KR101702076B1 - 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체 및 그를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 안정성 및 피부흡수가 증가하고 체내에서 가수분해되어 비타민D를 공급할 수 있어, 주름개선 및 노화방지용 화장료 조성물, 약제학적 조성물, 건강기능식품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체 {7-Dehydrocholesterol derivatives conjugated with fatty acid}

본 발명은 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 안정성 및 피부흡수가 증가하고, 체내에서 가수분해되어 비타민D를 공급하는 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체 및 그를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 조성물에 관한 것이다.

비타민D의 주요 형태로는 비타민D₂(에르고칼시페롤)와 비타민D₃(콜레칼시페롤, 화합물 II)가 있으며, 이 두 물질은 간과 콩팥에서 대사를 거치면서 활성형(칼시트리올, 화합물 III)으로 전환되게 된다. 7-데하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol: 7-DHC, 화합물 I)은 비타민D₃의 프로비타민(provitamin) 형태로, 햇빛에 의해 비타민 D₃로 전환된다.

I II III

비타민D₃는 일반적으로 칼슘 흡수를 자극하여 뼈의 밀도를 강화시키는 작용으로 골다공증 환자의 치료제로 사용되고 있고, 노인이나 일조량이 부족한 북위도 지역의 거주자들에 대한 보충제로 사용되고 있다.

비타민D의 전구물질로 알려진 7-데하이드로콜레스테롤은 강력한 주름개선 기능과 항산화 효능 및 자외선 방어효과를 가지고 있어 기능성화장품의 소재로서 활용되고 있다[참조: 대한민국 공개특허 제2001-0002281호]. 또한 미국 공개특허 제2013-0017234호에서는 뼈의 생성과 관련 있는 Col-1, ALP, OSX, OC, BMP-2, IL-5 등의 인자들을 발현시켜 관절치료 의약품으로 가능성을 보여준 바 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0568600호에는 임상실험을 통하여 모발 보호 효과 또한 뛰어나다고 보고되어 있다.

따라서 표피층에 지속적으로 7-데하이드로콜레스테롤을 보충하여 줌으로써 주름개선 및 자외선 흡수차단은 물론, 콜레칼시페롤의 생산을 증가시켜 골다공증의 예방과 이상각질로 인한 건선 및 아토피성 피부염과 같은 피부질환을 예방할 수 있는 기능이 기대된다.

그러나 7-데하이드로콜레스테롤은 피부 외에서는 매우 불안정하여 빛에 의해 여러 물질로 전환되며, 상기 변환체들은 부작용은 없으나 비타민D₃로의 전환이 매우 어렵게 된다. 또한 피부 이외의 장소에서는 7-데하이드로콜레스테롤이 피로칼시페롤이나 루미스테롤, 이소피로칼시페롤로 전환되어 활성이 떨어지는 문제점이 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 미국 특허 제5,342,833호에는 콜레칼시페롤 유도체를 사용하여 피부질환과 건선치료에 사용한 예를 보이고 있으며, 미국 특허 제5,747,478호에는 산화마그네슘과 소듐시트레이트를 사용하여 활성화된 콜레칼시페롤을 안정화시킨 예를 보이고 있다.

하지만 7-데하이드로콜레스테롤에 대한 안정화 연구는 매우 미진한 편이며, 이러한 이유는 7-데하이드로콜레스테롤이 자외선과 온도에 의해 쉽게 다른 물질로 전이되고, 공기 중의 산소와 반응하여 변성을 나타내는 구조적인 단점을 가지고 있기 때문이다.

또한 위에서 살펴본 바와 같이, 기존 특허는 제형적으로 7-데하이드로콜레스테롤의 안정화에 관한 내용만 있거나, 활성형인 콜레칼시페롤에 관한 연구만 보고되어 있으며, 7-데하이드로콜레스테롤을 합성적으로 안정화시킨 예는 보고되어 있지 않다.

