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KR101764800B1 - 변형된 면역글로불린 중쇄 서열을 갖는 비인간 동물 - Google Patents

변형된 면역글로불린 중쇄 서열을 갖는 비인간 동물 Download PDF

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KR101764800B1
KR101764800B1 KR1020157021632A KR20157021632A KR101764800B1 KR 101764800 B1 KR101764800 B1 KR 101764800B1 KR 1020157021632 A KR1020157021632 A KR 1020157021632A KR 20157021632 A KR20157021632 A KR 20157021632A KR 101764800 B1 KR101764800 B1 KR 101764800B1
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KR
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KR1020157021632A
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KR20150118135A (ko
Inventor
존 맥훠터
카간 구러
캐롤라이나 에이. 미에거
린 맥도날드
앤드류 제이. 머피
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Publication of KR20150118135A publication Critical patent/KR20150118135A/ko
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Abstract

재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 마우스 또는 래트가 제공된다. 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 또는 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 또한 기재되어 있다. 중쇄의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 또한 제공된다.

Description

변형된 면역글로불린 중쇄 서열을 갖는 비인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS WITH MODIFIED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN SEQUENCES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 2월 20일자에 출원된 미국 특허 가출원 제61/766,765호 및 2013년 9월 18일자에 출원된 미국 특허 가출원 제61/879,338호(이의 전체내용이 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
서열 목록
텍스트 파일(파일명 "1270WO_SL.txt"(2014년 2월 20일자 생성, 크기 87,000바이트) 형태의 서열 목록은 이의 전체내용이 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
기술분야
불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열(즉, 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 및 래트. 몇몇 실시형태에서, 동물은 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 구역(VDJ 서열) 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위를 갖도록 유전적으로 조작되고, VDJ 서열은 인간 VDJ 서열이고, 불변 구역 유전자 서열은 인간 또는 비인간이다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물은 (1) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄) 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (2) 인간 또는 비인간 경쇄(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄) 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하고, 재배열된 중쇄 가변 도메인은 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 유전자 분절(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함한다. 게놈에 (ⅰ) 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 및 래트가 제공된다. 게놈에 (ⅰ) 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 가변 구역 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 구역 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 잔기를 코딩한다. 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다. 중쇄의 부재 하에 항원에 결합할 수 있고/있거나, 재배열된 중쇄 가변 도메인과 회합될 수 있고/있거나, pH 의존적 항원 결합 특징을 나타내는, 면역글로불린 경쇄(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄) 가변 구역 서열을 제조하는 방법이 제공되고, 이 방법은 이중특이적 항체를 제조하는 데 유용하다.
이중특이적 항체는 2개의 명확한 항원 결정부위에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 다작용성 항체이고, 암을 포함하는 많은 질환을 치료하기 위한 주요한 치료학적 생물물질 중 하나로서 출현한다. 이중 항원 결합 특성을 갖는 다양한 이중특이적 항체가 최근 개발되었지만, 종래의 이중특이적 항체에서는 오직 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이 각각의 항원 결정부위에 대한 결합에 기여하지만, 규칙적인 항체에서는 경쇄 및 중쇄 가변 구역 둘 다가 동일한 항원 결정부위에 대한 결합에 기여할 수 있으므로, 종래의 이중특이적 항체에서의 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 특이성 및 친화도는 어느 정도 희생되어야 한다. 또한, 바람직한 수준의 효율을 성취하는 데 있어서, 치료학적 항체, 예를 들어 이중특이적 치료학적 항체는 대게 생체내 이의 제한된 재생력으로 인해 항체의 높은 또는 복수의 용량을 요한다.
지금까지 개발된 2개의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 대부분의 항원 결합 단백질은 (ⅰ) 제1 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 기여하는 면역글로불린 중쇄-경쇄 가변 도메인 쌍을 포함하는 제1 항원 결합 암(arm); 및 (ⅱ) 제2 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 기여하는 제2 중쇄-경쇄 가변 도메인 쌍을 포함하는 제2 항원 결합 암의 2개의 항원 결합 암을 포함한다. 이 항원 결합 단백질은 전체 항원 결합 단백질의 상황에서 이중특이적이지만 각각의 항원 결합 암 내에 반드시 이중특이적이지는 않아서, 다중특이적 포맷의 항원 결합 단백질, 예를 들어 삼중특이적 항원 결합 단백질의 사용을 제한한다. 본 명세서에 개시된 바대로, 항원 결합 단백질의 많은 상이한 포맷에서 사용하기 위한 항원 결합 단백질을 제조하기 위한 일반 도구로서 보편적 중쇄 가변 도메인을 발현하는 비인간 동물을 사용할 수 있다.
항원 특이성 및 친화도가 오로지 또는 주로 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 다양성으로부터 생기고/생기거나, 오로지 또는 주로 이 다양성에 기인하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열을 생성하는 것의 수요가 당해 분야에 존재한다. 이러한 서열은 항원 결합 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체를 설계하는 데 있어서 매우 유용할 것이고, 여기서 각각의 가변 도메인은 명확한 항원 특이적 결합을 개별적으로 담당한다. 본 명세서에 기재된 다양한 양상 및 실시형태는 재배열된 중쇄 가변 유전자 서열(예를 들어, 재배열된 중쇄 VDJ 서열)에 의해 코딩된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 이 수요를 만족시킬 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(즉, 보편적 중쇄 가변 도메인)을 코딩하는 비인간 동물은 재배열되지 않은(즉, 다양화가 가능한) 항체 경쇄 가변 도메인(들)에 대한 항체 다양화(diversification)의 기전에 중심을 둔다. 비인간 동물은 예를 들어 포유동물을 포함하고, 특정한 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터)를 포함한다.
관심 있는 항원에 의한 자극 시, 오로지 또는 주로 항체 경쇄 가변 도메인에 기인하는 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 생성하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 경쇄 항체 가변 도메인 아미노산 및 상응하는 핵산 서열은 이러한 유전적으로 변형된 동물에 의해 생성된 항체로부터 확인될 수 있고, 이 서열은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로(그리고 충분한 특이성 및 친화도로) 항원 결정부위에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 발생시키도록 재조합 항체 또는 다른 항원 결합 단백질에서 사용될 수 있다. 더구나, 재배열된 중쇄 가변 도메인(즉, 사전배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 동물의 이용성은 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 다양한 게놈 상황에, 예를 들어 상이한 면역글로불린 좌위에 배치함으로써 적용될 수 있다. 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열은 중쇄 좌위 또는 경쇄 좌위에 표적화될 수 있어서, 재배열된 중쇄 가변 도메인 서열은 인간 또는 비인간 중 어느 하나인 중쇄 또는 경쇄 불변 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열은 인간, 비인간, 또는 혼합 인간/비인간 면역글로불린 불변 구역 서열과 작동 가능한 연결로 게놈의 어디에서든 배치될 수 있다. 더욱이, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물은 면역글로불린 좌위의 추가의 유전자 변형과 조합될 수 있다(예를 들어, 면역글로불린 좌위의 추가의 유전자 변형을 포함하는 동물에 교잡됨). 예를 들어, 경쇄 좌위에 표적화된 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열에 의해 부여된 집중된 다양화는 중쇄 좌위로 삽입된 경쇄 가변 도메인 유전자 서열과 쌍을 지어서, 선택받은 항체 가변 유전자 서열(예를 들어, 항체 경쇄 가변 유전자 서열)의 다양성을 증가시키기 위해 선택받은 게놈 상황의 시기 및 다양화(예를 들어, 중쇄 좌위의 다양화 기전)를 완전히 이용하는 동물을 생성할 수 있다. 또한, 제한된(한정된) 경쇄 가변 구역 유전자 분절 레퍼토리(예를 들어, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 VL 유전자 분절을 상기 기재된 단일의 재배열된 중쇄 서열과 조합하여 포함하는 제한된 수의 경쇄 가변 유전자 서열)를 갖는 마우스를 사용함으로써, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인과 더 효과적으로 쌍을 지을 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 생성할 수 있다.
따라서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 즉, 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터)이 제공된다.
다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 발현된 유일한 게놈 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 재배열된 중쇄 가변 도메인이다. 따라서, 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 생성된 항체 중쇄 가변 도메인의 다양성은 극히 제한된다.
몇몇 실시형태에서, 게놈에 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 가져서 가변 구역 서열이 단일의 재배열된 인간 중쇄 가변 구역으로 실질적으로 이루어진 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 이러한 유전적으로 변형된 비인간 동물에서의 상이한 세포가 (예를 들어, 복제 오류, 체세포 초돌연변이 또는 다른 기전으로 인해) 단일의 재배열된 인간 중쇄 가변 구역에서 완전히 동일한 서열을 항상 가지지 않을 수 있지만, 무관하게, 이러한 유전적으로 변형된 비인간 동물이, 재배열되지 않은 중쇄 가변 서열을 갖는 동물 및/또는 게놈이 복수의 중쇄 가변 구역 유전자 분절(예를 들어, 특히 재배열되지 않은 경우 복수의 V, D 및/또는 J 분절)을 포함하는 동물과 비교하여, 항체 중쇄 가변 도메인의 극적으로 제한된 다양성을 나타내는 것으로 이해된다.
다양한 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위가 제공된다. 다양한 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 이것이 코딩하는 재배열된 중쇄 가변 도메인은 인간 V, D 및 J 유전자 분절로부터 유래한다. 다양한 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 이것이 코딩하는 재배열된 중쇄 가변 도메인은 인간 VH 유전자 및 인간 JH 분절로부터 유래한다. 다양한 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선에 존재한다. 다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 경쇄 불변 구역 유전자 서열과 작동 가능한 연결에 있는 경쇄 유전자를 형성하도록 재배열할 수 있는 재배열되지 않은 경쇄 가변 유전자 분절의 완전 보체를 포함한다. 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 재배열되지 않은 경쇄 가변 유전자 분절의 복수이지만 전체보다 적은(즉, 야생형 수보다 적은) 보체를 포함한다. 다양한 양상에서, 재배열되지 않은 경쇄 가변 유전자 분절은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 구체적인 양상에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 즉, 사전 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위)를 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물의 수많은 변형이 본 명세서에 개시되어 있다. 각각의 변형은 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에서 항체 다양화의 기전에 집중하는 능력을 갖는다.
다양한 양상에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열(예를 들어, IgM, IgD, IgA, IgE, IgG, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 이소형을 코딩하는 중쇄 불변 구역 유전자 서열)에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, (a) 제1 뉴클레오타이드 서열이 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하고(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간(또는 혼합 인간/비인간) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); (b) 제2 뉴클레오타이드 서열이 경쇄 가변 도메인을 코딩하는(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨) 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 동물이 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 재배열된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 비인간 동물이 제공되고, 중쇄 가변 도메인은 스페이서를 통해 중쇄 J 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 가변(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 코딩한다.
또 다른 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열; 즉, 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공되고, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 중쇄 좌위이다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 경쇄 좌위이다.
또 다른 양상에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 게놈 좌위를 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터)이 제공되고, 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 경쇄(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄) 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 양상에서, (a) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열(예를 들어, IgM, IgD, IgA, IgE, IgG, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 이소형을 코딩하는 중쇄 불변 구역 유전자 서열)에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 또는 비인간 경쇄(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄) 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공되고, 면역글로불린 좌위는
(a) (ⅰ) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임), 및
(ⅱ) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열임)
을 포함하는 제1 대립유전자; 및
(b) (ⅰ) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제3 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열임), 및
(ⅱ) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제4 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제4 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임)
을 포함하는 제2 대립유전자를 포함한다.
다양한 양상에서, 재배열되지 않은 경쇄 가변 구역 유전자 서열 또는 좌위를 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 야생형 수의(즉, 모든 또는 실질적으로 모든) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(즉, 서열)을 포함한다. 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 제한된 레퍼토리의 경쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어 (ⅰ) 1개, 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 VL 유전자 분절; 및 (ⅱ) 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1개 이상의 인간 JL 유전자 분절을 포함한다. 중쇄 핵산 서열 및/또는 경쇄 분절은 예를 들어 전이유전자에서 또는 내인성 면역글로불린 좌위에 존재할 수 있다.
다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공되고, 동물의 모든 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 동일한 재배열된 가변 중쇄 유전자 서열로부터 유래하고, 상기 가변 도메인은 적어도 1개, 2개 또는 3개 이상의 VL 유전자 분절 중 하나 및 적어도 1개, 2개 또는 3개 이상의 JL 유전자 분절로부터 유래한 경쇄 가변 도메인을 갖는 발현된 동족체이다. 추가로, 게놈에 (ⅰ) 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 및 (ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(예를 들어, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jκ 유전자 분절)을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트)이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물은, 관심 있는 항원에 의한 자극 시, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 발현하고, 중쇄 아미노산 서열은 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 중쇄 좌위로부터 유래한다. 소정의 양상에서, 경쇄 아미노산 서열은 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 VL 유전자 분절 및 (ⅱ) 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 경쇄 좌위로부터 유래한다.
게놈에서 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 유전자 분절(VH) 및/또는 변형된 D 유전자 분절을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공되고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산(예를 들어, 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 또는 4개의 아미노산)을 코딩한다. 다양한 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시형태에서, 비인간 동물은, 이의 게놈에, 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절, 예를 들어 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 경쇄 좌위를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하고 사용하는 방법이 또한 제공된다. 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 방법이 제공된다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역 아미노산 서열로부터 독립적으로 항원을 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 얻는 방법이 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위가 제공된다.
다양한 양상에서, 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 제조되거나 이로부터 유래한 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)이 제공된다. 다중특이적(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적) 항원 결합 단백질을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 이팩터 경쇄 면역글로불린 가변 도메인을 제조하는 방법이 또한 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 다양한 게놈 변형을 포함하는 비인간 동물로부터 유래한 다능성 세포, 유도 다능성 또는 전능성 줄기 세포가 제공된다. 전핵 주사(pronuclear injection)에 의해 세포로 도입된 변형과 같은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 함유하는 핵을 포함하는 세포가 또한 제공된다.
다양한 양상에서, 게놈이 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는, 세포를 포함하는 비인간 동물 배아가 제공된다. 소정의 양상에서, 비인간 동물 배아는, 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 추가로 포함한다.
중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원 또는 이의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 (a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함); (b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계; (c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포는 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 림프구이다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포, 예를 들어 골수종 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다.
중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원 또는 이의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 (a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함); (c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포는 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 림프구이다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포, 예를 들어 골수종 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다.
중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원 또는 이의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 (a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함); (c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포는 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 림프구이다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포, 예를 들어 골수종 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다.
항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (c)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (c)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (c)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (c)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (c)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (c)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 또한 제고되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (c)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (c)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (c)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 생식선 게놈에서 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 몇몇 실시형태에서, 포유동물은 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 동형접합성(homozygous)이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 Fc를 코딩한다. 특정한 실시형태에서, 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류이고, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 VH 유전자 분절, 인간 중쇄 D 유전자 분절 및 인간 중쇄 JH 유전자 분절로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 생식선 중쇄 VH 분절, 인간 생식선 중쇄 D 분절 및 인간 생식선 중쇄 JH 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 실질적으로 모든 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절은 비인간 동물의 면역글로불린 중쇄 좌위로부터 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하고; 비인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 이소성으로(ectopically) 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 면역원성이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 (VL) 유전자 분절 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 J 유전자 분절을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 분절(VL) 및 재배열되지 않은 경쇄 (JL) 유전자 분절을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 설치류 및 인간 불변 구역 유전자 서열로부터 선택된다. 특정한 또 다른 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 (VL) 유전자 분절 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 (JL) 유전자 분절은 내인성 설치류 좌위에서 설치류 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 좌위는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다.
추가의 양상에서, 비인간 생식 세포의 게놈에 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 면역글로불린 중쇄 좌위가 제공되고, 불변 구역 유전자 서열은 비인간 서열, 인간 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 내인성 비인간 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다.
추가의 양상에서, 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 이소성 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스, 래트 또는 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 좌위에 이형접합성인 비인간 동물이 제공되고, 비인간 동물은 주로 면역글로불린 중쇄 좌위로부터 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 발현한다.
추가의 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공되고, 상기 좌위는
(a) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 특정한 실시형태에서, 포유동물은 마우스, 래트 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 κ 경쇄 가변 도메인 유전자 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 λ 경쇄 가변 도메인 유전자 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 VH 유전자 분절, 인간 중쇄 D 유전자 분절 및 인간 중쇄 JH 유전자 분절로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 생식선 중쇄 VH 분절, 인간 생식선 중쇄 D 분절 및 인간 생식선 중쇄 JH 분절로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 인간 D 유전자 분절은 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 실질적으로 모든 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절은 비인간 동물의 면역글로불린 중쇄 좌위로부터 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하고; 비인간 동물은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 이소성 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 면역원성이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다.
추가의 양상은, 비인간 동물의 생식선 게놈에,
(1) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열, 및
(2) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다.
추가의 양상은 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열, 및
(ⅱ) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열
을 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 가변 도메인을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 가변 도메인을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 소정의 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 특정한 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스, 래트 또는 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다.
스페이서를 통해 중쇄 J 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 분절(VH) 서열을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물이 또한 제공되고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, VH 서열 및 JH 서열은 인간 VH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 인간 VH 유전자 분절은 VH3-23 또는 이들의 다형 변이체이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 인간 D 유전자 분절로부터 유래한 서열을 코딩한다. 특정한 실시형태에서, 인간 D 유전자 분절은 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 스페이서는 D4-4의 서열 또는 이들의 다형 변이체를 코딩한다. 소정의 실시형태에서, 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 인간 JH 분절은 JH4-4 또는 이들의 다형 변이체이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 실질적으로 모든 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절은 비인간 동물의 면역글로불린 중쇄 가변 좌위로부터 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하고; 비인간 동물은 이의 게놈의 이소성 좌위에서 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 면역원성이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함한다.
추가의 양상은 비인간 동물의 생식선 게놈에서 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH)에 작동 가능하게 연결된 중쇄 가변 유전자 분절(VH)을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 제공하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 좌위는 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다.
추가의 양상에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH)에 작동 가능하게 연결된 중쇄 가변 유전자 분절(VH)을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 뉴클레오타이드 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 이소성 좌위에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 중쇄 좌위는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스, 래트 또는 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위는 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다.
추가의 양상은, 게놈에서,
(a) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 및
(b) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 변형된 비인간 동물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 소정의 실시형태에서, 포유동물은 설치류이다. 특정한 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 이소형을 코딩하는 설치류 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 설치류 κ 또는 λ 불변 구역 핵산 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 인간 생식선 VH 분절, 인간 생식선 D 분절 및 인간 생식선 JH 분절로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 내인성 좌위에서 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절은 내인성 좌위에서 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 2개 이하의 인간 면역글로불린 재배열되지 않은 VL 유전자 분절, 및 1개, 2개, 또는 3개 이상의 인간 재배열되지 않은 JL 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 생식선 VH 유전자 분절로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 인간 생식선 VH3-23 유전자 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 VH3-23/X1X2/J(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임)의 서열을 코딩한다. 소정의 실시형태에서, X1은 Gly이고, X2는 Tyr이다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 좌위는 작용성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함한다. 소정의 실시형태에서, Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다는 내인성 Adam6 유전자이다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 게놈의 이소성 좌위에서 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 가변 구역 VL 및 JL 유전자 분절은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 좌위는 Vκ1-39 및 Vκ3-20인 2개의 인간 VL 유전자 분절을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 유전자 분절은 생식선 유전자 분절이다. 소정의 실시형태에서, 비인간 동물은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 VL 분절 서열에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 의한 부가 또는 치환을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 부간된 또는 치환된 히스티딘 코돈은 CDR3에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 VL 유전자 분절은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절이고, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절의 각각은 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 의한 치환을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 107번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 몇몇 실시형태에서, 제107항의 비인간 동물로서, 비인간 동물은, 관심 있는 항원에 의한 자극 시, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 발현하고, 항원 결합 단백질은 인간 VL 및 JL 유전자 분절로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하고, 항원 결합 단백질은 인간 VL 유전자 분절에 의해 코딩된 아미노산 위치에서 적어도 1개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 항원에 대한 반응에서 항원 결합 단백질의 집단을 발현하고, 집단에서의 모든 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 (a) 재배열된 인간 가변 구역 핵산 서열로부터 유래한 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및 (b) 인간 VL 유전자 분절 및 JL 유전자 분절의 재배열로부터 유래한 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하고, 적어도 1개의 인간 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다.
추가의 양상은 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 VH, D 및/또는 JH 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 면역글로불린 중쇄 불변 구역 핵산 서열과 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 면역글로불린 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 작동 가능한 연결에 있는 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절
을 비인간 동물의 변형된 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류이다. 소정의 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절은 야생형 비인간 동물의 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 또는 이 근처에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 면역글로불린 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절은 게놈에서 이소성 좌위에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 내인성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 게놈의 이소성 좌위에서 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역 핵산 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 Vκ1-39 및 Vκ3-20인 2개의 인간 VL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 비인간 동물은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 면역글로불린 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 VL 분절 서열에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 의한 부가 또는 치환을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 부가된 또는 치환된 히스티딘 코돈은 CDR3에 존재한다. 소정의 실시형태에서, 인간 VL 유전자 분절은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절이고, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절의 각각은 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 의한 치환을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 특정한 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 107번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에서 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은, 이의 게놈에,
(ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 면역글로불린 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 특정한 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 또 다른 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에서 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에서 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에서 (ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열, 및 (ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에서 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은, 이의 게놈에,
(ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에서 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
추가의 양상은 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은, 이의 게놈에,
(ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
도 1은, 인간 VH3-23 프로모터(서열 번호 139)에 작동 가능하게 연결된, 재배열된 인간 면역글로불린 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4; 서열 번호 136) 및 JH4의 인트론(서열 번호 140)을 포함하는 재배열된 중쇄 가변 도메인 미니-좌위("UHC 미니-좌위")를 작제하기 위한 계획을 예시한다. UHC 미니-좌위는 마우스 상동성 암에 의해 5' 및 3' 플랭킹된다. 단계 1(I-CeuI/SpeI 결찰(Amp+Spec))에서, 스펙티노마이신 선택 카세트는 I-CeuI 부위와 SpeI 부위 사이의 프로모터의 상류에 도입되어 pJSh0038(UHC 미니-좌위)을 생성한다.
도 2는 (A) MAID 1115 BAC 클론의 5' 말단에 하이그로마이신 선택 카세트(EM7-HYG)를 표적화하는 것(2. BHR(Hyg+Kan)); 및 (B) VI432 BAC 클론에서 IgM 좌위의 상류에 UHC 미니-좌위(pJSh0038)를 표적화하는 것(3. BHR(Spec+Hyg))에 대한 계획을 예시한다.
도 3은, (A) 5'로부터 내지 3'로, Adam6a 유전자(3'에서 5' 방향에 존재); FRT 부위에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트(3'에서 5' 방향에 존재); Adam6b 유전자(3'에서 5' 방향에 존재); 유전자간 제어 구역 1(IGCR1; 중요한 V(D)J 재조합 조절 구역); 및 스펙티노마이신 카세트(5'에서 3' 방향에 존재)를 포함하는, VI421 클론의 3' 말단으로 클로르암페니콜 카세트를 포함하는 pDBa0049 작제물을 표적화하는 것(4. BHR(Cm+Kan)); 및 (B) 제한 분해 및 결찰을 통해 I-CeuI 부위와 AscI 부위 사이의 VI443 BAC 클론의 보편적 중쇄(UHC) 게놈 좌위의 상류에 Adam6a 및 6b 유전자를 함유하는 VI444 BAC 클론의 게놈 좌위를 표적화하는 것(5. I-CeuI/AscI 결찰(Hyg+Kan))에 대한 계획을 예시한다.
도 4는 (A) 1661 이형접합성 마우스로부터 단리된 ES 세포로 최종 작제물(MAID6031 BAC DNA)을 표적화하는 것에 대한 계획을 예시하고; (B) 스크리닝 검정에서 사용된 프로브 및 프라이머의 게놈 위치를 나타낸다.
도 5는 UHC CDR3 서열(AKDYSNYYFDY; 서열 번호 143)과 유사한 CDR3 서열을 함유하는 리제네론 파마슈티컬스(Regeneron Pharmaceuticals)의 ASAP 데이터베이스에서의 항체의 목록이다.
도 6은 6031 박테리아 인공 염색체(BAC) DNA 및 6031 이형접합성 ES 세포의 게놈 조직화, 및 스크리닝 검정에서 사용된 프라이머 및 프로브의 게놈 위치를 예시한다.
도 7은 스크리닝 검정에서 대립유전자(LOA)의 결손, 대립유전자(GOA)의 획득, 또는 부모 대립유전자(부모)를 확인하도록 사용된 프라이머 및 프로브의 목록을 나타낸다.
도 8은 스크리닝 검정에서 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다.
도 9는 표적화된 대립유전자(Adam6a/6b 유전자 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(hVH3-23(D)JH4)을 함유)의 일 카피를 함유하는, 유전적으로 변형된 F0 마우스의 면역글로불린 중쇄 좌위의 게놈 구조를 예시한다. (A) MAID 6031 het: 선택 카세트와 함께 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 이형접합성 F0 마우스; (B) MAID 6032 het: 선택 카세트 없이 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 이형접합성 F0 마우스.
도 10은 야생형 또는 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 골수 세포의 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석의 결과를 나타낸다. 상부 패널: 야생형 또는 F0 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 골수 세포는 일중항에서 개폐되고 CD19 발현(B 세포 마커) 및 CD3 발현(T 세포 마커)에 기초하여 분류된다. 하부 패널: CD19+ 개폐된 B 세포는 IgMb 항체(야생형 대립유전자; B6 대립유전자로부터 생성된 항체) 또는 IgMa 항체(재배열된 중쇄 가변 도메인(hVH3-23(D)JH4)을 코딩하는 유전적으로 변형된 대립유전자(129 대립유전자)로부터 생성된 항체)의 존재에 기초하여 분류된다.
도 11은 야생형 또는 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 분석의 결과를 나타낸다. 상부 패널: 야생형 또는 F0 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 비장 세포는 일중항에서 개폐되고 CD19 발현(B 세포 마커) 및 CD3 발현(T 세포 마커)에 기초하여 분류된다. 하부 패널: CD19+ 개폐된 B 세포는 IgMb 항체(야생형 대립유전자; B6 대립유전자로부터 생성된 항체) 또는 IgMa 항체(재배열된 중쇄 가변 도메인(hVH3-23(D)JH4)을 코딩하는 유전적으로 변형된 대립유전자(129 대립유전자)로부터 생성된 항체)의 존재에 기초하여 분류된다.
도 12는 야생형 또는 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 혈액 세포의 FACS 분석의 결과를 나타낸다. 상부 패널: 야생형 또는 F0 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 혈액 세포는 일중항에서 개폐되고 CD19 발현(B 세포 마커) 및 CD3 발현(T 세포 마커)에 기초하여 분류된다. 하부 패널: CD19+ 개폐된 B 세포는 IgMb 항체(야생형 대립유전자; B6 대립유전자로부터 생성된 항체) 또는 IgMa 항체(재배열된 중쇄 가변 도메인(hVH3-23(D)JH4)을 코딩하는 유전적으로 변형된 대립유전자(129 대립유전자)로부터 생성된 항체)의 존재에 기초하여 분류된다.
도 13a는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스(6032HO)로부터 수확된 비장에서의 CD19+ B 세포 미성숙 B 세포(CD19+IgDintIgMhi) 및 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi)의 전체 수에 대한 FACS 분석의 결과를 나타낸다. 상부 패널: 야생형 또는 F2 6032 동형접합성 마우스로부터 단리된 비장 세포는 일중항에서 개폐되고 CD19 발현(B 세포 마커) 및 CD3 발현(T 세포 마커)에 기초하여 분류된다. 하부 패널은 CD19+에서 개폐되고 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 인간 면역글로불린 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 13b는 야생형(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), 성숙 B 세포(CD19+IgDhi IgMlo) 및 미성숙 B 세포(CD19+IgDintIgMhi)의 전체 수를 나타낸다.
도 13c는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스(6032HO)로부터 CD19+에서 개폐된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 13d는 야생형(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), Igκ+ B 세포(CD19+Ig카파+) 및 Igλ+ B 세포(CD19+Ig람다+)의 전체 수를 나타낸다.
도 13e는 야생형 마우스 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스에서의 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 입체 도면의 제1 칼럼(왼쪽)은, 미성숙 및 성숙 B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 입체 도면의 제2 칼럼(중간)은, T1(IgD-IgM+CD21loCD23-), T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3 B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 입체 도면의 제3 칼럼(오른쪽)은, 변연부 B 세포를 생성시키는 더 작은 제1 집단 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 제2 집단을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 14a는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 14b는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 세포의 절대 수(왼쪽), 세포의 전체 수(중간) 및 B(CD19+) 세포의 전체 수(오른쪽)를 나타낸다.
도 14c는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 입체 도면의 각각에 표시되어 있다.
도 14d는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 성숙 B(B220hiIgM+) 및 미성숙 B(B220intIgM+) 세포의 전체 수를 나타낸다.
도 14e는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 입체 도면의 각각에 표시되어 있다.
도 14f는 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23/D/JH4)에 대해 동형접합성인 마우스의 대퇴골로부터 단리된 Igκ 및 Igλ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 15는 족척 면역화 이후 15일 및 24일에 마우스 혈청(야생형 또는 6031 HET F0 및 F1)에서의 항원 특이적 mIgG의 수치를 나타낸다.
