KR101781310B1 - 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제 - Google Patents
만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 과루인, 황금, 황련 및 행인의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제에 관한 발명이다.
상기 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제를 생쥐에 투여함으로써 제제 간에 상승작용을 하여 호중구의 감소, IL-17A, MIP2, CXCL-1의 생산량 감소, BAL, PBMC 및 폐에서 면역세포 감소, 폐세포 벽과 교원섬유가 감소되므로 만성폐쇄성 폐질환의 개선에 이용할 수 있다.
상기 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제를 생쥐에 투여함으로써 제제 간에 상승작용을 하여 호중구의 감소, IL-17A, MIP2, CXCL-1의 생산량 감소, BAL, PBMC 및 폐에서 면역세포 감소, 폐세포 벽과 교원섬유가 감소되므로 만성폐쇄성 폐질환의 개선에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 만성폐쇄성 폐질환에 유효한 과루인, 황금, 황령, 행인의 복합 제제를 근거로 하여 동 질환을 해소함으로써 삶의 질을 향상시킬 수 있는 발명이다.
만성폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease ; COPD)이란 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고, 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환으로서, 폐기종, 만성 기관지염 등이 이에 속한다.
흡연은 만성폐쇄성 폐질환의 주된 원인이며, 이 질환의 예방을 위해 금연은 매우 중요하다. 최근에는 흡연 이외에도 여러 숙주 요인들과 환경 요인들의 복잡한 상호작용이 만성 폐쇄성 폐질환을 발생시킨다고 추정하고 있다. 숙주 요인으로는 유전자, 기도 과민반응 등이 관련되며, 환경 요인으로는 흡연 외에도 직업성 분진과 화학물질, 실내 외 대기오염 등이 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지는 흡연이 만성 폐쇄성 폐질환의 가장 중요한 원인이다. 비흡연자에 비해 흡연자에서 호흡기 증상의 발생과 폐 기능 이상 소견을 더 자주 볼 수 있으며, 사망률이 높다. 이러한 차이는 흡연량에 따라 직접적으로 비례하지만, 모든 흡연자가 만성폐쇄성 폐질환으로 발전하지는 않는 것으로 보아 개개인의 유전적인 요인들이 만성폐쇄성 폐질환의 발생위험에 관련되어 있다고 추정되고 있다. 흡연자 중에 만성폐쇄성 폐질환으로 발전되는 비율은 일반적으로는 15~20% 정도로 추정하지만, 증상이 없는 환자에서 진단이 늦어지고 환자의 인지도가 낮으므로 실제로는 이보다 더 높을 수 있다.
직업성 분진(예, 석탄분진)과 화학약품(증기, 자극물질, 연기)도 지속적으로 강하게 노출될 때 만성 폐쇄성 폐질환을 일으킬 수 있다. 실내,외 공기 오염이 만성폐쇄성 폐질환을 발생시키는지는 아직 확실하지 않지만, 환기가 되지 않는 주거지에서 조리와 난방으로 사용하는 유기물 에너지(biomass)의 연소로 발생하는 실내 공기 오염은 만성 폐쇄성 폐질환의 발생과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
만성폐쇄성 폐질환의 치료방법으로서는 다음과 같은 것들이 있다. 첫째 위험인자의 제거를 위하여 금연이 동 질환의 예방과 진행을 감소시키는 가장 효과적인 방법이다. 나이와 관계없이 흡연하는 모든 만성폐쇄성 폐질환 환자들은 금연하여야 한다. 금연을 하면 정상적인 폐 기능을 회복시킬 수는 없으나, 폐 기능이 악화되는 것을 예방할 수 있다. 금연을 위한 약물치료는 챔픽스, 부프로피온, 니코틴 껌, 니코틴 흡입, 니코틴 스프레이와 니코틴 패치 등이 있으며, 금연 약물치료는 금연 상담으로 충분한 효과가 없을 때 실시하게 되며 부작용 등을 잘 감시해야 한다.