대한민국 공개특허 제2001-0002281호 미국 공개특허 제2013-0017234호 대한민국 등록특허 제10-0568600호 미국 특허 제5,342,833호 미국 특허 제5,747,478호

본 발명자들은 상기한 7-데하이드로콜레스테롤의 문제점인 화학적인 불안정성, 자외선, 온도 및 공기와의 접촉에 의한 불안정성 문제를 개선하기 위해 예의 연구 검토한 결과, 7-데하이드로콜레스테롤을 지방산으로 에스테르화 컨쥬게이션하여 세포 안정성을 증가시키고, 피부 내 세포로의 전달 효과를 증가시키며, 물성개선을 통한 효능의 증대를 유도함으로써, 장기 보관에도 안정성을 유지하고, 피부흡수율이 크게 향상됨을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 안정성이 향상된 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 식에서,

R은 지방산에서 카르복시기를 제외한 부분이다.

본 발명의 일 실시형태에서, R은 C₃-C₂₇의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬, 특히 C₁₁-C₁₇의 포화 탄화수소 사슬, 또는 1 내지 6개의 이중결합을 가지는 C₁₅-C₂₁의 불포화 탄화수소 사슬일 수 있다. 구체적으로 R은 팔미틱애씨드(Palmitic acid), 라우릭애씨드(Lauric acid), 리노레익애씨드(Linoleic acid), 리노레닉애씨드(Linolenic acid) 또는 올레익애씨드(Oleic acid) 유래의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 하기 반응식 1에 나타낸 방법에 따라 제조될 수 있다. 하기 반응식에 기재된 방법은 본 발명에서 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위조작의 순서, 반응시약, 반응조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.

[반응식 1]

상기 식에서,

R은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 7-데하이드로콜레스테롤을 축합제와 유기염기의 존재 하에 포화 또는 불포화 지방산과 축합반응시켜 제조할 수 있다.

또는, 7-데하이드로콜레스테롤을 포화 또는 불포화 지방산의 애씨드클로라이드와 축합제를 사용하지 않고 유기염기의 존재 하에 축합반응시켜 제조할 수도 있다.

상기 축합제로는 N,N,N'N'-테트라메틸-(벤조트리아졸-1-일)-우로니움테트라플루오로보레이트(TBTU), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카보디이미드(EDC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 유기염기로는 트리에틸아민(TEA), 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 피리딘(Pyridine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

반응용매로는 유기용매, 예를 들어 디클로로메탄(DCM), 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로푸란(THF) 및 디메틸포름아미드(DMF) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 반응은 냉각 내지 가온된 상태에서 진행될 수 있다.

상기 7-데하이드로콜레스테롤과 포화 지방산의 축합반응에 있어서 포화 지방산은 7-데하이드로콜레스테롤 기준으로 0.8 내지 3 당량 사용하는 것이 바람직하고, 축합제는 1 내지 3 당량, 유기염기는 1 내지 2 당량 사용하는 것이 바람직하다. 애씨드클로라이드는 7-데하이드로콜레스테롤 기준으로 0.8 내지 2 당량 사용하고, 유기염기는 2 내지 5 당량 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 7-데하이드로콜레스테롤과 불포화 지방산의 축합반응에 있어서 불포화 지방산은 7-데하이드로콜레스테롤 기준으로 0.8 내지 3 당량 사용하는 것이 바람직하고, 축합제는 1 내지 3 당량, 유기염기는 0.9 내지 2 당량 사용하는 것이 바람직하다. 애씨드클로라이드는 7-데하이드로콜레스테롤 기준으로 0.8 내지 3 당량 사용하고, 유기염기는 0.9 내지 5 당량 사용하는 것이 바람직하다.

