KR101696285B1 - 변색이 감소된 식물을 동정하는 방법, 그에 따라 동정한 식물, 및 변색이 감소된 상업적 작물을 생산하기 위한 상기 동정된 식물의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대조군 식물이나 식물의 일부분에 비해, 손상-유발성 표면 변색이 감소되거나 변색이 없는 식물 또는 식물의 일부분을 테스트하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유전자 변이를 보이는 식물 집단, 특히 유전자은행으로부터 수득되는 식물 또는 식물의 일부분을 제공하는 단계; 선택적으로, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 손상 표면을 만드는 단계; 상기 식물 또는 식물의 일부분, 또는 거기에 만들어진 손상 표면을 인큐베이션하여, 그 내부 또는 그 위에 변색이 발생되도록 하는 단계; 상기 식물 또는 식물의 일부분의 내부 또는 그 위에서 변색을 관찰하는 단계; 관찰된 변색을 대조군 식물이나 식물의 일부분에서 관찰되는 변색과 비교하여, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되는 지를 평가하는 단계; 및 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소된 식물을, 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 지닌 식물로 동정하는 단계를 포함한다.

Description

변색이 감소된 식물을 동정하는 방법, 그에 따라 동정한 식물, 및 변색이 감소된 상업적 작물을 생산하기 위한 상기 동정된 식물의 용도{METHOD FOR IDENTIFYING PLANT MATERIAL THAT SHOWS A REDUCED DISCOLOURATION, PLANTS THUS IDENTIFIED AND USE OF THE IDENTIFIED PLANTS FOR THE PRODUCTION OF COMMERCIAL CROP PLANTS SHOWING A REDUCED DISCOLOURATION}

본 발명은 대조군 식물에 비해 변색, 특히 손상-유발성 표면 변색이 감소된 물질의 존재에 대해 식물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 동정된 식물, 육종에 있어서의 이의 용도 및 그로부터 수득되는 식물에 관한 것이다.

제품의 수확과 후속적인 가공, 포장 및 저장은 일반적으로 최종 제품의 품질의 급격한 저하를 초래하는 식물의 강력한 반응을 불러일으킨다. 이러한 측면에서 품질은 소비자가 신선한 것으로 인식하는 색, 맛, 향, 신선함(crispness)과 같은 여러가지 특성을 의미한다.

가공에서의 제품의 반응은 시듦, 변색 및 노화를 유발하는 물리적, 생화학적 및 생리학적으로 조합된 성질의 것일 수 있다. 가공 제품의 품질을 향상하기 위해, 가공의 결과로 변색되는 정도가 약한 식물 품종의 개발이 점점 더 중요하게 되었다.

상추는 현재 가공된 형태, 즉 절단형, 세정형, 포장된 형태로 소비자에게 공급되는 비중이 증가하고 있는 신선 제품들 중 하나이다. 이러한 바로 먹을 수 있는 제품은 소비자에게도 편리하지만, 여러가지 엽채나 다른 타입의 식물의 믹스와 같은 새로운 제품 개발도 가능하게 한다.

상추 가공과 저장 중에 발생하는 가장 중요한 문제점은 손상 표면의 변색이다. 이러한 변색은 잘려진 잎의 손상 표면에 분홍색 또는 갈색으로의 변색으로 나타난다. 특히, 주맥 절단은 이런 점에 있어서 심한 얼룩을 나타낼 수 있다. 소비자는 분홍 또는 갈색 변색이 있는 포장된 상추를 품질이 나쁜 제품으로 인지하기 때문에, 이러한 부정적인 품질 관련 형질은 가공 중에 컨트롤되어야 하는 가장 중요한 형질이다.

수확 이후에, 조절된 대기하에서의 포장과 같은 처리로, 변색을 방지하고, 신선편이(fresh cut), 포장 상추의 품질을 개선시킴에도 불구하고, 유전자적 해법이 바람직하다. 그 이유는, 이러한 처리에도 불구하고, 제품의 상당량이 손상된 포장과 같은 원인으로 인해 여전히 폐기되고 있다. 또한, 최종 사용자가 포장을 개봉한 후의 유통 기한이 매우 짧다. 그리고, 상당한 비용이 든다는 것도 중요하다.

