KR101757108B1

KR101757108B1 - 전장유전체연관분석방법을 이용한 단일염기다형성에 의한 심방세동의 예측 또는 진단에 관한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101757108B1
Application number: KR1020160028026A
Authority: KR
Inventors: 박희남; 이지영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2016-03-09
Publication date: 2017-07-12

Abstract

본 발명은 유전자좌위의 단일염기다형성을 확인하여 심방세동 발생의 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 정보 제공 방법은 심방세동 진단 및 예측과 관련된 단일염기다형성을 대규모 전장유전체연관분석방법을 이용하여 확인하였을 뿐만 아니라, 최초로 한국인 특이적인 단일염기다형성을 확인하였으므로, 이를 이용하여 한국인의 개개인의 치료, 시술, 수술 등 다양한 처치 과정에서의 개인 맞춤 정보로 활용할 수 있어, 향후 고연령 증가에 따른 심방세동 발생의 증가에 대한 예방 및 적극적인 중재에 대한 근거를 마련할 수 있으므로 심방세동으로 인한 위험성을 감소시키는데 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

전장유전체연관분석방법을 이용한 단일염기다형성에 의한 심방세동의 예측 또는 진단에 관한 정보 제공 방법{Method for providing the information for predicting or diagnosing of atrial fibrillation using single nucleotide polymorphism through by genome-wide association study}

본 발명은 심방세동의 예측 또는 진단에 관한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 전장유전체연관분석방법으로 확인된 하나 이상의 유전자좌위의 단일염기다형성을 이용하여 한국인의 심방세동 발생을 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.

최근 인간게놈프로젝트(International HapMap Project) 발표 후 인간의 유전체 염기서열 중 많은 부분이 규명되었고, 측정 기술이 발전함에 따라 전장유전체(whole genome)를 대상으로 하여 유전자와 질병과의 연관관계를 밝히기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재 전장유전체 관련 연구에서 가장 활발하게 연구되는 분야는 전장유전체 단일염기다형성(whole genome SNP; whole genome Single Nucleotide Polymorphism)에 대한 연구이다. 단일염기다형성은 사람의 염기서열에 있어서 평균 200-300bp 마다 하나씩 존재하는 단일염기서열(single nucleotide)의 다형성(polymorphism)을 의미한다. 단일염기다형성으로 인하여 개개인의 약물, 질병 등에 대한 감수성의 차이가 나타난다는 것을 확인하게 되면서, 최근에는 개개인의 질병에 대한 감수성이나, 치료 후 결과의 차이의 원인을 규명하는 것이 전장유전체연구의 주된 내용을 이루고 있다. 일반적으로 최근의 연구 단계는 대립유전자의 빈도가 높으며, 유전적인 효과가 상대적으로 적은 것으로 알려져있는 질병 관련 유전자들을 확인하는 것이 주를 이루고 있으며, 전장유전체 단일염기다형성 검사는 DNA 염기서열 변이 중 이미 흔하게 변이가 일어나는 곳만을 선택적으로 칩의 형태로 제작하여 질병과 관련을 보고 있다. 그리고 이러한 다양한 연구 결과를 통하여 각종 만성 질환과 여러 가지 표현형질(phenotype)과 연관된 유전자들이 밝혀지고 있다.

한편, 심방세동(atrial fibrillation; AF)이란 심방이 무질서하게 분당 400~600회의 매우 빠른 파형을 형성하고 이로 인해 불규칙한 맥박을 형성하는 부정맥(불규칙한 맥박) 질환의 일종으로서, 임상에서 가장 흔하게 발생하며 높은 사망률 및 장애율에 연관관계를 가지고 있다(Eur. J. Heart Fail. (2002) 4(5): 571-575). 따라서, 심방세동 고위험군을 예측할 수 있는 심방세동 관련 유전자 변이에 대한 연구가 활발히 이루어 지고 있으며, 이를 위하여 전장유전체연관연구(Genome Wide Association Study; GWAS) 방법이 사용되고 있다. 그러나, 심방세동 고위험군을 예측할 수 있는 유전자 변이에 대한 대부분의 연구는 서양인을 대상으로 하여 실시되고 있을 뿐, 한국인을 대상으로 한 연구는 거의 전무한 실정이다.

