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KR101715415B1 - 재조합 조류 인플루엔자 백신 및 그의 용도 - Google Patents

재조합 조류 인플루엔자 백신 및 그의 용도 Download PDF

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KR101715415B1
KR101715415B1 KR1020117014944A KR20117014944A KR101715415B1 KR 101715415 B1 KR101715415 B1 KR 101715415B1 KR 1020117014944 A KR1020117014944 A KR 1020117014944A KR 20117014944 A KR20117014944 A KR 20117014944A KR 101715415 B1 KR101715415 B1 KR 101715415B1
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KR
South Korea
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leu
asn
avian influenza
gly
ser
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KR1020117014944A
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쉬안 궈
미셸 뷔블로
조이스 에이 프리차드
린 에프 디키
Original Assignee
메리얼 인코포레이티드
바이오렉스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 인플루엔자 백신, 특히 조류 인플루엔자 백신을 포함한다. 백신은 인플루엔자의 헤마글루티닌에 기초한 서브유닛 백신일 수 있다. 헤마글루티닌은 개구리밥을 비롯한 식물에서 발현될 수 있다. 본 발명은 또한 동물을 인플루엔자에 대해 보호하는데 사용될 수 있는 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 인코딩하고 발현하는 재조합 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 벡터 및 서브유닛 백신을 이용하는 프라임-부스트 계획을 비롯한, DIVA 전략과 적합성인 예방접종 요법을 포함한다.

Description

재조합 조류 인플루엔자 백신 및 그의 용도{RECOMBINANT AVIAN INFLUENZA VACCINE AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008 년 11 월 28 일에 출원된 미국 가 출원 일련 번호 61/118,492 에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 인플루엔자 백신, 특히 조류 인플루엔자 백신을 포함한다. 백신은 재조합 조류 백신일 수 있다.
조류 인플루엔자, 때때로 조류 독감, 및 일반적으로 새 독감은 새에 적응된 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자를 언급한다. 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV) 는 오르토믹소바이러스 과에 속하는 RNA 바이러스이고, 핵단백질 및 막단백질과 관련되는 유형 A 인플루엔자 바이러스로서 분류된다. AIV 는 하기 2 개의 독특한 당단백질을 특별히 포함하는 지질 외피를 갖는다: 숙주 세포 내로 바이러스의 진입을 촉진하는, 헤마글루티닌 (HA), 및 감염된 세포로부터 자손 바이러스의 방출을 보조하는, 뉴라미니다제 (NA) (de Jong et al., J Clin Virol. 2006 Jan;35(1):2-13). H5N1 서브유형 (HA 5 및 NA 1 을 특별히 포함하는 바이러스) 은 구체적으로 아시아, 러시아, 중동, 유럽 및 아프리카에서의 최근의 발병과 연관되었었다 (Olsen et al., Science. 2006 Apr 21;312(5772):384-8).
고병원성 인플루엔자 A 바이러스 서브유형 H5N1 바이러스는 잠재적인 세계적 위협으로서 세계적 우려를 야기해온 최근 생겨난 조류 인플루엔자 바이러스이다. H5N1 은 아시아, 유럽 및 아프리카에 걸친 증가하는 수의 나라에서 수백만 마리의 가금류를 살생했다. 건강 전문가들은 인간 독감 바이러스 및 조류 독감 바이러스 (특히 H5N1) 의 공존이 종-특이적 바이러스 사이에 유전적 물질이 교환되는 기회를 제공하여, 아마도 인간에게 쉽게 전염가능하고 치명적인 새로운 병독성 인플루엔자를 창조해낼 것을 염려하고 있다 (Food Safety Research Information Office. "A Focus on Avian Influenza". Created May 2006, Updated November 2007).
첫번째 H5N1 발병이 1997 년에 발생한 이후로, 임상적으로 중증이고 치명적인 인간 감염을 초래하는 HPAI H5N1 새에서 인간으로의 전염의 수가 증가해 왔다. 그러나, 새와 인간 사이에 상당한 종 장벽이 존재하기 때문에, 바이러스는 쉽게 인간에게 넘어오지 않는다. 바이러스의 발견 이후로 수백만 마리의 새가 바이러스에 감염되었지만, 인도네시아, 라오스, 베트남, 루마니아, 중국, 터키 및 러시아에서 200 명이 넘는 인간이 조류 독감으로 사망했다.
최근, 식물이 치료적 약제 예컨대 백신, 항체, 및 생물약제의 생산을 위한 공급원으로서 연구되어 왔다. 그러나, 식물로부터의 백신, 항체, 단백질, 및 생물약제의 생산은 치료 과정과는 거리가 멀고, 그러한 백신 생산과 통상적으로 연관되는 수많은 장애물이 존재한다. 식물 백신의 성공적인 생산에 대한 한계에는 바이오산물 또는 발현되는 항원의 낮은 수율 (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 495-496), 단백질 불안정성, 제품 품질의 불일치 (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769), 및 예상되는 크기 및 면역원성을 갖는 바이러스-유사 제품을 생산하기에 불충분한 능력 (Arntzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756) 이 포함된다.
인간을 비롯한 동물의 AIV 에 대한 감수성을 고려할 때, AIV 감염을 예방하고 동물을 보호하는 방법이 필수적이다. 따라서, 인플루엔자에 대한 효과적인 백신을 생산하는 방법에 대한 필요가 존재한다.
인플루엔자 폴리펩티드 및 그의 조각 및 변이체를 포함하는 조성물이 제공된다. 폴리펩티드 또는 항원은 식물에서 생산되고, 고면역원성이고 보호적이다.
폴리펩티드 및 그의 조각 및 변이체는 백신 및/또는 제약적 또는 면역적 조성물로 제형화될 수 있다. 그러한 백신 또는 조성물은 동물을 예방접종하고, 동종 및 이종 인플루엔자 균주에 대한 보호를 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에는 동물에게 유효량의 항원성 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체를 투여하여 보호적 면역원성 반응을 야기하는 것을 포함하는 이용 방법이 포함된다. 방법에는 또한 항원성 폴리펩티드를 개구리밥 식물에서 제조하는 방법이 포함된다. 개구리밥에서 생산된 후 항원성 폴리펩티드는 백신 또는 면역적 조성물로서 사용하기 위해 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
하나 이상의 항원성 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체 및 사용 지침을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
하기 상세한 설명은 예로서 제공되나 오직 기술된 특정 구현예에 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 하기 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1 은 폴리뉴클레오티드 및 단백질 서열에 부여된 SEQ ID NO 를 나타내는 표이다.
도 2 는 A/chicken/Indonesia/7/2003 H5N1 헤마글루티닌 (HA) 을 코딩하는 합성 (코돈-최적화된) 및 돌연변이된 DNA 서열 (SEQ ID NO:1) 을 제공한다.
도 3 은 천연 및 합성/돌연변이된 A/chicken/Indonesia/7/2003 H5N1 (HA) 단백질 서열을 제공한다.
도 4 는 HA 유전자의 A/chicken/Indonesia/7/2003(H5N1) 야생형 (천연) cDNA 서열 (GenBank 접근 번호 EF473080) (SEQ ID NO:3) 을 제공한다.
도 5 는 HA 단백질 서열 정렬 및 서열 일치성 표를 나타낸다.
도 6 은 MerB01 벡터 서열 (SEQ ID NO:6) 을 나타낸다.
도 7 은 MerB01 벡터 맵을 나타낸다.
도 8 은 DNA 서열 정렬 및 서열 일치성 표를 나타낸다.
도 9 는 양성 트랜스제닉 식물의 HA 스크리닝의 플레이트 예 및 HA 검정 결과를 나타낸다.
도 10 은 H5N1 HA 를 발현하는 트랜스제닉 식물의 HA 검정 결과를 제공한다.
도 11 은 목표 제형물의 추정 수율을 나타내는 표를 제공한다.
도 12-14 는 상이한 항체로 수행된 적혈구응집 억제 검정 결과를 나타낸다.
도 15 는 SDS-PAGE (은 염색) 및 웨스턴-블롯을 나타낸다.
도 16 은 상이한 혈청을 사용하는 웨스턴-블롯을 제공한다.
도 17 은 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 H5 헤마글루티닌에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 렘나 (Lemna) 발현된 HA 의 면역위치결정 (immunolocalization) 검정을 나타낸다.
도 18 은 면역원성 연구의 예방접종 계획을 나타내는 표이다.
도 19 는 HPAI H5N1 공격 후 보호 데이타의 요약을 제공한다.
도 20 은 렘나 유도된 HA 로 예방접종된 닭에서 제 35 일에 수집된 혈청으로부터의 적혈구응집 억제 역가 (log2) 를 나타낸다.
도 21 은 공격 전 제 42 일 및 공격 후 제 56 일에 수집된 샘플에 대한 혈청학적 데이타를 요약하는 표를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
면역원성 반응을 동물에서 유발하는 인플루엔자 항원 및 그의 조각 및 변이체를 포함하는 조성물이 제공된다. 항원성 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체는 개구리밥 식물에서 생산될 수 있다. 항원성 폴리펩티드 또는 조각 또는 변이체는 백신 또는 제약적 또는 면역적 조성물로 제형화되고, 보호적 반응을 동물에서 유발 또는 자극하는데 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서 폴리펩티드 항원은 헤마글루티닌 폴리펩티드 또는 그의 활성 조각 또는 변이체이다.
본 발명의 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 전장 폴리펩티드 또는 그의 활성 조각 또는 변이체일 수 있다고 인식된다. "활성 조각" 또는 "활성 변이체" 는 그 조각 또는 변이체가 폴리펩티드의 항원성 성질을 보유함을 의미한다. 따라서, 본 발명은 면역원성 반응을 동물에서 유발하는 임의의 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함한다. 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 동물에서 반응을 유발, 유도 도는 자극하는 임의의 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질, 펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체일 수 있다.
관심의 특정 항원성 폴리펩티드는 헤마글루티닌 (HA) 이다. 인플루엔자 헤마글루티닌은 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 유형의 헤마글루티닌을 언급한다. 그것은 항원성 당단백질이고, 바이러스가 감염되는 세포에 결합하는 것을 책임진다. 상이한 HA 항원이 존재하고, 그중 임의의 것이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 관심의 대상이 되는 것은 고병원성 조류 독감 바이러스인 H5N1 로부터의 HA 이다. 더욱 특히, HA 는 A/chicken/Indonesia/7/2003 균주로부터 단리된 H5N1 로부터 단리될 수 있다. 그러나, 다른 인플루엔자 바이러스 (즉 H1 - H16) 예를 들어 H1, H3, H5, H6, H7, H9 등으로부터의 HA가 본 발명의 실시예 사용될 수 있다. 또한, 임의의 HA 단백질의 HA 전구체가 사용될 수 있는 것으로 인식된다.
HA 는 공모양 머리 및 줄기 영역으로 이루어지는 엑토도메인이 있는 동종3합체성 막관통 단백질이다. 2 개의 영역은 모두 HA 의 생물학적 기능에서 중요한 역할을 하는 N-연결된 올리고당을 보유한다 (Schulze, I.T., J Infect Dis, 1997. 176 Suppl 1: p. S24-8; Deshpande, K.L., et al., PNAS USA, 1987, 84(1): p. 36-40). 인플루엔자 A 바이러스의 상이한 서브유형 간에, 머리 영역의 당화 자리에 상당한 변이가 존재하는 한편, 줄기 올리고당은 더 보존되어 있고 융합 활성에 요구된다 (Ohuchi, R., et al., J Virol, 1997, 71(5): p. 3719-25). 항원성 펩티드 에피토프 근처의 글라이칸은 항체 인식을 간섭하고 (Skehel, J.J., et al., PNAS USA, 1984, 81(6): p. 1779-83), 단백질분해 자리 근처의 글라이칸은 절단을 조정하고 인플루엔자 바이러스의 감염성에 영향을 미친다 (Deshpande, K.L., et al., 1987). 62 H5 유전자의 뉴클레오티드 서열 분석은 HA 공모양 머리 내의 수용체 결합 자리 근처의 부가적인 당화가 야생 새, 특히 물새로부터, 가금류로의 종간 전염 이후 바이러스의 적응이라는 가설을 지지한다 (Banks, J., et al., Avian Dis, 2003, 47(3 Suppl): p. 942-50).
150 개 초과의 B 세포 에피토프 뿐만 아니라 113 개의 CD4+ 및 35 개의 CD8+ T 세포 에피토프가 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질에 대해 식별되었으나, 오직 제한된 수의 에피토프가 조류 인플루엔자 균주/서브유형에 대해 보고되었다 (Bui, H.H., et al., PNAS USA, 2007, 104(1): p. 246-51). 자연 및 모노클로날 항체-선별된 항원성 변이체에서 아미노산 치환 자리의 조사는 모든 항원성 자리가 수용체-결합 자리를 우세하게 둘러싸고 있는 막 원위 HA1 도메인의 표면 상에 있음을 나타냈다. 항원성 자리는 하기와 같은 2 가지 현저한 특징을 갖는다: 그들 중 다수의 루프 유사 구조 및 탄수화물 측쇄의 발생 (Skehel, J.J., et al., Annu Rev Biochem, 2000, 69: p. 531-69). 2 가지 H5 항원성 자리의 위치결정 및 미세 구조가 기술된 바 있다 (Kaverin, N.V., et al., J Gen Virol, 2002. 83(Pt 10): p. 2497-505). 자리 1 은 H1 의 Ca2 및 H3 의 항원성 자리에 상응하는 HA1 잔기 140-145 를 포함하는 노출된 루프이고, 자리 2 는 2 개의 서브자리, 즉 H3 서브유형 내 자리 B 에 상응하는 하나 (HA1 잔기 156 및 157) 및 H1 서브유형 내 자리 Sa 에 상응하는 하나 (HA1 잔기 129 내지 133) 로 이루어진다. 에피토프 맵핑 연구는 최근의 H5N1 단리물의 HA 항원성 구조가 저병원성 H5 균주와 실질적으로 상이하고, 빠르게 진화하고 있음을 시사했다 (Kaverin, N.V., et al., J Virol, 2007. 81(23): p. 12911-7). 에피토프 보존 분석은 상당한 수준의 균주간 교차 반응성이 T 세포 에피토프의 경우에 가능하지만, Ab 에피토프의 경우에는 훨씬 낮음을 시사했다. 중첩 펩티드 라이브러리를 사용하여, AIV 의 T 세포 에피토프가 최초로 식별되었고, 이는 H5 HA 에 대해 면역화된 닭에서 T 세포의 작용을 유도한 HA1 도메인 내의 15-mer 펩티드, H5246-260 이다 (Haghighi, H.R., et al., PLoS ONE, 2009. 4(11): p. e7772).
본 명세서에서, 특히 청구항 및/또는 단락에서, "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수형 용어에는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 "및" 을 포함하는 것으로 의도된다.
"동물" 은 포유류, 새 등을 의미한다. 동물 또는 숙주에는 포유류 및 인간이 포함된다. 동물은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 및 생선. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 조각" 은 본원에서 호환되게 사용되고, 임의의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산이 아닌 화학적 부분에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 하기와 같은 개입에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다; 예를 들어 디설피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 개질, 예컨대 표지 또는 생활성 성분과의 접합.
본 발명의 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자에 대해 보호할 수 있다. 즉, 그들은 면역 반응을 동물에서 자극할 수 있다. "항원" 또는 "면역원" 은 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사멸된, 약독화된 또는 살아 있는 전체 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 성질을 갖는 인서트를 포함하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되면 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 의 부분 또는 조각; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드" 에는 일단 숙주에 투여되면 그 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 의미에서 면역적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는 단백질 조각은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 조각은 하나 이상의 에피토프 또는 항원성 결정인자를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 본원에서 사용되는 "면역원성 또는 항원성" 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 그의 유사체, 또는 그의 면역원성 조각이 포함된다. "면역원성 또는 항원성 조각" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역적 반응을 유발하는 단백질의 조각을 의미한다. 상기 조각은 당업계에 잘 알려진 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 식별될 수 있다. 참조, 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어, 많은 수의 펩티드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고 (이 경우, 펩티드는 단백질 분자의 일부에 해당함), 펩티드가 지지체에 아직 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 확인될 수 있다. 상기 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986 에 기술되어 있다. 유사하게는, 입체형태적 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정술 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체구조를 확인함으로써 용이하게 식별된다. 참조, 예를 들어, 상기 Epitope Mapping Protocols. T. 파르바 (T. parva) 의 단백질에 특히 적용가능한 방법이 본원에 그 전문이 참조로 포함된 PCT/US2004/022605 에 상세히 기술되어 있다.
논의된 바와 같이, 본 발명은 항원성 폴리펩티드의 활성 조각 및 변이체를 포함한다. 따라서, 용어 "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드" 는 폴리펩티드가 본원에서 정의된 바와 같은 면역적 반응을 초래하는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 고려한다. 용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 성질이 보존성일 것이며, 즉 그러한 치환이 아미노산의 하나의 패밀리 내에서 일어날 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 하기와 같은 4 개의 패밀리로 분류된다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프로린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성--글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 라이신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 중대한 영향을 미치지 않을, 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 유사한 보존성 대체가 포함된다. 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 작은 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 그러므로 참조 폴리펩티드의 정의 안에 있다. 이들 개질에 의해 생성되는 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이" 는 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 비치환된 폴리펩티드와도 면역반응한다는 전제 하에 비치환된 부모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용도 포함한다.
용어 "에피토프" 는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상의 자리를 의미한다. 상기 용어는 또한 "항원성 결정인자" 또는 "항원성 결정인자 자리" 와 호환되게 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 하나의 항체가 또다른 항체의 표적 항원에 대한 결합을 차단하는 능력을 보여주는 단순한 면역검정에서 식별될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역적 반응" 은 숙주에서 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 발달이다. 대개, "면역적 반응" 은 하나 이상의 하기 효과를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원 또는 항원들에 특이적으로 지향되는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증강되고/거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 것과 같은 치료적 또는 보호적 면역적 반응을 나타낼 것이다. 그러한 보호는 감염된 숙주에서 보통 나타나는 증상의 감소 또는 결여, 더 빠른 회복 시간 및/또는 감염된 숙주 내 더 낮아진 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
합성 항원, 예를 들어, 폴리에피토프, 측면 (flanking) 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원이 또한 정의에 포함된다. 참조, 예를 들어, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. 면역원성 조각은, 본 발명의 목적을 위해, 보통 약 3 개 이상의 아미노산, 약 5 개 이상의 아미노산, 약 10-15 개 이상의 아미노산, 또는 약 15-25 개 이상의 아미노산 또는 그 이상의 아미노산의 분자를 포함할 것이다. 조각의 길이에는 임계적 상한이 존재하지 않고, 조각은 거의 전장인 단백질 서열, 또는 심지어 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
따라서, 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드의 최소 구조는 인플루엔자 폴리펩티드의 에피토프 또는 항원성 결정인자를 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지는 것이다. 인플루엔자 폴리펩티드의 조각을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 최소 15 개의 뉴클레오티드, 약 30-45 개의 뉴클레오티드, 약 45-75 개, 또는 57 개 이상, 87 개 또는 150 개의 연속 또는 인접 뉴클레오티드의, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 에피토프 결정 절차, 예컨대, 중첩 펩티드 라이브러리의 생성 (Hemmer et al., 1998), 펩스캔 (Pepscan) (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) 및 알고리즘 (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) 이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥인 RNA 또는 DNA, 또는 그의 하이브리드를 의미한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 조각, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 라이보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결 기 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 중합 후, 예컨대 표지 성분에 의한 접합에 의해 추가로 개질될 수 있다. 이 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡 (cap), 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 유사체에 의한 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 다른 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해 수득되거나 미생물로부터 유래될 수 있다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열 및/또는 이의 발현에 필요한 조절성 서열이 포함된다. 예를 들어, 유전자는 mRNA 또는 기능성 RNA 를 발현하거나, 특정 단백질을 인코딩하고, 조절성 서열을 포함하는 핵산 조각을 또한 언급한다.
