나 이상의 항체를 코딩하는, 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 특정 항체, 이의 일부분 또는 변이체를 코딩하는 이러한 축중 핵산 변이체를 제조하는 것은 당해 기술 분야의 당업자에게는 일반적이다. 예로, 전술한 Ausubel, et al.을 참조하며, 이러한 핵산 변이체 역시 본 발명에 포함된다.

본원에 나타낸 바와 같이, 항체, 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 본 발명의 핵산 분자는, 항체 단편 자체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자; 전체 항체 또는 이의 일부분의 코딩 서열; 항체, 단편 또는 일부분에 대한 코딩 서열 뿐만 아니라, 1종 이상의 신호 리더 또는 융합 펩타이드의 코딩 서열과 같은 부가적인 서열로서, 하나 이상의 인트론과 같은 전술한 부가적인 코딩 서열이 포함되거나 포함되지 않으며, 전사, mRNA 프로세싱, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예, mRNA의 리보좀 결합 및 안정성)에 역할을 하는 전사되지만 번역되지 않는 서열 등의 비코딩 5' 및 3' 서열을 비제한적으로 포함하는, 부가적인 비-코딩 서열이 조합된 형태; 부가적인 기능성을 제공하는 아미노산 등의 부가적인 아미노산을 코딩하는, 부가적인 코딩 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 즉, 항체, 이의 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 서열을, 항체 단편 또는 부분을 포함하는, 융합된 항체 또는 특정 부분 또는 변이체의 정제를 용이하게 해주는 펩타이드 코딩 서열과 같은, 마커 서열과 융합시킬 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 선택적인 혼성화 조건 하에서 혼성하는 분리된 핵산을 제공한다. 즉, 이러한 구현예의 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 검출 및/또는 정량하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 수탁된 라이브러리에서 클론의 일부분이나 전장 길이를 동정, 분리 또는 증폭시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 분리된 게놈 서열 또는 cDNA 서열이며, 또는 인간 또는 포유류의 핵산 라이브러리로부터 유래된 cDNA에 대한 상보적인 서열이다.

바람직하게는, cDNA 라이브러리는 80% 이상의 전장 서열들, 바람직하게는 85 % 이상 또는 90% 이상의 전장 서열들을, 더 바람직하게는 95% 이상의 전장 서열들을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열들이 많이 존재하도록 정규화할 수 있다. 상보적인 서열에 대해 비교적 서열 동일성이 낮은 서열을 가지고 있는 서열에 대해서는, 전형적이나, 배타적이진 않게, 낮거나 또는 중간 수준의 엄격 혼성화 조건을 사용한다. 동일성이 보다 높은 서열에 대해서는, 선택적으로 중간 및 높은 엄격 조건을 적용할 수 있다. 낮은 엄격 조건에서는, 약 70%의 서열 동일성을 가지는 서열의 선택적인 혼성화가 가능하며, 이를 적용하여 은 오소로그(orthologous) 또는 파라로그(paralogous) 서열을 동정할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체, 특정 부분 또는 변이체의 적어도 일부분 이상을 코딩할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 특정 부분이나 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 선택 혼성화를 위해 사용할 수 있는, 핵산 서열을 포함한다. 예로, 전술한 Ausubel; Colligan의 문헌을 참조하며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 분리된 핵산은, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기법, 및 (c) 정제 기법, 또는 이의 조합을 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 사용하여 제조할 수 있다.

핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 편리하게는 서열들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다클론 부위를 핵산에 삽입하여, 폴리뉴클레오티드의 분리를 도울 수 있다. 또한, 번역가능한 서열을 삽입하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 번역 산물을 분리하는 것을 도울 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는데 편리한 수단을 제공한다. 본 발명의 코딩 서열을 제외한 핵산은, 선택적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클리닝 및/또는 발현시키기 위한, 벡터, 어댑터 또는 링커이다.

부가적인 서열을, 클로닝 및/또는 발현에 있어서의 이의 기능을 최적화하도록, 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가하여, 폴리뉴클레오티드의 분리를 보조하거나, 또는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 개선시킬 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예, 전술한 Ausubel 또는 Sambrook).

본 발명의 분리된 핵산 조성물, 예컨대 RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의 조합은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의의 다수 클로닝 방법들을 이용하여 생물 소스로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 엄격 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여, cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 바람직한 서열을 동정한다. RNA 분리와 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다(예, 전술한 Ausubel 또는 Sambrook).

cDNA 또는 게놈 라이브러리는, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 서열을 기초로 하는 프로브를 이용하여 스크리닝할 수 있다. 동일하거나 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 분리하기 위해, 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성하는 프로브를 사용할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 혼성화의 다양한 엄격한 수준을 이러한 분석에 적용할 수 있으며, 혼성화 또는 세정 매질 중 어느 한가지를 엄격한 조건으로 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 혼성화 조건이 보다 엄격해 질수록, 이중 가닥 형성을 위한 프로브와 타겟 간의 상보성 수준은 더 높아져야 한다. 엄격성 수준은 온도, 이온 세기, pH 및 부분 변성 용매, 예컨대 포름아미드의 존재 중 한가지 이상에 의해 조절할 수 있다. 예컨대, 혼성화의 엄격성은, 반응제 용액의 극성을 예컨대 포름아미드의 농도를 0% 내지 50%의 범위내로 조작하여 바꿈으로써, 쉽게 변경가능하다. 검출가능한 수준의 결합에 필요한 상보성(서열 동일성) 수준은, 혼성화 매질 및/또는 세정 매질의 엄격성에 따라 바뀔 것이다. 상보성의 수준은 100%, 또는 90-100%이거나 또는 임의의 범위 또는 범위내 수치가 최적일 것이다. 그러나, 프로브와 프라이머내에서의 소수의 서열 변이가 혼성화 및/또는 세정 매질의 엄격성 저하에 의해 상쇄될 수도 있음을 인지하여야 한다.

RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 과도한 실험을 수행하지 않고도, 본원에 기술된 사항 및 지침을 기초로, 본 발명에 따라 사용할 수 있다. DNA 또는 RNA의 공지된 증폭 방법으로는, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 공정들(예로, Mullis의 미국 특허 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188; Tabor의 미국 특허 4,795,699 및 4,921,794; Innis의 미국 특허 5,142,033; Wilson 등의 미국 특허 5,122,464; Innis의 미국 특허 5,091,310; Gyllensten 등의 미국 특허 5,066,584; Gelfand 등의 미국 특허 4,889,818; Silver 등의 미국 특허 4,994,370; Biswas의 미국 특허 4,766,067; Ringold의 미국 특허 4,656,134), 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 타겟 서열에 안티센스 RNA를 이용하는, RNA 매개 증폭(Malek 등의 미국 특허 5,130,238, 상표명 NASBA을 이용)이 있지만, 이로 한정되는 것은 아니며, 이들 문헌들의 전체 내용은 본 명세서에 원용에 의해 포함된다(예, 전술한 Ausubel 또는 Sambrook 참조).

예를 들어, PCR 기법을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 관련 유전자들을 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리들로부터 직접 증폭시킬 수 있다. 또한, PCR과 다른 시험관내 증폭 방법들도, 예컨대, 발현시킬 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하거나, 시료내에서 원하는 mRNA의 존재 여부를 검출하거나, 핵산을 서열분석하거나 또는 다른 목적으로 프로브로 사용하기 위한 핵산을 제조하는데, 사용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법들 중에서 당업자가 진행하기에 충분한 기법들의 예들은, 전술한 Berger, Sambrook, 및 Ausubel 문헌들 뿐만 아니라 Mullis 등의 미국 특허 4,683,202 (1987);d Innis 등의 PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)에서 찾아 볼 수 있다. 게놈 PCR 증폭용 시판 키트들이 당업계에 공지되어 있다. 예, Advantage^®-GC 게놈 PCR 키트(Clontech). T4 유전자 32 단백질 (Boehringer Mannheim)을 이용하여 긴 PCR 산물의 수율을 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 분리된 핵산은 공지 방법에 의한 직접 화학 합성으로 제조할 수 있다(예, 전술한 Ausubel 참조). 화학 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하는데, 이것은 상호적인 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 이 단일 가닥을 이용하여 DNA 중합효소에 의해 중합에 의해, 이중 가닥 DNA로 변형시킬 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, DNA 화학 합성인 약 100개 이상의 염기로 구성된 서열들로 한정될 수도 있지만, 더 긴 길이의 서열도 짧은 서열들을 연결함으로써, 수득할 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명은, 또한, 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예컨대 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는, cDNA 또는 게놈 서열을 이용하여, 1종 이상의 원하는 숙주 세포에 도입시킬 수 있는 재조합 발현 카세트를 구축할 수 있다. 재조합 발현 카세트는, 전형적으로, 의도한 숙주 세포 안에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이종 및 비-이종(즉, 내인성) 프로모터들 모두 본 발명의 핵산 발현을 지시하는데 사용할 수 있다.

일부 구현예들에서, 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소들로서 제공되는 분리된 핵산을, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 상향 또는 하향 발현 조절을 위해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-이종성 형태로 적정 위치(상류, 하류 또는 인트론내)에 도입할 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터를 돌연변이, 결손 및/또는 치환에 의해 생체내 또는 시험관내에서 변형시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 당해 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이, 재조합 기법에 의한 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체의 생산 방법에 관한 것이다. 예로, 전술한 Sambrook, 및 Ausubel 문헌들을 참조하고, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는, 숙주에서의 증식을 위해 선별 마커가 포함된 벡터와 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는, 칼슘 포스페이트 침전과 같은 침전물로 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우에는, 적합한 패킹 세포주를 이용한 시험관내에서 팩킹한 다음 이를 숙주 세포에 전이시킬 수 있다.

DNA 삽입체는, 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조체에는 또한 전사 개시부, 종말부 및 전사되는 영역에는 번역을 위한 리보존 결합부가 포함될 것이다. 구조체에 의해 발현되는 성숙 전사체의 코딩 부분에는, 번역되는 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 개시 코돈과 종결 코돈(예, UAA, UGA 또는 UAG)에 번역 개시부가 바람직하게는 포함될 것이며, 포유류 또는 진핵 세포 발현에는 UAA 및 UAG가 선호적이다.

발현 벡터는 바람직하지만 선택적으로 1종 이상의 선별 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커로는, 예컨대 진핵 세포 배양의 경우, 메토트렉세이트(MTX), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR, 미국 특허 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 및 5,179,017), 암피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산 또는 글루타민 신테타제(GS, 미국 특허 5,122,464; 5,770,359; 및 5,827,739) 내성 유전자, 및 E. coli, 그외 박테리아 또는 원핵생물의 경우, 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다(상기 특허들은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 적절한 벡터들은 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 알 것이다. 숙주 세포로의 벡터 구조체의 도입은, 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개의 형질간염, 전기천공, 형질전이, 감염 또는 그외 다른 방법들에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법들은, 상기 Sambrook, Chapters 1-4 & 16-18; 상기 Ausubel, Chapters 1, 9, 13, 15, 16과 같이 당해 기술 분야에 기술되어 있다.

본 발명의 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체는, 융합 단백질과 같이 변형된 형태로 발현시킬 수 있으며, 분비 신호 뿐만 아니라 부가적인 이종 기능 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부가적인 아미노산 서열, 특히 하전된 아미노산의 영역을 항체, 특정 부분 또는 변이체의 N-말단에 첨가하여, 숙주 세포에서, 정제 단계 동안데 또는 이후 취급 및 조장시에 안정성과 지속성을 개선시킬 수 있다. 또한, 펩타이드 모이어티를 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체에 부가하여 정제를 쉽게 할 수 있다. 이러한 영역들은 항체 또는 이의 하나 이상의 단편의 최종적인 제조 단계 전에 제거할 수 있다. 이러한 방법들은, 상기 Sambrook, Chapters 17.29-17.42 및 18.1-18.74; 상기 Ausubel, Chapters 16, 17 & 18 등의 많은 표준 실험 매뉴얼들에 기술되어 있다. 당해 기술 분야의 당업자들은, 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용가능한 다수의 발현 시스템들을 인지하고 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 내인성 DNA를 포함하는 숙주 세포에서 수행되도록(조작)함으로써, 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야, 예컨대 미국 특허 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 및 5,733,761에 잘 알려져 있으며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

항체, 특정 부분 또는 변이체의 생산에 사용가능한 세포 배양물의 예는 포유류 세포이다. 포유류 세포 현탁물 또는 생물반응기를 사용할 수 있지만, 포유류 세포 시스템은 대게 단일층 세포 형태일 수 있다. 온전한 당화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 다수의 숙주 세포주들이 당해 기술 분야에서 개발되었으며, 그 예로는 COS-1 (예, ATCC CRL 1650), COS-7 (예, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (예, ATCC CRL-10), CHO (예, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (예, ATCC CRL-26) 세포주, COS-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 및 예컨대 American Type Culture Collection, Manassas, Va로부터 쉽게 입수할 수 있는 세포 등이 있다. 바람직한 숙주 세포로는, 림프성 기원의 세포, 예컨대 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC 수탁 번호 CRL-1851)를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.

이들 세포에 대한 발현 벡터로는, 다음과 같은 발현 조절 서열들 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 그 예로는, 복제 오리진; 프로모터 (예, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터; 미국 특허 5,168,062; 5,385,839), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터 (미국 특허 5,266,491), 1종 이상의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위들, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예, SV40 라지 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예로, 전술한 Ausubel; 전술한 Sambrook, et al.을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포들이 공지되어 있으며, 및/또는 예컨대 세포주 및 하이브리도마의 미국 세포주 은행의 카다로그(www.atcc.org) 또는 다른 공지되거나 상업적인 소스로부터 입수할 수 있다.

진핵 생물의 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 벡터에 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열을 전형적으로 포함시킨다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리아데닐화 서열이다. 또한, 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함시킬 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는, SV40 유래의 VP1 인트론이다(Sprague et al. 1983 J Virol 45 773-81). 또한, 숙주 세포에서 복제를 조절하기 위한 유전자 서열을 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 벡터에 도입할 수 있다.

항체, 특정 부분 또는 변이체는, 비제한적으로, 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피 등의, 잘 알려져 있는 방법에 의해, 재조합 세포 배양물로부터, 회수 및 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제에 사용할 수도 있다. 예로, Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2003), 예, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조하며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체는, 자연적으로 정제된 산물, 화학 합성 공정의 산물 및 예컨대 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포 등의 진핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 제조된 산물을 포함한다. 재조합 생산 공정에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 당화하거나 또는 비당화할 수 있으며, 바람직하게는 당화된다. 이러한 방법들은 예컨대, 상기 Sambrook, Sections 17.37-17.42; 상기 Ausubel, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 및 20, 상기 Colligan, Protein Science, Chapters 12-14와 같은, 많은 표준 실험 매뉴얼에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 분리된 항체는 본원에 보다 충분하게 기술된 본 발명의 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나에 의해 코딩되는 항체, 특정 부분 또는 변이체, 또는 분리되거나 제조된 항체, 특정 부분 또는 변이체를 포함한다.

바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IL-12/23에 결합하며, 그로 인해 단백질의 생물학적 활성은 실질적으로 무력화된다. 항체, 특정 부분 또는 변이체는, 부분적으로 또는 바람직하게는, 1종 이상의 IL-12/23 단백질의 한가지 이상의 생물 활성을 실질적으로, 무력화하여, 1종 이상의 IL-12 수용체에 대한 IL-12 결합, 또는 1종 이상의 IL-23 수용체에 대한 IL-23의 결합을 통해, 또는 다른 IL-12 또는 IL-23-의존적이거나 매개된 메카니즘을 통해 매개되는 활성을 저해한다. 본원에서, 용어 "중화 항체"는 인간 IL-12p40 단백질 또는 단백질 관련-의존적인 활성을 약 20-120%로, 바람직하게는 적어도 약 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%로, 또는 분석에서 보다 의존적으로 저해할 수 있는 항체이다. 인간 일/23 관련-의존적인 활성을 저해하는, 항체, 특정 부분 또는 변이체의 능력은, 바람직하게는, 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 1종 이상의 적합한 항체 또는 단백질 분석에 의해 평가한다. 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체는, 임의 클래스 (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, 등) 또는 이소형일 수 있으며, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 IgG 중쇄 또는 특정 단편, 예컨대 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 1종 이상을 포함한다. 이러한 타입의 항체들은, 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 1종 이상의 인간 경쇄(예, IgG, IgA 및 IgM; 예, γ1, γ2, γ3, γ4) 트랜스유전자를 포함하는, 형질전환 마우스 또는 그외 형질전환 비-인간 포유류를 이용함으로써, 제조할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함한다.

본 발명의 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체는 IL-12p40 단백질, 단편, 부분 또는 이들의 임의 조합에 특이적인, 1종 이상의 특정된 에피토프에 결합한다. 비제한적인 예로, 항체, 특정 부분 또는 변이체는, IL-12p40 서브유닛의 전체 아미노산 서열 중에서 적어도 1-3개의 아미노산을 포함하는 1종 이상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 1종 이상의 특정된 에피토프는 IL-12p40 중 하나 이상의 아미노산의 임의 조합을 포함할 수 있으며, 그 예로는 서열번호 1(인간 IL-12p40 서브유닛, 306개의 아미노산)의, 1종 이상의, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-210, 210-220, 220-230, 230-240, 240-250, 250-260, 260-270, 280-290, 290-300, 300-306, 1-7, 14-21, 29-52, 56-73, 83-93, 96-105, 156-175, 194-204, 208-246, 254-273, 279-281 또는 289-300 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 예상되는 에피토프들은 IL-12, IL-23, IL-12p40 단량체 및 IL-12p80 동형이량체 상에 이용할 수 있다.

항체는, 또한, 정의된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 또는 경쇄 가변부 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, 바람직한 구현예에서, 항체는 1종 이상의 중쇄 가변부 및/또는 1종 이상의 경쇄 가변부 중 1종 이상을 포함한다. 인간 IL-12/23 단백질 및/또는 단편에 결합하며, 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변부를 포함하는, 인간 항체는, 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 및/또는 본원에 기술된 바와 같이, 파지 디스플레이(Katsube et al. 1998 Int J Mol Med 1 863-8) 등의 적절한 방법이나 형질전환 동물을 이용하는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예로, 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스유전자 및 기능적인 재배열을 거칠 수 있는 인간 면역글로불린 경쇄 위치로부터 유래된 DNA를 포함하는 트랜스유전자를 포함하는, 형질전환 마우스에, 인간 IL-12 및/또는 IL-23 단백질, 수용체 및/또는 단편을 이용하여 면역화하여, 항체 생산을 유도할 수 있다. 바람직한 경우에는, 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 및/또는 본원에 기술된 바와 같이, 항체 생산 세포를 분리할 수 있으며, 하이브리도마 또는 그외 불멸화된 항체-생산 세포를 제조할 수 있다. 다른 예로, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 적정 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 이의 일부분을 이용하여 발현시킬 수 있다.

또한, 본 발명은, 본원에 기술된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열의 아미노산을 포함하는, 항체, 항원-결합 단편, 면역글로불린 체인 및 CDR에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편 및 상기한 체인 또는 CDR을 포함하는 항체는 인간 IL-12/23 단백질, 및/또는 단편에 고치환성(예, K _D < 약 10^-9M)으로 결합할 수 있다. 본원에 기술된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은, 보존적인 아미노산 치환 뿐만 아니라 아미노산 결손 및/또는 삽입을 포함하는 서열이다. 보존적인 아미노산 치환은 제1 아미노산이 제1 아미노산과 화학적 및/또는 물리적 특성(예, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)이 비슷한 제2 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 보존적인 치환은, 하나의 아미노산이 다음과 같은 그룹에 속하는 아미노산으로의 치환을 포함한다: 라이신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 타이로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 루신(L), 이소루신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.

본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체는, 본원에 명시된 바와 같이, 자연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터 한가지 이상의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 포함할 수 있다. 물론, 아미노산 치환 수는 전술한 한 요소 등의 다수인 인자에 따라 당업자가 정할 수 있다. 통상적으로는, 임의의 주어진 결합성 폴리펩타이드에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결손의 갯수는 본원에 명시된 바와 같이, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 이하, 예컨대 1-30개, 또는 임의 범위나 그 범위에 속하는 수치일 수 있다.

본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체에서 기능에 필수적인 아미노산은, 부위 특이적인 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 동정할 수 있다(예, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham et al. 1989 Science 244 1081-5). 후자의 방법은 분자의 각 잔기들에 하나의 알라닌 돌연변이를 도입하는 것이다. 제조되는 돌연변이 분자를 생물 활성, 예컨대 비제한적으로 한가지 이상의 IL-12/23 중화 활성에 대해 테스트한다. 항체, 특정 부분 또는 변이체의 결합에 중요한 부위들은 또한 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화 표지와 같은 구조 분석에 의해 동정할 수 있다(de Vos et al. 1992 Science 255 306-12; Smith et al. 1992 J Mol Biol 224 899-904).

다른 측면에서, 본 발명은, 유기 모이어티의 공유 결합에 의해 변형된, 본원에 기술된 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형으로 약동학적 특성들(예, 생체내 혈청 반감기 증가)이 향상된 항체 또는 항원-결합 단편을 제조할 수 있다. 유기 모이어티는, 선형 또는 분지형의 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특정 구현예에서, 친화성 폴리머 그룹의 분자량은 약 800 내지 약 120,000 달톤일 수 있으며, 폴라알칸 글리콜9예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹은 약 8-40개의 탄소 원자로 구성될 수 있다.

