KR101748678B1 - 글라이코펩타이드 화합물 생산증대방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비리보솜성 펩타이드계 화합물을 생산하는 미생물에 MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 글라이코펩타이드(glycopeptides), 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides), 사이더로포어(siderophores), 아미노코마린(aminocoumarins) 등의 화합물을 포함하는 비리보솜성 펩타이드계 화합물, 바람직하게는 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 발히마이신(balhimycin) 등을 포함하는 글라이코펩타이드계 화합물, 더욱 바람직하게는 반코마이신(vancomycin)의 생산을 증대하는 방법을 제공한다.

Description

글라이코펩타이드 화합물 생산증대방법 {Method for increasing the productivity of glycopeptides compounds}

본 발명은 MbtH 유사 단백질, 더욱 구체적으로는 Vcm11, CloY를 미생물에 과발현하여 비리보솜 생합성 기구에 의해 생산되는 글라이코펩타이드 계열의 미생물 대사산물의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

미생물은 의약 및 농용 항생제 등의 유용한 다양한 비리보좀성 펩타이드(Nonribosomal peptides, NRPs) 계열의 대사산물을 발효 생산한다. 이러한 NRPs 계열 대사 산물에는 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 발히마이신(balhimycin) 등의 글라이코펩타이드(Glycopeptides) 또는 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides), 마이코박틴(mycobactin), 엔테로박틴(enterobactin) 등의 사이더로포어(siderophores) 그리고, 클로로바이오신, 노보바이오신(novobiocin) 등의 아미노코마린(aminocoumarins)과 같은 산업적으로 매우 유용한 물질들이 있다. 이들 물질은 비리보좀 펩타이드 생합성 효소군 (non-ribosomal peptide synthases, NRPSs) 에 의해 활성화된 아미노산이 조합되어 합성된다. 아미노산의 조합에서 생합성 전구물질인 아미노산(amino acids)의 아데닐화 (adenylation) 과정이 생합성 과정의 필수단계이다. 최근의 생합성 기구를 조사한 바에 따르면 NRPSs의 유전자 군 (gene clusters)의 반 정도에 최근까지 그 기능이 명확하게 알려지지 않은 mbtH 유사 유전자들이 포함되어 있음이 알려졌다. MbtH 유사 단백질은 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 생산되는 마이코박틴(mycobactin) 생합성 효소 군에 존재하는 MbtH와 유사한 단백질을 말한다.

MbtH 유사 단백질은 70여 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 2차 대사물질 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. MbtH 유사 단백질들은 글라이코 펩타이드 항생제, 시더로포어(siderophores), 아미노쿠마린(aminocoumarins), 그리고 리포펩타이드(lipopeptide) 등의 생합성 유전자군에 존재하며 다양한 이차산물 합성에 관여한다.

Stegmann E. 등은 글라이코펩타이드인 발히마이신(balhimycin) 생합성 유전자군에 속한 MbtH 유사 단백질 (Orf1)을 제거한 균주가 모균주에 비해 발히마이신 생산성에 영향력이 없다고 보고한바 있으며, 이는 게놈상에 존재하는 다른 2개의 MbtH 유사 단백질이 그 역할을 대신하기 때문인 것으로 추정하였다 (Stegmann E. 등 (2006) FEMS Microbiol. Lett., 262:85-92). 또한 Wolpert M. 등의 연구에서는 클로로바이오신(clorobiocin) 생합성 유전자군에서 MbtH 유사 단백질(CloY)을 제거한 후 이종숙주인 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (S. coelicolor)에 MbtH 유사 단백질(CloY)을 도입한 경우 클로로바이오신(clorobiocin) 생산에 영향을 받지 않지만, 이종 숙주의 MbtH 유사 단백질을 제거한 균주에 MbtH 유사 단백질(CloY)을 도입한 경우 생산성이 급감함을 보였다. 이는 생합성 유전자군 내의 MbtH 유사 단백질 이외의 게놈에 존재하는 다른 MbtH 유사 단백질이 기능을 대체할 수 있음을 나타낸다 (Wolpert M. 등 (2007), Microbiology, 153:1413-1423).

방선균 게놈상에는 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor)의 게놈상에 2개, 댑토마이신 (daptomycin) 생산균주인 스트렙토마이세스 로제오스포루스(S. roseosporus)에는 6개, 스트렙토마이세스 클라불리게루스(S. clavuligerus)에 7개, 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei)에는 6개 등 많은 MbtH 유사 단백질이 존재한다(Baltz RH. (2011), J Ind Microbiol biotechnol., 38:1747-1760).