본 발명은 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 상보성 가닥을 추가로 포함한다. 상보성 가닥은 중합체성 그리고 임의의 길이일 수 있고, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 유사체를 임의의 조합으로 함유할 수 있다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 소기관) 은 그 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 소기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제되어진 성분을 언급한다. "단리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 상기 용어는 또한 재조합 기술 뿐만 아니라 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된" 은 절대 순도를 요하지 않으며; 오히려, 상대적 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 폴리펩티드 제제는 그안의 폴리펩티드가 그것의 자연 환경에 있을 때보다 더욱 농축되어 있는 것을 의미한다. 즉, 폴리펩티드는 세포성 성분으로부터 분리된다. "실질적으로 정제된" 은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 그 이상의 세포성 성분 또는 물질이 제거된 것을 의미한다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 부분적으로 정제될 수 있다. "부분적으로 정제된" 은 60% 미만의 세포성 성분 또는 물질이 제거되는 것을 의미한다. 이는 폴리뉴클레오티드에도 동일하게 적용된다. 본원에서 개시된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 항원성 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체는 개구리밥에서 생산되는 인플루엔자 항원성 폴리펩티드이다. 개시된 폴리뉴클레오티드 및 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 조각 및 변이체가 또한 본 발명에 포함된다. "조각" 은 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 그에 의해 인코딩되는 항원성 아미노산 서열의 일부를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 조각은 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이 천연 단백질의 생물학적 활성을 보유하고 따라서 면역원성 활성을 갖는 단백질 조각을 인코딩할 수 있다. 폴리펩티드 서열의 조각은 보호적 면역 반응을 동물에서 유도하는 능력을 보유한다.
"변이체" 는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 변이체는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가 및/또는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 각각 포함한다. 본 발명의 특정 폴리뉴클레오티드 (즉, 참조 폴리뉴클레오티드) 의 변이체는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 간의 백분 서열 일치성의 비교에 의해 또한 평가될 수 있다. "변이체" 단백질은 천연 단백질 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가 및/또는 천연 단백질 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 천연 단백질로부터 유도되는 단백질을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명에 포함되는 변이체 단백질은 생물학적 활성이며, 즉 면역 반응을 유발하는 능력을 갖는다.
조류, 돼지, 말류, 고양이, 개, 오리, 칠면조, 닭, 메추라기 및 야생 동물을 비롯한 기타 종으로부터의 인플루엔자 폴리펩티드의 상동체는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "상동체 (homolog)" 에는 이종상동체 (ortholog), 유사체 (analog) 및 동족체 (paralog) 가 포함된다. 용어 "유사체" 는 동일 또는 유사한 기능을 가지나, 무관한 유기체에서 별도로 진화되어 온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "이종상동체" 는 상이한 종으로부터이나, 공통의 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화되어온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 보통, 이종상동체는 동일 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 용어 "동족체" 는 게놈 내 중복에 의해 관련되는 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 동족체는 보통 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능은 관련될 수 있다. 야생형 인플루엔자 폴리펩티드의 유사체, 이종상동체, 및 동족체는 번역후 개질에 의해, 아미노산 서열 차이에 의해, 또는 둘 다에 의해 야생형 인플루엔자 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 상동체는 일반적으로 야생형 인플루엔자 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 80-85% 이상, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 의 서열 일치성을 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다.
변이체는 대립 변이체를 포함한다. 용어 "대립 변이체" 는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 자연 집단 (예, 바이러스 종 또는 변종) 에 존재하는 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 언급한다. 그러한 자연 대립 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 1-5% 분산을 초래할 수 있다. 대립 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열을 서열분석함으로써 식별될 수 있고, 이는 하이브리드형성 탐침을 사용하여 이들 종에서 동일한 유전자 유전자좌를 식별함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 자연 대립 변이의 결과이고 관심의 유전자의 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 모든 상기 핵산 변이 및 결과적인 아미노산 다형성 또는 변이가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "유도체" 또는 "변이체" 는 (1) 상응하는 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드와 비교할 때 실질적으로 동등한 기능을 갖거나 또는 (2) 그 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 야생형 폴리펩티드에 면역반응성이 되게 하는, 하나 이상의 보존성 아미노산 변이 또는 다른 작은 개질을 갖는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 언급한다. 이들 변이체 또는 유도체에는 미개질 대응 폴리펩티드와 비교할 때 실질적으로 동등한 활성을 갖는 펩티드를 초래할 수 있는, 인플루엔자 폴리펩티드 1차 아미노산 서열의 작은 변경을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 상기 개질은 자리-지정 돌연변이유도에 의하는 경우와 같이 의도적일 수 있고, 또는 자발성일 수있다. 용어 "변이체" 는 그 폴리펩티드가 본원에서 정의된 바와 같은 면역적 반응을 생성하는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 고려한다. 용어 "변이체" 는 또한 숙주 종으로부터 폴리펩티드의 발현 또는 분비를 촉진하도록 천연 신호 펩티드가 이종 신호 펩티드에 의해 대체되는 폴리펩티드의 개질을 포함한다. 그것은 또한 숙중 종에서 폴리펩티드의 막 발현을 촉진하도록 막관통 도메인 및/또는 세포질 꼬리가 유사한 이종 서열로 대체되는 폴리펩티드의 개질을 포함한다.
용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 내 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 상기와 같이 일반적으로 성질에 있어서 보존성일 것이다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드에는 유전적 코드, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 최적화된 코돈 사용의 결과로서 축퇴성인 서열이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "최적화된" 은 특정 종에서 그의 발현을 증가시키도록 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 인플루엔자 폴리펩티드에 대해 최적화된 폴리뉴클레오티드 코딩을 제공하기 위해, 인플루엔자 단백질 유전자의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고발현되는 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 뉴클레오티드 염기 조성 중 A+T 또는 G+C 함량을 상기 종에서 실질적으로 발견되는 정도까지 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA 의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 붕괴 및 종결을 야기하거나, 2 차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이스 자리를 형성하는 서열을 제거하도록 개질될 수 있다. 상기 종에서 인플루엔자 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물에서의, 또는 특정 종에서의 코돈 사용의 분포 빈도를 이용함으로써 달성될 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 사용의 빈도" 는 특정 아미노산을 지정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용시 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 언급한다. 20 개의 자연 아미노산이 존재하고, 이들 중 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 인플루엔자 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 개시에 포함된다.
2 개의 아미노산 서열 간의 서열 일치성은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) pairwise blast 및 blosum62 매트릭스에 의해, 표준 파라미터를 사용하여 [참조, 예를 들어, BLAST 또는 BLASTX 알고리즘, "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA) 서버에서, 뿐만 아니라 Altschul et al. 에서 입수가능함; 및 따라서, 이 문헌은 상기 알고리즘 또는 BLAST 또는 BLASTX 및 BLOSUM62 매트릭스의 사용을 용어 "blast" 에 의해 언급함] 규명될 수 있다.
서열과 관련하여 "일치성" 은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 있는 위치의 수를 2 개의 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 값을 언급할 수 있으며, 이 경우 2 개의 서열의 정렬은 Wilbur and Lipman algorithm (Wilbur and Lipman) 에 따라, 예를 들어, 윈도우 크기 20 뉴클레오티드, 단어 길이 4 뉴클레오티드, 및 갭 벌점 4 를 사용하여 확인될 수 있고, 컴퓨터-보조 분석 및 정렬을 비롯한 서열 데이타의 해석은 시판되는 프로그램 (예, IntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA) 을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하다거나, 어느 정도의 서열 일치성 또는 상동성을 갖는다고 언급되는 경우, DNA 서열 내 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여겨진다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주 안에 있고, DNA 서열 내 티미딘 (T) 을 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여김으로써 DNA 서열로부터 유도될 수 있다.
2 개의 아미노산 서열의 서열 일치성 또는 서열 유사성, 또는 2 개의 뉴클레오티드 서열 간의 서열 일치성은 벡터 NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA) 를 사용하여 측정될 수 있다.
하기 문헌들은 서열의 상대적 일치성 또는 상동성을 비교하기 위한 알고리즘을 제공하며, 상기에 대해 부가적으로 또는 대안적으로, 이들 참조의 교시는 백분 상동성 또는 일치성을 측정하는데 사용될 수 있다: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O. 그리고, 과도한 실험 없이, 당업자는 많은 다른 프로그램 또는 참조를 백분 상동성을 측정하기 위해 참고할 수 있다.
하이브리드형성 반응은 상이한 "가혹성 (stringency)" 조건 하에 수행될 수 있다. 하이브리드형성 반응의 가혹성을 증가시키는 조건은 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, "Molecular Cloning: Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989).
"벡터" 는 시험관내 또는 생체내에서 표적 세포에 전달될 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스를 언급한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 치료 목적으로 관심의 서열을 포함할 수 있고, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상에서 복제하는 능력이 있을 필요가 없다. 상기 용어는 클로닝 벡터 및 바이러스성 벡터를 포함한다.
용어 "재조합" 은 자연에서 발생하지 않거나, 또다른 폴리뉴클레오티드에 자연에서 발견되지 않는 배열로 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드 반합성, 또는 합성 기원을 의미한다.
"이종" 은 비교되고 있는 독립체의 나머지와 유전적으로 구별되는 독립체로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전자 조작 기술에 의해 상이한 공급원에서 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 배치되어, 이종 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다. 천연 코딩 서열로부터 제거되어 천연 서열이 아닌 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.
본 발명은 유효량의 재조합 조류 인플루엔자 항원 및 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 조류 백신 또는 제약적 또는 면역적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 기술되는 주제는 부분적으로, 식물 단백질 발현 시스템에서 제조된 조류 인플루엔자 항원이 고면역원성이었고 닭을 동종 및 이종 조류 인플루엔자 균주로부터의 공격에 대해 보호했다는 놀라운 발견과 관련되는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
조성물
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 렘나 발현 시스템에 의해 제조된 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 렘나 발현 시스템 및 렘나 속으로부터의 식물 물질에 의해 제조된 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 렘나 발현 시스템에 의해 제조된 단백질에 관한 것이다. 단백질은 당화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 조류 인플루엔자 항원 및 렘나 속으로부터의 식물 물질을 포함하는 렘나 발현 시스템에 의해 제조된 단백질에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 안정적으로 형질전환된 식물 또는 식물 배양물에 관한 것이고, 이 경우 식물 또는 식물 배양물은 렘나 속으로부터 선별된다.
하나의 구현예에서 조류 인플루엔자 면역적 조성물 또는 백신이 재조합 면역적 조성물 또는 백신인 경우, 그 조성물 또는 백신은 재조합 벡터 및 제약적 또는 수의적 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클을 포함하고; 재조합 벡터는 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 식물 발현 벡터이다. 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은, 헤마글루티닌, 매트릭스 단백질, 뉴라미니다제, 비구조 단백질, 핵단백질, 폴리머라제 또는 그의 임의의 조각일 수 있다.
또다른 구현예에서, 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 인플루엔자 또는 조류 인플루엔자 균주에 감염된 조류에서 유래할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원은 헤마글루티닌 (HA) (예, HA0 전구체, HA1 및/또는 HA2), H1, H2, 단백질, 매트릭스 단백질 (예, 매트릭스 단백질 M1 또는 M2), 뉴라미니다제, 비구조 (NS) 단백질 (예, NS1 또는 NS2), 핵단백질 (NP) 및 폴리머라제 (예, PA 폴리머라제, PB1 폴리머라제 1 또는 PB2 폴리머라제 2) 이다. 인플루엔자 유형 A 바이러스는 사람, 새, 돼지, 말, 개, 고양이, 및 기타 동물을 감염시킬 수 있으나, 야생 새가 이들 바이러스에 대한 자연 숙주이다.
또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원은 상이한 인플루엔자 A 서브유형 (예: H1, H3, H5, H6, H7, H9) 으로부터의 헤마글루티닌 (HA) 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원은 H5N1 단리물로부터의 HA 일 수 있다. 또다른 구현예에서, H5N1 항원은 A/chicken/Indonesia/7/2003 균주로부터 단리된다.
본 발명은 유효량의 재조합 조류 인플루엔자 항원 및 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 조류 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원은 헤마글루티닌일 수 있다.
또다른 구현예에서, 재조합 인플루엔자 항원은 식물에서 발현된다. 또다른 구현예에서, 식물은 개구리밥이다. 또다른 구현예에서, 식물은 렘나 식물이다. 하나의 구현예에서, 재조합 인플루엔자 항원은 전매 렘나 미노르 (Lemna minor) 단백질 발현 시스템인, Biolex 의 LEX systemSM 에서 발현될 수 있다.
또다른 구현예에서, 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀전일 수 있다. 또다른 구현예에서, 유중수 에멀전은 수/유/수 (W/O/W) 3중 에멀전일 수 있다. 또다른 구현예에서, 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 수중유 에멀전일 수 있다.
본 발명은 벡터 분자 또는 발현 벡터 내에 보유되고 프로모터 요소에 및 임의로 인핸서에 작동적으로 연결된 인플루엔자 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 인플루엔자 폴리펩티드, 특히 조류 인플루엔자 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 변이체 또는 조각을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항원성 폴리펩티드, 특히 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 잘 알려진 분자 생물학 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있는 상기 식별된 인플루엔자 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14) 의 조각 및 변이체를 제공한다.
변이체는 본 발명의 항원성 폴리펩티드와, 특히 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 아미노산 서열과 약 75% 이상, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 일치성을 갖는 동종 폴리펩티드이다.
인플루엔자 폴리펩티드의 면역원성 조각은 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 서열을 갖는 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 변이체의 8 개 이상, 10 개, 15 개, 또는 20 개 연속 아미노산, 21 개 이상 아미노산, 23 개 이상 아미노산, 25 개 이상 아미노산, 또는 30 개 이상 아미노산을 포함한다. 또다른 구현예에서, 인플루엔자 폴리펩티드의 조각은 전장 인플루엔자 폴리펩티드에서 발견되는 특이적 항원성 에피토프를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 인플루엔자 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 로 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 변이체, 상동체 또는 면역원성 조각, 또는 이들 폴리펩티드의 조합을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 또는 13 으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 또는 13 으로 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 95% 이상, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 부가적 서열, 예컨대 동일한 전사 단위 내의 부가적 인코딩 서열, 제어 요소 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 자리, 5'UTR, 3'UTR, 전사 종결자, 폴리아데닐화 자리, 동일 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 있는 부가적 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동 재조합, 및 형질전환을 허용하는 서열, 및 본 발명의 구현예를 제공하는데 바람직할 수 있는 임의의 그러한 구축물을 포함할 수 있다.
유리하게는 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 발현을 위한 요소가 본 발명의 벡터 내에 존재한다. 최소 방식으로, 이는 개시 코돈 (ATG), 정지 코돈 및 프로모터, 및 임의로 또한 특정 벡터 예컨대 플라스미드 및 특정 바이러스성 벡터, 예를 들어, 폭스바이러스 이외의 바이러스성 벡터에 대한 폴리아데닐화 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 폴리뉴클레오티드가 유리하게는 벡터 내에 폴리펩티드 조각, 예를 들어 인플루엔자 펩티드를 인코딩하는 경우, ATG 는 해독 프레임의 5' 에 위치하고, 정지 코돈은 3' 에 위치한다. 발현을 제어하기 위한 다른 요소, 예컨대 인핸서 서열, 안정화 서열, 예컨대 인트론 및 단백질의 분비를 허용하는 신호 서열이 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 벡터, 예컨대 발현 벡터를 포함하는 제제, 예를 들어, 치료적 조성물에 관한 것이다. 상기 제제는 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함하고 발현하는 생체내 발현 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 벡터는 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클 내에 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원에 대해 코딩하는 (및 유리하게는 이를 발현하는) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하고 발현한다. 따라서, 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 제제 내의 다른 벡터 또는 벡터들은 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원 (예, 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 핵단백질) 중 하나 이상의 다른 단백질 또는 그의 조각을 인코딩하는 (그리고 적당한 환경에서 그 벡터가 발현하는) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 제제 내의 벡터 또는 벡터들은 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원 중 하나 이상의 단백질 또는 그의 조각(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 벡터 또는 벡터들은 폴리뉴클레오티드(들)을 발현한다. 또다른 구현예에서, 상기 제제는 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 융합 단백질 또는 그의 에피토프를 인코딩하고 유리하게는 생체내에서 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1 개, 2 개, 또는 그 이상의 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 상이한 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예를 들어, 상이한 종 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 닭, 오리, 칠면조, 메추라기 및 거위를 비롯한 조류 종에 더하여 인간, 말, 돼지, 개, 고양이로부터의 인플루엔자 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 인코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 혼합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 발현 벡터는 플라스미드 벡터 또는 DNA 플라스미드 벡터, 특히 생체내 발현 벡터이다. 구체적인 비제한적 예에서, pVR1020 또는 1012 플라스미드 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,846,946 및 6,451,769) 가 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 벡터로서 이용될 수 있다. pVR1020 플라스미드는 pVR1012 에서 유래하고, 인간 tPA 신호 서열을 함유한다. 하나의 구현예에서 인간 tPA 신호는 Genbank 내 접근 번호 HUMTPA14 하의 아미노산 M(1) 내지 아미노산 S(23) 를 포함한다. 또다른 구체적인 비제한적 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 벡터로서 이용되는 플라스미드는 Genbank 내 접근 번호 U28070 하의 아미노산 M(24) 내지 아미노산 A(48) 의 말 IGF1 의 신호 펩티드 서열을 함유할 수 있다. 실시에 참고 또는 이용될 수 있는 DNA 플라스미드에 대한 부가적 정보는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 및 6,221,362 에 있다.
플라스미드라는 용어는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 원하는 숙주 또는 표적의 세포 또는 세포들에서의 생체내 발현에 필요한 요소를 포함하는 임의의 DNA 전사 단위를 포함하고; 이와 관련하여, 고차나선 (supercoiled) 또는 비-고차나선, 원형 플라스미드, 뿐만 아니라 선형 형태가 본 발명의 범주 안에 있는 것으로 의도됨에 유의한다.
각각의 플라스미드는 프로모터에 작동적으로 연결되거나 프로모터의 제어 하에 있거나 프로모터에 의존성인, 임의로 이종 펩티드 서열, 변이체, 유사체 또는 조각과 융합된, 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 함유하거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 일반적으로, 진핵 세포에서 강한 프로모터 기능성을 이용하는 것이 유리하다. 강한 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 또는 쥐 기원의, 또는 임의로 랫트 또는 기니아피그와 같은 또다른 기원을 갖는 조기발현 거대세포바이러스 프로모터 (CMV-IE), 슈퍼 프로모터 (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995) 일 수 있다. CMV-IE 프로모터는 인핸서 부분과 연관되거나 연관되지 않을 수 있는, 실제 프로모터 부분을 포함할 수 있다. EP-A-260 148, EP-A-323 597, 미국 특허 번호 5,168,062, 5,385,839, 및 4,968,615, 뿐만 아니라 PCT 출원 번호 WO87/03905 를 참조할 수 있다. CMV-IE 프로모터는 유리하게는 인간 CMV-IE (Boshart et al., 1985) 또는 쥐 CMV-IE 이다.
더 일반적으로, 프로모터는 바이러스, 식물, 또는 세포 기원을 갖는다. 본 발명의 실시에 유용하게 이용될 수 있는 CMV-IE 이외의 강한 바이러스성 프로모터는 SV40 바이러스의 조기/후기 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스의 LTR 프로모터이다. 본 발명의 실시에 유용하게 이용될 수 있는 강한 세포성 프로모터는 세포골격의 유전자의 프로모터, 예컨대 예를 들어 데스민 프로모터 (Kwissa et al., 2000), 또는 액틴 프로모터 (Miyazaki et al., 1989) 이다.
임의의 구성적, 조절가능, 또는 자극-의존성 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 구성적 프로모터는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 로부터의 만노파인 (mannopine) 신타제 프로모터를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 열 충격 유전자 프로모터, 궁핍 (drought)-유도가능 유전자 프로모터, 병원체-유도가능 유전자 프로모터, 상처-유도가능 유전자 프로모터, 및 광/암-유도가능 유전자 프로모터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 식물 성장 조절인자, 예컨대 앱시스산, 옥신, 사이토키닌, 및 지베렐산에 의해 제어되는 프로모터를 사용하는 것이 유용할 수 있다. 조직 특이적 발현을 제공하는 프로모터 (예, 뿌리, 잎, 및 꽃-특이적 프로모터) 가 또한 선택될 수 있다.