본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편들은, 항체, 특정 부분 또는 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된, 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합되는 각각의 유기 모이어티는, 독립적으로 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 본원에서, 용어 "지방산"은 모노-카르복시산 및 디-카르복시산을 포함한다. "친수성 폴리머 그룹"이라는 용어는 본원에서 옥탄내에서 보다 수중에서 수용성이 더 높은 유기 폴리머를 의미한다. 예컨대, 폴리라이신은 옥탄 중에서 보다는 수중에서 용해성이 더 높다. 따라서, 폴리라이신의 공유 결합에 의해 변형된 항체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 변형에 적합한 친수성 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 예컨대, 폴리알칸 글리콜(예, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물 (예, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 폴리머(예, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥사이드(예, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 변형시키는 친수성 폴리머는 분자량이 개별 분자 물질로서 약 800 내지 약 150,000 달톤일 수 있다. 예컨대, PEG₅₀₀₀ 및 PEG₂₀ _,000(아래 첨자는 폴리머의 달톤으로 나타낸 평균 분자량)을 사용할 수 있다.

친수성 폴리머 그룹은, 1 내지 약 6개의, 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환할 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환된 친수성 폴리머는, 적합한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대, 아민기를 포함하는 폴리머를 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 결합시킬 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화됨)을 폴리머 상의 하이드록시기에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 항체를 변형시키는데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는, 포화될 수 있거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형시키는데 적합한 지방산으로는, 예컨대, n-도데카노에이트(C₁₂, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C₁₄, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C₁₈, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C₂₀, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C₂₂, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C₃₀), n-테트라콘타노에이트(C₄₀), cis-Δ9-옥타데카노에이트(C₁₈, 올레이트), 모든 cis-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C₂₀, 아라키도네이트), 옥탄디옥산, 테트라데칸디옥산, 옥타데칸디옥산, 도코산디옥산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르로는 선형 또는 분지형의 저급 알킬기를 포함하는 디카르복시산의 모노-에스테르를 포함한다. 상기 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

변형된 항체 및 항원-결합 단편은, 1종 이상의 변형 제제와 반응시키는 등의 적합한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 용어 "변형 제제"는 본원에서 활성화 기를 포함하는 적정 유기기(예, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화 기"는 적절한 조건 하에서 제2 화학기와 반응하여, 상기 변형 제제와 제2 화학 기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는, 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예로, 아민-반응성 활성화 기로는, 친전자성 기, 예컨대 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플로오로, 요오도), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기로는, 예컨대 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데하이드 작용기를 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 결합시킬 수 있으며, 아지드기를 3가 포스포러스기와 반응시켜, 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성시킬 수 있다. 활성화 기를 분자에 도입하기 위한 적합한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques , Academic Press: San Diego, Calif. (1996)). 활성화 기는 유기 기(예, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 또는 링커 모이어티, 예컨대 하나 이상의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황과 같은 이종 원자로 치환될 수 있는 2가 C₁-C₁₂ 기를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티로는 예컨대 테트라에틸렌 글리콜, -(CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH- 및 -CH₂ -O-CH₂ -CH₂ -O-CH₂ -CH₂-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형 제제는 예컨대 모노-Boc-알킬디아민(예, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜, 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써, 제조할 수 있다. Boc 보호기는, 본원에 기술된 다른 카르복실레이트와 결합시킬 수 있는 1급 아민을 노출시키기 위해 트리플루오로아세트산(TFA)로 처리함으로써 산물로부터 제거하거나, 또는, 말레 무수화물과 제조되는 환화된 산물을 반응시켜 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체로 제조할 수 있다(예, Thompson, et al., WO 92/16221, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).

본 발명의 변형된 항체는, 항체 또는 항원-결합 단편을 변형 제제와 반응시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티를 아민-반응성 변형 제제, 예컨대 PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 부위 비-특이적인 방식으로 항체에 결합시킬 수 있다. 또한, 변형된 항체 또는 항원-결합 단편들은, 항체 또는 항원-결합 단편의 이황화 결합(예, 체인내 이황화 결합)을 환원시킴으로써, 제조할 수 있다. 그 후, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형 제제와 반응시켜, 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체의 특이적인 부위에 결합되는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 항체 및 항원-결합 단편은, 역 단백질 분해(reverse proteolysis)(Fisch et al. 1992 Bioconjug Chem 3 147-53; Werlen et al. 1994 Bioconjug Chem 5 411-7; Capellas et al. 1997 Biotechnol Bioeng 56 456-63; Kumaran et al. 1997 Protein Sci 6 2233-41 및 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques , Academic Press: San Diego, Calif. (1996)에 기술된 방법) 등의 적합한 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 항체 조성물은, 선택적으로, 항-감염성 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 호흡기 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 조절 약물, 혈액학적 약물, 항종양제, 면역조절제, 안약, 귀 약물, 코 약물, 국소 약물, 영양성 약물 등 중 1종 이상으로부터 선택되는, 1종 이상의 화합물 또는 단백질을 유효량으로 더 포함할 수 있다. 이러한 약물들은, 본원에 제시된 각각에 대한 제형, 증상, 투약 및 투여에 대해서는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다(예, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21 ^st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, Conn., 이들 각 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).

본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체 조성물은, 비제한적으로 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지성 용매, 보존제, 보강제 등의 임의의 적합한 보조제 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 보조제가 바람직하다. 이러한 무균 용액의 비제한적인 예와 제조 방법은, 비제한적으로 Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 ^th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990 등의 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있거나 본원에 기술된 바와 같이 항체 조성물의 투여, 용해성 및/또는 안정성 모드에 적합하게, 통상적으로 선별할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용가능한 제약학적 부형제 및 첨가제로는, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질 및 탄수화물(예, 당, 예컨대 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 및 올리고당; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등의 유도체화된 당; 및 다당류 또는 당 폴리머들)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않으며, 이것은 단독으로 또는 1-99.99 중량% 또는 부피% 등의 단독으로 또는 조합으로 제시될 수 있다. 단백질 부형제의 예로는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 또한, 왈충력에 작용할 수 있는 아미노산의 예로는, 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 루신, 이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 바람직한 한가지 아미노산은 글리신이다.

본 발명에 사용하기 적합한 탄수화물 부형제로는, 예컨대 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류; 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 셀로바이오스 등의 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 스타치 등의 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 지일리톨 소르비톨(글루시톨), 미오인시톨 등의 다당류를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.

또한, 항체 조성물은 완충제 또는 pH 조절제를 포함할 수 있으며, 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조되는 염이다. 완충제의 예로는 유기 산 염, 예컨대, 시트르산염, 아스코르브산염, 글루콘산염, 카본산염, 타르타르산염, 숙신산염, 아세트산염 또는 프탈산염; 트리스, 트로메탄민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트레이트이다.

부가적으로, 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체 조성물은, 폴리머성 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머성 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 정전기 방지제, 계면활성제(예, 폴리소르베이트, 예컨대 "TWEEN^® 20" 및 "TWEEN^® 80"), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 조성물에 사용하기 적합한, 다른 공지되거나 상기한 제약학적 부형제 및/또는 첨가제들은, 당해 기술 분야, 예컨대 "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 ^th ed., Williams & Williams, (1995), and in the "Physician's Desk Reference", 52 ^nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)의 리스트에 기술되어 있으며, 이 문헌의 내용은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예, 사카라이드 및 알디톨) 및 완충제(예, 시트레이트) 또는 폴리머성 제제이다.

본 발명은, 식염수(saline) 또는 선택 염과의 포스페이트 완충액을 포함하는 안정적인 제형, 뿐만 아니라 보존된 용액 및 보존제가 함유된 제형을 포함하는 안정적인 제형과, 또한 제약학적으로 허용가능한 제형내에 하나 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 포함하는, 제약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다중-용도로 보존된 제형을 제공한다. 보존된 제형은 하나 이상의 공지된 보존제, 또는 선택적으로, 1종 이상의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐머큐리 나트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예, 헥사하이드레이트), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살로 이루어진 군 또는 이의 혼합물로부터 선택되는 보존제를, 수성 희석제 중에 포함한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물은, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 예컨대 0.001-5%, 또는 임의의 범위나 이에 포함된 수치, 예를 들어 비제한적으로, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 임의의 범위나 이에 포함된 수치로, 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 보존제를 포함하지 않으며, 0.1-2% m-크레졸(예, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알코올(예, 0.5, 0.9, 1.1., 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티메로살(예, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀(예, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(들)(예, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.

본 발명의 임의 방법은 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 제약학적 조성물을 유효량으로 조절, 치료 또는 요법이 요구되는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 면역 질환을 치료하기 위한 공동-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 투여하는 단계는 한가지 이상의 다발성 경화증 치료제(예컨대, 비제한적으로, 베타-인터페론 1a 및 베타-인터페론 1b (예, Avonex™, Rebif™, Betaseon™), 글루티라머 아세테이트(glutiramer acetate)(예, 코팍손(Copaxone)), 사이클로파스파미드(cyclophasphamide), 아자티오프린(azathioprine), 글루코코르티코스테로이드(glucocorticosteroid), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 2-클로로데옥시아데노신(2-chlorodeoxyadenosine), 미토산트론(mitoxantrone), IL-10, TGBb, CD4, CD52, 안테그렌(antegren), CD11, CD18, TNF알파, IL-1, IL-2, 및/또는 CD4 항체나 항체 수용체 융합체, 인터페론 알파, 면역글로불린, 리스미드(Lismide)(Requinimax™), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 엘프로딜(elprodil), 피르페니돈(pirfenidone), 경구 마이엘린(oral myelin), 또는 마이엘린 파괴의 자가면역 억제, 면역 조절, 활성화, 증식, 이동 및/또는 T 세포의 세포기능 억제자, 혈액 뇌 경계를 통과 감소, 전염증성 사이토카인(T_H1) 및 면역조절 사이토카인(T_H2)의 균형 변이, 매트릭스 메탈로프로테아제 저해제의 저해, 신경 보호, 신경교증의 경감, 재수초화 촉진), TNF 길항제(예, 비제한적으로, TNF 항체, 단편, 수용성 TNF 수용체 또는 단편, 이의 융합 단백질 또는 소형 분자 TNF 길항제), 항류마티스제, 근육 이환제, 최면제, 비-스테로이드성 항-염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제(예, 아미노글리코사이드, 항진균제(antiftingal), 항기생충제, 항바이러스제, 카바페넴(carbapenem), 세팔로스포린(cephalosporin), 플루로르귀놀론(flurorquinolone), 마크롤라이드(macrolide), 페니실린(penicillin), 설폰아미드(sulfonamide), 테트라사이클린(tetracycline, 기타 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화성 스테로이드, IL-12/23 제제, 미네랄, 영양, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬(honnone), 항설사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 완화제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen^®), 사르그라모스팀(sargramostim)(GM-CSF, Leukine), 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제(예, 바실릭시맵(basiliximab), 사이클로스포린(cyclosporine), 다클리주맵(daclizumab)), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 산동제(mydriatic), 사이클로플리직(cycloplegic), 알킬화제, 항대사산물, 유사 분열 저해제(mitotic inhibitor), 방사성약물(radiopharmaceutical), 항우울제, 항조제(antimanic agent), 항정신병제, 불안 완화제, 최면제(hypnotic), 교감신경흥분제(syinpathomimetic), 자극제(stimulant), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 천식 약물(asthma medication), 베타 작용제(beta agonist), 흡입형 스테로이드(inhaled steroid), 루코트리엔 저해제(leukotriene inhibitor), 메틸잔틴(methylxanthine), 크로몰린(cromolyn), 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(dornase alpha)(Pulmozyme^®), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제 중에서 선택되는 1종 이상의 투여 전, 동시에, 및/또는 투여 후에 투여하는 것을 더 포함한다. 적정 투여량은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예로, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)를 참조하며, 각 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 조성물, 조합 요법, 공통-투여, 디바이스 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제(본 발명의, 1종 이상의 항체, 특정 부분 및 변이체를 더 포함함)는, 항-TNF 항체, 항원-결합 단편 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 분비 또는 이의 타겟 세포에 대한 작용을 예방 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대 탈리도미드, 테니댑, 포스포다이에스테라제 저해제(예, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 강화제; TNF 수용체 시그널링을 예방 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성화된 단백질(MAP) 키나제 저해제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대, 메탈로프로테나제 저해제; TNF 활성을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예로 안지오텐신 변환 효소(ACE) 저해제(예, 카프토프릴); TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예, MAP 키나제 저해제를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본원에서, "종양 괴사 인자 항체", "TNF 항체", "TNFα 항체" 또는 단편 등은 TNFα 활성을 시험관내, 생체외 및/또는 바람직하게는 생체내에서 감소, 차단, 저해, 저지 또는 간섭한다. 예로, 본 발명의 적합한 TNF 인간 항체는 TNFα에 결합할 수 있으며, 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNFα에 특이적으로 결합하는, 이의 특정 돌연변이 또는 도메인을 포함한다. 또한, 적합한 TNF 항체 또는 단편은 TNF RNA, DNA 또는 단백질의 합성, TNF 방출, TNF 수용체 시그널링, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 저지, 간섭, 방해 및/또는 저해할 수 있다.

본 발명에 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는, TNFα와 고친화성으로 결합하는 분자이며(예, Feldmann et al., International Publication No. WO 92/07076; Loetscher et al. 1990 Cell 61 351-9; Schall et al. 1990 Cell 61 361-70, 이들 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 선택적으로 낮은 면역원성을 가진다. 특히, 55 kDa (p55 TNF-R) 및 75 kDa (p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체들이 본 발명에 유용하다. 또한, 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 그것의 기능성 부분을 포함하는, 이들 수용체의 절단형(truncated form)(예, Corcoran et al. 1994 Eur J Biochem 223 831-40) 역시 본 발명에 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 절단형들이 뇨와 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα의 저해 항체로 검출되었다(Engelmann et al. 1990 J Biol Chem 265 1531-6). TNF 수용체 다량체성 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자, 및 이의 유도체, 단편 또는 일부분도, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자의 다른 예이다. 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자들은, 장기간의 환자 치료력, 증상의 우수 내지 탁월한 경감 및 저독성이 특징적이다. 낮은 면역원성 및/또는 고친화성 뿐만 아니라 다른 미확인된 특성들이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다.

전형적으로, 병리학적 증상의 치료는, 조성물에 포함된 항체, 특정 부분 또는 변이체의 특이적인 활성에 따라, 투여 당 환자 kg 당, 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체가 평균 적어도 약 0.01 내지 500 mg, 바람직하게는 1회 또는 다회 투여 당 환자 kg 당, 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체가 적어도 약 0.1 내지 100 mg인, 1종 이상의 항체 조성물을 유효량 또는 투여량으로 투여함으로써 이루어진다. 다른 구현예에서, 유효 혈청 농도는 1회 또는 다회 투여 당 혈청 농도 ml 당 0.1-5000 ㎍을 포함할 수 있다. 적정 투여량은 의학 실무자들에게 공지되어 있으며, 이는 물론 특정 질환 상태, 투여 중인 조성물의 특이 활성 및 치료 중인 특정 환자에 따라 결정될 것이다. 일부 예들에서, 원하는 치료량을 달성하기 위해서는, 반복 투여, 즉 특정한 추적되거나 또는 측정된 투여량을 각각 반복 투여할 필요가 있을 수 있으며, 이 경우 각각 투여는 원하는 1일 투여량 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다. 바람직한 투여량은, 선택적으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및/또는 100 mg/kg/투여, 또는 임의 범위, 범위내 수치 또는 분수를 포함할 수 있거나, 또는 1회 또는 다회 투여 당 혈청 농도 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 ㎍/ml, 또는 임의 범위, 범위내 수치 또는 분수 수준을 달성하도록 포함할 수 있다.

다른 예로, 투여되는 투여량은 공지된 인자, 예컨대 특정 제제의 약동학적 특징들과 이의 투여 모드와 경로; 수여체의 나이, 건강 및 체중; 증상의 특성과 정도, 병용 치료제의 종류, 치료 빈도 및 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 통상적으로, 활성 성분의 투여량은 체중 kg 당 약 0.1 - 100 mg일 수 있다. 일상적으로는, 투여 당 kg 당 0.1 - 50, 바람직하게는 0.1 - 10 mg, 또는 서방형 형태가 원하는 결과를 수득하는데 효과적이다.

비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료제는, 본 발명의 1종 이상의 항체, 특정 부분 또는 변이체를, 1회 또는 주기적인 투여량으로서, 0.1 - 100 mg/kg, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg/day로, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 24일 이상, 25일 이상, 26일 이상, 27일 이상, 28일 이상, 29일 이상, 30일 이상, 31일 이상, 32일 이상, 33일 이상, 34일 이상, 35일 이상, 36일 이상, 37일 이상, 38일 이상, 39일 이상 또는 40일 이상, 또는 다른 예로 또는 부가적으로, 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 12주 이상, 13주 이상, 14주 이상, 15주 이상, 16주 이상, 17주 이상, 18주 이상, 19주 이상, 20주 이상, 21주 이상, 22주 이상, 23주 이상, 24주 이상, 25주 이상, 26주 이상, 27주 이상, 28주 이상, 29주 이상, 30주 이상, 31주 이상, 32주 이상, 33주 이상, 34주 이상, 35주 이상, 36주 이상, 37주 이상, 38주 이상, 39주 이상, 40주 이상, 41주 이상, 42주 이상, 43주 이상, 44주 이상, 45주 이상, 46주 이상, 47주 이상, 48주 이상, 49주 이상, 50주 이상, 51주 이상 또는 52주 이상, 또는, 다른 예로 또는 부가적으로, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상, 4년 이상, 5년 이상, 6년 이상, 7년 이상, 8년 이상, 9년 이상, 10년 이상, 11년 이상, 12년 이상, 13년 이상, 14년 이상, 15년 이상, 16년 이상, 17년 이상, 18년 이상, 19년 이상 또는 20년 이상, 또는 이의 임의 조합으로, 1회 투여, 주입 투여 또는 반복 투여로 제공할 수 있다.

내부 투여에 적합한 투약 형태(조성물)는 일반적으로 유닛 또는 용기 당 활성 성분을 약 0.1 mg 내지 약 500 mg으로 포함한다. 이러한 제약학적 조성물에서, 활성 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5-99.999 중량%로 통상 존재될 것이다.

비경구 투여의 경우, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 제약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 더불어, 조합하거나 개별적으로 제공되는, 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조 분말로서 제형화할 수 있다. 상기 비히클의 예로는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스액 및 1-10% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정 오일 역시 사용할 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말에는 등장성(예, 소듐 클로라이드, 만니톨) 및 화학적 안정성(예, 완충액 및 보존제)을 유지시키는 첨가제가 포함될 수 있다. 제형은 공지되거나 적절한 기법으로 무균화한다.

적합한 제약학적 담체들은 본 분야의 표준 자료인 최신판 Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol에 기술되어 있다.

때로는, 장기간 동안, 예컨대 1회 투여 후 1주일 내지 1년 동안 본 발명의 항체를 개체에게 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 느린 방출, 데포트(depot) 또는 임플란트 투약 형태를 활용할 수 있다. 예로, 투약 형태에는 체액에 대해 용해성이 낮은 화합물의 제약학적으로 허용가능한 무독성 염, 예컨대 (a) 폴리베이직 산, 예컨대 인산, 황산, 구연산, 주석산, 탄닌산, 파모르산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-설폰산, 폴리갈락투론산 등과의 산 부가염; (b) 다가 금속 양이온, 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과의 염, 또는 예컨대 N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성되는, 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 예컨대 아연 타닌산염이 포함될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는, 전술한 화합물과 같이 비교적 불용성의 염은, 젤, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 젤 중에서 예컨대 주입에 적합한 참깨 오일과 함께 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 타닌산염, 파모에이트 염 등이다. 다른 타입의 느린 방출형의 주사용 데포트 제형에는, 폴리락트산/폴리글리콜산 폴리머, 예컨대 미국 특허 3,773,919에 개시된 것과 같이, 느리게 분해되는 무독성의 비-항원성 폴리머 중에서의 캡슐화를 위해, 분산된 화합물 또는 염이 포함될 것이다. 화합물, 또는 바람직하게는 전술한 것과 같이 비교적 불용성의 염은, 또한 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛 중에서, 특히 동물용으로 제형화할 수 있다. 부가적인 느린 방출형의 데포트 또는 임플란트 제형, 예컨대 가스 또는 지질 리포좀은 문헌에 공지되어 있다(미국 특허 5,770,222 및 "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

일반적으로 본 발명에 개시된 바와 동일한 내용은 하기 실시예들을 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 하기 실시예들은 예시적인 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 실시예들

본 실시예에서, IL-12, IL-23, IL-12p40, IL-12p80, IL-12Rβ1, IL-12Rβ2 및 IL-23은 다르게 언급되지 않은 한 단백질의 인간 형태를 언급하는 것이다.

본 실시예들에 나열된 각 항체에 대한 해당 단백질 및 DNA 서열은 표 10에 나타낸다.

실시예 1

1.1 하이브리도마 분리 및 키메라 항체의 제조

뮤라인 하이브리도마 제조 기법과 면역원으로서 재조합 IL-12를 사용하여, 2종의 하이브리도마 세포주, PMA202 및 PMA204를 수득하였다. 이들 세포주는 ELISA (PMA204 - 도 3)에서 테스트한 바와 같이 IL-12p40 (서열번호 1), IL-12 (서열번호 1 및 서열번호 2) 및 IL-23 (서열번호 1 및 서열번호 3)에 결합하는 항체를 분히하였다. 항체들을 뮤라인 IgG-₁kappa로서 동위체화(isotype)하였다.