2011년까지 염기분석된 168개의 방선균 게놈을 살펴보면, 188개의 MbtH 유사 단백질이 보고되어 있으며, 이는 방선균 게놈당 평균 1.1개의 MbtH 유사 단백질이 포함되어 있음을 알 수 있다. 이들의 상동성은 55% 이상이며, NXEXQXSXWP-X5-PXGW-X13-L-X7-WTDXRP 영역이 보존된 특징이 있다(Baltz R. H. (2011), J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 38:1747-1760).

최근의 MbtH에 관한 인비트로 연구에 따르면, 이들 단백질이 NRPSs(nonribosomal peptide synthetases)에 존재하는 아데닐화 도메인 (adenylation domain)에 아미노산의 결합 즉, 아데닐화 (adenylation)를 도와주는 필수적인 역할을 수행함이 알려졌다.

Davidsen J. M. 등은 노카르디신(nocardicin) A 생합성효소 모듈 내의 5개의 아데닐화 도메인(adenylation domain) 중 3개만이 아데닐화에 MbtH 유사 단백질인 NocI이 필요한 것으로 보고하였다 (Davidsen J. M. 등 (2013), J AM Chem Soc., 135:1749-1759). 이와 유사한 연구에서도 MbtH 유사 단백질이 모든 아데닐화 도메인에 필수적인 것은 아니며, 아직 그 이유에 대해서는 명백히 밝혀지지 않았다 (Felnagle EA. 등 (2010), Biochemistry, 49:8815-8817).

Boll B. 등의 인비트로 연구에 따르면, MbtH 유사 단백질의 아데닐화 활성은 이종(non-cognate)의 MbtH 유사 단백질에 의해서도 그 기능을 대체할 수 있음을 확인하였다(Boll B. 등 (2011), J. Biol. Chem., 286:36281-36290).

상기 연구 결과를 볼 때 MbtH 유사 단백질은 미생물의 NRPSs 생합성 기구에서 생합성 모듈에 존재하는 아데닐화 도메인에서 대사전구물질인 아미노산의 부착에 필요한 주요한 단백질임을 알 수 있다. 또한 인비트로 연구 결과에 따르면 MbtH 유사 단백질의 종류에 따라 차이가 있지만, MbtH 유사 단백질을 16 ~ 32배 과량 첨가할 경우 아데닐화 효소 활성이 10배 정도 증가함이 관찰되었다 (Felnagle EA. 등 (2010), Biochemistry, 49:8815-8817)). 일반적으로 NRPSs 계는 다수 모듈로 구성되어 있으며, 다수의 모듈로 구성된 NRPSs 계의 경우 원활한 아데닐화를 위해 아데닐화를 도와주는 단백질인 MbtH 유사 단백질이 많이 요구될 것으로 추론할 수 있다. 즉, 생합성 기구 내에 MbtH 유사 단백질이 부족하면 비리보솜성 펩타이드계 물질의 생산이 제한될 수 있을 것이다. 그러므로, MbtH 유사 단백질의 충분한 발현은 비리보솜성 펩타이드계 물질의 생산성을 증대시킬 것으로 기대할 수 있다.

NRPSs에서 합성되는 비리보솜성 펩타이드 계열의 유용 의약소재 대사산물은 반코마이신, 테이코플라닌, 데카플라닌, 클로로에레모마이신, 답토마이신, 사이클로스포린 등이 있다. 이들의 생합성 기구는 다수의 모듈로 구성되어 있다. 이들 모듈에는 아데닐화 도메인이 하나 이상 포함되어 있다.

이들 물질 중 MRSA(methicillin- resistant staphylococcus aureus)에 대한 최후의 항생제로 알려져 있으며, 감염성 질환 치료제로 널리 사용되는 반코마이신은 도 1에서 보는 바와 같이, 7개의 아미노산 잔기가 원환화 (cyclization)되어있는 원환 헵타펩타이드 골격 (cyclic heptapeptide backbone)에 O-반코사민-글루코실기(O-vancosamine-glucosyl)가 결합되어 있다. 원환화된 헵타펩타이드를 구성하는 7개 아미노산은 류신(Leucin; Leu) 1개, 베타하이드록시타이로신(β-hydroxytyrosin; b-Hty) 2개, 아스파라긴(asparagine; Asn) 1개, 하이드록시페닐글라이신(hydroxyphenylglycins; Hpg) 2개, 3,5-다이하이드록시페닐글라이신(3,5-dihydroxyphenylglycine; Dpg) 1개로 구성되어 있다. 이들을 구성하고 있는 생합성 기구인 NRPSs에도 각 아미노산의 축합을 담당하고 있는 7개의 모듈에 7개의 아데닐화 도메인이 존재하고 있다.

미생물, 특히 방선균에서 발효 생산되는 유용 이차 대사생산물은 원생산 균주에서 생산량을 증대시키기가 매우 어렵다. 본 발명은 방선균에서 발효 생산되는 유용 이차 대사생산물을 증대시키는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.