둘째, 약물요법은 증상을 예방하고 완화시키며, 증상 악화의 빈도와 정도를 감소시켜 건강 상태를 개선시키고, 운동 지구력을 향상시킨다. 하지만, 현재 만성 폐쇄성 폐질환에 사용되는 어떤 약제도 폐 기능이 장기간에 걸쳐 계속 감소되는 것을 완화시키지는 못한다. 기관지 확장제는 만성 폐쇄성 폐질환의 증상을 완화시키는데 중심적인 역할을 한다. 기관지 확장제는 경구로 투여했을 때보다 흡입제를 사용했을 때 효과가 즉시 나타나고 부작용이 적게 나타난다. 흡입제를 사용할 때는 투여방법을 잘 교육받아 약이 효과적으로 투여되도록 올바로 사용하여야 한다. 흔히 사용하는 기관지 확장제는 베타항진제, 항콜린제, 메틸잔틴계 약물이 있다. 환자에서 기관지확장제의 선택은 기관지 확장제에 대한 개인의 반응과 부작용의 정도에 따라 결정하게 된다. 부신피질 호르몬 흡입제는 만성 폐쇄성 폐질환에서 증상과 운동능력을 호전시키고 입원 필요성을 줄이는 효과가 있으나, 부신피질 호르몬 흡입제를 장기간 투여하여도 폐 기능이 점차적으로 감소되는 현상을 완화시키지는 못한다. 부신피질 호르몬 흡입제는 기도 가역성이 확인된 환자나 1초간 강제 호기량이 예측치의 50% 이하인 환자에서 반복적인 악화로 항생제나 경구 부신피질 호르몬제 투여가 필요한 경우에 사용하게 된다. 부신피질 호르몬 흡입제를 사용 후에는 반드시 입을 헹궈 입 안에 남아있는 약물입자들을 제거하도록 한다.
그 밖에, 인플루엔자 백신(독감예방주사)을 접종하는 것은 만성폐쇄성 폐질환환자에서 심각한 합병증과 사망을 약 50%까지 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 고령의 만성폐쇄성 폐질환 환자들에게 효과적이다. 따라서 고령의 환자들은 인플루엔자 백신을 가을에 한 번 접종하도록 추천한다.
만성폐쇄성 폐질환과 관련한 종래기술로서, 하기 특허 문헌 001은 “숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 백부를 포함하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 및 치료용 한약조성물”이 개시되어 있으나, 이는 기관지 폐포 중 호중구, 염증전구물질인 TNF-α, IL-6의 사이토카인 및 조직상에서의 폐기종을 감소시킴으로써 만성폐쇄성 폐질환을 예방하고 치료하는 것이다.
또한 하기 특허 문헌 002는 “백합 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 폐세척액내(BALF) 대식세포, 호산구, 호중구 및 림프구의 수를 감소시키고, IL-6 및 TNF-α 사이토카인, MCP-1 및 MMP-12의 양을 현저하게 낮추는 등의 효과를 가지는 것이다.
또한 하기 특허문헌 003에는 “숙지황, 산약, 산수유, 백복령, 목단피, 택사, 오미자, 천문동, 맥문동, 패모, 과루인, 행인, 반하, 지실, 길경, 황금, 황련 및 감초를 포함하는 천식의 유지치료용 한약조성물”이 개시되어 있으나, 이는 천식에 유효한 것으로 질환의 종류가 다르다.
이에 본 발명자들은 생약의 성분을 이용한 신약을 개발하던 중, 이를 사용하여 만성폐쇄성 폐질환의 유효한 약효가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 과루인, 행인, 황련, 황금으로 이루어진 복합 제제를 생쥐에게 주입함으로써 만성폐쇄성 폐질환의 개선을 과제로 한다.
본 발명은 과루인, 황금, 황련 및 행인의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제를 제공한다.
한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.
본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제를 생쥐에 투여함으로써 제제 간에 상승작용을 하여 호중구의 감소, IL-17A, MIP2, CXCL-1의 생산량 감소, BAL, PBMC 및 폐에서 면역세포 감소, 폐세포 벽과 교원섬유가 감소되므로 만성폐쇄성 폐질환의 개선에 이용할 수 있다.
도 1은 실험물질의 만성폐쇄성 폐질환 모델의 유발 및 처리 시각표이다.
도 2는 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 BAL에서 각 실험군의 호중구 세포의 광학현미경 관찰 사진이다.