세포주 PMA202 및 PMA204로부터 RNA를 추출하고, PCR 기법을 실시하여, 뮤라인 중쇄 및 경쇄 가변부의 서열을 수득하였다. 이들 서열은 아래에 나타내며, CDR은 밑줄 치고, 카바트에 따라 정하였다(Kabat et al. 1971 Ann N Y Acad Sci 190 382-93 and Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 항체의 가변부를 코딩하는 하기 단백질 서열 모두 카바트 넘버링 시스템에 따라 번호를 매긴다.

PMA202 뮤라인 중쇄 가변부 (서열번호 4)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSS

PMA202 뮤라인 경쇄 가변부 (서열번호 5)

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR

PMA204 뮤라인 중쇄 가변부 (서열번호 6)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSS

PMA204 뮤라인 경쇄 가변부 (서열번호 7)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKR

주형으로서 PMA202 단백질 서열을 이용하여, 인간 IgG₁ 도메인 상(CH1, CH2 및 CH3) (서열번호 8)에 뮤라인 중쇄 가변부가 이식되고, 인간 카파 불변 도메인(서열번호 9) 상에 경쇄 가변부가 이식된, 최적화된 새로운 뉴클레오티드 서열을, 아래와 같이 제조하였다. 이러한 키메라 항체를 항체 202.1으로 명명하였다:

항체 202.1 중쇄 (서열번호 10)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

항체 202.1 경쇄 (서열번호 11)

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

PMA204 단백질 서열을 주형으로 이용하여, 인간 IgG₁ 도메인 상(CH1, CH2 및 CH3) (서열번호 8)에 뮤라인 중쇄 가변부가 이식되고, 인간 카파 불변 도메인(서열번호 9) 상에 경쇄 가변부가 이식된, 최적화된 새로운 뉴클레오티드 서열을, 아래와 같이 제조하였다. 이러한 키메라 항체를 항체 1로 명명하였다:

항체 1 중쇄 (서열번호 12)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

항체 1 경쇄 (서열번호 13)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

이들 2가지 항체를 HEK 세포주에서 일시적으로 생산하여, 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 항체 1을 ELISA (도 3) 및 표면 플라스몬 공명(SPR)(표 1) 분석으로 IL-12, IL-23, IL-12p40에 대해 분석하였으며, IL-12/23의 p40 서브유닛에 특이적인 것으로 확인되었다. 결합 프로파일은 오리지날 마우스 항체 PMA204와 비슷하였다(도 3).

항체 1의 SPR 데이타

분석물	k _a (1/Ms)	k _a (1/s)	K _D (pM)
IL-12	1.36 x 10⁶	6.45 x 10^-5	47.7
IL-23	2.55 x 10⁶	1.14 x 10^-4	44.6
IL-12p40	1.07 x 10⁶	7.12 x 10^-5	66.3

실시예 2

2.1 PMA204 및 항체 1의 특이성

PMA204 및 항체 1은 ELISA를 이용하여 측정된 바에 따라 용량 의존적인 방식으로 인간 IL-12, IL-23, IL-12p40 및 IL-12p80에 동등하게 잘 결합하였다(도 3). SPR을 이용하여, k_a (on-rate), k_d (the off-rate) 및 평형 해리 상수 (K_D)를 포함한 카이네틱 데이타를 항체 1에 대해 계산하여, 표 1에 나열하였다. 항체 1은 인간 IL-12, IL-23, IL-12p40에 결합하였고, K_D 수치는 40-70 pM으로 비슷하였다(표 1).

2.2 PMA204 및 항체 1은 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 중화시킨다

수용체 중화 분석을 이용하여, PMA204 및 항체 1이 IL-12Rβ2의 세포외 도메인(서열번호 15)(도 4A)에 대한 IL-12의 결합을 중화시키고, IL-23R의 세포외 도메인(서열번호 16)(도 4B)에 대한 IL-23의 결합을 중화시킨다는 것을 확인하였다.

2.3 PMA204 및 항체 1은 IL -12, IL -12 p40 , IL -12 p80 또는 IL -23의 IL -12Rβ 1에 대한 결합을 중화하지 않는다

PMA204 및 항체 1은 IL-12 및 IL-12p80의 IL-12Rβ1(서열번호 14) 결합을 중화하지 않는다(도 5). IL-12p40 및 IL-23의 IL-12Rβ1에 대한 결합은 PMA204 또는 항체 1에 의해 저해되지 않았다(도 6).

2.4 항체 1은 IL -12Rβ 1 형질감염된 세포주에 대한 IL-12/23의 결합을 저해하지 않는다

IL-12Rβ1을 과다 발현하는 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포주를 제조하였다. 이 세포주는 유세포 측정에 따르면 IL-12Rβ2와 IL-23R에 음성이었다. 세포주에 대한 IL-12p40, IL-12 및 IL-23의 결합성을 유세포 측정으로 검증하였다. 항체 1 및 항체 202.1을 IL-12p40, IL-12 또는 IL-23으로 적정하는 실험에서, 항체 202.1이 IL-12Rβ1 Jurkat 세포주에 대한 사이토카인 결합을 적정가능하게 저해하는 것으로 확인되었다(도 7). 반대로, 항체 1은 IL-12, IL-23 또는 IL-12p40 체인 중 어느 한가지도 IL-12Rβ1 Jurkat 세포주에 대한 결합을 인지가능한 수준으로 중화시키지 않았다(도 7). IL-12 및 IL-23의 평균 형광 세기는 항체 1의 농도를 최대 1 ㎍/ml로 증가시킴에 따라 높아졌으며, 이는 항체-사이토카인-수용체 복합체가 형성됨을 의미한다(도 7).

2.5 항체 1은 형질감염 세포주에서 IL -12Rβ1에 결합된 IL -12, IL -23과의 복합체를 형성한다.

항체 1은 형질감염 세포의 표면상의 IL-12Rβ1에 결합된 IL-12, IL-23 또는 IL-12p40에 강하게 결합하였다(도 8). 이는, 이 복합체가 생물학적 시스템에서 발생할 수 있으며, 항체의 Fc 영역이 Fc 결합 수용체와 상호작용할 수 있도록 하는 방향으로 항체가 제시될 수 있는 것으로 생각해 볼 수 있었다. 이러한 수용체들은 작용자 세포 상에 존재하며, ADCC 및 CDC 활성을 유도함으로써 항체-사이토카인-수용체 복합체가 형성되는 타겟 세포에 대해 세포독성 효과를 발휘할 수 있었다. 반면에, 항체 202.1은 사이토카인-수용체 복합체에 대해 매우 약한 결합성을 나타내었다.

실시예 3

3.1 항체 1의 최적화

3.1.1 경쇄에서 94번 위치의 W

항체 정제 공정에서 트립토판을 산화시켜, Yang et al. 2007 J Chromatogr A 1156 174-82에서 확인된 바와 같이, 단백질을 HPLC 분석하는 동안에 문제를 야기하는 산화된 종 및 비산화된 종으로 유도할 수 있다. 이를 방지하기 위해, 경쇄의 94번 위치에서 Trp를 Phe로 보존적인 치환을 수행하였다. 이 항체를 항체 3으로 명명하고, 유전자 합성에 의해 제조한 다음 발현시켜 ELISA로 스크리닝하였다(도 9). SPR 스크린에서, 이 항체는 항체 1에 비해 IL-12 및 IL-23으로부터의 해리 속도가 더 빨랐다(표 2).

항체 1, 3, 4 및 7의 SPR 데이타

항체 번호	IL-12 결합성			IL-23 결합성
	*ka (1/Ms)*	*kd (1/s)*	*KD pM*	*ka (1/Ms)*	*kd (1/s)*	*KD pM*
1	1.67x10⁶	1.32x10^-4	79.5	2.85x10⁶	1.46x10^-4	51.3
3	2.15x10⁶	9.39x10^-5	43.8	1.24x10⁶	1.11x10^-4	89.6
4	1.54x10⁶	2.04x10^-4	133.0	1.25x10⁶	1.58x10^-4	127.0
7	1.82x10⁶	1.67x10^-4	91.8	2.03x10⁶	1.47x10^-4	72.2

3.1.2 중쇄 34번 위치의 M

Met는 항체 정제 및 저장 중에 산화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 위치에 Leu가 일반적인 것으로 인간 항체 서열의 BLAST 검색에서 확인되었다. M34L 치환을 수행하고, 구축물을 항체 4로 명명하였다. 유전자를 합성하고, 발현시킨 다음 SPR 및 ELISA를 이용하여 항체를 스크리닝하였다(도 9). 항체 4는 항체 1과 비교하여 IL-12 및 IL-23 둘다에 대한 친화성이 조금 낮았다(표 2).

3.1.3 중쇄 95번 위치의 시스테인

항체 1의 중쇄 95번 위치가 문제가 되는 잔기인 것으로 관찰되었다. CDR3 첫번째 잔기인 이 시스테인은 산화되어 제조되는 모든 항체 산물에 이종성(heterogeneity)을 야기할 수 있다. 또한, 이황화 결합 형성에 의한 복합체도 형성할 수 있다. 따라서, (오리지날 Cys 및 Trp인 것을 제외한) 나머지 18개의 아미노산들로 각각 유전자 합성을 이용하여 이 위치로 치환하고, 항체를 일시적으로 발현시켰다(항체 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22). 이들 항체에 대해 ELISA 수행하였다(도 9). 이들 항체들 중 일부에는 IL-12 및 IL-23 둘다에 대한 결합 활성이 있었지만, 다른 일부 항체들은 한가지 또는 다른 사이토카인에 대한 결합 활성을 가지고 있었으며, 그외 항체들은 어느 쪽 사이토카인에도 최소한으로 결합하였다. SPR을 동일한 시료를 대상으로 수행하였고, 이로부터 구축물의 off-rate 데이타를 분석하였다. 이 데이타에서, C95N 치환이 있는 항체 7이 항체 1과 가장 비슷한 친화성을 보였다(표 2).

SDS-PAGE에서 확인된 바와 같이, 이러한 치환이 산물의 동종성(homogenitiy)을 예상치도 못하게도 매우 개선시켰다. 항체 7은 알려진 분자량의 비교 항체에서 확인되는 결과와 비슷한 한가지의 주류 종이 나타나는 크기 패턴을 나타내었다(도 10). 이러한 결과는 주류 종이 2개 나타난 항체 1과 비교되었다(도 10).

그 후, 3가지 치환을 하나의 항체에 조합하였고, 이 항체는 다음과 같은 중쇄 가변부와 경쇄 가변부를 가진 항체 50으로 명명하였다:

항체 50 VH 도메인 (서열번호 112)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNANKELRYFDVWGAGTTVTVSS

항체 50 VL 도메인 (서열번호 169)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSFPLTFGAGTKLELKR

ELISA, SPR 및 세포성 분석에 의한 측정에 따르면, 이 항체는 IL-12 및 IL-23에 대해 고친화성을 유지하였다(도 11).

실시예 4

4.1 PMA204 의 슈퍼인간화

PMA204의 슈퍼인간화는 미국 공개공보 US 2003/039649 (Foote), PCT 공개번호 WO 04/006955 (Foote)에 언급된 방법과 Tan et al. (2002) 및 Hwang et al. (2005)에 의해 추가로 설명된, 방법에 따라 수행하였다.

우선, 중쇄 및 경쇄 CDR의 캐논 구조(하기 나열)를 미국 특허 출원번호 10/194975 및 미국 특허 6,881,557에 기술된 방법과, Tan et al (2002. J. Immunol. 169(2): 1119-25), Hwang et al (2005) 및 본원(하기)에 기술된 방법에 따라, 결정하였다.

PMA204의 CDR들의 캐논 구조 패턴

CDR	캐논 구조
중쇄 CDR1	1
중쇄 CDR2	2
경쇄 CDR1	2
경쇄 CDR2	1
경쇄 CDR3	1

PMA204와 비슷한 캐논 구조 패턴을 가진 인간 생식선 VH 영역 서열(Hwang et al, 2005)을 억셉터로서 선정하였다. 다음과 같은 생식선 서열들이다(주의: 모든 생식선 서열들은 IMGT 데이타베이스로부터 입수함, Giudicelli, V. et al. Nucleic Acids Res., 33: D256 - D261 (2005); 이들 생식선 서열에서 일부 잔기들은 과가변성이며, 서열에 나열하지 않았음):

IGHV1-f*01 (서열번호 17)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT

IGHV1-24*01 (서열번호 18)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT

IGHV1-18*01 (서열번호 19)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR

나타낸 임의의 생식선 서열(서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호:19)을 공지된 6종의 인간 생식선 JH 서열과 조합하여, 인간화된 중쇄를 제조하기 위한 프래임워크 영역을 제공할 수 있었다. 하기 JH 영역의 서열은 1차 서열 유사성을 기초로 선정하였다:

JH3 (서열번호 20)

AFDVWGQGTMVTVSS

PMA204와 캐논 구조 패턴이 유사한 인간 생식선 VL 영역 서열(Hwang et al, 2005)을 억셉터 서열로 선정하였다. 이 서열은 하기 생식선 서열이다:

IGKV6D-21*01 (서열번호 21)

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP

IGKV3-15*01 (서열번호 22)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP

IGKV3-11*01 (서열번호 23)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP

공지된 임의의 생식선 서열(서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23)을 5종의 가능성있는 J 서열과 조합하여, 인간화된 경쇄를 제조하기 위한 프래임워크 영역으로 제공하였다. 하기 Jκ 영역 서열은 1차 서열 유사성을 기초로 선별하였다:

Jκ4 (서열번호 24)

LTFGGGTKVEIKR

억셉터의 CDR을 PMA204의 대응되는 CDR로 치환하였다. 유전자 합성을 이용하여 유전자를 만들고, 슈퍼인간화된 중쇄 및 경쇄의 여러가지 조합체(항체 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48)를 형질감염시켰다. 발현되는 항체들 모두 IL-12 및 IL-23에 대한 결합 활성을 보유하였다(도 12).

PMA204의 중쇄에서 2종의 빈도가 낮은 아미노산을 동정하였다. 93번의 Ala과 94번의 Asn이었다. 이들 아미노산을 중쇄 슈퍼인간화된 변이체에 역돌연변이로서 도입하였다. 유전자 합성을 이용하여 유전자를 제조하고, 이들 역돌연변이된 슈퍼인간화된 중쇄 및 슈퍼인간화된 경쇄들의 여러가지 조합체(항체 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39)를 형질감염시켰다. 발현되는 항체들 중 일부에는 IL-12 및 IL-23 모두에 대해 결합 활성을 가지고 있었지만, 일부 항체는 한가지 사이토카인이나 다른 사이토카인에만 결합하고, 그외 항체들은 어느 사이토카인에도 최소한으로 결합하였다(도 12).

이러한 조합의 항체들 중에서, 몇 종의 항체는 ELISA 및 SPR 분석에서 이의 항원에 일관된 강력한 결합성을 나타내었다. 3종의 항체, 항체 37, 39 및 44를 선별하였다. 항체 1의 최적화를 기반으로, 항체 1의 생물물리학적 특성을 강화시키는 3 부위 돌연변이(경쇄 W94F, 중쇄 M34L, 중쇄 C95N)를 항체 37, 39 및 44에 도입하였다. 변이체의 중쇄와 경쇄를 혼성하는 조합 방법을 수행하여 항체 패널을 제조하였다(항체, 76, 77, 78, 79, 80, 81). 이들 항체들 모두 ELISA에서 IL-12 및 IL-23에 결합하는 것으로 확인되었다(도 13). SPR로 측정한 결과 항체 80이 IL-12에 대해 강력한 결합성을 나타내어, NK92 세포주를 이용한 분석(도 11) 및 인간 PBMC IL-12 유도성 IFN-γ 분석(도 17) 및 뮤라인 비장세포 분석(도 14)을 이용한 추가적인 분석용으로 선택하였다. 구축물 항체 80은 NK-92 분석에서 IL-12 유도성 IFN-감마 분비를 강하게 저해하였고, 뮤라인 비장세포 분석에서는 IL-23 유도성 IL-17 분비를 강하게 저해하였다.

실시예 5

5.1 PMA204 의 인간화

오리지날 마우스 항체의 프래임워크 서열과 상동성이 높은 선형 펩타이드 서열로서 인간 프래임워크 서열을 이용하여, PMA204를 인간화하였다.

PBD 데이타베이스의 BLAST 검색 (http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)을, 대상 서열로서 PMA204의 중쇄 및 경쇄를 이용하여 수행하였다.

PMA204의 중쇄 가변부에 매우 가까운 인간 상동체는 하기 나타낸 1RZ7HC 가변부(서열번호 25)였다:

PMA204HC EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQR 40

1RZ7HC ....V....EVKKP..TV.I..K...YTFS.F..Y..R.A 40

PMA204HC PEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAY 80

1RZ7HC .GK....M.L....DA..M..E..R.RV.I.....TD.G. 80

PMA204HC LQLSSLTSEDTAVYYCNACK-ELRYFDVWGAGTTVTVSS 118

1RZ7HC .E....R.........A.DPW..NA.N...Q..L.S... 119

CDR 영역의 바깥쪽 2종의 서열들 간에 31개의 아미노산 차이가 있었다.

또한, 경쇄 상동성은 하기와 같이 PMA204의 경쇄 가변부와 1RZ7LC 가변부(서열번호 26) 간에 매우 높았다:

PMA204LC DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKS 40

1RZ7LC D.QM....SSV.ASV..R.TIT.....D..TW.A.....P 40

PMA204LC HESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVET 80

1RZ7LC GKA.K...YA..TLQ..V......S......S.T...LQP 80

PMA204LC EDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKR 107

1RZ7LC ...AT.Y...A..F-F...G...V.I.. 107

CDR 영역의 바깥쪽 2가지 서열들 간에는 31개의 아미노산 차이가 있다.

3D-모델링 소프트웨어(Accelrys, Modeller)를 이용하여, PMA204의 중쇄 및 경쇄의 3D 모델을, PBD 데이타베이스의 BLAST 검색 중에 찾은 1차 서열을 기초로 10종의 가장 상동적인 항체들을 주형으로 하여 구축하였고, 이때 각 주형 항체는 고해상의 결정 구조가 공개된 것이다. PMA204와 1RZ7 모델의 정렬하여, 2종의 항체들의 프래임워크 간의 적정한 피트(fit)가 확인되었다(RMSD 중쇄 = 1.53 및 RMSD 경쇄 = 0.6). 따라서, 1RZ7을 PMA204 유래 공여체 CDR을 이식하여 CDR-이식된 항체를 제조하기 위한 억셉터 프래임워크로 선택하였다.

PMA204 모델의 유사 조사를 통해, CDR-이식된 항체의 항원 결합성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 프래임워크 잔기들이 동정되었다. 이는 다음과 같다:

중쇄

ARG40 - 다른 잔기와 수소 결합하며, CDR 루프 구조를 안정시킴

GLU42 - 공여체와 억셉터 간에 비교시 이차 구조에 차이가 있음

LYS66 - 3개의 다른 잔기와 수소 결합하며, CDR 루프 구조를 안정시킴

경쇄

LYS49 - 중쇄 CDR3 잔기와 수소 결합

TYR65 - 비보존적인 저빈도(RARE) 잔기

ARG85 - 비보존적인 저빈도(RARE) 잔기

이들 각 아미노산을 역돌연변이로서 CDR-이식된 항체에 도입하였다. 항체 1의 최적화를 기초로, 항체 1의 생물물리적 특징들을 강화시키는 3가지 점 돌연변이(경쇄 W94F, 중쇄 M34L, 중쇄 C95N)를 인간화된 변이체들 모두에 도입하였다.

모든 인간화된 변이체의 유전자를 합성한 다음, 선형의 CDR-이식된 항체 체인과 역돌연변이된 체인의 조합들을 함께 발현시켜, 인간화된 항체 패널(항체 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75)을 제작하였다. 이들 항체에 대해 ELISA를 수행하였다. 항체들 모두 IL-12 및 IL-23 둘다에 대해 결합 활성을 가지고 있었다(도 15. 16). 항체 68은 SPR로 측정시 IL-23에 대한 강한 결합성을 보여서, NK92 세포 분석을 이용한 이후의 분석용으로 선택하였다(도 11). 항체 68은 NK-92 분석에서 IL-12 유도성 IFN-감마 분비를 강하게 저해하는 것으로 확인되었다.

다른 역돌연변이가 항체의 친화성 및 효능을 증강시킬 수 있는지를 보기 위해, 항체 68의 중쇄 가변부를 최적화된 키메라 항체 50의 중쇄 가변부와 정렬하였다. 항체 68에서 항체 50과 다른 각 위치에, 해당 위치에 있는 항체 50의 잔기를 항체 68에 도입하였다. 이러한 변이체들은 유전자 합성하고, 항체 68 경쇄와 쌍을 지은 다음 발현시켰다(항체 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125). 항체의 중쇄와 경쇄에 대해 ELISA를 수행하였다. 일부는 IL-12와 IL-23에 대해 결합 활성을 가졌지만, 일부는 어느 하나의 사이토카인에 대해서만 결합 활성을 보였으며, 어떤 것들은 어느 사이토카인에도 결합하지 않았다(도 18).