따라서, 개선된 가공 형질, 특히 표면 변색이 감소된 형질을 보이는 상추 식물의 육종이 상추 가공 산업에서 매우 중요하다. 또한 이는 위틀로프(witloof) 및 가지(eggplant)와 같은 다른 식물의 가공에도 적용된다.

이에, 본 발명은 수확 후 품질 저하가 쉽게 일어나지 않는 작물의 생산을 위해, 표면 변색이 감소된 식물을 신속하고 효율적으로 동정하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개요

손상-유발성 변색 과정은 병원체, 해충 또는 물리적 요인(바람, 비, 가뭄, 냉한, 열 등)에 의해 야기되는 표면 손상을 통해, 식물이 손상에 대해 스스로를 방어하는 수단이다. 따라서, 손상-유발성 변색의 자연 변이는 자연 선택으로 인해 사라질 것으로 예상된다. 외부 공격에 대해 스스로를 방어할 수 없는 식물은 보다 약하므로, 이러한 위협에서 생존할 가능성은 보다 낮아진다.

그럼에도 불구하고, 유전자은행 물질이 변색, 특히 손상-유발성 변색에 있어서 상당한 변이를 포함하고 있다는 것이 본 발명에서 놀랍게도 확인되었다. 본 발명자들은 대조군 식물이나 식물의 일부분에 비해, 변색이 감소되었거나 없는 식물 또는 식물의 일부분을 테스트하는 방법에 의해 이를 입증할 수 있었는데, 상기 방법은

a) 유전자 변이를 보이는 식물 집단, 특히 유전자은행으로부터 수득한 식물 또는 식물의 일부분을 제공하는 단계;

b) 선택적으로, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 손상 표면을 만드는 단계;

c) 상기 식물 또는 식물의 일부분, 또는 거기에 만들어진 손상 표면을 인큐베이션하여, 그 내부에 또는 그 위에 변색이 발생하도록 하는 단계;

d) 상기 식물 또는 식물의 일부분의 내부 또는 그 위에서 변색을 관찰하는 단계;

e) 관찰된 변색을 대조군 식물이나 식물의 일부분에서 관찰되는 변색과 비교하여, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되었는 지를 평가하는 단계; 및

f) 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소된 식물을, 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 지닌 식물로 동정하는 단계를 포함한다.

이러한 방법에서, 변색은 내인성 물질이 변환된 결과이다. 상기 변색은 얼마간의 시간 동안 특정 환경에서 식물 또는 식물의 일부분을 인큐베이션하면 자발적으로 나타날 것이다. 이러한 경우의 변색은 손상-유발성 변색이다. 본 발명은 특히 자연적으로 이루어지는 효소에 의한 분홍 변색 및 갈변 반응에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 이러한 반응을 보이지 않거나 대조군에 비해 그 반응이 감소된 식물을 동정하고자 의도한 것이다.

다른 예로, 변색에 있어서의 변이는, 하기 단계들을 포함하는 식물 또는 식물의 일부분을 변색을 나타내지 않거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되었는지를 테스트하는 방법을 이용하여 검출할 수 있다:

a) 유전자 변이를 보이는 식물 집단, 특히 유전자 은행으로부터 식물 또는 식물 일부분을 제공하는 단계;

b) 상기 식물 또는 식물의 일부분을, 유색 색소로 변환될 수 있는 기질과 인큐베이션하여, 그 내부나 그 위에서 변색이 이루어지도록 하는 단계;

c) 상기 식물 또는 식물의 일부분의 내부 또는 그 위에서 변색을 관찰하는 단계;

d) 관찰된 변색을 대조군 식물이나 식물의 일부분에서 관찰되는 변색과 비교하여, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되었는 지를 평가하는 단계; 및

e) 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소된 식물을, 감소된 변색 형질을 지닌 식물로 동정하는 단계.