도 3은 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 BAL에서 케모카인 생산량 측정 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 a) PBMC, b) BAL, c) 폐의 절대세포수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5은 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 폐의 H&E, M-T염색을 통한 조직검사 분석 사진 및 그래프이다.
도 2는 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 BAL에서 각 실험군의 호중구 세포의 광학현미경 관찰 사진이다.
도 3은 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 BAL에서 케모카인 생산량 측정 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 a) PBMC, b) BAL, c) 폐의 절대세포수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5은 본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델의 폐의 H&E, M-T염색을 통한 조직검사 분석 사진 및 그래프이다.
이하, 본 발명의 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제에 대하여 바람직한 실시형태를 들어 자세하게 설명한다.
본 발명에 의한 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제는 과루인, 황금, 황련 및 행인의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기한 바의 복합 제제를 구성하는 각 성분들은 다음과 같은 약리효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
먼저, 과루인(瓜蔞仁, Trichosanthis Semen )은 열담, 주담, 노담, 조담을 치료하며, 폐를 촉촉하게 하고, 담을 삭이며, 기를 내리고, 가슴속의 묵은 것들을 씻어낸다고 알려져 있다.
행인(杏仁, Ansu Seman)은 폐와 대장에 작용한다. 행인은 폐에 작용하여 폐기가 위로 치솟고 건조하여 발생하는 기침, 가래, 천식 등에 좋은 효과를 보이는 약재이다. 기름기가 풍부하여 장을 원활하게 해주기 때문에 변비에 좋으며, 위장의 연동운동을 촉진시켜 소화를 잘 되게 하는 효과가 있다.
황금(Scutellariae Radix)은 심장마비 치료, 이뇨, 소염성 해열, 충혈성 염증에 쓰고, 혈압 동맥 경화증의 치료에도 쓴다. 또한 농혈, 복통, 오림, 악창, 해열, 소염, 치질, 안태, 지혈, 황달, 단독, 구토, 지사제 등에 약재로 쓰고 목욕탕의 향료로 쓰인다.
황련(Coptidis Rhizoma)은 항균작용, 해열작용, 소염작용, 항암작용, 여드름 치료작용, 고콜레스테롤증 치료작용, 신경섬유 성장촉진작용 등을 갖는다.
상기 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제에서 과루인, 황금, 황련 및 행인추출물의 중량비는 2 : 1 : 1 : 2인 것이 바람직하다.
또한 상기 복합 추출물은 과루인, 황금, 황련 및 행인의 각각에 대하여 용매로서 증류수를 10배의 중량비로 사용하여 추출한 후에 혼합되는 것이 바람직하다.
상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 증류수를 사용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 등을 열거할 수 있으나, 환류추출을 하는 것이 바람직하다. 추출온도는 상온이 바람직하고, 추출시간은 2시간 동안이 바람직하며, 아울러, 추출 회수는 2회인 것이 바람직하다.
상기 추출방법에 있어서, 농축은 감압농축기를 이용하는 것이 바람직하고, 건조는 여러 가지 방법이 있을 수 있으나, 동결건조하는 것이 바람직하다.
또한 상기 환류 추출하여 제조되는 추출액은 여과한 후에 감압 농축하여 냉동 보관하는 것이 바람직하다.
아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정된 것은 아니다.
<실시예> 복합 제제의 제조
과루인, 행인, 황련, 황금의 약재는 ㈜휴먼허브에서 지원받아 사용하였으며, 과루인, 행인, 황련, 황금은 각각 36g에 각각 용매로서 증류수를 10배 가하여 환류추출기(Heating Mantle Stirrer analog, EAMS 9502-06, Seoul, Korea)에서 2시간 동안, 2회 추출하여 얻은 각각의 추출액을 여과하였다. 이를 감압 증류장치(SB-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고, 다시 동결건조기(FD 8508, IlShin, Yangju, Korea)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동(-84oC) 보관하여 사용하였다. 최종적으로 각각의 약재 36g으로부터 과루인(4.23%), 행인 (17.15%), 황련(22.06%), 황금(12.51%)의 추출물 수율을 나타냈다. 하기 실험을 위하여 각각의 추출물 혼합은 과루인 : 행인 : 황련 : 황금 = 2 : 1 : 1 : 2 중량비로 혼합하여 복합 제제를 제조하였다.