본 발명에서는 미생물 생산증대에 영향을 줄 수 있는 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 도입하여 과발현함으로써 미생물 이차 대사산물 특히 펩타이드계 산물, 특히 글라이코펩타이드계 항생제, 더욱 구체적으로 반코마이신의 생산성을 증대시켜, 산업적 생산성을 증대하고자 한다.

본 발명은 다수의 아데닐화 도메인(adenylation domain)이 포함된 모듈로 구성된 반코마이신 생합성 기구가 더욱 많은 MbtH 유사 단백질이 요구될 것으로 추론하고 반코마이신 생합성 기구에 MbtH 유사 단백질을 과발현하여 생산성이 증대됨을 확인하고자 하였다.

일반적으로 유용 이차대사물의 발효 생산성이 증대된 고생산 미생물의 개발은 비특이적 돌연변이 과정의 반복을 통해 선별함으로 시간 및 비용이 많이 소요된다. 이러한 방법으로 대사 과정의 조절 및 전구체 생산량의 증대를 이룰 수 있는 유전자의 도입 및 제어를 통한 고생산 균주 개발을 위해 최근 많은 연구가 이루어져 왔다. 본 발명에서는 비리보솜성 펩타이드계 항생제 중 특히 반코마이신 생합성 경로 중 아데닐화의 활성에 도움을 줄 것으로 추론되는 유전자인 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 생산균주에 도입하고 이를 과발현하여, 글라이코펩타이드계인 반코마이신 생산성을 증대시키는 방법을 개발하였다. 도입하는 MbtH 유사 단백질 유전자는 대표적으로 반코마이신 생합성 유전자 군에 존재하는 vcm11과 클로로바이오신(clorobiocin) 생합성 유전자군에 있는 cloY를 이용하였고, 이들 유전자를 방선균 발현 벡터계에 구축하여 도입하였다.

본 발명은

a) MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 발현벡터에 삽입하는 단계;

b) 상기 MbtH 유사 단백질 암호화 유전자가 삽입된 발현벡터로 미생물을 형질전환시키는 단계; 및

c) 상기 형질전환된 미생물과 비리보솜성 펩타이드 화합물 생산 방선균을 콘쥬게이션시켜 방선균을 형질전환시키는 단계;를 포함하는 비리보솜성 펩타이드 화합물의 생산증대방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자가 vcm11 또는 cloY임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자에서 MbtH 유사 단백질이 Vcm11 단백질 또는 CloY 단백질과 서열유사도가 55% 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자가 미생물에서 수득하거나 합성한 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 비리보솜성 펩타이드 화합물이 글라이코펩타이드(Glycopeptides), 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides), 사이더로포어(siderophores) 또는 아미노코마린(aminocoumarins)임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 비리보솜성 펩타이드 화합물이 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin) 또는 발히마이신(balhimycin)임을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방선균이 스트렙토마이세스임을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의하면 인비보에서 MbtH 유사 단백질을 과발현하여 이차 대사산물의 생산성을 현저히 증대시켰다. 이와 같이, MbtH 유사 단백질을 과발현하여 반코마이신을 비롯한 펩타이드계 이차 대사산물의 생산성을 증대시킴으로써 본 발명의 방법은 의학 등의 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 반코마이신 및 글라이코펩타이드계 항생제 구조이다.
도 2는 방선균 유래의 다양한 MbtH 유사 단백질의 서열을 비교한 것이다.
도 3은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KFCC10990P-vcm11 돌연변이체 제조 모식도이다.
도 4는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KFCC10990P-vcm11 돌연변이체를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.
도 5는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KFCC10990P-vcm11 배양액의 분석한 결과를 나타낸 HPLC이다.
도 6은 Vcm11을 과발현하기 위한 벡터의 구성도이다.
도 7은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KFCC10990P ::vcm11를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.
도 8은 과발현을 위해 cloY 염기서열을 포함하는 유전자 합성 서열이다.
도 9는 CloY를 과발현하기 위한 벡터의 구성도이다.
도 10은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KFCC10990P ::cloY를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.

본 발명은 MbtH 유사 단백질을 과발현시켜 반코마이신을 비롯한 글라이코펩타이드계 미생물 이차 대사산물의 생산성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물은 글라이코펩타이드를 비롯한 비리보솜성 펩타이드성 물질을 생산하는 산업적으로 유용한 곰팡이, 효모, 세균이 될 수 있으며, 특히 세균 중 방선균이 될 수 있다.