상기 포화 또는 불포화 지방산의 애씨드클로라이드는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 제조하거나, 상업적으로 입수할 수 있다. 구체적으로, 지방산 카르보닐기에 클로라이드를 치환하는 반응은 무수 유기용매 하에서 필요에 따라 유기아민 촉매를 사용하여 지방산을 티오닐클로라이드(Thionylchloride) 및 옥살릴클로라이드(Oxalylchloride) 중 하나와 반응시켜 수행할 수 있다. 상기 티오닐클로라이드 또는 옥살릴클로라이드는 지방산 기준으로 1 내지 5 당량 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1 의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 7-데하이드로콜레스테롤과 비교하여 빛과 열에 대한 안정성이 현저하게 개선되었으며, 피부 흡수율이 증가되었다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 체내에서 가수분해되어 비타민 D 전구체인 7-데하이드로콜레스테롤을 공급할 수 있는 비타민 D 전구체의 공급원으로서, 주름개선 및 노화방지용 화장료 조성물, 약제학적 조성물 및 건강기능식품에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 유효성분으로서 약 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%로 포함한다. 유효성분의 함량은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로서 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬 등의 화장품에 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 경피흡수, 직장투여) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사일 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 약 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량%로 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg 당 활성성분 10 내지 200 mg이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선 및 노화방지용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽제 등의 경구형 제제 형태이거나, 캔디, 과자, 껌, 아이스크림, 면류, 빵, 음료 등 일반적인 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 형태에 따라 통상적인 방법으로 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 방향제, 보존제, 계면활성제, 윤활제, 부형제 등 식품학적으로 허용되는 담체를 적절히 사용하여 제조될 수 있다.

상기 건강기능식품의 제조에 있어서 상기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 함량은 건강기능식품의 형태에 따라 다르지만, 약 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 중량%의 농도이다.

본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 안정성이 개선되고, 독성감소 및 피부 흡수력 향상 효과를 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 우수한 비타민 D의 공급원으로서, 주름개선 및 노화방지용 화장료 조성물, 약제학적 조성물, 건강기능식품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체는 생체 내 pH 조건에서 가수분해되어 활성 비타민 D의 전구체를 서서히 방출하거나, 비타민 D 전구체의 체내 저장형태의 화합물로 항산화, 주름개선 등의 생리활성을 지속적으로 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 45^oC 온도 가혹조건에 대한 안정성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 빛(solar) 가혹조건에 대한 안정성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 세포독성시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 콜라겐 발현시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 MMP-1 저해시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 트로포엘라스틴 발현시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체의 피부흡수 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체에 피부흡수 증강제를 함께 사용한 피부흡수 시험결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1: 데하이드로콜레스테릴팔미테이트(Dehydrocholesteryl palmitate)의 제조

실시예 1-1:

7-데하이드로콜레스테롤(7-DHC) 7.1 g(0.0185 mol)을 디클로로메탄 90 ml에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘 4.5 g(0.0369 mol)을 가한 용액에 팔미틱클로라이드(Palmitoyl chloride) 4.8 g(0.0175 mol)을 디클로로메탄 30 ml에 용해시킨 용액을 천천히 가한 후 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 300 ml로 결정화하여 데하이드로콜레스테릴팔미테이트 8.7 g(79.8%)을 얻었다.

실시예 1-2:

7-데하이드로콜레스테롤 385.0 mg(1.0 mmol)을 디클로로메탄 10 ml에 용해한 용액에 4-디메틸아미노피리딘 183.0 mg(1.5 mmol)과 팔미틱애씨드(Palmitic acid) 256 mg(1.0 mmol)를 가한 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카르보디이미드 384.0 mg(2.0 mmol)을 가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화나트륨 수용액으로 순차적으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 : 헥산 = 1 : 50의 조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 데하이드로콜레스테릴팔미테이트 436.2 mg(70.0%)을 얻었다.