<실험예 1> 담배연기응축물 제작
1) 표준담배 연기의 포집 : 표준담배인 Coresta Monitering Cigarette 7(CM7, Heinr Borgwaldt, Germany)의 연기응축물 포집은 ISO3402 규정에 의거하여 흡연실 온도 22℃, 상대습도 60%에서 실시하였으며, ISO3308 규정에 의거하여 자동흡연장치(RM20/CS, Heinr Borgwaldt, Germany)를 이용하여 흡연부피 35.0±0.3ml, 흡연주기 60초, 흡연시간 2.00초, 꽁초길이 3mm 이상으로 표준담배를 연소시키고, 92mm 켐브리지 필터(USA)로 담배연기 응축물을 포집하였다.
2) 표준담배 연기응축물 추출: 담배연기응축물이 포집된 켐브리지 필터를 시가렛홀더(RM20, Heinr Borgwaldt, Germany)에서 분리하여 각각 100ml 삼각플라스크에 넣고 추출용매 이소프로판올 50 ml씩을 가하여 잘 흔든 다음, 실온에서 8시간 이상 방치하여 추출하였다. 추출 후에 여과하고 감압여과농축기로 농축하였으며, 3개의 삼각플라스크에 들어있는 농축액을 scintillation vial rack(WHEATON 03-340-25N, USA)에 모으고 질소 가스를 이용하여 완전 농축하였다. 표준담배 주류연(主流煙) 중 고체상분획(TPM)의 함량은 다음의 계산식을 이용하여 계산한다. 실험에 사용할 때는 담배연기응축물을 media에 용해시켜 표준담배추출물(CSS)로 사용하였다.
WFHA : 흡연 후 필터 홀더의 중량, WFHB : 흡연 전 필터 홀더의 중량,
N : 각 트랩의 권련 수
<실험예 2> 폐손상 모델
1) 7주령 BALB/c 수컷 생쥐에 대해 Lipopolysaccharide(LPS) +표준담배 추출물, LPS + elastase, elastase + DEP를 주 1회씩 3주간 코와 입을 통하여 50㎕씩 총 100㎕를 흡인시켜 COPD를 유발시킨다. 흡인은 7% Chloral hydrate(C8383, Sigma, USA)를 복강 주사하여 마취를 약간만 시켜 움직임이 없는 생쥐의 앞니를 고무밴드로 고정시킨 상태에서 투여하였다. 실험군은 (i) 아무런 처리를 하지 않은 정상군(Normal), (ii) 유발물질을 처리한 대조군(Control), (ⅲ) 유발물질 처리한 후에 덱사메타손(3㎎/kg, p.o.) 투여한 양성 대조군(Positive control), (ⅳ) 유발물질을 처리한 후에 과루인 추출물(200㎎/㎏, p.o) 투여군(TF-200), (ⅴ) 유발물질을 처리한 후에 황금 추출물(200㎎/㎏ p.o) 투여군(SB-200), (ⅵ) 유발물질을 처리한 후에 황련 추출물(200㎎/㎏ p.o) 투여군(CR-200), (ⅶ) 유발물질을 처리한 후 행인 추출물 (200㎎/㎏ p.o) 투여군(AS-200), (ⅷ) 유발물질을 처리한 후 복합 제제(200㎎/㎏ p.o) 투여군(GHX02-200)으로 하였다. 약물을 투여하는 각각의 실험군은 14일간 매일 경구투여 하고, 실험이 끝난 후 각 군 생쥐의 기관지 폐포 세척액(BALF) 및 폐조직을 분리하였다(도면 1).
LPS+CSS : LPS + 표준담배추출물의 비강내 주입 50㎍/㎕
<실험예 3> 부검 및 검사 계획
실험종료 후 실험동물은 에틸에테르로 마취시킨 후 혈액과 기관지폐포세척액(BAL)을 획득한다. BAL과 말초혈액단핵구(PBMC), 폐에서 유세포분석기를 이용하여 면역세포를 확인하고, BALF에서 IL-17A, MIP2, CXCL-1를 확인하였다. 또한 BAL 세포원심분리 후에 Diff-Quik Stain으로 호중구의 증가를 확인하였다. 폐를 분리하여 폐 조직검사(H&E, M-T stain)와 실시간 중합연쇄반응을 통해 유전자변화를 확인하였다.