본 발명에서 생산성을 증대시키고자 하는 비리보솜성 펩타이드 계열의 물질은 비리보솜 펩타이드 생합성 효소군 (non-ribosomal peptide synthases, NRPSs)에 의해 생산되는 것으로서, 글라이코펩타이드(Glycopeptides), 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides), 사이더로포어(siderophores) 또는 아미노코마린(aminocoumarins) 등과 같은 산업적으로 매우 유용한 물질들이다.

구체적으로 본 발명의 내용을 설명하면, 본 발명은 반코마이신 생합성 유전자로부터 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 vcm11 유전자를 확보하고, 또한 대표적인 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 클로로바이오신(clorobiocin) 생합성 유전자에 존재하는 것으로 보고된 cloY 유전자를 인공합성하여 확보하였으며, 이를 일반적인 방선균 발현 벡터계인 ^P ermE ^* 프로모터 하류에 착제하여 Vcm11의 과발현벡터 및 CloY의 과발현벡터를 완성하였다.

이들 발현벡터를 펩타이드 물질 생산 미생물, 구체적으로 글라이코펩타이드 생산 방선균, 더욱 구체적으로 반코마이신 생산 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis)에 도입하여 발현 벡터계를 통한 MbtH 유사 단백질의 과발현, 더욱 구체적으로 Vcm11 및 CloY의 과 발현에 의한 펩타이드 물질, 구체적으로 글라이코펩타이드, 더욱 구체적으로 반코마이신의 생산성의 증대를 확인한 결과, 약 1.6배 내지 1.9배의 증대 효율을 나타내었다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 균주 유래의 반코마이신 생합성 유전자군에서 MbtH 유사 단백질을 코딩하는 vcm11 유전자를 확보하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 글라이코 펩타이드 중 반코마이신의 생산균주에 MbtH 유사 단백질을 암호화하는 vcm11 유전자 기능을 규명하고, 유전자를 도입 및 발현하여 반코마이신 생산성을 높이고자 하였다. 본 발명자들은 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 유전자 vcm11을 제거한 균주를 제조하고, 이를 발효하여 이 균주가 반코마이신 비생산 균주임을 확인함으로써 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 유전자 vcm11이 반코마이신 생산에 필수적 유전자임을 밝혔다. 이에, 반코마이신 생산향상을 위해 아미코라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 균주 유래의 vcm11 유전자 또는 클로로바이오신(clorobiocin) 생합성 유전자에 존재하는 것으로 보고된 cloY 유전자를 방선균용 프로모터인 ^PermE^* 하류에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.

상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체에서 반코마이신 생산성을 조사한 결과, 모균주에 비해 반코마이신 생산성이 56-85% 정도 증가하는 것을 확인하였다.

이하 실시예를 들어 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시예는 본 발명의 구성에 대한 설명을 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 사용된 균주 및 유전자 조작

본 발명의 재조합 형질전환체 제조를 위해 반코마이신 생산균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 균주를 사용하였다. 유전자 조작은 일반적인 과정에 따라 E. coli DH5α 내에서 실시하였다 (Sambrook J. 등. (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY). 서브클로닝을 위해 pTOPTAV2(Enzynomics, cat.EZ001S) 벡터를 이용하였다.

실시예 2: 아미콜라톱시스 오리엔탈리스에 접합에 의한 유전자 도입

돌연변이체 제조를 위한 코스미드 벡터 및 발현벡터의 방선균으로의 도입은 E. coli/스트렙토마이세스 간의 컨쥬게이션 방법( Kieser, T. 등, 2000)으로 수행하였다.

각각의 벡터는 비메틸화 주게(non-methylation donor)로 dam ^- , dcm ^- 인 E.coli ET12567/pUZ8002에 도입하였다. 상기 형질전환된 E. coli를 항생제 25 ug/ml의 클로람페니콜과 50 ug/ml의 카나마이신, 아프라마이신이 각각 함유된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 12-16시간 배양하였고, 배양액을 1 ml LB 배지에 접종하여 37℃에서 광학밀도 0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양세포는 LB 배지로 2회 세척한 후 0.5 ml LB 배지로 농축하였다. 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 균주 포자액 200 ul를 원심분리하고 0.5 ml LB를 첨가하여 혼합한 후 동량의 대장균 농축액을 첨가하여 배지에 도포하였다. 30℃에서 16시간 배양하여 500 ug 날리딕신산(nalidixic acid)과 1 mg의 아프라마이신을 도말하였다. 돌연변이체 및 형질전환체는 3-7일 후 확인하여 선별하였다.

실시예 3: 아미콜라톱시스 오리엔탈리스의 발효 배양

반코마이신을 생산하는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 균주를 ISP4 배지에서 2주간 30℃에서 배양하여 수집한 포자를 본 실험에 사용하였다. 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 균주, 돌연변이체 및 형질전환체의 발효배양은 다음과 같은 조건으로 수행하였다.