도 16은 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열 및 hVH3-23(D4-4_리딩 프레임 3)JH6의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 145)을 나타낸다.
도 17은 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열 및 hVH3-23(D4-4_리딩 프레임 2)JH6의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 146)을 나타낸다.
도 18은 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열 및 hVH3-23(D4-4_리딩 프레임 3)JH4의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 147)을 나타낸다.
도 19는 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열 및 hVH3-23(D4-4_리딩 프레임 2)JH4의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 148)을 나타낸다.
도 20은 2개의 유전적으로 변형된 이중 경쇄(DLC) 좌위의 예를 나타낸다. 상부에서의 좌위(DLC-5J)는 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절을 함유하는 조작된 인간 DNA 단편을 함유한다. 하부에서의 좌위(DLC-1J)는 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절을 함유하는 조작된 인간 DNA 단편을 함유한다. 각각의 좌위는 내인성 경쇄 불변 구역(예를 들어, Cκ)에 작동 가능하게 연결된 인간 Vκ 구역을 형성하도록 재배열할 수 있다. 면역글로불린 프로모터(P, 좌위 위의 빈 화살표), 리더 엑손(L, 짧은 빈 화살표), 및 2개의 인간 Vκ 유전자 분절(긴 빈 화살표)(모두 Frt 재조합 부위를 함유하는 네오마이신 카세트에 의해 상류에 (5'에) 플랭킹됨)이 도시되어 있다. 각각의 인간 유전자 분절(Vκ 및 Jκ)에 의해 조작된 재조합 신호 서열은 각각의 유전자 분절과 병치된 빈 타원형으로 표시된다. 대부분의 실시형태에서, 달리 기재되지 않은 한, 채워진 형상 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다. 다이어그램은 크기조정으로 제시되지 않는다.
도 21a 내지 도 21c는 2개의 인간 Vκ 분절(hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 1개의 인간 Jκ 분절(Jκ5), 및 마우스 인핸서 및 IgκC 암을 포함하는 면역글로불린 카파 좌위의 조작을 위한 표적화 벡터의 작제를 위한 일반적인 전략을 나타낸다. 도 21d는 ES 세포로의 이 표적화 벡터의 도입 및 이를 갖는 이형접합성 마우스의 생성을 나타내고; 도 21e는 FLP 효소를 사용한 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 나타낸다. 대부분의 실시형태에서, 달리 기재되지 않은 한, 채워진 형상 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다. 다이어그램은 크기조정으로 제시되지 않는다.
도 22a 내지 도 22d는 2개의 인간 Vκ 분절(hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 1개의 인간 Jκ 분절을 포함하는 면역글로불린 κ 좌위의 조작된 부분의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 82)을 나타내고; 뉴클레오타이드 서열은 조작된 인간 서열을 아우르고 5' 및 3' 말단 둘 다에서 내인성 마우스 서열의 100개의 염기 쌍을 포함한다. 도 22d의 하부는 다양한 서열을 도시하도록 사용된 상이한 폰트를 설명한다.
도 23a 내지 도 23b는 2개의 인간 Vκ 분절(hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 분절, 및 마우스 인핸서 및 IgκC 암을 포함하는 면역글로불린 카파 좌위의 조작을 위한 표적화 벡터의 작제를 위한 일반적인 전략을 나타낸다. 도 23c는 ES 세포로의 이 표적화 벡터의 도입 및 이를 갖는 이형접합성 마우스의 생성을 나타내고; 도 23d는 FLP 효소를 사용한 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 나타낸다. 대부분의 실시형태에서, 달리 기재되지 않은 한, 채워진 형상 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다. 다이어그램은 크기조정으로 제시되지 않는다.
도 24a 내지 도 24d는 2개의 인간 Vκ 분절(hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 좌위의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 83)을 나타내고; 뉴클레오타이드 서열은 조작된 서열 및 5' 및 3' 말단 둘 다에서 내인성 마우스 서열의 100개의 염기 쌍에 아우른다. 도 24d의 하부는 다양한 서열을 도시하도록 사용된 상이한 폰트를 설명한다.
도 25a는 상부 패널에서 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 CD19+에서 개폐되고 ckit+ 및 CD43+에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 프로 및 프리 B 세포는 하부 패널의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 25b는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)의 대퇴골로부터 수확된 골수에서의 프로(CD19+CD43+ckit+) 및 프리(CD19+CD43-ckit-) B 세포의 수를 나타낸다.
도 26a는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 26b는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 B(CD19+), 미성숙 B(B220intIgM+) 및 성숙 B(B220hiIgM+) 세포의 전체 수를 나타낸다.
도 27a는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 27b는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)의 대퇴골로부터 단리된 Igκ 및 Igλ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 28a는 상부 패널에서 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 일중항에서 개폐되고 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 CD19+에서 개폐되고 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 성숙(WT에 대해 54, DLC-5J에 대해 56.9) 및 이행성(WT에 대해 23.6, DLC-5J에 대해 25.6) B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 28b는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 수확된 비장에서의 CD19+ B 세포, 이행성 B 세포(CD19+IgMhiIgDlo) 및 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi)의 전체 수를 나타낸다.
도 29a는 야생형 마우스(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 CD19+에서 개폐된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 29b는 야생형(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), Igκ+ B 세포(CD19+Igκ+) 및 Igλ+ B 세포(CD19+Igλ+)의 전체 수를 나타낸다.
도 30a는 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스에서 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 제1(가장 왼쪽) 입체 도면은, 미성숙(39.6) 및 성숙(57.8) B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 제2(상부 중간) 입체 도면은, T1(33.7; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2(21.2; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3(29.1) B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제3(하부 중간) 입체 도면은, 변연부 B 세포를 생성시키는 작은 집단(14.8) 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 제2 집단(70.5)을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 제4(상부 오른쪽) 입체 도면은, 변연부(90.5; MZ) 및 변연부 전구체(7.3; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 B220+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제5(하부 오른쪽) 입체 도면은, FO-I(79.0; IgDhiIgMloCD21midCD23+) 및 FO-II(15.1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 IgD+ 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 30b는 야생형 마우스에서의 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 제1(가장 왼쪽) 입체 도면은, 미성숙(31.1) 및 성숙(64.4) B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 제2(상부 중간) 입체 도면은, T1(28.5; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2(28.7; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3(30.7) B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제3(하부 중간) 입체 도면은, 변연부 B 세포를 생성시키는 작은 집단(7.69) 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 제2 집단(78.5)을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 제4(상부 오른쪽) 입체 도면은, 변연부(79.9; MZ) 및 변연부 전구체(19.4; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 B220+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제5(하부 오른쪽) 입체 도면은, FO-I(83.6; IgDhiIgMloCD21midCD23+) 및 FO-II(13.1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 IgD+ 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 31은 야생형(WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)의 수확된 비장에서의 이행성, 변연부 및 소포성 B 세포 집단의 전체 수를 나타낸다.
도 32는 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절(H κ)(벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스의 인간 경쇄)에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 대체에 동형접합성인 마우스, 야생형 마우스(WT), 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J) 및 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-1J)에서, Vκ3-20 또는 Vκ1-39 유전자 분절에 특이적인 프로브를 사용한, 정량적 PCR 검정에서 Vκ3-20 유래 및 Vκ1-39 유래 경쇄의 골수에서의 상대 mRNA 발현(y축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현에 정규화된다. ND: 비검출.
도 33은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절(H κ)(벨로시뮨(등록상표) 마우스의 인간 경쇄)에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 대체에 동형접합성인 마우스, 야생형 마우스(WT), 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J) 및 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-1J)에서, Vκ3-20 또는 Vκ1-39 유전자 분절에 특이적인 프로브를 사용한, 정량적 PCR 검정에서 Vκ3-20 유래 및 Vκ1-39 유래 경쇄의 전체 비장에서의 상대 mRNA 발현(y축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현에 정규화된다. ND: 비검출.
도 34는 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 경쇄 서열의 CDR3으로 4개의 히스티딘 잔기를 조작하기 위해 사용된 선택되는 돌연변이유발 프라이머의 서열 및 특성(%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 나타낸다. 서열 목록에서 사용된 이 프라이머에 대한 서열 번호는 하기 표에 포함된다. F = 정방향 프라이머, R = 역방향 프라이머.
도 35a는 각각 4개의 히스티딘 잔기 및 5개의 인간 Jκ에 의해 치환된 2개의 인간 Vκ 경쇄 분절을 포함하는 표적화 벡터의 ES 세포로의 도입 및 이를 갖는 이형접합성 마우스의 생성을 나타내고; 도 35b는 FLPo 효소를 사용한 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 나타낸다. 대부분의 실시형태에서, 달리 기재되지 않은 한, 채워진 형상 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다. 다이어그램은 크기조정으로 제시되지 않는다.
도 36은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 경쇄 서열의 CDR3으로 3개의 히스티딘 잔기를 조작하기 위해 사용된 선택되는 돌연변이유발 프라이머의 서열 및 특성(%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 나타낸다. 서열 목록에서 사용된 이 프라이머에 대한 서열 번호는 하기 표에 포함된다. F = 정방향 프라이머, R = 역방향 프라이머.
도 37a는 각각 3개의 히스티딘 잔기 및 5개의 인간 Jκ에 의해 치환된 2개의 인간 Vκ 경쇄 분절을 포함하는 표적화 벡터의 ES 세포로의 도입 및 이를 갖는 이형접합성 마우스의 생성을 나타내고; 도 37b는 FLPo 효소를 사용한 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 나타낸다. 대부분의 실시형태에서, 달리 기재되지 않은 한, 채워진 형상 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다. 다이어그램은 크기조정으로 제시되지 않는다.
도 38a는 CDR3 서열(상부 서열)에서 각각 3개의 히스티딘 잔기로 치환된 2개의 V 카파 분절(Vκ3-20 및 Vκ1-39)을 포함하는 마우스에서 발현된 IgM 카파 경쇄 가변 서열의 예시적인 아미노산 번역과의 인간 생식선 Vκ3-20 서열(하부 서열)에 의해 코딩된 아미노산 서열의 정렬을 나타내고; 정렬은 생식선 서열에 도입된 모든 3개의 히스티딘 치환을 보유하는 마우스에서 발현된 IgM 카파 사슬 가변 서열을 나타낸다. 도 38b는 CDR3 서열(각각의 정렬에서 상부 서열)에서 각각 3개의 히스티딘 잔기로 치환된 2개의 V 카파 분절(Vκ3-20 및 Vκ1-39)을 포함하는 마우스에서 발현된 IgM 카파 경쇄 가변 서열의 예시적인 아미노산 번역과의 인간 생식선 Vκ1-39 서열(각각의 정렬에서 하부 서열)에 의해 코딩된 아미노산 서열의 정렬을 나타내고; 상부 정렬은 생식선 서열에 도입된 모든 3개의 히스티딘 변형을 보유하는 마우스에서 발현된 IgM 카파 사슬 가변 서열을 나타내고, 하부 정렬은 생식선 서열에 도입된 모든 3개의 히스티딘 변형 중 2개를 보유하는 마우스에서 발현된 IgM 카파 사슬 가변 서열을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, Vκ의 마지막 위치에 도입된 히스티딘은 V-J 재배열 동안 소실될 수 있다.
도 39는 중쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(MAID6032; "UHC 마우스")을 포함하고 2개의 인간 Vκ 유전자 분절(예를 들어, 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20 유전자 분절) 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절(hJκ1-5; DLC-5J)을 함유하는 유전적으로 조작된 경쇄 좌위(MAID 1912HO)를 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 F2 마우스의 게놈 구조를 예시한다.
도 40a는 상부 패널에서 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 일중항에서 개폐되고 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 CD19+에서 개폐되고 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 40b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 수확된 비장에서의 CD19+ B 세포, 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi) 및 미성숙 B 세포(CD19+IgMhiIgDint)의 전체 수를 나타낸다.
도 41a는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 CD19+에서 개폐된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 41b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), Igκ+ B 세포(CD19+Igκ+) 및 Igλ+ B 세포(CD19+Igλ+)의 전체 수를 나타낸다.
도 42는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 수확된 비장에서의 B 세포 상의 IgM 표면 발현의 유세포 분석기 분석을 나타낸다. 세포를 IgM에 대해 형광성(PE-Cy7 접합) 항체에 의해 염색한다.
도 43a는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)에서 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 제1(가장 왼쪽) 입체 도면은, 미성숙 및 성숙 B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 제2(중간) 입체 도면은, T1(IgD-IgM+CD21loCD23-), T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3 B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제3(오른쪽) 입체 도면은, 변연부 B 세포를 생성시키는 더 작은 제1 집단 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 더 큰 제2 집단을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 43b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)에서 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 제1(왼쪽) 입체 도면은, 변연부 B 세포를 생성시키는 작은 집단 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 제2 집단을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 제2(중간) 입체 도면은, 변연부(MZ) 및 변연부 전구체(IgMhiIgDhiCD21hiCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 B220+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제3(오른쪽) 입체 도면은, FO-I(IgDhiIgMintCD21intCD23+) 및 FO-II(IgDhiIgMintCD21intCD23+) B 세포 집단을 나타내는, 성숙 B 세포 상의 IgD+ 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 44a는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 44b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)의 대퇴골로부터 수확된 골수에서의 림프구의 백분율, 세포/대퇴골의 전체 수 및 CD19+ B 세포의 수를 나타낸다.
도 45a는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 CD19+에 대해 개폐되고 ckit+ 및 CD43+에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 프로 및 프리 B 세포는 입체 도면에 표시되어 있다.
도 45b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032HO; DLC x UHC)의 대퇴골로부터 수확된 골수에서의 프리(CD19+CD43-ckit-) 및 프로(CD19+CD43+ ckit +) B 세포의 수를 나타낸다.
도 46a는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 46b는 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 세포/대퇴골, 미성숙 B(B220intIgM+) 및 성숙 B(B220hiIgM+) 세포의 전체 수를 나타낸다.
도 47은 유전적으로 변형된 대조군 마우스(VI3; 1293HO 1460HO) 및 중쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(MAID 1912HO 6032 HO; DLC x UHC)의 대퇴골로부터 단리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 48은 족척 면역화 전에, 제1 회차의 족척 면역화 후 23일에, 제1 회차의 족척 면역화 후 5주에 및 제2 회차의 족척 면역화 후에 마우스 혈청(야생형 또는 1912HO 6031 HET(동형접합성 DLC x 이형접합성 UHC))에서의 항원 특이적 mIgG의 수치를 나타낸다.
도 49는 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(즉, 카파 경쇄 불변 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 함유하는 유전적으로 변형된 F1 마우스의 게놈 구조를 예시한다.
도 50a는 상부 패널에서 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 CD19+에서 개폐되고 ckit+ 및 CD43+에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 프로 및 프리 B 세포는 하부 패널의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 50b는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)의 대퇴골로부터 수확된 골수에서의 프로(CD19+CD43+ ckit +) 및 프리(CD19+CD43-ckit-) B 세포의 수를 나타낸다.
도 51a는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 51b는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 B(CD19+) 및 프로/프리 B(IgM-B220+) 세포의 전체 수를 나타낸다.
도 51c는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 미성숙 B(B220intIgM+) 및 성숙 B(B220hiIgM+) 세포의 수를 나타낸다.
도 52는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)의 대퇴골로부터 단리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 53a는 상부 패널에서 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 일중항에서 개폐되고 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 CD19+에서 개폐되고 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 성숙(카파에서 WT에 대해 56.9, hVH3-23/D/JH4에 대해 43) 및 이행성(카파에서 WT에 대해 26.8, hVH3-23/D/JH4에 대해 34). B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 53b는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 수확된 비장에서의 CD19+ B 세포, 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi) 및 이행성 B 세포(CD19+IgMhiIgDint)의 전체 수를 나타낸다.
도 54a는 카파 경쇄 좌위에서 야생형 마우스(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(hVH3-23/D/JH4)로부터 CD19+에서 개폐된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 54b는 카파 경쇄 좌위에서 야생형(WT) 및 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), Igκ+ B 세포(CD19+Igκ+) 및 Igλ+ B 세포(CD19+Igλ+)의 전체 수를 나타낸다.
도 55는 야생형 마우스와 비교하여 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(hVH3-23/D/JH4)의 비장 구획에서의 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 제1(왼쪽) 입체 도면은, 미성숙 및 성숙 B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 제2(중간) 입체 도면은, T1, T2 및 T3 B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 제3(오른쪽) 입체 도면은, 변연부 B 세포를 생성시키는 더 작은 제1 집단 및 소포성(FO) B 세포를 생성시키는 더 큰 제2 집단을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+(CD35+) 및 IgM+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 56은 카파 경쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성(MAID 6079HO; 동형접합성 "카파 상의 UHC 마우스")이고 중쇄 좌위에서의 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성(MAID 1994HO; 중쇄 상의 카파("KoH") 마우스)인 유전적으로 변형된 F2 마우스의 게놈 구조를 예시한다.
도 57a는 상부 패널에서 벨로시뮨(등록상표)(VI3) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스로부터 B 세포 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 하부 패널은 벨로시뮨(등록상표)(VI3) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스로부터 CD19+에서 개폐되고 ckit+ 및 CD43+에 대해 염색된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 프로 및 프리 B 세포는 하부 패널의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 57b는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)의 대퇴골로부터 수확된 골수에서의 B 세포(CD19+)의 전체 수 및 프로(CD19+CD43+ ckit +) 및 프리(CD19+CD43-ckit-) B 세포의 수를 나타낸다. 수는 대퇴골당 세포의 전체 수 및 세포 백분율 둘 다로 제시되어 있다.
도 58a는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)로부터 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 일중항에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프리 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 58b는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)의 대퇴골로부터 단리된 골수에서의 미성숙 B(B220intIgM+) 및 성숙 B(B220hiIgM+) 세포의 수를 나타낸다. 수는 대퇴골당 세포의 전체 수 및 세포 백분율 둘 다로 제시되어 있다.
도 59는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)의 대퇴골로부터 단리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포에서 개폐된 골수의 대표적인 입체 도면을 나타낸다.
도 60a는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(VI3; 1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)로부터 CD19+에서 개폐되고 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 입체 도면을 나타낸다. 성숙 및 이행성/미성숙 B 세포는 각각의 입체 도면에 표시되어 있다.
도 60b는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)로부터 수확된 비장에서의 CD19+ B 세포, 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi) 및 이행성 B 세포(CD19+IgMhiIgDlo)의 전체 수를 나타낸다.
도 61은 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)로부터 수확된 비장에서의 B 세포(CD19+), Igκ+ B 세포(CD19+Igκ+) 및 Igλ+ B 세포(CD19+Igλ+)의 전체 수를 나타낸다. 수는 림프구의 절대 세포 수 및 세포 백분율 둘 다로 제시되어 있다.
도 62는 벨로시뮨(등록상표) 마우스(1242HO 1640HO) 및 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성이고 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(1994HO 6079HO)의 비장 구획에서의 말초 B 세포 발생을 나타낸다. 상부 입체 도면은, 미성숙 및 성숙 B 세포를 나타내는, CD19+에서 개폐된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 나타낸다. 하부 입체 도면은, T1, T2 및 T3 B 세포 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포 상의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 나타낸다. 각각의 개폐된 구역 내의 세포의 백분율이 도시되어 있다.
본 발명은 특정한 방법, 및 기재된 실험 조건에 제한되지 않는데, 이 방법 및 조건이 변경될 수 있기 때문이다. 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 한정되므로, 본 명세서에서 사용된 전문용어가 오직 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 제한인 것으로 의도되지 않는 것으로 또한 이해된다.
달리 규정되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 용어 및 구절은, 반대사항이 명확히 표시되지 않거나 용어 또는 구절이 사용된 상황으로부터 명백히 명확하지 않은 한, 이 용어 및 구절이 당해 분야에서 얻은 의미를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정한 방법 및 물질이 이제 기재되어 있다. 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
용어 "항체"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)의 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 구역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 구역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 구역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은, 프레임워크 구역(framework region: FR)이라 칭하는 더 보존된 구역과 배치되는, 상보성 결정 구역(complementarity determining region: CDR)이라 칭하는 초가변의 구역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 하기 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 축약될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 축약될 수 있다). 용어 "고친화도" 항체는 KD가 이의 표적 에피토프와 관련하여 약 10-9M 이하(예를 들어, 약 1x10-9M, 1x10-10M, 1x10-11M, 또는 약 1x10-12M)인 항체를 의미한다. 일 실시형태에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어 비아코어(BIACORE)(상표명)에 의해 측정된다. 또 다른 실시형태에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
구절 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 2개의 비동일한 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 2개의 상이한 분자 상의 상이한 에피토프(예를 들어, 2개의 상이한 면역원 상의 상이한 에피토프) 또는 동일한 분자 상의 상이한 에피토프(예를 들어, 동일한 면역원 상의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적은, 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 이상의 차수의 양일 것이고, 그 반대도 그러하다. 이중특이적 항체에 의해 특이적으로 결합된 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적(예를 들어, 동일한 또는 상이한 단백질) 상에 있을 수 있다. 예시적인 이중특이적 항체는 종양 항원에 특이적인 제1 중쇄 및 세포독성 마커, 예를 들어 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등) 또는 T 세포 마커(예를 들어, CD3, CD28 등)에 특이적인 제2 중쇄를 갖는 것을 포함한다. 추가로, 제2 중쇄 가변 도메인은 상이한 원하는 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원에 특이적인 제1 중쇄 및 독소에 특이적인 제2 중쇄를 갖는 이중특이적 항체는 종양 세포에 독소(예를 들어, 사포닌, 빈카 알칼로이드 등)를 전달하도록 쌍 지을 수 있다. 다른 예시적인 이중특이적 항체는 활성화 수용체(예를 들어, B 세포 수용체, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαRI, T 세포 수용체 등)에 특이적인 제1 중쇄 및 저해 수용체(예를 들어, FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a 등)에 대해 특이적인 제2 중쇄를 갖는 것을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체는 세포 활성화와 관련된 치료학적 병증(예를 들어, 알레르기 및 천식)을 위해 작제될 수 있다. 예를 들어, 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 합함으로써 이중특이적 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 코딩하는 핵산 서열은 동일한 또는 상이한 중쇄 불변 구역을 코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 통상적인 이중특이적 항체는, 각각 3개의 중쇄 CDR, 이어서 (N 말단에서 C 말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는 2개의 중쇄, 및 에피토프 결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄와 회합될 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 에피토프 결합 구역에 의해 결합된 1개 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 에피토프 중 하나 또는 둘 다에 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. 유사하게, 용어 "삼중특이적 항체"는 3개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 균주), 마이코박테리아(mycobacteria) 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. 세레비시아제(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스(baculovirus) 감염된 곤충 세포, 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma) 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 진핵생물이고, 하기 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), 헬라(HeLa), HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), 주카트(Jurkat), 다우디(Daudi), A431(상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리(Sertoli) 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상술된 세포로부터 유래한 세포주. 몇몇 실시형태에서, 세포는 1개 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6(상표명) 세포)를 포함한다.
구절 "상보성 결정 구역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 구역에서 2개의 프레임워크 구역 사이에서 보통(즉, 야생형 동물에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어 생식선 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열, 및 예를 들어 나이브(naive) 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 코딩될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이(예를 들어, 동물의 생식선에서 코딩된 서열로부터 변함)되고/되거나, 인간화되고/되거나, 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 변형될 수 있다. (예를 들어, CDR3에 대해) 몇몇 상황에서, (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 인접하지 않지만, 예를 들어 서열의 스플라이싱 또는 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 인접한, 2개 이상의 서열(예를 들어, 생식선 서열)에 의해 CDR은 코딩될 수 있다.
용어 "보존적"은, 보존적 아미노산 치환을 기술하도록 사용될 때, 아미노산 잔기의 유사한 화학 특성(예를 들어, 전하 또는 소수화도)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 포함한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 있는 기능적 특성, 예를 들어 원하는 친화도로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 가변 구역의 능력을 실질적으로 변경하지 않을 것이다. 유사한 화학 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예는 지방족 측쇄, 예컨대 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 지방족-하이드록실 측쇄, 예컨대 세린 및 트레오닌; 아마이드 함유 측쇄, 예컨대 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 측쇄, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 염기성 측쇄, 예컨대 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 산성 측쇄, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산; 및 황 함유 측쇄, 예컨대 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존적 아미노산 치환기는 예를 들어 발린/류신/아이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에서 사용되는 바와 같은 단백질에서의 임의의 네이티브 잔기의 알라닌에 의한 치환일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 문헌[Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(PAM250 log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 적당히 보존적인 치환이고, 치환은 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음의 값을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서의 잔기 위치는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 작용성 단편(예를 들어, B 세포로부터 예를 들어 발현 및 분비를 허용하는 단편)에서의 잔기 위치는 아미노산 서열이 본 명세서에서 기재된 경쇄와 동일하지 않지만, 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다.
구절 "에피토프 결합 단백질"은 적어도 1개의 CDR을 갖고, 에피토프를 선택적으로 인식할 수 있는, 예를 들어 KD가 약 1 마이크로몰 이하(예를 들어, 약 1x10-6M, 1x10-7M, 1x10-9M, 1x10-9M, 1x10-10M, 1x10-11M 또는 약 1x10-12M인 KD)인 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료학적 에피토프 결합 단백질(예를 들어, 치료학적 항체)은 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD를 흔히 요한다.
구절 "작용성 단편"은 발현되고 분비되고, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프 결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인지는 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위 또는 피코몰 범위의 KD를 갖는 것을 포함한다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손으로 전달될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터 면역글로불린 중쇄 불변 구역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 달리 기재되지 않은 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 구역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 통상적인 중쇄는, 가변 도메인(N 말단으로부터 C 말단으로) 이후에, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 작용성 단편은 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있고(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인식함), 세포를 발현하고 이로부터 분비할 수 있고, 적어도 1개의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 VH, DH 및 JH 분절의 레퍼토리로부터 유래한 VH, DH 및 JH 분절을 일반적으로 포함하는, 가변 구역 유전자 서열에 의해 코딩된다. 다양한 유기체에 대한 V, D 및 J 중쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스(www.imgt.org.)에서 확인될 수 있다.
용어 "동일성"은, 서열과 관련하여 사용될 때, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하도록 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 측정되는 동일성을 포함한다. 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에서, 10.0의 오픈 갭 패널티(open gap penalty), 0.1의 연장 갭 패널티(extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v. 1.83 (슬로우(slow)) 정렬을 이용하여, 고넷(Gonnet) 유사성 매트릭스(MACVECTOR(상표명) 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 이용하여 동일성은 결정된다. 서열의 동일성과 관련하여 비교되는 서열의 길이는 특정한 서열에 따라 달라질 것이지만, 경쇄 불변 도메인의 경우에, 길이는 표준형(canonical) 경쇄 불변 도메인을 형성하도록 자가 회합할 수 있는, 예를 들어 베타 가닥을 포함하는 2개의 베타 시트를 형성할 수 있고 인간 또는 마우스의 적어도 1개의 CH1 도메인과 상호작용할 수 있는, 경쇄 불변 도메인으로 폴딩하기에 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다. CH1 도메인의 경우에, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 2개의 베타 시트를 형성할 수 있고, 마우스 또는 인간의 적어도 1개의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 CH1 도메인으로 폴딩하기에 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다.
구절 "면역글로불린 분자"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 상이할 수 있고, 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다.
구절 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 달리 기재되지 않은 한, 인간 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB, 및 대용(surrogate) 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 달리 기재되지 않은 한 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 구역을 통상적으로 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 구역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 V 및 J 분절의 레퍼토리로부터 유래한, VL 및 JL 분절을 일반적으로 포함하는 경쇄 가변 구역 유전자 서열에 의해 코딩된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스(www.imgt.org.)에서 확인될 수 있다. 경쇄는 예를 들어 이들이 나타나는 에피토프 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 에피토프 또는 제2 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 에피토프 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 1개 이상의 에피토프에 결합하고 인식하거나, 중쇄가 이것과 결합하고 인식하는 것을 돕는 것을 포함한다. 공통 또는 보편적 경쇄는 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자로부터 유래한 것을 포함하고, 이의 체세포 돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다. 이중 경쇄(DLC)는 2개 이하의 인간 Vκ 분절, 예를 들어 인간 Vκ1-39 유전자 분절 및 인간 Vκ3-20 유전자 분절을 포함하는 경쇄 좌위로부터 유래한 것을 포함하고, 이의 체세포 돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다.
구절 "체세포 초돌연변이된"은 종류 변환(class-switching)을 겪는 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함하고, 종류 변환된 B 세포에서의 면역글로불린 가변 구역의 핵산 서열(예를 들어, 중쇄 가변 도메인을 코딩하거나 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열)은, 예를 들어 종류 변환을 겪지 않은 B 세포와 종류 변환을 겪은 B 세포 사이의 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이와 같이, 종류 변환 전의 B 세포에서의 핵산 서열에 동일하지 않다. "체세포 돌연변이된"은 친화도 성숙되지 않은 B 세포에서의 상응하는 면역글로불린 가변 구역 서열(즉, 생식선 세포의 게놈에서의 서열)에 동일하지 않은 친화도 성숙된 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함한다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 또한 관심 있는 에피토프에 대한 B 세포의 노출 후 B 세포로부터의 면역글로불린 가변 구역 핵산 서열에 대한 언급을 포함하고, 핵산 서열은 관심 있는 에피토프에 대한 B 세포의 노출 전에 상응하는 핵산 서열과 다르다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 면역원 공격에 대한 반응에서 인간 면역글로불린 가변 구역 핵산 서열을 갖는 마우스와 같은 동물에서 생성되고, 이러한 동물에서 선천적으로 작동적인 선택 과정으로부터 생긴 항체로부터의 서열을 의미한다.