1) 기관지폐포 세척액 분리
실험 마지막 날에 채혈한 후, 개흉하여 기도를 노출시켜 FBS free DMEM 배지 1㎖을 넣은 주사기를 기관지(trachea)에 삽입하여 주입시키고, 끈으로 묶어 고정한 후에 기관지 폐포세척을 3회 순환하여 세척액(BALF)을 얻는다. 기관지폐포 세척액을 4℃, 2,000 rpm, 5분간 원심분리한 후에, 상층액은 세포원심분리를 측정하기 위해 냉동보관하고, BALF에서 분리한 세포는 ACK 액을 3분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 1% FBS free DMEM 배양액으로 세척한 후, 혈구계수기를 사용하여 총 세포수를 측정하였다.
2) 기관지폐포 세척액(BALF) 분리 및 총 호중구 세포수 측정
혈액을 채혈한 후 해부하여 호중구의 BALF 내 세포계수를 위해 세포원심분리 시행 후 침전된 혈구를 분리하여 0.04% trypan blue로 염색한 후 총세포수를 측정하였다. Diff-Quick staining(Romanowsky stain)을 3회에 걸쳐 처리하고, 이후 PBS로 2회 세척한 후 군당 9개의 슬라이드를 제작하여 400배율의 광학현미경 (Light microscope, Nikon, Japan)을 통해 계수하였다.
3) 혈액에서 PBMCs 분리 및 세포수 측정
실험종료 후에 3ml 주사기에 50I.U 헤파린(APU8AF, 중외제약) 20㎕를 넣어 놓고, 생쥐를 에틸에테르로 마취한 후에 심장천자법으로 800~1000㎕를 채혈하였다. 채혈된 혈액 500㎕를 9.5ml의 ACK 용액에 넣고 5분 동안 방치한 후에 적혈구를 용해시키기고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 PBMCs를 분리하여 0.04% trypan blue로 염색한 후 총세포수(/ml)를 측정하였다.
4) 폐 세포 분리 및 총세포수 측정: 폐포세척액 (BALF)을 분리하지 않은 생쥐에서 폐를 적출하여 폐조직을 잘게 절편한 후 우태아 혈청(FBS)이 포함되지 않은 3㎖ DMEM 배지에 넣고, 1㎎/㎖의 콜라게나제 IV(C5138, Sigma)를 가하여 37oC 진탕배양기에서 30분 동안 4회 이상 조직을 분해(digestion)하여 폐세포를 분리하였다. 분리된 폐세포는 배지로 세척한 후 cell strainer(352350, FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 이들 세포들로부터 ACK 용액(10-548E, LONZA)을 37oC에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 배양액으로 세척한 후에 0.04% trypan blue(15250061, Invitrogen)로 염색한 후 총 폐세포수를 측정하였다.
5) 기관지폐포 세척액 내 면역형광세포 염색
분리한 PBMCs, BAL, 그리고 폐세포들을 5 x 105세포를 조정한 후 4℃에서 면역형광염색을 실시하였다. 각각에 PE-anti-CD4e(553047, BD Pharmingen, San Diego, CA), FITC-anti-CD8(553031, BD Pharmingen), PE-anti-Gr-1,(553128, BD Pharmingen), FITC-anti-CD69,(55732, BD Pharmingen), FITC-anti-CD11b (553310, BD Pharmingen)을 넣고 30분간 4℃에서 반응시킨다. 반응 후에 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후에 유세포분석기의 Cell Quest 프로그램(643274, BD Biosciences, San Diego, CA)을 이용하여 CD8+CD4+, CD8+CD69+, CD69+CD4+ 그리고 Gr-1+Neutrophil+, Gr-1+CD11b+ 세포빈도를 백분율(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서 분석하였다.