균주를 500 ml 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ml 배지-1{1.1% 소이톤 펩톤, 0.3% 효모 추출물, 0.3% 말트 추출물, 1.7% 덱스트로스, pH 7.5)}에 접종하여 30℃, 220 rpm 조건으로 하루 동안 배양하여 활성화시킨 후, 500 ml 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ml 배지- 2(0.5% 감자단백, 0.5% 생대두분, 0.2% 탄산칼슘, 4.2% 산화전분)에 접종하여 동일 조건에서 2일 동안 배양하였다. 배지-2에서 배양된 배양액을 500 ml 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 30 ml 배지-3(1.1% 감자단백, 0.1% 염화나트륨, 1.5% 생대두분, 0.8% 포도당, 7.4% 과당, pH9.5)에 접종하여 34℃, 240 rpm으로 3일간 배양하였다.

실시예 4: 반코마이신 발효 생산 분석

반코마이신의 추출은 발효 배양액과 황산용액(pH 1.8)을 1:9로 혼합하고 원심분리하여 상등액을 HPLC 분석을 통해 실시하였다. 정량분석은 반코마이신 표준물질(USP reference standard cat. No. 1709007)을 사용하여 실시하였다. 10 ㎕의 추출액은 흡수파장 280 nm, 유속 1 ml/min로 C18 컬럼 (symmetry C18, 5 um, 4.6 X 250 mm, Waters)에 도입하여 분석하였다.

실시예 5: vcm 유전자군의 확보

코스미드 라이브러리 (Cosmid library)는 SuperCos1 (Stratagene, USA) 코스미드 벡터를 사용하여 작제하였다. 유전자 DNA를 물리적인 절단을 통해 30-45 kb정도의 사이즈를 함유하는 코스미드 라이브러리로 작제하였다. 작제된 코스미드 2000개의 양 말단의 염기서열을 분석하여 비리보솜성 펩타이드 합성효소 (nonribosomal peptide synthetase; NRPS) 서열을 가지는 5개의 코스미드 (COS001F04, COS017C05, COS005H09, COS019E09, COS004B12)를 선택하여 숏건 서열 분석 (shotgun sequencing)을 수행하여 약 94,557 kb의 반코마이신 생합성 유전자연결 정보를 확보할 수 있었다. 확보한 반코마이신 생합성 유전자는 약 94 kb에 전체 72개의 유전자가 예측되었다. 이를 vcm 유전자군으로 명명하였다. 예측된 유전자에서 반코마이신 생합성과 연관된 유전자로는 헵타펩타이드 (heptapeptide) 형성을 담당하는 NRPS 유전자인 cepA, cepB, cepC 유사체 (homologue)인 vcm8,9, 10과, 반코마이신과 D-글루코스 부착을 담당하는 gtfD , E 유사체 (homologue)인 vcm16, 17, 헵타펩타이드의 원환화 (cyclization)를 담당하는 oxyA , B, C 유사체(homologue)인 vcm12, 13, 14 등을 포함하여 36개의 핵심 유전자가 포함되어 있었다. 이를 통해 MbtH 유사 단백질을 암호화하고 있는 유전자 vcm11을 확인하였다. 확보된 Vcm11의 단백질 서열은 다른 MbtH 유사 단백질과 70% 유사도를 보이며, MbtH 유사 단백질에 보존된 것으로 알려진 NXEXQXSXWP-X5-PXGW-X13-L-X7-WTDXRP 서열을 잘 보존하고 있었다(도 2).

실시예 6: vcm11 유전자가 제거된 돌연변이체의 제조

본 발명에서 사용한 돌연변이체의 제조는 Gust B. 등이(2003) 보고한 방법에 준하여 실시하였다. Vcm 11 돌연변이 제조의 모식도는 도 3과 같다. 돌연변이체 제조를 위해 apr-oriT 카셋트는 pIJ773을 주형으로 vcm11-dF(5'-ccggcagcgtccggaaggtgaaaggacacaacgatgaccattccggggatccgtcgacc-3'), vcm11-dR (5'-tccaaccgtccgcgttgagcggctggacacgcgccctcatgtaggctggagctgcttc-3') 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 약 1.4 kb 단편들을 확보하였다. 확보된 단편을 Vancos001F04가 형질전환된 E. coli BW25113/pIJ790 균주에 전기 충격법으로 도입하여 Vancos001F04(Δ vcm11::aac (3)IV- oriT) 코스미드 벡터를 만들었다. 작제된 돌연변이체는 실시예 2에 따라 도입하였다.