용어 "재배열되지 않은"은, 핵산 서열에 대한 언급 시, 동물 세포의 생식선에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "가변 도메인"은 N 말단으로부터 C 말단으로의 서열에서(달리 기재되지 않은 한) 하기 아미노산 구역을 포함하는 (원하는 바대로 변형된) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 작동 가능하게 연결된 성분이 이의 의도되는 방식으로 작용하는 관계를 의미한다. 일 경우에, 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절을 보유하도록 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 경우에, 면역글로불린 가변 구역(또는 V(D)J 분절)의 핵산 서열은, 서열 사이의 적절한 재조합이 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열로 허용되도록, 면역글로불린 불변 구역의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로 "작용성"은, 예를 들어 작용성 폴리펩타이드에 대한 언급 시, 네이티브 단백질과 보통 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 경우에, 작용성 면역글로불린 유전자 분절은 재배열된 면역글로불린 유전자 서열을 생성하도록 생산적인 재배열할 수 있는 가변 유전자 분절을 포함할 수 있다.
"중성 pH"는 약 7.0 내지 약 8.0의 pH, 예를 들어 약 7.0 내지 약 7.4, 예를 들어 약 7.2 내지 약 7.4의 pH, 예를 들어 생리학적 pH를 포함한다. "산성 pH"는 6.0 이하의 pH, 예를 들어 약 5.0 내지 약 6.0의 pH, 약 5.75 내지 약 6.0의 pH, 예를 들어 엔도솜 또는 리소좀 구획의 pH를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로 용어 "다형 변이체"는 1개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 소정의 서열과 비교하여 상이한 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로 치환된 서열을 포함한다. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절(VH 유전자)의 다형 대립유전자는 주로 코딩 구역 내의 단일 뉴클레오타이드 차이 및 유전자 분절의 삽입/결실의 결과이고, 이들 둘 다 면역글로불린 분자에 작용성 결과를 갖는 가능성을 갖는다. 인간 면역글로불린 VH 유전자의 흔한 다형 대립유전자의 예는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 제13/653,456호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조).
용어 "실질적인" 또는 "실질적으로 모든"은, 유전자 분절(예를 들어, "실질적으로 모든" V, D, 또는 J 유전자 분절)의 양을 언급하도록 사용될 때, 작용성 및 비작용성 유전자 분절 둘 다를 포함하고, 다양한 실시형태에서, 예를 들어 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 모든 V, D, 또는 J 유전자 분절을 포함한다. 다양한 실시형태에서, "실질적으로 모든" 유전자 분절은 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 작용성(즉, 비-위유전자) 유전자 분절)을 포함한다.
재배열된 중쇄 가변 구역 유전자 서열 및 임의로 재배열되지 않은 경쇄 가변 유전자 분절의 제한된 레퍼토리를 포함하는 비인간 동물
이중 항원 결합 특성을 갖는 다양한 이중특이적 항체가 개발되었지만, 종래의 이중특이적 항체에서, 중쇄 또는 경쇄 가변 구역 중 어느 하나가 단독으로 각각의 별개의 항원 결정부위에 대한 결합에 기여하고, 반면 규칙적 항체에서, 경쇄 및 중쇄 가변 구역 둘 다가 동일한 항원 결정부위에 대한 결합에 기여할 수 있으므로, 종래의 이중특이적 항체에서의 경쇄 또는 중쇄 가변 구역의 특이성 및 친화도는 어느 정도 희생되어야 한다.
이후, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합하는 능력을 갖는 경쇄 가변 구역의 생성은 항원 결합 분자(예를 들어, VL과 융합된 (예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된) 중쇄 불변 구역을 포함하는 이중특이적 결합 분자)에서 사용하기 위한 경쇄 가변 도메인(VL), 특히 동일하거나 유사한 중쇄 불변 구역, 그러나 상이한 특이성 및/또는 친화도로 VL을 갖는 이종이합체를 포함하는, 중쇄 가변 도메인을 포함하지 않는 것을 제조하기에 유용할 수 있다.
중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 이러한 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위한 일 접근법은 더 다양한 항원 결합 레퍼토리를 갖는 경쇄 CDR3을 생성하도록 경쇄의 가변 구역 또는 도메인(VL)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 선택적 압박을 가하는 것이다. 본 명세서에 개시된 바대로, 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 생성함으로써 이를 성취할 수 있다. 중쇄 서열이 이 동물에서 공통 또는 보편적(즉, 동일한 또는 매우 유사한) 서열로 제한되므로, 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 유전자)은, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원 결정부위에 결합할 수 있는, 더 다양하고 효과적인 항원 결합 특성을 갖는 경쇄 CDR3을 제조하도록 강제될 것이다. 더욱이, 본 명세서에 개시된 바대로, (예를 들어, 상동성 재조합 매개 유전자 표적화에 의한) 생식선 가변 구역 유전자 분절의 정확한 대체는 부분적 인간 면역글로불린 좌위를 갖는 동물(예를 들어, 마우스)을 제조하도록 허용한다. 부분적 인간 면역글로불린 좌위가 보통 재배열하고, 초돌연변이하고, 체세포 돌연변이(예를 들어, 종류 변환)하므로, 부분적 인간 면역글로불린 좌위는 인간 가변 구역을 포함하는 동물에서 항체를 생성한다. 이 동물은 야생형 동물과 실질적으로 유사한 체액 면역계를 나타내고, 동물이 인간 가변 구역 유전자 분절의 완전 레퍼토리가 부족한 경우에도 정상 세포 집단 및 정상 림프성 장기 구조를 나타낸다. 이 동물(예를 들어, 마우스)의 면역화는 가변 유전자 분절 사용빈도의 광범위한 다양성을 나타내는 튼튼한 체액 반응을 발생시킨다. 가변 구역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 확인되고 클로닝되고 이후 (예를 들어, 실험실내 시스템에서) 선택받은 임의의 서열, 예를 들어 특정한 용도에 적합한 임의의 면역글로불린 이소형과 융합되어, 전체적으로 인간 서열로부터 유래한 항체 또는 항원 결합 단백질을 생성시킬 수 있다.
또한, 상기 기재된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열과 조합하여, 제한된(한정된) 경쇄 가변 구역 유전자 분절 레퍼토리, 예를 들어 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 VL 유전자 분절을 포함하는 제한된 경쇄 가변 분절 레퍼토리를 갖는 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트)을 이용함으로써(예를 들어, 이중 경쇄 또는 "DLC", 미국 특허 출원 공보 제2013/0198880호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)), 면역글로불린 중쇄 가변 도메인과 더 효과적으로 쌍을 지을 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이 생성될 수 있다. 더욱이, 예를 들어 1개 이상의 히스티딘 코돈의 부가 또는 히스티딘 코돈에 의한 1개 이상의 비히스티딘 코돈의 치환을 통해, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 게놈에 제한된 경쇄 가변 유전자 분절로 히스티딘 코돈을 도입함으로써, 항원 결합 단백질(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체)에 대해 개선된 pH 의존적 재생력을 부여할 수 있는 경쇄 가변 구역 아미노산 서열이 생성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물은 더 높은 항체 수율을 제공하면서 동시에 다양성을 제한하여, 단일의 재배열된 경쇄 가변 구역을 포함하는 비인간 동물(예를 들어, 보편적 경쇄("Universal Light Chain: ULC") 마우스; 예를 들어, 미국 예비등록 공보 제2013/0185821호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨) 참조)에서 생성된 경쇄와 중쇄의 성공적인 쌍 지음의 확률을 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄는 그 자체가 항원 결합 특성을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 이의 경쇄에 의해 야기된 항원 특이성을 나타내는 항원 결합 단백질을 생성하도록 유도될 수 있다(예를 들어, 마우스 또는 래트의 면역글로불린 중쇄 레퍼토리를 제한함으로써; 예를 들어, 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 좌위에 의해 마우스 또는 래트 중쇄 좌위를 대체함으로써). 몇몇 실시형태에서, 이러한 동물에서 생성된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 이의 경쇄 결합을 통해 특정한 제1 에피토프(예를 들어, 이팩터 항원, 세포독성 분자, Fc 수용체, 독소, 활성화 또는 저해 수용체, T 세포 마커, 면역글로불린 수송체 등)에 대해 특이적일 것이다. 비인간 동물로부터 유래한 이러한 에피토프 특이적 인간 경쇄는 제한된 경쇄 레퍼토리를 갖는 마우스, 예를 들어 ULC 마우스 또는 래트로부터 유래한 인간 중쇄와 동시 발현될 수 있고, 중쇄는 제2 에피토프(예를 들어, 상이한 항원 상의 제2 에피토프)에 결합하는 이의 능력에 기초하여 선택된다.
다양한 양상에서, 생식선 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 면역원성이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 중쇄 불변 도메인에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인의 2개의 카피, 3개의 카피, 4개 이상의 카피를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 코딩한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개의 카피를 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 카피를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 좌위는 중쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다.
다른 양상에서, 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 면역글로불린 경쇄 좌위(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 좌위)를 포함하도록 유전적으로 조작된 비인간 동물이 제공된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 예비설계된 VDJ 구역; 즉, 공통 또는 보편적 중쇄 서열)은 재배열된 중쇄 서열을 카파 또는 람다 중 어느 하나의 마우스 또는 래트 경쇄 좌위로 표적화함으로써 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 발현된 재배열된 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 면역원성이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 경쇄 불변 도메인에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 2개의 카피, 3개의 카피, 4개 이상의 카피를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 카피를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 좌위는 경쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다
다양한 양상에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 면역글로불린 경쇄 좌위는, 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 경쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 VL 유전자 분절; 및 1개 이상의 인간 JL 유전자 분절의 제한된 레퍼토리를 포함한다. 따라서, 게놈에서 (ⅰ) 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 가변 구역 유전자 분절은 항체의 인간 가변 도메인을 재배열하고 코딩할 수 있고, 비인간 동물은 내인성 VL 유전자 분절을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 5개의 인간 Jκ 유전자 분절, 예를 들어 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 좌위는 Vκ1-39 및 Vκ3-20인 2개의 인간 VL 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 인간 VL 유전자 분절 및 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 좌위, 예를 들어 내인성 카파 경쇄 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 마우스는 작용성 λ 경쇄 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 마우스는 비작용성 λ 경쇄 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 인간 VH, 1개 이상의 인간 DH 및 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 서열에 작동 가능하게 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 게놈에 (ⅰ) 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위, 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 야생형 마우스 또는 면역글로불린 좌위의 다른 변형을 함유하는 마우스(즉, 유전적으로 변형된 대조군 마우스; 예를 들어, 벨로시뮨(등록상표) 마우스, 여기서 마우스의 체액 면역계는 야생형 마우스와 같이 작용함)에서 관찰되는 수와 실질적으로 동일한 CD19+ B 세포 수 및 성숙 B 세포 수를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 비장에서 미성숙 B 세포 수의 증가를 나타낸다. 구체적인 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 비장에서 미성숙 B 세포 수의 약 2배, 약 3배, 약 4배 또는 약 5배 이상의 배수 증가를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 또한 비장 B 세포에서 카파 및 감마 경쇄 사용빈도와 관련하여 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 실질적으로 유사하다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 비장 B 세포 상에 증가한 표면 IgM(즉, 세포마다 더 많은 IgM 표면 발현)을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 비장 구획에서의 B 세포 발생의 다양한 단계를 통한 변경된 말초 B 세포 발생, 예를 들어 미성숙, T1 및/또는 변연부 B 세포의 증가를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스에서 나타난 수와 실질적으로 유사한 골수 구획에서의 CD19+ B 세포의 수를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 골수에서의 더 적은 프로-B 세포를 나타낸다. 구체적인 실시형태에서, 골수 구획에서의 프로-B 세포의 수는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배 이상 감소한다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 골수에서의 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배 등의 더 적은 미성숙 및/또는 성숙 B 세포를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 마우스는 유전적으로 변형된 대조군 마우스와 비교하여 람다 경쇄 유전자의 사용빈도에 대해 골수 구획에서 약간의 선호도(예를 들어, 2배 증가)를 나타낸다.
또 다른 양상에서, (a) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (b) 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 예비설계된 VDJ 구역으로부터의 재배열된 중쇄(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 즉, 공통 또는 보편적 중쇄 서열)는 재배열된 중쇄 서열을 카파 또는 람다 중 어느 하나의 마우스 경쇄 좌위로 표적화함으로써 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 다른 실시형태에서처럼, 이 유전적으로 조작된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재할 수 있다. 중쇄 불변 구역 유전자 서열과 작동 가능한 연결에 있는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 미국 예비등록 공보 제2012/0096572호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, 카파 경쇄 유전자)을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 야생형 마우스 또는 면역글로불린 좌위에서 다른 변형을 갖는 유전적으로 변형된 마우스(즉, 유전적으로 변형된 대조군 마우스; 예를 들어, 벨로시뮨(등록상표) 마우스, 여기서 마우스의 체액 면역계는 야생형 마우스와 같이 작용함)에 대해 변경된 골수에서의 CD19+ 및 프리-B 세포 빈도를 제시한다. 구체적인 실시형태에서, 골수에서의 CD19+ B 세포 및 프리-B 세포 수는 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위 대조군 마우스와 비교하여 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 작다. 구체적인 실시형태에서, 골수에서의 미성숙 B 세포의 수는 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위 대조군 마우스와 비교하여 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 작다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, 카파 경쇄 유전자)을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 골수 세포에서 람다 경쇄 유전자를 발현하지 않거나 실질적으로 발현하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, 카파 경쇄 유전자)을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위 대조군 마우스와 비교하여 감소한 비장 B 세포의 수치를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 비장 B 세포 및 성숙 B 세포의 수치는 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위 대조군 마우스와 비교하여 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, 카파 경쇄 유전자)을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 비장 B 세포에서 람다 경쇄 유전자를 발현하지 않거나 실질적으로 발현하지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, 카파 경쇄 유전자)을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위 대조군 마우스와 비교하여 비장에서 T1 단계에서 세포의 빈도의 증가를 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 마우스(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위를 갖는 마우스)에서 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인을 이용하는 실시형태가 본 명세서에 광범위하게 기재되어 있지만, 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 다른 비인간 동물이 또한 제공된다. 이러한 비인간 동물은 예를 들어 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 숫소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들어, 마모셋, 레서스 원숭이) 등을 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있는 임의의 동물을 포함한다. 예를 들어, 적합한 유전적으로 변형 가능한 ES 세포가 실제로 이용 가능하지 않은 이 비인간 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조하는 다른 방법을 이용한다. 이러한 방법은 예를 들어 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 다능성 세포)을 변형시키는 것 및 유전적으로 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들어 제핵 난모세포로 전달하기 위해 체세포 세포 핵 전달(somatic cell nuclear transfer: SCNT)을 이용하는 것 및 배아를 형성하는 적합한 조건 하에 비인간 동물에서 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 수태시키는 것을 포함한다. 비인간 동물 게놈(예를 들어, 돼재, 암소, 설치류, 닭 등 게놈)을 변형시키는 방법은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 게놈을 변형시키기 위해, 예를 들어 아연 손가락 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN) 또는 전사 활성자 유사 이팩터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN)를 이용하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 예를 들어 슈퍼패밀리 디포도이데아(Dipodoidea) 또는 무로이데아(Muroidea)의 작은 포유동물이다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 슈퍼패밀리 무로이데아로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로마이스시다에(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스 유사 햄스터), 크리세티다에(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴 월드 래트(New World rat) 및 마우스, 들쥐), 무리다에(Muridae)(트루 마우스(true mice) 및 래트, 게르빌, 스파이니(spiny) 마우스, 크레스티드(crested) 래트)), 네소마이다에(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스, 위드-테일드(with-tailed) 래트, 말라가시(Malagasy) 래트 및 마우스), 플라타칸토마이다에(Platacanthomyidae)(예를 들어, 스파이니 동면쥐류), 및 스팔라시다에(Spalacidae)(예를 들어, 몰 래트(mole rate), 밤부 래트 및 조코(zokor))로부터 선택되는 패밀리 유래이다. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(패밀리 무리다에), 게르빌, 스파이니 마우스 및 크레스티드 래트로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 패밀리 무리다에의 구성원 유래이다. 몇몇 실시형태에서, 동물은 설치류이다. 구체적인 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스이다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6N, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 균주의 마우스인 설치류이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 129 균주이다. 몇몇 실시형태에서, 129 균주는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2로 이루어진 군으로부터 선택된다(예를 들어, 문헌[Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836], 참조, 또한, 문헌[Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines] 참조). 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상술된 129 균주와 상술된 C57BL 균주(예를 들어, C57BL/6 균주)의 혼합이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 상술된 129 균주의 혼합 또는 상술된 C57BL/6 균주의 혼합이다. 몇몇 실시형태에서, 혼합의 129 균주는 129S6(129/SvEvTac) 균주이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 129/SvEv 유래 균주와 C57BL/6 유래 균주의 혼합이다. 구체적인 실시형태에서, 마우스는 문헌[Auerbach et al . 2000 BioTechniques 29:1024-1032]에 기재된 바대로 129/SvEv 유래 균주와 C57BL/6 유래 균주의 혼합이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주, 예를 들어 BALB/c 균주이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주(예를 들어, BALB/c 균주)와 또 다른 상술된 균주의 혼합이다.
몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 래트이다. 몇몇 실시형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 균주, 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 균주, 피셔(Fischer) 균주, F344, F6, ACI, 및 다크 아구티(Dark Agouti)(DA)로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 래트 균주는 위스타, LEA, 스프라그 다울리, 피셔, F344, F6, ACI 및 다크 아구티(DA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주의 2개 이상의 혼합이다.
몇몇 실시형태에서, 생식선 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 야생형 마우스에 비해 실질적으로 정상인 비장 성숙 및 미성숙 B 세포 집단을 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 유전적으로 변형된 마우스는 비장 B 세포에서 야생형에 비해 경쇄 람다 유전자 서열의 사용빈도의 약간의 감소를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 이러한 유전적으로 변형된 마우스는 비장 B 세포에서 야생형보다, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮은 빈도로, 경쇄 람다 유전자 서열을 이용한다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 유전적으로 변형된 마우스는 야생형에 비해 T1 집단 비장 B 세포의 약간의 감소 및 변연부 비장 B 세포의 증가를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 유전적으로 변형된 마우스는 골수에서 거의 정상인 B 세포 집단을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 유전적으로 변형된 마우스는, 람다 유전자 서열이 야생형에서 사용되는 빈도의 반 또는 반보다 적은 빈도로, 람다 유전자 서열을 이용한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 재배열된 중쇄 가변 도메인(예를 들어, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열)은 인간 V, D 및 J 유전자 서열 또는 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인은 인간 생식선 V 분절, 인간 생식선 D 분절 및 인간 생식선 J 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 VH 분절은 인간 집단에서 관찰된 변이체에 상응한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 인간 V 유전자 분절은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 V 분절은 VH3-23 또는 이들의 다형 변이체이다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 인간 D 유전자 분절은 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 또는 비인간 동물 중쇄 불변 구역 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 불변 구역 서열은 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 인간 J 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고 이로부터 발현된 재배열된 중쇄 가변 도메인은 인간 VH3-23/X1X2/J의 서열(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, X1은 Gly이고, X2는 Tyr이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인은 인간 VH3-23/X1X2/JH4-4의 서열(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, X2는 페닐기를 포함하는 아미노산이다. 구체적인 실시형태에서, X2는 Tyr 및 Phe로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 동물에서 자가반응성(비면역원성)이 아닌 인간 D 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 성숙 B 세포의 중쇄 가변 서열에서 발현될 수 있는 인간 D 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, D 분절은 인간 VH, 인간 D 및 인간 JH 분절을 포함하는 인간화 면역글로불린 좌위를 포함하는 마우스에서 발현된 분절이다.
다양한 실시형태는 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스로부터 유래한 특징 또는 서열 정보를 이용하거나 포함한다. 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스는, 내인성 좌위에서 상응하는 인간 면역글로불린 가변 구역에 의한, 마우스 면역글로불린 중쇄(IgH) 및 면역글로불린 경쇄(예를 들어, κ 경쇄, Igκ)의 생식선 가변 구역의 정확한 대규모 대체를 함유한다(예를 들어, US 제6,596,541호 및 US 제8,502,018호(이의 전체 내용은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨) 참조). 종합하면, 마우스 좌위의 약 6 메가 염기는 인간 게놈 서열의 약 1.5 메가 염기로 대체된다. 이 정확한 대체는 인간 가변 구역 및 마우스 불변 구역을 갖는 중쇄 및 경쇄를 만드는 하이브리드 면역글로불린 좌위를 갖는 마우스를 생성시킨다. 마우스 VH-D-JH 및 Vκ-Jκ 분절의 정확한 대체는 하이브리드 면역글로불린 좌위에서 플랭킹 마우스 서열이 온전하고 작용성으로 남게 한다. 마우스의 체액 면역계는 야생형 마우스와 같이 작용한다. B 세포 발생은 임의의 상당한 관점에서 방해되지 않고, 인간 가변 구역의 풍부한 다양성이 항원 공격 시 마우스에서 생성된다. 더구나, 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스는, 야생형 마우스로부터 상당한 관점에서만 상이한, 면역화에 대해 본질적으로 정상인 야생형 반응을 나타내고, 면역화에 대한 반응에서 생성된 가변 구역은 완전한 인간이다. 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스는 중쇄 및 κ 경쇄에 대한 면역글로불린 유전자 분절이 인간 및 마우스에서 유사하게 재배열하므로 가능하다. 좌위가 동일하지 않지만, 인간 면역글로불린 좌위로부터 동등한 서열을 기본적으로 커버하는 인접한 인간 게놈 서열의 약 100만 개의 염기에 의해 모든 VH, D 및 JH 유전자 분절을 함유하는 인접한 마우스 서열의 약 300만 개의 염기 쌍을 대체함으로써, 이들은 중쇄 가변 유전자 좌위의 인간화가 성취될 수 있도록 충분히 유사하다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, D 분절은 항원에 의해 면역화된 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스의 성숙 B 세포에서 발현된 중쇄로부터 유래하고, D 분절은 중쇄 CDR3 서열에 대한 2개 이하의 아미노산에 기여한다.
특정한 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 면역글로불린 중쇄 좌위(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위)를 포함하는 벨로시뮨(등록상표) 마우스가 제공된다. 이렇게 변형된 벨로시뮨(등록상표) 마우스는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 내인성 중쇄 좌위에서의 보편적 중쇄 서열)에 의한 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절의 대체, 및 적어도 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 의한 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절의 대체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ1-22, Vκ1-27, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ1-35, Vκ1-37, Vκ1-39, Vκ1D-8, Vκ1D-12, Vκ1D-13, Vκ1D-16, Vκ1D-17, Vκ1D-22, Vκ1D-27, Vκ1D-32, Vκ1D-33, Vκ1D-35, Vκ1D-37, Vκ1D-39, Vκ1D-42, Vκ1D-43, Vκ1-NL1, Vκ2-4, Vκ2-10, Vκ2-14, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ2-23, Vκ2-24, Vκ2-26, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ2-36, Vκ2-38, Vκ2-40, Vκ2D-10, Vκ2D-14, Vκ2D-18, Vκ2D-19, Vκ2D-23, Vκ2D-24, Vκ2D-26, Vκ2D-28, Vκ2D-29, Vκ2D-30, Vκ2D-36, Vκ2D-38, Vκ2D-40, Vκ3-7, Vκ3-11, Vκ3-15, Vκ3-20, Vκ3-25, Vκ3-31, Vκ3-34, Vκ3D-7, Vκ3D-7, Vκ3D-11, Vκ3D-15, Vκ3D-15, Vκ3D-20, Vκ3D-25, Vκ3D-31, Vκ3D-34, Vκ3-NL1, Vκ3-NL2, Vκ3-NL3, Vκ3-NL4, Vκ3-NL5, Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ6-21, Vκ6D-21, Vκ6D-41 및 Vκ7-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5 및 Vκ1-6을 포함한다. 일 실시형태에서, Vκ 유전자 분절은 Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 및 Vκ1-16을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29 및 Vκ2-30을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 및 Vκ2-40을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, Vκ 유전자 분절은 Vκ4-1 내지 Vκ2-40의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위에 걸친 인접한 인간 면역글로불린 κ 유전자 분절을 포함하고, Jκ 유전자 분절은 Jκ1 내지 Jκ5의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위에 걸친 인접한 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인 뉴클레오타이드 서열은 마우스 중쇄 불변 구역 서열에 작동 가능하게 연결된다. 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 면역글로불린 중쇄 좌위(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위)를 포함하는 벨로시뮨(등록상표) 마우스를 본 명세서에 기재된 임의의 양상, 실시형태, 방법 등에서 사용할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 마우스 중쇄 불변 구역 유전자 서열(예를 들어, IgM, IgD, IgA, IgE, IgG, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 이소형을 코딩하는 중쇄 불변 구역 유전자 서열)에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, (a) 제1 뉴클레오타이드 서열이 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하고(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (b) 제2 뉴클레오타이드 서열이 경쇄 가변 도메인을 코딩하는(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨), 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 마우스 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 유전자 서열에 의한 소정의 비인간 동물 불변 구역 유전자 서열의 추가의 대체(예를 들어, 인간 CH1 서열에 의한 마우스 CH1 서열의 대체, 및 인간 CL 서열에 의한 마우스 CL 서열의 대체)는, 인간 가변 구역 및 예를 들어 완전한 인간 항체 단편, 예를 들어 완전한 인간 Fab를 만들기에 적합한, 부분적 인간 불변 구역을 갖는, 항체를 만드는 하이브리드 면역글로불린 좌위를 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 생성시킨다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 비인간 동물의 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위는 중쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 2개의 카피, 3개의 카피, 4개 이상의 카피를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 좌위는 중쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 CH2 또는 CH3의 변형을 포함하고, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 중쇄 불변 구역 아미노산 서열의 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 250번 위치(카밧 넘버링에 의해 263번)(예를 들어, E 또는 Q); EU 넘버링에 의한 250번 위치(카밧 넘버링에 의해 263번) 및 EU 넘버링에 의한 428번 위치(카밧 넘버링에 의해 459번)(예를 들어, L 또는 F); EU 넘버링에 의한 252번 위치(카밧 넘버링에 의해 265번)(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), EU 넘버링에 의한 254번 위치(카밧 넘버링에 의해 267번)(예를 들어, S 또는 T) 및 EU 넘버링에 의한 256번 위치(카밧 넘버링에 의해 269번)(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 EU 넘버링에 의한 428번 위치(카밧 넘버링에 의해 459번) 및/또는 EU 넘버링에 의한 433번 위치(카밧 넘버링에 의해 464번)(예를 들어, L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 EU 넘버링에 의한 434번 위치(카밧 넘버링에 의해 465번)(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 EU 넘버링에 의한 250번 위치(카밧 넘버링에 의해 263번) 및/또는 EU 넘버링에 의한 428번 위치(카밧 넘버링에 의해 459번)에서의 변형; 또는 EU 넘버링에 의한 307번 위치(카밧 넘버링에 의해 326번) 또는 EU 넘버링에 의한 308번 위치(카밧 넘버링에 의해 327번)(예를 들어, 308F, V308F) 및 EU 넘버링에 의한 434번 위치(카밧 넘버링에 의해 465번)에서의 변형을 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 일 실시형태에서, 변형은 EU 넘버링에 의한 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형(459, 예를 들어 카밧 넘버링에 의한 M459L 및 465S(예를 들어, N465S) 변형); EU 넘버링에 의한 428L, 259I(예를 들어, V259I) 및 308F(예를 들어, V308F) 변형(459L, 272I(예를 들어, V272I) 변형) 및 카밧 넘버링에 의한 327F(예를 들어, V327F) 변형; EU 넘버링에 의한 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형(464K(예를 들어, H464K) 변형) 및 카밧 넘버링에 의한 465(예를 들어, 465Y) 변형; EU 넘버링에 의한 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T 및 256E) 변형(카밧 넘버링에 의한 265, 267, 269(예를 들어, 265Y, 267T 및 269E) 변형); EU 넘버링에 의한 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L)(카밧 넘버링에 의한 263Q 및 459L 변형, 예를 들어 T263Q 및 M459L); 및 EU 넘버링에 의한 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 307F 또는 308P)(카밧 넘버링에 의한 326 및/또는 327 변형, 예를 들어 326F 또는 308P)을 포함하고, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 중쇄 불변 구역 아미노산 서열의 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 252번 및 257번 위치에서의 아미노산 잔기 사이의 적어도 하나의 변형(즉, 카밧 넘버링에 의한 265번과 270번 사이의 아미노산 위치의 적어도 하나의 변형)을 포함하는 인간 CH2 아미노산 서열을 코딩하고, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 인간 CH2 아미노산 서열의 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 307번 및 311번 위치에서의 아미노산 잔기 사이의 적어도 하나의 변형(즉, 카밧 넘버링에 의한 326번과 330번 사이의 아미노산 위치의 적어도 하나의 변형)을 포함하는 인간 CH2 아미노산 서열을 코딩하고, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 CH2 아미노산 서열의 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 CH3 아미노산 서열을 코딩하고, CH3 아미노산 서열은 EU 넘버링에 의한 433번 및 436번 위치에서의 아미노산 잔기 사이의 적어도 하나의 변형(즉, 카밧 넘버링에 의한 464번과 467번 위치에서의 아미노산 잔기 사이의 적어도 하나의 변형)을 포함하고, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 CH3 아미노산 서열의 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 M428L(카밧 넘버링에 의한 459), EU 넘버링에 의한 N434S(카밧 넘버링에 의한 465) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 M428L(카밧 넘버링에 의한 M459L), EU 넘버링에 의한 V259I(카밧 넘버링에 의한 V272I), EU 넘버링에 의한 V308F(카밧 넘버링에 의한 V327) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 N434A 돌연변이(카밧 넘버링에 의한 N465A 돌연변이)를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 M252Y(카밧 넘버링에 의한 M265Y), EU 넘버링에 의한 S254T(카밧 넘버링에 의한 S267T), EU 넘버링에 의한 T256E(카밧 넘버링에 의한 T269E) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 T250Q(카밧 넘버링에 의한 T263Q), EU 넘버링에 의한 M428L(카밧 넘버링에 의한 M459L), 또는 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열은 EU 넘버링에 의한 H433K(카밧 넘버링에 의한 H464K), EU 넘버링에 의한 N434Y(카밧 넘버링에 의한 N465Y), 또는 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 불변 구역 아미노산 서열을 코딩한다.
몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위는 (1) 본 명세서에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 조합으로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 아미노산 서열을 코딩하는 제1 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 대립유전자; 및 (2) 본 명세서에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 조합으로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 아미노산 서열을 코딩하는 제2 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 대립유전자(여기서, 제2 CH3 아미노산 서열은 단백질 A에 대한 제2 CH3 아미노산 서열의 결합을 감소하거나 제거하는 변형을 포함함)(예를 들어, US 특허 제8,586,713호(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해 H435R)을 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 Y96F 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU에 의해 H436F)을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해 H435R) 및 Y96F 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU에 의해 H436F) 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 변형된 인간 IgG1 유래이고, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이(IMGT; EU에 의해 D356E, L38M, N384S, K392N, V397M 및 V422I)를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 변형된 인간 IgG2 유래이고, N44S, K52N 및 V82I(IMGT: EU에 의해 N384S, K392N 및 V422I)로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 CH3 아미노산 서열은 변형된 인간 IgG4 유래이고, Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이(IMGT: EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I)를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 아미노산 서열은 비인간 불변 구역 아미노산 서열이고, 중쇄 불변 구역 아미노산 서열은 상기 기재된 하나 이상의 임의의 변형을 포함한다.
다양한 실시형태에서, Fc 도메인은 변경된 Fc 수용체 결합(여기서, 결국 이팩터 기능에 영향을 미침)을 갖도록 변형된다. 몇몇 실시형태에서, Fc 도메인을 포함하는 조작된 중쇄 불변 구역(CH)은 키메라이다. 그러므로, 키메라 CH 구역은 하나 초과의 면역글로불린 이소형으로부터 유래한 CH 도메인을 조합한다. 예를 들어, 키메라 CH 구역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래한 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래한 CH2 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 CH 구역은 키메라 힌지 구역을 함유한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 구역으로부터 유래한 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따라 228번 내지 236번 위치의 아미노산 잔기; 카밧 넘버링에 따라 241번 내지 249번 위치의 아미노산 위치)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 구역으로부터 유래한 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따라 216번 내지 227번 위치의 아미노산 잔기; 카밧 넘버링에 따라 226번 내지 240번 위치의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 힌지 구역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지로부터 유래한 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 하부 힌지로부터 유래한 아미노산 잔기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 함유 단백질(예를 들어, 항체)의 원하는 약동학적 특성에 영향을 미치는 일 없이, 정상 Fc 이팩터 기능의 전부 또는 일부를 활성화하거나, 어떤 것도 활성화하지 않도록 조작될 수 있다. 키메라 CH 구역을 포함하고 변경된 이팩터 기능을 갖는 단백질의 예를 위해, US 가출원 제61/759,578호(2013년 2월 1일 출원)(본 명세서에서 그 전문이 포함됨)를 참조한다.
다양한 양상에서, 비인간 동물의 게놈은 (ⅰ) 모든 또는 실질적으로 모든, 내인성 작용성 면역글로불린 VH, D, JH 분절의 재배열 또는 역전을 통해 또는 면역글로불린 좌위에서 (예를 들어, 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 외인성 뉴클레오타이드 서열)의 삽입을 통해) 결실시키거나 비작용성이 되도록 변형되고; (ⅱ) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(여기서, 뉴클레오타이드 서열은 내인성 좌위에 위치함(즉, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비인간 동물에 위치함))을 포함하도록 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 게놈에서 이소성 좌위에(예를 들어, 이의 게놈에서 내인성 면역글로불린 사슬 좌위와 다른 좌위에, 또는 이의 내인성 좌위 내에, 예를 들어 면역글로불린 가변 좌위 내에, 여기서 내인성 좌위는 게놈에서 다른 위치에 배치되거나 이로 이동됨) 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 모든 내인성 작용성 중쇄 V, D 또는 J 유전자 분절의 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상은 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 내인성 작용성 중쇄 V, D 또는 J 유전자 분절의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 카파 또는 람다 중 어느 하나인 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 작용성 VH, D 및 JH 중쇄 가변 유전자 분절 및 내인성 작용성 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하고; (ⅰ) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 이소성 좌위에(예를 들어, 이의 게놈에서 내인성 면역글로불린 사슬 좌위와 다른 좌위에, 또는 이의 내인성 좌위 내에, 예를 들어 면역글로불린 가변 구역 좌위 내에, 여기서 내인성 좌위는 게놈에서 다른 위치에 배치되거나 이로 이동됨), 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절(VL) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 J 유전자 분절(JL)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비인간 동물에 위치함)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 작용성 VH, D 및 JH 중쇄 가변 유전자 분절 및 내인성 작용성 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하고; (ⅰ) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 내인성 위치(즉, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비인간 동물에 위치함)에 또는 이소성 좌위에(예를 들어, 이의 게놈에서 내인성 면역글로불린 사슬 좌위와 다른 좌위에, 또는 이의 내인성 좌위 내에, 예를 들어 면역글로불린 가변 구역 좌위 내에, 여기서 내인성 좌위는 게놈에서 다른 위치에 배치되거나 이로 이동됨), 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 모든 내인성 작용성 중쇄 V, D 또는 J 유전자 분절의 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상은 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 내인성 작용성 중쇄 V, D 또는 J 유전자 분절의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 카파 또는 람다 중 어느 하나인 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
다양한 실시형태는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간을 제조하는 데 사용될 수 있고, 이러한 동물에 의해 발현될 수 있고/있거나, 이러한 동물에 의해 생성된(또는 이에 의해 분화된 서열로부터 유래한) 항체에 존재하는 아미노산을 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 인간 κ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 마우스 κ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 래트 κ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 인간 λ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 마우스 λ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 래트 λ 경쇄 가변 도메인이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 생성된 경쇄 가변 도메인은 1개 이상의 마우스 또는 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩된다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 약 3 메가 염기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 적어도 137개의 Vκ 유전자 분절, 적어도 5개의 Jκ 유전자 분절 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 약 1/2 메가 염기를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 (면역글로불린 κ 불변 구역과 관련하여) 근위 반복을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 적어도 40Vκ 유전자 분절, 적어도 5개의 Jκ 유전자 분절 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 (VL) 유전자 분절 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄(JL) 유전자 분절을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 분절 및 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다른 실시형태에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 분절 및 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 V(VL) 유전자 분절 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 J(JL) 유전자 분절은 내인성 설치류 좌위에서 설치류 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자; 예를 들어, κ 또는 λ 경쇄 불변 구역 유전자에 작동 가능하게 연결된다.
다양한 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 가변 구역 유전자 분절(예를 들어, 인간 Vκ 유전자 분절)은 항체의 인간 가변 도메인을 재배열하고 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 내인성 VL 유전자 분절을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물에 의해 발현된 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ1-22, Vκ1-27, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ1-35, Vκ1-37, Vκ1-39, Vκ1D-8, Vκ1D-12, Vκ1D-13, Vκ1D-16, Vκ1D-17, Vκ1D-22, Vκ1D-27, Vκ1D-32, Vκ1D-33, Vκ1D-35, Vκ1D-37, Vκ1D-39, Vκ1D-42, Vκ1D-43, Vκ1-NL1, Vκ2-4, Vκ2-10, Vκ2-14, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ2-23, Vκ2-24, Vκ2-26, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ2-36, Vκ2-38, Vκ2-40, Vκ2D-10, Vκ2D-14, Vκ2D-18, Vκ2D-19, Vκ2D-23, Vκ2D-24, Vκ2D-26, Vκ2D-28, Vκ2D-29, Vκ2D-30, Vκ2D-36, Vκ2D-38, Vκ2D-40, Vκ3-7, Vκ3-11, Vκ3-15, Vκ3-20, Vκ3-25, Vκ3-31, Vκ3-34, Vκ3D-7, Vκ3D-7, Vκ3D-11, Vκ3D-15, Vκ3D-15, Vκ3D-20, Vκ3D-25, Vκ3D-31, Vκ3D-34, Vκ3-NL1, Vκ3-NL2, Vκ3-NL3, Vκ3-NL4, Vκ3-NL5, Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ6-21, Vκ6D-21, Vκ6D-41 및 Vκ7-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물은 모든 작용성 인간 Vκ 유전자를 발현한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5 및 Vκ1-6을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Vκ 유전자 분절은 Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 및 Vκ1-16을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29 및 Vκ2-30을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 Vκ 유전자 분절은 Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 및 Vκ2-40을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 비인간 동물은 5개의 인간 Jκ 유전자 분절, 예를 들어 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, Vκ 유전자 분절은 Vκ4-1 내지 Vκ2-40의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위에 걸친 인접한 인간 면역글로불린 κ 유전자 분절을 포함하고, Jκ 유전자 분절은 Jκ1 내지 Jκ5의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 좌위에 걸친 인접한 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 좌위는 Vκ1-39 및 Vκ3-20인 2개의 인간 VL 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 인간 VL 유전자 분절 및 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 좌위, 예를 들어 내인성 카파 경쇄 좌위에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 작용성 λ 경쇄 좌위를 포함하는 마우스이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 비작용성 λ 경쇄 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 이상의 인간 VH, 1개 이상의 인간 DH 및 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 서열에 작동 가능하게 연결된다(즉, 1개 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절은 내인성 중쇄 좌위에 존재한다).
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트)은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 생성함), 및 Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ1-22, Vκ1-27, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ1-35, Vκ1-37, Vκ1-39, Vκ1D-8, Vκ1D-12, Vκ1D-13, Vκ1D-16, Vκ1D-17, Vκ1D-22, Vκ1D-27, Vκ1D-32, Vκ1D-33, Vκ1D-35, Vκ1D-37, Vκ1D-39, Vκ1D-42, Vκ1D-43, Vκ1-NL1, Vκ2-4, Vκ2-10, Vκ2-14, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ2-23, Vκ2-24, Vκ2-26, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ2-36, Vκ2-38, Vκ2-40, Vκ2D-10, Vκ2D-14, Vκ2D-18, Vκ2D-19, Vκ2D-23, Vκ2D-24, Vκ2D-26, Vκ2D-28, Vκ2D-29, Vκ2D-30, Vκ2D-36, Vκ2D-38, Vκ2D-40, Vκ3-7, Vκ3-11, Vκ3-15, Vκ3-20, Vκ3-25, Vκ3-31, Vκ3-34, Vκ3D-7, Vκ3D-7, Vκ3D-11, Vκ3D-15, Vκ3D-15, Vκ3D-20, Vκ3D-25, Vκ3D-31, Vκ3D-34, Vκ3-NL1, Vκ3-NL2, Vκ3-NL3, Vκ3-NL4, Vκ3-NL5, Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ6-21, Vκ6D-21, Vκ6D-41 및 Vκ7-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Vκ 유전자에 의해 코딩된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 등의 경쇄 가변 도메인을 발현한다.
다양한 실시형태에서, 적어도 1개의 경쇄 가변 구역 유전자 분절(예를 들어, 인간 경쇄 가변 구역 유전자 분절)은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인은 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배 또는 적어도 약 30배의 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 분해 반감기(t1/2)의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서의 t1 /2의 감소는 약 30배 이상이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 VL 유전자 분절은 히스티딘 코돈에 의한 상응하는 인간 생식선 VL 분절 서열에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 코돈(예를 들어, 3개 또는 4개의 코돈)의 치환이다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 CDR3 코돈(들)에서의 치환이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 VL 유전자 분절은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절이고, 각각의 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절은 히스티딘 코돈에 의한 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈의 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절은 3개의 또는 4개의 히스티딘 코돈의 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 3개 또는 4개의 치환은 CDR3 구역에서의 치환이다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 108번 및 111번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다(예를 들어, US 제2013/0247234A1호 및 WO 제2013/138680호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨) 참조). 몇몇 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 3개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 분절의 4개의 비히스티딘 코돈의 치환이고, 치환은 105번, 106번, 107번 및 109번 위치에서 히스티딘을 발현하도록 설계된다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 좌위는 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 VL 유전자 분절 및 1개 이상, 예를 들어 2개 이상의 인간 JL 유전자 분절을 포함하고, 각각의 인간 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 적어도 1개의 히스티딘 코돈을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 관심 있는 항원에 의한 자극 시 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물은 인간 VL 유전자 분절로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 발현하고, 항원 결합 단백질은 인간 VL 유전자 분절로 도입된 적어도 1개의 히스티딘 코돈에 의해 코딩된 아미노산 위치에서 적어도 1개의 히스티딘 잔기를 보유한다. 몇몇 실시형태에서, 동물은 항원에 대한 반응 시 항원 결합 단백질의 집단을 발현하고, 집단에서의 모든 항원 결합 단백질은 (a) 인간 VL 유전자 분절 및 JL 유전자 분절의 재배열로부터 유래한 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(여기서, 적어도 1개의 인간 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 VL 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩함) 및 (b) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
다양한 실시형태는 경쇄 불변 구역 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임)은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되고, 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열임)은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임)은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되고, 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열임)은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 인간 κ 경쇄 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 마우스 κ 경쇄 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 래트 κ 경쇄 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 인간 λ 경쇄 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 마우스 λ 경쇄 불변 구역 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 경쇄 불변 구역 서열은 래트 λ 경쇄 불변 구역 서열이다.
다양한 양상에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위(즉, 여기서 면역글로불린 좌위는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함함)를 포함하는 비인간 동물이 제공되고, 여기서 재배열된 중쇄 가변 도메인은 스페이서를 통해 중쇄 J 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 가변(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 단일 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 2개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 3개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 4개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 5개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 6개의 아미노산 잔기이다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물 및 상기 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 동물은 작용성 보편적 경쇄("ULC") 면역글로불린 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 동물은 재배열된 중쇄 가변 도메인 좌위(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 면역글로불린 좌위)를 추가로 포함한다. ULC는 예를 들어 반감기를 개선하기 위해 FcRn 결합에 영향을 미치는 변형과 같은 기능을 함유하는 이중특이적 포맷, 예를 들어 항원에 결합하는 중쇄 및 FcRn에 결합하는 경쇄를 포함하는 이중특이적 포맷으로 사용될 수 있는 공통 경쇄이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스는 오로지 경쇄를 통해 FcRN에 결합하는 항체를 얻기 위해 FcRN에 의해 면역화된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 생성된 이 경쇄는 이중특이적 항체가 FcRn과 회합하는 것을 보조하여 반감기를 증가시키는 것을 돕는 ULC로서 사용된다. 항체의 나머지(예를 들어, FcRn과 다른 항원에 결합하는 제2의 상이한 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나)는 제2 기능을 수행하도록 선택된다. 본 명세서에 기재된 실시형태에서 사용되는 ULC는 체세포 돌연변이(예를 들어, 초돌연변이)의 처리로부터 주로 다양성이 생기는(이로써 항원 결합 능력이 후 게놈 사건으로부터 이익이 되는 항체 가변 사슬 서열을 설명함) 항체 가변 사슬 서열을 생성하도록 또한 사용될 수 있다.
다양한 양상은 게놈에 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하고, 게놈에서 카파 불변 구역, 람다 불변 구역, 중쇄 불변 구역(예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로 이루어진 군)으로부터 선택되는 불변 구역 핵산 서열로 클로닝된 본 명세서에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 구역 핵산 서열은 제1 인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열로 클로닝되고, 제2 경쇄 가변 도메인은 제2 인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열로 클로닝되고; 제1 및 제2 인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 동일하고, 제1 경쇄 가변 도메인은 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 제2 경쇄 가변 도메인은 제2 항원에 특이적으로 결합한다. 이 실시형태에서, 2개의 폴리펩타이드의 이합체가 형성되고, 중쇄 불변 구역에 융합된 각각의 경쇄 가변 도메인은 명확한 항원 결합 특이성을 나타낸다.
또 다른 양상에서, 트랜스페린 수용체와 같은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 수용체 또는 다른 모이어티에 결합하는 경쇄를 생성할 수 있는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 마우스)이 제공된다. 이전의 연구는 트랜스페린 수용체에 대한 저친화도 항체가 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 저친화도로 인해 방출될 것이라는 것을 나타낸다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있는 모이어티(예를 들어, 트랜스페린 수용체)에 대해 저친화도 항체를 제조하기 위해 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 동물(예를 들어, 마우스)이 사용되고, 저친화도 항체는 이중특이적이고 원하는 표적에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다(즉, 항체는 횡단 모이어티에 결합하고, 또한 횡단 모이어티와 다른 표적에 결합한다).
본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 비인간 동물의 게놈에 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 위치시키는 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 불변 구역 핵산 서열은 인간 또는 비인간이고, 비인간 동물은 설치류이다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은, 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 경쇄 가변 구역 유전자 분절, 예를 들어 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 추가로 포함하는 비인간 동물을 제조하는 단계를 포함한다. 다양한 양상에서, 상기 방법은, 예를 들어 변형된 다능성 또는 전능성 공여자 세포(예를 들어, ES 세포 또는 iPS 세포)와 숙주 배아, 생식 세포(예를 들어, 난모세포) 등을 사용하는 것을 포함하는, 예를 들어 형질전환 기술을 이용하여 비인간 동물, 예를 들어 설치류의 생식선에서 상술된 서열을 위치시키는 단계를 포함한다. 따라서, 실시형태는 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 생식 세포의 게놈에 비인간 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하고, 불변 구역 유전자 서열은 비인간 서열, 인간 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 내인성 비인간 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다.
다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 위치시키는 단계를 포함한다. 이러한 일 양상에서, 비인간 동물의 생식선에서 재배열된 중쇄 유전자 서열로부터 단일 면역글로불린 중쇄를 발현하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 전체 항체 발현 성숙 B 세포 집단이 (ⅰ) 단일 VH 유전자 분절; (ⅱ) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산의 아미노산 스페이서; 및 (ⅲ) 단일 JH 유전자 분절로부터 유래한 중쇄를 발현하도록 비인간 동물을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 몇몇 양상에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바대로 내인성 중쇄 면역글로불린 가변 좌위를 단일의 재배열된 중쇄 유전자에 의해 불활성화하거나 대체하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 (a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 위치시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 실질적으로 모든 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절은 비인간 동물의 면역글로불린 중쇄 좌위로부터 결실되거나, (예를 들어, 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 면역글로불린 좌위에서의 외인성 뉴클레오타이드 서열)의 삽입을 통해 또는 내인성 VH, D, JH 분절의 비작용성 재배열 또는 역전을 통해) 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)을 내인성 위치(즉, 뉴클레오타이드 서열이 야생형 비인간 동물에 위치한 곳에 표적화됨)로 삽입하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 이소성으로(예를 들어, 이의 게놈에서 내인성 면역글로불린 사슬 좌위와 다른 좌위에, 또는 이의 내인성 좌위 내에, 예를 들어 면역글로불린 가변 구역 좌위 내에, 여기서 내인성 좌위는 게놈에서 다른 위치에 배치되거나 이로 이동됨) 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 모든 내인성 작용성 V, D 또는 J 유전자 분절의 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상이 결실되거나 비작용성이 된다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 내인성 작용성 중쇄 V, D 또는 J 유전자 분절의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 결실되거나 비작용성이 된다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 내인성 면역글로불린 경쇄 좌위에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)을 위치시키는 단계를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절 및 (ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 게놈에 (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨) 및 (ⅱ) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 위치시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역글로불린 좌위는 비인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 κ 경쇄 가변 도메인이다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 카파 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 λ 경쇄 가변 도메인이다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 람다 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절 및 (ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 게놈에 (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨) 및 (ⅱ) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 위치시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 인간 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 κ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 λ 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 게놈에 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 위치시키는 단계(여기서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 유전자 분절(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함함)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 면역글로불린 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 내인성 위치(즉, 뉴클레오타이드 서열이 야생형 비인간 동물에 위치한 곳)에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 이소성으로(예를 들어, 이의 게놈에서 내인성 면역글로불린 사슬 좌위와 다른 좌위에, 또는 이의 내인성 좌위 내에, 예를 들어 면역글로불린 가변 좌위 내에, 여기서 내인성 좌위는 게놈에서 다른 위치에 배치되거나 이로 이동됨) 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 단일 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 2개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 3개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 4개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 5개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 스페이서는 6개의 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 2개의 카피, 3개의 카피, 4개 이상의 카피를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 도메인 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 복수의 카피를 코딩한다.
비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 VH, D 및 및/또는 JH 유전자 분절 및 (ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) (ⅰ) 중쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(여기서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 유전자 분절(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함함); 및 (ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(예를 들어, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jκ 유전자 분절)을 위치시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 경쇄 가변 구역 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다.
몇몇 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) 비인간 동물의 게놈에 경쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 위치시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및/또는 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨), 및
(ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)
을 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및/또는 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및
(ⅱ) 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)
을 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및/또는 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) (1) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임), 및
(2) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임)을 포함하는 제1 대립유전자; 및
(ⅱ) (1) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제3 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임), 및
(2) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제4 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제4 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열임)을 포함하는 제2 대립유전자
를 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 및/또는 J 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및 (b) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(여기서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 스페이서를 통해 중쇄 J 유전자 분절(JH) 서열에 작동 가능하게 연결된 중쇄 V 유전자 분절(VH) 서열을 포함하고, 스페이서는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함함)을 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및/또는 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 중쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및
(ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능한 연결에 있는 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절
을 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 양상에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) (ⅰ) 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D 및/또는 J 유전자 분절, 및
(ⅱ) 내인성 작용성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절
을 결실시키거나 비작용성이 되도록 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계; 및
(b) (ⅰ) 경쇄 불변 구역 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및
(ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능한 연결에 있는 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절
을 비인간 동물의 게놈에 위치시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역은 래트 또는 마우스 불변 구역, 예를 들어 래트 또는 마우스 Cκ 불변 구역이다.
또 다른 양상에서, 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열인 뉴클레오타이드 서열; 즉, 사전 재배열된 가변 중쇄 VDJ 뉴클레오타이드 서열)이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 인간 V, D 및 J 유전자 서열 또는 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 인간 생식선 V 분절, 인간 생식선 D 분절 및 인간 생식선 J 분절로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 VH 분절은 인간 집단에서 관찰된 변이체에 상응한다. 다양한 실시형태에서, 핵산 서열은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 V 유전자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 V 분절은 VH3-23 또는 이들의 다형 변이체이다. 다양한 실시형태에서, 핵산 서열은 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 D 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 동물에서 자가반응성이 아닌(비면역원성) 인간 D 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스의 성숙 B 세포의 중쇄 가변 서열에서 발현될 수 있는 인간 D 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 인간 또는 비인간 동물 중쇄 불변 구역 유전자 서열을 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 핵산은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3을 포함하는 불변 구역 유전자 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 핵산 서열은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 J 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4의 서열(서열 번호 137)을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 인간 VH3-23/X1X2/J의 서열(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임)을 포함하는 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, X1은 Gly이고, X2는 Tyr이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 인간 VH3-23/X1X2/JH4-4의 서열(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임)을 포함하는 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, X2는 페닐기를 포함하는 아미노산이다. 구체적인 실시형태에서, X2는 Tyr 및 Phe로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 인간 또는 비인간 동물 경쇄 불변 구역 유전자 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, 사전 재배열된 중쇄 VDJ 서열)을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 작제물은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이 인간 또는 비인간 동물 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 방식으로 설계된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 작제물은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열의 2개의 카피, 3개의 카피, 4개 이상의 카피를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 작제물은 표적화 벡터이다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 벡터는 Adam6a/6b 유전자의 결실과 관련된 생식력 문제를 방지하기 위해 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다(예를 들어, US 제2012-0322108A1호(그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조). 몇몇 실시형태에서, Adam6a 및 Adam6b 유전자는 보편적 중쇄 서열의 전사 단위의 상류의 5'에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 벡터는 재조합 부위에 의해 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 벡터는 하나 이상의 부위 특이적 재조합 부위(예를 들어, loxP 또는 FRT 부위)를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역 아미노산 서열로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능한 연결에 있는 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물)을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응을 개시시킴); 및 (b) 유전적으로 변형된 비인간 동물의 세포(예를 들어, 성숙 B 세포)로부터 항원에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인의 재배열된 경쇄(VJ) 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 이러한 방법에 의해 생성된 경쇄 가변 구역이 제공된다.
몇몇 양상에서, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함), (b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계, (c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계 및 (d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 좌위에 의해 발현된 재배열된 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 자가반응성이 아니고, 즉 비면역원성이다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 이의 게놈에 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)은 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 몇몇 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다.
따라서, 다양한 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 특정한 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 마우스 카파 서열 또는 마우스 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 래트 카파 서열 또는 래트 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 마우스 또는 래트이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
다양한 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 특정한 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 마우스 카파 서열 또는 마우스 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 래트 카파 서열 또는 래트 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 마우스 또는 래트이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
몇몇 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 비인간 동물을 관심 있는 항원 또는 이의 면역원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및
(d) 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리 단계 (c)를 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 유세포분석법을 통해 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 항원에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포는 림프구이다. 특정한 실시형태에서, 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (c)' 림프구를 암 세포와 융합하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 카파 서열 또는 인간 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 마우스 카파 서열 또는 마우스 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 핵산 서열은 래트 카파 서열 또는 래트 람다 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 인간 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 구역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 마우스 또는 래트이다. 몇몇 실시형태에서, (d)의 핵산 서열은 동물의 게놈에 재배열되지 않은 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입을 포함한다.
몇몇 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계;
(d) 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
(e) 하이브리도마 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL) 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합하는 VL 아미노산 서열을 발현하는 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 확인하는 단계; 및
(d) (c)의 림프구로부터 (c)의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계;
(d) 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
(e) 하이브리도마 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합하는 VL 아미노산 서열을 발현하는 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 확인하는 단계; 및
(d) (c)의 림프구로부터 (c)의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 아미노산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계;
(d) 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
(e) 하이브리도마 세포로부터 항원에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄의 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL) 핵산 서열을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및 (ⅱ) 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 중쇄 가변 구역으로부터 독립적으로 항원에 결합하는 VL 아미노산 서열을 발현하는 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 확인하는 단계; 및
(d) (c)의 림프구로부터 (c)의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 경쇄 가변 도메인은 이팩터 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 이팩터 경쇄 가변 도메인은 다중특이적 항체의 반감기를 개선하기 위해 FcRn에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 항원에 결합하는 중쇄 가변 도메인 및 FcRn에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스는 오직 경쇄를 통해 FcRN에 결합하는 항체를 얻기 위해 FcRN에 의해 면역화된다. 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 생성된 이 경쇄는 이중특이적 항체가 FcRn과 회합하는 것을 보조하여 반감기를 증가시키는 것을 돕는 보편적 또는 공통 경쇄로서 사용된다. 항체의 나머지(예를 들어, FcRn과 다른 항원에 결합하는 제2의 상이한 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나)는 제2 기능을 수행하도록 선택된다.
추가의 양상에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 경쇄 가변 구역 및 이러한 경쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
몇몇 양상에서, 비인간 동물의 생식선 게놈에 (1) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 (2) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위가 제공된다. 몇몇 양상에서, 비인간 동물의 생식선 게놈에 (1) 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 (2) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위가 제공된다. 몇몇 양상에서, 비인간 동물의 생식선 게놈에 (1) 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열 및 (2) 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 좌위가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 λ 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 마우스 또는 래트 경쇄 불변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 κ 경쇄 가변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 λ 경쇄 가변 구역 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 래트 경쇄 가변 구역 유전자 서열이다.