플라스미드는 다른 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 안정화 서열(들), 예를 들어, 인트론 서열(들), 예를 들어, 옥수수 알코올 탈수소효소 인트론 (옥수수 ADHI 인트론), hCMV-IE 의 첫번째 인트론 (PCT 출원 번호 WO1989/01036), 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II (van Ooyen et al., 1979) 을 포함하는 것이 특히 유리하다. 또다른 구현예에서, 플라스미드는 3'UTR 을 포함할 수 있다. 3'UTR 은, 이에 제한되는 것은 아니나, 아그로박테리움 노팔린 신타제 (Nos) 3'UTR 일 수 있다.
플라스미드 및 폭스바이러스 이외의 바이러스성 벡터에 대한 폴리아데닐화 신호 (polyA) 에 관하여, 소 성장 호르몬 (bGH) 유전자의 폴리(A) 신호 (참조, U.S. 5,122,458), 또는 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리(A) 신호 또는 SV40 바이러스의 폴리(A) 신호가 사용될 수 있다.
"숙주 세포" 는 유전적으로 변경되었거나, 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 투여에 의해 유전적으로 변경될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다. 유전적으로 변경된 세포를 언급하는 경우, 그 용어는 최초에 변경된 세포 또는 그의 자손을 모두 언급한다.
하나의 구현예에서, 재조합 인플루엔자 항원은 트랜스제닉 개구리밥 식물에서 발현된다. 또다른 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 렘나 식물이다. 또다른 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 렘나 미노르이다. 또다른 구현예에서, 재조합 인플루엔자 항원은 렘나 미노르 단백질 발현 시스템, Biolex 의 LEX systemSM 에서 발현될 수 있다. 렘나 미노르 단백질 발현 시스템의 세부사항은 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,815,184; 7,022,309; 7,160,717; 7,176,024, 6,040,498, 7,161,064, 및 7,326,38 에서 찾을 수 있다. 상기 구현예들에서 인플루엔자 항원은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 또는 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.
항원성 인플루엔자 폴리펩티드를 개구리밥에서 발현시키는 방법
따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체는 개구리밥에서 발현된다. 이들 방법은 당업계에 알려진 임의의 적합한 형질전환 방법을 사용하여 개구리밥 식물에 도입되는 발현 카세트의 사용을 포함한다. 이들 발현 카세트 내의 폴리뉴클레오티드는 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체의, 개구리밥에서의 증강된 발현을 위해 하기와 같이 개질될 수 있다.
항원성 인플루엔자 폴리펩티드의 개구리밥 발현을 위한 카세트
인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 발현하는 트랜스제닉 개구리밥은 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 의한 개구리밥의 형질전환에 의해 수득된다. 이 방식으로, 관심의 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트 내에 구성되고 당업계에 알려진 임의의 적합한 형질전환 방법에 의해 개구리밥 식물에 도입된다.
일부 구현예에서, 관심의 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 의해 형질전환되는 개구리밥 식물은, 또한 관심의 또다른 이종 폴리펩티드, 예를 들어, 또다른 인플루엔자 폴리펩티드, 그의 조각, 또는 변이체의 발현을 제공하는 발현 카세트에 의해 형질전환되었다. 관심의 또다른 이종 폴리펩티드의 발현을 제공하는 발현 카세트는 개구리밥 식물 내로 도입되는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 (예를 들어, 동일한 형질전환 벡터 상에), 또는 동일 또는 상이한 도입 방법에 의해, 예를 들어 동일 또는 상이한 형질전환 방법에 의해, 동시 또는 이시에, 개구리밥 식물 내로 도입되는 상이한 폴리뉴클레오티드 상에 (예를 들어, 상이한 형질전환 벡터 상에) 제공될 수 있다.
개구리밥의 형질전환에 사용되는 발현 카세트는 관심의 폴리뉴클레오티드, 즉, 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 그의 조각, 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 전사 개시 영역 (예, 프로모터) 을 적어도 포함하는 발현 제어 요소를 포함한다. 본원에서 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 사용되는 "작동적으로 연결된" 은 서로 기능적 관계에 위치하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 언급한다. 일반적으로, 작동적으로 연결된 DNA 서열은 인접한 위치에, 2 개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 곳에, 해독 프레임 내에 있다. 그러한 발현 카세트에는 관심의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들 (예, 관심의 하나의 폴리뉴클레오티드, 관심의 2 개의 폴리뉴클레오티드들 등) 을 프로모터 및 다른 발현 제어 요소의 전사 조절 하에 있도록 삽입하기 위한 복수의 제한 자리가 제공된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 전달되는 폴리뉴클레오티드는 각각 하나 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 2 개 이상의 발현 카세트를 함유한다.
"발현 제어 요소" 는 RNA 폴리머라제 II (또는 일부 구현예에서 RNA 폴리머라제 III) 를 인도하여, 적당한 전사 개시 자리에서 특정 코딩 서열에 대한 RNA 합성을 개시할 수 있는, 보통 TATA 박스를 포함하는, DNA 의 조절인자 영역을 의미한다. 발현 제어 요소는 일반적으로 TATA 박스의 상류 또는 5' 위치에, 전사 개시 속도에 영향을 미치는 (예, 증강시키는) 다른 인지 서열을 부가적으로 포함할 수 있다. 게다가, 발현 제어 요소는 일반적으로 TATA 박스의 하류 또는 3' 위치에, 전사 개시 속도에 영향을 미치는 (예, 증강시키는) 서열을 부가적으로 포함할 수 있다.
전사 개시 영역 (예, 프로모터) 은 개구리밥 숙주에 대해 선천 또는 동종 또는 외래 또는 이종일 수 있거나, 자연 서열 또는 합성 서열일 수 있다. 외래는 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 개구리밥 숙주에서 그 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것을 의미한다. "기능성 프로모터" 는 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 서열에 작동적으로 연결되는 경우, 인코딩된 폴리펩티드, 조각, 또는 변이체의 발현 (즉, 전사 및 번역) 을 추진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터는 원하는 결과에 기초하여 선택될 수 있다. 따라서 본 발명의 발현 카세트는 구성적, 유도가능, 조직-선호되거나, 기타 개구리밥에서의 발현을 위한 프로모터를 포함할 수 있다.
세균, 이스트, 진균, 곤충, 포유류, 및 식물 프로모터를 비롯한, 당업계에 알려진 임의의 적합한 프로모터가 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용될 수 있다. 예를 들어, 개구리밥 프로모터를 비롯한 식물 프로모터가 사용될 수 있다. 예시적 프로모터에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 오파인 신테타제 프로모터 (예, nos, mas, ocs 등), 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 리불로스 비스포스페이트 (RubP) 카르복실라제 소형 서브유닛 프로모터, 및 알코올 탈수소효소 프로모터가 포함된다. 개구리밥 RubP 카르복실라제 소형 서브유닛 프로모터가 당업계에 알려져 있다 (Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). 식물, 바람직하게는 개구리밥을 감염시키는 바이러스로부터의 다른 프로모터가 또한 적합하며, 그 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 타로토란 (Dasheen) 모자이크 바이러스, 클로렐라 바이러스 (예, 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트랜스퍼라제 프로모터; Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), 토마토 반점 시듦 바이러스, 담배 얼룩 바이러스, 담배 괴사 바이러스, 담배 둥근 무늬 바이러스, 토마토 둥근 모늬 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 땅콩 그루터기 (stump) 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스, 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (sugarcane baciliform badnavirus) 등으로부터 단리된 프로모터가 포함된다.
프로모터를 비롯한 발현 제어 요소는 원하는 수준의 조절을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 구성적 발현을 부여하는 프로모터 (예, 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 만노파인 신타제 프로모터) 를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 대안적으로는, 다른 상황에서, 특정 환경 자극에 반응하여 활성화되는 프로모터 (예, 열 충격 유전자 프로모터, 궁핍-유도가능 유전자 프로모터, 병원체-유도가능 유전자 프로모터, 상처-유도가능 유전자 프로모터, 및 광/암-유도가능 유전자 프로모터) 또는 식물 성장 조절인자에 반응하여 활성화되는 프로모터 (예, 앱시스산, 옥신, 사이토키닌, 및 지베렐산에 의해 유도되는 유전자로부터의 프로모터) 를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 추가의 대안으로서, 조직-특이적 발현을 제공하는 프로모터 (예, 뿌리, 잎, 및 꽃-특이적 프로모터) 가 선택될 수 있다.
주어진 프로모터의 전체 강도는 시스-작용 뉴클레오티드 서열 예컨대 상류 활성화 서열의 조합 및 공간적 조직에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 신타제 유전자로부터 유래된 활성화 뉴클레오티드 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스 만노파인 신타제 프로모터로부터의 전사를 증강시킬 수 있다 (참조, Gelvin et al. 의 미국 특허 5,955,646). 본 발명에서, 발현 카세트는 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체의 발현을 증강시키는 프로모터 서열의 상류에 삽입된 활성화 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 아그로박테리움 투메파시엔스 만노파인 신타제 유전자로부터 유래된 프로모터에 작동적으로 연결된 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 신타제 유전자로부터 유래된 3 개의 상류 활성화 서열을 포함한다 (참조, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,955,646).
따라서 발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로, 전사 및 번역 개시 영역을 포함하는 발현 제어 요소, 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드 (또는 그의 조각 또는 변이체) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 종결 서열이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 종결 영역은 전사 개시 영역과 함께 선천일 수 있거나, 관심의 코딩 서열과 함께 선천일 수 있거나, 또다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역이 A. 투메파시엔스로부터의 Ti-플라스미드로부터 입수가능하고, 예컨대 옥토파인 신테타제 및 노팔린 신테타제 종결 영역이다. 참조, 또한 Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; 및 Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. 부가의 예시적 종결 서열은 완두콩 RubP 카르복실라제 소형 서브유닛 종결 서열 및 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 종결 서열이다.
일반적으로, 발현 카세트는 형질전환된 개구리밥 세포 또는 조직의 선별을 위한 선별가능 마커 유전자를 포함할 것이다. 선별가능 마커 유전자에는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT) 를 인코딩하는 유전자, 뿐만 아니라 제초제 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로 제초제에 비감수성인 개질된 표적 단백질, 또는 식물에서 제초제가 작용할 수 있기 전에 제초제를 분해하거나 그의 독성을 제거하는 효소를 코딩한다. 참조, DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et al.(1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. 예를 들어, 글라이포스페이트 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 내성은 돌연변이체 표적 효소, 5-에놀파이루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS) 를 코딩하는 유전자를 사용하여 수득된 바 있다. 글루포시네이트 암모늄, 보로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D) 에 대한 내성은, 각각의 제초제를 해독하는, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 니트릴라제, 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제를 인코딩하는 세균 유전자를 사용하여 수득된 바 있다.
본 발명의 목적을 위해, 선별가능 마커 유전자에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기를 인코딩하는 유전자가 포함된다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); 시아나미드 히드라타제 (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250); 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 (Perl et al. (1993) BioTechnology 11:715); 바 (bar) 유전자 (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367); 트립토판 데카르복실라제 (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제 (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); 아세토히드록시애시드 신타제 (Anderson et al. 의 미국 특허 번호 4,761,373; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-에놀파이루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제 (aroA; Comai et al. (1985) Nature 317:741); 할로아릴니트릴라제 (Stalker et al. 의 WO 87/04181); 아세틸-코엔자임 A 카르복실라제 (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); 디히드로프테로에이트 신타제 (sulI; Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); 및 32 kDa 광계 II 폴리펩티드 (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983).
하기에 대한 내성을 인코딩하는 유전자가 또한 포함된다: 젠타마이신 (예, aacC1, Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:202-208); 클로람페니콜 (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); 메토트렉세이트 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); 하이그로마이신 (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807); 스트렙토마이신(Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131); 블레오마이신 (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); 술포나미드 (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127); 브로목시닐 (Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811); 포스피노트리신 (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5:131).
바 유전자는 글루포시네이트-유형 제초제, 예컨대 포스피노트리신 (PPT) 또는 비알라포스 등에 대한 제초제 내성을 부여한다. 상기 언급된 바와 같이, 벡터 구축물 내에 사용될 수 있는 다른 선별가능 마커에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 또한 비알라포스 및 포스피노트리신 내성을 위한 pat 유전자, 이미다졸리논 내성을 위한 ALS 유전자, 하이그로마이신 내성을 위한 HPH 또는 HYG 유전자, 글리포세이트 내성을 위한 EPSP 신타제 유전자, Hc-독소에 대한 내성을 위한 Hm1 유전자, 및 일상적으로 사용되고 당업자에게 알려진 다른 선별 약제가 포함된다. 참조, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Biol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; 및 Gill et al. (1988) Nature 334:721. 상기 공개들은 본원에 참조로 포함된다.
선별가능 마커 유전자의 상기 목록은 제한하려는 것은 아니다. 임의의 선별가능 마커 유전자가 본 발명에 사용될 수 있다.
식물 숙주에서의 증강된 발현을 위한 뉴클레오티드 서열의 개질
항원성 인플루엔자 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체가 개구리밥에서 발현되는 경우, 인플루엔자 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서의 발현을 증강시키도록 개질될 수 있다. 하나의 그러한 개질은 식물-선호되는 코돈, 특히 개구리밥-선호되는 코돈을 사용하는 폴리뉴클레오티드의 합성이다. 식물-선호되는 코돈으로 뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법이 당업계에서 입수가능하다. 참조, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 5,380,831 및 5,436,391; EP 0 359 472; EP 0 385 962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; 및 Murray et al. (1989) Nucleic acids. Res. 17:477. 합성은 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 선호되는 코돈은 개구리밥에서 발현되는 단백질에서 가장 높은 빈도의 코돈으로부터 확인될 수 있다. 예를 들어, 렘나 미노르에 대한 코돈 사용의 빈도가 하기 표에서 제시된다.
Figure 112011049383980-pct00001
본 발명의 목적을 위해, "개구리밥-선호되는 코돈" 은 개구리밥에서의 코돈 사용의 빈도가 17% 초과인 코돈을 언급한다. 본원에서 사용되는 "렘나-선호되는 코돈" 은 렘나 속에서의 코돈 사용의 빈도가 17% 초과인 코돈을 언급한다. 본원에서 사용되는 "렘나 미노르-선호되는 코돈" 은 렘나 미노르에서의 코돈 사용의 빈도가 17% 초과인 코든을 언급하며, 이 경우 렘나 미노르에서의 코돈 사용의 빈도는 Codon Usage Database (GenBank Release 160.0 (June 15, 2007) 에서 수득된다.
관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 임의의 일부가 최적화되거나 합성일 수 있다고 또한 인식된다. 다시 말하면, 완전히 최적화된 또는 부분적으로 최적화된 서열이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 코돈이 개구리밥-선호되는 코돈일 수 있다. 하나의 구현예에서, 90 내지 96 % 의 코돈이 개구리밥-선호되는 코돈이다. 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열은, 렘나 깁바 (Lemna gibba) 에서 17% 이상 또는 렘나 미노르에서 17% 이상의 빈도로 사용되는 코돈을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 인플루엔자 폴리펩티드는 HA 폴리펩티드, 예를 들어, SEQ ID NO:2 로 제시되는 HA 폴리펩티드이고, 발현 카세트는 이 HA 폴리펩티드에 대한 최적화된 코딩 서열을 포함하고, 이 경우 코딩 서열은 개구리밥-선호되는 코돈, 예를 들어, 렘나 미노르-선호되는 또는 렘나 깁바-선호되는 코돈을 포함한다. 하나의 그러한 구현예에서, 발현 카세트는 SEQ ID NO:2 로 제시되는 HA 폴리펩티드를 인코딩하는 렘나 미노르-선호되는 코돈을 함유하는 SEQ ID NO:1 을 포함한다.
관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 개구리밥에서의 그의 발현을 증강시키는 다른 개질이 또한 가해질 수 있다. 이들 개질에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 거짓 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 서열, 엑손-인트론 스플라이스 자리 신호, 트랜스포손-유사 리피트, 및 유전자 발현에 해로울 수 있는 기타 그러한 잘 특성화된 서열의 제거가 포함된다. 서열의 G-C 함량은 개구리밥 식물에서 발현되는 알려진 유전자를 참조하여 계산되는, 개구리밥에 대한 평균 수준으로 조정될 수 있다. 가능한 경우, 관심의 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 예측되는 헤어핀 2 차 mRNA 구조를 회피하도록 개질될 수 있다.
동물 및 식물에서 번역 개시 코돈에 대한 최적의 번역 개시 정황 뉴클레오티드 서열 간에 알려진 차이가 존재한다. 본원에서 사용되는 "번역 개시 정황 뉴클레오티드 서열" 은 번역 개시 코돈의 바로 5' 의 3 개의 뉴클레오티드의 일치성을 언급한다. "번역 개시 코돈" 은 관심의 뉴클레오티드 서열로부터 전사된 mRNA 의 번역을 개시하는 코돈을 언급한다. 이들 번역 개시 정황 뉴클레오티드 서열의 조성은 번역 개시의 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 참조, 예를 들어, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98; 및 Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35:993-1001. 본 발명에서, 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 번역 개시 코돈에 대한 번역 개시 정황 뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서의 발현을 증강시키도록 개질될 수 있다. 하나의 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 번역 개시 코돈의 바로 상류의 3 개의 뉴클레오티드가 "ACC" 가 되도록 개질된다. 두번째 구현예에서, 이들 뉴클레오티드는 "ACA" 이다.
개구리밥에서 항원성 인플루엔자 폴리펩티드의 발현은 5' 리더 서열의 사용에 의해 또한 증강될 수 있다. 그러한 리더 서열은 번역을 증강시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 피코르나바이러스 리더, 예를 들어, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 영역; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126); 포타이바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각(etch) 바이러스; Allison et al. (1986) Virology 154:9); 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP; Macajak and Sarnow (1991) Nature 353:90); 알팔파 모자이크 바이러스의 외피 단백질 mRNA 로부터의 비번역 리더 (AMV RNA 4; Jobling and Gehrke (1987) Nature 325:622); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); 감자 식각 바이러스 리더 (Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen. Virol. 74:2717-2724); Fed-1 5' 비번역 영역 (Dickey (1992) EMBO J. 11:2311-2317); RbcS 5' 비번역 영역 (Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58); 및 옥수수 백화 반점 바이러스 리더 (MCMV; Lommel et al. (1991) Virology 81:382) 를 포함한다. 또한, 참조, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965. 옥수수 알코올 탈수소효소 1 (ADH1) 유전자, 아주까리씨 카탈라제 유전자, 또는 애기장대 (Arabidopsis) 트립토판 경로 유전자 PAT1 로부터의 인트론 서열을 비롯한, 식물 인트론 서열을 포함하는 리더 서열이 또한 식물에서 번역 효율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920).
본 발명의 일부 구현예에서, 옥수수 알코올 탈수소효소 1 유전자 (ADH1; GenBank 접근 번호 X04049) 의 뉴클레오티드 1222-1775 에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 관심의 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 삽입되어, 그의 번역의 효율성을 증강시킨다. 또다른 구현예에서, 발현 카세트는 렘나 깁바 리불로스-비스-포스페이트 카르복실라제 소형 서브유닛 5B 유전자로부터의 리더 (RbcS 리더; 참조, Buzby et al. (1990) Plant Cell 2:805-814) 를 함유한다.
임의의 단일 개질 또는 개질의 임의의 가능한 조합을 비롯한, 발현을 증강시키는 상기 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열 개질이 본 발명에 사용될 수 있다고 인식된다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 개구리밥에서의 "증강된 발현을 위해 개질된" 이라는 어구는 상기 개질 중 임의의 하나 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급한다.
신호 펩티드.