돌연변이체 선별은 gDNA PCR을 통해 아프라마이신 (apramycin) 유전자 증폭 및 vcm11-F/B(5'-cgggatccgcagcgtccggaaggtgaaa-3'), vcm11-conR(5'-ccggccccggatcgaagc-3') 프라이머를 사용하여 1.6 kb 단편만 증폭되는 이중 크로스오버 균주 선별을 하였다 (도 4).

실시예 7: vcm11 유전자가 제거된 돌연변이체 발효 및 반코마이신 생산

돌연변이체의 반코마이신 생산성을 확인한 결과, 도 5과 같이 vcm11이 제거된 균주에서는 반코마이신이 생산되지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해 vcm11 유전자는 반코마이신 생산에 중요한 역할을 하는 유전자임을 확인하였다.

실시예 8: vcm11 과 발현 벡터 제조 및 도입

아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 유래 vcm11 유전자는 코스미드 벡터(Van_Cos005H09)를 주형으로 하여 268 bp의 DNA 단편을 증폭하였다. 이때 프라이머의 5' 말단에는 BamHI 링커 (vcm11-F/B:5'-cgggatccgcagcgtccggaaggtgaaa-3')를, 3' 말단에는 XbaI 링커 (vcm11-R/X:5'-gctctagaggacacgcgccctcaggcgc-3')를 첨가한 프라이머를 사용하였으며, 증폭 산물은 pTOPTAV2(Enzynomics, cat.EZ001S)벡터 시스템을 이용하여 클로닝하였다. M13 순방향 프라이머, M13 역방향 프라이머를 사용하여 염기서열 분석을 실시하여 확인하고 , BamHI, XbaI으로 절단하여 pSET152(^P ermE) 벡터 하류에 삽입하여 도 6과 같은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) 속 KFCC10990P 유래 vcm11 발현벡터인 pSET152 (^P ermE - vcm11)를 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 pSET152(^P ermE) 는 아프라마이신 내성 유전자(acc (3)IV)를 가지고 있으며, 미생물 유전체에 직접 도입할 수 있는 특성이 있다. 작제된 돌연변이체는 실시예 2에 따라 도입하였다.

vcm11 과발현 벡터가 도입된 형질전환체는 apr1(5'-gtgcaatacgaatggcgaaaag-3'), apr2(5'-ggcatcgcattcttcgcatccc-3') 프라이머를 사용하여 gDNA PCR을 실시하고 780 bp DNA 단편이 증폭됨을 확인하였고, ermE-5E(5'-ggaattcgagctcggtaccagc-3'), vcm11-R/X 프라이머를 사용하여 535bp DNA 단편이 증폭됨을 추가로 확인하였다 (도 7).

실시예 9: Vcm11 과발현 벡터 도입 형질전환체의 반코마이신 생산성

vcm11 과발현 벡터가 도입된 형질전환체는 세 번 반복 실험을 통해 표 1과 같이 반코마이신 생산성이 85% 가량 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통해 vcm11 과발현으로 반코마이신 생산성 증대를 도모할 수 있음을 알 수 있었다.

Strain	VM	Yield
	g L-1	(%)
A. orientalis KFCC10990P::vcm11	5.07±0.22	185
A. orientalis KFCC10990P	2.74±0.12	100

실시예 10. CloY 과발현 벡터 제조

cloY 유전자는 Streptomyces roseochromogenes subsp. oscitans (Genbank no. AF329398.1)균주로부터 알려진 염기서열을 바탕으로 인공합성하였다. 합성 유전자의 서열은 도 8과 같다.

합성시 5' 말단에는 BamHI 링커, 3' 말단에는 XbaI 링커를 부착하여 pTOPbluntV2 벡터에 클로닝하고 염기서열을 확인하였다. 확보한 pTOPbluntV2(cloY)를 BamHI/XbaI 절단하여 cloY DNA 단편을 회수하고 pSET152(^P ermE) 벡터 하류에 삽입하여 CloY 과발현 벡터인 pSET152(^P ermE- cloY ))를 제작하였다(도 9). 작제된 돌연변이체는 실시예 2에 따라 도입하였다.

cloY 과발현 벡터가 도입된 형질전환체는 apr1(5'-gtgcaatacgaatggcgaaaag-3'), apr2(5'-ggcatcgcattcttcgcatccc-3') 프라이머를 사용하여 gDNA PCR을 실시하고 780bp DNA 단편이 증폭됨을 확인하였고, ermE-5E(5'-ggaattcgagctcggtaccagc-3'), cloY-OR(5'-gctctagatgaatgagcagatgc-3') 프라이머를 사용하여 530bp DNA 단편이 증폭됨을 추가로 확인하였다(도 10).