추가의 양상은 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물에 의해 제조된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)을 포함한다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래하거나 이에 의해 생성된(즉, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절로부터 발현된) 경쇄 가변 구역(VL) 서열을 갖는 항원 결합 단백질(예를 들어, 재조합 항체)이 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원 결합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 항원에 대한 경쇄의 결합을 방해하지 않고/않거나, 중쇄는 경쇄의 부재 하에 항원에 결합하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 존재 하에서보다 중쇄의 부재 하에 더 높은 1 이하의 차수의 양인 KD(예를 들어, 중쇄의 존재 하에 KD ~ 10-10 또는 중쇄의 부재 하에 KD ~10-9)로 관심 있는 항원에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10보다 낮은 친화도(KD)로 관심 있는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법에 의해 생성된 면역글로불린 경쇄는 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10보다 낮은 친화도(KD)로 중쇄 가변 구역의 부재 하에 관심 있는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로 생성된 경쇄 가변 도메인은 표적 분자("T")에 특이적으로 결합한다. 표적 분자는 활성 또는 세포외 농도가 약화되거나 감소되거나 제거되는 것이 바람직한 임의의 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 마크로분자이다. 많은 경우에, 경쇄 가변 구역이 결합하는 표적 분자는 단백질 또는 폴리펩타이드(즉, "표적 단백질")이지만, 또한 표적 분자("T")가 탄수화물, 당단백질, 지질, 리포단백질, 리포폴리사카라이드, 또는 경쇄 가변 구역이 결합하는 다른 비단백질 중합체 또는 분자인 실시형태가 제공된다. 다양한 실시형태에서, T는 세포 표면 발현된 표적 단백질 또는 가용성 표적 단백질일 수 있다. 항원 결합 분자에 의한 표적 결합은 세포외 또는 세포 표면 상황에서 발생할 수 있다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 항원 결합 분자는, 소포체, 골지, 엔도솜, 라이소좀 등과 같은, 세포 내부에, 예를 들어 세포내 성분 내에 표적 분자에 결합한다. 세포 표면 발현된 표적 분자의 예는 세포 표면 발현된 수용체, 막 결합 리간드, 이온 채널, 및 세포막에 부착되거나 이것과 회합된 세포외 부분을 갖는 임의의 다른 단량체 또는 다합체 폴리펩타이드 성분을 포함한다. 본 명세서에서 제공된 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 표적화될 수 있는 비제한적인 예시적인 세포 표면 발현된 표적 분자는 예를 들어 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33 등에 대한 수용체) 및 세포 표면 표적, 예를 들어 다른 1형 막관통 수용체, 예컨대 PRLR, G-단백질 커플링된 수용체, 예컨대 GCGR, 이온 채널, 예컨대 Nav1.7, ASIC1 또는 ASIC2, 비수용체 표면 단백질, 예컨대 MHC-I(예를 들어, HLA-B*27) 등을 포함한다. T가 세포 표면 발현된 표적 단백질인 실시형태에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은, 예를 들어 T에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 세포 표면 발현된 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 리간드 또는 리간드의 부분일 수 있다. 예를 들어, T가 IL-4R인 경우, D1 성분은 IL-4 또는 이의 수용체 결합 부분을 포함하거나, 이것들로 이루어질 수 있다. 가용성 표적 분자의 예는 사이토카인, 성장 인자 및 다른 리간드 및 신호전달 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 제공된 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 표적화될 수 있는 비제한적인 예시적인 가용성 표적 단백질의 예는 예를 들어 IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, SOST, DKK1 등을 포함한다. 가용성 표적 분자는 또한 예를 들어 비인간 표적 분자, 예컨대 알레르겐(예를 들어, Fel D1, Betv1, CryJ1), 병원균(예를 들어, 칸디다 알비칸스, S. 아우레우스 등) 및 병원균 분자(예를 들어, 리포폴리사카라이드(LPS), 리포테코산(LTA), 단백질 A., 독소 등)를 포함한다. T가 가용성 표적 분자인 실시형태에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 예를 들어 T에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 가용성 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 수용체의 부분일 수 있다. 예를 들어, T가 IL-4인 경우, D1 성분은 IL-4R 또는 이의 리간드 결합 부분을 포함하거나, 이것들로 이루어질 수 있다. 표적 분자는 또한 종양 관련 항원을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체)은 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 갖는 면역글로불린 좌위를 포함하는 비인간 동물(즉, 예비설계된, 재배열된 중쇄 VDJ 서열을 포함하는 동물)로부터 유래한(즉, 이에 의해 생성된 인간 경쇄 가변 구역(VL) 서열을 갖는) 항원 특이적 경쇄 가변 도메인을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 항원 특이적, 리버스 키메라(예를 들어, 인간 가변/ 마우스 불변) 경쇄는 적합한 인간 경쇄 불변 구역 서열을 갖는 발현 벡터로 인프레임으로 클로닝될 수 있는 항원 특이적 경쇄 가변 구역 서열을 유도시키도록 사용될 수 있다. 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 갖는 면역글로불린 좌위를 포함하는 동물(즉, 예비설계된, 재배열된 중쇄 VDJ 서열을 포함하는 마우스)로부터의 항원 특이적 인간 중쇄 가변 구역(들)(항원 특이적 경쇄와 동일한 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적)은 인간 중쇄 불변 구역 서열을 포함하는 발현 벡터로 인프레임으로 클로닝될 수 있고, 항원 특이적 인간 경쇄 및 중쇄는 항원 결합 단백질(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적 인간 항체)를 얻도록 적합한 세포에서 동시 발현될 수 있다. 대안적으로, 이전에 선택된 항원 특이적 중쇄, 예를 들어 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열에서 사용되는 것과 동일한 가변 구역 유전자 분절로부터 유래한 경쇄를 포함하는 항체로부터의 중쇄는 인간 중쇄 불변 구역 서열을 포함하는 발현 벡터로 인프레임으로 클로닝될 수 있고, 항원 특이적 인간 경쇄 및 중쇄는 항원 결합 단백질(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적 인간 항체)를 얻도록 적합한 세포에서 동시 발현될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 중쇄 불변 구역 유전자 서열(예를 들어, 마우스 또는 래트, 카파 또는 람다)에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 비인간 경쇄 불변 구역 유전자 서열(예를 들어, 마우스 또는 래트, 카파 또는 람다)에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 인간 경쇄 가변 구역(VL) 서열은 카파 유전자 서열이다.
또 다른 양상에서, 다중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제1 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제1 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함함);
(b) 제1 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 제1 비인간 동물로부터 제1 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계(여기서, 제1 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 가변 도메인을 포함함);
(d) 친화도 성숙된 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(e) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 람다 또는 카파 서열)과 인프레임으로 있는 제1 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 클로닝하여 제1 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계;
(f) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제2 비인간 동물을 제2 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제2 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 연결된 재배열되지 않은 인간 V, D 및 J 유전자 분절; 및 (ⅱ) 단일의 재배열된 인간 경쇄 가변 구역 서열을 포함함);
(g) 제2 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(h) 면역화된 제2 비인간 동물로부터 제2 림프구를 수확하는 단계(여기서, 제2 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함함);
(i) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체의 인간 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(j) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 IgG1 불변 서열)과 인프레임으로 있는 제2 발현 작제물에서의 (i)의 핵산 서열을 클로닝하여 제2 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계; 및
(k) 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 제1 폴리펩타이드 유전자 및 제2 폴리펩타이드 유전자를 발현시키기에 적합한 세포로 도입하여 제2 폴리펩타이드의 이합체를 포함하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계(여기서, 제2 폴리펩타이드의 각각의 단량체는 제1 폴리펩타이드의 단량체와 회합됨)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 별개의 벡터에 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 동일한 벡터에 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다. 일 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원은 세포 표면 수용체이고, 제2 항원은 가용성 항원 및 세포 표면에 결합된 항원으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체(예를 들어, FcRN)이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 다중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제1 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제1 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열은 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨); 및 (ⅱ) 인간 또는 비인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 포함함);
(b) 제1 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 제1 비인간 동물로부터 제1 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계(여기서, 제1 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 가변 도메인을 포함함);
(d) 친화도 성숙된 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(e) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 람다 또는 카파 서열)과 인프레임으로 있는 제1 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 클로닝하여 제1 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계;
(f) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제2 비인간 동물을 제2 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제2 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 연결된 재배열되지 않은 인간 V, D 및 J 유전자 분절; 및 (ⅱ) 단일의 재배열된 인간 경쇄 가변 구역 서열을 포함함);
(g) 제2 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(h) 면역화된 제2 비인간 동물로부터 제2 림프구를 수확하는 단계(여기서, 제2 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함함);
(i) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체의 인간 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(j) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 IgG1 불변 서열)과 인프레임으로 있는 제2 발현 작제물에서의 (i)의 핵산 서열을 클로닝하여 제2 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계; 및
(k) 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 제1 폴리펩타이드 유전자 및 제2 폴리펩타이드 유전자를 발현시키기에 적합한 세포로 도입하여 제2 폴리펩타이드의 이합체를 포함하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계(여기서, 제2 폴리펩타이드의 각각의 단량체는 제1 폴리펩타이드의 단량체와 회합됨)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 별개의 벡터에 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 동일한 벡터에 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원은 세포 표면 수용체이고, 제2 항원은 가용성 항원 및 세포 표면에 결합된 항원으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체(예를 들어, FcRN)이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 다중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제1 비인간 동물을 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제1 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 제1 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 제1 비인간 동물로부터 제1 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계(여기서, 제1 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 가변 도메인을 포함함);
(d) 친화도 성숙된 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(e) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 람다 또는 카파 서열)과 인프레임으로 있는 제1 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 클로닝하여 제1 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계;
(f) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 제2 비인간 동물을 제2 관심 있는 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 제2 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 비인간 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 연결된 재배열되지 않은 인간 V, D 및 J 유전자 분절; 및 (ⅱ) 단계 (c)의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 VL 유전자 분절과 동일한 VL 유전자 분절로부터 유래한 단일의 재배열된 인간 경쇄 가변 구역 서열을 포함함);
(g) 제2 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(h) 면역화된 제2 비인간 동물로부터 제2 림프구를 수확하는 단계(여기서, 제2 림프구는 친화도 성숙된 항체를 발현하고, 친화도 성숙된 항체는 비인간 불변 도메인에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함함);
(i) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체의 인간 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 단계;
(j) 적합한 인간 불변 구역 핵산 서열(예를 들어, 인간 IgG1 불변 서열)과 인프레임으로 있는 제2 발현 작제물에서의 (i)의 핵산 서열을 클로닝하여 제2 폴리펩타이드 유전자를 형성하는 단계; 및
(k) 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 제1 폴리펩타이드 유전자 및 제2 폴리펩타이드 유전자를 발현시키기에 적합한 세포로 도입하여 제2 폴리펩타이드의 이합체를 포함하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계(여기서, 제2 폴리펩타이드의 각각의 단량체는 제1 폴리펩타이드의 단량체와 회합됨)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 별개의 벡터에 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 동일한 벡터에 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원은 세포 표면 수용체이고, 제2 항원은 가용성 항원 및 세포 표면에 결합된 항원으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체(예를 들어, FcRN)이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 다중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 1개 이상의 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계(여기서, 림프구는 마우스 면역글로불린 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 친화도 성숙된 항체를 발현함);
(d) 친화도 성숙된 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 서열을 확인하는 단계;
(e) (d)의 제1 핵산 서열을 인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 인프레임으로 있는 제1 발현 벡터로 클로닝하는 단계;
(f) 숙주 세포로 (ⅰ) 인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 인프레임으로 있는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터; 및 (ⅱ) 인간 중쇄 불변 구역에 융합된 제1 항원 특이적 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 도입하는 단계;
(g) 숙주 세포를 배양하여 다중특이적 항체를 발현시키는 단계; 및
(h) 다중특이적 항체를 단리하는 단계(여기서, 다중특이적 항체는 제1 항원 특이적 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 다중특이적 항체의 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인으로부터 명확한 항원 결합 특이성을 나타냄)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 다중특이적 항체는 삼중특이적 항체이고, 단계 (f)는 인간 중쇄 불변 구역 서열과 융합된 제2 항원 특이적 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 다중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 비인간 동물을 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인; 및 (ⅱ) 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절을 포함함);
(b) 비인간 동물이 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 면역화된 비인간 동물로부터 림프구(예를 들어, B 세포)를 수확하는 단계(여기서, 림프구는 마우스 면역글로불린 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 친화도 성숙된 항체를 발현함);
(d) 친화도 성숙된 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 서열을 확인하는 단계;
(e) (d)의 제1 핵산 서열을 인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 인프레임으로 있는 제1 발현 벡터로 클로닝하는 단계;
(f) 숙주 세포로 (ⅰ) 인간 경쇄 불변 구역 핵산 서열과 인프레임으로 있는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터; 및 (ⅱ) 인간 중쇄 불변 구역에 융합된 제1 항원 특이적 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 도입하는 단계;
(g) 숙주 세포를 배양하여 다중특이적 항체를 발현시키는 단계; 및
(h) 다중특이적 항체를 단리하는 단계(여기서, 다중특이적 항체는 제1 항원 특이적 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 다중특이적 항체의 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인으로부터 명확한 항원 결합 특이성을 나타냄)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 다중특이적 항체는 삼중특이적 항체이고, 단계 (f)는 인간 중쇄 불변 구역 서열과 융합된 제2 항원 특이적 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은, 이의 게놈에,
(ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 면역글로불린 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 재배열되지 않은 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에
(ⅰ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 면역글로불린 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 재배열되지 않은 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 중쇄 가변 도메인으로부터 독립적으로 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은,
(a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 제1 항원에 의해 면역화시키는 단계(여기서, 비인간 동물은 이의 게놈에
(ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열; 및
(ⅱ) 면역글로불린 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절(VL 및 JL)을 포함함);
(b) 비인간 동물이 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 대한 면역 반응을 개시하게 하는 단계;
(c) 비인간 동물로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 단계;
(d) (c)의 세포로부터 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
(e) 인간 면역글로불린 불변 구역 핵산 서열에 융합된, 발현 작제물에서의 (d)의 핵산 서열을 사용하는 단계; 및
(f) 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄를 발현하는 생산 세포주에서 (d)의 핵산 서열을 발현시켜, 경쇄가 (d)의 핵산에 의해 코딩되고 중쇄로부터 독립적으로 제1 에피토프 또는 이의 면역원성 부분에 결합하며 중쇄가 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 Fc 수용체이다. 특정한 실시형태에서, Fc 수용체는 FcRn이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 가용성 항원으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 항원 또는 에피토프는 세포 표면 수용체로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 항원은 Fc 수용체이고, 제2 항원은 가용성 단백질이고, 항원 결합 단백질은 비인간 동물의 게놈에 VL 유전자 분절로부터 유래한 1개 이상의 히스티딘 치환 및 삽입을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질의 손쉬운 분리를 허용하기 위해, 중쇄 중 1개는 단백질 A 결합 결정부위를 생략하도록 변형되어서, 이종이합체 결합 단백질로부터 동종이합체 결합 단백질의 차등 단백질 A 결합 친화도를 발생시킨다. 이 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 발명의 명칭이 "네이티브 면역글로불린 포맷을 갖는 용이하게 단리된 이중특이적 항체(Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format)"인 미국 특허 제8,586,713호(2013년 11월 19일 등록, 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 동일한 경쇄를 갖는 이종이합체 중쇄를 포함하는 종이 선택되면, 이 이중특이적 항원 결합 단백질은 이의 pH 의존적 항원 결합 특성의 보유를 확인하도록 스크리닝될 수 있다.
다양한 양상에서, 본 명세서에서의 다양한 게놈 변형을 포함하는 비인간 동물로부터 유래한 다능성 세포, 유도 다능성 또는 전능성 줄기 세포가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 다능성 또는 전능성 세포는 비인간 동물로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 몇몇 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 구체적인 실시형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 다능성 세포는 이의 게놈에 (ⅰ) 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 다능성, 유도 다능성 또는 전능성 줄기 세포는 마우스 또는 래트 배아 줄기(ES) 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 다능성, 유도 다능성 또는 전능성 줄기 세포는 XX 핵형 또는 XY 핵형을 갖는다.
전핵 주사에 의해 세포로 도입된 변형과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 함유하는 핵을 포함하는 세포가 또한 제공된다. 또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비인간 동물의 세포로부터 유래한 하이브리도마 또는 쿼드로마가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 단리된 림프구가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 림프구는 B 세포이고, B 세포는 인간 또는 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 중쇄 또는 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 게놈 좌위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, B 세포는 항체를 생성할 수 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 재배열된 중쇄 가변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 양상에서, 비인간 동물 배아는 게놈이 (ⅰ) 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 및 (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 재배열된 중쇄 가변 도메인 및 복수의 경쇄 V 분절(및 복수의 경쇄 J 분절)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로부터 유래한 항체 레퍼토리(예를 들어, IgG 레퍼토리)를 발현한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 좌위는 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10보다 낮은 친화도(KD)로 관심 있는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 집단을 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 좌위에 의해 발현된 면역글로불린 경쇄는 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10보다 낮은 친화도(KD)로 중쇄 가변 구역의 부재 하에 관심 있는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형은 비인간 동물의 생식력에 영향을 미치지 않는다(예를 들어, US 제2012-0322108A1호(그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조). 몇몇 실시형태에서, 중쇄 좌위는 내인성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함하고, 유전자 변형은 내인성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능에 영향을 미치지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물의 게놈은 이소성으로 위치한 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Adam6a 및/또는 Adam6b 유전자는 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열의 전사 단위의 상류의 5'에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, Adam6a 및/또는 Adam6b 유전자는 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열의 전사 단위의 하류의 3'에 위치한다.
몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 중쇄 좌위는 유전자간 제어 구역 1(Intergenic Control Region 1: IGCR1) 핵산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 변형된 중쇄 좌위는 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열의 하류에 IGCR1 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, IGCR1 핵산 서열은 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열과 가장 V-근위인 DH 유전자 분절 사이에 존재한다.
몇몇 양상에서, 상기 기재된 바대로, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 면역글로불린 경쇄 좌위는 경쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어 (ⅰ) 1개, 2개 이상이지만 야생형 수보다 작은 인간 VL 유전자 분절의 제한된 레퍼토리를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스이고; 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 2개 중 1개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열로부터 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 마우스는 (a) λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 골수에서의 B 세포 대 (b) κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 골수에서의 B 세포의, 약 1 내지 약 15의 비율을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 재배열은 인간 Vκ1-39 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재배열은 인간 Vκ3-20 유전자 분절을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절은 내인성 면역글로불린 Vκ 좌위에 있고, 몇몇 실시형태에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절은 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 Vκ 유전자 분절을 대체한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절은 내인성 면역글로불린 Vκ 좌위에 있고, 몇몇 실시형태에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절은 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 대체한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 인간 Jκ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 다른 실시형태에서, 마우스의 경쇄 가변 도메인은 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성된다. 이러한 몇몇 실시형태에서, λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 골수에서의 미성숙 B 세포 대 κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 미성숙 B 세포의 비율은 약 1 내지 약 13이다. 몇몇 다른 실시형태에서, 마우스의 경쇄 가변 도메인은 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성되고, λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 골수에서의 성숙 B 세포 대 κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 미성숙 B 세포의 비율은 약 1 내지 약 7이다.
특정한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스의 경쇄 가변 도메인은 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성되고, 골수에서 약 2.5x104개 내지 약 1.5x105개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 2.5x104개, 3.0x104개, 3.5x104개, 4.0x104개, 4.5x104개, 5.0x104개, 5.5x104개, 6.0x104개, 6.5x104개, 7.0x104개, 7.5x104개, 8.0x104개, 8.5x104개, 9.0x104개, 9.5x104개, 1.0x105개 또는 1.5x105개의 세포의 프로 B 세포 집단을 갖고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 2.88x104개의 세포의 프로 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 6.42x104개의 세포의 프로 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 9.16x104개의 세포의 프로 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.19x105개의 세포의 프로 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 골수에서의 예시적인 프로 B 세포는 CD19, CD43, c-키트 및/또는 이들의 조합(예를 들어, CD19+, CD43+, c-키트+)의 발현을 특징으로 한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 설치류(예를 들어, 마우스)는 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성된 경쇄를 발현하고, 골수에서 약 1x106개 내지 약 2x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 1.0x106개, 1.1x106개, 1.2x106개, 1.3x106개, 1.4x106개, 1.5x106개, 1.6x106개, 1.7x106개, 1.8x106개, 1.9x106개 또는 2.0x106개의 세포의 프리 B 세포 집단을 갖고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.25x106개의 세포의 프리 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.46x106개의 세포의 프리 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.64x106개의 세포의 프리 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 2.03x106개의 세포의 프리 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 골수에서의 예시적인 프리 B 세포는 CD19, CD43, c-키트 및/또는 이들의 조합(예를 들어, CD19+, CD43-, c-키트-)의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성된 경쇄를 발현하고, 골수에서 약 5x105개 내지 약 7x105개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 5.0x105개, 5.1x105개, 5.2x105개, 5.3x105개, 5.4x105개, 5.5x105개, 5.6x105개, 5.7x105개, 5.8x105개, 5.9x105개, 6.0x105개, 6.1x105개, 6.2x105개, 6.3x105개, 6.4x105개, 6.5x105개, 6.6x105개, 6.7x105개, 6.8x105개, 6.9x105개 또는 7.0x105개의 세포의 미성숙 B 세포 집단을 갖고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 5.33x105개의 세포의 미성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 5.80x105개의 세포의 미성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 5.92x105개의 세포의 미성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 6.67x105개의 세포의 미성숙 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 골수에서의 예시적인 미성숙 B 세포는 IgM, B220 및/또는 이들의 조합(예를 들어, IgM+, B220int)의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성된 경쇄를 발현하고, 골수에서 약 3x104개 내지 약 1.5x105개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 3.0x104개, 3.5x104개, 4.0x104개, 4.5x104개, 5.0x104개, 5.5x104개, 6.0x104개, 6.5x104개, 7.0x104개, 7.5x104개, 8.0x104개, 8.5x104개, 9.0x104개, 9.5x104개, 1.0x105개 또는 1.5x105개의 세포의 성숙 B 세포 집단을 갖고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 3.11x104개의 세포의 성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.09x105개의 세포의 성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.16x105개의 세포의 성숙 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.44x105개의 세포의 성숙 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 골수에서의 예시적인 성숙 B 세포는 IgM, B220 및/또는 이들의 조합(예를 들어, IgM+, B220hi)의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 인간 Vκ1-39 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 중 1개의 인간 Jκ 유전자 분절의 재배열을 통해 생성된 경쇄를 발현하고, 골수에서 약 1x106개 내지 약 3x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 1.0x106개, 1.1x106개, 1.2x106개, 1.3x106개, 1.4x106개, 1.5x106개, 1.6x106개, 1.7x106개, 1.8x106개, 1.9x106개, 2.0x106개, 2.1x106개, 2.2x106개, 2.3x106개, 2.4x106개, 2.5x106개, 2.6x106개, 2.7x106개, 2.8x106개, 2.9x106개 또는 2.0x106개의 세포의 전체 B 세포 집단을 갖고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.59x106개의 세포의 전체 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 1.75x106개의 세포의 전체 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 2.13x106개의 세포의 전체 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 골수에서 약 2.55x106개의 세포의 전체 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 골수에서의 예시적인 전체 B 세포는 CD19, CD20 및/또는 이들의 조합(예를 들어, CD19+)의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 분절 및 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 좌위를 포함하고, 설치류(예를 들어, 마우스)는 면역글로불린 κ 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 야생형 보체를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스)와 거의 동일한 이행성(예를 들어, T1, T2 및 T3) B 세포 집단을 포함하는 말초 비장 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 비장에서의 예시적인 이행성 B 세포 집단(예를 들어, T1, T2 및 T3)은 IgM, CD23, CD93, B220 및/또는 이들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93+, B220+, IgMhi, CD23-)에서 약 2x106개 내지 약 7x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 2.0x106개, 2.5x106개, 3.0x106개, 3.5x106개, 4.0x106개, 4.5x106개, 5.0x106개, 5.5x106개, 6.0x106개, 6.5x106개 또는 7.0x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 2.16x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.63x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.91x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 6.83x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93+, B220+, IgMhi, CD23+)에서 약 1x106개 내지 약 7x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 1.0x106개, 1.5x106개, 2.0x106개, 2.5x106개, 3.0x106개, 3.5x106개, 4.0x106개, 4.5x106개, 5.0x106개, 5.5x106개, 6.0x106개, 6.5x106개 또는 7.0x106개의 세포의 T2 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.30x106개의 세포의 T2 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 2.46x106개의 세포의 T2 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.24x106개의 세포의 T2 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 6.52x106개의 세포의 T2 B 세포 집단을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93+, B220+, IgMlo, CD23+)에서 약 1x106개 내지 약 4x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 1.0x106개, 1.5x106개, 2.0x106개, 2.5x106개, 3.0x106개, 3.5x106개 또는 4.0x106개의 세포의 T3 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.08x106개의 세포의 T3 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.35x106개의 세포의 T3 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.37x106개의 세포의 T3 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.63x106개의 세포의 T1 B 세포 집단을 포함한다.
변연부 B 세포는 비장의 변연부(MZ)로 해부학적으로 분리하는 비순환 성숙 B 세포이다. 설치류에서, MZ B 세포는 착생(sessile)이고 변연동과 적비수 사이의 비장의 외부 백비수에 있는다. 이 구역은 대식세포, 수지상 세포 및 MZ B 세포의 복수의 아형을 함유하고; 설치류에서 출생 2주 내지 3주 및 인간에서 1년 내지 2년까지 완전히 형성되지 않는다. 이 구역 내의 MZ B 세포는, 소포성(FO) B 세포 및 B1 B 세포로부터 표현형으로 이를 구별하는 것을 돕는 sIgD, CD23, CD5 및 CD11b의 적거나 무시할 만한 수준과 함께, 통상적으로 높은 수준의 sIgM, CD21, CD1, CD9를 발현한다. B1 B 세포와 유사하게, MZ B 세포는 T 세포 독립적인 방식으로 초기 적응 면역 반응으로 신속히 동원될 수 있다. MZ B 세포는, 순환계로 들어가고 비장에서 포획되는 전신 혈액 전염 항원에 대한 방어의 제1 라인으로서, 특히 잘 위치한다. 이것이 박테리아 세포벽 성분에 특히 반응성이고 지질 특이적 항체의 중요한 공급원인 것으로 생각된다. MZ B 세포는 가속된 1차 항체 반응에 추가로 기여하는 혈장 세포 분화에 대한 고조된 성향을 갖는 이의 FO B 세포 대응물보다 낮은 활성화 쓰레스홀드를 또한 나타낸다.
다양한 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, VH3-23/D/JH4)을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 야생형 설치류(예를 들어, 야생형 마우스)에 대해 변연부 B 세포의 증가 수치를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)에서의 변연부 B 세포는 야생형 설치류(예를 들어, 야생형 마우스)에 대해 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상 증가한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 분절 및 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 좌위를 포함하고, 설치류(예를 들어, 마우스)는 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 야생형 보체를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스)와 거의 동일한 변연부 및 변연부 전구체 B 세포 집단을 포함하는 말초 비장 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 비장에서의 예시적인 변연부 B 세포 집단은 IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 및/또는 이들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93-, B220+, IgMhi, CD21/35hi, CD23-)에서 약 1x106개 내지 약 3x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 1.0x106개, 1.5x106개, 2.0x106개, 2.5x106개 또는 3.0x106개의 세포의 변연부 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.47x106개의 세포의 변연부 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.49x106개의 세포의 변연부 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 2.26x106개의 세포의 변연부 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 2.33x106개의 세포의 변연부 B 세포 집단을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)가 제공되고, 설치류(예를 들어, 마우스)는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 분절 및 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 좌위를 포함하고, 설치류(예를 들어, 마우스)는 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 야생형 보체를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스)와 거의 동일한 소포성(예를 들어, FO-I 및 FO-II) B 세포 집단(들)을 포함하는 말초 비장 B 세포 집단을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)의 비장에서의 예시적인 소포성 B 세포 집단(예를 들어, FO-I 및 FO-II)은 IgM, IgD, CD21/35, CD93, B220 및/또는 이들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93-, B220+, CD21/35int, IgMlo, IgDhi)에서 약 3x106개 내지 약 1.5x107개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 약 3.0x106개, 3.5x106개, 4.0x106개, 4.5x106개, 5.0x106개, 5.5x106개, 6.0x106개, 6.5x106개, 7.0x106개, 7.5x106개, 8.0x106개, 8.5x106개, 9.0x106개, 9.5x106개, 1.0x107개 또는 1.5x107개의 세포의 소포성 1형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 3.57x106개의 세포의 소포성 1형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 6.31x106개의 세포의 소포성 1형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 9.42x106개의 세포의 소포성 1형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.14x107개의 세포의 소포성 1형 B 세포 집단을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장(예를 들어, CD93-, B220+, CD21/35int, IgMint, IgDhi)에서 약 1x106개 내지 약 2x106개의 세포(경계 포함)의 범위, 예를 들어 1.0x106개, 1.25x106개, 1.5x106개, 1.75x106개 또는 2.0x106개의 세포의 소포성 2형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.14x106개의 세포의 소포성 2형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.45x106개의 세포의 소포성 2형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 1.80x106개의 소포성 2형 B 세포 집단을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 설치류(예를 들어, 마우스)는 비장에서 약 2.06x106개의 세포의 소포성 2형 B 세포 집단을 포함한다.