¹H NMR 400 MHz(CDCl₃) δ 5.58(dd, 1H), 5.40(m, 1H), 4.73(m, 1H), 2.51(dd, 1H), 2.38(t, 1H), 2.29(t, 2H), 2.11(dt, 1H), 2.01(t, 1H), 1.92(m, 4H), 1.79-1.50(m, 8H), 1.45-1.02(m, 11H), 1.27(s, 24H), 0.97(s, 3H), 0.95(t, 3H), 0.89(d, 3H), 0.88(d, 3H), 0.63(s, 3H)

실시예 2: 데하이드로콜레스테릴리놀레네이트(Dehydrocholesteryl linolenate)의 제조

7-데하이드로콜레스테롤(7-DHC) 500 mg(1.30 mmol)을 디클로로메탄 15 ml에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘 369.1 mg(1.23 mmol)을 가한 용액에 리노레닉클로라이드(Linolenic chloride) 0.61 g(2.79 mmol)을 디클로로메탄 10 ml에 용해시킨 용액을 천천히 가한 후 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 : 헥산 = 1 : 50의 조건으로 실리카겔컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 데하이드로콜레스테릴리놀레네이트 420 mg(50 %)을 얻었다.

¹H NMR 400 MHz(CDCl₃) δ 5.59(dd, 1H), 5.38(m, 5H), 4.73(m, 1H), 2.80(t, 2H), 2.51(dd, 1H), 2.37(t, 1H), 2.30(t, 2H), 2.06(q, 4H), 2.15-1.88(m, 6H), 1.78-1.50(m, 8H), 1.46-1.01(m, 11H), 1.32(s, 14H), 0.97(s, 3H), 0.95(t, 3H), 0.89(d, 3H), 0.88(d, 3H), 0.64(s, 3H)

실시예 3: 데하이드로콜레스테릴라우레이트(Dehydrocholesteryl laurate)의 제조

실시예 3-1:

7-데하이드로콜레스테롤(7-DHC) 1.13 g(2.94 mmol)을 디클로로메탄 25 ml에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘 0.72 g(5.88 mmol)을 가한 용액에 라우릭클로라이드(Lauroyl chloride) 0.61 g(2.79 mmol)을 디클로로메탄 10 ml에 용해한 용액을 천천히 가한 후 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 50 ml로 결정화하여 데하이드로콜레스테릴라우레이트 0.53 g(31.2%)을 얻었다.

실시예 3-2:

7-데하이드로콜레스테롤 641.7 mg(1.67 mmol)을 디클로로메탄 10 ml에 용해한 용액에 4-디메틸아미노피리딘 305.7 mg(2.50 mmol)과 라우릭애씨드(Lauric acid) 334.2 mg(1.67 mmol)을 가한 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카르보디이미드 639.6 mg(3.34 mmol)을 가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화나트륨 수용액으로 순차적으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 : 헥산 = 1 : 30의 조건으로 실리카겔컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 데하이드로콜레스테릴라우레이트 633.7 mg(67.0%)을 얻었다.

¹H NMR 400 MHz(CDCl₃) δ 5.59(dd, 1H), 5.40(m, 1H), 4.73(m, 1H), 2.50(dd, 1H), 2.37(t, 1H), 2.30(t, 2H), 2.09(dt, 1H), 2.01(t, 1H), 1.91(m, 4H), 1.77-1.50(m, 8H), 1.43-1.02(m, 11H), 1.26(s, 16H), 0.97(s, 3H), 0.95(t, 3H), 0.89(d, 3H), 0.88(d, 3H), 0.64(s, 3H)

실시예 4: 데하이드로콜레스테릴리놀레이트(Dehydrocholesteryl Linoleate)의 제조

7-데하이드로콜레스테롤 629.9 mg(1.64 mmol)을 디클로로메탄 10 ml에 용해한 용액에 4-디메틸아미노피리딘 300.1 mg(2.46 mmol)과 리노레익애씨드(Linoleic acid) 414.5 mg(1.49 mmol)를 가한 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카르보디이미드 570.8 mg(2.98 mmol)을 가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화나트륨 수용액으로 순차적으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 : 헥산 = 1 : 50의 조건으로 실리카겔컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 데하이드로콜레스테릴리놀레이트 646 mg(61 %)을 얻었다.