6) 효소면역분석법(ELISA)
BALF 내의 TNF-α, IL-17A, MIP2, CXCL-1의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. Capture antibody를 coating 버퍼에 혼합하여 각각의 well당 100㎕씩 넣고, 4℃에서 overnight한 후, washing 버퍼로 4회 세척한다. Assay diluent를 well당 200㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 blocking을 한 후, washing 버퍼로 4회 세척한다. 각 실험군의 혈청 및 standard를 assay diluent 용액에 10배의 농도로 희석한 후, 각각의 capture antibody로 코팅된 96 well plate에 100㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. Washing 버퍼로 3회 세척하고, biotin-conjugate antibody reagent를 각각의 well에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2회 세척한 다음, streptavidine-HRP solution을 각각의 well에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후에 다시 washing 버퍼로 2회 세척하였다. 여기에 substrate solution을 100㎕씩 처리하여 20분간 반응시킨 후에, 50㎕의 stop solution을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
7) 폐조직에서 mRNA 유전자 발현 측정
① 폐조직에서 RNA 분리: 생쥐의 폐조직을 적출한 후에 RNAzolB (CS-105B, Tel-Test) 500㎕를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 클로로폼(CHCl3) 50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000rpm에서 원심분리한 다음 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-프로판올 200㎕와 동량 혼합 후에 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후에 80% 에탄올로 수세하고 3분간 진공펌프에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 디에틸 피로카보네이트(DEPC, IBS-BW1004, Intron)를 처리한 20㎕에 녹여 heating block(2050, Lab-Line, INDIA) 75℃에서 불활성화시킨 후에 first strand cDNA합성에 사용하였다.
② 실시간 중합연쇄반응
합성한 cDNA를 실시간 중합연쇄반응(Galli SJ. Allergy, Curr. Biol., 10:R93-95, 2006)은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 사용된 TGF-β1, MUC5AC, IL-1β, IL-10 그리고 mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)의 probe는 CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG(VIC)을 사용하였으며 (probe는 Applied Biosystems사에서 제공되는 제품임), Sper-Taqman PCR Master mix(4369016, ABI)를 사용하였고, primer의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다. 실시간 중합연쇄반응의 조건으로는 pre-denaturation은 50℃에서 2분, 94℃에서 10 분, 그리고 40 싸이클을 95℃에서 0.15분, 60℃에서 1분 수행하였다. RME 투여군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 하기 수학식 1를 이용하여 RQ (relative quantitative)을 측정하였다.
x = starting quantity
y = yield
n = number of cycles
e = efficiency로 계산하여 RQ (relative quantitative)을 측정하였다.
8) 조직병리검사
폐조직의 병리적 손상정도를 관찰하기 위해 폐조직을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 사용한다. H&E staining을 실시하기 위하여 슬라이드를 hematoxylin에 1분 동안 담가 둔 후 흐르는 증류수에 여러 번 세척 후 eosin에 30초간 담그고 흐르는 증류수로 여러 번 세척하였다. 그 다음 70%→95%→100% 에탄올에 여러 번 씻으며 염색을 적당히 제거한 후 크실렌에 1분간 담가둔다. 마지막으로 mounting medium 크실렌을 이용하여 cover-slide를 영구 부착한다. 그리고 collagen deposition염색인 Masson-Trichrome 염색을 수행하였다. 이러한 샘플들은 400배율의 광학현미경(Light microscope, Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.
9) 통계처리
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다. 상기 데이터는 측정된 개개 최종 포인트(point)에 대한 각 그룹간의 통계학적 유의성있는 분산을 결정하기 위하여 일원분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였고 각 군간의 통계적 유의성은 비모수적 검정법(nonparametric Mann-Whitney test) 및 다중분석 비교법(Dunnett’multiple comparison test; IBM SPSS statistics version 19.0 statistic software, Inc, IBM, USA)을 이용하였다. 대조군(COPD-control)간의 상이성은 자명하고 따라서, 대조군간의 통계학적 유의성은 도 및 표에 나타내지 않았다. The results (presented as 평균(mean) ±평균 표준 오차(standard error of mean)로 표기되는 결과는 P 값(values): < 0.05 (*), < 0.01 (**), or < 0.001 (***).에 통계적 유의성으로 표기되었다.