경쇄 가변 구역 또는 도메인(예를 들어, 경쇄 CDR3)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에 선택적 압박을 가하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비인간 동물의 능력은 다양한 가변 경쇄 유전자 서열에 적용될 수 있다. 즉, 본 명세서에 개시된 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열은 경쇄 좌위의 하나 이상의 유전자 변형 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 중쇄 좌위로의 삽입과 쌍 지을 수 있다. 이는 (공통 또는 보편적 중쇄 가변 도메인으로 제한된) 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 하나 이상의 경쇄 코딩 좌위 내에 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물과 예를 들어 짝짓기(즉, 단일 변형을 갖는 동물의 품종 교잡 또는 상호 교잡)시킴으로써 성취될 수 있다. 재배열된 중쇄 가변 도메인 및 하나 이상의 경쇄 변형 둘 다를 갖는 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 동시에 또는 순차적으로(예를 들어, 배아 줄기 세포에서의 순차적인 재조합에 의해) 복수의 좌위의 표적화 유전자 대체에 의해 또한 생성될 수 있다. 경쇄 좌위에서의 변형의 어느 방법도 구체적으로 기재되지 않은 한 본 명세서에 기재된 실시형태를 제한하지 않는다. 오히려, 발현될 수 있고 경쇄 항원 결합 서열로서 작용할 수 있는(이로써 더 잘 맞는 항체 가변 구역의 진화를 추진시킴), 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 본 명세서에 기재된 실시형태에 의해 실행 가능한 선택적 압박이 적용될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 바대로, 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열을 갖는 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 (예를 들어, 품종 교잡 또는 복수의 유전자 표적화 전략을 통해) WO 제2011/072204호, WO 제2011/163311호, WO 제2011/163314호, WO 제2012/018764호, WO 제2012/141798호, U.S. 제2013/0185821호, WO 제2013/022782호, WO 제2013/096142호, WO 제2013/116609호; 이들 공보는 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 경쇄 좌위에서의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(즉, 인간 또는 비인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 인간 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위(예를 들어, 마우스 중쇄 좌위로 삽입된 40개의 인간 Vκ 유전자 및 모든 인간 Jκ 유전자; 예를 들어, 미국 예비등록 공보 제2012/0096572호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨) 참조)를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스로 교잡된다. 구체적인 실시형태에서, 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열(즉, 인간 또는 비인간 κ 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 중쇄 가변 도메인 유전자 서열)을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 1개 이상(예를 들어, 2개)이지만 야생형 수보다 작은 인간 경쇄 가변 구역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스로 교잡된다. 생성된 마우스는 게놈 경쇄 가변 서열로부터 유래한 가변 중쇄를 갖는 카파+ B 세포를 생성하여서, 특이적 표적에 결합하는 카파 VJ 서열의 확인을 수월하게 하고, 이것은 이후 경쇄로 다시 재포맷팅되고 다양한 중쇄와 쌍을 지어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체를 생성할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 당업자에게 제공하도록 기재되어 있고, 본 발명자들이 이의 발명으로 여기는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않고, 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 기재되지 않은 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.
실시예 1. 후보 보편적 중쇄 서열의 클로닝 및 발현 분석
이전의 연구는 hVH3-23이 열 안정 인간 가변 중쇄 유전자 분절이고, 또한 인간 레퍼토리에서 가장 흔히 사용되는 가변 분절 중 하나라는 것을 나타냈다. 따라서, 코돈 최적화 인간 VH3-23, D4-4(리딩 프레임 2 또는 3) 및 JH4(또는 JH6) 유전자 분절은 재배열된 중쇄 가변 서열(이하 "보편적 중쇄" 또는 "UHC")을 설계하도록 선택되었다.
간단히 말하면, 하기 4개의 후보 재배열된 VDJ 서열을 (IDT에 의해) 신생 합성하고, CMV 발현 벡터(예를 들어, pRG1301 또는 pRG1368)로 클로닝하였다: (1) hVH3-23(D4-4_RF2)JH4(서열 번호 148); (2) hVH3-23(D4-4_RF2)JH6(서열 번호 146); (3) hVH3-23(D4-4_RF3)JH4(서열 번호 147); (4) hVH3-23(D4-4_RF3)JH6(서열 번호 145). 모든 이 작제물은, 합성된 UHC 유전자가 Xho I/Sap I에 의한 분해 후 pRG1301(hIgG1) 또는 pRG1368(mIgG1) 벡터에 결찰될 수 있는 방식으로 설계되었다. 발현 분석을 위해, pIDTSMART에서의 4개의 UHC 유전자(1-4)를 pRG1301(hIgG1) 또는 pRG1368(mIgG1)의 Xho I/Sap I 부위로 서브클로닝하고, 각각의 발현 작제물을 CHO 세포에 별개로 형질감염시켰다. 형질감염 시, 모든 4개의 후보 VDJ 서열은 충분한 수준으로 발현되었고, 발현된 펩타이드는 상이한 κ 및 λ 경쇄와 쌍 지을 수 있었다.
유전적으로 변형된 마우스에서 B 세포 결실을 발생시킬 수 있는 가능한 자가반응성 항체를 피하기 위해, hVH3-23(D4-4)JH4와 유사한 아미노산 서열을 함유하는 항체에 대해, 벨로시뮨(등록상표) 인간화 마우스에 의해 생성된 항체로부터 생성된, 리제네론 파마슈티컬스의 ASAP 항체 데이터베이스를 조사하였다(도 5). 더 구체적으로, 비자가반응성 항체를 확인하기 위해 이용된 기준은 DYSNY(서열 번호 144)의 아미노산 서열 또는 DYSNY(서열 번호 144)와 유사한 서열을 포함하였다. 그러나, CHO 세포에서의 발현 연구는 DYSNY(서열 번호 144)를 함유하는 UHC 서열이 포유동물 세포에서 잘 발현되지 않는다는 것을 나타냈다. 따라서, D가 결핍되지만 서열 YSNY(즉, 항체 H1H2002B; AKGYYFDY(서열 번호 143); 여기서 AK는 3-23으로부터이고; GY는 D 또는 N 부가 또는 N 및 P 부가로부터이고; YFDY는 JH4임)를 갖는 또 다른 서열을 대신에 선택하고 CHO 세포에서의 이의 발현에 대해 시험하였다. 변형된 UHC 서열은 CHO 세포에서 충분한 수준으로 발현되었다. 이 결과는 포유동물 세포에서 재배열된 VDJ 서열의 적절한 발현을 위해 중쇄 V 유전자 분절에 의해 코딩된 서열과 중쇄 J 유전자 분절에 의해 코딩된 서열 사이에 일부 아미노산 잔기(즉, 스페이서)가 필요하다는 것을 제시한다.
또한, CHO 세포에서 재배열된 VDJ 서열(VH3-23/GY/JH4; HIH2002B)로부터 유래한 펩타이드 AKGYYFDY의 발현 수준을 5개의 인간 κ 사슬, 3개의 인간 λ 사슬 및 다른 재배열된 VDJ 서열(즉, VH3-20 및 VH1-39)에 의한 발현과 관련하여 VH3-23/D4-4(리딩 프레임 2)/JH4(서열 번호 148)로부터 유래한 펩타이드와 비교하였다. 선택되는 재배열된 VDJ 서열(VH3-23/GY/JH4)은 대조군과 동등한 발현 수준을 나타냈다.
이 데이터에 기초하여, 유전적으로 변형된 마우스를 생성하기 위한 재배열된 중쇄 가변 도메인 서열로서 VH3-23/GY/JH4(서열 번호 137; HIH2002B)를 선택하였다. 재배열된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 좌위를 함유하는 마우스(즉, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역을 포함하는 면역글로불린 좌위를 포함하는 마우스)를 생성하기 위한 상세한 표적화 전략이 도 1 내지 도 9에 도시되어 있고 하기 기재되어 있다.
실시예 2. 재배열된 VDJ 서열을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위의 작제
박테리아 인공 염색체(BAC) DNA를 사용하여 박테리아 세포(BHR)에서의 일련의 상동성 재조합 반응에 의해 재배열된 인간 VDJ 서열을 함유하는 면역글로불린 중쇄 좌위의 작제를 수행하였다. 벨로시진(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 기술(예를 들어, US 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6):652-659](본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조)을 이용하여 재배열된 중쇄 가변 도메인을 발현하는 유전적으로 조작된 마우스의 기준을 위한 몇몇 표적화 작제물을 생성하였다.
간단히 말하면, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 V, D, J 유전자 분절이 결실된 유전적으로 변형된 마우스로 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(즉, hVH3-23(D)JH4; 서열 번호 136)을 도입하도록 표적화 벡터를 설계하였다. 또한, 표적화 벡터는 마우스에서 Adam6a/6b 유전자를 포함하는 게놈 구역의 결실과 관련된 생식력 문제를 방지하기 위해 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 게놈 구역을 포함하였다(예를 들어, US 제2012-0322108A1호(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조).
초기에, 2239bp VH3-23 프로모터(서열 번호 139)에 작동 가능하게 연결된, 리더 서열(소포체를 통해 중쇄를 안내함), 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(VH3-23(D)JH4; 서열 번호 136) 및 hJH4의 인트론(서열 번호 140)을 포함하는 마우스 BAC 클론을 변형하기 위한 BHR 공여자를 작제하였다. 추가로, 게놈 좌위는 MAID1115 BAC 클론과의 상동성 재조합을 위해 마우스 IgH 상동성 박스에 의해 5' 및 3'에 플랭킹되었다(도 1).
또한, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 표적화 작제물을 생성하기 위해 하기 5개의 변형을 수행하였다.
첫째로, 스펙티노마이신 선택 카세트를 VH3-23 프로모터의 상류에(I-CeuI 부위와 SpeI 부위 사이) 도입하여 pJSh0038(UHC 미니-좌위; 서열 번호 142)(도 1, 1. I-CeuI/SpeI 결찰(Amp+Spec))를 생성하였다. UHC 미니-좌위는 (1) 결찰을 위한 I-CeuI/AscI 부위를 갖는 스펙티노마이신(Spec) 카세트; (2) 2239bp hVH3-23 프로모터(서열 번호 139); (3) 재배열된 hVH3-23(D)JH4 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 136); (4) hJH4 인트론(서열 번호 140); 및 (5) BHR(MAID 1115)을 위한 마우스 상동성 박스를 함유한다.
둘째로, IgM 게놈 구역의 상류에서 loxP 플랭킹된 네오마이신 카세트(Pgk-Neo)를 함유하는 MAID 1115 BAC 클론의 게놈 구역의 5' 말단에 하이그로마이신 선택 카세트(EM7-HYG)를 표적화하였다. 하이그로마이신 카세트의 삽입은 MAID 1115 클론의 5' 말단에 위치한 loxP 부위를 결실시켰다. 하이그로마이신/카나마이신 선택(도 2, 2. BHR(Hyg+Kan))을 통해 유전적으로 변형된 BAC 클론(VI432)을 함유하는 박테리아 세포를 선택하였다.
셋째로, VI432 BAC 클론의 IgM 좌위의 상류로 단계 1에서 작제된 UHC 미니-좌위를 표적화하였다. UHC 미니-좌위의 도입은 플록싱된(floxed) 네오마이신 선택 카세트를 새로운 스펙티노마이신 카세트(VI443)에 의해 대체하였다. 스펙티노마이신 및 하이그로마이신 선택(도 2; 3. BHR(Spec+Hyg))을 통해 유전적으로 변형된 BAC 클론(VI443)을 함유하는 박테리아 세포를 선택하였다.
넷째로, 5'로부터 3'로 (1) Adam6a 유전자(3'에서 5' 방향으로 존재); (2) FRT 부위에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트(3'에서 5' 방향으로 존재); (3) Adam6b 유전자(3'에서 5' 방향으로 존재); (4) 유전자간 제어 구역 1(IGCR1; 즉, 중요한 V(D)J 재조합 조절 구역); 및 (5) 스펙티노마이신 카세트(5'에서 3' 방향으로 존재)를 포함하는 VI421 BAC 클론을 pDBa0049 작제물에 의해 표적화하였고, 이 작제물은 클로르암페니콜(Cm) 카세트; 클로르암페니콜 유전자의 상류에 AscI 제한 부위; 및 5' 및 3' 상동성 암을 함유한다. pDBa0049 작제물의 표적화는 VI421 클론으로부터 IGCR1 및 스펙티노마이신 카세트를 제거하고; Adam6b 유전자의 하류에 새로운 AscI 제한 부위 및 클로르암페니콜 카세트를 도입하였다. 클로르암페니콜 및 카나마이신 선택(도 3; 4. BHR(Cm+Kan))을 통해 성공적으로 표적화된 클론(VI444)을 함유하는 박테리아 세포를 선택하였다.
다섯째로, 제한 분해 및 결찰을 통해 I-CeuI 부위와 AscI 부위 사이의 VI443 BAC 클론에서 보편적 중쇄 게놈 좌위의 상류에 Adam6a 및/또는 6b 유전자를 함유하는 VI444 BAC 클론의 게놈 구역을 도입하였다(도 3). 이 변형은 Adam6a 및/또는 6b 유전자를 클론으로 도입하고 스펙티노마이신 카세트를 네오마이신 카세트에 의해 대체하여, 최종 표적화 작제물(MAID6031; VI445)을 생성시켰다. 하이그로마이신 및 카나마이신 선택(도 3, 5. I-CeuI/AscI 결찰(Hyg+Kan))에 기초하여 최종 표적화 작제물(MAID 6031; VI445)을 함유하는 박테리아 세포(BHR)를 선택하였다.
재배열된 인간 중쇄 가변 도메인 서열을 함유하는 게놈 좌위의 기준을 위한 최종 표적화 작제물(MAID6031)은 5'로부터 3'로 (1) 내인성 Ig 중쇄 좌위의 상류의 약 20000bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암; (2) Adam6a 유전자; (3) 5' FRT 부위; (4) 네오마이신 카세트; (5) 3' FRT 부위, (6) Adam6b 유전자; (7) 2239bp의 hVH3-23 프로모터(서열 번호 139); (8) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 뉴클레오타이드 서열(hVH3-23(D)JH4; 서열 번호 136); (9) hJH4 인트론(서열 번호 140); 및 (10) 마우스 JH 유전자 분절의 하류의 약 7400bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 함유한다.
MAID6031 BAC DNA인 최종 표적화 작제물을 선형화하고, 1661 이형접합성 마우스로부터 단리된 ES 세포로 전기천공하고(도 4), 이 마우스는 야생형 Ig 중쇄 VDJ 게놈 좌위 및 모든 VH, D, JH 유전자가 결실된 돌연변이된 VDJ 게놈 좌위를 함유한다. 도 6 내지 도 8에 도시된 프라이머 및 프로브를 사용하여 성공적으로 표적화된 마우스 ES 세포를 스크리닝하였다. 성공적으로 표적화된 마우스 ES 세포를 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기술을 이용하여 숙주 마우스 배아로 도입하여 유전적으로 변형된 이형접합성 F0 마우스를 생성하였다. 선택 카세트(즉, FRT-Ub-Neo-FRT)가 없는 마우스(MAID 6032 het)를 생성하기 위해, 숙주 배아를 도입하기 전에 Flp 재조합효소를 발현하는 플라스미드에 의해 성공적으로 표적화된 ES 세포를 전기천공하였다. 대안적으로, 선택 카세트를 보유하는 MAID6031 이형접합성 수컷 마우스를 Flp 재조합효소를 발현하는 암컷 마우스와 번식시켜 카세트를 제거하였다. 변형을 보유하는 이형접합성 마우스를 서로에 번식시켜 오직 유전적으로 변형된 좌위로부터 면역글로불린 중쇄를 만들 수 있는 동형접합체(MAID 6032 HO)를 생성하였다.
실시예 3. 재배열된 중쇄 가변 도메인을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스의 규명
모든 마우스를 리제네론 파마슈티컬스에서 특수 병원균 비함유 조건에서 감금하고 사육하였다. 3마리의 야생형(WT) 한배 새끼 대조군 마우스(16주령, 수컷, n=2; 배경: 75% C57/BL6 및 25% 129) 및 2마리 내지 4마리의 MAID 6032 HET F0 마우스(도 9; 9주령, 수컷, n=2; 배경: 50% C57/BL6 및 50% 129)를 희생시키고, 동물로부터 혈액, 비장 및 골수를 수확하였다. 추가로, 4마리의 야생형(WT) 한배 새끼 대조군 마우스(10주령; 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷) 및 4마리의 MAID 6032 동형접합성("HO") F2 마우스(10주령; 3마리의 수컷; 1마리의 암컷)를 희생시키고, 동물로부터 혈액, 비장 및 골수를 수확하였다. EDTA(카테고리 365973호)를 갖는 BD 마이크로테이너(microtainer) 관에 혈액을 수집하였다. 완전한 RPMI 배지(소 태아 혈청, 피루브산나트륨, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 플러싱 처리(flushing)함으로써 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 말초 혈액, 비장 및 골수 제제로부터의 적혈구를 ACK 용해 완충제에 의해 용해시키고, 완전한 RPMI 배지에 의해 세척하였다.
유세포분석법
유전적으로 변형된 대립유전자(즉, 재배열된 VH3-23/D/JH4의 단일 카피를 함유하는 대립유전자)로부터 유래한 항체를 생성하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 이형접합성 F0 마우스(MAID 6032 HET)의 능력을 검사하기 위해, 야생형 또는 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 혈액, 비장, 골수 세포를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다.
간단히 말하면, 1x106개의 세포를 10분 동안 얼음에서 마우스 항-CD16/CD32 항체(2.4G2, BD)와 항온처리한 후, 30분 동안 얼음에서 하기 항체 칵테일에 의해 라벨링하였다: 항마우스 FITC-IgMa(DS-1, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)), 퍼시픽 블루(Pacific blue)-CD3(17A2, 바이오레전드(BioLegend)), APC-H7-CD19(1D3, 비디 바이오사이언시스) 및 PE-IgMb(AF6-78, 바이오레전드). 염색된 세포를 세척하고 2% 폼알데하이드 중에 고정하였다. 데이터 획득을 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 수행하고 플루조(FlowJo)에 의해 분석하였다. 야생형 또는 F0 6032 이형접합성 마우스로부터 단리된 골수 세포, 비장 세포 및 혈액 세포를 일중항에서 개폐하고, CD19 발현(B 세포 마커) 또는 CD3 발현(T 세포 마커)에 기초하여 분류하였다. 또한, IgMb 항체(야생형 대립유전자(B6 대립유전자)로부터 생성된 IgM 항체) 또는 IgMa 항체(재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열(hVH3-23(D)JH4)을 포함하는 유전적으로 변형된 대립유전자(129 대립유전자)로부터 생성된 항체)의 존재에 기초하여 CD19+ 개폐된 B 세포를 분류하였다. FACS 분석(도 11 내지 도 12)은 표적화된 대립유전자(즉, 재배열된 중쇄 가변 서열의 1개의 카피를 함유; MAID 6032 het)와 관련하여 이형접합성인 마우스가 유전적으로 변형된 129(IgMa) 대립유전자로부터 대부분 유래한 IgM 항체를 생성할 수 있다는 것을 제시한다.
유전적으로 변형된 대립유전자(즉, 재배열된 VH3-23/D/JH4의 단일 카피를 함유하는 대립유전자)로부터 유래한 항체를 생성하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 동형접합성 F2 마우스(MAID 6032 HO)의 능력을 검사하기 위해, 야생형 또는 6032 동형접합성 마우스로부터 단리된 비장 및 골수 세포를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 상기 기재된 바대로 수행하였다.
오직 성숙 B 림프구가 림프절 및 비장의 림프성 소낭에 진입하고 따라서 면역 반응에서 효과적으로 참여할 수 있다. 성숙한, 오래 사는 B 림프구는 골수에서 생성된 짧게 사는 전구체로부터 유래한다. 성숙 풀(pool)로의 선택은 활성 과정이고 비장에서 일어난다. 비장 B 세포의 2개의 집단은 성숙 B 세포에 대해 전구체로서 확인되었다. 1형의 이행성 B 세포(T1)는 골수로부터 최근의 이민자이다. 이것은 2형의 이행성 B 세포(T2)로 전개되고, 이것은 순환하고 비장의 1차 소포에서 배타적으로 발견된다. 성숙 B 세포는 T1 또는 T2 B 세포로부터 생성될 수 있다(Loder, F. et al., J. Exp. Med., 190(1): 75-89, 1999).
FACS 분석(도 13a 및 도 13b)은 표적화된 대립유전자(즉, 재배열된 중쇄 가변 서열의 2개의 카피를 함유: MAID 6032 HO)와 관련하여 동형접합성인 마우스가 야생형에 대해 람다 서열에서의 약간의 감소에도 불구하고 정상인 비장 성숙 및 미성숙 B 세포 집단을 생성할 수 있다는 것을 제시한다(도 13c 및 도 13d). 또한 비장에서, MAID 6032HO 마우스는 T1 집단 B 세포의 약간의 감소 및 변연부 B 세포의 증가를 나타낸다(도 13e).
골수에서, MAID6032 HO 마우스는 야생형(도 14f)의 반인 람다 서열의 사용빈도를 갖는 거의 정상인 B 세포 집단(도 14a 내지 도 14e)을 생성하였다.
면역화 연구
5마리의 WT(75% C57BL6/25% 129 배경) 및 3마리 내지 4마리의 MAID 6032 HET 마우스를 2.35㎍의 항원 X, 10㎍의 CpG 올리고뉴클레오타이드(ODN 1826, 인비보겐(InvivoGen), 카탈로그 tlrl-1826호) 및 25㎍의 인산알루미늄 겔 아쥬번트(브렝탕(Brenntag) 카탈로그 7784-30-7호)를 함유하는 0.025㎖의 혼합물에 의해 족적에서 면역화하였다. 마우스를 동일한 투약량으로 6회 부스팅하였다. 1차 면역화 후 15일에 및 24일에, BD 혈청 분리기 관(BD, 카탈로그 365956호)으로 후안와 출혈을 이용하여 마취된 마우스로부터 혈액을 수집하였고, 제조업자의 방향에 따라 혈청을 수집하였다.
항원 특이적 IgG 항체의 수치를 측정하고 mmh(myc-myc-his) 태그를 상호 스크리닝하기 위해, 4℃에서 밤새 항온처리된 1㎍/㎖의 항원 X에 의해 ELISA 플레이트(Nunc)를 코팅하였다. 과량의 항원을 세척한 후 실온에서 1시간 동안 PBS + 1% BSA에 의해 차단하였다. 혈청의 연속 희석을 적용하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 서양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합된 항-IgG(카탈로그 1030-05호, 사우던 바이오테크(Southern Biotech)) 항체와 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질(카탈로그 555214호, BD)에 의해 전개시켰다. 반응을 1N 황산에 의해 중지시키고, 빅터 X5 퍼킨 엘머 판독기(Victor X5 Perkin Elmer Reader)를 사용하여 450㎚에서 O.D.를 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에 의해 분석하여 배경보다 2배 높은 혈청의 희석을 계산하였다. IACUC 및 리제네론 파마슈티컬스가 모든 동물 실험을 승인하였다.
도 15에 도시된 바대로, 표적화된 대립유전자(즉, 재배열된 VH3-23/D/JH4 뉴클레오타이드 서열의 1개의 카피를 함유)와 관련하여 이형접합성인 유전적으로 변형된 F0 및 F1 마우스(MAID 6032 het)는 1차 면역화 후 15일 및 24일 둘 다에 야생형 마우스에 의해 생성된 것과 필적하는 수치로 항원 특이적 IgG 항체를 생성할 수 있었다.
실시예 3. 2개의 인간 경쇄 V 분절을 포함하는 마우스의 생성 및 분석
실시예 3.1: 2개의 인간 경쇄 V 분절을 포함하는 마우스의 생성을 위한 표적화 벡터의 작제
2개의 인간 Vκ 유전자 분절을 함유하는 2개의 조작된 경쇄 좌위(예를 들어, 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20 유전자 분절; 즉, 이중 경쇄("DLC"))를 작제하였다(도 20). 1개의 조작된 경쇄 좌위는 재배열되지 않은 입체구성에서 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절을 함유하였다(DLC-5J). 제2 조작된 경쇄 좌위는 재배열되지 않은 입체구성에서 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절을 함유하였다(DLC-1J). 2개의 추가의 조작된 경쇄 좌위의 각각의 경우, 인간 유전자 분절은 B 세포에서의 인간 유전자 분절의 생체내 재배열을 허용하도록 재조합 신호 서열에 의해 3'에 플랭킹되었다.
DLC -1J 마우스의 조작 및 생성. DLC-1J라 달리 칭하는, 2개의 인간 Vκ 유전자 분절(Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절(Jκ5)을 포함하는 경쇄 좌위를 생성시키는 조작 단계가 도 21에 도시되어 있다. 구체적으로, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 서열을 BAC 주형(인비트로겐)으로부터 PCR에 의해, UB-하이그로마이신 선택 카세트(도 21a)를 함유하는 플라스미드로 4방향 결찰을 통해 클로닝된, 재조합 신호 서열(rss) 및 인간 Jκ5 분절을 함유하는 증폭된 서열과 함께 증폭시켰다. 5' 및 3' 암을 도 21b 및 도 21c에 도시된 바대로 부착시켰다.
생성된 표적화 작제물은 도 21c(하부 다이어그램; DLC-1J)에 도시되어 있고, 재조합 신호 서열(RSS)은 투명한 타원형이다. 2개의 인간 Vκ 유전자 분절을 함유하는 조작된 경쇄 좌위 내에 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 마우스 서열에 작동 가능하게 연결된 조작된 DLC-1J 경쇄 좌위의 변형된 BAC DNA 클론(즉, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 상류 및 하류 서열)을 확인한 후, 마우스 Igκ 가변 좌위(κ 가변 및 연결 유전자 분절을 포함)의 결실을 포함하는 ES 세포로 전기천공하여(도 21d) 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 중 하나를 발현하는 마우스를 생성하였다. 조작된 DLC-1J 경쇄 좌위를 함유하는 양성 ES 세포 클론은 조작된 DLC-1J 경쇄 좌위에 특이적인 프로브를 사용한 핵형분석 및 택맨(Taqman)(상표명) 스크리닝에 의해 확인되었다. DLC-1J ES 세포의 ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 하기 표 8에 기재되어 있고, 서열 목록에 포함된다.
Figure 112015077557708-pct00001
이후, 확인된 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스를 이식하여 DLC-1J 경쇄 좌위를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 한배 새끼를 생성시켰다. 새끼의 유전자형분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열이 상기 표 8에 기재되어 있다. 삽입된 조작된 서열의 상류 및 하류의 마우스 서열의 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 DLC-1J 좌위에 걸친 서열이 도 22a 내지 도 22d에 제시되어 있고, 서열 번호 82에 기재되어 있다.
FLP를 발현하는 작제물에 의해 조작된 경쇄 좌위를 보유한 ES 세포를 형질감염시켜 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 21e 참조). 임의로, FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 번식시킴으로써 네오마이신 카세트를 제거하였다(예를 들어, US 제6,774,279호). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유되었다.
DLC -5J 마우스의 조작 및 생성. 2개의 인간 Vκ 유전자 분절(Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절(Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)(달리 DLC-5J라 칭함)을 포함하는 경쇄 좌위를 생성하기 위해, 모든 5개의 인간 Jκ를 포함하는 2000개의 염기 쌍 증폭된 서열을 도 21b(중간)에 도시된 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ를 포함하는 벡터에 결찰하였다(도 23a 참조). 후속적인 조작 단계는 도 23b에 도시된 바대로 3' 및 5'의 부착을 포함하였다.
생성된 표적화 작제물이 도 23b(하부 다이어그램; DLC-5J)에 도시되어 있고, 재조합 신호 서열(RSS)은 투명한 타원형이다. 2개의 인간 Vκ 유전자 분절을 함유하는 조작된 경쇄 좌위 내에 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 마우스 서열에 작동 가능하게 연결된 조작된 DLC-5J 경쇄 좌위의 변형된 BAC DNA 클론(즉, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 상류 및 하류 서열)을 확인한 후, 마우스 Igκ 가변 좌위(κ 가변 및 연결 유전자 분절을 포함)의 결실을 포함하는 ES 세포로 전기천공하여(도 23c) 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 중 하나를 발현하는 마우스를 생성하였다. 조작된 DLC-5J 경쇄 좌위를 함유하는 양성 ES 세포 클론은 조작된 DLC-5J 경쇄 좌위에 특이적인 프로브를 사용한 핵형분석 및 택맨(상표명) 스크리닝에 의해 확인되었다. DLC-5J ES 세포의 ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 하기 표 9에 기재되어 있고, 서열 목록에 포함된다.
Figure 112015077557708-pct00002
이후, 확인된 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스를 이식하여 DLC-5J 경쇄 좌위를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 한배 새끼를 생성시켰다. 새끼의 유전자형분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열이 상기 표 9에 기재되어 있다. 삽입된 조작된 서열의 상류 및 하류의 마우스 서열의 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 DLC-5J 좌위에 걸친 서열이 도 24a 내지 도 24d에 제시되어 있고, 서열 번호 83에 기재되어 있다.
FLP를 발현하는 작제물에 의해 조작된 경쇄 좌위를 보유한 ES 세포를 형질감염시켜 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 23d 참조). 임의로, FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 번식시킴으로써 네오마이신 카세트를 제거하였다(예를 들어, US 제6,774,279호). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유되었다.
실시예 3.2: 2개의 인간 V 분절을 포함하는 마우스의 규명
유세포분석법. DLC 마우스에서의 B 세포 집단 및 B 세포 발생을 비장세포 및 골수 제제의 유세포분석법 분석에 의해 검증하였다. 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스 (n=4), 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(n=4) 및 야생형 마우스(n=4)로부터의 세포 현탁액을 표준 방법을 이용하여 만들고 형광 라벨링된 항체에 의해 염색하였다.