상기 두번째 방법에서, 변색은, 식물에서 반응이 이루어지면 볼 수 있게 되는 유색 물질로 변환가능한, 외부에서 투입되는 기질의 변환에 의해 야기된다. 이러한 색 반응은 손상-유발성이거나 아닐 수 있다. 또한, 이러한 반응은 예를 들어 손상되지 않은 종자의 종피(seed coat)에서도 일어난다. 본 발명의 스크리닝 방법은 이러한 반응을 보이지 않거나 대조군에 비해 감소된 반응을 보이는 식물을 동정하기 위한 것이다.

변색이 감소된 형질, 특히 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 가진 적정 식물 물질이 상기한 방법들 중 한가지 방법으로 동정되면, 이러한 식물 물질은 본 발명에 따라 상업 작물에 형질을 도입하는데 이용한다. 이러한 개선된 작물도 본 발명의 일부분이다.

본 발명은 따라서 테스트하는 특정 소스의 식물 물질의 용도를 기초로 한다. 재배한 물질들에서는 변색에 많은 변이가 나타나지 않는다. 반면, 예상하지 못하게도, 수탁물(accession)과 같이 유전자은행에서 확인된 생식질(germ plasm)에는 변색, 특히 손상 표면 유발성 표면 변색에 상당한 변이가 있는 것으로 확인되었다. 하나의 수탁물은 하나의 종의 한가지 표본이며, 위치가 기재되어 있다. 수탁물은 예컨대 유전자 은행이나 라이브러리에 보관된다.

본 발명의 바람직한 예에서, 전술한 변색 분석 방법은 작물 종에서 자연적으로 발생하는 유전자 변이를 스크리닝하기 위한 효과적인 수단으로서 사용된다. 본 발명은 특히, 상추의 생식질을 테스트하는데, 예컨대 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종 뿐만 아니라 락투카 세리올라(Lactuca seriola), 락투카 비로사(Lactuca virosa) 등과 같은 유사 종을 테스트하는데 유용하다.

본 발명은 또한 잎이나 줄기 부분(꽃상추(endive), 위틀로프), 뿌리 또는 덩이 줄기(감자, 고구마, 셀러리(celeriac)), 열매 부분(가지, 사과, 바나나, 아보카도, 복숭아, 서양 배, 살구, 망고), 꽃 또는 꽃 부분(아티초크, 솜나물, 국화) 및 버섯 재배를 위해 작물에 사용할 수 있다.

상추의 변색, 특히 손상-유발성 표면 변색을 검출할 수 있는 다른 분석 방법들, 예컨대 다양한 성숙 단계에서 가공된 상추의 시각적 평가도 잘 이용할 수 있다.

이러한 방법을 이용함으로써, 특히 잎에서 손상-유발성 표면 변색에 있어서 유의적인 변이를 가지고 있는 여러가지 수탁된 락투카 종들을 동정할 수 있다. 본 발명에 기술된 방법으로 동정된, 손상-유발성 변색이 감소되었거나 없는 각각의 식물들은, 이들의 수확 후 가공 특성들, 특히 손상 표면 변색이 개선된 상추 식물을 개발하기 위해, 육종에 사용한다. 이러한 변종은 일용 잡화 식료품 시장에서 특히 유용하다.

또한, 가지의 유전자은행 수탁물 세트를 스크리닝하여 변색 감소를 보이는 수탁물을 확인하였다. 변색이 감소된 가지의 개발에 있어 이들 수탁물들의 용도도 본 발명의 일부분이다.

또한, 본 발명은 손상-유발성 표면 변색 형질의 소스로서 본 발명의 방법을 통해 동정되는 식물의 용도에 관한 것이다. 상기 소스는 이러한 형질을 내재하고 있는 유전자 물질의 공여체로서 또는 통상적인 교배에 모체로서 사용할 수 있다.

발명의 상세한 설명

육종을 통해 손상 표면 변색이 감소된 식물, 궁극적으로 식물 변종의 개발에는, 우선 이러한 형질에 대한 유전자 변이를 동정할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 최초 동정 단계와 추가적으로 이러한 형질을 상업 작물에 도입하는 단계에 관한 것이다. 원하는 형질을 제공하는 1차 모체 식물이 동정되고 나면, 식물 변종을 개발하는 것은 숙련된 육종자들에겐 일반적인 것이다.