또한, 이종 유전자인 cloY 과발현 벡터가 도입된 형질전환체는 세 번 반복 발효배양을 통해 표 2와 같이 반코마이신 생산성이 56% 정도 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통해 cloY 과발현으로 반코마이신 생산성 증대를 도모할 수 있음을 확인하였다.

Strain	VM	Yield
	g L-1	(%)
A. orientalis KFCC10990P::cloY	4.58±0.04	156
A. orientalis KFCC10990P	2.94±0.07	100

<110> Genotech Corp. <120> Method for increasing the productivity of glycopeptides compounds <130> genotech-MbtH <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Amycolatopsis orientalis <400> 1 Asn Xaa Glu Xaa Gln Xaa Ser Xaa Trp Pro Xaa Pro Xaa Gly Trp Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Trp Thr Asp Xaa Arg Pro 20 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccggcagcgt ccggaaggtg aaaggacaca acgatgacca ttccggggat ccgtcgacc 59 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccaaccgtc cgcgttgagc ggctggacac gcgccctcat gtaggctgga gctgcttc 58 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgggatccgc agcgtccgga aggtgaaa 28 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccggccccgg atcgaagc 18 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 6 gctctagagg acacgcgccc tcaggcgc 28 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtgcaatacg aatggcgaaa ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggcatcgcat tcttcgcatc cc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggaattcgag ctcggtacca gc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctctagatg aatgagcaga tgc 23 <210> 11 <211> 69 <212> PRT <213> Amycolatopsis orientalis <400> 11 Met Thr Asn Pro Phe Asp Asn Glu Asp Gly Ser Phe Phe Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Asp Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ala Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Ala Gly Trp Thr Thr Val His Gly Glu Ala Gly Arg Lys Glu Cys Leu 35 40 45 Ala Tyr Val Glu Glu Asn Trp Thr Asp Leu Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Gln Glu Ala Gly Ala 65 <210> 12 <211> 71 <212> PRT <213> Streptomyces roseochromogenes <400> 12 Met Ala Thr Asn Pro Phe Glu Asp Glu Asn Gly Ser Tyr Leu Val Leu 1 5 10 15 Ile Asn Gly Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ser Phe Ala Asp Val 20 25 30 Pro Asn Gly Trp Thr Val Ile Phe Asn Glu Ala Ser Arg Gln Asp Cys 35 40 45 Leu Asp Tyr Val Asn Glu His Trp Thr Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu 50 55 60 Gln Arg Ala Met Gly Gly Glu 65 70 <210> 13 <211> 72 <212> PRT <213> Saccharomyces viridis <400> 13 Met Lys Ser Asn Pro Phe Glu Asp Glu Asn Gly Val Tyr His Val Leu 1 5 10 15 Val Asn Asp Glu Gly Gln Tyr Ser Leu Trp Pro Ser Phe Ile Glu Val 20 25 30 Pro Ala Gly Trp Arg Glu Val Leu Ser Gly Lys Ser Arg Gln Glu Cys 35 40 45 Leu Asp Tyr Ile Glu Glu Asn Trp Thr Asp Met Arg Pro Lys Ser Leu 50 55 60 Ile Lys Ala Met Glu Asp Ala Ser 65 70 <210> 14 <211> 80 <212> PRT <213> Streptomyces fradiae <400> 14 Met Thr Met Thr Asn Pro Phe Asp Asp Thr Glu Gly Val Phe His Val 1 5 10 15 Leu Val Asn Asp Glu Asn Gln His Ser Leu Trp Pro His Phe Val Glu 20 25 30 Ile Pro Asp Gly Trp Arg Ala Val Val Arg Glu Arg Pro Arg Gln Glu 35 40 45 Cys Leu Asp Tyr Ile Glu Ala Asn Trp Thr Asp Met Arg Pro Gln Ser 50 55 60 Leu Ile Asp Ala Met Glu Ala His Glu Lys Ser Glu Gly Ala Ile Arg 65 70 75 80 <210> 15 <211> 75 <212> PRT <213> Streptomyces roseosporus <400> 15 Met Ala Asn Pro Phe Glu Asn Asn Asp Gly Ser Tyr Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Asp Glu Gly Gln Tyr Ser Leu Trp Pro Ala Phe Ala Asp Val Pro 20 25 30 Ala Gly Trp Thr Val Thr Phe Gly Glu Ser Ser Arg Gln Glu Cys Leu 35 40 45 Asp His Ile Asn Glu Asn Trp Thr Asp Met Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Arg Gln Met Glu Asn Asp Arg Thr Thr Ala Ala 65 70 75 <210> 16 <211> 71 <212> PRT <213> Streptomyce fungcidicus <400> 16 Met Pro Asn Pro Phe Glu Asp Pro Asp Ala Ser Tyr Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Asp Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Val Phe