다른 역돌연변이가 항체의 친화성 및 효능을 증강시킬 수 있는지를 보기 위해, 항체 68의 경쇄 가변부를 최적화된 키메라 항체 50의 경쇄 가변부와 정렬하였다. 항체 68에서 항체 50과 다른 각 위치에, 해당 위치에 있는 항체 50의 잔기를 항체 68에 도입하였다. 이러한 변이체들은 유전자 합성하고, 항체 68 중쇄와 쌍을 지은 다음 발현시켰다(항체 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148). 항체의 중쇄와 경쇄에 대해 ELISA를 수행하였다. 일부는 IL-12와 IL-23에 대해 결합 활성을 가졌지만, 다른 것들은 어느 사이토카인에도 결합하지 않았다(도 19).

항체 127, 130, 136, 140, 146, 147 및 148을 세포성 분석에서 스크리닝되는 IL-12 및 IL-23에 대한 강력한 결합성을 기초로 선택하였다. 항체 136은 인간 PBMC IL-12 유도성 IFN-γ 분석에서 강력한 일 저해를 나타내었고(도 17), 뮤라인 비장세포 분석에서 IL-23 유도성 IL-17 분비를 저해하였다(도 14).

실시예 6

6.1 항체 80의 친화성 성숙

6.1.1 리보좀 디스플레이용 재료 제조

항체 80을, scFv(scFv-80)(서열번호 27)로 발현되도록 재포맷하여 pEGX448 발현 벡터에 서브클로닝하였다. scFv를 친화성 정제가 가능하도록 FLAG 테그와 함께 발현시켰다. 그 후, scFv를 E. coli에서 발현시키고, 친화성 크로마토그래피와 겔 여과에 의해 정제하였다. 발현은 SDS-PAGE와 면역블롯팅으로 검증하였다. 이 scFv는 SPR에 의해 검증한 바에 따르면 모 IgG와 유사한 카이네틱스를 가지며 IL-12 및 IL-23 둘다에 대한 결합 활성을 가지고 있었다.

scFv-80의 코딩 서열을 pEGX412 돌연변이화/리보좀 디스플레이 벡터로 서브 클로닝하고, Q-베타 레플리카제를 이용하여(Kopsidas et al ., 2007, BMC Biotechnology, 7: 18), scFv 서열에 랜덤 돌연변이를 도입하였다. 돌연변이 scFv-80을 코딩하는 DNA 구조체 제조 풀을 T7 RNA 중합효소 반응으로 단일가닥 mRNA로 전사한 다음, 이를 이용하여 리보좀 디스플레이를 수행하였다.

상업적인 IL-23 조제물을 리보좀 디스플레이 실험에 이용하기 위해 바이오틴화하였다. SPR 실험을 수행하여 바이오틴화된 IL-23이 스트렙타비딘에 잘 결합하며 결합 친화성이 거의 감소되지 않은 수준으로 scFv-80에 대한 결합성을 유지하고 있음을 확인하였다.

6.1.2 리보좀 디스플레이를 이용한 IL -23 결합성 변이체의 농화

scFv-80 변이체를 코딩하는 mRNA 풀을 시험관내 발현 시스템을 이용하여 번역하고, 제조되는 scFv 라이브러리를 Kopsidas et al. (2007)에 기술된 리보좀 디스플레이 프로토콜을 이용하여 IL-23 바인더를 취하였다. 시스템의 선택압을 해리 상수(k_d)가 낮은 바인더에 편향되게 조절하였다. 1 라운드의 리보좀 디스플레이 프로세스가 완료되면, 농화된 scFv에 대한 코딩 서열을 PCR로 증폭시키고, PEGX448 발현 벡터에 서브 클로닝하였다. 서브 클로닝한 scFv 풀로부터 유래한 20개의 랜덤 클론들을 서열분석하여 scFv-80의 변이체로서의 실체를 확인하였다. 나머지 클론들은 IL-23에 대한 고성능 스크리닝을 수행하였다.

6.1.3 리보좀 디스플레이에 의해 발견된 scFv -80 변이체의 고성능 스크리닝

리보좀 디스플레이 반응으로부터 회수한 약 6500종의 각 scFv를 발현시키고, 고성능 SPR 분석을 이용하여 IL-23에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 변이체들을 k_d에 따라 순위를 매기고, 가장 우수한 변이체를 핵산 수준에서 서열분석하였다. 이 과정으로, 새로운 22개의 scFv 변이체(표 4)를 동정하였으며, 이들 각각은 모 scFv-80과 동일하거나 보다 우수한 IL-23 결합 친화성(k_d을 기초로 함)을 나타낸다

SPR 스크리닝을 통해 동정한 고유 scFv-80 변이체들의 서열 요약 개시

	VH 도메인			VL 도메인
scFv 명칭	서열번호 단백질	돌연변이*	서열번호 DNA	서열번호 단백질	돌연변이*	서열번호 DNA	k _d (1/s) vs. IL-23
scFv-80**	119	.	286	179	.	348	6.5x10^-4
AZ-D8	28	Y27C	217	179	.	348	4.3x10^-5
AY-B2	29	M69V	218	179	.	348	1.0x10^-4
AY-G7	119	.	286	46	Y86H	235	1.2x10^-4
CL-G7	30	E10Q	219	179	.	348	1.2x10^-4
CW-H1	119	.	286	47	S52R***	236	1.6x10^-4
CU-A6	31	F29L, T107A	220	32	S63F	221	1.9x10^-4
CP-A6	33	Y59H***	222	179	.	348	1.9x10^-4
AW-F2	34	Y59S***	223	179	.	348	2.5x10^-4
CR-B1	35	D85E	224	179	.	348	2.6x10^-4
CW-H7	119	.	286	48	V13M	237	2.78x10^-4
AV-F11	36	S112P	225	37	I75T	226	2.8x10^-4
CE-B1	38	F29L	227	179	.	348	2.8x10^-4
BV-B2	119	.	286	49	D82G	238	2.9x10^-4
BU-B1	39	L34M***	228	179	.	348	2.9x10^-4
AQ-G10	40	K12E, R66G	229	179	.	348	2.9x10^-4
AU-G9	41	Q43R	230	42	I55T***	231	3.1x10^-4
CE-G10	43	V5L	232	179	.	348	3.1x10^-4
BY-B4	44	T28A	233	179	.	348	3.3x10^-4
CE-A6	119	.	286	50	G64S	239	3.3x10^-4
AX-G4	119	.	286	51	S26P***	240	3.6x10^-4
BZ-G10	119	.	286	52	Q27R***	241	3.6x10^-4
BB-A9	45	T28A, T68S	234	179	.	348	4.5x10^-4

* 모든 돌연변이들은 천연형 scFv-80 서열과 관련하여 보고됨.

** 전체 스크리닝 실험에서 확립한 scFv-80의 평균 k_d(n=110).

*** CDR 가변부에서의 돌연변이

6.1.4 고유한 scFv -80 변이체의 전체 카이네틱 특징 파악

표 4에 제시한 다수의 scFv 변이체들을, 매우 다양한 돌연변이 프로파일 및 결합 친화성을 비롯한 결합 카이네틱스의 전체 특정화를 위해 선택하였다. 각 scFv에 대해 대규모 단백질 발현을 수행하였다. 발현시킨 scFv를 단량체성 단백질로서 분리하고, SPR에 의해 IL-12 및 IL-23에 대한 결합성을 조사하였다(표 5). 이러한 결과들은, 변이체들 모두 리보좀 디스플레이와 이들 2가지 항체에 결합된 것을 스크리닝함으로써 분리되었고, 모 scFv-80에 비해 친화성이 최대 50배 개선되었음을 나타낸다.

선택된 scFv-80 변이체의 전체 카이네틱 특징

scFv 명칭	IL -12 결합성			IL -23 결합성
scFv 명칭	ka *(1/* Ms )	kd *(1/s)*	*KD(* pM )	ka *(1/* Ms )	kd *(1/s)*	*KD(* pM )
scFv-80	2.0x10⁶	4.5x10^-4	230	3.1x10⁵	6.1x10^-5	200
CU-A6	2.0x10⁶	9.7x10^-5	48	3.0x10⁵	< LOD*	< LOD*
AW-F2	2.2x10⁶	1.0x10^-4	46	3.5x10⁵	< LOD*	< LOD*
CP-A6	2.0x10⁶	1.2x10^-4	61	3.1x10⁵	< LOD*	< LOD*
CE-B1	2.0x10⁶	1.8x10^-4	89	3.1x10⁵	3.0x10^-5	98
BU-B1	2.0x10⁶	2.4x10^-4	120	3.0x10⁵	3.7x10^-5	120
AU-G9	2.1x10⁶	2.4x10^-4	110	3.4x10⁵	4.4x10^-5	130
BB-A9	2.0x10⁶	2.3x10^-4	120	3.1x10⁵	4.4x10^-5	160
AX-G4	2.3x10⁶	3.1x10^-4	140	3.6x10⁵	5.5x10^-5	150
AV-F11	1.6x10⁶	3.3x10^-4	200	2.7x10⁵	2.5x10^-5	93
CR-B1	1.9x10⁶	4.4x10^-4	230	3.2x10⁵	4.1x10^-5	130
AQ-G10	1.5x10⁶	5.2x10^-4	350	2.8x10⁵	4.9x10^-5	170

** 이들 변이체의 k_d는 이러한 분석 포맷을 이용한 BIAcore T100의 검출 한계(LOD) 보다 낮았다. LOD는 1x10^-5 s^-1로 예측되었다.

6.1.5 scFv 변이체의 IgG 포맷으로의 전환

SPR 분석에서 최고의 결합 친화성을 나타낸 3가지의 scFv(AW-F2, CU-A6 및 CP-A6)를 각각의 포유류 발현 벡터에 V_H 및 V_L 도메인을 서브클로닝함으로써 IgG 발현을 위해 재포맷하였다(즉, 항체 중쇄용 구조체, 경쇄용 구조체). CU-A6를 항체 183으로 변환하였다. 인간 중쇄 Fc 영역(서열번호 8) 및 불변 카파 경쇄 영역(서열번호 9)을 삽입함으로써, CP-A6은 항체 184로 변환하고, AW-F2는 항체 207로 변환하였다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 구조체를 HEK 293E 배양물에 공동-감염시켜, IgG 분자를 발현시켰다. 발현되는 IgG들은 친화성 크로마토그래피와 겔 배제로 정제하고, 수득되는 단량체성 분자들을 SPR에 의해 IL-12 및 IL-23에 대한 결합성을 조사하였다(표 6). 3종의 IgG 변이체들 모두 2가지 분석에 대한 결합 활성을 가지고 있었으며, 모체인 야생형 IgG와 비교하여 k_d의 가시적인 개선이 나타났다. 이를 토대로, 표 4에 기재된 scFv 변이체들을 IgG 포맷으로 변환시킬 수 있으며 IL-12 및 IL-23에 대한 개선된 결합 특징을 유지할 수 있는 것으로 예상하는 것이 타당하다.

전장 길이의 IgG로서 재포맷하고 발현시킨 후, scFv 변이체들에 대한 전체 카이네틱 특징

항체 번호	scFv 명칭	IL -12 결합성			IL -23 결합성
항체 번호	scFv 명칭	ka *(1/Ms)*	kd *(1/s)*	KD pM	ka *(1/Ms)*	kd *(1/s)*	KD pM
80	n/a	4.3x10⁶	1.3x10^-3	292	4.1x10⁵	1.1x10^-4	280
183	CU-A6	4.1x10⁶	2.7x10^-4	65	4.0x10⁵	< L.O.D.*	2.7
184	CP-A6	4.2x10⁶	5.4x10^-4	127	4.1x10⁵	4.2x10^-5	104
207	AW-F	3.7x10⁶	6.3x10^-4	167	3.7x10⁵	6.5x10^-5	176

* 이들 변이체의 k_d는 이러한 분석 포맷을 이용한 BIAcore T100의 검출 한계(LOD) 보다 낮았다. LOD는 1x10^-5 s^-1로 예측되었다.

6.1.6 리보좀 디스플레이 및 스크리닝을 통해 동정된 돌연변이의 조합

전술한 다양한 돌연변이들을 조합하여, 부가적인 scFv 변이체 시리즈를 제작하였다(표 4). a) 스크리닝 단계에서 관찰되는 횟수, b) 돌연변이와 조합된 scFv의 친화성을 기초로 다양한 돌연변이들을 더하여 이들 scFv를 제작하였다. 가장 중요한 조합(표 7)을 부위 특이적인 돌연변이화를 이용하여 scFv-80에 부가하였다. 이졸 조합 scFv 모두 소량으로 발현시킨 다음 친화성 크로마토그래피와 탈염 컬럼을 이용하여 일부 정제하였다. 각각의 새로운 scFv를 단일 농도의 분석물을 이용한 중간 수준의 성능 분석 프로토콜(medium-throughput analysis protocol)을 이용하여 SPR에 의해 IL-12 및 IL-23에 대한 결합성을 조사하였다(표 7). 이 데이타에서, 이들 변이체들 모두 IL-12 또는 IL-23에 대한 결합성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 대부분의 경우, 새로운 변이체의 해리 속도는 모 변이체와 거의 동일하였다. 2종의 돌연변이 조합(VH 도메인에 T28A + VL 도메인에 S26P, VH 도메인에 F29L + VL 도메인에 S26P)이 모 변이체 보다 개선된 친화성을 보였다. 따라서, 표 4에 나열된 돌연변이들의 새로운 조합을 가지고 있는 scFv가, 모 돌연변이, 실제 야행성 scFv-80 보다 친화성이 우수하지 않다 하더라도 IL-12 및 IL-23에 동일하게 결합할 수 있는 것으로 예상하는 것이 타당하다.

scFv를 가지는 돌연변이 조합의 단일 농도 카이네틱 분석

scFv 조합 번호	VH 도메인			VL 도메인			결합 카이네틱스
scFv 조합 번호	서열번호(단백질)	돌연변이*	서열번호( DNA )	서열번호(단백질)	돌연변이*	서열번 호( DNA )	분석물	k _a (1/ Ms )	k _d (1/s)	K _D pM	효과
scFv-80		nil.					IL-23	3.0x10⁵	3.1x10^-5	104	n/a
scFv-80		nil.					IL-12	1.6x10⁶	2.5x10^-4	156	n/a
1	53	Q43R, Y59H	242	42	I55T	231	IL-23	2.3x10⁵	<LOD**	32	++
2	54	T28A, Y59S	243	179		348	IL-23	2.3x10⁵	<LOD**	34	++
3	44	T28A	233	51	S26P	240	IL-12	1.6x10⁶	4.5x10^-5	29	++
4	38	F29L	227	51	S26P	240	IL-12	1.8x10⁶	4.8x10^-5	27	++
5	44	T28A	233	32	S63F	221	IL-12	1.7x10⁶	6.5x10^-5	38	++
6	55	T28A, Y59H, T68S	244	179		348	IL-23	2.3x10⁵	<LOD**	41	+
7	56	F29L, Y59H	245	179		348	IL-23	2.0x10⁵	<LOD**	3.3	+
8	57	F29L, Y59S	246	179		348	IL-23	2.0x10⁵	<LOD**	7.5	+
9	58	Q43R, Y59S	247	42	I55T	231	IL-23	2.2x10⁵	<LOD**	27	+
10	59	T28A, Y59H	248	179		348	IL-23	2.2x10⁵	<LOD**	13	+
11	34	Y59S	223	51	S26P	240	IL-23	2.2x10⁵	<LOD**	27	+
12	60	T28A, Y59S, T68S	249	179		348	IL-23	2.2x10⁵	<LOD**	16	+
13	61	T28A, Q43R	250	42	I55T	231	IL-23	2.5x10⁵	1.3x10^-5	51	+
14	62	F29L, Q43R	251	42	I55T	231	IL-23	2.7x10⁵	2.1x10^-5	79	+
15	38	F29L	224	32	S63F	221	IL-12	1.7x10⁶	6.4x10^-5	39	+
16	38	F29L	224	47	S52R	236	IL-12	1.5x10⁶	7.5x10^-5	50	+

* 모든 돌연변이들은 야생형 scFv-80 서열과 비교하여 보고됨.

+ k_d가 모 변이체와 적어도 동일한 것으로 확인된 돌연변이 조합

++ 모 변이체에 비해 k_d가 개선된 것으로 확인된 돌연변이 조합

- 친화성이 감소된 돌연변이

실시예 7

7.1 인간화된 항체의 추가적인 돌연변이 유발

7.1.1 항체 136에 친화성 개선된 돌연변이 도입

항체 80의 친화성 성숙을 기초로, IL-12 및 IL-23에 대한 친화성을 강화하는 중쇄 가변부에서의 몇가지 주요 돌연변이(Y59S, Y59H 및 F29L)를 항체 136에 도입하였다(항체 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182). 이들을 발현시키고 ELISA로 스크리닝 하였다(도 20). 항체들 모두 IL-12 및 IL-23에 대해 결합성을 나타내었다.

7.1.2 항체의 다른 조합

93번 위치에 치환(N93A)을 포함하는 항체 30의 중쇄에 대한 친화성 성숙된 변이체를, 이의 대응되는 경쇄와 쌍을 지웠다(항체 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206) (도 20). 이 치환을 도입하여, 93번 위치를 다시 대부분 이 위치가 Ala인 인간 생식선의 잔기로 바꾸었다. 또한, 고친화성의 변이체를 동정하기 위해, N93A 치환을 포함하는 항체 80의 중쇄에 대한 친화성 성속된 변이체들도 항체 136 경쇄와 함께 발현시켰다(항체 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198) (도 20).

7.2 결합 친화성 측정

SPR 기법을 이용하여, 인간화된 다양한 항체들에 대한 k_a, k_d 및 K_D를 측정하였다. 이들 친화성은 표 8에 나열되어 있다. Y59S 또는 Y59H 치환이 포함된 항체들 모두, 항체의 프래임워크와는 독립적으로, IL-12 및 IL-23에 대한 결합 친화성 개선을 나타내었다.

다양한 인간화된 항체의 SPR 데이타

항체	IL-23 결합성			IL-12 결합성
	ka	kd	KD	ka	kd	KD
	1/ Ms	1/s	pM	1/ Ms	1/s	pM
80	6.25E+06	3.34E-04	53.5	4.88E+06	5.39E-04	110.0
136	7.55E+06	7.95E-04	105.3	5.05E+06	9.97E-04	197.0
177	3.43E+06	1.28E-04	37.3	4.61E+06	2.12E-04	46.0
180	3.12E+06	9.27E-05	29.7	5.31E+06	1.73E-04	32.5
181	4.09E+06	1.73E-04	42.4	3.57E+06	2.44E-04	68.1
182	5.27E+06	1.29E-04	24.6	6.23E+06	2.14E-04	34.4
190	4.28E+06	6.09E-04	142.0	3.86E+06	8.40E-04	217.0
192	2.66E+06	2.11E-04	79.4	4.16E+06	3.56E-04	85.5
193	N/D	N/D	N/D	2.60E+06	2.06E-04	79.4
194	2.99E+06	1.22E-04	41.0	2.09E+06	1.94E-04	92.7
195	4.03E+06	2.02E-04	50.0	2.65E+06	2.74E-04	103.0
198	4.65E+06	4.09E-04	87.7	3.75E+06	5.94E-04	158.0
205	4.81E+06	4.15E-04	86.2	3.70E+06	5.81E-04	157.0

실시예 8

8.1 다양한 항체들의 추가적인 특징

8.1.1 경쟁적인 실험 - SPR

경쟁적인 분석은 SPR을 이용하여 확립하여, 전술한 키메라 및 인간화된 항체가 PMA204와 동일한 결합 특이성을 유지하는지를 검증하였다. SPR 실험에서, 항체 136을 단백질 A로 코팅된 표면 상에 포획하여, 반응 단위(RU)를 높인 후 IL-12 또는 IL-23(반응 단위를 다시 증가시킴)을 부하하였다. PMA204를 부하하였으나 표면 IL-12 또는 IL-23 - 항체 136 복합체에 결합하지 않았다(도 21) (반응 단위 증가 안됨). 이는, 항체 136이 PMA204 결합성을 방해하는 방식으로 IL-12 및 IL-23에 결합하며, 2종의 항체가 IL-12 및 IL-23 상에서 중첩되는 에피토프를 공유하고 있음을 시사한다.

대조군 실험에서, 항체 136을 단백질 A로 코팅된 표면 상에 포획하여, 반응 단위를 높인 후, IL-12 또는 IL-23을 부하하였다(반응 단위를 또다시 높임). PMA202를 부하하였고, 그 결과 반응 단위가 증가되었는데, 이는 복합체에 결합되었음을 의미한다. PMA202와 항체 1은 IL-12 또는 IL-23이 사이에 끼인 복합체를 형성할 수 있는데, 즉 이들이 분자의 다른 위치에서 IL-12 또는 IL-23에 결합함을 의미한다(도 22).

유사한 경쟁적인 ELISA를 다른 조합의 포획 항체, IL-12 또는 IL-23 및 경쟁 항체를 이용하여 수행할 수 있을 것으로 생각할 수 있다.

8.1.2 경쟁적인 실험 - ELISA

경쟁 분석은 ELISA 방법을 이용하여 확립하여, 항체 136에 PMA204와 동일한 결합 특이성이 유지되어 있음을 검증하였다. PMA204를 ELISA 플레이트에 코팅한 후, IL-12 또는 IL-23을 첨가한 다음 항체 136을 첨가하였으나, 항체 136의 결합은 검출되지 않았다(도 23A). 이러한 결과는, 항체 136이 PMA204와 IL-12 또는 IL-23과의 결합에 대해 경쟁함을 의미한다. 대조군 항체인 PMA202로 코팅하고, 항체 136 및 IL-12p40의 사전 인큐베이션한 혼합물을 첨가하였을 때, 항체 136의 결합이 검출되었다(도 23B). 이 결과는, 항체 1이 PMA202와 IL-12에 대한 결합에 경쟁하지 않음을 시사한다. 항체 202.1을 1차 실험의 양성 결합 대조군(도 23A)으로 2차 실험의 음성 대조군(도 23B)으로 사용하였다.