¹H NMR 400 MHz(CDCl₃) δ 5.58(dd, 1H), 5.40(m, 7H), 4.73(m, 1H), 2.83(t, 4H), 2.51(dd, 1H), 2.37(t, 1H), 2.27(t, 2H), 2.07(q, 4H), 2.15-1.89(m, 6H), 1.78-1.50(m, 8H), 1.45-1.01(m, 11H), 1.33(s, 8H), 1.00(t, 3H), 0.98(s, 3H), 0.89(d, 3H), 0.88(d, 3H), 0.64(s, 3H)

실시예 5: 데하이드로콜레스테릴올레이트(Dehydrocholesteryl oleate)의 제조

7-데하이드로콜레스테롤 835.0 mg(2.17 mmol)을 디클로로메탄 25 ml에 용해한 용액에 4-디메틸아미노피리딘 397.8 mg(3.26 mmol)과 올레익애씨드(Oleic acid) 511.0 mg(1.81 mmol)를 가한 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카르보디이미드 693.6 mg(3.62 mmol)을 가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 1.0 N 염산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화나트륨 수용액으로 순차적으로 세척하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 처리한 후 여과하여 감압 농축하고, 얻은 혼합물을 에틸아세테이트 : 헥산 = 1 : 50의 조건으로 실리카겔컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 데하이드로콜레스테릴올레이트 761 g(64 %)을 얻었다.

¹H NMR 400 MHz(CDCl₃) δ 5.59(dd, 1H), 5.40(m, 1H), 5.36(m, 2H), 4.73(m, 1H), 2.80(t, 2H), 2.51(dd, 1H), 2.37(t, 1H), 2.30(t, 2H), 2.13-1.88(m, 10H), 1.78-1.50(m, 8H), 1.46-1.01(m, 11H), 1.28(d, 20H), 0.97(s, 3H), 0.95(t, 3H), 0.89(d, 3H), 0.88(d, 3H), 0.64(s, 3H)

실험예 1: 열 안정성 시험

상기 실시예 1 의 화합물을 분말형태로 5 mg 갈색 병에 소분하여 시험물질을 준비하고, 비교물질로 7-데하이드로콜레스테롤을 분말형태로 5mg 소분하여 시험물질과 동일한 방법으로 준비하였다. 준비된 시험 분말은 빛을 차단하고 가혹조건인 45 ℃ 항온에 방치하고, 일정 시간에 회수하여 헥산으로 용해하여 분석액 농도를 1 mg/ml로 하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

HPLC의 분석 조건은 다음과 같다.

분석기기명: Agilent HPLC 1260

컬럼: C18 (150 x 4.6 mm/5 um)

전개용매: 메탄올/헥산(0.5% Dioxane)= 6/4

컬럼 온도: 실온

파장: 280 nm

유속: 1.2 ml/분

주입량: 20 μl

도 1에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 데하이드로콜레스테릴팔미테이트는 7-데하이드로콜레스테롤보다 열에 대한 안정성이 우수함을 확인하였다.

실험예 2: 빛 안정성 시험

상기 실시예 1의 화합물을 분말형태로 5 mg 투명한 병에 소분하여 시험물질을 준비하고, 비교물질로 7-데하이드로콜레스테롤을 분말형태로 5mg 소분하여 시험물질과 동일한 방법으로 준비하였다. 준비된 시험 분말은 실온에서 빛을 조사하고, 일정 시간에 회수하여 헥산으로 용해하여 분석액 농도를 1 mg/ml로 하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

HPLC의 분석 조건은 다음과 같다.

분석기기명: Agilent HPLC 1260

컬럼: C18 (150 x 4.6 mm/5 um)

전개용매: 메탄올/헥산(0.5% Dioxane)= 6/4

컬럼 온도: 실온

파장: 280 nm

유속: 1.2 ml/분

도 2에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 데하이드로콜레스테릴팔미테이트는 7-데하이드로콜레스테롤보다 빛에 대한 안정성이 우수함을 확인하였다.

실험예 3: 세포독성 시험

사람섬유아세포(Human fibroblast)인 CCD-986SK를 T-플라스크 바닥에 접종한 후, 페니실린 (100 IU/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS를 함유하는 배양배지를 넣고, 37 ℃, 5% CO₂(g)를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

상기 실시예 1 내지 5에서 수득한 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체들과 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤을 각각 DMSO로 용해 후 희석하여 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM의 농도로 준비하였다.