관심의 인플루엔자 폴리펩티드는 정상적으로 또는 유리하게는 분비 단백질로서 발현될 수 있다. 분비 단백질은 보통, 소포체 (ER) 막의 수용체 단백질과 상호작용하여 성장하는 폴리펩티드 사슬이 막을 통해 소포체 내로 전위되는 것을 안내하여 세포로부터 분비되게 하는 "신호 펩티드" 를 포함하는 전구체 폴리펩티드로부터 번역된다. 이 신호 펩티드는 종종 전구체 폴리펩티드로부터 절단되어, 신호 펩티드를 결여하는 "성숙" 폴리펩티드를 생성한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체는 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체가 배양 배지 내로 분비되는 것을 안내하는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 개구리밥에서 발현된다. 소포체로의 단백질 전위 (세포 외부로의 분비를 위해) 를 목표로 하는 식물 신호 펩티드가 당업계에 알려져 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,020,169. 본 발명에서, 발현된 폴리펩티드를 ER 로 표적화하는데 임의의 식물 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 염기성 엔도키티나제 신호 펩티드 (NCBI 단백질 접근 번호 BAA82823 의 아미노산 14-34), 익스텐신 신호 펩티드 (Stiefel et al. (1990) Plant Cell 2:785-793), 쌀 α-아밀라제 신호 펩티드 (NCBI 단백질 접근 번호 AAA33885 의 아미노산 1-31; 또한 참조, GenBank M24286) 이다. 또다른 구현예에서, 신호 펩티드는 분비된 개구리밥 단백질의 신호 펩티드에 해당한다.
대안적으로는, 재조합적으로 생산된 항원성 인플루엔자 폴리펩티드를 표적화하여 개구리밥으로부터 분비시키는데 포유류 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 식물 세포가 소포체를 표적화하는 포유류 신호 펩티드를 인지하고, 이들 신호 펩티드가 형질 막을 통해서 뿐만 아니라 식물 세포 벽을 통해서 폴리펩티드의 분비를 안내할 수 있음이 증명되었다. 참조, 미국 특허 번호 5,202,422 및 5,639,947.
하나의 구현예에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관심의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상기 개시된 임의의 개질 또는 개질의 조합을 이용하여 개구리밥에서의 증강된 발현을 위해 개질된다.
분비된 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 용매-용매 추출 등을 비롯한 당업계에 알려진 임의의 종래의 수단에 의해 배양 배지로부터 수집될 수 있다. 그렇게 함으로써, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체가 배양 배지로부터 수득될 수 있다.
형질전환된 개구리밥 식물 및 개구리밥 결절 (Nodule) 배양물.
본 발명은 관심의 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 발현하는 형질전환된 개구리밥 식물을 제공한다. 용어 "개구리밥" 은 렘나세애 (Lemnaceae) 과의 일원을 언급한다. 이 과는 현재 하기와 같이 5 개의 속 및 38 개의 종의 개구리밥으로 분류된다: 렘나 속 [L. 애퀴녹티알리스 (L. aequinoctialis), L. 디스페르마 (L. disperma), L. 에쿠아도리엔시스 (L. ecuadoriensis), L. 깁바 (L. gibba), L. 자포니카 (L. japonica), L. 미노르 (L. minor), L. 미니스쿨라 (L. miniscula), L. 옵스쿠라 (L. obscura), L. 페르푸실라 (L. perpusilla), L. 테네라 (L. tenera,), L. 트리술카 (L. trisulca), L. 투리오니페라 (L. turionifera), L. 발디비아나 (L. valdiviana)]; 스피로델라 (Spirodela) 속 [S. 인테르메디아 (S. intermedia), S. 폴리리자 (S. polyrrhiza,), S. 푼크타타 (S. punctata)]; 울피아 (Wolffia) 속 [Wa. 안구스타 (Wa. angusta), Wa. 아리자 (Wa. arrhiza), Wa. 아우스트랄리나 (Wa. australina), Wa. 보레알리스 (Wa. borealis), Wa. 브라실리엔시스 (Wa. brasiliensis), Wa. 콜룸비아나 (Wa. columbiana), Wa. 엘론가타 (Wa. elongata), Wa. 글로보사 (Wa. globosa), Wa. 미크로스코피카 (Wa. microscopica), Wa. 네글렉타 (Wa. neglecta)]; 울피엘라 (Wolfiella) 속 [Wl. 카우다타 (Wl. caudata), Wl. 덴티쿨라타 (Wl. denticulata), Wl. 글라디아타 (Wl. gladiata), Wl. 하이알리나 (Wl. hyalina), Wl. 링굴라타 (Wl. lingulata), Wl. 레푼다 (Wl. repunda), Wl. 로툰다 (Wl. rotunda), 및 Wl. 네오트로피카 (Wl. neotropica)] 및 란돌티아 (Landoltia) 속 [L. 푼크타카 (L. punctata)]. 렘나세애의 임의의 다른 속 또는 종이, 존재하는 경우, 또한 본 발명의 양상이다. 렘나 종은 Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae - A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich) 에 기술된 분류 방법을 사용하여 분류될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "식물" 에는 전체 식물, 식물 기관 (예, 엽상체 (frond) (잎), 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 및 이의 자손이 포함된다. 예를 들어, 관심의 폴리뉴클레오티드로 이전에 형질전환되어 적어도 부분적으로 트랜스제닉 세포로 이루어지는 트랜스제닉 식물 또는 그의 자손에서 유래하는 식물 세포, 식물 원형질체, 식물이 그로부터 재분화될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 조직, 식물 캘리 (calli), 배아 뿐만 아니라 꽃, 배주, 줄기, 열매, 잎, 뿌리, 근단, 결절 등을 포함하는, 트랜스제닉 식물의 일부가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 용어 "식물 세포" 에는 종자, 배아, 배주, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 엽상체, 뿌리, 결절, 싹, 꽃밥, 및 꽃가루의 세포가 포함된다.
본원에서 사용되는 "개구리밥 결절" 은 약 50% 이상, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 의 세포가 분화된 세포인 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 조직을 의미한다. 본원에서 사용되는 "분화된 세포" 는 미분화 세포 또는 다른 조직 유형에서 발견되는 세포와 구별되게 하는 하나 이상의 표현형 특징 (예, 독특한 세포 형태, 또는 마커 핵산 또는 단백질의 발현) 을 갖는 세포를 의미한다. 본원에서 개술된 개구리밥 결절 배양물의 분화된 세포는 인접 세포 벽에 융합된, 타일을 붙이듯 배열된 (tiled) 매끄러운 표면을 갖는 상호연결된 세포를 형성하고, 결절은 조직 전체에 걸쳐 분산된 엽상체 원기로 조직되기 시작한다. 결절 배양물의 조직의 표면은 플라스모데스마타를 통해 서로 연결된 표피 세포를 갖는다.
개구리밥의 성장 습성은 배양 방법에 이상적이다. 이 식물은 효모의 무성 번식과 유사한 거시적 방식으로 새로운 엽상체의 영양 (vegetative) 발아를 통해 빠르게 증식한다. 이 증식은 분열조직 세포로부터 영양 발아에 의해 일어난다. 분열조직 영역은 작고, 엽상체의 복측 표면에 존재한다. 분열조직 세포는 엽상체 주맥의 각 측면에 하나씩, 2 개의 주머니에 위치한다. 작은 주맥 영역은 또한 그로부터 뿌리가 유래하고 줄기가 생기는 자리로서, 각각의 엽상체를 그의 모 엽상체에 연결시킨다. 분열조직 주머니는 조직 판 (flap) 에 의해 보호된다. 엽상체는 이들 주머니로부터 교대로 발아한다. 배가 시간은 종마다 다르며, 20-24 시간으로 짧다 (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z.　Pflanzenphysiol. 62:316). 개구리밥의 집중 배양은 최고 속도의 단위 시간 당 바이오매스 축적 (Landolt and Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae - A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich)) 과, 생중량의 6-15% 범위의 건조 중량 축적을 초래한다 (Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, 미출판 자료). 다양한 조건 하에 생장한 다수의 개구리밥 종의 단백질 함량이 15-45% 건조 중량의 범위인 것으로 보고된 바 있다 (Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang and Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). 이들 값을 사용하면, 개구리밥에서 배지 1 리터 당 단백질 생산의 수준은 효모 유전자 발현 시스템과 동일한 자릿수이다.
본 발명의 형질전환된 개구리밥 식물은 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구축물을 관심의 개구리밥 식물에 도입함으로써 수득될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구축물과 관련하여, 용어 "도입" 은 개구리밥 식물에 폴리뉴클레오티드를 제시하여 폴리뉴클레오티드가 개구리밥 식물의 내부로 접근하는 것이 허용되도록 함을 의미한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 경우, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 구축물의 일부로서, 또는 별도의 뉴클레오티드 구축물로서 조립될 수 있고, 동일 또는 상이한 형질전환 벡터 상에 위치할 수 있다. 따라서, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 형질전환 사건으로, 별도의 형질전환 사건들로, 또는, 예를 들어, 번식 프로토콜의 일부로서, 관심의 개구리밥 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 폴리뉴클레오티드(들)이 개구리밥 식물의 하나 이상의 세포의 내부로 접근하는 것을 허용하지 않는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 개구리밥 식물에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 일시적 형질전환 방법, 안정적 형질전환 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함한다.
"일시적 형질전환" 은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서, 폴리뉴클레오티드가 개구리밥 식물에 도입되고 개구리밥 식물의 게놈에 통합되지 않는 것을 의미한다.
"안정적으로 도입하는" 또는 "안정적으로 도입되는" 은 개구리밥 식물로 도입되는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드) 와 관련하여, 도입되는 폴리뉴클레오티드가 개구리밥 게놈에 안정적으로 통합됨으로써, 개구리밥 식물이 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 형질전환되는 것을 의미한다.
"안정적 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환되는" 은 개구리밥 식물에 도입되는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물의 게놈에 통합되어 식물의 자손에 의해, 더욱 특히, 여러 연속적 세대의 자손에 의해 유전될 수 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, 연속적 세대는 영양적 (즉, 무성 생식) 으로, 예를 들어, 클론 증식으로 생성된 자존을 포함한다. 다른 구현예에서, 연속적 세대는 유성 생식을 통해 생성된 자손을 포함한다.
항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구축물은 당업자에게 알려진 임의의 형질전환 프로토콜을 사용하여 관심의 개구리밥 식물에 도입될 수 있다. 개구리밥 식물 또는 식물 세포 또는 결절에 뉴클레오티드 서열을 도입하는 적합한 방법에는 미세주입 (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), 전기천공 (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), 아그로벡테리움-매개 형질전환 (미국 특허 번호 5,563,055 및 5,981,840, 모두 본원에 참조로 포함됨), 직접적 유전자 전달 (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), 탄도 입자 가속 (ballistic particle acceleration) (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; 및 5,932,782 (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨); 및 Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926) 이 포함된다. 형질전환된 세포는 통상적인 방식에 따라 식물에서 성장할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 안정적으로 형질전환된 개구리밥은 당업계에 알려진 임의의 유전자 전달 방법, 예컨대 그 전문이 제시된 것과 같이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,040,498 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0115640, 2003/0033630 또는 2002/0088027 에 개시된 유전자 전달 방법 중 하나에 의해 수득될 수 있다. 개구리밥 식물 또는 결절 배양물은 아그로벡테리움-매개 유전자 전달, 탄도 충격 (ballistic bombardment) 또는 전기천공을 비롯한 다수의 방법 중 임의의 하나에 의해, 본원에서 기술된 바와 같은 핵산 서열을 함유하는 발현 카세트로 효율적으로 형질전환될 수 있다. 사용되는 아그로벡테리움은 아그로벡테리움 투메파시엔스 또는 아그로벡테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) 일 수 있다. 안정적 개구리밥 형질전환체는 관심의 핵산 서열 및, 선별 약제에 대한 내성을 부여하는 유전자 모두로 개구리밥 세포의 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포를 선별 액제를 함유하는 배지에서 배양함으로써 단리될 수 있다. 참조, 예를 들어, 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,040,498.
이들 방법에 이용되는 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물은 정상적 형태를 나타내고, 유성 생식에 의해 번식되고/거나, 예를 들어, 클론 증식에 의해, 영양 번식 (즉, 무성 생식) 할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 형질전환된 개구리밥 식물은 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달된 핵산의 단일 카피를 함유하고, 전달된 핵산은 그안에서 현저한 재배열을 갖지 않는다. 본 발명의 형질전환된 개구리밥 식물은 전달된 핵산을 적은 카피 수로 함유할 수 있다고 인식된다 (즉, 형질전환된 세포 1 개 당 12 카피 이하, 8 카피 이하, 5 카피 이하, 대안적으로는, 3 카피 이하, 추가의 대안으로서, 3 카피 미만의 핵산).
항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 발현하는 형질전환된 식물은 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체를 발현하기에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 그 후, 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체는 개구리밥 식물, 배양 배지, 또는 개구리밥 식물 및 배양 배지로부터 수집될 수 있고, 원하는 경우, 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 용매-용매 추출 등을 비롯한 임의의 종래의 단리 및 정제 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 그 후, 항원성 인플루엔자 폴리펩티드, 또는 그의 조각 또는 변이체는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 치료적 적용을 위한 백신으로서 제형화될 수 있다.
조류 인플루엔자 폴리펩티드의 제조 방법
본원에서 상세히 기술된 바와 같이, 하나의 구현예에서, 항원성 조류 인플루엔자 폴리펩티드의 생산 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 개구리밥 배양 배지에서 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물을 배양하는 단계로서, 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물이 안정적으로 형질전환되어 항원성 폴리펩티드를 발현하고, 항원성 폴리펩티드가 상기 항원성 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 및 항원성 폴리펩티드의 배양 배지로의 분비를 안내하는 신호 펩티드에 대한 작동적으로 연결된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 단계; 및 (b) 항원성 폴리펩티드를 상기 배양 배지로부터 수집하는 단계. 용어 "수집" 은, 이에 제한되는 것은 아니나, 배양 배지로부터 수확하거나 정제하는 것을 포함한다.
개구리밥에서 재조합 폴리펩티드의 생산 후, 당업계에서 입수가능한 임의의 방법이 단백질 정제에 사용될 수 있다. 다양한 단계가 단백질을 비단백질 또는 식물 물질로부터 유리시킨 후, 관심의 단백질을 다른 단백질로부터 정제하는 것을 포함한다. 정제 과정의 초기 단계는 원심분리, 여과 또는 그의 조합을 포함한다. 조직의 세포외 공간에 분비된 단백질은 진공 도는 원심분리 추출을 사용하여 수득될 수 있다. 최소 공정은 또한 미가공 생성물의 제조를 포함할 수 있다. 다른 방법은 추출물의 직접적 사용을 허용하기 위해 침연 (maceration) 및 추출을 포함한다.
관심의 단백질을 정제하는 상기 방법들은 단백질 크기, 생리화학적 특성, 및 결합 친화성을 이용할 수 있다. 상기 방법에는 크로마토그래피, 예컨대 프로카인아미드 친화성, 크기 배제, 고압 액체, 역상, 및 음이온 교환 크로마토그래피, 친화성 태그, 여과, 등이 포함된다. 특히, 고정 Ni-이온 친화성 크로마토그래피가 발현된 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 참조, Favacho et al. (2006) Protein expression and purification 46:196-203. 또한, 참조, Zhou et al. (2007) The Protein J 26:29-37; Wang et al. (2006) Vaccine 15:2176-2185; 및 WO/2009/076778; 이들 모두 본원에 참조로 포함됨. 보호제, 예컨대 오스모티카, 항산화제, 페놀 산화 억제제, 프로테아제 억제제 등이 정제 과정에 사용될 수 있다.
이용 방법
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 동물에게 유효량의 재조합 조류 인플루엔자 항원 및 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 유효량의 백신을 투여하는 것을 포함하는 동물을 예방접종하는 방법에 관한 것이다.
상기 백신 또는 조성물은 재조합 인플루엔자 폴리펩티드를 포함한다. 재조합 폴리펩티드는 개구리밥 식물에서 생산될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 당화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 발현된 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 백신을 조류에게 투여하여, 면역 반응이 유발되는 것을 포함하는 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 조류에게 개구리밥으로부터의 식물 물질 및 개구리밥에서 생산된 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 백신을 투여하여, 면역 반응이 유발되는 것을 포함하는 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 하기 단계를 포함하는, 안정적으로 형질전환된 식물 또는, 렘나 속으로부터 선별된 식물 배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다: (a) 식물에게 조류 인플루엔자 항원 유전자를 포함하는 유적적 구축물을 도입하는 단계; 및 (b) 식물을 배양하는 단계. 개구리밥의 형질전환 방법은 당업계에서 입수가능하고 본원에 제시되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 렘나 발현 시스템에 의해 생산된 조류 인플루엔자 항원을 단리하고, 임의로 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클과 조합하는 것을 포함하는, 백신 또는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 렘나 속으로부터의 식물 물질 및 렘나 발현 시스템에 의해 생산된 조류 인플루엔자 항원 및 임의로 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 조합하는 것을 포함하는 백신 또는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 백신 또는 조성물은 1 일령 이상의 닭에게 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 공통의 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 1 차 투여 및 하나 이상의 부스터 투여로 이루어지는 프라임-부스트 요법이 이용될 수 있다. 전형적으로는 1 차 투여에 사용되는 면역적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것과 성질이 상이하다. 그러나, 1 차 투여 및 부스트에서 동일한 조성물이 사용될 수 있음에 유의한다. 이러한 투여 프로토콜은 "프라임-부스트" 로 언급된다.
본 발명에서 재조합 바이러스성 벡터가 항원성 인플루엔자 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체를 인코딩하는 인플루엔자 코딩 서열 또는 그의 조각을 발현하는데 사용된다. 구체적으로는, 바이러스성 벡터는 조류 인플루엔자 서열, 더욱 구체적으로는 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 HA 유전자 또는 그의 조각을 발현할 수 있다. 본원에서 고려되는 바이러스성 벡터에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폭스바이러스 [예를 들어, 박시나 바이러스 또는 약독화된 박시나 바이러스, 조류폭스 바이러스 또는 약독화된 조류폭스 바이러스 (예, 카나리폭스 (canarypox), 파울폭스 (fowlpox), 도브폭스 (dovepox), 구두 (pigeonpox), 퀘일폭스 (quailpox), ALVAC, TROVAC; 참조, 예를 들어, US 5,505,941, US 5,494,8070), 라쿤폭스 (raccoonpox) 바이러스, 돈두 바이러스, 등], 아데노바이러스 (예, 인간 아데노바이러스, 개 아데노바이러스), 헤르페스바이러스 (예를 들어, 개 헤르페스바이러스, 칠면조의 헤르페스바이러스, 마렉병 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 고양이 헤르페스바이러스, 소 헤르페스바이러스, 돼지 헤르페스바이러스), 바큘로바이러스, 레트로바이러스 등이 포함된다. 또다른 구현예에서, 조류폭스 발현 벡터는 카나리폭스 벡터, 예컨대, ALVAC 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 조류폭스 발현 벡터는 파울폭스 벡터, 예컨대, TROVAC 일 수 있다. 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원은 헤마글루티닌, 예컨대 H5 일 수 있다. 파울폭스 벡터는 vFP89 또는 vFP2211 일 수 있다. 카나리폭스 벡터는 vCP2241 일 수 있다 (참조, US 2008/0107681 및 US 2008/0107687). 본 발명의 발현된 조류 인플루엔자 항원은 특이적 폭스바이러스 프로모터, 특히, 예를 들어, 박시나 프로모터 7.5 kDa (Cochran et al., 1985), 박시나 프로모터 I3L (Riviere et al., 1992), 박시나 프로모터 HA (Shida, 1986), 우두 (cowpox) 프로모터 ATI (Funahashi et al., 1988), 박시나 프로모터 H6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989) 의 통제 하에 삽입된다.