8.1.3 수용체 중화 분석

8.1.3.1 항체 80 및 항체 136은 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 중화한다.

수용체 중화 분석을 이용하여, 항체 80과 항체 136이 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합(도 24A) 및 IL-23R에 대한 IL-23의 결합(도 24B)을 중화한다는 것을 입증하였다. 대조군 항체 202.1은 IL-12Rβ2에 대한 IL-12의 결합과 IL-23R에 대한 IL-23의 결합을 저해하지 않았다.

8.1.3.2 항체 80 및 항체 136은 IL -12 또는 IL -23의 IL -12Rβ1과의 결합을 중화하지 않는다

항체 80과 항체 136은 IL-12의 IL-12Rβ1과의 결합을 중화하지 않았다(도 25A). IL-23의 IL-12Rβ1과의 결합 역시 항체 80 및 항체 136에 의해 저해받지 않았고(도 25B), 오히려 단지 IL-23 및 수용체 단독인 경우에 비해 결합된 IL-23 증가에 의해 입증된 바와 같이 복합체 형성이 이루어졌다. 대조군 항체 202.1은 IL-12 및 IL-23의 IL-12Rβ1에 대한 결합성을 저해하였다.

실시예 9

9.1 진피내 IL -23 투여에 의해 유도되는 피부 염증의 완화

선두 항체 수종이 뮤라인 비장세포 상에서 IL-23 유도성 IL-17 분비를 저해할 수 있다는 것을 관찰한 후(도 26), 추가적인 연구를 진행하여 인간 IL-23을 질병의 유인제로 사용할 수 있는 동물 모델을 설계하였다. 6일간 C57Bl/6J 마우스의 등에 IL-23을 진피내로 처리하면, 홍반 및 경화가 특징적인 국소 염증 반응이 유발되며, 조직학적 증거로 상피 과형성, 이상 각화증(parakeratosis) 및 국소 염증 침윤이 나타난다. 항체를 사이토카인 처리 개시 전날, 1회 투여량 수준에서의 염증 반응을 낮추는 능력을 조사하였다. 항체 80 및 항체 136을 투여받는 2가지 그룹에서는 이소형 대조군에 비해 5일 이후부터 임상 수치가 감소되었는데, 이는 본 실험에서의 항체의 효능을 입증하는 것이다(도 27A).

항체 136은 이소형 대조군에 비해 상피 두께를 감소시키는 경향을 보였지만, 항체 80만 상피 두께 감소에 통계학적 유의성을 나타내었다(도 27B). 이러한 결과는, 항체 136과 항체 80 둘다 IL-23에 의해 야기된 홍반과 경화를 유의하게 감소시키지만 항체 80이 보다 유효하다는 임상 수치와 적절하게 조화된다.

실시예 10

10.1 뮤라인 비장세포 상에서의 키메라 IL -12에 의해 유도되는 IFN -γ의 중화

인간 IL-12는 IFN-γ 생산을 유도하기에는 뮤라인 비장세포의 반응성이 약한 것으로 확인되었다. 그러나, 인간 p40 및 뮤라인 p35으로 구성된 키메라 분자(서열번호 63)는 뮤라인 IL-12에서 보여지는 수준과 비슷한 수준에서 뮤라인 비장세포로부터 IFN-γ 반응을 유도할 수 있었다. 몇가지 주요 항체(항체 번호: 36, 80, 180, 181, 193, 194, 198)를 본 분석에 투입하여, 뮤라인 비장세포 상에서 키메라 IL-12가 IFN-γ 반응을 유도하는 것을 저해하고자 하였다. 항체들 모두 이러한 분석에서 중화력이 입증되었다(도 28).

10.2 정상적인 동계 교배종 마우스에서 키메라 IL -12( IL -12)에 대한 혈청 인터페론-γ( IFN -γ) 반응의 중화

C57Bl/6J 마우스에 키메라 IL-12(인간 IL-12p40 체인 + 마우스 IL-12 p35 체인(서열번호 63))를 0.1 mg/kg으로 5일간 연속 처리하면, 명확한 혈청 IFN-γ 반응이 유도되며, 외관상 독성은 없었다. 항체를, 사이토카인 처리한 1일에 1회 투여시, 또는 사이토카인 처리와 동시에 격일에 3회 투여시, 키메라 IL-12를 중화하여, 투여량 5 mg/kg에 대한 IFN-γ 반응을 저지시키는 능력에 대해, 조사하였다. 테스트한 2가지 항체들은 중화력을 나타내었으며, 항체 80을 5mg/kg으로 1회 투여가 혈청 IFN-γ를 베이스라인의 검출가능한 수준으로 낮추는데 충분하였다(도 29).

실시예 11

11.1 IL -23를 생산하기 위한 PBMC 의 자극: 항체 80을 이용한 진단 검출

IL-12 및 IL-23에 대한 인간화된 항체를 생물 시료에서 IL-12 및 IL-23을 검출하기 위한 진단 시약으로 사용할 수 있다. 재조합 인간 IL-23을 검출하기 위해 ELISA를 개발하였다. 본 분석에서, 항-인간 p19 항체를 포획 항체로 사용하였고, 항체 80은 검출 항체로 사용하였다. 항체 80은 이러한 샌드위치 ELISA 포맷에서 재조합 인간 IL-23을 검출할 수 있었다(도 30A).

스타필로코커스 아우레우스 코완 1(SAC)을 처리하면 인간 말초 혈액 세포(PBMC)에 의해 IL-23 분비가 유도되었다. 항체 80은 샌드위치 ELISA 포맷에서 SAC에 의해 자극된 PBMC에 의해 분비되는 천연적인 내인성 인간 IL-23을 검출할 수 있었다(도 30B).

실시예 12

12.1 H/D 교체에 의한 에피토프 맵핑

1차 실험에서, IL-12p40에서 하이드로겐을 용액 중에서 중양자로 바꾼 다음 컬럼에 고정시킨 항체 80에 결합시킨 후 다시 항체 컬럼에 계속 결합된 상태에서 H₂O 중에서 교체하여, 에피토프는 보호되게 하였다. 즉, 에피토프는 중양자로 표지된다. 2차 실험에서, IL-12p40을 항체 컬럼에 결합시키고, 중양자로 표지한 다음 컬럼에 결합시킨 상태에서 H₂O로 다시 교체하였다. 각각의 실험 후, IL-12p40은 매우 낮은 pH를 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨 다음 단백질을 분해하는 펩신 컬럼에 통과시켰다. 펩타이드 단편들을 LC:MS에 주입하였다. 2가지 실험들 간의 중수소율 차이는 항체에 결합되었을 때 교체 지연 수치이다.

본 실험에서, IL-12p40은 서열번호 64에 기재된 것으로 사용하였다. H/D 교체율에서 현저한 차이를 보인 유일한 부분은, 표 9에 나타낸 서열 vqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisv (서열번호 65)에 해당되는 아미노산 253에서 286까지의 부분이었다.

pH 7, 3 ℃에서의 온/오프 교체 실험 후, IL-12p40의 각 세그먼트의 중소수율 차이. 평균 비율 차이가 10% 보다 높은 것은 교체 반응 중에 상당히 보호된 영역이다. 잔기 번호는 서열번호 64에 나타낸 IL-12p40에 따른다.

잔기	잔기	펩타이드	시간 (초)
시작	끝	전하	500	1,500	5,000	평균
3	9	1	6%	3%	8%	5%
3	12	2	11%	2%	5%	6%
15	23	1	10%	6%	11%	9%
16	23	1	10%	6%	12%	9%
38	40	1	-2%	2%	4%	2%
57	65	1	2%	6%	6%	5%
57	80	2	2%	3%	8%	4%
68	80	2	9%	3%	0%	4%
83	90	1	10%	9%	6%	8%
83	95	2	12%	2%	8%	7%
93	95	1	2%	8%	7%	6%
93	109	2	8%	-3%	2%	2%
93	125	3	6%	0%	4%	3%
93	129	3	4%	-2%	1%	1%
128	132	1	5%	5%	7%	6%
131	132	1	4%	2%	-2%	1%
135	153	2	5%	5%	2%	4%
156	166	2	1%	0%	2%	1%
158	168	2	3%	0%	3%	2%
173	181	1	5%	-7%	2%	0%
184	187	1	6%	4%	5%	5%
184	189	1	4%	1%	3%	2%
208	231	3	7%	5%	9%	7%
212	231	3	9%	5%	9%	8%
234	246	2	6%	1%	1%	3%
236	246	2	9%	3%	9%	7%
249	250	1	4%	-2%	-1%	1%
249	251	1	1%	-2%	1%	0%
253	274	3	27%	28%	30%	28%
253	275	3	28%	25%	29%	27%
254	275	3	33%	27%	31%	30%
277	286	2	10%	16%	25%	17%
295	299	1	1%	1%	7%	3%
302	306	1	2%	0%	-1%	0%

12.2 항체 80에 대한 돌연변이 IL -23의 결합성 분석

H/D 교체 실험의 결과를 기초로, IL-23의 동정된 영역에 타겟 돌연변이를 도입하였다. 스크리닝할 돌연변이의 수를 더욱 줄이기 위해, 그 위치의 인간 IL-12p40을 뮤라인 IL-12p40(Uni-Prot No: P43432; http://www.uniprot.org)과 정렬하였다.

인간 p40 VQVQGKSKREK--------KDRVFTDKTSATVICRKNASISV

뮤라인 p40 .RI.R.KEKM.ETEEGCNQ.GAFLVE...TE.Q.-.GGNVC.

항체 80이 인간 IL-23에는 결합하지만 뮤라인 IL-23에는 결합하지 않는다는 사실을 기초로, 2가지 종들 간에 차이가 있는 잔기달만 타겟 돌연변이 부위로 선택하였다. 도입한 돌연변이는 서열 목록에 기재된 서열번호들로부터 취한 하기 아미노산 253-297의 정렬로 요약 개시한다.

IL-23WT(서열번호 66) CVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVR

Q254A(서열번호 67) ..A.................................

V255A(서열번호 68) ...A................................

G257A(서열번호 69) .....A..............................

S259A(서열번호 70) .......A............................

K260A(서열번호 71) ........A...........................

R261A(서열번호 72) .........A..........................

E262A(서열번호 73) ..........A.........................

K264A(서열번호 74) ............A.......................

D265A(서열번호 75) .............A......................

R266A(서열번호 76) ..............A.....................

V267A(서열번호 77) ...............A....................

F268A(서열번호 78) ................A...................

T269A(서열번호 79) .................A..................

D270A(서열번호 80) ..................A.................

T275A(서열번호 81) .......................A............

I277A(서열번호 82) .........................A..........

R279A(서열번호 83) ...........................A........

N281A(서열번호 84) .............................A......

S283A(서열번호 85) ...............................A....

S285A(서열번호 86) .................................A..

HEK-293E 세포를 각각의 돌연변이로 형질감염한 후, 이들 형질감염체로부터 유래된 상층액으로부터 항체 80에 대해 SPR로 스크리닝하였다. 돌연변이 D265A 및 R266A를 제외한, 모든 구조체들은 항체 80과 비슷한 결합 수준을 보였다. 몇가지 돌연변이의 k_d는 야생형 IL-23 보다 눈에 띄게 낮았는데, 이는 IL-12p40의 이 영역에 있는 잔기들이 IL-12p40과 항체 80 사이의 상호작용에 기여함을 의미한다.

D265A와 R266A는, 항체 80, 항체 202.1 또는 IL-12Rβ1 및 IL-23R이 플레이트에 코팅되고 야생형 IL-23(IL-23WT)이 포함된 형질감염 상층액을 사용하는, ELISA로 더욱 분석하였다. D265A와 R266A를 플레이트에서 적정하였다. 돌연변이 D265A는 항체 80와의 결합에 백그라운드 수준을 나타내었으며(도 31), 그래서 D265를 항체 80이 결합하는 IL-12p40에서의 중요한 잔기로 동정하였다. D265A는 항체 202.1, IL-12Rβ1 및 IL-23R에 야생형 IL-23의 수준과 견줄만한 수준으로 결합하였으며, 이는 이것이 바르게 폴딩되었으며 기능적인 결합을 할 수 있음을 의미한다. 돌연변이 R266A는 IL-12Rβ1, IL-23R, 항체 80 및 항체 202.1에 대해 낮은 수준의 결합성을 나타내었는데, 이는 이 돌연변이 단백질이 미스-폴딩되었음을 의미한다(도 31).

항체 리스트

항체 번호 및 각각의 서열 식별 번호 리스트. 항체 1을 제외한, 이 표에 나열된 서열들 모두 항체의 가변부이다. 이 표에 나열된 가변부들 모두 인간 중쇄 IgG₁ Fc 영역(서열번호 8) 및 경쇄 카파 불변부(서열번호 9)를 포함하는 항체의 일부분을 형성한다.

항체 번호	VH 도메인		VL 도메인
항체 번호	단백질	DNA	단백질	DNA
1	서열번호 12	서열번호 252	서열번호 13	서열번호 336
3	서열번호 12	서열번호 252	서열번호 169	서열번호 338
4	서열번호 87	서열번호 254	서열번호 13	서열번호 336
5	서열번호 88	서열번호 255	서열번호 13	서열번호 336
6	서열번호 89	서열번호 256	서열번호 13	서열번호 336
7	서열번호 90	서열번호 257	서열번호 13	서열번호 336
8	서열번호 91	서열번호 258	서열번호 13	서열번호 336
9	서열번호 92	서열번호 259	서열번호 13	서열번호 336
10	서열번호 93	서열번호 260	서열번호 13	서열번호 336
11	서열번호 94	서열번호 261	서열번호 13	서열번호 336
12	서열번호 95	서열번호 262	서열번호 13	서열번호 336
13	서열번호 96	서열번호 263	서열번호 13	서열번호 336
14	서열번호 97	서열번호 264	서열번호 13	서열번호 336
15	서열번호 98	서열번호 265	서열번호 13	서열번호 336
16	서열번호 99	서열번호 266	서열번호 13	서열번호 336
17	서열번호 100	서열번호 267	서열번호 13	서열번호 336
18	서열번호 101	서열번호 268	서열번호 13	서열번호 336
19	서열번호 102	서열번호 269	서열번호 13	서열번호 336
20	서열번호 103	서열번호 270	서열번호 13	서열번호 336
21	서열번호 104	서열번호 271	서열번호 13	서열번호 336
22	서열번호 105	서열번호 272	서열번호 13	서열번호 336
31	서열번호 106	서열번호 273	서열번호 170	서열번호 339
32	서열번호 107	서열번호 274	서열번호 170	서열번호 339
33	서열번호 108	서열번호 275	서열번호 170	서열번호 339
34	서열번호 106	서열번호 273	서열번호 171	서열번호 340
35	서열번호 107	서열번호 274	서열번호 171	서열번호 340
36	서열번호 108	서열번호 275	서열번호 171	서열번호 340
37	서열번호 106	서열번호 273	서열번호 172	서열번호 341
38	서열번호 107	서열번호 274	서열번호 172	서열번호 341
39	서열번호 108	서열번호 275	서열번호 172	서열번호 341
40	서열번호 109	서열번호 276	서열번호 170	서열번호 339
43	서열번호 110	서열번호 277	서열번호 171	서열번호 340
46	서열번호 111	서열번호 278	서열번호 172	서열번호 341
50	서열번호 112	서열번호 279	서열번호 169	서열번호 338
51	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 173	서열번호 342
52	서열번호 114	서열번호 281	서열번호 173	서열번호 342
53	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 173	서열번호 342
54	서열번호 116	서열번호 283	서열번호 173	서열번호 342
55	서열번호 117	서열번호 284	서열번호 173	서열번호 342
56	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 174	서열번호 343
57	서열번호 114	서열번호 281	서열번호 174	서열번호 343
58	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 174	서열번호 343
59	서열번호 116	서열번호 283	서열번호 174	서열번호 343
60	서열번호 117	서열번호 284	서열번호 174	서열번호 343
61	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 175	서열번호 344
62	서열번호 114	서열번호 281	서열번호 175	서열번호 344
63	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 175	서열번호 344
64	서열번호 116	서열번호 283	서열번호 175	서열번호 344
65	서열번호 117	서열번호 284	서열번호 175	서열번호 344
66	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 176	서열번호 345
67	서열번호 114	서열번호 281	서열번호 176	서열번호 345
68	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 176	서열번호 345
69	서열번호 116	서열번호 283	서열번호 176	서열번호 345
70	서열번호 117	서열번호 284	서열번호 176	서열번호 345
71	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 177	서열번호 346
72	서열번호 114	서열번호 281	서열번호 177	서열번호 346
73	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 177	서열번호 346
74	서열번호 116	서열번호 283	서열번호 177	서열번호 346
75	서열번호 117	서열번호 284	서열번호 177	서열번호 346
76	서열번호 118	서열번호 285	서열번호 178	서열번호 347
77	서열번호 119	서열번호 286	서열번호 178	서열번호 347
78	서열번호 120	서열번호 287	서열번호 178	서열번호 347
79	서열번호 118	서열번호 285	서열번호 179	서열번호 348
80	서열번호 119	서열번호 286	서열번호 179	서열번호 348
81	서열번호 120	서열번호 287	서열번호 179	서열번호 348
92	서열번호 121	서열번호 288	서열번호 176	서열번호 345
93	서열번호 122	서열번호 289	서열번호 176	서열번호 345
94	서열번호 123	서열번호 290	서열번호 176	서열번호 345
95	서열번호 124	서열번호 291	서열번호 176	서열번호 345
96	서열번호 125	서열번호 292	서열번호 176	서열번호 345
97	서열번호 126	서열번호 293	서열번호 176	서열번호 345
98	서열번호 127	서열번호 294	서열번호 176	서열번호 345
99	서열번호 128	서열번호 295	서열번호 176	서열번호 345
100	서열번호 129	서열번호 296	서열번호 176	서열번호 345
101	서열번호 130	서열번호 297	서열번호 176	서열번호 345
102	서열번호 131	서열번호 298	서열번호 176	서열번호 345
103	서열번호 132	서열번호 299	서열번호 176	서열번호 345
104	서열번호 133	서열번호 300	서열번호 176	서열번호 345
105	서열번호 134	서열번호 301	서열번호 176	서열번호 345
106	서열번호 135	서열번호 302	서열번호 176	서열번호 345
107	서열번호 136	서열번호 303	서열번호 176	서열번호 345
108	서열번호 137	서열번호 304	서열번호 176	서열번호 345
109	서열번호 138	서열번호 305	서열번호 176	서열번호 345
110	서열번호 139	서열번호 306	서열번호 176	서열번호 345
111	서열번호 113	서열번호 280	서열번호 176	서열번호 345
112	서열번호 140	서열번호 307	서열번호 176	서열번호 345
113	서열번호 141	서열번호 308	서열번호 176	서열번호 345
114	서열번호 142	서열번호 309	서열번호 176	서열번호 345
115	서열번호 143	서열번호 310	서열번호 176	서열번호 345
116	서열번호 144	서열번호 311	서열번호 176	서열번호 345
117	서열번호 145	서열번호 312	서열번호 176	서열번호 345
118	서열번호 146	서열번호 313	서열번호 176	서열번호 345
119	서열번호 147	서열번호 314	서열번호 176	서열번호 345
120	서열번호 148	서열번호 315	서열번호 176	서열번호 345
121	서열번호 149	서열번호 316	서열번호 176	서열번호 345
122	서열번호 150	서열번호 317	서열번호 176	서열번호 345
123	서열번호 151	서열번호 318	서열번호 176	서열번호 345
124	서열번호 152	서열번호 319	서열번호 176	서열번호 345
125	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 176	서열번호 345
126	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 180	서열번호 349
127	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 181	서열번호 350
128	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 182	서열번호 351
130	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 183	서열번호 352
131	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 184	서열번호 353
132	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 185	서열번호 354
133	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 186	서열번호 355
134	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 187	서열번호 356
135	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 188	서열번호 357
136	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 189	서열번호 358
137	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 190	서열번호 359
138	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 191	서열번호 360
139	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 192	서열번호 361
140	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 193	서열번호 362
141	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 194	서열번호 363
142	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 195	서열번호 364
143	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 196	서열번호 365
144	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 197	서열번호 366
145	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 198	서열번호 367
146	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 199	서열번호 368
147	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 200	서열번호 369
148	서열번호 115	서열번호 282	서열번호 201	서열번호 370
175	서열번호 153	서열번호 320	서열번호 189	서열번호 358
176	서열번호 154	서열번호 321	서열번호 189	서열번호 358
177	서열번호 155	서열번호 322	서열번호 189	서열번호 358
178	서열번호 156	서열번호 323	서열번호 189	서열번호 358
179	서열번호 157	서열번호 324	서열번호 189	서열번호 358
180	서열번호 158	서열번호 325	서열번호 189	서열번호 358
181	서열번호 159	서열번호 326	서열번호 189	서열번호 358
182	서열번호 160	서열번호 327	서열번호 189	서열번호 358
183	서열번호 31	서열번호 220	서열번호 32	서열번호 221
184	서열번호 33	서열번호 222	서열번호 179	서열번호 348
185	서열번호 45	서열번호 234	서열번호 179	서열번호 348
186	서열번호 119	서열번호 286	서열번호 51	서열번호 240
190	서열번호 119	서열번호 286	서열번호 189	서열번호 358
191	서열번호 161	서열번호 328	서열번호 189	서열번호 358
192	서열번호 162	서열번호 329	서열번호 189	서열번호 358
193	서열번호 163	서열번호 330	서열번호 189	서열번호 358
194	서열번호 164	서열번호 331	서열번호 189	서열번호 358
195	서열번호 165	서열번호 332	서열번호 189	서열번호 358
196	서열번호 166	서열번호 333	서열번호 189	서열번호 358
197	서열번호 167	서열번호 334	서열번호 189	서열번호 358
198	서열번호 168	서열번호 335	서열번호 189	서열번호 358
199	서열번호 161	서열번호 328	서열번호 179	서열번호 348
200	서열번호 162	서열번호 329	서열번호 179	서열번호 348
201	서열번호 163	서열번호 330	서열번호 179	서열번호 348
202	서열번호 164	서열번호 331	서열번호 179	서열번호 348
203	서열번호 165	서열번호 332	서열번호 179	서열번호 348
204	서열번호 166	서열번호 333	서열번호 179	서열번호 348
205	서열번호 167	서열번호 334	서열번호 179	서열번호 348
206	서열번호 168	서열번호 335	서열번호 179	서열번호 348

방법:

포유류 세포에서의 항체 제조, 분리 및 발현

하이브리도마 세포주 제조, 발현 및 정제

5 BALB/C 마우스를 완전 프로이드 보강체 중에서 각각 인간 IL-12 (Peprotech)로 면역화한 다음, 14일, 35일 및 70일에 불완전 프로이드 보강체 중의 인간 IL-12로 부스트하였다. 74일에, 마우스 비장을 취하여 비장세포를 수득하였다. 이 세포와 골수종 세포주 SP2/0 Ag-14를 융합시키고, 이 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에 두었다. 이 96웰 플레이트 각 웰의 상층액에 대해 항-IL-12, 항-IL-12p40 및 항-IL-23 ELISA (하기 참조)를 수행하였다. 3가지 ELISA 모두에서 양성인 상층액을 앞으로 이동시켜 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 하류 ELISA에서 양성으로 판정된 클론은 최대 500 ml 수준으로 배양하여, 항체 정제하였다(하기 참조). 이러한 방법으로 정제한 항체는 1 X PBS에서 투석하고, BCA^® 분석 키트(Pierce^®)로 농도를 측정하였다.