사람섬유아세포인 CCD-986SK 세포를 96 웰 플레이트에 분주한 다음, 세포 배양조건에서 18시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 준비된 시료 및 새로운 배지를 넣고 18시간 동안 배양하였다. MTT 분석법을 수행하여 세포 생존율(%)을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다.

농도(μM)	7-DHC	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
6.25	110.47 ±0.884	120.76 ±0.024	161.94 ±0.547	112.49 ±0.001	115.86 ±0.073	170.71 ±0.521
12.5	124.78 ±0.928	124.48 ±0.199	179.86 ±0.067	143.24 ±0.808	107.51 ±0.401	165.48 ±0.594
25	114.45 ±0.366	134.97 ±0.241	157.00 ±0.072	134.74 ±0.481	108.41 ±0.222	147.94 ±0.115
50	103.75 ±0.042	128.22 ±0.820	160.05 ±0.184	102.12 ±0.312	102.78 ±0.092	197.71 ±0.239

상기 표 1 및 도 3에서 보듯이, 실시예 1 내지 실시예 5에서 수득한 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체들은 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤보다 전반적으로 우수한 독성감소 효과를 나타내었다.

실험예 4: 유전자 발현 확인 시험

상기 실시예 1 내지 5에서 수득한 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체들과 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤을 각각 DMSO로 용해 후 희석하여 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 의 농도로 CCD-986SK 세포에 처리하여 48 시간 배양 한 뒤, RNA를 추출하여 RT-PCR를 수행하고 Gel Documentation System과 Image J 프로그램을 이용하여 증폭된 유전자를 분석하여 콜라겐(Collagen) 및 트로포엘라스틴(Tropoelastin)의 발현율(%) 및 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 저해율(%)을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

	농도(uM)	콜라겐 발현율(%)	MMP-1 저해율(%)	트로포엘라스틴 발현율(%)
대조군		100.00	100.00	100.00
7- DHC	3.125	114.03	87.58	114.03
	6.25	115.93	92.91	115.93
	12.5	117.18	74.74	117.18
	25	120.16	58.92	120.16
실시예 1	3.125	112.74	89.52	125.85
	6.25	114.47	85.52	126.65
	12.5	112.41	84.74	128.69
	25	106.61	83.56	134.74
실시예 2	3.125	90.56	91.77	109.41
	6.25	96.32	88.26	101.37
	12.5	95.01	92.81	107.23
	25	97.71	92.51	107.71
실시예 3	3.125	105.64	89.32	91.98
	6.25	104.42	92.50	106.26
	12.5	101.79	96.68	126.33
	25	97.22	102.16	138.34
실시예 4	3.125	98.75	93.92	104.54
	6.25	100.28	101.26	113.76
	12.5	100.24	101.06	107.34
	25	103.81	103.26	126.94
실시예 5	3.125	100.07	109.08	121.60
	6.25	97.12	72.14	102.89
	12.5	105.41	77.98	126.81
	25	114.93	74.04	123.61

상기 표 2 및 도 4 내지 도 6으로부터, 실시예 1 내지 실시예 5에서 수득한 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체들은 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤과 대등한 정도의 콜라겐 발현율, MMP-1 저해율 및 피부탄력 효능을 위한 트로포엘라스틴 발현율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 피부 흡수 시험

피그(pig) 피부를 경피흡수장치(Franz diffusion cell)에 장착하여 피부투과 시험을 진행하였다. 경피흡수장치의 리셉터(Receptor) 용기(7 ml)에 50% 에탄올/물 용액을 넣고, 적출한 피부의 각질부분이 위로 향하도록 도너(donor)와 리셉터(receptor) 사이에 피부를 고정시켰다. 리셉터 페이스(Receptor phase)와 접촉하는 경 표피의 면적은 0.6262 cm²이고, 항온순환기를 이용하여 온도를 32 ℃로 유지하며 150 rpm의 속도로 교반하였다.