<실험결과>
1) 만성폐쇄성 폐질환 유도 마우스 모델에서의 각 실험군 및 복합제제의 BAL cell cytospin과 Diff-Qick staining을 통해 호중구 수를 확인함으로써 양성대조군과의 차이를 알아보았다(도면 2). C57BL/6 생쥐에 LPS와 표준담배추출물을 INT방법으로 주입한 대조군에서 호중구의 수가 확연히 증가하는 것으로 보아 폐에서의 염증 수치가 함을 알 수 있었다. 또한 양성대조군인 덱사메타손(3mg/kg) 투여군에서 상대적인 호중구의 수가 감소함을 보였고, 과루인, 황금, 황련, 행인의 복합 제제 실험군에서도 호중구의 수가 더 감소함을 보였으므로, 폐에서 염증 수준이 감소한다고 예상할 수 있었다.
2) 정상군, 대조군, 양성대조군, 실험군 생쥐에서 분리한 BALF에서 ELISA를 통해 케모카인인 IL-17A, MIP2, GRO-a (CXCL-1)의 생산량을 측정하였다. C57BL/6 생쥐에 LPS와 표준담배추출물을 INT방법으로 주입한 대조군의 BALF에서 염증관련 케모카인 생산량이 모두 증가하였다. 양성대조군인 덱사메타손 투여군에서 통계적으로 유의성 있게 IL-17A, MIP2와 CXCL-1의 생산량이 감소함을 통계적으로 유의성 있는 수준으로 확인할 수 있었다. 단일 실험군들과 복합 제제군에서도 생산량이 감소함을 통계적으로 유의성 있는 수준으로 확인할 수 있었다(도면 3)
3) 정상군, 대조군, 양성대조군 생쥐에서 PBMC, BAL과 폐에서 유세포(FACS) 분석을 통해 세포빈도를 CD11b+/Gr-1+, CD4+/CD8+, CD4+/CD69+, CD8+/CD69+, Gr-1+/호중구를 백분율(%)로 분석하여 산출하였다. C57BL/6 생쥐에 LPS와 표준담배추출물을 INT방법으로 주입한 대조군의 PBMC, BAL, 폐에서 면역세포 수가 증가하였다. 양성대조군, 단독실험군, 복합 제제 투여군의 BAL, PBMC와 폐에서는 면역 세포 수가 감소함을 보였다(도면 4).
4) C57BL/6 생쥐에 LPS와 표준담배추출물을 INT방법으로 주입한 마우스에서 분리한 폐 조직 일부를 10% 포름알데히드 용액에 고정한 후에 H&E, M-T 염색 수행하였다. 정상군에 비해 LPS와 표준담배추출물을 INT방법으로 주입한 대조군의 H&E 염색법을 통해 폐세포 벽이 두꺼워지는 것을 확인할 수 있었고, M-T염색법을 통해 교원섬유가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군인 덱사메타손 투여군과 과루인, 황금, 황련, 행인의 복합 제제 투여군은 대조군에 비해 얇은 폐세포 벽과 교원섬유가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도면 5).
이상 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명하였다. 상기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 상기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.
Claims (5)
- 과루인, 황금, 황련 및 행인의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제.
- 제 1항에 있어서,
상기 과루인, 황금, 황련 및 행인의 중량비는 2 : 1 : 1 : 2인 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제.
- 제 2항에 있어서,
상기 복합 추출물은 과루인, 황금, 황련 및 행인의 각각에 대하여 증류수를 10배의 중량비로 사용하여 추출한 후에 혼합되는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제.
- 제 3항에 있어서,
상기 추출은 상온에서 2시간 동안 2회 환류 추출하는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제.
- 제 4항에 있어서,
상기 환류 추출로 얻어지는 추출액은 여과한 후에 감압 농축하여 냉동 보관하는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환 개선용 복합 제제.
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| KR102223717B1 (ko) * | 2021-01-08 | 2021-03-08 | (주)오성내츄럴바이오 | 만성폐쇄성 페질환 완화 또는 치료용 생약 조성물, 이를 포함하는 한방 약침액 및 이를 포함하는 주사제 |
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| KR101344013B1 (ko) | 2012-03-22 | 2013-12-23 | 경희대학교 산학협력단 | 백합 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
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