본 발명의 프라임-부스트 프로토콜 또는 요법의 또다른 양상에서, 본 발명의 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물이 투여된 후 조류 인플루엔자 항원 및/또는 그의 변이체 또는 조각을 함유하고 생체내에서 발현하는 재조합 바이러스성 벡터가 투여된다. 마찬가지로, 프라임-부스트 프로토콜은 재조합 바이러스성 벡터의 투여 후, 본 발명의 재조합 조류 인플루엔자 항원의 투여를 포함할 수 있다. 1 차 및 2 차 투여가 모두 본 발명의 재조합 조류 인플루엔자 항원을 포함할 수 있다는 점에 또한 유의한다. 따라서, 본 발명의 재조합 조류 인플루엔자 항원은 바이러스성 벡터와 함께 임의의 순서로 투여될 수 있거나, 대안적으로는 단독으로 1 차 및 2 차 조성물 모두로서 사용될 수 있다.
본 발명의 프라임-부스트 프로토콜의 또다른 양상에서, 본 발명의 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물이 투여된 후, 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스성 조성물 또는 백신이 투여된다. 마찬가지로, 프라임-부스트 프로토콜은 비활성화된 바이러스성 조성물 또는 백신의 투여 후, 본 발명의 재조합 조류 인플루엔자 항원의 투여를 포함할 수 있다. 1 차 및 2 차 투여가 모두 본 발명의 재조합 항원성 폴리펩티드를 포함할 수 있다는 점에 또한 유의한다. 본 발명의 항원성 폴리펩티드는 비활성화된 바이러스성 조성물 또는 백신과 함께 임의의 순서로 투여될 수 있거나, 대안적으로는 단독으로 1 차 및 2 차 조성물 모두로서 사용될 수 있다.
프라임-부스트 요법은 하나 이상의 공통의 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체 또는 조각을 사용하는 하나 이상의 프라임-투여 및 하나 이상의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용되는 백신은 그 후의 부스터 백신으로서 사용되는 것과 성질이 상이할 수 있다. 프라임-투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게는, 부스트 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
포유류인 표적 종에 대한 조성물의 투여 부피, 예를 들어 바이러스성 벡터에 기초한 조류 조성물, 예를 들어, 비-폭스바이러스-바이러스성-벡터-기재 조성물의 투여 부피는 일반적으로는 약 0.1 내지 약 2.0 ㎖, 약 0.1 내지 약 1.0 ㎖, 및 약 0.5 ㎖ 내지 약 1.0 ㎖ 이다.
조류와 같은 동물을 인플루엔자, 유리하게는 H5N1, H5N2, H5N8 또는 H5N9 균주와 같은 H5 서브유형에 속하는 인플루엔자의 병독성 균주로 공격함에 의한 마지막 면역화 후 약 2 내지 4 주째에 백신의 효능이 시험될 수 있다. 백신의 효능을 시험하기 위한 공격에 동종 및 이종 균주가 모두 사용된다. 동물은 분무, 비강내, 안구내, 기관내, 및/또는 경구로 공격될 수 있다. 공격 바이러스는 부피가 투여 경로에 따라 약 105-8 EID50 일 수 있다. 예를 들어, 투여가 분무에 의하는 경우, 바이러스 현탁액이 에어로졸화되어 약 1 내지 100 ㎛ 의 액적을 생성하고, 투여가 비강내, 기관내 또는 경구인 경우, 공격 바이러스의 부피는 각각 약 0.5 ㎖, 1-2 ㎖, 및 5-10 ㎖ 이다. 동물은 공격 후 14 일 동안 매일 임상 징후, 예를 들어, 탈수증 및 생기없는 항문 (pasty vent) 에 대해 관찰될 수 있다. 또한, 동물의 군이 안락사되고, 폐 및 흉막 출혈, 기관염, 기관지염, 세기관지염, 및 기관지폐렴의 병리학적 소견에 대해 평가될 수 있다. 바이러스 단리를 위해 공격 후 모든 동물로부터 구인두 면봉채취물 (swab) 이 수집될 수 있다. 호흡 조직 내 바이러스성 항원의 존재 또는 부존재는 정량적 실시간 역 전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (qRRT-PCR) 에 의해 평가될 수 있다. 혈액 샘플이 공격 전 및 공격 후에 수집될 수 있고, 항-인플루엔자 H5N1 바이러스-특이적 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다.
프라임-부스트 프로토콜에 사용되는 본 발명의 재조합 항원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 제약적으로 또는 수의적 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제 내에 함유된다. 본 발명의 프로토콜은 동물을 조류 인플루엔자로부터 보호하고/거나 감염된 동물에서 질환 진행을 방지한다.
다양한 투여가 바람직하게는 1 내지 6 주 간격으로 수행된다. 하나의 구현예에 따르면, 1 년 주기 (annual) 부스터가 또한 고려된다. 동물은 첫번째 투여시 1 일령 이상이다.
본 개시는 예로서 제공되고 본 발명이 이에 제한되지 않음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 개시 및 당업계의 지식으로부터, 당업자는 각각의 주입 프로토콜에 사용되는 투여의 횟수, 투여 경로, 및 투여량을 임의의 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 제조된 치료적 조성물의 효율적 양을 동물에게 1 회 이상 투여하는 것을 고려한다. 동물은 수컷, 암컷, 임신한 암컷 및 신생아일 수 있다. 이러한 투여는 이에 제한되는 것은 아니나, 근육내 (IM), 피내 (ID) 또는 피하 (SC) 주입을 비롯한 다양한 경로를 통하거나, 비강내 또는 경구 투여를 통할 수 있다. 본 발명에 따른 치료적 조성물은 또한 무바늘 장치 (예컨대, 예를 들어 Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, USA), Vetjet 또는 Vitajet 장치 (Bioject, Oregon, USA)) 에 의해 투여될 수 있다. 플라스미드 조성물의 투여에 대한 또다른 접근은 전기천공을 사용한다 (참조, 예를 들어 Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT 출원 번호 WO99/01158). 또다른 구현예에서, 치료적 조성물은 동물에게 유전자 총 또는 금 입자 충격에 의해 전달된다. 유리한 구현예에서, 동물은 조류이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 표적 세포에서 인플루엔자 항원 또는 에피토프의 전달 및 발현을 위한 치료 유효량의 제형물의 투여를 제공한다. 치료 유효량의 결정은 당업자에게 일상적 실험작업이다. 하나의 구현예에서, 제형물은 인플루엔자 항원 또는 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드 및 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 구현예에서, 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제는 트랜스펙션 또는 감염을 촉진시키고/거나 숙주에서 벡터 또는 단백질의 보존을 향상시킨다.
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 예방접종 요법 및 감염된 동물 및 예방접종된 동물 간의 구별 (DIVA) 을 위한 탐지 방법을 제공한다.
현재, 2 가지 유형의 조류 인플루엔자 백신, 즉 비활성화된 전체 AI 바이러스 (AIV) 백신 및 파울폭스 및 뉴캣슬병 바이러스에 기초한 생 재조합 백신이 존재하며, 이 경우 헤마글루티닌 (HA) 이 보호적 면역을 생성하기 위한 1 차 표적인 것으로 밝혀졌다 [Peyre, et al., Epidemiol Infect, 2009. 137(1): p. 1-21.; Bublot, et al., Ann N Y Acad Sci, 2006. 1081: p. 193-201; Skehel, et al., Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 531-69]. 종래의 비활성화된 백신은 AIV 를 부화란에서 또는 세포 배양물에서 성장시키는 것을 요하는데, 이는 환경 및 사람들에게 영향을 미칠 잠재적 위험이 있는 고함유 시설 (highly contained facility) 을 필요로 한다. 또한, 비활성화된 백신의 사용에 적합성인 시판되는 DIVA 시험이 현재 존재하지 않는다 [Bublot, et al., 2006; El Sahly, et al., Expert Rev Vaccines, 2008. 7(2): p. 241-7; Veits, et al., Vaccine, 2008. 26(13): p. 1688-96]. 감염된 동물과 예방접종된 동물의 구별" (DIVA) 을 허용하는 전략은, 특히 개발 도상국에서 새의 대량 살처분 및 이에 따른 경제적 손실을 수반하지 않는 AI 의 궁극적 박멸을 위한 가능한 해결로서 제안되었다 (Food and Agriculture Organization of the United (FAO) (2004). FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza. Animal health special report). 이러한 전략은 살처분방식을 비롯한 다른 통제 조치의 실행을 여전히 허용하는 감염된 무리를 식별하는 능력으로 예방접종의 유익을 갖는다 (환경 내 더 적은 바이러스). 무리 수준에서, 단순한 접근은 각각의 에방접종된 무리에서 예방접종되지 않은 감시 (sentinel) 새를 정기적으로 모니터링하는 것이나, 이는 특히 큰 무리에서 감시체를 식별함에 있어서, 일부 관리 문제를 야기할 수 있다. 대안으로서, 예방접종된 새에 대해 필드 노출에 대한 시험이 수행될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 예방접종된 집단에서 필드 노출의 탐지를 가능하게 하는 예방접종 시스템이 사용될 것이다. 필드 바이러스와 동일한 H 서브유형의 그러나 상이한 N 의 바이러스를 함유하는 백신의 사용을 비롯한 몇몇 시스템이 근래에 개발되었다. 필드 바이러스의 N 에 대한 항체는 감염의 자연 마커로서 작용하나, 상이한 N 항원을 갖는 필드 바이러스가 현존하는 필드 바이러스에 출현하는 경우 또는 상이한 N 항원을 갖는 서브유형이 이미 필드에서 순환하고 있는 경우에 문제가 생길 것이다. 대안적으로는 오직 HA 만을 함유하는 백신의 사용이 고전적인 AGID 및 NP- 또는 매트릭스-기재 ELISA 가 예방접종된 새에서 감염을 탐지하는데 사용되는 것을 허용할 것이다.
본 발명의 백신 또는 조성물의 사용이 HA 이외의 인플루엔자 단백질에 대한 항체 반응을 탐지하는 것을 목표로 하는 이용가능한 진단 시험 예컨대 아가 겔 면역확산 또는 NP-기재 ELISA 를 사용하여 예방접종된 동물에서 인플루엔자 감염의 탐지를 허용함이 본원에서 개시된다. 본 발명의 백신 또는 조성물의 사용이 감염된 동물과 예방접종된 동물을 구별 (DIVA) 함으로써 동물에서 감염의 탐지를 허용함이 본원에서 개시된다. NP-기재 면역원성 탐지 방법, 예컨대, NP-기재 ELISA 를 사용하여 동물에서 인플루엔자의 감염을 진단하는 방법이 본원에서 개시된다. 하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 하기 단계를 포함하는 동물에서 인플루엔자 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다: a) 핵단백질 (NP) 을 포함하는 고체 기질을 동물로부터 수득된 샘플과 접촉시키는 단계; b) 고체 기질을 NP 에 대한 모노클로날 항체 (MAb) 와 접촉시키는 단계; 및 c) 고체 기질 상의 NP 에 의해 포획된 샘플에 대한 MAb 의 결합을 탐지하는 단계, 이 경우 음성 대조군에 대한 시험 샘플의 백분율 억제가 대상이 인플루엔자에 감염되었음을 나타냄으로써, 대상에서 인플루엔자 감염을 진단함.
제조의 물품
하나의 구현예에서, 본원에서 개시되는 주제는 재조합 인플루엔자 면역적 조성물 또는 백신, 또는 비활성화된 인플루엔자 면역적 조성물 또는 백신, 재조합 인플루엔자 바이러스성 조성물 또는 백신 중 임의의 하나, 및 그 방법을 실시하기 위한 지침을 포함할 수 있는 면역 반응을 유발 또는 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 재조합 인플루엔자 바이러스성 면역적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발하기에 유효한 양으로 전달하는 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는, 인플루엔자에 대한 면역적 또는 보호적 반응을 동물에서 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 비활성화된 인플루엔자 면역적 조성물 또는 백신, 및 면역 반응을 동물에서 유발하기에 유효한 양으로 전달하는 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는, 인플루엔자에 대한 면역적 또는 보호적 반응을 동물에서 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 또다른 양상은 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 프라임-부스트 예방접종을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 적어도 하기 2 개의 바이알을 포함할 수 있다: 본 발명에 따른 프라임-예방접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 본 발명에 따른 부스트-예방접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 2 바이알. 키트는 유리하게는 부가적 프라임-예방접종 또는 부가적 부스트-예방접종을 위한 부가적 제 1 또는 제 2 바이알을 함유할 수 있다.
하기 구현예가 본 발명에 포함된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 조성물이 개시된다. 또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 조류 인플루엔자 항원의 15 개 이상의 아미노산을 포함하는 면역원성 조각을 포함하는 상기 기술된 조성물이 개시된다. 또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 개구리밥에서 생산되는 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 부분적으로 정제되어 있는 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 실질적으로 정제되어 있는 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 조류 H5N1 폴리펩티드인 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, H5N1 폴리펩티드가 헤마글루티닌 폴리펩티드인 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각 또는 변이체가 SEQ ID NO:2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 에서 제시된 서열과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원이 SEQ ID NO: 1, 3, 6, 7, 9, 11, 또는 13 에서 제시된 서열과 70% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩 되는 상기 조성물이 개시된다. 하나의 구현예에서, 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클이 유중수 에멀전 또는 수중유중수 또는 수중유 에멀전인 상기 조성물이 개시된다. 또다른 구현예에서, 상기 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 조류 인플루엔자에 감수성인 동물의 예방접종 방법이 개시된다. 하나의 구현예에서, 프라임-부스트 요법을 포함하는 조류 인플루엔자에 감수성인 동물의 예방접종 방법이 개시된다. 하나의 구현예에서, 개구리밥에서 발현되는 실질적으로 정제된 항원성 폴리펩티드로서, SEQ ID NO: 2, 4, 5, 10, 12 또는 14 에서 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 개시된다. 임의의 구현예에서 동물은 바람직하게는 조류, 말류, 개류, 고양이류 또는 돼지류이다. 하나의 구현예에서, 인플루엔자 감염을 동물에서 진단하는 방법이 개시된다. 또다른 구현예에서, 적어도 2 개의 바이알, 즉, 본 발명의 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 비활성화된 바이러스성 조성물을 포함하는 조성물 또는 재조합 라이벌 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 부스트-예방접종을 위한 조성물을 함유하는 제 2 바이알을 포함하는 프라임-부스트 예방접종을 위한 키트가 개시된다.
제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제가 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl (예, 식염) 용액 또는 포스페이트 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 본 발명의 벡터로부터 시험관내 발현되는 단백질) 의 투여를 촉진하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고; 유리하게는, 담체, 비히클 또는 부형제는 트랜스펙션을 촉진할 수 있고/거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 향상시킬 수 있다. 투여량 및 투여 부피는 본원의 일반적 기술에서 논의되어 있고, 당업자가 당업계의 지식과 함께 본 개시를 읽음으로써 임의의 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
유리하게는 그러나 배타적이지는 않게 플라스미드에 적합한 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질은 유리하게는 하기 화학식을 갖는 것이다:
Figure 112011049383980-pct00002
(식 중, R1 은 탄소수가 12 내지 18 인 포화 또는 불포화 직쇄 지방족 라디칼이고, R2 는 탄소수가 2 또는 3 인 또다른 지방족 라디칼이고, X 는 아민 또는 히드록실기, 예를 들어 DMRIE 임). 또다른 구현예에서 양이온성 지질은 중성 지질, 예를 들어 DOPE 와 연합될 수 있다.
이들 양이온성 지질 중에서, 유리하게는 중성 지질, 유리하게는 DOPE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr, 1994) 와 연합되어, DMRIE-DOPE 를 형성하는 DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109) 이 바람직하다.
유리하게는, 아주반트가 있는 플라스미드 혼합물이 임시로, 유리하게는 제제의 투여와 동시에 또는 제제의 투여 조금 전에 형성된다; 예를 들어, 투여 조금 전 또는 투여에 앞서, 플라스미드-아주반트 혼합물이 형성되어, 유리하게는 투여에 앞서 혼합물이 복합체를 형성하기에 충분한 시간, 예를 들어 투여에 앞서 약 10 내지 약 60 분, 예컨대 투여에 앞서 대략 30 분을 제공한다.
DOPE 가 존재하는 경우, DMRIE:DOPE 몰비는 유리하게는 약 95: 약 5 내지 약 5: 약 95, 더욱 유리하게는 약 1: 약 1, 예를 들어, 1:1 이다.
DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 아주반트:플라스미드 중량비는 약 50: 약 1 내지 약 1: 약 10, 예컨대 약 10: 약 1 내지 약 1:약 5, 및 약 1: 약 1 내지 약 1: 약 2, 예를 들어, 1:1 내지 1:2 일 수 있다.
제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀전일 수 있다. 적합한 유중수 에멀전의 예에는 4 ℃ 에서 유체이며 안정적인 하기를 함유하는 오일-기재 유중수 백신 에멀전이 포함된다: 6 내지 50 v/v %, 바람직하게는 12 내지 25 v/v % 의 항원-함유 수성 상, 전체적으로 또는 부분적으로 비-대사가능 오일 (예, 광물 오일 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사가능 오일 (예, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알코올 에스테르) 을 함유하는 50 내지 94 v/v % 의 오일 상, 0.2 내지 20 p/v %, 바람직하게는 3 내지 8 p/v % 의 계면활성제, 후자는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 혼합물로 폴리글리세롤 에스테르이고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게는 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그밖의 수소첨가된 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다. 유중수 에멀전에 사용될 수 있는 계면활성제의 예에는 에톡실화된 소르비탄 에스테르 (예, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80®, AppliChem, Inc., Cheshire, CT 에서 입수가능) 및 소르비탄 에스테르 (예, 소르비탄 모노올레에이트 (Span 80®), Sigma Aldrich, St. Louis, MO 에서 입수가능) 가 포함된다. 또한, 유중수 에멀전과 관련하여, 또한 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,919,084, 예를 들어, 이의 실시예 8 참조. 일부 구현예에서, 항원-함유 수성 상은 하나 이상의 완충제를 포함하는 식염수를 포함한다. 적합한 완충액의 예는 포스페이트 완충 식염수이다. 유리한 구현예에서, 유중수 에멀전은 수/유/수 (W/O/W) 3중 에멀전 (미국 특허 번호 6,358,500) 일 수 있다. 다른 적합한 에멀전의 예가 미국 특허 번호 7,371,395 에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 면역적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아주반트를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에서의 사용에 적합한 아주반트는 하기이다: (1) 알케닐 유도체 중합체, 말레산 무수물, 및 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀전, 예컨대 M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 에 의해 출판된 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 의 페이지 147 에 기술되어 있는 SPT 에멀전, 및 동일한 문헌의 페이지 183 에 기술되어 있는 에멀전 MF59, (4) 4차 암모늄 염, 예를 들어, DDA 를 함유하는 양이온 지질 (5) 사이토카인, (6) 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 참조로 포함되고 임의의 언급된 문헌에서 논의된 다른 아주반트, 또는 (9) 그의 임의의 조합 또는 혼합물.
바이러스성 벡터에 특히 적당한 수중유 에멀전 (3) 은 하기에 기초할 수 있다: 경 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 유형), 이소프레노이드 오일 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, 알켄, 예를 들어 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성되는 오일, 직쇄 알킬기를 갖는 알코올 또는 산의 에스테르, 예컨대 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜, 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세롤 트리(카프릴레이트/카프레이트) 및 프로필렌 디올레에이트, 또는 분지형 지방 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르.
오일은 유화제와 조합되어 사용되어 에멀전을 형성한다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 한편으로는 소르비탄, 만니드 (예를 들어, 안히드로만니톨 올레에이트), 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 다른 한편으로는 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르일 수 있고, 상기 에스테르는 임의로 에톡실화되거나, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 플루로닉, 예를 들어, L121 이다.