이와 같이, 한국인을 대상으로 하여 심방세동의 발생을 진단 또는 예측할 수 있는 유전자 변이(genetic variation)에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유전자좌위의 단일염기다형성을 이용하여 한국인의 심방세동 발생을 예측 또는 진단하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 명세서에 있어서 "생물학적 시료(biological sample)"란, 분석하고자 하는 개체의 지노믹 DNA(genomic DNA)를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 체액, 모근, 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나 유전자좌위를 확인할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "유전자좌위(locus)"란 염색체 또는 연관지도상 유전자지도에서 유전자가 차지하는 위치를 말하기도 하지만, 동시에 기능단위로서 유전자(gene)와 같은 뜻으로 사용하는 경우도 있다. 일반적으로 유전자좌위를 표기하는 방법은 첫번째 숫자는 염색체 번호이고, 두번째 영어는 염색체 상의 위치를 의미하며, 그 다음의 숫자는 염색체 팔(arm)의 밴드의 위치를 의미한다. 예를 들어 "6p21.3"이란, 염색체 6번 상의 짧은 팔의 두번째 위치의 첫번째 밴드(band)이며, 보조 밴드(sub-band)는 3임을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)"이란 단일 유전자좌위의 단일 염기에서 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며 대립 유전자형은 일반적으로 염기서열 내에 "[ ]"로 표기된다. 인구집단에서 1%이상의 빈도로 존재하는 2개 이상의 대립 유전자가 발생하는 위치를 SNP라고 하며, 대립유전자형이 5% 이상의 빈도로 존재하는 경우 common polymorphism이라고 하며, 1~5% 인 경우 rare polymorphism으로 분류한다.

본 명세서에 있어서, "심방세동 예측(prediction) 또는 진단(diagnosis)에 관한 정보 제공 방법"이란 개체의 심방세동 발생 가능성을 확인하는 방법을 포괄적으로 의미하며, 본 발명의 정보 제공 방법은 임의의 특정 개체 또는 환자가 일상 생활 중, 또는 소정의 치료, 시술, 수술 등과 같은 처치 과정에서 심방세동이 발생할 가능성을 확인함으로써 심방세동의 발생을 예측 또는 진단함으로써 임상적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "키트(kit)"란 심방세동의 발생을 예측 또는 진단할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 생물학적 시료로부터 단일염기다형성의 존재 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 rs531007, rs4611994, rs6584554, rs883079, rs2106261, rs3737883 및 rs8180252로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성과 특이적으로 결합하는 또는 상기 단일염기다형성에 대한 상보적인 서열을 가지는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer) 세트를 포함할 수 있으며, 또는 상기 단일염기다형성에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 형태일 수 있다. 상기 "프로브 또는 프라이머"는 단일염기다형성에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드(oliogonucleotide)를 의미하며, 길이는 8 내지 52 뉴클레오티드(nucleotide), 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 20 내지 40 뉴클레오티드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 생물학적 시료로부터 하나 이상의 유전자좌위(locus)의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 확인하는 단계를 포함하는, 심방세동의 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자좌위는 바람직하게는 PRRX1, PITX2, NEURL1, TBX5, ZFHX3, PPFIA4, HANDS2 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1q24.2, 4q25, 10q24.33, 12q24.21, 16q22.3, 1q32.1, 4q34.1 등 일 수 있으나, 심방세동의 위험성과 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 유전자좌위라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 단일염기다형성은 바람직하게는 1q24.2 위치의 rs531007, 4q25 위치의 rs4611994, 10q24.33 위치의 rs6584554, 12q24.21 위치의 rs883079, 16q22.3의 rs2106261, 1q32.1의 rs3737883, 4q34.1의 rs8180252 등 일 수 있으나(hg38/human기준), 심방세동의 발생 위험성과 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 단일염기다형성이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 심방세동 발생의 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 바람직하게는 동양인을 대상으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 한국인을 대상으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 체액, 모근, 혈액, 혈장, 혈청 등 일 수 있으나, 예측하고자 하는 개체의 지노믹 DNA(genomic DNA)를 포함하는 시료라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 정보를 제공하는 방법은 rs531007의 대립유전자형이 A/T일 때, rs4611994의 대립유전자형이 A/T일 때, rs6584554의 대립유전자형이 A/T일 때, rs883079의 대립유전자형이 A/T일 때, rs2106261의 대립유전자형이 A/T일 때, rs3737883의 대립유전자형이 A/T일 때, 또는 rs8180252의 대립유전자형이 A/T일 때 심방세동의 발생을 예측 또는 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 rs531007, rs4611994, rs6584554, rs883079, rs2106261, rs3737883 및 rs8180252로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)과 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 심방세동 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 심방세동 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 심방세동 예측 또는 진단용 키트를 제공한다. 상기 단일염기다형성에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

본 발명에 따른 유전자좌위의 단일염기다형성을 확인하여 심방세동의 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 단일염기다형성을 확인하여 한국인 환자 중 심방세동의 발생을 예측 또는 진단할 수 있는 최초의 방법으로 한국인 특이적으로 심방세동 고위험군을 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 큰 의미를 가지며, 이를 이용하여 개개인의 치료, 시술, 수술 등 다양한 처치 과정에서의 위험성을 감소시켜 심방세동으로 인한 위험성을 감소시키는데 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전장유전체연관분석에 대한 맨하탄 플롯(Manhattan plot)을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 rs8180252에 대한 regional LD plot을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 rs3737883에 대한 regional LD plot을 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 심방세동 관련 유전자 확인을 위한 전장유전체연관분석 실시