DNA 서열분석

하이브리도마 세포로부터 TRI 시약(Sigma-Aldrich^®)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 분리하였다. 10 - 200 ng RNA로부터 AccuScript^® 하이 피델러티 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Stratagene^®)를 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 하기 PCR 반응에 주형으로 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 노바젠 뮤라인 IgG 프라이머 세트의 프라이머를 cDNA 및 Pfu II Mastermix^® (Stratagene^®)와 혼합한 다음, Thermocyler (Eppendorf Mastercycler^®)에서 하기 조건으로 반응을 수행하였다.

℃ 시간 사이클

94 2 분 1

94 30 초 30

60 30 초 30

72 45 초 30

94 5 분 1

DNA 겔 추출 키트(QIAgen^®)를 이용하여 PCR 산물을 겔에서 정제하였다. 테깅된 [dATP 및 Taq-중합효소(Invitrogen™)]를 72℃에서 15분간 PCR 산물에 오버행 (A-overhang)으로 첨가하고, pGEM-T-벡터 시스템(Promega^®)에 연결시켜, TOP10 컴피턴트(competent) 세포(Invitrogen™)에 형질감염시켰다. 500 bp 삽입체에 대해 클론들을 스크리닝하였다. 양성 클론들로부터 플라스미드를 분리(Miniprep, QIAgen^®)하고, 기존의 서열분석 기기로 서열 분석하였다. 그 후, 뉴클레오티드 서열을 1차 아미노산 서열로 번역하였다.

키메라 항체를 발현하는 벡터의 구축

하이브리도마 세포인 PMA202 및 PMA204에 대한 DNA 서열분석을 통해 결정된 VH 도메인을 인간 불변부(인간 IgG1 중쇄 CH1, 힌지, CH2 & CH3 도메인)와 함께 발현시켰다. 이는, 유전자옵티마이저 기법을 이용하여 포유류 세포 발현을 위해 최적화된 DNA 서열로 아미노산 서열을 역-번역한 다음 합성 올리고뉴클레오티드(GeneArt, Germany)를 조립하여 신규 합성함으로써, 달성하였다. 유전자 합성한 후, 전체 서열을 pTT5 중쇄 벡터의 다중 클로닝 부위에 서브클로닝하였다(Durocher et al. 2002 Nucleic Acids Res 30 E9). 하이브리도마 세포인 PMA202 및 PMA204의 DNA 서열 분석을 통해 발견한 VL 아미노산 체인을 인간 카파 경쇄 불변부와 함께 발현시켰으며, 이는, 상기 서열은 pTT5 경쇄 벡터의 다클론 부위에 서브클로닝함으로써, 달성하였다. 제조된 PMA202 뮤라인-인간 키메라 항체를 항체 202.1이라 하였다. 제조된 PMA204 뮤라인-인간 키메라 항체는 항체 1이라 하였다. 항체들 모두 후보 단백질 서열을 DNA 서열로 역-번역한 다음 최적화하고, 합성 올리고뉴클레오티드를 조립하여 신규 합성하는 방법으로 제조하였다. 항체들 모두에는 인간 중쇄 Fc 영역과 인간 중쇄 카파 불변부가 포함되어 있다. 항체 가변부를 코딩하는 유전자들은 모두 발현을 위해 pTT5 벡터에 클로닝하였다.

일시적인 형질감염을 통한 재조합 항체의 발현

항체들 모두를 일시적으로 발현시키기 위해, 다음의 방법을 사용하였다. 간략하게는, HEK293E 세포를 완전 세포 성장 배지(1 L의 F17 배지(Invitrogen™), 9 mL의 Pluronic F68 (Invitrogen™), 20% (w/v) 트립톤 NI (Organotechnie^®)과 제네티신(50 mg/mL, Invitrogen™) 50 ㎕/100 mL(배양액)을 포함하는 2mM 글루타민)에서 배양하였다. 형질감염 전날에, 세포를 원심분리에 의해 회수하여 신선한 배지(제네티신 무첨가)에 재현탁하였다. 다음날, 중쇄 및 경쇄 DNA를 FuGENE^® (Roche) 형질감염 시약과 혼합하여, DNA 형질감염 믹스를 배양물에 점적 첨가하였다. 배양물을 밤새 37 ℃, 5% CO₂ 및 120rpm에서 제네티신을 무첨가한 조건에서 배양하였다. 다음날, 트립톤 12.5 mL을 배양물 500 ml 당 제네티신 250 ㎕ 비율로 함께 첨가하였다. 배양물을 37 ℃, 5% CO₂ 및 120rpm 조건에서 인큐베이션하였다. 7일 후, 상층액을 원심분리에 의해 회수하여, 정제용으로 준비하였다.

친화성 크로마토그래피를 통한 항체의 정제

상기 형질감염체로부터 수득한 상층액을 pH 7.4로 조절한 다음, HiTrap^® 단백질 A 컬럼(5 mL, GE Healthcare)에 주입하였다. 컬럼을 1X PBS (pH 7.4) 50 mL로 세정하였다. 용출은 0.1M 시트르산 pH 2.5를 이용하여 수행하였다. 용출된 항체를 Zeba^® 탈염 컬럼(Pierce^®)을 이용하여 1 X PBS (pH 7.4)로 탈염하였다. 항체의 온전성은 SDS-PAGE와 겔 여과 HPLC로 분석하였다. 항체의 농도는 BCA^® 분석 키트(Pierce^®)를 이용하여 측정하였다.

항- IL -12/23 항체의 특징

항- IL -12/23 ELISA

IL-12 (Peprotech), IL-23 (Ebioscience™), IL-12p40 (Ebioscience™) 또는 IL-12p80(Peprotech)을 카보네이트 코팅 완충액(35mM 소듐 카보네이트, 15 mM 소듐 하이드로겐 카보네이트 pH 9.6) 중에 1 ㎍/mL로 희석하고, 96웰 플레이트(Nunc™, Maxisorp™)에 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음, 플레이트를 세정 완충액(0.01M PBS pH 7.2, 0.05% Tween-20)으로 3번 헹구고, 0.01M PBS pH 7.2로 3번 헹구었다. 그 후 웰에 차단 완충액 200 ㎕(0.01 M PBS pH 7.2 중의 1% w/v BSA)씩 첨가하여, 플레이트를 25 ℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 웰을 블록킹하였다. 항체를 적정 커브 제작에 충분한 항체 희석제(0.01M PBS pH 7.2 중의, 1% w/v BSA, 0.05% Tween-20)에 희석하였다. 웰들을 항체와 함께 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 헹구었다. 염소 항-인간 면역글로불린 G (H+L) 항체 HRP 접합체 (Zymed^®)를 항체 희석제 중에 1:2000로 사용하여, 결합된 1차 항체를 검출하였다. 염소 항-뮤라인 면역글로불린 항체 HRP 접합체(Dako)를 항체 희석제 중에 1:2000으로 사용하여 결합된 뮤라인 항체를 검출하였다. 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션한 다음, 플레이트를 상기와 같이 헹구었다. 각 웰에 TMB 기질 용액(Zymed^®)을 첨가하여 발색되게 하고, 웰에 1M HCl을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 각 웰의 흡광도를 450 nm (ref. 620 nm)에서 측정하였다.

IL -12/ IL -12Rβ1 중화 분석

IL-12Rβ1/Fc 키메라(R&D Systems^®)를 카보네이트 코팅 완충액에 1 ㎍/mL로 희석하여, 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 세정 완충액으로 3번 헹구고, 0.01M PBS pH 7.2로 다시 3번 헹구었다. 이후, 각 웰에 차단 완충액 200 ㎕을 넣고 플레이트를 25 ℃에서 1시간 인큐베이션하여, 웰을 블록킹하였다. 항체는 적정 곡선 작성에 충분한 항체 희석제에 희석하였다. IL-12 (Peprotech)는 항체 희석제에 300 ng/mL로 희석하였다. IL-12를 딥 웰 컨테이너(deep well container)에서 항체와 함께 2시간 미리 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 웰에 항체/IL-12 용액을 넣어 25 ℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 항체 희석제 중의, 바이오틴화한 0.5 ㎍/mL의 항-인간 IL-12 항체(Peprotech) 100 ㎕을 사용하여 1시간 동안 25 ℃에서 결합된 항체를 검출하였다. 플레이트를 다시 상기와 같이 헹구었다. 항체 희석제 중의 1:1000 비율의 스트렙타비딘 HRP (Zymed^®) 100 ㎕를 사용하여, 결합된 바이오틴화된 항체를 검출하였다. 25 ℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 상기와 같이 헹구었다. 100 ㎕ TMB 기질 용액(Zymed^®)을 각 웰에 첨가하여 5분간 발색시켰다. 여기에 100 ㎕ 1M HCl을 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, 450 nm (ref. 620 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

IL -12 p80 / IL -12Rβ1 중화 분석

본 분석은 하기한 변형을 제외하고는 상기 IL-12/IL-12Rβ1 중화 분석과 동일하게 수행하였다.

IL-12 대신 IL-12p80 (Peprotech)으로 교체하였다.

IL -12/ IL -12Rβ2 중화 분석

본 분석은 하기한 변형을 제외하고는 상기 IL-12/IL-12Rβ1 중화 분석과 동일하게 수행하였다: IL-12Rβ1/Fc 키메라를 IL-12Rβ2/Fc 키메라(R&D　Sytsems^®)로 바꾸고, 1 ㎍/ml이 아닌 5 ㎍/ml로 희석하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 3번 헹구고, 다른 PBS 세정을 하지 않았다. IL-12 (Peprotech)는 바이오틴화된 IL-12 (Peprotech)로 바꾸었다. 항체/IL-12 용액이 든 웰을 2시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 바이오틴화되지 않은 항-인간 IL-12 항체를 웰에 첨가하였다. 1:1000 스트렙타비딘 HRP (Zymed^®) 100 ㎕ 대신 1:5000 스트렙타비딘 HRP (Sigma-Aldrich^®) 100 ㎕로 치환하였다. 100 ㎕ TMB 기질 용액(Zymed^®)은 100 ㎕ TMB 기질 용액(Sigma-Aldrich^®)으로 바꾸었다.

IL -23/ IL -23R 중화 분석

IL-23/Fc 키메라(R&D Systems^®)를 카보네이트 코팅 완충액에 1 ㎍/mL로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 세정 완충액으로 3번 헹구고, 0.01M PBS pH 7.2로 다시 3번 헹구었다. 이후, 각 웰에 차단 완충액 200 ㎕을 넣고 플레이트를 25 ℃에서 1시간 인큐베이션하여, 웰을 블록킹하였다. 항체는 적정 곡선 작성에 충분한 항체 희석제에 희석하였다. IL-23 (Ebioscience™) 을 항체 희석제에 300 ng/mL로 희석하였다. IL-23을 딥 웰 컨테이너(deep well container)에서 항체와 함께 2시간 미리 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 웰에 항체/IL-23 용액을 넣어 25 ℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 항체 희석제 중의, 바이오틴화한 0.5 ㎍/mL의 항-인간 IL-12 항체(Peprotech) 100 ㎕을 사용하여 1시간 동안 25 ℃에서 결합된 항체를 검출하였다. 플레이트를 다시 상기와 같이 헹구었다. 항체 희석제 중의 1:1000 비율의 스트렙타비딘 HRP (Zymed^®) 100 ㎕를 사용하여, 결합된 바이오틴화된 항체를 검출하였다. 25 ℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 상기와 같이 헹구었다. 100 ㎕ TMB 기질 용액(Zymed^®)을 각 웰에 첨가하여 5분간 발색시켰다. 여기에 100 ㎕ 1M HCl을 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, 450 nm (ref. 620 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 본 분석을 하기한 변형을 제외하고는 상기 IL-23/IL-23R 중화 분석과 동일하게 수행하였다: IL-23/Fc 키메라(R&D Systems^®)를 HEK-293E 세포로부터 유래되며 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한, 내부에서 제조되는 IL-23R-HIS로 교체하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 3번 헹구고, 다른 PBS 세정을 하지 않았다. IL-23 (Ebioscience™)은 바이오틴화된 IL-23 (Ebioscience™)으로 바꾸었다. IL-23을 항체 희석제에 300 ng/ml이 아닌 50 ng/ml로 희석하였다. 항체/IL-23 용액이 든 웰을 2시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 바이오틴화되지 않은 항-인간 IL-12 항체를 웰에 첨가하였다. 1:1000 스트렙타비딘 HRP (Zymed^®) 100 ㎕ 대신 1:5000 스트렙타비딘 HRP (Sigma-Aldrich^®) 100 ㎕로 교체하였다. 100 ㎕ TMB 기질 용액(Zymed^®)은 100 ㎕ TMB 기질 용액(Sigma-Aldrich^®)으로 바꾸었다. 발색은 5분이 아니라 15분간 진행시켰다.

경쟁적인 결합 실험

IL -12/23의 경쟁 ELISA

PMA204 또는 PMA202를 카보네이트 코팅 완충액(35mM 소듐 카보네이트, 15 mM 소듐 하이드로겐 카보네이트 pH 9.6) 중에 1 ㎍/mL로 희석하고, 96웰 플레이트(Nunc™, Maxisorp™)에 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음, 플레이트를 세정 완충액(0.01M PBS pH 7.2, 0.05% Tween-20)으로 3번 헹구고, 0.01M PBS pH 7.2로 3번 헹구었다. 그 후 웰에 차단 완충액 200 ㎕(0.01 M PBS pH 7.2 중의 1% w/v BSA)씩 첨가하여, 플레이트를 25 ℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 웰을 블록킹하였다. 항체를 항체 희석제(0.01M PBS pH 7.2 중의, 1% w/v BSA, 0.05% Tween-20)에 0.5 ㎍/ml로 희석하고, 각 웰에 100 ㎕를 첨가한 후 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 헹구었다. 경쟁 항체의 연속 하프 로그(half log) 희석을 수행하였고, 각 웰에 100 ㎕를 첨가하였다. 최종 단백질 농도는 적정 곡선 제조에 충분하였다. 플레이트를 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하고, 상기와 같이 헹구었다. 염소 항-인간 면역글로불린 G (Fc 특이적인)-HRP 접합체(Sigma-Aldrich^®)를 항체 희석제 중에 1:2000로 사용하여 결합된 경쟁 항체를 검출하였다. 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 상기와 같이 헹구었다. HRP(horse-radish-peroxidase)-표지된 검출 시약의 경우, 효소적 반응은 암 조건에서 기질 테트라메틸벤지딘(Zymed^®) 100 ㎕/well을 실험에서 사용하여 진행시켰다. 반응은 1 M HCl 100 ㎕를 첨가하여 정지시키고, 광학 밀도를 450 nm (ref. 620 nm)에서 측정하였다.

SPR 경쟁 분석

단백질 A (Thermo)를 BIAcore 3000을 이용하여 CM5 센서 칩 상에 고정하였다. HBS-P (GE Healthcare) 중의 5 ㎍/ml의 키메라 또는 인간화된 항체를 1분간 유속 20 ul/분으로 주입하였다. 그런 후, IL-12 또는 IL-23을 표면에 HBS-P 중의 5 ㎍/ml로 1분간 유속 20 ul/분으로 주입하였다. 그 후, 뮤라인 항체를 HBS-P 중의 5 ㎍/ml로 1분간 유속 20 ul/분으로 주입하였다. IL-12 또는 IL-23을 HBS-P로 치환한 대조군과, 뮤라인 항체를 HBS-P로 치환한, 대조군도 수행하였다. 데이타는 모두 IL-12 또는 IL-23 또는 뮤라인 항체를 단백질 A 표면에 대한 백그라운드 결합을 조사한 대조군 실험 결과를 제하였다.

IL -12 Rb1 체인을 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포주의 제조

IL-12Rβ1의 아미노산 서열은 유전자옵티마이저 기법을 이용하여 포유류 세포 발현에 최적인 DNA 서열로 역-번역하고, 합성 올리고뉴클레오티드(GeneArt, Germany)를 조립하여 신규 합성하였다. IL-12Rβ1을 코딩하는 DNA 서열을 pcDNADEST-40에 서브클로닝하고, Top-10 화학적으로 처리한 컴피턴트 E. coli 세포에 형질전환하였다. 세포 배양물로부터 하이스피드 플라스미드 맥시 키트(QIAgen^®)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하고, ScaI (Promega^®)로 제한 효소 분해하여 선형화하였다. 플라스미드를 Jurkat 6E 세포(ATCC)에 형질전환시키고, IL-12Rβ1에 대한 항-수용체 체인 항체(R&D Systems^®)로 염색하여 표면 발현을 확인하였다.

IL -12Rβ1 발현 세포주에 대한 IL -12 p40 , IL -12 및 IL -23의 결합 검출

FLAG-테깅된 IL-12 또는 HIS-테깅된 IL-23 또는 IL-12p40을 IL-12-Rβ1-발현 세포(10⁶/ml)와 연속 하프 로그 희석한 1000 내지 .01 ng/ml 농도에서 2시간 37 ℃에서 공배양하였다. 세포에 대한 사이토카인 결합은 피코에리트린이 접합된 마우스 항-6xHIS 테그 항체(Abcam^®) 또는 FITC-접합된 항-FLAG (Sigma-Aldrich^®)을 이용하여 검출하였다. 시료의 데이타는 Beckman-Coulter Quanta^®에서 입수하였다.

IL -12Rβ1 발현 세포주에 대한 IL -12 p40 , IL -12 및 IL -23의 결합 저해 검출

FLAG-테깅된 IL-12 또는 HIS-테깅된 IL-23 또는 IL-12p40을, 250 ng/ml 농도에서, 연속 하프 로그 희석한 10 내지 .01 mg/ml 농도의 항체와 1시간 동안 37 ℃에서 공배양한 다음, 상기 IL-12Rβ1-발현 세포를 10⁶/ml로 첨가하고 다시 한시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/10% FBS로 잘 헹구고, 세포에 결합된 사이토카인을 피코에리트린-접합된 마우스 항-6xHIS 테그 항체(Abcam^®) 또는 FITC-접합된 항-FLAG 항체(Sigma-Aldrich^®)로 검출하였다. 시료의 데이타는 Beckman-Coulter Quanta^®에서 입수하였다.

IL -12Rβ1 발현 세포주의 표면에서의 항체 - 사이토카인 복합체의 검출

FLAG-테깅된 IL-12 또는 HIS-테깅된 IL-23 또는 IL-12p40을, 상기와 같이 250 ng/ml의 농도에서 IL-12Rβ1-발현 세포와 공배양하였다. 2시간 배양한 후, 항체를 연속 하프 로그 의석에 의해 10 내지 0.01 mg/ml의 범위로 첨가하고, 다시 1시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/10% FBS로 잘 헹구고, 세포 결합된 사이토카인에 결합된 항체를 FITC-접합된 토끼 항-인간 IgG (Dako)로 검출하였다. 시료의 데이타는 Beckman-Coulter Quanta^®에서 입수하였다.