유형 (1) 아주반트 중합체 중에서, 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르에 의해 교차결합된, 교차결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체가 바람직하다. 이들 화합물은 카르보머라는 이름으로 알려져 있다 (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). 당업자는 또한 미국 특허 번호 2,909,462 를 참조할 수 있고, 이는 3 개 이상의 히드록실기의 수소 원자가 탄소수가 2 이상인 불포화 지방족 라디칼에 의해 대체된, 3 개 이상의, 바람직하게는 8 개 미만의 히드록실기를 갖는 폴리히드록시 화합물에 의해 교차연결된 상기 아크릴 중합체를 제공한다. 바람직한 라디칼은 탄소수가 2 내지 4 인 라디칼, 예를 들어 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌성 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 또한 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. 카르보폴 (BF Goodrich, Ohio, USA) 이라는 이름으로 판매되는 제품이 특히 적합한다. 그들은 알릴 사카로스 또는 알릴 펜타에리트리톨에 의해 교차결합될 수 있다. 그중에서도, 카르보폴 974P, 934P 및 971P 가 언급될 수 있다.
말레산 무수물-알케닐 유도체 공중합체에 대하여, EMA (Monsanto) 가 바람직한데, 이는 직쇄 또는 교차결합된 에틸렌-말레산 무수물 공중합체이고, 예를 들어 디비닐 에테르에 의해 교차결합된다. 또한 J. Fields et al., 1960 을 참조한다.
구조에 관하여, 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및 EMA 는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 기본 단위에 의해 형성된다:
Figure 112011049383980-pct00003
(식 중,
- R1 및 R2 는 동일 또는 상이할 수 있고, H 또는 CH3 을 나타내고,
- x = 0 또는 1 이고, 바람직하게는 x = 1 이고,
- y = 1 또는 2 이고, x + y = 2 임).
EMA 의 경우, x = 0 및 y = 2 이고, 카르보머의 경우 x = y = 1 이다.
이들 중합체는 물 또는 생리식염수 (20 g/ℓ NaCl) 에 용해되고, pH 는 7.3 내지 7.4 로, 예를 들어, 소다 (NaOH) 에 의해 조정되어, 발현 벡터(들) 이 포함될 수 있는 아주반트 용액을 제공할 수 있다. 최종 면역적 또는 백신 조성물 중 중합체 농도는 약 0.01 내지 약 1.5% w/v, 약 0.05 내지 약 1% w/v, 및 약 0.1 내지 약 0.4% w/v 범위일 수 있다.
사이토카인 또는 사이토카인들 (5) 은 면역적 또는 백신 조성물 중 단백질 형태일 수 있고, 또는 숙주에서 면역원 또는 면역원들 또는 그의 에피토프(들)과 함께 공동발현될 수 있다. 면역원 또는 면역원들 또는 그의 에피토프(들)을 발현하는 벡터와 동일한 벡터에 의한, 또는 그와 별도의 벡터에 의한 사이토카인 또는 사이토카인들의 공동발현이 바람직하다.
본 발명은 예를 들어, 활성 성분을 유리하게는 아주반트, 담체, 사이토카인, 및/또는 희석제로 및 그와 함께 혼합함으로써, 그러한 조합 조성물을 제조하는 것을 이해한다.
본 발명에 사용될 수 있는 사이토카인에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 α(IFNα), 인터페론 β (IFNβ), 인터페론 γ (IFNγ), 인터루킨-1α(IL-1α), 인터루킨-1β (IL-1β), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-8 (IL-8), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-11 (IL-11), 인터루킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 종양 괴사 인자 β (TNFβ), 및 전환 성장 인자 β (TGFβ) 가 포함된다. 사이토카인은 본 발명의 면역적 또는 백신 조성물과 공동투여되고/거나 순차적으로 투여될 수 있다고 이해된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 백신은 또한 적합한 사이토카인, 예를 들어, 예방접종될 또는 면역적 반응이 유발될 숙주에 부합하는 사이토카인 (예를 들어, 조류에 투여될 제제에 대한 조류 사이토카인) 을 생체내에서 발현하는 외인성 핵산 분자를 함유할 수 있다.
적합한 에멀전 또는 아주반트의 예는, 예를 들어, US 6,235,282; US 6,224,882; US7,371,395; US 2006/0233831; US 2005/0238660; US 2006/0233831 (모두 Merial 의 특허 및 특허 출원임) 에 또한 기술되어 있다.
본 발명에 따른 면역적 조성물 및/또는 백신은 본원에서 논의되는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 폴리펩티드를 치료적 반응을 유발하기에 유효한 양으로 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지고; 유효량은 본원에 포함된 문헌을 비롯한 본 개시 및 당업계의 지식으로부터 과도한 실험 없이 결정될 수 있다.
플라스미드 벡터에 기초한 면역적 조성물 및/또는 백신의 경우, 하나의 투여물은 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 플라스미드를 일반적으로 약 1 ㎍ 내지 약 2000 ㎍, 유리하게는 약 50 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 더욱 유리하게는 약 100 ㎍ 내지 약 800 ㎍ 으로 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 플라스미드 벡터에 기초한 면역적 조성물 및/또는 백신이 전기천공으로 투여되는 경우, 플라스미드의 투여량은 일반적으로는 약 0.1 ㎍ 내지 1 ㎎, 유리하게는 약 1 ㎍ 내지 100 ㎍, 유리하게는 약 2 ㎍ 내지 50 ㎍ 이다. 투여 부피는 약 0.1 내지 약 2 ㎖, 유리하게는 약 0.2 내지 약 1 ㎖ 일 수 있다.
유리하게는, 항원이 헤마글루티닌인 경우, 투여량은 적혈구응집 단위 (HAU) 또는 ㎍ HA 로 측정된다. 유리한 구현예에서, 투여량은 약 655 적혈구응집 단위 (HAU), 0.2 ㎍ HA/투여, 약 6550 HAU, 2.3 ㎍ HA/투여 또는 약 65,500 HAU/투여일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 약 26,200 HAU, 9.2 ㎍ HA/투여 이다. 부피는 1일령 닭의 경우 약 0.1 ㎖ 내지 약 1.0 ㎖, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 ㎖, 더 나이가 많은 닭의 경우 0.3 내지 0.5 ㎖ 일 수 있다.
면역적 조성물 및/또는 백신은 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 바이러스 입자를 투여 당 약 104 내지 약 1011, 유리하게는 약 105 내지 약 1010, 더욱 유리하게는 약 106 내지 약 109 개로 함유한다. 폭스바이러스에 기초한 면역적 조성물 및/또는 백신의 경우, 투여량은 약 102 pfu 내지 약 109 pfu 일 수 있다. 면역적 조성물 및/또는 백신은 인플루엔자 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스 재조합체를 투여 당 약 105 내지 109, 유리하게는 약 102 내지 108 pfu 로 함유한다.
포유류인 표적 종에 대한 조성물의 투여 부피, 예를 들어, 바이러스성 벡터에 기초한 조류 조성물, 예를 들어, 비-폭스바이러스-바이러스성-벡터-기재 조성물의 투여 부피는 일반적으로는 약 0.1 내지 약 2.0 ㎖, 약 0.1 내지 약 1.0 ㎖, 및 약 0.1 ㎖ 내지 약 0.5 ㎖ 이다.
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
실시예
DNA 삽입물, 플라스미드 및 재조합 바이러스성 또는 식물 벡터의 구축을 J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 에 의해 기술된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행했다.
실시예 1 플라스미드의 구축 및 식물의 형질전환
이 연구에서, 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI) H5N1 A/chicken/Indonesia/7/2003 (ck/Indonesia/03) 단리물로부터의 합성 헤마글루티닌 (HA) 유전자를 전매 렘나 미노르 단백질 발현 시스템인 Biolex 의 LEX systemTM 을 사용하여 발현시켰다.
헤마글루티닌 (HA) 은 숙주 세포 수용체 상의 말단 시알산에 대한 바이러스의 부착을 책임지고, 바이러스 입자와 세포 막 사이의 융합을 그 자신의 절단을 통해 매개하는 표면 바이러스 당단백질이다. 그것은 자연 감염 및 예방접종 모두에서 인플루엔자 바이러스에 대한 숙주 반응에 있어서 핵심 항원이다.
HA0 전구체는 분자량이 약 77kDa 이고, 적혈구를 응집시키는 능력이 있는, 564 개 아미노산을 함유하는 단백질이다. HA1 영역에 6 개의 예측되는 N-연결 (N-linked) 당화 자리, 및 HA2 영역에 1 개의 예측되는 N-연결 당화 자리가 존재한다.
HA 는 식물의 아포플라스트 공간에서 고도로 발현되었고, 웨스턴 블롯 분석에 의해 예상된 크기를 가졌고, 적혈구응집 활성을 가졌다. SPF 닭에서 면역원성 및 효능을 평가하기 위해 트랜스제닉 렘나 라인으로부터 미가공 식물 추출물을 제조했다. 동종 및 이종 항원 모두를 사용한 상당한 혈청 적혈구응집 억제 역가는 렘나 유도된 HA 가 고면역원성임을 나타냈다. 유중수 에멀전으로 제형화된 렘나 유도된 HA 의 단일 투여물로 예방접종한 3주령 SPF 닭을 A/ck/Indonesia/7/2003 또는 항원성 변이체 A/ck/WestJava/PWT-WU/2006 HPAI H5N1 단리물로 공격했다. 완전한 및 80 내지 90% 의 보호가 각각 A/ck/Indonesia/07/2003 및 A/ck/WestJava/PWT-WU/2006 에 대해 유도되었다. 1일령에 파울폭스 조류 인플루엔자 벡터 백신으로 초회감작된 (primed) HA-예방접종된 새에서 완전한 임상적 보호가 수득되었다 (프라임-부스트 계획). 구인두 방출 (shedding) 의 극적인 감소를 모든 피예방접종체 (vaccinate) 에 대해 관찰했고, 혈청 샘플에 대해 수행한 NP-기재 ELISA 는 피예방접종체와 감염된 닭을 명백히 구별시켰다. 분쇄된 HA-발현 개구리밥을 공급한 닭에서 보호가 관찰되지 않았다.
결론은, 렘나 미노르 발현된 HA 는 강한 면역 반응을 유발했고, 동종 및 변이체 H5N1 공격에 대해 뛰어난 수준의 보호를 제공했다. 트랜스제닉 개구리밥은 DIVA 잠재력 때문에 현재의 비활성화된 백신에 대한 탁월한 대안일 수 있다.
식물 형질전환 플라스미드의 구축 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI) 바이러스 A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) 단리물로부터 L. 미노르 선호되는 코돈 사용 (63-67% GC 함량) 을 하는 최적화된 형태의 헤마글루티닌 (HA) 유전자를 디자인했다. 합성 HA 유전자를 HA1 과 HA2 사이의 절단 자리에서 고병원성 조류 인플루엔자 서열 (다중 염기성 아미노산: RERRRKKR - SEQ ID NO:17) 에서 저병원성 조류 인플루엔자 서열 (RETR - SEQ ID NO:18) 로 개질했다. 선천 HA 신호 서열을 코돈-최적화된 H5N1 코딩 서열 (SEQ ID NO:1) 의 5' 말단에 융합된 쌀 α-아밀라제 신호 서열 (GenBank M24286) 로 대체했다. 아그로벡테리움 투메파시엔스 이원성 벡터 내로 클로닝하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 자리 (5'-EcoRI 및 3'-SacI) 를 첨가했다. L.미노르 최적화된 HA 유전자를 개질된 pMSP3 A. 투메파시엔스 2원성 벡터 (Gasdaska, J., et al., Bioprocessing J. 3, 50-56, 2003) 내로 렘나 깁바 RBCS SSU1 5' 리더가 있는 키메라 옥토파인 및 만노파인 신타제 프로모터와 노팔린 신타제 (Nos) 종결자 사이에서 EcoRI/SacI 클로닝하여 식물 형질전환 벡터 MerB01 을 생성했다.
트랜스제닉 라인 생성 및 스크리닝 Yamamoto, Y. et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37, 349-353 (2001) 에 기술된 바와 같이, 식물 형질전환 벡터 MerB01 로 형질전환된 A. 투메파시엔스 C58Z707 (Hepburn, A.G. et al., J. Gen. Microbiol. 131, 2961-2969, 1985) 을 사용하여, 빠르게 성장하는 L. 미노르 결절로부터 각각의 클론 라인을 나타내는 트랜스제닉 식물을 생성했다. 트랜스제닉 스크리닝을 위해, 각각의 클론 라인을 1 주일 동안 150 내지 200 mmol m-2s-1 에서 수크로오스가 없는 SH 배지를 함유하는 통풍되는 식물 성장 용기 내에서 예비조절 (preconditioning) 했다 (Schenk, R., et al., Can. J. Bot. 50, 199-204, 1972). 그 후, 15 내지 20 개의 예비조절된 엽상체를 신선한 SH 배지를 함유하는 통풍되는 용기 내로 배치하여, 2 주 동안 성장하도록 두었다. 각각의 라인으로부터의 조직 샘플을 동결하고 -70 ℃ 에서 저장했다. 그 후, 이들 조직 샘플을 적혈구응집 검정을 통해 HA 발현에 대해 스크리닝했다. 간략히, 동결 조직을 균질화 (homogenize) 하고, 원심분리하고, 검정을 위해 상청액을 제거했다. 트랜스제닉 샘플의 희석액을 칠면조 적혈구의 10% 용액 (Fitzgerald Industries International) 과 인큐베이션하고, 적혈구응집 활성에 대해 수치를 매겼다. 최초 희석액에서 이러한 검정으로 선별된 최고의 라인을 더 많은 희석액을 사용하여 다시 검정하여 역가를 사정했다. 샘플을 양성 대조군으로서의 재조합 H5N1 및 음성 대조군으로서의 렘나 야생형 식물과 비교했다. 라인 스크리닝의 예가 도 9 에 나타나 있다.
실시예 2 조류 인플루엔자 H5N1 라인의 개발
130 개의 트랜스제닉 조류 인플루엔자 H5N1 라인을 스크리닝을 위해 생성했다. 트랜스제닉 라인을 생성한 후, 배지 및 조직에서 조류 인플루엔자 H5N1 의 발현에 대해 스크리닝했다. 간략히, 식물을 2 주 동안 소형 연구 용기 내에서 성장시키고, 수득된 배지 및 조직을 분석을 위해 수집했다. 조직 분석을 위해, 동결 조직을 균질화하고, 원심분리하고, 검정을 위해 상청액을 제거했다.
샘플을 적혈구응집 검정 방법을 사용하여 검정했다. 간략히, 트랜스제닉 샘플의 희석액을 칠면조 적혈구의 10% 용액 (Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA) 과 인큐베이션하고, 적혈구응집 활성에 대해 수치를 매겼다. 최초 희석액에서 이러한 검정으로 선별된 최고의 라인을 더 많은 희석액을 사용하여 다시 검정했다. 샘플을 양성 대조군으로서의 재조합 H5N1 및 음성 대조군으로서의 렘나 야생형 식물과 비교했다. 적혈구응집 검정에서 배양 배지의 분석은 라인의 부분집합 (subset) 에 대해 활성을 보이지 않았고, 라인의 나머지는 검정에서 시험하지 않았다. 적혈구응집 검정의 전형적인 플레이트 및 트랜스제닉 식물의 스크리닝의 적혈구응집 분석의 결과 (막대 그래프 및 표 형식으로) 가 도 9 에 나타나 있다. 최초 스크리닝으로부터의 최고의 라인을 증대시켜서 약 1 ㎏ 의 바이오매스를 추가 특성화를 위해 제공했다.
실시예 3 렘나 미노르에서의 조류 인플루엔자 H5N1 헤마글루티닌의 생산
적혈구응집 검정 (HA), 적혈구응집 억제 검정 (HI), ELISA, SDS-PAGE, 및 웨스턴 블롯을 사용하여 H5N1 HA 를 특성화했다. 또한 재조합 단백질을 HI 시험에 의해 양성 닭 혈청의 패널에 대해 스크리닝했다.
식물 추출 H5N1 HA 를 함유하는 라인으로부터의 미가공 조직 추출물을 하기 절차에 따라 준비했다. 모든 단계가 4 ℃ 에서 이루어졌다. 100 그램의 동결 바이오매스를 200 ㎖ 추출 완충액 (50mM NaPO4, 0.3M NaCl, 10mm EDTA, pH 7.4, 프로테아제 억제제 칵테일 1:1000 (Sigma P9599, Sigma, St. Louis, MO, USA)) 과 혼합한 후, Waring Blender 에서 20 초 파열 4 회 및 그 사이의 10-20 초 냉각으로 균질화시켰다. 호모지네이트 (homogenate) 를 14,000 × g 으로 30 분 동안 4 ℃ 에서 원심분리하고, 치즈 클로쓰를 통과시켜 임의의 큰 데브리스를 제거하고, 마지막으로 셀룰로오스 아세테이트 필터 (0.22 um) 를 통과시켜 정화했다. 수득된 호모지네이트를 4 ℃ 에서 또는 얼음 위에서 즉시 시험을 위해 저장했다. 호모지네이트를 부분표본 (aliquot) 으로 -80 ℃ 에서 추가 분석을 위해 동결시켜 임의의 동결-해동 사이클을 회피했다. 총 가용성 단백질 (TSP) 을 소 혈청 알부민을 표준으로 브래드포드 검정을 사용하여 측정했다.
적혈구응집 검정 (HA) 적혈구응집 검정은 적혈구응집 항원을 탐지하고 정량하는 추정 시험이다. HA 시험의 기초는 바이러스성 헤마글루티닌이 적혈구 (RBC) 표면의 수용체에 부착하여 RBC 의 응집을 초래하는 것이다. HA 검정을 연속 2 배 희석액을 사용하여 미가공 추출물에 대해 Nunc U-바닥 플레이트에서 수행했다. 50 ㎕ 의 10% 칠면조 적혈구 (Fitzgerald Industries International Inc.) 를 50 ㎕ 의 시험 샘플과 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 규정된 바닥이 관찰되기 전에 최고 희석액에서 역가의 수치를 매겼다. 음성 대조군은 개구리밥 야생형 및 PBS 를 포함했고, 양성 대조군은 바큘로바이러스 발현된 재조합 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 A/Vietnam/1203/2004 (87 ㎍/㎖) 를 포함했다.
PBS 음성 대조군 및 개구리밥 야생형 샘플은 적혈구응집을 야기하지 않았는데, 이는 H5N1 HA 가 응집에 대한 유일한 원천임을 시사한다 (도 10). HA 역가는 비활성화된 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 (돌연변이된), 재조합 HA 단백질 참조, 및 H5N1 HA 를 함유하는 미가공 추출물에 대해, 각각 64, 12,800, 및 51,200-102,400 으로 측정되었다. 결과는 미가공 추출물이 심지어 102,400 배로 희석된 경우에도 여전히 RBC 를 응집시키고 RBC 가 조밀한 펠렛을 형성하는 것을 방지할 수 있음을 시사했다. HA 검정에 의해 판단되는 바와 같이, H5N1 HA 를 함유하는 미가공 추출물은 비활성화된 전체 바이러스 (108.5 EID50) 및 재조합 HA 참조 (87 ㎍/㎖) 보다 상당히 더 높은 활성도로 생물학적으로 활성이다.
시판 칠면조 적혈구를 최초 스크리닝에 사용했다. 제형화 실행가능성을 추정하기 위해, 미가공 H5N1 HA 추출물을 표준화된 HA 검정을 사용하여 평가했다. 신선한 닭 적혈구를 PBS 로 3 회 세척하고, 1 시간 대신 30 분 동안 시험 샘플과 인큐베이션했다. 결과는 표준 HA 검정 및 현 HA 검정 사이에 HA 역가의 1-2 배 차이를 나타냈다. 도 11 에 나타나 있는 바와 같이, 추정 수율을 결정했다.
적혈구응집 억제 검정 (HI) 및 ELISA 적혈구응집 억제 검정의 기초는 특이적 항체와 동종 바이러스성 헤마글루티닌의 상호작용이 적혈구응집을 억제하는 것이다. 특이적 항체에 의한 발현된 HA 항원의 인지는 HA 의 항원성을 확인한다.