Ala Lys Val Pro 20 25 30 Asp Gly Trp Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala Gly Arg Gln Asp Cys Leu 35 40 45 Asp Tyr Ile Glu Lys Asn Trp Thr Asp Met Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Glu Ala Met Glu Asn Gln Arg 65 70 <210> 17 <211> 69 <212> PRT <213> Amycolatopsis balhimycina <400> 17 Met Ser Asn Pro Phe Asp Asn Glu Asp Gly Ser Phe Phe Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Asp Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Thr Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Ala Gly Trp Thr Arg Val His Gly Glu Ala Gly Arg Gln Glu Cys Leu 35 40 45 Ala Tyr Val Glu Glu Asn Trp Thr Asp Leu Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Arg Glu Ala Ser Ala 65 <210> 18 <211> 69 <212> PRT <213> Nonomuraea sp. <400> 18 Met Thr Asn Pro Phe Glu Asn Glu Asp Gly Ser Phe Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Asp Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ser Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Pro Gly Trp Thr Arg Val His Gly Val Ala Thr Arg Gln Glu Cys Leu 35 40 45 Ala Tyr Val Glu Glu Asn Trp Thr Asp Ile Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Ala Glu Ala Gly Ala 65 <210> 19 <211> 69 <212> PRT <213> Actinoplanes teichomyceticus <400> 19 Met Thr Asn Pro Phe Asp Asn Glu Asp Gly Ser Phe Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Gly Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ala Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Asp Gly Trp Thr Gly Val His Gly Pro Ala Ser Arg Gln Asp Cys Leu 35 40 45 Gly Tyr Val Glu Gln Asn Trp Thr Asp Leu Arg Pro Lys Ser Leu Ile 50 55 60 Ser Gln Ile Ser Asp 65 <210> 20 <211> 69 <212> PRT <213> Actinoplanes teichomyceticus <400> 20 Met Thr Asn Pro Phe Asp Asn Glu Asp Gly Ser Phe Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn Gly Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ala Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Asp Gly Trp Thr Gly Val His Gly Pro Ala Ser Arg Gln Asp Cys Leu 35 40 45 Gly Tyr Val Glu Gln Asn Trp Thr Asp Leu Arg Pro Arg Ser Leu Val 50 55 60 Glu Gln Ala Asp Ala 65 <210> 21 <211> 71 <212> PRT <213> Streptomyces rishiriensis <400> 21 Met Ala Thr Asn Pro Phe Asp Asp Glu Asn Gly Val Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Asn Asp Glu Gly Gln His Ser Leu Trp Pro Ser Phe Ala Ala Leu 20 25 30 Pro Lys Gly Trp Thr Val Ile Leu Asp Glu Ala Ser Arg Gln Glu Cys 35 40 45 Leu Asp Tyr Val Asn Glu His Trp Thr Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Ala Met Gly Asp Glu 65 70 <210> 22 <211> 72 <212> PRT <213> Streptomyces pristinaespiralis <400> 22 Met Ser Asn Pro Phe Glu Asp Ala Glu Gly Thr Phe Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Asn His Glu Gly Gln Tyr Ser Leu Trp Pro Ser Phe Ala Glu Val Pro 20 25 30 Ala Gly Trp Thr Val Ala Leu Pro Ala Thr Asp Arg Glu Ser Ala Leu 35 40 45 Ala His Ile Thr Asp Arg Trp Thr Asp Met Arg Pro Gln Ser Leu Ile 50 55 60 Asp Ala Met Asn Gly Thr Ala Ala 65 70 <210> 23 <211> 71 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 23 Met Gly Thr Asn Pro Phe Asp Asp Pro Asp Gly Arg Tyr Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Asn Glu Glu Asp Gln His Ser Leu Trp Pro Ala Phe Ala Glu Val 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Thr Val Ala Leu Ala Glu Thr Asp Arg Gln Ser Ala 35 40 45 Leu Asp Phe Ile Thr Glu His Trp Thr Asp Met Arg Pro Arg Ser Leu 50 55 60 Val Arg Ala Met Glu Glu Ala 65 70

Claims (6)

1. a) MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자 vcm11 또는 cloY를 발현벡터에 삽입하는 단계;
   b) 상기 MbtH 유사 단백질 암호화 유전자 vcm11 또는 cloY가 삽입된 발현벡터로 미생물을 형질전환시키는 단계; 및
   c) 상기 형질전환된 미생물과 반코마이신 생산 방선균을 콘쥬게이션시켜 방선균을 형질전환시키는 단계;를 포함하는 반코마이신의 생산증대방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,
   MbtH 유사 단백질을 암호화하는 유전자 vcm11 또는 cloY는 미생물에서 수득하거나 합성한 것임을 특징으로 하는, 반코마이신의 생산증대방법.
5. 삭제
6. 삭제

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