손상-유발성 표면 변색은 절단되었을 때나 상처 치유를 목적으로 한 그외 기계적 교란, 그리고 병원체 침입에 대한 식물의 특이적인 방어 반응이다.

손상 반응은 국소 뿐만 아니라 전신 둘다에서 나타나는 물리적 손상에 대한 식물의 복잡한 생물학적 반응이다. 국소 반응은 주로 잘린 표면이나 바로 뒤에 있는 세포의 국소 사멸에 의해 나타나는 상처 표면의 폐쇄(closing)를 목적으로 한다. 많은 식물 종들에서, 상처 표면에 식물체와 환경 사이에 유효하고 새로운 단절 배리어를 만드는, 목질화나 코르크화를 관찰할 수 있다.

또한, 이러한 가시적인 효과 이외에도, 호흡 증가 또는 에틸렌 생산 증가와 같은 다른 반응들이 유도되는 것으로 알려져 있다. 생화학적 수준의 연구에서, 손상은 특히 폴리페놀이나 리그닌 생산에 필요한 페닐프로파노이드 경로를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.

이 경로에 있어 중요한 효소는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL: phenylalanine ammonia lyase)인데, 이 효소는 한가지 이상의 PAL 이소형의 유전자 발현의 유도에 의해, 상처받았을 때 증강된다. 이러한 반응으로 폴리페놀 옥시다제(PPO)에 의해 산화되는 폴리페놀이 만들어진다. PPO는 색소체에 위치하며, 상해를 입으면 분비되어 활성화된다. 폴리페놀의 산화는 고반응성의 퀴논 화합물의 생성을 유도한다. 이들 퀴논 화합물은 분홍색, 갈색 또는 때때로는 검정색으로의 변색을 유도하는 아미노산이나 단백질과 반응할 수 있다.

이러한 반응은 상추에서도 물론 관찰할 수 있다. 자른 상추 잎들을 공기 중에서 플라스틱 백에 보관하는 경우, 잘린 표면에서 손상 부위에 분홍빛이 나타나기 시작해서 장기간 보관하면 점차 갈색으로 바뀐다. 상세한 생화학적 분석을 통해, 이러한 반응에 신규한 폴리페놀 합성이 필요하며, 폴리페놀은 이후에 산화되어 최종적으로 손상 표면에 분홍색이나 갈색의 변색으로 관찰될 수 있는 케스케이드 반응을 유도하는 것으로 확인되었다.

개발되어 현재 상추 가공 산업에 적용되고 있는 수확 후 처리는 이러한 특정 반응을 거스른다. 본 발명은 손상-유발성 변색을 목표로 한 수확 후 처리를 줄이거나 없애기 위해 적용될 수 있는, 이러한 특정 반응을 저지하기 위한 유전자적 방법을 제공한다.

가공 특성이 개선된 작물을 개발하기 위해, 손상된 잘린 작물, 특히 상추의 수확 후 변색을 진단하는 표면 변색의 효과적인 검출을 허용하는 방법을 본 발명에 따라 이용한다.

이러한 방법들은 계류중인 출원 PCT/EP2007/000226 및 PCT/EP2007/000230에 기술되어 있다.

바람직한 예로, 상추 식물의 잎 디스크를 젖은 필터지 사이에 넣고 인큐베이션한다. 인큐베이션 시, 분홍 변색이 나타나는데, 이는 손상-유발성 분홍 및 갈색화로 인한 것으로 진단된다. 따라서, 이러한 방법에 따르면, 손상 표면의 변색이 감소되어 가공 품질이 개선된 유전자 변종의 존재를 확인하기 위해, 유전자 변이가 있는 상추 집단을 매우 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

이러한 개별 식물이 성공적으로 동정되면, 이것을 개선된 상추 식물 육종에 이용하여, 궁극적으로 가공에 특히 유용한 상추 변종을 개발할 수 있다.