H5N1 HA 미가공 추출물의 응집 활성을 모든 HI 양성 혈청, 즉 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 모노클로날 항-H5 헤마글루티닌 (Rockland, Gilbertsville, PA), CP62 및 364/1 의 모노클로날 항-H5N1 Ab 풀 (pool) (CDC, Atlanta, GA, USA), FP2211 닭 혈청, 및 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 (돌연변이된) 닭 혈청에 의해 성공적으로 중화시켰다. 음성 대조군은 PBS 및 적혈구응집을 야기하지 않은 개구리밥 야생형 샘플을 포함했다 (도 12-14). 결과는 미가공 H5N1 HA 추출물에 존재하는 HA 가 예상된 항원성을 가졌음을 확인했다.
임상적 면역원성 연구로부터 수집한 샘플의 혈청학적 분석을 위해, HI 시험을 NVSL 표준 프로토콜에 따라 수행했다. 항원의 패널을 하기 혈청의 교차반응성에 대해 시험했다: H5N1 클레이드 2.1 A/chicken/Indonesia/7/2003 (Indo/03), H5N1 클레이드 2.1 (변이체) A/ck/West Java/PWT-WIJ/2006, H5N1 클레이드 2.2 A/WS/Mongolia/244/05, H5N1 클레이드 1 A/Vietnam/1203/2004 (VN/04), 및 H5N8 A/turkey/Ireland/1378/1983 (Ireland/83). 통계적 분석을 SAS V9.1 을 사용하여 수행했다. 차단 효소 연결 면역흡착 검정 (bELISA) 을 제조사의 지침 (FlockCheck AI MultiS-Screen Antibody Test Kit, IDEXX Laboratories, Westbrook, ME) 에 따라 수행했다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 단백질 샘플 (미가공 조직 추출물) 을 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 희석하고, Nu-PAGE 10% Bis-Tris 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 분리하고, Invitrogen iBlot 을 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 1 시간 동안 실온에서 (또는 밤새 4 ℃ 에서) 차단하고, 1 시간 동안 실온에서 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스 (Rockland) 의 H5 헤마글루티닌에 대한 모노클로날 항체로 프로빙 (probed) 했다. 0.1% Tween-20 이 함유된 PBS 로 4 회 세척 후, 막을 HRP-접합된 2 차 항체와 1 시간 동안 인큐베이션하고, 0.05% Tween-20 이 함유된 PBS 로 4 회 세척한 후, 5 분 동안 TMB 막 퍼옥시다제 기질 시스템 (KPL, Gaithersburg, MD) 으로 발달시켰다. 이미지 분석을 Odyssey LICOR 적외선 이미징 시스템 9120 (LICOR, Lincoln, NE) 을 사용하여 수행했다.
은 염색 SDS-PAGE 로, HA 발현 라인 (도 15a) 에서 구별되는 밴드를 77kDa 에서 관찰했다. A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 모노클로날 항-H5 헤마글루티닌을 사용하는 웨스턴 블롯으로 예상되는 분자량 77kDa 으로 HA 의 발현을 확인했고, 한편 렘나 야생형은 여전히 음성이었다 (도 15b). 웨스턴 블롯에서, 비환원 조건 하에, A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 모노클로날 항-H5 헤마글루티닌 (Rockland) 및, CP62 및 364/1 의 모노클로날 항-H5N1 Ab 풀 (CDC, Atlanta, GA) 은 모두 H5N1 HA 를 예상된 분자량 77kDa 의 하나의 뚜렷한 밴드로서 인지했고, 한편 렘나 야생형은 여전히 음성이었다 (도 15c). 도 16 은 또한 FP2211 닭 혈청 및 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 (돌연변이된) 닭 혈청에 의한 HA 인식을 77kDa 에서의 하나의 예상된 밴드로서 입증했고, 한편 Biolex 야생형은 여전히 음성이었다. 비활성화된 전체 바이러스 및 재조합 HA 참조는 50 kDa 및 28 kDa 에서 2 개의 밴드를 나타냈고, 이는 HA0 이 2 개의 서브유닛 HA1 및 HA2 로 절단되었음을 시사한다. 웨스턴 블롯 결과는 적혈구응집 억제 시험에서의 관찰과 일치했다.
요약 적혈구응집 검정 결과는 H5N1 HA 의 생물학적 활성을 역가 51,200 HAU/50㎕ 로 확인했고, 이는 87 ㎍/㎖ 에서의 정제된 재조합 HA 및 108.5 EID50 에서의 비활성화된 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 (돌연변이된) 보다 상당히 더 높았다. H5N1 HA 의 적혈구응집 활성을 HI 양성 혈청, 즉 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 모노클로날 항-H5 헤마글루티닌 (Rockland), CP62 및 364/1 의 모노클로날 항-H5N1 Ab 풀 (CDC), FP2211 닭 혈청, 및 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 닭 혈청의 패널에 의해 성공적으로 중화시켰다. 결과는 각각의 항체가 선천 형태의 항원을 인지했음을 시사했다. HA 발현을 또한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 입증했다. HA0 전구체의 예상된 크기에 해당하는 77kDa 의 밴드를 은-염색 SDS-PAGE 로 시각화했다. 웨스턴 블롯에서, H5N1 HA 는 모든 시험된 MAb 및 닭 혈청, 즉 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 모노클로날 항-H5 헤마글루티닌 (Rockland), CP62 및 364/1 의 모노클로날 항-H5N1 Ab 풀 (CDC), FP2211 닭 혈청, 및 조류 인플루엔자 H5N1 ck/Indonesia/03 닭 혈청에 의해 77kDa 에서의 예상된 분자량으로 매우 잘 인지되었다.
실시예 4 식물에서 면역위치결정에 의한 렘나 (Biolex system) 에 의해 생산된 AIV H5N1 균주 Indonesia 로부터의 HA 의 발현의 특성화
렘나 조직에서의 HA 의 발현을 면역형광 검정으로 분석했다. 식물을 슬라이드 위에 4% 포름알데히드가 함유된 MTSB 완충액 (EGTA 5mM, Pipes 50 mM, MgSO4 5mM, pH7.0) 중 진공 하에 고정시킨 후, MTSB+0.1% Triton X100 및 그 뒤에 물+0.1% Triton X100 으로 헹궜다. 세포 벽을 Driselase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를 사용하여 30 분 동안 37 ℃ 에서 소화시키고, 다시 MTSB+0.1% Triton X100, MTSB + 10% DMSO + 3% NP40, 및 MTSB+0.1% Triton X100 으로 세척한 후, MTSB + 3% BSA 로 차단했다. 처리된 식물을 그 후 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스의 H5 헤마글루티닌에 대한 모노클로날 항체와 밤새 4 ℃ 에서 인큐베이션하고, 플루오레세인 (FITC)-접합 2차 항체로 3 시간 동안 실온에서 프로빙하고, 슬라이드를 Nikkon eclipse 600 형광 현미경을 사용하여 조사했다.
결과는 렘나 야생형에서 형광 배경이 관찰되지 않았고, 한편 형질전환된 렘나에서 강하고 특이적인 형광 신호가 탐지되었음을 나타냈다 (도 17). 결과는 또한 HA 가 식물 조직의 아포플라스트에서 발현되었는데, 이는 HA 발현에 대한 표적 세포 위치와 일치했음을 시사했다.
실시예 5 면역원성 및 공격 연구
면역원성 및 공격 연구를 아주반트가 첨가된 렘나 발현된 HA 로 3주령에 예방접종한 특정 무 병원체 (SPF) 닭에서 수행했다. 10 마리의 닭을 각각의 백신 군에 배정했다. 아주반트가 첨가된 렘나 야생형 물질로 예방접종한 군을 음성 대조군으로서 두 연구 모두에 포함시켰고, 바큘로바이러스 시스템에서 발현시킨 아주반트가 첨가된 실험적 재조합 HA 의 군을 또한 공격 연구에 포함시켰다. 하나의 군 (군 8) 은 파울폭스 벡터 AIV H5 (vFP89, 참조, US 2008/0107681 및 US 2008/0107687) 백신을 1 일령에 아주반트가 첨가된 렘나 발현된 HA (참조, 하기) 의 3 주 전에 수령했다.
면역원성 연구 닭을 도 18 에 기술된 바와 같이 예방접종했다. 3 주령 닭의 6 개의 군을 하기 2 개의 상이한 계획을 사용하여 시험했다: 3 가지 투여량 수준 (655 HAU, 6550 HAU, 및 26200 HAU) 에서 1 회 샷 (shot) (군 5-7) 또는 2 회 샷 (군 2-4). 프라임-부스트 계획 (군 8) 을 H5N8 (A/turkey/Ireland/1378/83) 의 HA 유전자를 발현하는 TROVAC® (vFP89) 으로 초회감작되고 렘나 발현된 HA 로 6550 HAU 에서 부스트된 1 일령 닭에서 조사했다. TROVAC® 을 목덜미에 피하 투여했다 (103 TCID50/ 0.2 ㎖/투여). 미가공 렘나 추출물의 유중수 에멀전을 다리에 근육내 경로에 의해 제공했다 (0.3 ㎖/투여). 혈구응집 억제 시험을 위해 혈액 샘플을 21 일 및 35 일에 수집했다.
어떠한 닭도 식물 유도된 백신에 대한 부정적 반응을 보이지 았았다. 예방접종한 닭으로부터 수집한 혈청의 HI 역가에 의해 면역원성을 측정했다 (도 20). 렘나 야생형으로 예방접종한 닭은 모든 시험된 H5 항원에 대해 HI 검정에 의해 음성이었다. 면역화 21 일 후, 특이적 항체가 렘나 HA 군에서 유도되었고, 동종 Indo/03 균주에 대한 평균 HI 역가는 655 HAU, 6550HAU, 및 262000 HAU 투여량 수준에서 각각 4, 6.5, 및 8.1 log2 였다. 예방접종 (p.v.) 후 35 일째 Indo/03 에 대한 HI 역가는 1 회 샷 계획에 의한 낮은 투여량 내지 높은 투여량의 경우 4.7, 6.6, 및 7.6 log2 로 유지되었고, 한편 HI 역가는 2 회 샷 계획의 경우 6.8, 9.4 및 9.5 log2 로 상당히 증가했는데, 이는 분명한 부스트 효과 (p<0.005) 및 투여량 효과 (p<0.005 낮은 투여량과 중간/높은 투여량 사이) 를 시사했다. 이 결과는 또한 이종 균주 Mong/244/05 및 VN/1203/04 에 대한 하기 HI 역가에서 입증되었다: 655 HAU, 6550HAU, 및 262000 HAU 투여량 수준에서 각각 1 회 샷 및 2 회 샷 계획에 대해 2.9, 5.4, 6.5 log2 대 5.3, 7.7, 8.5 log2 및 2.6, 3.6, 4.8 대 4.2, 6.0, 6.6 log2. 2 가지 예방접종 계획의 경우 모두 면역 반응은 동종 H5N1 클레이드 2.1 Indo/03 균주에 대해 가장 높았고, 그 다음 클레이드 2.2 Mong/244/05, 그 후 클레이드 1 VN/1203/04 였다. HA 를 프라임으로 발현하는 파울폭스 재조합체를 사용하는 프라임 부스트 계획을 또한 렘나 HA 로 중간 투여량 6550 HAU 에서 시험했다. 초회감작 후 21 일째, TK/Ire/83 (역가 4.0 log2) 을 제외한 나머지 H5 항원에 대해 HI 역가가 관찰되지 않았다. 부스트 후 35 일째, HI 역가는 VN/1203/04, Indo/03, Mong/244/05, 및 Tk/Ire/83 에 대해 각각 5.3, 5.6, 5.4 및 9.2 log2 로 증가했다. 그러나, 역가 6.0, 9.4, 7.7, 및 7.3 log2 에서의 렘나 HA 2 회 샷 계획과 비교할 때, 항체 반응은 Tk/Ire/83 을 제외하고는 낮았다.
공격 연구 닭을 도 19 에 따라 예방접종했다. 면역원성 연구와 유사하게, 닭을 렘나 HA 로 3 가지 상이한 투여량으로, 그러나 군 4 (경구 예방접종) 및 군 8 (프라임-부스트 계획) 을 제외하고는 단일 면역화 (군 2-3, 5-7) 에 의해 예방접종했다.
제 42 일에, 닭을 HPAI H5N1 바이러스, A/ck/Indonesia/07/2003 (군 1-4) 또는 A/ck/WestJava/PWT-WU/2006 (군 5-8) 으로 닭 1 마리 당 106.0 EID50 으로 비강내/경구 공격했다. 공격 후, 닭을 매일 병적상태 및 사망률에 대해 관찰하고, 병든 닭을 인플루엔자에 감염된 것으로서 계수했다. 기도로부터 방출되는 공격 바이러스를 측정하기 위한 구인두 면봉채취물을 공격후 2 및 4 일 (days post-challenge, DPC) 에 항균 화합물 (100 ㎍/㎖ 겐타마이신, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 5 ㎍/㎖ 암포테리신 B) 을 함유하는 뇌 심장 침출 (BHI) 배지 (Becton-Dickinson, Sparks, MD) 1.5 ㎖ 에서 수집했다. 모든 군으로부터의 잔존 닭을 42 일 및 56 일령에 혈청 수집을 위해 피를 뽑았다. 새를 56 일령에 정맥내 나트륨 펜토바르비탈 (100 ㎎/㎏ 체중) 로 안락사시켰다.
HPAI H5N1 바이러스에 의한 공격은 예방접종하지 않은 (naive) 닭의 2 일 이내 100% 사망률을 재현가능하게 유도할 것으로 예상했다. 2 개의 음성 대조군, 즉, 렘나 야생형으로 예방접종하고 Indo/03 균주로 공격한 닭, 및 실험적 재조합 HA 대조군으로 예방접종하고 PWT/06 으로 공격한 닭은 이 기간 동안 죽었다 (도 19). Indo/03 으로 공격한 군에서, 렘나 유도된 HA 로 IM 경로를 통해 예방접종한 닭은 655 HAU 및 6550 HAU 투여량 수준에서 모두 100% 생존했다. PWT/06 으로 공격한 군에서, 6550 HAU 및 26200 HAU 에서의 1 회 샷 계획 후 10 마리 닭 중 각각 9 마리 및 8 마리가 생존했다. 6550 HAU 군에서 한 마리 새가 공격후 10 일 (dpc) 에 중증 사경으로 인해 안락사당했다. TROVAC®/렘나 프라임-부스트 계획은 이 변이체 균주에 대한 100% 보호를 입증했다.
바이러스 방출을 2 및 4 dpc 에 생존자 새로부터 채취한 구인두 면봉채취물 샘플에 대한 정량적 RT-PCR 시험을 이용하여 조사했다. 구인두 명봉채취물을 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 정량적 실시간 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (qRRT-PCR) 에 의해 시험했고, 공격 바이러스 희석액 시리즈를 사용하여 생성한 회귀 선에 기초하여 qRRT-PCR 사이클 역치를 부화 계란 중 동등한 전염 역가로 전환했다 (Lee et al., Journal of Virological Methods 119(2):151-158). 간략히, 250 ㎕ 의 면봉 매질을 750 ㎕ 의 Trizol LS (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) 에 첨가함으로써 구인두 면봉 물질로부터 RNA 를 추출한 후, 볼텍싱 (vortexing) 을 통해 혼합하고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한 후, 200 ㎕ 의 클로로포름을 첨가했다. 샘플을 다시 볼텍싱하고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한 후, 15 분 동안 약 12,000×g 에서 원심분리했다. 수상을 수집하고, RNA 를 MagMAX AI/ND 바이러스성 RNA 단리 키트 (Ambion, Inc. Austin TX) 로 키트 지침에 따라 KingFisher 자기 입자 가공 시스템 (Thermo Scientific, Waltham, MA) 을 사용하여 단리했다. 조류 인플루엔자 바이러스 공격 균주를 사용하여 정량 표준에 대한 RNA 를 생성했다. 요막강액 바이러스 스톡을 BHI 브로쓰 (Becton-Dickinson) 에 희석하고, 표준 방법에 따른 희석시 부화 계란에서 적정했다 (Swayne et al., 2008, Avian Influenza. In: Isolation and Identification of Avian Pathogens. 5th ed., pp. 128-134). 전체 바이러스 RNA 를 면봉 물질에 대해 기술된 바와 같은 적정된 바이러스의 10 배 희석액으로부터 추출했다. 인플루엔자 매트릭스 유전자에 대한 qRRT-PCR 을 이전에 기술된 바와 같이 수행했다 (Lee et al., 2004). 샘플 중 바이러스 역가를 표준 곡선에 기초하여 계산하거나, Smart Cycler II (Cepheid, Inc. Sunnyvale, CA) 소프트웨어 또는 표준 곡선 방정식의 외삽법에 의해 계산했다. Indo/03 으로 공격한 군의 경우, 렘나 야생형으로 예방접종한 모든 닭이 바이러스 역가 106.9 EID50 에서 양성으로 발견되었고, 한편 렘나 HA 군에 대한 바이러스 방출은 2 dpc 에 각각 6550 HAU 및 655 HAU 에 대해 탐지 한계 102.9 및 103.1 EID50 바로 위까지 극적으로 감소했고, 4 dpc 에는 탐지가능하지 않게 되었다. 항원성 변이체 PWT/06 균주로 공격한 군의 경우, 실험적 HA 로 5000 HAU 에서 예방접종한 모든 닭이 2 dpc 에 여전히 바이러스를 107.1 EID50 에서 방출했고, 6550 HAU, 26200 HAU, 및 TROVAC®/렘나 군의 경우 각각 10 마리 새 중 오직 1 마리, 2 마리 및, 1 마리가 탐지가능했고, 4 dpc 이후 렘나 HA 군의 경우 2 마리가 6550 및 26200 HAU 모두에서 여전히 양성이었으나, 바이러스는 TROVAC®/렘나 군에서 탐지 한계 (103.5 EID50) 근처 또는 미만이었다.
H5N1 공격 전후에 ELISA 키트를 사용하여 샘플을 핵단백질 (NP) 특이적 항체의 존재에 대해 또한 조사했다 (도 19). NP 특이적 항체는 렘나 HA 에 의한 면역화 이후 및 공격 이전에 수집한 모든 혈청 샘플에 부존재했다. PWT/06 공격 이후, 9 개 중 9 개, 8 개 중 8 개, 및 10 개 중 8 개의 샘플이 각각 6550 HAU, 26200 HAU, 및 프라임-부스트 군에 대해 양성 신호를 나타냈다.
도 21 은 공격 전 42 일 및 공격 후 56 일 (14 dpc) 에 수집한 샘플의 혈청학적 분석을 나타낸다. 렘나 야생형과 경구 군 모두 Indo/03 균주에 대해 어떠한 체액성 면역을 발달시키지 않았고, 실험적 바큘로바이러스 발현된 HA 로 예방접종한 10 마리 중 3 마리가 VN/04 균주에 대해 탐지가능한 항체 역가 2.4 log2 를 나타냈다. 모든 다른 군은 시험된 항원, 즉 Indo/03, VN/04, 및 Mong/05 에 대해 양성 면역 반응을 나타냈는데, 이는 면역원성 연구에서의 데이타를 지지했다.
Indo/03 공격 이후, Indo/03 에 대한 평균 HI 역가가 655 HAU 및 6550 HAU 군에 대해 각각 4.5 에서 7.1 log2 로, 및 6.9 에서 8.2 log2 로 증가했다. 혈청은 또한 PWT/06 에 대해 탐지불가능에서 2.7 log2 로, 및 2.2 에서 3.8 log2 로 현저한 증가를 나타냈다. PWT/06 공격 이후, 동종 PWT/06 에 대한 평균 HI 역가가 6550 HAU, 26200 HAU, 및 프라임-부스트 군에 대해 각각 2.2 에서 6.0 log2 로, 2.2 에서 6.3 log2 로, 및 2.7 에서 4.9 log2 로 급증했다. Indo/03 에 대한 HI 역가에서 동일한 군에 대해 6.9 에서 8.6 log2 로, 6.8 에서 9.0 log2 로, 및 7.1 에서 7.7 log2 로 유사한 경향을 또한 관찰했다.