친화성 성숙

방법

항체 80 V _H 및 V _L 도메인으로부터 유래된 scFv -80 코딩 서열의 조립

서열 (Gly₄Ser)₃ (scFv-80, 서열번호 27)의 15개 아미노산으로 구성된 링커에 의해 경쇄의 가변 도메인(V_L)과 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하는, 폴리펩타이드를 설계하므로써, 항체 80으로부터 단쇄 항체 단편(scFv-80)을 추출하였다. 상기 V_H 및 V_L 서열을 (각각) 폴리펩타이드의 N-말단과 C-말단에 위치시켰다. 그 후, 아미노산 서열을 유전자옵티마이저 기법을 이용하여 포유류 발현용으로 최적화된 DNA 서열로 역-번역하였다. 그 후, 전체 유전자를 합성 올리고뉴클레오티드(GeneArt)를 조립하여 신규 합성하였다. 또한, 최종 서열에는 추가적인 서브 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' NcoI 및 3' NotI 부위가 포함된다.

scFv-80 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를, pEGX448 발현 벡터의 NcoI 및NotI 부위에 서브 클로닝하였다. pEGX448은, NcoI 및NotI 부위에 서브 클로닝된 임의의 scFv에 자동적으로 C-말단에 독점 'FLAG' 친화성 테그가 융합되도록 설계되어 있다.

scFv-80 유전자를 마찬가지로 RNA 제조, 돌연변이 유발 및 리보좀 디스플레이를 위해 pEGX412 벡터에 서브 클로닝하였다. 이 벡터는 Kopsidas et al . (2007)에 기술된 pEGX253 플라스미드와 동일하지만, pEGX412는 scFv를 리보좀에 연결시키는데 pEGX253에 사용되는 C_L 서열 대신 유전자 III 단백질을 사용한다.

RNA 제조 및 돌연변이 유발

전술한 pEGX412-scFv80 구조체를 사용하여, scFv-80 돌연변이 변이체들을 코딩하는 RNA 풀을 제조하였다. 이를 위해, 플라스미드에 SmaI을 처리하여 선형화하여, 단일 가닥 RNA(ssRNA) 제조를 위한 주형으로서 T7 RNA 중합효소 키트(Promega^®)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 바로 사용하였다. 제조되는 단일 가닥 RNA 분자를 Q-Beta 레플리카제(Epicentre^® Biotechnologies)를 이용한 에러 유발성(error-prone) 복제의 주형으로 사용하였다. 이를 위해, RNA 200 ng을 33 mM Tris-아세테이트(pH 7.8), 66 mM 포타슘 아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 0.5 mM 디티오트레이톨(DTT), 5 mM rATP, 5 mM rUTP, 10 mM rCTP, 10 mM rGTP, 0.1 U/㎕의 Q-Beta 레플리카제 및 H₂O과 최종 부피 20 ㎕로 혼합하였다. 반응물을 ~16시간 동안 45 ℃에서 인큐베이션하였다.

Q-Beta 레플리카제 반응으로, 돌연변이 당 1-2개의 점 돌연변이가 있는, 모 scFv-80에 대한 돌연변이체 풀을 코딩하는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자 라이브러리가 제작되었다. 이 dsRNA 라이브러리를 역-전사효소 PCR(RT-PCR)을 이용하여 DNA 단편들의 풀로 변환하였다. RT-PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출에 의해 정제한 다음, 최종 T7 RNA 중합효소 반응의 주형으로 수득하였다. 전술한 모든 반응들에서 산물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 테스트하였다.

scFv -80 변이체 라이브러리에서 IL -23 결합제들의 농화

전술한 scFv 라이브로리를, pEGX412 벡터로부터 발현시켜, scFv-리보좀 복합체를 제조한 다음, Kopsidas et al. (2007)에 의해 개시된 리보좀 디스플레이 프로토콜에 따라 IL-23에 대해 골라내었다. 간략하게는, scFv-리보좀 복합체(또한, scFv-코딩 ssRNA가 포함됨)를 바이오틴화된 IL-23과 함께 최종 농도 1 nM에서 24시간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 선별 실험이 해리상수가 낮은 IL-23 결합제를 농화시키는 방향으로 선택압을 가하였다. 이는, 바이오틴화되지 않은 IL-23을 800배로 첨가하고, 추가로 5일간 선별 반응을 지속함으로써, 달성하였다. 선별 실험 기간 종료시에, 바이오틴화된 IL-23에 결합되어 유지되는 scFv-리보좀 복합체를, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 이용하여 회수하였다. 이 비드를 0.05% Tween20 및 5 mM MgCl₂가 포함된 PBS로 3번 헹구고, 5 mM MgCl₂가 포함된 PBS로 2번 헹구었다. 마지막으로, 회수한 scFv-리보좀 복합체들로부터 ssRNA를 용리시킨 다음, 코딩된 scFv 풀을 Superscript III 한단계 RT-PCR 시스템 (Invitrogen™)을 제조사의 지침에 따라 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰으며, 이때 회수한 RNA 8 ㎕을 반응 주형으로 사용하고, 하기 나타낸 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다. 서브 클로닝을 용이하게 하기 위해, 이들 올리고뉴클레오티드에 5' NcoI 부위와 3' NotI 부위가 추가된다.

정방향: 5'-CCATGGCCCAGGTGCAGCTG-3'

역방향: 5'-GCGGCCGCTGTCGTACGC-3'

IL -23 결합제를 동정하기 위한 고성능 스크리닝 프로토콜

(상기) 리보좀 디스플레이 실험 종료시에 증폭된 RT-PCR 풀을, pEGX448 발현 벡터의 NcoI 부외와 NotI 부위에 서브 클로닝한 다음, 한단계 컴피턴트 KRX E. coli (Stratagene^®)에 형질전환시켜, 고체 배양 배지에서 배양하였다. 수득되는 박테리아 콜로리를 각각 200 ㎕의 액체 배양 배지에 96웰 플레이트에서 접종한 다음, 600 nm (OD_600nm) 0.8까지 배양한 후 0.5 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 반응을 유도하였다. 200 ㎕의 발현 배양물을 20 ℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 여기에 용혈 완충액(2 M 슈크로스; 0.25M Tris pH 7; 0.2M EDTA pH 8) 40 ㎕를 첨가하고 플레이트를 900 RPM으로 30분간 교반함으로써 박테리아 용혈 조산물을 제조하는데 사용하였다. 용혈물을 원심분리하고, 분자량 10,000 컷-오프 필터 플레이트(Millipore)를 통과시켜, 맑게 하였다. 이 방법을 적용하여, 하기에 상세하게 설명되는 고성능 SPR 프로토콜을 이용하여 IL-23 결합성을 스크리닝하게 될 약 6500개의 scFv 시료들을 준비하였다.

고성능 SPR 스크리닝은 BIAcore A100 바이오센서(GE Healthcare)를 이용하여 수행하였다. 독점 소유된 FLAG-특이적인 포획 분자 약 10,000 RU를 CM5 시리즈 S 센서 칩 상에 표준적인 아민 커플링 화학법을 이용하여, BIAcore A100 바이오센서의 4가지 플로우 셀(flow cell) 각각에, 스팟 1 & 5(바깥 스팟)에 고정시키고, 스팟 2 & 4(내부 스팟)에 3,000RU를 고정시켰다. 사용한 런닝 완충액은 HBS-EP+ (BIAcore)이며, 모든 상호작용은 25 ℃에서 측정하였다. (상기 단락에 기재된 대로 제조한) FLAG-테깅된 scFv의 미정제 페리플라즘 조제물(periplasmic preparation)을 상기 런닝 완충액에 2배로 희석하고, 60초간 유속 5 ㎕/분으로 포획하였다. 테깅된 scFv의 약 100RU (바깥 스팟) 및 50RU (내부 스팟)가 포획되었다. 2분간의 안정화 시간이 지난 후, IL-23을 120초간 유속 30 ㎕/분으로 동시에 4가지 모든 플로우 셀의 모든 스팟 위를 통과시키고, 200초간 해리를 모니터링하였다. 생성된 센서그램(sensorgram)에 각 플로우 셀의 비변형 스팟 3을 표시하고, RI를 로칼(local)로 설정한 1:1 랑뮈에 등식을 이용하여 피팅하여, 리간드 밀도 변화를 고려하여, k _a , k _d 및 KD 수치를 구하였다.

SPR 스크리닝 프로세스 데이타를 이용하여 잠재적인 개선된 결합제들을 선별하였다. 각각의 scFv의 k_d vs. IL-23을 각 플레이트에 포함된 야생형 scFv 대조군에서 기록된 수치와 비교하였다. 대조군에 비해 k_d가 적어도 1.5배 개선된(즉 낮은) 임의의 scFv 변이체를 잠재적인 개선된 결합제로 지칭하였다. 이러한 변이체들 각각을 DNA 서열 분석하고, 새로운 아미노산 서열을 가지고 있는 임의의 scFv는 추가적인 특정화를 진행하였다.

고도로 정제된 scFv 의 전체 카이네틱 특정화

리보좀 디스플레이 및 스크리닝 실험으로 직접 동정한 scFv 변이체들의 전체 카이네틱 특정화를 위해 본 프로토콜을 사용하였다. 우선, 해당 scFv를 코딩하는 pEGX448 구조체를 HB2151 E. coli에 형질전환하였다. 이를 500 ml 배양물에서 OD₆₀₀ 0.8이 될 때까지 배양한 다음, 0.5 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도함으로써, 재조합 scFv가 박테리아 페리플라즘으로 발현되게 하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하고, 페리플라즘 분획을 Minsky et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, 4180-4184)에 기술된 바와 같이 삼투압 충격에 의해 추출하였다. C-말단의 FLAG 테그를 특이적으로 인지하는 항체가 접합된, 1 mL의 세파로스 수지 컬럼을 이용하여 페리플라즘 분획으로부터 scFv를 정제하였다. 친화성 정제한 단백질을 최종 부피 200 ㎕로 농축한 다음, PBS로 평형화한 슈퍼덱스 200 컬럼(GE Healthcare)에서 겔 여과 크로마토그래피를 수행하고, 단량체 scFv (~32 kDa)에 해당되는 피크 단백질 분획을 기능 특정화(하기 참조)를 위해 채집하였다.

정제된 scFv는 BIAcore T100 바이오센스(GE Healthcare)를 이용하여 전체 카이네틱 특징을 파악하였다. 독점적 FLAG-포획 분자 약 10,000 RU를 BIAcore T100 바이오센서의 플로우 셀(FC) 1 및 FC2(또는 다른 예로 FC3 및 FC4)에서 표준적인 아민 커플링 화학법을 이용하여. CM5 시리즈 S 센서 칩에 고정시켰다. 사용한 전개 완충액은 HBS-EP+ (BIAcore)이며, scFv들을 구별할 수 있도록 30 ℃ 또는 35 ℃에서 상호작용을 측정하였으며, k_d 값은 매우 유사하였다. 피크 정제된 FLAG-테깅된 scFv (상기 단락에 기재된 내용에 따라 제조됨)를 전개 완충액에 10 nM로 희석하고, scFv 50 RU를 포획하기 위해 유속 10 ㎕/분으로 FC2 상에 포획시켰다(전형적으로 상기 수준의 테깅된 scFv를 포획하는데에는 60초가 충분함). 적절한 안정화 기간을 거친 후, 타겟인 IL-12 또는 IL-23 81 nM 내지 0.13 nM (IL-12의 5배수 희석의 경우) 및 81 nM 내지 1 nM (IL-23의 3배수 희석의 경우)의 농도로 FC1 및 FC2 상에 유속 60 ㎕/분으로 통과시켰다. 조합을 위한 접촉 시간은 180초였고, 해리 시간은 최고 농도에서는 10분이고, 시리즈의 다른 모든 농도들에서는 300초로 측정되었다. FC2의 센서그램 데이타에서 FC1 및 완충액 단독 대조군 데이타를 제하였다. 1:1 랑뮈에 등식을 이용하여 그래프에 적용하여, k _a , k _d 및 KD 수치를 구하였다.

리보좀 디스플레이 및 스크리닝을 통해 동정된 돌연변이의 조합

리보좀 디스플레이 및 스크리닝

을 통해 확인된 돌연변이들을 조합하여 다른 scFv-80 변이체들을 유도하였다. 이러한 돌연변이 조합들은, 돌연변이 유발 수준은 scFv 서열 당 (평균) 1개의 돌연변이가 생기도록 본질적으로 설정되어 있는, 1차례의 리보좀 디스플레이의 결과로 생겨나지 않았다는 것에 유념하는 것이 중요하다. 이들 조합들은 대신 설계에 의해 제조된 것이다. 조합들은 표 11에 따른 각각의 개별 돌연변이를 합하여 선택하였다.

다른 scFv-80 변이체 설계를 위한 돌연변이 가중(weighting) 전략

돌연변이*	가중치
V_H: F29L	7
V_H: Y59S	3
V_H: Y59H	3
V_H: T07A	3
V_L: S63F	3
V_H: T28A	2
V_H: T68S	1
V_H: Q43R	1
V_L: I55T	1
V_L: S26P	1
V_L: Q27R	1
V_L: S52R	1

* 돌연변이들 모두 야생형 scFv-80 서열과 비교하여 기록됨

가중 단서(Weighting key)

스크리닝 동안에 관찰되는 횟수	k _d 배수-향상 결과*
스크리닝 동안에 관찰되는 횟수	최대 2배	2배 이상	3.5배 이상
1번	1	2	3
2번	2	4	5
3번	3	5	6
4번	4	6	7

* k_d는 정제된 단량체 scFv 단백질(표 5 참조)을 이용하여 측정됨.

최대-가중된 돌연변이 조합을 가진 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 주형으로 scFv-80을 사용하고 Quikchange 라이트닝 키트(Stratagene^®)를 제조사의 지침에 따라 이용하는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의헤 제조하였다. 각각의 특이적인 돌연변이를 부가하기 위해 사용한 돌연변이 유발 프라이머들은 하기에 나타낸다. scFv 전범위는 표 4X에 기재되어 있으며, 아미노산 서열을 교차-참조한다.

V_H 돌연변이 Y59S

센스: 5'-gaacggcgataccgagtccgcccccaa-3'

안티센스: 5'-ttgggggcggactcggtatcgccgttc-3'

V_H 돌연변이 Y59H

센스: 5'-cggcgataccgagcacgcccccaagtt-3'

안티센스: 5'-aacttgggggcgtgctcggtatcgccg-3'

V_H 돌연변이 T28A

센스: 5'-ggccagcggctacgccttcaccgacta-3'

안티센스: 5'-tagtcggtgaaggcgtagccgctggcc-3'

V_H 돌연변이 F29L

센스: 5'-gccagcggctacaccctcaccgactactatc-3'

안티센스: 5'-gatagtagtcggtgagggtgtagccgctggc-3'

V_L 돌연변이 S26P

센스: 5'-tgtcctgtagagccccccagagcatcagc-3'

안티센스: 5'-gctgatgctctggggggctctacaggaca-3'

V_L 돌연변이 S52R

센스: 5'-gatctacttcgccagacagtccatcagcggc-3'

안티센스: 5'-gccgctgatggactgtctggcgaagtagatc-3'

V_L 돌연변이 Q27R

센스: 5'-cctgtagagcctcccggagcatcagcatcaa-3'

안티센스: 5'-ttgatgctgatgctccgggaggctctacagg-3'

중쇄 돌연변이 Q43R 또는 경쇄 돌연변이 I55T를 부가하기 위한 프라이머는 제작하지 않았다. 대신, 이미 V_H 및 V_L에 각각 R43과 T55를 가지고 있는 구조체에 다른 돌연변이들을 직접 도입하였다(서열번호 230 및 서열번호 231).

돌연변이 조합을 가진 scFv 의 중간 레벨의 성능 카이네틱 분석

본 프로토콜을 이용하여 돌연변이 조합을 가지고 있는 scFv-80 변이체들의 IL-12 및 IL-23 결합성을 조사하였다. 소규모의 HB2151 E. coli 배양물을 사용하여, 중간 수준의 SPR 분석(하기 참조)을 위한 부분 정제된 scFv를 제조하였다. 재조합 scFv를 페리플라즘으로 발현시킨 후, 전술한 바와 같이 추출하고 항-FLAG 항체-세파로스 컬럼을 이용하여 정제하였다. 그 후, scFv 시료를 PD10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 PBS로 완충액 교체한 다음 최종 부피 200 ㎕로 농축하였다. 이 물질을 추가적인 정제없이 SPR 분석에 사용하였다.

중쇄 돌연변이와 경쇄 돌연변이가 조합된 이러한 scFv를, 고도로 정제된 scFv(상기 참조)의 전체 특정화에 사용된 방법과 유사한 방법으로 분석하였으며, 단, IL-12 또는 IL-23는 단일 기준 농도 81 nM로 각각 사용하였고, 해리는 3000초간 측정하였다.

IgG 에서의 표면 플라스몬 공명 결합 실험

SPR 3000을 이용하여, 단백질 A를 CM5 연구 등급의 센서 칩의 FC1 및 FC2 (또는 다른 예로 FC3 및 FC4)에 아민 커플링으로 고정시켜, 약 2000 RU를 제공하였다. FC1은 실험 전체에서 블랭크로 사용하였다. 실험은 HBS-P 완충액(SPR) 중에서 수행하였다. 유속 20 ㎕/분으로, 20 ㎕의 5 ㎍/mL 항체를 FC2 상에 통과시켰다. IL-12, IL-23 또는 IL-12p40 (Peprotech)을 FC1 및 FC2의 표면 상에 66 nM 내지 2 nM의 농도로 통과시켰다. 표면은 10 mM 글리신, pH 1.0을 사용하여 재생시켰다. FC2의 센서그램 데이타에서 FC1 결과와 완충액 단독 대조군의 결과를 제하였다. 1:1 랑뮈에 등식을 이용하여 그래프에 적용하여, k _a , k _d 및 KD 수치를 구하였다. 그래프들 모두 가능한 경우 χ²< 2.0이었다.

시험관내 효능 연구

시험관내 뮤라인 비장세포 분석

마우스 비장을 파괴하여 100 ㎛ 체에 통과시켜, 단일 세포 현탁물을 수득하였다. 적혈구 세포를, 세포 현탁물을 원심분리한 다음 9 ml의 멸균수에 재현탁하는, 수 방법에 의해 용혈시켰다. 1 ml의 10x PBS를 즉시 첨가하여 혼합하였다. 세포를 헹군 다음 카운트하고, RPMI (2 mM l-글루타민, 100 U/ml Pen/Strep, 10% FBS)에 10⁷세포/ml 농도로 재현탁하였다. 세포를 바닥이 평평한 96웰 조직 배양 플레이트에 100 ㎕ 중의 10⁶세포/웰로 접종하였다. 콘카나발린 A와 rhIL-23을 각각 최종 농도 1 ㎍/ml 및 25 ng/ml로 첨가하였다. 테스트 항체를 시료에서 적정하였다. 전형적인 분석은 테스트 항체 1개 당 3-5개의 생물학적 레플리케이트를 사용하며, 시작하는 테스트 항체의 농도는 1-10 ㎍/ml이다. 각 분석 플레이트에는 항체 무첨가한, Con A + IL-23, 및 ConA 단독 시험군에 대한 레플리케이트 시료들이 포함된다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 3일간 인큐베이션한 다음, 상층액을 IL-17 ELISA를 위해 채집하였다. IL-17은 IL-17 ELISA 키트(R&D Systems^®)를 제조사의 지침에 따라 이용하여 분석하였다. 농도는 표준 곡선 방법으로 결정하였다.

NK92 IFN -γ 분비 분석

NK92 세포(ATCC, CRL-2407)를, 200 U/ml 인간 IL-2 (Peprotech Asia) 및 10 ng/ml 인간 IL-15 (Ebioscience™)이 보충된, RPMI1640, 2 mM L-글루타민, 100 U Pen/Strep, 10% FBS에서 배양하였다. 분석하기 전에 세포를 인간 IL-2과 인간 IL-15에 대해 차단시켰다. 항체를 적정 그래프 작용에 충분하게 배양 배지에 희석하였다. 플레이트에 IL-12 (Peprotech)를 첨가하여, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 세포를 회수하고, 웰에 총 부피 200 ㎕/웰로 세포 농도 1 x10⁵ 세포/mL로 넣었다. 이 배양물을 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 상층액을 배양 종료 시 회수하고, Duoset ELISA 인간 IFN-γ 키트(R&D Systems^®)를 이용하여 생산된 인간 IFN-γ를 검출하였다.

인간 PBMC IL -12 유발성 IFN -γ 분석

인간 PBMC를 림포프렙 분리(lymphoprep separation)를 이용하여 인간 연층(buffy coat)으로부터 회수하여, 배양 배지(50% DMEM, 50% RPMI, 0.045% D(+) 글루코스, 2mM L-글루타민, 5% 소 태아 혈청(FBS), 10mM HEPES)에 1x10⁷ 세포/mL로 배양하였다. 여기에 PHA-P (Sigma-Aldrich^®)를 10 ㎍/ml로 첨가하여, 3일간 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 그 후, 인간 IL-2 (R&D Systems^®)를 50 U/mL로 첨가하였다. 배양물을 1일간 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 항체를, 96웰 플레이트에서 10 ㎍/mL - 0.001 ㎍/mL의 범위를 포함하는, 적정 그래프 작성에 충분하게 배양 배지에 희석하였다. 이 플레이트에 1 ng/mL의 인간 IL-12 (Peprotech)를 첨가하여, 2일간 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 각 웰에 1 ng/mL의 hIL-2 (R&D Systems^®)를 첨가하였다. 그 후 세포를 회수하여, 각 웰에 세포 농도 2 x10⁵ 세포/mL이 되게 총 부피 200 ㎕/웰로 넣었다. 이를 2일간 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면 상층액을 회수하여, Duoset ELISA 인간 IFN-γ 키트(R&D Systems^®)를 이용하여, 생산된 인간 IFN-γ를 검출하였다.