간단히 말하면, 1x106개의 세포를 10분 동안 얼음에서 항마우스 CD16/CD32(클론 2.4G2, 비디 파미겐(BD Pharmigen))와 항온처리한 후, 30분 동안 얼음에서 하기 항체 칵테일에 의해 라벨링하였다: APC-H7 접합된 항마우스 CD19(클론 1D3, 비디 파미겐), 퍼시픽 블루 접합된 항마우스 CD3(클론 17A2, 바이오레전드), FITC 접합된 항마우스 Igκ(클론 187.1, 비디 파미겐) 또는 항마우스 CD43(클론 1B11, 바이오레전드), PE 접합된 항마우스 Igλ(클론 RML-42, 바이오레전드) 또는 항마우스 c-키트(클론 2B8, 바이오레전드), PerCP-Cy5.5 접합된 항마우스 IgD(바이오레전드), PE-Cy7 접합된 항마우스 IgM(클론 II/41, 이바이오사이언스(eBioscience)), APC 접합된 항마우스 B220(클론 RA3-6B2, 이바이오사이언스). 염색 후, 세포를 세척하고 2% 폼알데하이드 중에 고정하였다. 데이터 획득을 LSRII 유세포분석기에서 수행하고 플루조(Tree Star, Inc.)에 의해 분석하였다. 개폐: 전체 B 세포(CD19+CD3-), Igκ+ B 세포(Igκ+Igλ-CD19+CD3-), Igλ+ B 세포(Igκ-Igλ+CD19+CD3-). 골수 구획에 대한 결과가 도 25a 내지 도 27b에 도시되어 있다. 비장 구획에 대한 결과가 도 28a 내지 도 31에 도시되어 있다.
이 실시예에 기재된 바대로, DLC-5J 마우스는 비장 및 골수 구획 내의 정상 B 세포 집단을 나타낸다(도 25a 내지 도 31). DLC-5J 마우스는 야생형 한배 새끼에서 관찰된 것과 실질적으로 동일한 골수 구획 내의 미성숙, 성숙 및 프리/프로 B 세포 집단을 나타낸다. 사실, DLC-5J 좌위는 내인성 람다 경쇄 좌위와 경쟁하여 야생형 마우스에서 관찰된 것과 실질적으로 동일한 카파:람다 비율을 생성할 수 있다(도 27b). 또한, DLC-5J 마우스는, 비장 구획(예를 들어, 미성숙, 성숙, T1, T2 T3, 변연부 전구체, 변연부, 소포성-I, 소포성-II 등)에서 다양한 단계에 걸친 B 세포의 진행이 야생형 마우스에서 관찰된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 발생하면서, 정상 말초 B 세포 발생을 나타낸다(도 30a 내지 도 31). 반대로, DLC-1J 마우스는 조작된 카파 경쇄와 비교하여 더 낮은 전체 B 세포 수 및 증가한 람다 경쇄 사용빈도(데이터 비도시)를 나타낸다.
이중 경쇄 발현. 정량적 PCR 검정을 이용하여 동형접합성 마우스에서 인간 Vκ 유전자 분절 둘 다의 발현을 분석하였다. 간단히 말하면, 야생형 마우스, 상응하는 인간 중쇄 및 κ 경쇄 가변 구역 좌위(Hκ)에 의한 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 가변 좌위의 대체에 동형접합성인 마우스, 및 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개 중 어느 하나의 인간 Jκ 유전자 분절(DLC-5J) 또는 1개의 인간 Jκ 유전자 분절(DLC-1J)을 함유하는 조작된 κ 경쇄 좌위에 대해 동형접합성인 마우스의 골수 및 전체 비장으로부터 CD19+ B 세포를 정제하였다. 상대 발현을 마우스 Cκ 구역(그룹마다 n = 3마리 내지 5마리의 마우스)의 발현으로 정규화하였다. 결과가 도 32 및 도 33에 도시되어 있다.
DLC-5J 및 DLC-1J 마우스의 골수 및 비장 둘 다에서 재배열된 인간 Vκ3-20 또는 인간 Vκ1-39 유전자 분절을 함유하는 경쇄의 발현을 검출하였다(도 32 및 도 33). 골수 구획에서, DLC 마우스의 균주 둘 다에서의 인간 Vκ3-20 유래 및 인간 Vκ1-39 유래 경쇄 둘 다의 발현은 상응하는 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절(Hκ; 도 32)에 의한 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 대체를 포함하는 마우스와 비교하여 상당히 더 높았다. 인간 Vκ3-20 유래 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 6배(DLC-5J) 내지 15배(DLC-1J) 더 높게 관찰되었다. DLC-1J 마우스는 골수 구획에서 DLC-5J 마우스에 대해 인간 Vκ3-20 유래 경쇄의 약 2배 더 높은 발현을 나타냈다. 인간 Vκ1-39 유래 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 6배(DLC-5J) 내지 13배(DLC-1J) 더 높게 관찰되었다. DLC-1J 마우스는 골수 구획에서 DLC-5J 마우스에 대해 인간 Vκ1-39 유래 경쇄의 약 2배 더 높은 발현을 나타냈다.
비장 구획에서, DLC 마우스의 균주 둘 다에서의 인간 Vκ3-20 유래 및 인간 Vκ1-39 유래 경쇄 둘 다의 발현은 Hκ 마우스와 비교하여 상당히 더 높았다(도 33). 인간 Vκ3-20 유래 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 4배(DLC-5J) 및 8배(DLC-1J) 더 높게 관찰되었다. DLC-1J 마우스는 비장 구획에서 DLC-5J 마우스에 대해 인간 Vκ3-20 유래 경쇄의 약 2배 더 높은 발현을 나타냈다. 인간 Vκ1-39 유래 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 4배(DLC-5J) 내지 5배(DLC-1J) 더 높게 관찰되었다. DLC-1J 마우스는 비장 구획에서 DLC-5J 마우스와 비교하여 인간 Vκ1-39 유래 경쇄의 유사한 발현을 나타냈다.
DLC -5J 마우스에서의 인간 Vκ / Jκ 사용빈도. 역전사효소 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에 의해 비장 B 세포에서의 인간 Vκ/Jκ 유전자 분절 사용빈도에 대해 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)를 분석하였다.
간단히 말하면, 동형접합성 DLC-5J(n=3) 및 야생형(n=2) 마우스로부터의 비장을 수확하고, 젖빛 유리 슬라이드를 사용하여 10% 열 불활화 소 태아 혈청을 함유하는 10㎖의 RPMI 1640(시그마(Sigma)) 중에 메싱(meshing)하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 비장세포를 원심분리(5분 동안 1200rpm)에 의해 펠렛화하고, 적혈구를 3분 동안 5㎖의 ACK 용해 완충제(깁코(Gibco)) 중에 용해시켰다. 비장세포를 PBS(얼바인 사이언티픽(Irvine Scientific))에 의해 희석시키고, 0.7㎛ 세포 균주기에 의해 여과시키고, 다시 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 이후 1㎖의 PBS 중에 재현탁시켰다.
제조업자의 사양에 따라 AllPrep DNA/RNA 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 펠렛화 비장세포로부터 RNA를 단리하였다. 제조업자의 사양(인비트로겐)에 따라 마우스 Cκ 유전자에 특이적인 프라이머에 의해 5' RACE(Rapid Amplification of cDNA end: cDNA 말단의 신속한 증폭) 시스템을 사용하여 비장세포 RNA에서 RT-PCR을 수행하였다. 마우스 Cκ 유전자에 특이적인 프라이머는 3' mIgκC RACE1(AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC; 서열 번호 90) 및 mIgκC3'-1(CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; 서열 번호 91)이다. PCR 생성물을 겔 정제하고, pCR(등록상표)2.1-토포(TOPO)(등록상표) 벡터(토포(등록상표) TA 클로닝(등록상표) 키트, 인비트로겐)로 클로닝하고, 클로닝 부위를 플랭킹하는 위치에서 벡터 내에 위치한 M13 정방향 프라이머(GTAAAACGAC GGCCAG; 서열 번호 92) 및 M13 역방향 프라이머(CAGGAAACAG CTATGAC; 서열 번호 93)에 의해 서열분석하였다. 각각의 비장 샘플로부터의 10개의 클론을 서열분석하였다. 서열을 IMGT/V-QUEST 기준 디렉터리 세트로부터의 마우스 및 인간 면역글로불린 세트와 비교하여 Vκ/Jκ 사용빈도를 결정하였다. 표 10은 각각의 비장세포 샘플로부터의 RT-PCR 클론에서 관찰된 선택된 클론에 대해 Vκ/Jκ 조합을 기술한다. 표 11은 DLC-5J 동형접합성 마우스로부터의 선택된 RT-PCR 클론의 인간 Vκ/인간 Jκ 및 인간 Jκ/마우스 Cκ 연접부의 아미노산 서열을 기술한다. 소문자는 재조합 동안 N 및/또는 P 부가로부터 생긴 비주형 부가 또는 가변 구역의 아미노산 서열에서의 돌연변이를 나타낸다.
이 실시예에 기재된 것처럼, 마우스 Cκ 유전자에 작동 가능하게 연결된 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절에 동형접합성인 마우스(DLC-5J)는 인간 Vκ 유전자 분절 둘 다를 복수의 인간 Jκ 유전자 분절에 생산적으로 재조합하여 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 생성할 수 있다. 표 10에 기재된 DLC-5J 동형접합성 마우스에서의 재배열 중에서, Vκ1-39/Jκ2(1), Vκ1-39/Jκ3(1), Vκ3-20/Jκ1(7), Vκ3-20/Jκ2(4) 및 Vκ3-20/Jκ3(1)에 대해 독특한 인간 Vκ/Jκ 재배열이 관찰되었다. 추가로, 이러한 독특한 재배열은 발생 동안 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 재조합 및/또는 돌연변이로부터 생긴 경쇄의 CDR3 구역 내의 독특한 아미노산의 존재를 통해 연접부 다양성(표 11)을 나타낸다. 모든 재배열은 마우스 Cκ로의 기능적 리드(read)를 나타낸다(표 11).
종합하면, 이 데이터는 2개 이하의 인간 Vκ 유전자 분절(이들 둘 다 (예를 들어, 1개 이상 및 몇몇 실시형태에서 5개 이하의 인간 Jκ 유전자 분절에 의해) 재배열하고 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 코딩할 수 있음)의 선택을 제시하도록 조작된 마우스가 B 세포 수 및 모든 양상에서 거의 야생형인 발생을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 마우스는 수집에서 존재하는 2개 중 1개의 가능한 인간 VL 유전자 분절을 갖는 면역글로불린 경쇄를 갖는 항체 수집을 생성한다. 마우스는 항원 공격에 반응하여 이 항체 수집을 생성하고, 항체 수집은 리버스 키메라(인간 가변/마우스 불변) 중쇄의 다양성과 관련된다.
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실시예 4: 2개의 히스티딘 치환된 인간 경쇄를 포함하는 마우스의 생성 및 규명
실시예 4.1: 각각 4개의 히스티딘 치환을 함유하는 2개의 V 카파 분절을 포함하는 마우스의 조작 및 생성
Vκ1-39 및 Vκ3-20 ULC 마우스에 대해 상기 기재된 바대로 이중 경쇄 좌위로 히스티딘 치환을 도입하였다. 간단히 말하면, 도 23a(하부)에 도시된 DLC 서열을 도 34에 도시된 프라이머를 사용하여 처음에 Vκ1-39 서열을 변형시키고 후속하여 Vκ3-20 서열을 변형시킴으로써 부위 지정 돌연변이유발로 처리하였다. 생성된 이중 경쇄 서열은 히스티딘이 105번, 106번, 108번 및 111번 위치에서 생식선 서열로 도입된 Vκ1-39 분절, 히스티딘이 105번, 106번, 107번 및 109번 위치에서 생식선 서열로 도입된 Vκ3-20 분절, 및 모든 5개의 Jκ 분절(Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)을 함유하였다. 후속적인 조작 단계는 FRT-Ub-Neo-FRT 카세트를 보유하는 5' 암, 및 마우스 Igκ 인핸서 및 불변 구역을 보유하는 3' 암의 부착을 포함하였다. 이 표적화 벡터를 도 35a(재조합 신호 서열, RSS, 이 도면에서 생략됨)에 도시된 바대로 마우스 Igκ 가변 좌위(κ 가변 및 연결 유전자 분절을 포함)의 결실을 포함하는 ES 세포로 전기천공하였다. 표 1, 표 5, 표 8 및 표 9에서 상기 기재된 구역(구체적으로, 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mIgKd2 및 mIgKp15)을 검출한 프라이머 및 프로브, 및 하기 표 12에 기재된 프라이머 및 프로브의 2개의 추가의 세트를 사용하여 상기 기재된 바대로 대립유전자 검정의 변형에 의해 표적화된 ES 세포를 스크리닝하였다. 프라이머 및 프로브의 이 2개의 추가의 세트의 서열이 서열 목록에 포함된다.
Figure 112015077557708-pct00006
이후, 확인된 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스를 이식하여 2개의 존재하는 VL 분절 서열의 각각에서 4개의 히스티딘 변형을 갖는 DLC-5J 경쇄 좌위를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 한배 새끼를 생성시켰다. ES 세포 스크리닝에 사용된 것과 동일한 서열의 일부를 또한 새끼의 유전자형분석에 사용하였다.
FLP를 발현하는 작제물(예를 들어, FLPo)에 의해 조작된 경쇄 좌위를 보유한 ES 세포를 형질감염시켜 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 35b 참조, RSS는 이 도면에서 생략됨). 임의로, FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 번식시킴으로써 네오마이신 카세트를 제거하였다(예를 들어, US 제6,774,279호). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유되었다.
실시예 4.2: 3개의 히스티딘 치환을 각각 함유하는 2개의 V 카파 분절을 포함하는 마우스의 조작 및 생성
이중 경쇄 마우스의 각각의 Vκ1-39 및 Vκ3-20에 3개의 히스티딘 치환을 도입하였다. 간단히 말하면, 도 23a(하부)에 도시된 DLC 서열을 도 36에 도시된 프라이머를 사용하여 처음에 Vκ1-39 서열을 변형시키고 후속하여 Vκ3-20 서열을 변형시킴으로써 부위 지정 돌연변이유발로 처리하였다. 생성된 이중 경쇄 서열은 히스티딘이 106번, 108번 및 111번 위치에서 생식선 서열로 도입된 Vκ1-39 분절, 히스티딘이 105번, 106번 및 109번 위치에서 생식선 서열로 도입된 Vκ3-20 분절, 및 모든 5개의 Jκ 분절(Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)을 함유하였다. 후속적인 조작 단계는 FRT-Ub-NEO-FRT 카세트를 보유하는 5' 암, 및 마우스 Igκ 인핸서 및 불변 구역을 보유하는 3' 암의 부착을 포함하였다. 이 표적화 벡터를 도 37a(RSS는 이 도면에서 생략됨)에 도시된 바대로 마우스 Igκ 가변 좌위(κ 가변 및 연결 유전자 분절을 포함)의 결실을 포함하는 ES 세포로 전기천공하였다. 표 1, 표 5, 표 8 및 표 9에서 상기 기재된 구역(구체적으로, 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mIgKd2 및 mIgKp15)을 검출한 프라이머 및 프로브, 및 하기 표 13에 기재된 프라이머 및 프로브의 2개의 추가의 세트를 사용하여 상기 기재된 바대로 대립유전자 검정의 변형에 의해 표적화된 ES 세포를 스크리닝하였다. 프라이머 및 프로브의 이 2개의 추가의 세트의 서열이 서열 목록에 포함된다.
Figure 112015077557708-pct00007
이후, 확인된 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스를 이식하여 2개의 존재하는 VL 분절 서열의 각각에서 4개의 히스티딘 변형을 갖는 DLC-5J 경쇄 좌위를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 한배 새끼를 생성시켰다. ES 세포 스크리닝에 사용된 것과 동일한 서열의 일부를 또한 새끼의 유전자형분석에 사용하였다.
FLP를 발현하는 작제물(예를 들어, FLPo)에 의해 조작된 경쇄 좌위를 보유한 ES 세포를 형질감염시켜 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 37b 참조, RSS는 이 도면에서 생략됨). 임의로, FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 번식시킴으로써 네오마이신 카세트를 제거하였다(예를 들어, US 제6,774,279호). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유되었다.
실시예 4.3: 인간 히스티딘 치환된 이중 경쇄를 포함하는 마우스의 번식
조작된 인간 히스티딘 치환된 이중 경쇄 좌위를 보유한 마우스를 내인성 λ 경쇄 좌위의 결실을 함유한 마우스와 번식시켜, 이의 유일한 경쇄로서, 이중 경쇄 좌위로부터 유래한 조작된 히스티딘 치환된 경쇄를 발현하는 자손을 생성하였다.
조작된 인간 히스티딘 치환된 이중 경쇄 좌위를 보유한 마우스를 인간 중쇄 가변 좌위에 의한 내인성 마우스 중쇄 가변 좌위의 대체를 함유한 마우스(US 제6,596,541호 및 US 제8,502,018호 참조; 벨로시뮨(등록상표) 마우스, 리제네론 파마슈티컬스, 인크.)와 번식시켰다.
실시예 4.4: 3개의 히스티딘 치환을 함유하는 2개의 V 카파 분절을 각각 포함하는 마우스로부터 얻은 면역글로불린 경쇄에서의 히스티딘 변형의 검출
역전사효소 PCR(RT-PCR) 및 고속 스크리닝을 이용하여 비장 B 세포 mRNA로부터 V 카파 암플리콘을 제조하였다.
간단히 말하면, 3개의 히스티딘 치환(카파 좌위가 도 35에 도시된 마우스)을 각각 함유하는 2개의 V 카파 분절(Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 내인성 마우스 중쇄를 포함하는 5마리의 이형접합성 마우스로부터의 비장을 수확하고 유리 슬라이드를 사용하여 1x PBS(깁코) 중에 균질화하였다. 세포를 원심분리(5분 동안 500xg)에서 펠렛화하고, 적혈구를 3분 동안 ACK 용해 완충제(깁코) 중에 용해시켰다. 세포를 1xPBS에 의해 세척하고 0.7㎛ 세포 균주기를 사용하여 여과시켰다. CD19(밀테위 바이오텍(Miltenyi Biotec))에 대한 MACS 자기 양성 선택을 이용하여 비장 세포로부터 B 세포를 단리시켰다. RNeasy 플러스 키트(퀴아젠)를 사용하여 펠렛화된 B 세포로부터 전체 RNA를 단리시켰다. 올리고텍스 다이렉트 mRNA 미니 키트(Oligotex Direct mRNA mini kit)(퀴아젠)를 사용하여 전체 RNA로부터 PolyA+ mRNA를 단리시켰다.
SMARTer 피코 cDNA 합성 키트(SMARTer Pico cDNA Synthesis Kit)(클론테크(Clontech))를 사용하여 5' RACE에 의해 비장 B 세포 mRNA로부터 이중 가닥 cDNA를 제조하였다. 클론테크 역전사효소 및 dNTP를 인비트로겐사제의 슈퍼스크립트(Superscript) II 및 dNTP로 대체하였다. IgK 불변 구역에 특이적인 프라이머 및 SMARTer 5' RACE 프라이머(표 14)를 사용하여 cDNA로부터 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 증폭시켰다. QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 동일한 5' RACE 프라이머 및 IgK 불변 구역에 특이적인 내재 3' 프라이머(표 15)를 사용하여 제2 회차의 PCR을 수행하였다. 사이즈설렉트 E-겔 시스템(SizeSelect E-gel system)(인비트로겐)을 사용하여 제2 회차의 PCR 생성물을 정제하였다. 454 어댑터(adapter) 및 바코드가 첨가된 프라이머에 의해 3차 PCR을 수행하였다. 아겐코트 AMPure XP 비즈(Agencourt AMPure XP Beads)를 사용하여 제3 회차의 PCR 생성물을 정제하였다. 카파 라이브러리 정량화 키트(KAPA Library Quantification Kit(카파 바이오시스템즈(KAPA Biosystems))를 사용하여 SYBR-qPCR에 의해 정제된 PCR 생성물을 정량화하였다. 혼주된 라이브러리를 제조업자의 프로토콜에 따라 454 GS 쥬니어 티탄 시리즈 립-A emPCR 키트(454 GS Junior Titanium Series Lib-A emPCR Kit)(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))를 사용하여 에멀션 PCR(emPCR)로 처리하고, 로슈 454 GS 쥬니어 기기(Roche 454 GS Junior instrument)를 사용하여 양방향 서열분석으로 처리하였다.
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Figure 112015077557708-pct00009
생물정보학 분석을 위해, 454 서열 판독을 샘플 바코드 완벽 일치에 기초하여 분류하고 품질에 대해 손질하였다. igblast(NCBI, v2.2.25+)의 국소 설치를 이용하여 인간 생식선 V 및 J 분절 데이터베이스에 대한 재배열된 Ig 서열의 정렬에 기초하여 서열에 주석을 달았다. 동일한 점수를 갖는 복수의 최고의 히트(hit)가 검출될 때, 서열을 모호하게 표시하고 분석으로부터 배제하였다. 일련의 perl 스크립트를 전개시켜 결과를 분석하고 mysql 데이터베이스에서 데이터를 분류하였다. 카파 경쇄의 CDR3 구역은 보존된 C 코돈과 FGXG 모티프 사이에 한정된다.
도 38은 히스티딘 변형된 DLC-5J(Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절(각각의 분절은 상기 기재된 바와 같은 3개의 히스티딘 변형을 가짐)을 포함하는 경쇄 가변 좌위를 포함)를 포함하는 마우스에서 생성된 생산적으로 재배열된 항체로부터 얻은 예시적인 Vκ 서열의 아미노산 번역에 의한, 인간 생식선 IGKV3-20(도 38a) 또는 IGKV1-39(도 38b) 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 서열 리드는 대부분의 생산적으로 재배열된 경쇄가 이의 생식선 CDR3으로 도입된 적어도 1개의 히스티딘을 보유한다는 것을 나타낸다. 몇몇 경우에, 적어도 1개의 히스티딘 잔기를 보유하는 Vκ3-20 서열을 포함하는 모든 생산적으로 재배열된 인간 경쇄의 대부분에서, 이의 생식선 CDR3으로 도입된 모든 3개의 히스티딘 변형이 보유되었다(도 38a 참조). 몇몇 경우에, 적어도 1개의 히스티딘 잔기를 보유하는 Vκ1-39 서열을 포함하는 생산적으로 재배열된 인간 경쇄에서, 경쇄의 약 50%는 이의 생식선 CDR3으로 도입된 모든 3개의 히스티딘을 보유하고(도 38b 상부 정렬 참조), 경쇄의 약 50%는 이의 생식선 CDR3으로 도입된 3개 중 2개의 히스티딘을 보유한다(도 38b 하부 정렬 참조). 몇몇 경우에, V 분절 서열의 마지막 위치에서의 히스티딘은 V-J 재배열로 인해 손실될 수 있다.
실시예 5. 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 뉴클레오타이드 서열 및 2개의 V 카파 유전자 분절을 포함하는 마우스의 생성 및 분석
상기 기재된 바대로 중쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 마우스(MAID6031; "UHC 마우스")를 생성하였다. 간단히 말하면, UHC 마우스에서, 모든 내인성 작용성 중쇄 가변 유전자 분절은 결실되고, 내인성 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 hVH3-23/D/JH4를 코딩하는 단일의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 의해 대체되었다.
상기 기재된 바대로 2개의 인간 Vκ 유전자 분절(예를 들어, 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20 유전자 분절), 및 1개의 인간 Jκ 분절(Jκ5; DLC-1J) 또는 5개의 인간 Jκ 유전자 분절(hJκ1-5; DLC-5J) 중 어느 하나를 함유하는 유전적으로 조작된 경쇄 좌위를 포함하는 마우스를 생성하였다. 간단히 말하면, 1개의 조작된 경쇄 좌위는 재배열되지 않은 입체구성에서 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절(Jκ1-5)을 함유하고, 내인성 마우스 κ 불변 구역 서열(MAID 1911(DLC-5J); 도 19e)에 작동 가능하게 연결된다. 다른 조작된 경쇄 좌위는 재배열되지 않은 입체구성에서 2개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 1개의 인간 Jκ(Jκ1) 유전자 분절을 함유하고, 내인성 마우스 κ 불변 구역 서열(MAID 1913(DLC-1J); 도 21d)에 작동 가능하게 연결된다. 2개의 추가의 조작된 경쇄 좌위의 각각의 경우, 인간 유전자 분절은 B 세포에서의 인간 유전자 분절의 생체내 재배열을 허용하도록 재조합 신호 서열에 의해 3'에 플랭킹되었다.
상기 기재된 동형접합성 UHC 마우스(MAID6031)를 동형접합성 DLC-5J(MAID1911) 마우스에 번식시켜 UHC 대립유전자 및 DLC-5J 대립유전자에 이형접합성인 마우스를 생성하였다. 유사하게, 동형접합성 UHC 마우스(MAID6031)를 동형접합성 DLC-1J(MAID1913) 마우스에 번식시켜 UHC 대립유전자 및 DLC-1J 대립유전자에 이형접합성인 마우스를 생성하였다. 이러한 교잡으로부터 생성된 F1 이형접합성 마우스를 서로 번식시켜 각각의 대립유전자에 동형접합성인 마우스를 얻었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌위에서의 유전적으로 변형된 대립유전자의 존재는 상기 기재된 특이적 프로브 및 프라이머를 사용한 핵형분석 및 택맨(상표명) 스크리닝에 의해 확인되었다.
UHC 대립유전자 및 DLC-5J에 이형접합성인 마우스를 서로 번식시켜 대부분 유전적으로 변형된 좌위로부터 면역글로불린 "경쇄"를 발현하는 동형접합체(MAID 1912HO 6032HO; "DLC x UHC")를 생성하였다. MAID 1912HO 6032HO(동형접합성 DLC x UHC) 마우스는 모든 내인성 가변 중쇄 VDJ 유전자가 결실된 마우스 중쇄 좌위 및 모든 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자가 결실된 DLC-5J(hVκ1-39 hVκ3-20 hJκ1-5) 마우스 카파(κ) 경쇄 좌위로의 본 명세서에 기재된 보편적 중쇄(예를 들어, hVH3-23/hD/hJH4)의 삽입을 포함한다.
모든 마우스를 리제네론 파마슈티컬스에서 특수 병원균 비함유 조건에서 감금하고 사육하였다. 3마리의 F5 벨로시뮨(등록상표)(MAID 1293O 1640HO("VI3"); 미국 특허 제8,502,018호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨) 참조, 마우스, 14주령, 수컷; 배경: 26.5% C57/BL6, 22.75% 129 및 50.75% Balb/c) 및 3마리의 MAID 1912HO 6032HO F2 마우스(도 39; 7-8주령, 암컷; 배경: 18.75 C57/BL6, 18.75% 129 및 62.5% Balb/c)를 희생시키고, 동물로부터 비장 및 골수를 수확하였다. 완전한 RPMI 배지(소 태아 혈청, 피루브산나트륨, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 플러싱 처리함으로써 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 비장 및 골수 제제로부터의 적혈구를 ACK 용해 완충제에 의해 용해시키고, 완전한 RPMI 배지에 의해 세척하였다.
유세포분석법
유전적으로 변형된 대립유전자(예를 들어, 중쇄 좌위에서의 재배열된 VH3-23/D/JH4의 단일 카피를 함유하는 대립유전자 및 경쇄 좌위에서의 2개의 인간 Vκ 5개의 인간 Jκ 유전자를 함유하는 대립유전자)로부터 유래한 항체를 생성하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 동형접합성 "DLC x UHC"(MAID 1912HO 6032HO) 마우스의 능력을 검사하기 위해, 실시예 3에서처럼 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다.
비장 구획에서, MAID 1912HO 6032HO 마우스는, 이의 면역글로불린 좌위에서 다른 유전자 변형을 갖는 마우스에 비해 MAID 1912HO 6032HO 마우스에서 관찰된 특수한 효과에 대한 대조군으로서 작용하는, 벨로시뮨(등록상표)(VI3) 마우스(도 40a 내지 도 40b)에서 관찰된 수와 실질적으로 동일한 CD19+ B 세포 수 및 성숙 B 세포 수를 나타내고; 또한, 벨로시뮨(등록상표) 마우스의 체액 면역계는 야생형 마우스(상기 참조)와 같이 작용한다. MAID 1912HO 6032HO 마우스는 비장에서 VI3 마우스와 비교하여 미성숙 B 세포 수의 2배 증가를 나타냈다(도 40a 내지 도 40b). MAID 1912HO 6032HO 마우스는 또한 카파 및 감마 경쇄 사용빈도와 관련하여 VI3 마우스와 실질적으로 유사하였다(도 41a 내지 도 41b). MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 또한 VI3 마우스와 비교하여 비장 B 세포에서 증가한 표면 IgM(즉, 세포마다 더 많은 IgM 표면 발현)을 나타냈다(도 42).
또한, MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는, 비장 구획(예를 들어, 미성숙, 성숙, T1, T2 T3, 변연부 전구체, 변연부, 소포성-I, 소포성-II 등)에서 다양한 단계에 걸친 B 세포의 진행이 VI3 마우스에서 관찰된 것과 상이한 방식으로 발생하면서, 변경된 말초 B 세포 발생을 나타낸다(도 43a). 구체적으로, MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 VI3 마우스와 비교하여 비장 구획에서 더 많은 미성숙, T1 및 변연부(MZ) B 세포를 나타냈다. MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스에서의 소포성-I 및 소포성-II 세포의 수는 VI3 마우스에서 관찰된 것과 실질적으로 동일하였다(도 43b).
골수 구획에서, MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 VI3 마우스 대조군과 비교하여 유사한 CD19+ B 세포 수를 나타냈다(도 44a 내지 도 44b). 그러나, MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 골수에서 VI3 마우스와 비교하여 약 25배 더 적은 프로-B 세포를 나타냈다(도 45a 내지 도 45b). MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 또한 골수에서 VI3 마우스와 비교하여 약 2배 더 적은 미성숙 B 세포 및 2배 더 적은 성숙 B 세포를 나타냈다(도 46a 내지 도 46b). 또한, MAID 1912HO 6032HO(DLC x UHC) 마우스는 VI3 마우스와 비교하여 람다 발현에 대해 선호도(2배 증가)를 나타냈다(도 47).