흥미롭게도, NP-기재 ELISA 결과는 예상한 바와 같이 공격 전에 탐지가능한 NP-면역 반응이 존재하지 않았음을 시사했다. 그러나, 공격 후에, 보호된 새의 대부분의 혈청이 양성으로 변했다. 이 결과는 렘나 발현된 HA 백신 단독 또는 HA 를 발현하는 파울폭스 벡터에 의한 프라임-부스트 예방접종 요법 (소위, 프라임-부스트 계획) 이 DIVA (감염된 동물을 예방접종된 동물과 구별) 전략과 완전히 적합성임을 명백히 나타낸다. 상기 백신의 사용은 상업적으로 입수가능한 ELISA 를 사용하여 항-NP 항체에 대해 체크함으로써 예방접종한 무리에서 감염의 탐지를 쉽게 가능하게 할 것이다.
실시예 6 개구리밥 식물로부터의 조류 인플루엔자 단백질의 정제
조류 인플루엔자 항원성 폴리펩티드 또는 그의 조각 또는 변이체를 항원성 폴리펩티드를 배양 배지로부터 분리함으로써 정제했다. 최초의 정제는 식물 물질 및 세포 데브리스를 제거하는 원심분리를 포함한다. 이 부분적 정제 이후, 미가공 추출물을 pH 이동 및 열 처리, 그 후 규조토 상에서의 여과에 의해 정화할 수 있다. 재조합 HA 를 이들 정화된 추출물로부터 피투인 칼럼 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다. 정제는 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서의 밀도측정에 의해 확인할 수 있다.
식물 조직을 Silverson 고 전단 믹서를 사용하여 50 mM 나트륨 포스페이트, 0.3 M 나트륨 클로리드 및 10 mM EDTA, pH 7.2 로 균질화한다. 호모지네이트를 1 M 시트르산으로 pH 4.5 로 산성화하고, 7,500g 에서 30 분 동안 4 ℃ 에서 원심분리한다. 상청액의 pH 를 2 M 2-아미노-2-[히드록시메틸]-1,3-프로판디올 (Tris) 에 의해 pH 7.2 로 조정한 후, 0.22-㎛ 필터를 사용하여 여과한다. 50 mM 나트륨 포스페이트, 0.3 M 나트륨 클로리드 및 10 mM EDTA, pH 7.2 를 함유하는 용액으로 평형화시킨 mAbSelect SuRe 단백질 A 수지 (GE Healthcare) 상에 물질을 직접 적재한다. 적재 후, 칼럼을 평형화 완충액으로 기준선까지 세척한 뒤, 5 칼럼 부피의 0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 5.0 로 중간 세척한다. 결합된 항체를 10 칼럼 부피의 0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 3.0 으로 용출시킨다. 단백질 A 용출물을 2 M Tris 로 즉시 중화시킨다. 응집체 제거를 위해, 단백질 A 용출물을 pH 5.5 로 조정하고, 25 mM 나트륨 포스페이트, pH 5.5 로 평형화시킨 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I (Bio-Rad, CA, USA) 칼럼에 적용한다. 칼럼을 5 칼럼 부피의 평형화 완충액으로 세척한 후, 0.25 M 나트륨 포스페이트, pH 5.5 를 사용하는 단일 단계-용출로 단백질을 용출한다. A280 에 의해 모니터링한 단백질을 함유하는 분획을 모으고 -80 ℃ 에서 저장했다 (Cox, K.M., et al., 2006. 24(12): p. 1591-7).
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본 발명의 바람직한 구현예에서 이와 같이 상세히 기술했지만, 상기 단락들에 의해 규정되는 본 발명은 상기 기술에서 제시된 특정 세부사항에 제한되지 않으며, 이는 본 발명의 정신 또는 범주에서 이탈하지 않으면서 그의 많은 명백한 변이가 가능하기 때문임이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial Limited Guo, Xuan Bublot, Michel Pritchard, Nikki <120> RECOMBINANT AVIAN INFLUENZA VACCINE AND USES THEREOF <130> MER 08-125 <150> 61/118,492 <151> 2008-11-28 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1644 <212> DNA <213> artificial <220> <223> codon-optimized <400> 1 gaccagatct gcatcggcta ccacgccaac aattccaccg agcaggtgga cacgatcatg 60 gaaaagaacg tgaccgtcac ccacgcccag gacatcctcg agaagacgca caacgggaag 120 ctctgcgacc tcgacggcgt gaagccgctc atcctccgcg actgctccgt ggccggctgg 180 ctcctgggca accccatgtg cgacgagttc atcaacgtcc cggagtggtc ctacatcgtg 240 gagaaggcca accccgccaa cgatctgtgc tacccgggga acctcaacga ctacgaggaa 300 ctcaagcacc tgctctcccg catcaaccac ttcgagaaga tccagatcat cccgaagtcc 360 agctggtccg accacgaggc gtccagcggc gtcagctccg cctgcccgta ccaaggcaag 420 tccagcttct tccggaacgt cgtgtggctg atcaagaaga actcggccta ccccaccatc 480 aagaggagct acaacaatac gaaccaggag gacctgctcg tgctgtgggg gatccaccac 540 ccgaacgacg cggccgagca gacccgcctg taccagaacc ccaccacgta catctccgtc 600 gggaccagca cgctcaacca gcgcctggtg ccgaagatcg ccatccgcag caaggtgaac 660 gggcagtcgg gtcgcatgga gttcttctgg acgatcctga agcccaacga cgccatcaac 720 ttcgagagca acggcaactt catcgccccg gagtacgcgt acaagatcgt caagaagggg 780 gacagcgcca tcatgaagtc ggagctggag tacgggaact gtaacacgaa gtgccagacc 840 cccatgggcg cgatcaactc cagcatgccc ttccacaaca tccacccgct caccatcggc 900 gagtgcccca agtacgtcaa gagcaacagg ctggtcctgg ccacgggcct ccgcaacagc 960 ccccagcggg agacccgcgg gctcttcggg gccatcgcgg ggttcatcga gggcgggtgg 1020 cagggcatgg tggacggttg gtacggctac caccacagca acgagcaggg ctcgggctac 1080 gccgcggaca aggagtccac ccagaaggcc atcgacggcg tgaccaacaa ggtgaactcc 1140 atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtcgggc gcgagttcaa caacctggag 1200 cgccggatcg agaacctcaa caagaagatg gaggacgggt tcctggacgt gtggacctac 1260 aacgcggagc tgctcgtgct catggagaac gagaggacgc tcgacttcca cgactccaac 1320 gtcaagaacc tgtacgacaa ggtccggctg cagctccggg acaacgccaa ggagctgggc 1380 aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggagtc catcaggaac 1440 ggcacgtaca actaccccca gtattccgag gaggctcgcc tcaagaggga ggagatcagc 1500 ggcgtcaagc tcgagtccat cgggacctac cagatcctct ccatctactc cacggtggcg 1560 tccagcctcg ccctcgccat catgatggct ggcctgtcgc tgtggatgtg ctccaacggg 1620 agcctccagt gccgcatctg catc 1644 <210> 2 <211> 548 <212> PRT <213> artificial <220> <223> protein sequence <400> 2 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 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atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ttcaacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaat 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ctcaacgact atgaagaact aaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 420 catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttt 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gagaagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaggctata tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct attagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 agaatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctctgcaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatgggg tcaccaataa ggtcaactcg 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gttaagaacc tctacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac 1500 ggaacgtata actacccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga agaaataagt 1560 ggagtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620 agttccctag cactggcaat catgatggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 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acgatctgtg ctacccgggg aacctcaacg actacgagga actcaagcac ctgctctccc 420 gcatcaacca cttcgagaag atccagatca tcccgaagtc cagctggtcc gaccacgagg 480 cgtccagcgg cgtcagctcc gcctgcccgt accaaggcaa gtccagcttc ttccggaacg 540 tcgtgtggct gatcaagaag aactcggcct accccaccat caagaggagc tacaacaata 600 cgaaccagga ggacctgctc gtgctgtggg ggatccacca cccgaacgac gcggccgagc 660 agacccgcct gtaccagaac cccaccacgt acatctccgt cgggaccagc acgctcaacc 720 agcgcctggt gccgaagatc gccatccgca gcaaggtgaa cgggcagtcg ggtcgcatgg 780 agttcttctg gacgatcctg aagcccaacg acgccatcaa cttcgagagc aacggcaact 840 tcatcgcccc ggagtacgcg tacaagatcg tcaagaaggg ggacagcgcc atcatgaagt 900 cggagctgga gtacgggaac tgtaacacga agtgccagac ccccatgggc gcgatcaact 960 ccagcatgcc cttccacaac atccacccgc tcaccatcgg cgagtgcccc aagtacgtca 1020 agagcaacag gctggtcctg gccacgggcc tccgcaacag cccccagcgg gagacccgcg 1080 ggctcttcgg ggccatcgcg gggttcatcg agggcgggtg gcagggcatg gtggacggtt 1140 ggtacggcta ccaccacagc aacgagcagg gctcgggcta cgccgcggac aaggagtcca 1200 cccagaaggc catcgacggc gtgaccaaca aggtgaactc catcatcgac aagatgaaca 1260 cccagttcga ggccgtcggg cgcgagttca acaacctgga gcgccggatc gagaacctca 1320 acaagaagat ggaggacggg ttcctggacg tgtggaccta caacgcggag ctgctcgtgc 1380 tcatggagaa cgagaggacg ctcgacttcc acgactccaa cgtcaagaac ctgtacgaca 1440 aggtccggct gcagctccgg gacaacgcca aggagctggg caacggctgc ttcgagttct 1500 accacaagtg cgacaacgag tgcatggagt ccatcaggaa cggcacgtac aactaccccc 1560 agtattccga ggaggctcgc ctcaagaggg aggagatcag cggcgtcaag ctcgagtcca 1620 tcgggaccta ccagatcctc tccatctact ccacggtggc gtccagcctc gccctcgcca 1680 tcatgatggc tggcctgtcg ctgtggatgt gctccaacgg gagcctccag tgccgcatct 1740 gcatctaaga gctcgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga 1800 ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag 1860 catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga 1920 gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat 1980 aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg aattaattca gatcggctga 2040 gtggctcctt caacgttgcg gttctgtcag ttccaaacgt aaaacggctt gtcccgcgtc 2100 atcggcgggg gtcataacgt gactccctta attctccgct catgatcaga ttgtcgtttc 2160 ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat tggcgggtaa acctaagaga 2220 aaagagcgtt tattagaata atcggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg 2280 tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttccccagat ctggcgccgg ccagcgagac 2340 gagcaagatt ggccgccgcc cgaaacgatc cgacagcgcg cccagcacag gtgcgcaggc 2400 aaattgcacc aacgcataca gcgccagcag aatgccatag tgggcggtga cgtcgttcga 2460 gtgaaccaga tcgcgcagga ggcccggcag caccggcata atcaggccga tgccgacagc 2520 gtcgagcgcg acagtgctca gaattacgat caggggtatg ttgggtttca cgtctggcct 2580 ccggaccagc ctccgctggt ccgattgaac gcgcggattc tttatcactg ataagttggt 2640 ggacatatta tgtttatcag tgataaagtg tcaagcatga caaagttgca gccgaataca 2700 gtgatccgtg ccgccctgga cctgttgaac gaggtcggcg tagacggtct gacgacacgc 2760 aaactggcgg aacggttggg ggttcagcag ccggcgcttt actggcactt caggaacaag 2820 cgggcgctgc tcgacgcact ggccgaagcc atgctggcgg agaatcatac gcattcggtg 2880 ccgagagccg acgacgactg gcgctcattt ctgatcggga atgcccgcag cttcaggcag 2940 gcgctgctcg cctaccgcga tggcgcgcgc atccatgccg gcacgcgacc gggcgcaccg 3000 cagatggaaa cggccgacgc gcagcttcgc ttcctctgcg aggcgggttt ttcggccggg 3060 gacgccgtca atgcgctgat gacaatcagc tacttcactg ttggggccgt gcttgaggag 3120 caggccggcg acagcgatgc cggcgagcgc ggcggcaccg ttgaacaggc tccgctctcg 3180 ccgctgttgc gggccgcgat agacgccttc gacgaagccg gtccggacgc agcgttcgag 3240 cagggactcg cggtgattgt cgatggattg gcgaaaagga ggctcgttgt caggaacgtt 3300 gaaggaccga gaaagggtga cgattgatca ggaccgctgc cggagcgcaa cccactcact 3360 acagcagagc catgtagaca acatcccctc cccctttcca ccgcgtcaga cgcccgtagc 3420 agcccgctac gggctttttc atgccctgcc ctagcgtcca agcctcacgg ccgcgctcgg 3480 cctctctggc ggccttctgg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 3540 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 3600 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 3660 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 3720 aaaatcgacg 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gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtacacgg gcaaagtgga 720 aggatggatt tcttctggac aattttaaat cctaatgata caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtgactgc aacactaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca acagggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agcagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactca 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt ttctagatgt ttggacttat 1320 aatgccgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gttaagaacc tctacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagttgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac 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chicken/Vietnam <400> 13 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgcccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caacaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 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gggctacgca 1020 tacatcctca cccaccccgg caacccatgc atcttctacg accatttctt cgattggggt 1080 ctcaaggagg agatcgagcg cctggtgtca atcagaaacc ggcaggggat ccacccggcg 1140 agcgagctgc gcatcatgga agctgacagc gatctctacc tcgcggagat cgatggcaag 1200 gtgatcacaa agattggacc aagatacgac gtcgaacacc tcatccccga aggcttccag 1260 gtcgtcgcgc acggtgatgg ctacgcaatc tgggagaaaa tctga 1305 <210> 16 <211> 434 <212> PRT <213> rice <400> 16 Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly Gln 20 25 30 Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Trp Lys Glu Asn Gly Gly 35 40 45 Trp Tyr Asn Phe Leu Met Gly Lys Val Asp Asp Ile Ala Ala Ala Gly 50 55 60 Ile Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val Gly Glu Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly 85 90 95 Asn Glu Ala Gln Leu Lys Ser Leu Ile Glu Ala Phe His Gly Lys Gly 100 105 110 Val Gln Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Thr Ala Glu His 115 120 125 Lys Asp Gly Arg Gly Ile Tyr Cys Leu Phe Glu Gly Gly Thr Pro Asp 130 135 140 Ser Arg Leu Asp Trp Gly Pro His Met Ile Cys Arg Asp Asp Pro Tyr 145 150 155 160 Gly Asp Gly Thr Gly Asn Pro Asp Thr Gly Ala Asp Phe Ala Ala Ala 165 170 175 Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Lys Arg Val Gln Arg Glu Leu Ile Gly 180 185 190 Trp Leu Asp Trp Leu Lys Met Asp Ile Gly Phe Asp Ala Trp Arg Leu 195 200 205 Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Ala Asp Met Ala Lys Ile Tyr Ile Asp 210 215 220 Ala Thr Glu Pro Ser Phe Ala Val Ala Glu Ile Trp Thr Ser Met Ala 225 230 235 240 Asn Gly Gly Asp Gly Lys Pro Asn Tyr Asp Gln Asn Ala His Arg Gln 245 250 255 Glu Leu Val Asn Trp Val Asp Arg Val Gly Gly Ala Asn Ser Asn Gly 260 265 270 Thr Ala Phe Asp Phe Thr Thr Lys Gly Ile Leu Asn Val Ala Val Glu 275 280 285 Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg Gly Glu Asp Gly Lys Ala Pro Gly Met 290 295 300 Ile Gly Trp Trp Pro Ala Lys Ala Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp 305 310 315 320 Thr Gly Ser Thr Gln His Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met 325 330 335 Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Asn Pro Cys Ile Phe 340 345 350 Tyr Asp His Phe Phe Asp Trp Gly Leu Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu 355 360 365 Val Ser Ile Arg Asn Arg Gln Gly Ile His Pro Ala Ser Glu Leu Arg 370 375 380 Ile Met Glu Ala Asp Ser Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Ile Asp Gly Lys 385 390 395 400 Val Ile Thr Lys Ile Gly Pro Arg Tyr Asp Val Glu His Leu Ile Pro 405 410 415 Glu Gly Phe Gln Val Val Ala His Gly Asp Gly Tyr Ala Ile Trp Glu 420 425 430 Lys Ile <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> basic amino acid region of HA gene <400> 17 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated HA cleavage site <400> 18 Arg Glu Thr Arg 1

Claims (25)

  1. SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원이, SEQ ID NO: 18 에서 제시된 서열을 포함하는 변이된 HA 절단 부위를 포함하는 조성물.
  3. SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물로서, 상기 조류 인플루엔자 항원이 개구리밥에서 발현되는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원이 정제된 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원이 조류 H5N1 폴리펩티드인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, H5N1 폴리펩티드가 헤마글루티닌 폴리펩티드인 조성물.
  8. 제 3 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원이 SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원이 SEQ ID NO: 1 에서 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트, 또는 비히클이 유중수 에멀전 또는 수중유 에멀전인 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 조성물의 1 회 이상의 투여를 포함하는, 조류 인플루엔자에 감수성인 동물의 예방접종 방법으로서, 상기 동물이 조류, 말류, 개류, 고양이류 또는 돼지류인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 방법이 프라임-부스트 투여 요법을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 프라임-부스트 요법이,
    SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물의 프라임-투여, 및
    조류 인플루엔자 항원, 그의 조각을 생체내에서 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스성 벡터를 제약적으로 또는 수의적 허용가능한 비히클 또는 부형제 내에 포함하는 조성물의 부스트 투여를 포함하여,
    대상을 인플루엔자로부터 보호하고/거나 감염된 대상에서 질환 진행을 방지하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 프라임-부스트 요법이,
    조류 인플루엔자 항원, 조류 인플루엔자 폴리펩티드의 조각, 또는 그의 혼합물을 생체내에서 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스성 벡터를 제약적으로 또는 수의적 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제 내에 포함하는 조성물의 프라임-투여, 및
    SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물의 부스트 투여를 포함하여,
    대상을 인플루엔자로부터 보호하고/거나 감염된 대상에서 질환 진행을 방지하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 프라임-부스트 요법이,
    SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물의 프라임-투여, 및
    조류 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 또는 비활성화된 바이러스성 조성물의 부스트 투여를 포함하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 프라임-부스트 요법이,
    조류 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 또는 비활성화된 바이러스성 조성물의 프라임-투여, 및
    SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원 및 제약적 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물의 부스트 투여를 포함하여,
    대상을 인플루엔자로부터 보호하고/거나 감염된 대상에서 질환 진행을 방지하는 방법.
  17. 삭제
  18. 제 3 항에 따른 조성물에 포함되는, 정제된 조류 인플루엔자 항원으로서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원.
  19. 삭제
  20. 적어도 2 개의 바이알을 포함하는 프라임-부스트 예방접종을 위한 키트로서, 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 재조합 바이러스성 벡터를 포함하는 조성물 또는 비활성화된 바이러스성 조성물을 포함하는 조성물을 포함하는 부스트-예방접종을 위한 조성물을 함유하는 제 2 바이알을 포함하는 키트.
  21. 조류 인플루엔자 항원 또는 그의 조각을 발현시키기 위한 유전자에 의해 안정하게 형질전환된 개구리밥 식물로서, 상기 조류 인플루엔자 항원이 SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 개구리밥 식물.
  22. 삭제
  23. 하기 단계를 포함하는 조류 인플루엔자 항원의 제조 방법으로서,
    (a) 조류 인플루엔자 항원의 분비를 안내하는 신호 펩티드에 대한 작동적으로 연결된 코딩 서열 및 조류 인플루엔자 항원을 인코딩하는 DNA 조각을 포함하는 플라스미드에 의해 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물을 형질전환하는 단계;
    (b) 배양 배지에서 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물을 배양하고, 여기서 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물이 안정하게 형질전환되어, 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 단계; 및
    (c) 조류 인플루엔자 항원을 수집하는 단계,
    상기 조류 인플루엔자 항원이 SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 방법.
  24. SEQ ID NO: 2 에서 제시된 서열을 포함하는 조류 인플루엔자 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물 형질전환용 플라스미드.
  25. 삭제
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