실시예 1의 화합물과 실시예 2의 화합물을 50% 에탄올/물에 5 mg/ml의 농도로 하여 시험용액 1과 시험용액 2를 제조하고, 폴리옥시에틸렌(20) 올레일에테르(polyoxyethylene(20) oleyl ether [BrijTM98])를 6% 함유한 50% 에탄올/물에 실시예 1과 실시예 2의 화합물을 5 mg/ml의 농도로 하여 시험용액 3과 시험용액 4를 제조하였다.

비교물질로 7-데하이드로콜레스테롤을 50% 에탄올/물에 5 mg/ml의 농도로 하여 비교용액 1을 제조하고, 폴리옥시에틸렌(20) 올레일에테르(polyoxyethylene(20) oleyl ether [BrijTM98])를 6% 함유한 50% 에탄올/물에 7-데하이드로콜레스테롤을 5 mg/ml의 농도로 하여 비교용액 2를 제조하였다.

각각의 시료 2.5 ml을 도너(donor)의 피부표면에 가한 후 2 시간 간격으로 매회 0.6 ml의 리셉터 페이스(receptor phase)를 샘플링 포트(sampling port)를 통해 채취하고, 즉시 동일한 양의 리셉터 용액(receptor solution)으로 보충하였다. 채취한 시료는 HPLC로 실시예 1의 화합물과 실시예 2의 화합물을 포함하여 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤을 각각 정량분석하였다.

마지막 시간 시료를 채취한 후 경 표피에 남아있는 실시예 1의 화합물과 실시예 2의 화합물을 포함하여 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤을 확인하기 위해 우선 경피흡수장치에서 분리하여 50% 에탄올/물로 2회 세척하고, 리셉터 페이스(receptor phase)와 닿은 부위만 잘라내 세절하여 1.0 ml의 디클로로메탄을 넣고 5분간 흔든 후 60분 동안 초음파처리(Ultrasonication)하여 혼합하였다. 원심분리하여 하층부를 취해 HPLC로 정량하였다. 그 결과를 도 7과 도 8에 나타내었다.

HPLC의 분석 조건은 다음과 같다.

분석기기명: Agilent HPLC 1260

컬럼: C18 (150 x 4.6 mm/5 um)

전개용매: 메탄올/헥산(0.5% Dioxane)= 6/4

컬럼 온도: 실온

파장: 280 nm

유속: 1.2 ml/분

도 7에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 데하이드로콜레스테릴팔미테이트는 비교물질인 7-데하이드로콜레스테롤보다 피부 흡수율이 현저히 우수함을 확인하였다. 또한 도 8에서 보듯이, 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체들은 피부흡수 증강제(PE)를 함께 사용할 경우, 피부 흡수율이 현저히 증가됨을 알 수 있었다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선용 화장료 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 식에서,
   R은 지방산에서 카르복시기를 제외한 부분이다.
2. 제1항에 있어서,
   R은 C₃-C₂₇의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬인 주름개선용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   R은 C₁₁-C₁₇의 포화 탄화수소 사슬, 또는 1 내지 6개의 이중결합을 가지는 C₁₅-C₂₁의 불포화 탄화수소 사슬인 주름개선용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   R은 팔미틱애씨드(Palmitic acid), 라우릭애씨드(Lauric acid), 리노레익애씨드(Linoleic acid), 리노레닉애씨드(Linolenic acid) 또는 올레익애씨드(Oleic acid) 유래의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬인 주름개선용 화장료 조성물.
   
5. 삭제
6. 하기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선용 약제학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 식에서,
   R은 지방산에서 카르복시기를 제외한 부분이다.
7. 하기 화학식 1의 지방산 컨쥬게이션된 7-데하이드로콜레스테롤 유도체를 포함하는 주름개선용 건강기능식품:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 식에서,
   R은 지방산에서 카르복시기를 제외한 부분이다.

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