면역화 연구
5마리의 WT(75% C57BL6/25% 129 배경) 및 7마리의 F2 MAID1912HO 6031HET(동형접합성 DLC x 이형접합성 UHC) 마우스를 2.35㎍의 항원 X, 10㎍의 CpG 올리고뉴클레오타이드(ODN 1826, 인비보겐, 카탈로그 tlrl-1826호) 및 25㎍의 인산알루미늄 겔 아쥬번트(브렝탕 카탈로그 7784-30-7호)를 함유하는 0.025㎖의 혼합물에 의해 족적에서 면역화하였다. 마우스를 동일한 투약량으로 6회 부스팅하였다. 1차 면역화 후 0일, 15일 및 23일에, BD 혈청 분리기 관(BD, 카탈로그 365956호)으로 후안와 출혈을 이용하여 마취된 마우스로부터 혈액을 수집하였고, 제조업자의 방향에 따라 혈청을 수집하였다. 제1 회차의 면역화 후 5주에 상기한 바대로 제2 회차의 면역화를 수행하였다.
항원 특이적 IgG 항체의 수치를 측정하기 위해, 실시예 3에서처럼 ELISA를 수행하였다. 도 48에 도시된 바대로, 재배열된 VH3-23/D/JH4 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 표적화된 대립유전자에 이형접합성이고 DLC-5J를 함유하는 표적화된 대립유전자에 동형접합성인 유전적으로 변형된 마우스는 1차 면역화 후 23일 및 5주 둘 다에서 야생형 마우스에 의해 생성된 것과 필적하는 수치로 항원 특이적 IgG 항체를 생성할 수 있다. MAID1912HO 6031HET(동형접합성 DLC x 이형접합성 UHC) 마우스는 또한 제2 회차의 면역화 후 야생형 마우스에 의해 생성된 것과 필적하는 수치로 항원 특이적 IgG 항체를 생성할 수 있다.
따라서, 이 마우스는 2개 중 1개의 인간 VL 유전자 분절(Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 분절) 및 인간 Jκ 분절의 재배열로부터 유래한 리버스 키메라 경쇄(인간 경쇄 가변 도메인 및 마우스 Cκ) 및 단일의 재배열된 인간 중쇄 가변 유전자 분절로부터 유래한 리버스 키메라 중쇄(인간 중쇄 가변 도메인 및 마우스 CH)를 포함하는 항체를 생성한다. 리버스 키메라 항체(즉, 이 리버스 키메라 사슬로 이루어진 항체)는 관심 있는 항원에 의한 면역화 시 얻어진다.
실시예 6. 3개의 히스티딘 치환을 함유하는 2개의 V 카파 유전자 분절 및 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스의 생성 및 분석
유사하게, 히스티딘 변형된 이중 경쇄를 포함하는 조작된 인간 경쇄 좌위를 보유하는 마우스(예를 들어, 상기 본 명세서에 기재된 히스티딘 변형을 갖는 2개의 인간 VL 유전자 분절을 포함하는 마우스)를 보편적 인간 중쇄 좌위(상기 본 명세서에 기재된 단일의 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 좌위)에 의한 내인성 마우스 중쇄 가변 좌위의 대체를 함유하는 마우스와 번식시켰다. 따라서, 이 마우스는 2개 중 1개의 히스티딘 변형된 인간 VL 유전자 분절(Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 분절) 및 인간 Jκ 분절의 재배열로부터 유래한 리버스 키메라 경쇄(인간 경쇄 가변 도메인 및 마우스 Cκ) 및 단일의 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인으로부터 유래한 리버스 키메라 중쇄(인간 중쇄 가변 도메인 및 마우스 CH)를 포함하는 항체를 생성시킨다. 리버스 키메라 항체는 관심 있는 항원에 의한 면역화 시 얻어진다. 당해 분야에 공지되거나 상기 기재된 항체 단리 및 스크리닝 방법을 이용하여 이러한 마우스에 의해 생성된 pH 의존적 인간 항체를 확인하였다.
항체를 발현하는 B 세포의 가변 경쇄 및 중쇄 구역 뉴클레오타이드 서열을 확인하고, 가변 경쇄 및 중쇄 구역 뉴클레오타이드 서열을 각각 인간 CL 및 CH 뉴클레오타이드 서열에 융합하여 완전 인간 경쇄 및 중쇄를 만들었다. 관심 있는 경쇄, 예를 들어 관심 있는 항원에 결합하는 경쇄(예를 들어, 당해 분야에 공지된 다양한 검정, 예를 들어 비아코어(상표명) 검정을 이용하여 pH 의존적 항원 특성을 또한 나타낸 항체로부터의 경쇄)를 다른 항체로부터 유래한 중쇄, 예를 들어 관심 있는 경쇄(예를 들어, Vκ1-39 또는 Vκ3-20)에서와 동일한 VL 유전자 분절로부터 유래한 경쇄를 포함하는 항체로부터 유래한 중쇄와 적합한 발현 시스템에서 동시발현시키고, 항원 결합 및 pH 의존적 항원 결합 특성을 보유하는 능력에 대해 재구성된 항체를 시험하였다.
실시예 7. 재배열된 중쇄 VDJ 서열을 함유하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는 마우스의 작제
중쇄 좌위를 표적화하기 위해 상기 기재된 방법과 유사한 방법에 의해 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하는 마우스(MAID6079; "카파 상의 UHC 마우스")를 생성하였다. 간단히 말하면, 카파 상의 UHC 마우스에서, 모든 내인성 작용성 경쇄 카파 가변 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 결실시키고, 내인성 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 hVH3-23/D/JH4를 코딩하는 단일의 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 의해 대체하였다. 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인 서열을 함유하는 게놈 좌위의 생성을 위한 최종 표적화 작제물은 5'로부터 3'로 (1) 내인성 Ig 경쇄 좌위의 상류에 약 22500bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암; (2) 5' FRT 부위; (3) 네오마이신 카세트; (4) 3' FRT 부위, (5) 2239bp의 hVH3-23 프로모터(서열 번호 139); (6) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 뉴클레오타이드 서열(hVH3-23/D/JH4; 서열 번호 136); (7) hJH4 인트론(서열 번호 140); 및 (8) 마우스 JL 유전자 분절의 하류에 약 75000bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 함유한다. 변형을 보유하는 이형접합성 마우스를 서로에 번식시켜 오직 유전적으로 변형된 좌위로부터 면역글로불린 "경쇄"를 만들 수 있는 동형접합체(MAID 6079HO)를 생성하였다. MAID 6079HO(카파 상의 동형접합성 UHC) 마우스는 모든 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자가 결실된 마우스 카파(κ) 경쇄 좌위로의 본 명세서에 기재된 보편적 중쇄(예를 들어, hVH3-23/hD/hJH4)의 삽입을 포함한다.
모든 마우스를 리제네론 파마슈티컬스에서 특수 병원균 비함유 조건에서 감금하고 사육하였다. 4마리의 MAID 6079HO F1 마우스(도 49; 7-12.5주령, 수컷 및 암컷) 및 4마리의 MAID 6079 F1 야생형 한배 새끼 대조군 마우스(7-12.5주령, 수컷 및 암컷)를 희생시키고, 동물로부터 비장 및 골수를 수확하였다. 완전한 RPMI 배지(소 태아 혈청, 피루브산나트륨, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 플러싱 처리함으로써 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 비장 및 골수 제제로부터의 적혈구를 ACK 용해 완충제에 의해 용해시키고, 완전한 RPMI 배지에 의해 세척하였다.
유세포분석법
유전적으로 변형된 대립유전자(예를 들어, 카파 경쇄 좌위에서 재배열된 VH3-23/D/JH4의 단일 카피를 함유하는 대립유전자)로부터 유래한 항체를 생성하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 동형접합성 "카파 상의 UHC 마우스"(MAID 6079HO) 마우스의 능력을 검사하기 위해, 실시예 3에서처럼 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다.
MAID 6079HO 마우스는 야생형 한배 새끼에서 관찰된 것과 실질적으로 동일한 골수 구획에서 프로- 및 프리-B 세포 수를 나타냈다(도 50a 내지 도 50b). 반대로, 이것은 골수 구획에서 야생형 한배 새끼와 비교하여 더 적은 미성숙 및 성숙 B 세포 수를 나타냈다(도 51a 내지 도 51c). 사실, 마우스는 2배 더 적은 미성숙 B 세포 및 거의 4배 더 적은 성숙 B 세포를 가졌다. MAID 6079HO 마우스는 거의 배타적으로 골수에서 미성숙 및 성숙 B 세포에서 람다 경쇄 서열을 사용하였다(도 52).
비장 구획에서, MAID 6079HO 마우스는 야생형 한배 새끼와 비교하여 더 적은 성숙 B 세포를 나타냈다(도 53a 내지 도 53b). 골수에서 관찰된 것과 유사하게, MAID 6079HO 마우스는 거의 배타적으로 비장 구획에서 람다 경쇄 서열을 사용하였다(도 54a 내지 도 54b). 이것은 또한 야생형 한배 새끼와 비교하여 더 적은 미성숙 세포, 변연부 B 세포의 증가 및 소포성 B 세포의 감소를 나타냈다(도 55).
실시예 8. 재배열된 중쇄 VDJ 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위 및 인간 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하는 마우스의 생성 및 분석
상기 기재된 바대로 경쇄 좌위에서 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(MAID 6079HO; 동형접합성 "카파 상의 UHC 마우스")를 생성하였다. 이 마우스를 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열에 동형접합성인 마우스(MAID 1994HO)(중쇄 상의 카파("KoH") 마우스)에 교잡하였다. MAID 1994 동형접합성 KoH 마우스는, 마우스 Ig 중쇄 불변 사슬 좌위(즉, 결실된 마우스 Ig 중쇄 좌위)로 삽입된, 긴 IGCR 및 마우스 ADAM6을 갖는, 40개의 인간 Vκ 유전자 및 모든 인간 Jκ 유전자를 포함한다. KoH는 상기 기재되어 있고; 예를 들어, 미국 예비등록 공보 제2012/0096572호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
모든 마우스를 리제네론 파마슈티컬스에서 특수 병원균 비함유 조건에서 감금하고 사육하였다. 2마리의 벨로시뮨(등록상표)(MAID 1242HO 1640HO("VI3"); 미국 특허 제8,502,018호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨) 참조, 마우스, 15주령, 암컷 n=2; 배경: 28% C57/BL6, 13% 129 및 59% Balb/c), 4마리의 MAID 1994HO 6079HO F2 마우스(도 56; 13-14주령, 수컷 n=2; 배경: 25% C57/BL6, 25% 129 및 50% Balb/c) 및 MAID 6079 야생형 한배 새끼 대조군 마우스를 희생시키고, 동물로부터 비장 및 골수를 수확하였다. 완전한 RPMI 배지(소 태아 혈청, 피루브산나트륨, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 플러싱 처리함으로써 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 비장 및 골수 제제로부터의 적혈구를 ACK 용해 완충제에 의해 용해시키고, 완전한 RPMI 배지에 의해 세척하였다.
유세포분석법
유전적으로 변형된 대립유전자(예를 들어, 재배열된 VH3-23/D/JH4의 단일 카피를 함유하는 대립유전자 및 중쇄 좌위에서 카파 경쇄 가변 구역 핵산 서열을 함유하는 대립유전자)로부터 유래한 항체를 생성하는 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 동형접합성 "카파 상의 KoH x UHC"(MAID 1994HO 6079HO) 마우스의 능력을 검사하기 위해, 실시예 3에서처럼 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다.
MAID 1994HO 6079HO 마우스는 VI3 마우스와 비교하여 골수 구획에서 더 낮은 CD19+ 및 프리-B 세포 빈도수를 나타냈다(도 57a). 구체적으로, MAID 19940 6079HO 마우스는 골수에서 VI3 마우스와 비교하여 약 2배 더 적은 CD19+ 및 프리-B 세포 수를 나타냈다(도 57b). 추가로, MAID 1994HO 6079HO 마우스는 VI3 마우스에 비해 골수 구획에서 약 3배 더 적은 미성숙 B 세포를 나타냈다(도 58a 및 도 58b). MAID 1994HO 6079HO 마우스로부터의 B 세포가 골수에서 람다 경쇄의 발현이 실질적으로 결여되는 것으로 또한 밝혀졌다(도 59).
MAID1994HO 6079HO 마우스는 비장 구획에서 더 낮은 B 세포 빈도수를 나타냈다. 구체적으로, MAID 1994HO 6079HO 마우스는 VI3 마우스에 비해 더 적은 비장 B 세포 수(약 2배 적음) 및 성숙 B 세포 수(약 3배 적음)를 가졌다(도 60a 내지 도 60b). 이것은 VI3 마우스와 비교하여 람다 경쇄의 발현의 결여를 다시 나타낸다(도 61).
비장에서의 말초 B 세포 발생을 고려하여, FACS 분석은 MAID1994HO 6079HO 마우스가 VI3 마우스보다 비장에서 T1 단계에서 증가한 세포 빈도수를 갖는다는 것을 나타낸다(도 62).
당해 분야의 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적인 실시형태의 많은 등가물을 인지하거나 확신할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함된다.
본원에 인용된 모든 비특허 문헌, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
기재된 발명이 특정한 양상 및 이의 실시형태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명의 진정한 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화기 이루어질 수 있고 등가물이 치환될 수 있다는 것을 당해 분야의 당업자는 이해한다. 또한, 기재된 발명의 객관적인 정신 및 범위에 특정한 상황, 물질, 물질의 조성, 과정, 프로세스 단계 또는 단계를 적용하도록 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 명세서에 첨부된 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMALS WITH MODIFIED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN SEQUENCES <130> 2010794-0456 <150> US 61/879,338 <151> 2013-09-18 <150> US 61/766,765 <151> 2013-02-20 <160> 183 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 2 cag cag agc tac agc acc ccc 21 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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gttaaacatc atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat 780 cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt 840 acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg 900 tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt 960 cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg 1020 acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc 1080 gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct 1140 tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct 1200 ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga 1260 actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt 1320 ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg 1380 agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac 1440 aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga 1500 aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aatgtctcct aggcacgaag ggcgaattcc 1560 agcacactgg cggccgttac tagtggcgcg ccggtgtgtc cttccaagta tccctgccct 1620 tccttcaggt gtgatgctga tccatgcatc ttcctcccat tcctgggtag agggtctcct 1680 tgttctttcc ccaatcttct cccagcagcc actatgtctt cccactgatg tcttcagctt 1740 cctcttttct gcccttccca gcagatgagt ctgttattcc tgagggaaga gagaggaggt 1800 gggagatgag gctttattcc tgaaagaatg gacagagctt tggagctttt ctttcttcta 1860 ccccagtttc tacgagttcc tccagtgcct gtaacacaga gctgtcagtg gctttgcccc 1920 tgcatgttaa ttctttggtc atgtagtggt ggtgagggag ctgggtctgg atgcatttca 1980 gccacagctg ctgttccact tccccacaca gaaccgtctc aggaggaaga ggttggagat 2040 ttttctgatg tgtcctcaat cctgggagaa aagttttcaa tagcaatagg aatctctcag 2100 ttgtatgtcc gctgagaatt taaacaataa cttctttata atactaaatt ttaaacaatc 2160 caatgaatat atctaattta attttttatt agcttatgtg acatttgctg gcctctcccc 2220 cagataaggt catattctct tcctgtttgt tcctgcaagt cactgaattt cacaagatgt 2280 aaggtctctt gattatacta taacatcaat aatctggtgt actaaagaaa atgtgctaat 2340 ttgcagctta ctaaaattag ttgttttagt aaaaataata tatttgttat agcatgccta 2400 catctccagg ctgagtagaa gctttgtttg taatactcag aaactgcaaa taacacacat 2460 attaaggagc tttctaaata aatactatgg gtgaattctt taactggaat actgttcctc 2520 attagaatca acacattctt tatacacaac caaattactg actcacaagt aattatactg 2580 agcaagaagc cacacaaatg aaattgaaaa tataagattt cactttaaca aaatcttgaa 2640 aaatagatct gaattaacaa agatgagagg ttgactcagt atggtgagag ggaaataatg 2700 gggaggcagg aatgagagga acacagggag gcttttaact gtaatcatcg ttatctcgat 2760 tgttattttg gatacacagg tgagcacacg tgaaattacg ttttttttcc ttcggagaca 2820 tggttttgct ttgtcgtcca ggctggagct ccgtggtgag atcatagctc tctgcagcct 2880 cagaccctgg gtctccagca atcctcctcc ctctgcccta tgtagctggg actacaggtg 2940 tgcaccacca tgctcggctt cagtgcgtat taaaccgcac acttcaatta tgcagtattt 3000 attatatagc aataatgcct caataagggt attacaaata agtggataga taatttgtta 3060 aagattgatg gaaagataga taccaacatg agaaatgtat gacactcaag aaaataaaac 3120 tgtaggaaac ttgcttttct ttatatttgt taggtaatca ccacagtgtg tacacatcac 3180 accatgttcc cattacagag aaaaggttct gcgaacctca cgagctgtga cccctgtgtg 3240 ctgggcttgg ttcagggaga agtcaggtcc agtggtgaga agcacaggcc cagatgccca 3300 ggctcactct gaccaaaagt gagcactggg gacattgtaa aacccacctg tgcttttgct 3360 gataattttt catctttaac atggaaataa tattgatact atataccatg gtttctctgc 3420 gtatgtaaaa ataaaagatg attggtgcta actttaaaaa tatgcagttt atgtagatct 3480 atggtacctc aataaaactg ttttaaaata aaaattacaa aattataaga tttttaggtt 3540 ttaaggttta agtttatcac aaaacaaact gacaatagga aagcacaatt tcccaatgct 3600 ttcaatatca cagatctccc cgaggacatt ctgacatgct ctgagcccca ctatctccaa 3660 aggcctctca ccccagagct tactatatag taggagatat gcaaatagag ccctccgtct 3720 gctgatgaaa accagcccag ccctgaccct gcagctctga gagaggagcc cagccctggg 3780 attttcaggt gttttcattt ggtgatcagg actgaacaga gagaactcac catggagttt 3840 gggctgagct ggctttttct tgtggctatt ttaaaaggta attcatggag aaatagaaaa 3900 attgagtgtg aatggataag agtgagagaa acagtggata cgtgtggcag tttctgacca 3960 gggtttcttt ttgtttgcag gtgtccagtg tgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg 4020 cttggtacag cctggggggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttag 4080 caactctcca atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc 4140 tattagtggt agtggtagta acacattcta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat 4200 ctccagagac aattccaaga acacgctgca tctgcaagtg aacagcctga gagccgacga 4260 cacggccgta tattactgtg cgaaaggtta ctactttgac tactggggcc agggaaccct 4320 ggtcaccgtc tcctcaggtg agtcctcaca acctctctcc tgctttaact ctgaagggtt 4380 ttgctgcatt tttgggggga aataagggtg ctgggtctcc tgccaagaga gccccggagc 4440 agcctggggg gctcaggagg atgccctgag gcaacagcgg ccacacagac gaggggcaag 4500 ggctccagat gctccttcct cctgagccca gcagcacctg agcattgcag actaatcttg 4560 gatatttgtc cctgagggag ccggctgaga gaagttggga aataaactgt ctagggatct 4620 cagagccttt aggacagatt atctccacat ctttgaaaaa ctaagaatct gtgtgatggt 4680 gttggtggag tccctggatg atgggatagg gactttggag gctcatttga agaagatgct 4740 aaaacaatcc tatggctgga gggatagttg gggctgtagt tggagatttt cactcgag 4798 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 143 Ala Lys Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 144 Asp Tyr Ser Asn Tyr 1 5 <210> 145 <211> 445 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 145 ctcgagccac catggagttc gggctgtcct ggctttttct tgtggccatt ctgaagggtg 60 tgcaatgtga agtgcagttg ctggagtccg gggggggcct tgtgcagcct ggaggatcac 120 tccggctgag ctgcgcagcc agtggtttca cgttcagtag ttatgctatg tcttgggtgc 180 gccaggcccc tggtaagggg ctggaatggg tgtcagctat ttccggcagc ggcggatcta 240 cttattacgc tgatagcgtg aagggacgct tcacaatctc tcgggacaac tccaaaaaca 300 ccctctatct tcagatgaat agcctccgcg ctgaggacac cgctgtttat tactgcgcca 360 aaaccacagt gacatactac tactattatg gcatggacgt ctggggtcag ggaacaaccg 420 tcaccgtgtc cagcgcctga agagc 445 <210> 146 <211> 448 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 146 ctcgagccac catggagttc gggctgtcct ggctttttct tgtggccatt ctgaagggtg 60 tgcaatgtga agtgcagttg ctggagtccg gggggggcct tgtgcagcct ggaggatcac 120 tccggctgag ctgcgcagcc agtggtttca cgttcagtag ttatgctatg tcttgggtgc 180 gccaggcccc tggtaagggg ctggaatggg tgtcagctat ttccggcagc ggcggatcta 240 cttattacgc tgatagcgtg aagggacgct tcacaatctc tcgggacaac tccaaaaaca 300 ccctctatct tcagatgaat agcctccgcg ctgaggacac cgctgtttat tactgcgcca 360 aagattattc aaattactac tactactatt atggcatgga cgtctggggt cagggaacaa 420 ccgtcaccgt gtccagcgcc tgaagagc 448 <210> 147 <211> 430 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 147 ctcgagccac catggagttc gggctgtcct ggctttttct tgtggccatt ctgaagggtg 60 tgcaatgtga agtgcagttg ctggagtccg gggggggcct tgtgcagcct ggaggatcac 120 tccggctgag ctgcgcagcc agtggtttca cgttcagtag ttatgctatg tcttgggtgc 180 gccaggcccc tggtaagggg ctggaatggg tgtcagctat ttccggcagc ggcggatcta 240 cttattacgc tgatagcgtg aagggacgct tcacaatctc tcgggacaac tccaaaaaca 300 ccctctatct tcagatgaat agcctccgcg ctgaggacac cgctgtttat tactgcgcca 360 aaaccacagt gacatacttt gattactggg gacaggggac cctcgtcacc gtctcttctg 420 cctgaagagc 430 <210> 148 <211> 433 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 148 ctcgagccac catggagttc gggctgtcct ggctttttct tgtggccatt ctgaagggtg 60 tgcaatgtga agtgcagttg ctggagtccg gggggggcct tgtgcagcct ggaggatcac 120 tccggctgag ctgcgcagcc agtggtttca cgttcagtag ttatgctatg tcttgggtgc 180 gccaggcccc tggtaagggg ctggaatggg tgtcagctat ttccggcagc ggcggatcta 240 cttattacgc tgatagcgtg aagggacgct tcacaatctc tcgggacaac tccaaaaaca 300 ccctctatct tcagatgaat agcctccgcg ctgaggacac cgctgtttat tactgcgcca 360 aagattattc aaattactac tttgattact ggggacaggg gaccctcgtc accgtctctt 420 ctgcctgaag agc 433 <210> 149 <211> 141 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 149 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Thr Val Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 150 <211> 140 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 150 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Tyr Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135 140 <210> 151 <211> 17 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 151 tgcggccgat cttagcc 17 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> mammal <400> 152 acgagcgggt tcggcccatt c 21 <210> 153 <211> 18 <212> DNA <213> unknown <220> <223> mammal <400> 153 ttgaccgatt ccttgcgg 18 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> unknown <220> <223> mammal <400> 154 tcaggtgtga tgctgatcca 20 <210> 155 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> mammal <400> 155 tgcatcttcc tcccattcct gggta 25 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> unknown <220> <223> mammal <400> 156 tggctgctgg gagaagattg 20 <210> 157 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 157 cccagcagcc actatgtc 18 <210> 158 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 158 tcccactgat gtcttcagct tcctc 25 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 159 ccctcaggaa taacagactc atc 23 <210> 160 <211> 19 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 160 aagggccggt tcaccatct 19 <210> 161 <211> 26 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 161 ccagagacaa ttccaagaac acgctg 26 <210> 162 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 162 cggctctcag gctgttca 18 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 163 gcagcctctg gattcacctt 20 <210> 164 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 164 agcaactctc caatgagctg ggtc 24 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 165 tcacggagtc tgcgtagaat g 21 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 166 ctcagtgatt ctggccctgc 20 <210> 167 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 167 tgctccacag ctacaaaccc cttcctataa tg 32 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 168 ggatgatggc tcagcacaga g 21 <210> 169 <211> 19 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 169 ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 170 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23 <210> 171 <211> 17 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 171 gaacacggcg gcatcag 17 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 172 ggtgtgcgat gtaccctctg aac 23 <210> 173 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 173 ctaaaaatgc tacacctggg gcaaaacacc tg 32 <210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 174 tgtggcagtt taatccagct ttatc 25 <210> 175 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 175 gatgggaaga gactggtaac atttgtac 28 <210> 176 <211> 27 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 176 cctccactgt gttaatggct gccacaa 27 <210> 177 <211> 26 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 177 ttcctctatt tcactctttg aggctc 26 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 178 tggtcacctc caggagcctc 20 <210> 179 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 179 agtctctgct tcccccttgt ggctatgagc 30 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 180 gctgcagggt gtatcaggtg c 21 <210> 181 <211> 17 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 181 gccatgcaag gccaagc 17 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 182 ccaggaaaat gctgccagag cctg 24 <210> 183 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mammal <400> 183 agttcttgag ccttagggtg ctag 24

Claims (215)

  1. 설치류로서, 상기 설치류의 생식선 게놈의 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에서, 내인성 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 VH3-23/X1X2/JH의 서열을 코딩하며, 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이며, 설치류는 래트 또는 마우스인, 설치류.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 X1은 Gly이고 X2는 Tyr인, 설치류.
  3. 제 1항에 있어서, 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 설치류.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4 (SEQ ID NO:137)의 서열을 코딩하는, 설치류.
  5. 제4항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인, 설치류.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 불변 구역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 설치류.
  7. 제 1항에 있어서, 모든 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절은 상기 설치류의 면역글로불린 중쇄 좌위로부터 결실되거나 비작용성이 되는, 설치류.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 설치류는 내인성 작용성 VH, D 및 JH 유전자 분절을 결실시키거나 비작용성이 되게 하는 변형을 포함하는, 설치류.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 비인간 동물에 대해 면역원성이 아닌, 설치류.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 설치류는 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함하는, 설치류.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 설치류는 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절(VL) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 J 유전자 분절(JL)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된, 설치류.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 경쇄 불변 구역 유전자 서열은 설치류 및 인간 불변 구역 유전자 서열로부터 선택되는, 설치류.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 설치류 경쇄 불변 구역 유전자는 마우스 경쇄 불변 구역 유전자, 래트 경쇄 불변 구역 유전자 및 햄스터 경쇄 불변 구역 유전자로부터 선택되는, 설치류.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 (VL) 유전자 분절 및 상기 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 (JL) 유전자 분절은 내인성 설치류 좌위에서 설치류 면역글로불린 불변 구역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된, 설치류.
  15. 설치류의 제조 방법으로서,
    (a) 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위의 모든 내인성 작용성 면역글로불린 중쇄 VH, D 및 JH 유전자 분절이 결실되거나 비작용성이 되도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계, 이때 설치류는 래트 또는 마우스이고; 및
    (b) 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열을 상기 게놈의 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에 위치시키는 단계, 이때 상기 재배열된 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 내인성 중쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 VH3-23/X1X2/JH의 서열을 코딩하며, 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산인 단계를 포함하는, 설치류의 제조 방법.
  16. 변형된 설치류로서, 상기 변형된 설치류의 게놈에,
    (ⅰ) 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에서, 내인성 중쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 중쇄 가변 구역 핵산 서열을 포함하고, 이때 상기 재배열된 중쇄 가변 구역 핵산 서열은 VH3-23/X1X2/JH의 서열을 코딩하며, 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이며, 설치류는 래트 또는 마우스이고; 및
    (ⅱ) 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함하는, 변형된 설치류.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 X1은 Gly이고 X2는 Tyr인, 변형된 설치류.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 및 이들의 다형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 설치류.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 구역 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH3-23/GY/JH4-4 (SEQ ID NO:137)의 서열을 코딩하는, 변형된 설치류.
  20. 제 16항에 있어서, 1개 이상이지만 야생형 수보다 적은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절은 내인성 좌위에서 경쇄 불변 구역 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 변형된 설치류.
  21. 제 16항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 좌위는 2개의 인간 VL 유전자 분절, Vκ1-39 및 Vκ3-20을 포함하는, 변형된 설치류.
  22. 제 16항에 있어서, 적어도 1개의 인간 경쇄 VL 또는 JL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 분절에 의해 코딩되지 않은 1개 이상의 히스티딘 코돈을 코딩하는, 변형된 설치류.
  23. 제 16항에 있어서, 상기 적어도 1개의 VL 유전자 분절은 히스티딘 코돈의 부가 또는 상기 상응하는 인간 생식선 VL 분절 서열에 의해 코딩된 적어도 1개의 비히스티딘 코돈을 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는, 변형된 설치류.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 부가된 또는 치환된 히스티딘 코돈은 CDR3에 존재하는, 변형된 설치류.
  25. 제 5항에 있어서, 상기 마우스는 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함하는, 설치류.
  26. 제 5항에 있어서, 상기 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절(VL) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 J 유전자 분절(JL)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 구역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된, 설치류.
  27. 제 16항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인, 변형된 설치류.
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