한국인의 심방세동(atrial fibrillation; AF)과 관련된 유전자를 확인하기 위하여, 전장유전체연관분석(Genome Wide Association Study; GWAS)를 실시하였다. 1단계 전장유전체연관분석을 위하여 Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 6.0 칩(AffymetrixInc., Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 유전자형 분석을 시행하였고, 총 5,372명의 말초혈액에서 채취한 혈액시료로부터 QIAamp® DNA Mini and Blood Mini kit(Qiagen)을 이용하여 DNA 500ng을 채취하여 유전자형 분석을 시행하였다. 전장유전체연관분석 결과를 이용한 연관성 분석에는 PLINK program version 1.07을 이용하여 수행하였다. 그리고 통계적 분석은 SAS(version 9.1) 을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1의 적색선은 전장유전체연관분석 결과 "P=1.0X10^-8"의 유의수준(significant level)을 나타내며, 청색선은 "P=1.0X10^-5"의 유의수준(significant level)을 나타낸다. 또한, 청색으로 표기된 유전자, 즉, PRRX1, PITX2, ZFHX3, NEURL, 및 TBX5는 기존에 서양인(European ancestry)을 대상으로 하여 심방세동 관련 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)과 최단거리에 위치하는 유전자좌위(closest locus)이며, 적색으로 표기된 유전자, 즉, PPFIA4 및 HANDS2/FBXO8는 본 전장유전체연관분석을 통하여 새롭게 발견된 유전자좌위이다. 상기 결과를 통하여, 기존의 서양인을 대상으로 했던 심방세동 관련 유전자좌위와, 한국인을 대상으로 한 관련 유전자위가 일치하지 않는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 하여 한국인을 대상으로 한 심방세동 관련 단일염기다형성을 확인하는 실험을 진행하였다.

실시예 2: 연관 단일염기다형성 이차 검증 실험

2.1. 서양인의 심방세동 관련 단일염기다형성을 이용한 검증 실험

기존에 서양인에게서 심방세동과 관련되어 있는 것으로 보고되었던 14개의 유전자좌위을 선정하여 이차 검증을 실시하였다. 연관성 분석을 위하여, 대조군인 3,700명과 심방세동 환자군 672명을 대상으로 하여 전장유전체연관분석을 재실시하였으며, 그 결과는 본페로니 보정법(bonferroni correction)에 의하여 "P-value < 0.0036"일 때 유의성이 있는 것으로 보았다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

[표 2]

표 2에 나타난 바와 같이, 염색체(chromosome) 1번에 위치한 PPFIA4 유전자에서 단일염기다형성인 rs3737883이 유의성 있게 심방세동 발생 위험도가 가장 높은 것(OR = 1.37 (95% CI = 1.07 to 1.76; P = 1.3 × 10^- ²)으로 확인되었으며, HANDS2(4q34.1) 유전자좌위 중 단일염기다형성인 rs8180252 또한 유의성 있는 결과를 나타내는 것을 확인하였다(p < 0.05). 그리고 전장유전체연관분석 결과와 이차 검증 결과를 모두 합친 결과 또한, 유의성 있게 나타나는 것을 확인하였다(p < 5.0X10^-8)

상기 결과들을 통하여, 서양인과 유사하게 한국인에게 있어서 PRRX1, PITX2, ZFHX3, NEURL, 및 TBX5가 심방세동 발생과 연관된 것을 확인하였으며, 특히 서양인에게서 발굴되지 않은 2개의 유전자좌위인 PPFIA4 및 HANDS2(4q34.1)의 경우에는 한국인의 심방세동 발생 위험성과 매우 높은 연관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 유전자좌위 중 단일염기다형성인 rs531007, rs4611994, rs6584554, rs883079, rs2106261, rs3737883 및 rs8180252가 한국인의 심방세동 발생 위험성과 매우 높은 연관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 본 발명의 유전자좌위 또는 단일염기다형성을 확인하여 한국인에게 있어서의 심방세동 발생 위험성, 즉, 심방세동의 발생을 예측 또는 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

생물학적 시료로부터 유전자좌위(locus)인 1q32.1 또는 4q34.1의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 확인하는 단계를 포함하는, 심방세동 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
상기 1q32.1의 단일염기다형성은 rs3737883이고, 상기 4q34.1의 단일염기다형성은 rs8180252인 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 심방세동 예측 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 한국인을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 체액, 모근, 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 정보를 제공하는 방법은 rs3737883의 대립유전자형이 G/A일 때, 또는 rs8180252의 대립유전자형이 A/G일 때 심방세동의 발생을 예측 또는 진단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
단일염기다형성인 rs3737883 또는 rs8180252와 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함하는, 심방세동 예측 또는 진단용 조성물.
제 6 항의 심방세동 고위험군 예측용 조성물을 포함하는, 심방세동 예측 또는 진단용 키트.