진피내 IL -23 투여에 의해 유발되는 피부 염증의 완화

예비 범위( Pilot range )-탐색 및 카이네틱 연구

주사 개시 2일 전에, 수컷 C57Bl/6J 마우스의 등 부분에 있는 테스트 부위로부터 털을 제거한 다음, 등의 2곳에 PBS 또는 rhIL-23을 총 3 또는 10 ㎍/mouse/day로 매일 진피내 주사하였다. 2가지 요법들 모두 일부 염증 증상을 나타내었고, 투여량 10 ㎍/day 처리시 높은 수준의 홍반을 동반한 강한 반응이 나타났다. 이후의 실험에서, 염증 반응의 전체 카이네틱스를 보기 위해, 총 10일간 10 ㎍의 rhIL-23/day를 마우스에 투여하였다. 반응은 처리 3일째부터 검출할 수 있었으며, 6-7일에 최고조에 이르렀다가 이후 나아지기 시작하였다.

생체내 항체 테스트

수컷 C57Bl/6J 마우스에 6일간 전술한 바와 같이 10 ㎍/day의 rhIL-23를 처리하였다. 사이토카인 주사 전날에, 항체 80, 항체 136 또는 이소형의 대조군 항체를 투여량 10 mg/kg으로 복막내 1회 주사하였다. 마우스의 테스트 부위에서의 홍반과 경화 수준을 매일 모니터링하여 점수를 매겼다. 모든 처리와 관찰은 맹검으로 실시하였다. 실험이 종료되면, 각 마우스로부터 피부 샘플을 채집하여, 조직학적 과정에 따라 고정하고, 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색하였다.

각 마우스의 피부 단면에 대한 저전력 이미지 종이 카피본을 인쇄하여, 상피 두께 수치를 결정하였다. 각 이미지에서 피부 단면을 3개의 세로 선을 사용하여 4개의 4분면으로 분할하였다. 그 후, 사분면을 그리는데 사용된 3개의 선에 대한 교차 지점에서 상피 두께를, 즉 사진 1개 당 3가지 두께를 측정하였다. 그 후, 실제 거리(mm)를 각 이미지의 스케일에 따라 미크론으로 변환하였다. 모낭 또는 땀샘과 같이 대표적인 상피 두께가 없는 것으로 보이는 영역을 교차하는 지점을 측정하는 경우에는, 측정 지점의 위치를 피부읜 인접부로 조절하였다. 측정은 2명의 독립적인 관찰자에 의해 맹검으로 수행되었다.

정상 동계 마우스에서의 키메라 IL -12 ( IL -12)에 대한 혈청 인터페론-γ( IFN -γ)의 반응 중화

키메라 IL -12

인간 IL-12p40과 뮤라인 IL-12p35가 포함된, 키메라 IL-12(서열번호 63)를 제조하였다. 이 단백질을 유전자 서열로 역-번역하고, 최적화, 합성한 다음 pTT5 벡터에 서브 클로닝하였다. 키메라 IL-12를 HEK-293E 세포에서 발현시키고, HIS 테그 친화성 정제 컬럼을 이용하여 정제하였다. 키메라 IL-12에 대한 마우스 T 세포의 반응을 시험관내에서 조사하였다. 마우스 비장 세포(10⁷/ml)를, 2mM l-글루타민과 10% 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI에서, 키메라, 재조합 마우스 또는 재조합 인간 IL-12(0-20ng/ml)를 첨가하여, 밤새 배양하였다. 상층액을 회수하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D systems^®)를 제조사의 지침에 따라 효소 연계된 면역흡착 분석(ELISA)으로 수행하여, IFN-γ에 대해 분석하였다. 키메라 IL-12는 전체 농도 범위에서 마우스 비장세포로부터 IFN-γ 분비를 유도할 수 있었다. 인간 IL-12는 최고 테스트 농도 실험을 제외하고는 무활성이었다.

뮤라인 비장세포에 의한 키메라 IL -12 유도성 IFN -γ 분비의 항체 저해

마우스 비장을 파괴하여 100 ㎛ 체에 통과시켜, 단일 세포 현탁물을 수득하였다. 적혈구 세포를, 세포 현탁물을 스핀 다운한 다음 사용 직전에 1 ml의 10x PBS를 첨가한, 9 ml의 멸균수에 재현탁하여 혼합하는, 수 방법에 의해 용혈시켰다. 세포를 헹군 다음 카운트하고, RPMI + 2 mM l-글루타민 + 100 U/ml Pen/Strep + 10% FBS에 5x10⁶/ml 농도로 재현탁하였다.

세포를 바닥이 평평한 96웰 조직 배양 플레이트에 100 ㎕ 중의 5x10⁶ 세포/ml로 접종하였다. 콘카나발린 A와 키메라 IL-12를 각각 최종 농도 0.5 ㎍/ml 및 20 ng/ml로 첨가하였다. 테스트 항체를 시료에서 적정하였다. 전형적인 분석은 테스트 항체 1개 당 3-5개의 생물학적 레플리케이트를 사용하며, 시작하는 테스트 항체의 농도는 1-10 ㎍/ml이다. 각 분석 플레이트에는 항체 무첨가한 Con A + IL-23, 및 ConA 단독 시험군에 대한 레플리케이트 시료들이 포함되어야 한다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 인큐베이션한 다음, 상층액을 IFN-γ ELISA를 위해 채집하였다. IFN-γ는 IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems^®)를 제조사의 지침에 따라 이용하여 분석하였다. 농도는 표준 곡선 방법으로 결정하였다. 백그라운드 IFN-γ 생산(Con A 단독 시험군으로 측정됨)이 높으면, 이 백그라운드를 IL-12 처리한 샘플의 결과로부터 제하여, IL-12에 직접 관여될 수 있는 IFN-γ 농도를 구하였다.

예비 탐색 연구

C57Bl/6J 수컷 마우스에, PBS, 마우스 IL-12(IL-12) 0.03 mg/kg, 또는 키메라 IL-12 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg을 5일간 복막내 주사에 의해 처리하였다. 6일째 되는 날, 말단 혈액 샘플을 채혈하여 혈청을 준비하였다. 혈청내 IFN-γ 농도는 고민감성 IFN-γ ELISA 키트 (Ebioscience™)를 제조사의 지침에 따라 이용하여 결정하였다.

PBS 처리 대조군에서는 IFN-γ가 검출되지 않았지만, 마우스 IL-12 또는 키메라 IL-12 처리한 그룹들 모두에서는 IFN-γ가 검출되었다. 키메라 IL-12을 처리하면 혈청내 IFN-γ가 활발하게 농도-의존적인 양상으로 유도되었다. 0.1 mg/kg이 혈청내 IFN-γ 반응 변화를 측정하기 위한 이상적인 농도로 선정되었다.

생체내 항체 테스트

C57Bl/6J 수컷 마우스에, 키메라 IL-12를 0.1 mg/kg 수준으로 5일간 복막내 주사하였다. 또한, 사이토카인 주사하는 1일에, 키메라 IL-12를 투여하기 30분 전에, 항체 80 또는 항체 136을 5 mg/kg으로 1회 투여하거나, 또는 사이토카인 주사하는 1일, 3일 및 5일에, 키메라 IL-12를 투여하기 30분 전에 항체 80, 항체 136 또는 이소형 대조군을 3번 투여하였다. 6일에, 말단 혈액 샘플을 채혈하여, 상기와 같이 혈청내 IFN-γ를 측정하였다.

IL -23을 생산하기 위한 PBMC 의 자극: 항체 80을 이용한 진단학적 검출

ELISA 개발

바닥이 평평한 96-웰 ELISA 플레이트(Nunc Maxisorp)를, 마우스 항-인간 IL-23p19 (Ebioscience™)로 PBS 중의 0.5 ㎍/ml로, 밤새 4 ℃에서 코팅하였다. 플레이트를 헹구고(모든 헹구는 과정은 3번 수행함), 1시간 동안 PBS/10% FBS로 블록킹하였다. 플레이트를 헹군 후, 재조합 IL-23을 하프-로그 희석에 의한 1000 내지 0.003 ng/ml의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 헹군 후, 0.5 ㎍/ml의 항체 80을 이용하여 사이토카인을 검출하였다. 플레이트를 2시간 더 실온에서 인큐베이션한 다음, 헹군 후, 마우스 흡착된 항-인간 IgG, 호르세라디시 퍼옥시다제-접합체(Invitrogen™)를 첨가하였다. 30분 더 인큐베이션한 후, 플레이트를 6번 헹구고, TMB 기질을 첨가한 다음(Sigma-Aldrich^®), 5-10분간 발색시켰다. 1M HCl을 첨가하여 반응을 중지시키고, 450nm에서 플레이트의 흡광도를 판독하였다. 모든 세정 과정은 PBS+0.1% Tween에서 Biotek^® ELx405 플레이트 세척기를 이용하여 수행하였다.

IL -23을 생산하기 위한 인간 PBMC 의 자극

림포프렙 농도 구배(Axis-shield^®)에서의 원심 분리에 의해 단일 연층으로부터 PBMC를 수득하였다. 이를 바닥이 평평한 96웰 플레이트에 10⁵/웰로 접종하였다. 스타필로코커스 아우레우스 코완 1 (SAC) (Sigma-Aldrich^®)을 다음과 같이 준비하였다: 10%w/v 스톡 용액으로부터, 적량을 취하여 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 이를 X-Vivo 15 매질(Biowhittaker™)로 2번 헹군 다음, 적정하기 위한 출발 농도로 재현탁하였다. SAC를 PBMC에 연속 하프-로그 희석으로 1% w/v 내지 0.0001%w/v의 농도 범위로 첨가하였다. 플레이트를 72시간 인큐베이션한 다음 ELISA를 위해 상층액을 회수하였다. IL-23을 검출하기 위한 ELISA를 상기와 같이 수행하였다.

H/D 교체 실험

IL-12p40을 PBS 중에 1 mg/mL로 사용하였다. 항체 80은 PBS 중에 2.0 mg/mL로 사용하였다. 항체를 제조사의 지침에 따라 POROS AL 수지(Applied Biosystems)에 커플링시켰다. mab 컬럼에 항체 80 - POROS AL 수지 600 ㎕를 충전하여, 4 ℃에 두었다.

컬럼을 PBS의 87.5% D₂O 용액으로 헹구었다. 1 mg/mL IL-12p40 5 ㎕를, 100% D₂O 중의 빙냉한 PBS 완충액(pH 7.0) 35 ㎕/과 혼합하였다. 이 IL-12p40 혼합물을 500, 1500, 5000초 (각각 진행) 동안 인큐베이션한 다음, 항체 컬럼에 주입하였다. 컬럼은 차가운 PBS(H₂O에 용해) 200 ㎕로 헹구었다. 그 후, 컬럼을 3 ℃에서 250, 750 또는 2500초간 (각각 진행) 세워두었다. 차가운 0.8% 포름산 80 ㎕를 이 컬럼에 주입하였다. 다시 차가운 0.8% 포름산 40 ㎕를 이용하여, 항체 컬럼으로부터 항원을 용리시켰다. 40 ㎕ 샘플을 채집하고, 여기에, 차가운 2 M 우레아, 1 M TCEP, pH 3.0 20 ㎕를 첨가하였다. 그 후, 55 ㎕를 펩신이 포함된 컬럼에 주입하여, 단백질을 펩타이드로 분해시켰으며, 상기 펩타이드는 rpHPLC에서 용출 완충액(95% 아세토니트릴, 5% 물, 0.0025% TFA) 13 - 40% 농도 구배를 23분간 수행하여 분리시켰다. 용출물을 MS1: 프로파일 및 MS2: DDA 모드에서 질량 분광분석으로 분석하였다. SEQUEST 소프트웨어 프로그램(Thermo)을 사용하여 모 펩타이드의 서열을 동정하였다.

IL-12p40의 다른 부분의 교체율에 대한 항체 효과는 기본적으로 상기와 동일하게 수행하였으며, 단 다음과 같은 부분은 달리하였다: 5 ㎕의 IL-12p40을 H₂O 중의 빙냉한 PBS 완충액(pH 7.0) 35 ㎕로 희석한 다음, H₂O 중의 PBS 처리한 컬럼에 주입한다. 결합 후, 컬럼을 H₂O 중의 PBS 100 ㎕로 헹구었다. 온-교체(on-exchange) 반응은, 87.5% D₂O 중의 PBS 200 ㎕를 컬럼에 통과시킴으로써 개시하였다. 컬럼을 각각 500, 1500 및 5000초 3 ℃에서 인큐베이션하였다.

돌연변이 IL -23 구조체 제조

서브유닛들과 C-말단 FLAG 테그 사이에 링커가 포함된 야생형 IL-23을 코딩하는 유전자를 합성하였다. 측쇄가 노출된 IL-23(예, 3D85) 아미노산의 X선 결정 구조를 분석한 후, Ala 잔기를 돌연변이용으로 선택하였다. 이는 야생형 IL-23 유전자에 대한 부위 특이적인 돌연변이 유발로 수행하였다. 유전자들 모두 pTT5 벡터에 클로닝하였다.

돌연변이 IL -23 구조체의 형질전환

HEK293E 세포를 제네티신(Invitrogen™)이 첨가된 F17 배지(Invitrogen™)에서 배양한 다음, 제네티신 무첨가한 상태에서 1x10⁶ 세포/ml에서 형질전환을 수행하였다. 각 구조체에 대해 형질전환 배양물 5 ml을 설정하였다. DNA 7.5 ug을 OptiMEM^® I (Invitrogen™) 및 Fugene^® HD 형질전환 시약(Roche)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환한 다음 날 배양물에 트립톤(BD^®)과 제네티신을 첨가하였다. 배양물을 6일간 배양한 다음, 상층액을 수득하여 분석을 위해 여과하였다.

돌연변이 IL -23 구조체의 ELISA 스크리닝

IL-12Rβ1/Fc 키메라(R&D Systems^®), IL-23/Fc 키메라(R&D Systems^®), 항체 202.1 및 항체 80을, 카보네이트 코딩 완충액 중에 1 ㎍/mL로 희석하고, 이를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세정 완충액으로 3번 헹구었다. 그 후, 웰에 블록킹 완충액 200 ㎕를 각각 넣고, 플레이트를 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션함으로써, 웰을 블록킹 처리하였다. 상층액을 적정 그래프 작성에 충분하게 항체 희석제로 희석하고, 웰에 100 ㎕를 넣어 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 헹군 다음, 항체 희석제 중의 1:1000 비율의 단일클론 항-FLAG^® M2 - HRP (Sigma-Aldrich^®) 100 ㎕를 사용하여 결합된 사이토카인을 검출하였다. 플레이트를 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션한 다음, 상기와 같이 다시 헹구었다. 100 ㎕ TMB 기질 용액(Sigma-Aldrich^®)을 각 웰에 첨가하여, 5분간 발색시켰다. 여기에 1M HCl 100 ㎕을 첨가하여 발색 반응을 중지시키고, 450 nm (ref. 620 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Arana Therapeutics Limited CLARKE, Adam William (US ONLY) DOYLE, Anthony Gerard (US ONLY) JENNINGS, Philip Anthony (US ONLY) POULTON, Lynn Dorothy (US ONLY) WAI, Bernadette (US ONLY) POW, Andrew James (US ONLY) <120> Anti-IL-12/IL-23 Antibodies <130> 30825635 <160> 370 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser 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25 30 Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp 35 40 45 Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu 85 90 95 Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile 115 120 125 Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe 130 135 140 Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val 145 150 155 160 Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 165 170 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 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Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Asn Ala Cys Lys Glu Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ser Thr Lys Asn Pro Asp Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Artifical <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu 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ccgccaggca 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa cgccaacaaa 300 gagctgcggt acttcgacgt gtggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc ctct 354 <210> 228 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical <400> 228 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactata tgcactgggt ccgccaggca 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa cgccaacaaa 300 gagctgcggt acttcgacgt gtggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc ctct 354 <210> 229 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical <400> 229 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtggagaaac caggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactatc tgcactgggt ccgccaggca 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcgg agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa cgccaacaaa 300 gagctgcggt acttcgacgt gtggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc ctct 354 <210> 230 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical <400> 230 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactatc tgcactgggt ccgccaggca 120 ccagggcggg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa cgccaacaaa 300 gagctgcggt acttcgacgt gtggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc ctct 354 <210> 231 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 231 gagatcgtga tgacccagag ccctgccacc ctgagcgtgt ctccaggcga gagagccacc 60 ctgtcctgta gagcctccca gagcatcagc atcaatctgc attggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccagactgct gatctacttc gccagccagt ccaccagcgg catccccgcc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtgtatta ttgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 232 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical <400> 232 caggtgcagc tgttgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactatc tgcactgggt ccgccaggca 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa cgccaacaaa 300 gagctgcggt acttcgacgt gtggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc ctct 354 <210> 233 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical <400> 233 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cgccttcacc gactactatc tgcactgggt ccgccaggca 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggctgg atcgaccccg agaacggcga taccgagtac 180 gcccccaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcaa 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gagcctccca gagcatcagc atcaatctgc attggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccagactgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg catccccgcc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 gagggcttcg ccgtgtatta ttgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 239 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 239 gagatcgtga tgacccagag ccctgccacc ctgagcgtgt ctccaggcga gagagccacc 60 ctgtcctgta gagcctccca gagcatcagc atcaatctgc attggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccagactgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg catccccgcc 180 agattttcta gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtgtatta ttgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 240 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 240 gagatcgtga tgacccagag ccctgccacc ctgagcgtgt ctccaggcga gagagccacc 60 ctgtcctgta gagcccccca gagcatcagc atcaatctgc attggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccagactgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg catccccgcc 180 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gcagcggcag cggcaccgac ttcagcctga ccatcaacag cctgcagccc 240 gaggacttcg cccggtacta ctgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 367 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 367 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc gtgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc atcaatctgc actggtatca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagctgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcagcctga ccatcaacag cctgcagccc 240 gaggacttcg cccggtacta ctgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 368 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 368 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc gtgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc atcaatctgc actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg catccccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcagcctga ccatcaacag cctgcagccc 240 gaggacttcg cccggtacta ctgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 369 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 369 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc gtgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc atcaatctgc actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcagcctga ccatcaacag cctgcagacc 240 gaggacttcg cccggtacta ctgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324 <210> 370 <211> 324 <212> DNA <213> Artifical <400> 370 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc gtgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc atcaatctgc actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacttc gccagccagt ccatcagcgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcagcctga ccatcaacag cctgcagccc 240 gaggacttcg cccggtactt ttgccagcag agcaacagct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgt 324

Claims

2가지 면역글로불린 가변부를 포함하며,
상기 2가지 면역글로불린 가변부는 하기 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, IL-12p40에 결합하는 항체:
서열번호 6 및 서열번호 7;
서열번호 119 및 서열번호 179; 및
서열번호 115 및 서열번호 189.
2가지 면역글로불린 가변부를 포함하며,
상기 2가지 면역글로불린 가변부는 V_H 도메인 및 V_L 도메인이고,
상기 V_H 도메인은 V_H CDR1, V_H CDR2 및 V_H CDR3 을 포함하고,
상기 V_L 도메인은 V_L CDR1, V_L CDR2 및 V_L CDR3 을 포함하고,
상기 CDR 의 서열은 하기의 서열인, IL-12p40에 결합하는 항체:
V_H CDR1 DYYLH
V_H CDR2 WIDPENGDTEYAPKFQG
V_H CDR3 NKELRYFDV
V_L CDR1 RASQSISINLH
V_L CDR2 FASQSIS
V_L CDR3 QQSNSFPLT
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 서열 VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV (서열번호 65)을 가지는 인간 IL-12p40의 부분에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 인간 IL-12p40 (서열번호 1)의 Asp 265에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
인간 IL-23(서열번호 66)에 대한 상기 항체의 결합성이, 돌연변이 IL-23 D265A (서열번호 75)에 대한 상기 항체의 결합성 보다 높은 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE 및 IgA로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 인간을 제외한 영장류의 중쇄 면역글로불린 불변부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 카파 및 람다로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 인간을 제외한 영장류의 경쇄 면역글로불린 불변부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 유기 모이어티의 공유 결합에 의해 변형된 것을 특징으로 하는 항체.
제8항에 있어서,
상기 유기 모이어티가 선형 또는 분지형의 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체가 항체-의존적인 세포성 세포독성, 보체-의존적인 세포독성, 혈청 반감기, 생물 분포 (biodistribution) 및 Fc 수용체에 대한 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능적인 특징을 조절하도록 변형된 것을 특징으로 하는 항체.
제10항에 있어서,
상기 변형이 단백질 조작, 당조작(glycoengineering) 또는 화학적 방법에 의한 것임을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 건선 관절염, 탈수초 질환, 건선, 다발성 경화증, 홍반성 전신 루푸스, 자가면역성 장 염증 질환, 맥관염, 유육종증, 간경변, 간염, 원발성 담즙성 경변, 포도막염 및 죽상경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 항체의 V_H 도메인을 코딩하는 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 따른 항체의 V_L 도메인을 코딩하는 핵산 분자.
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