손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 지닌 식물을 동정하기 위해, 자연적인 유전자 변이를 조사하였다. 자연적인 유전자 변이는 종의 생식질내에서 발생하며, 생식 세포의 DNA 내에서 복제 및 유지 중의 에러로 인해 나타나는, DNA 일차 구조 상의 변이이다.

이러한 집단내 유전자 다형성(polymorphism) 발생은 해당 유전자 백그라운드에서의 자발적 돌연변이의 적합성 뿐만 아니라 환경에 의한 선택을 통해 결정된다.

상추의 경우, 이러한 자연 변이는 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종 뿐만 아니라 락투카 세리올라(Lactuca serriola), 락투카 살리그나(Lactuca saligna) 또는 락투카 비로사(Lactuca virosa)와 같은 다른 락투카 종에도 존재한다. 본 발명에 따라 동정되는 식물들은 따라서 이러한 종들로 동정될 수 있으며, 손상-유발성 표면 변색이 감소된 상추 식물을 생산하는데 이용할 수 있다. 그 이유는, 자연적인 종간 교배 배리어가 절대적인 것은 아니며, 필요에 따라 배 배양(embryo rescue)과 같은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있는 기법들로 극복할 수 있기 때문이다.

자연 변이는 유전자 은행과 같은 육종 회사나 기관에 종자 형태로 존재하는 식물 물질들에서 발생한다. 손상 표면 변색이 감소된 변종의 존재를 확인하기 위해, 식물 물질을 정상 조건, 예컨대 온실이나 야외에서 생육시킨다. 묘목 단계에서, 샘플 예컨대 잎 디스크를 각각의 식물로부터 취하여, 전술한 방법들 중 한가지 방법으로 변색 정도를 결정할 수 있다. 손상-유발성 변색이 감소된 상추 또는 다른 작물을 동정하기 위한 이러한 방법은, 작물을 성숙 단계로 키워 수확하고 가공한 다음 가공 품질을 분석하는 방법에 비해 훨씬 더 효율적이다.

또한, 재배한 상추의 근친 야생종(wild relative)은 비교 분석을 덜 분명하게 만드는 완전히 다른 방식으로도 개발할 수 있다. 분홍색 표면 변색을 보이는 잎 디스크 반응은 수확 후 변색의 징후인 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 방법은 상추나 다른 작물의 수확 후 특성의 개선에 이용할 수 있는 생화학적 반응을 기초로 초기 발생 단계에서 식물을 동정할 수 있다.

이러한 방법은 여러가지 식물 유형들의 보다 쉽고 신뢰성있는 비교를 가능하게 한다. 락투카 속의 식물에서 손상-유발성 변색에 대한 유의적인 변이를 관찰할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다.

본 발명에서 확인된 손상-유발성 변색이 없거나 그 수준이 감소된 상추 식물은 가공 산업의 요건에 맞는 변종을 개발하기 위하여 정규 육종 프로그램에 사용할 수 있다. 이러한 육종 프로그램에서, 육종가들은 QTL-맵핑, 마커-보조 선별(marker-assisted selection) 및 역교배와 같은 일반적인 잘 알려져 있는 육종 방법을 이용하여, 손상-유발성 변색 수준 감소를 병원체 및 해충 내성, 추대(bolting) 및 끝마름 등과 같이 재배한 상추의 원하는 다른 특성과 조합할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 손상-유발성 표면 변색이 감소된 식물의 생산방법에 관한 것이다:

a) 손상-유발성 표면 변색이 감소된 제1 모체 식물을 제2 모체 식물과 교배하여 F1 종자를 수득하는 단계;

b) F1 종자로부터 F1 식물을 키운 다음 F1 식물을 자가-수정하여 F2 종자를 수득하는 단계;

c) 손상-유발성 표면 변색 수준이 적어도 제2 모체 식물의 수준 보다 낮은 F2 식물을 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 가진 식물로서 선별하는 단계. 이들 식물과, 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질을 가진 그의 후대는 본 발명의 식물이다.

바람직하기로는, 제2 모체 식물은 농경학적으로 용인가능한 특징들을 가진 배양된 모체 식물, 특히 상추이다.

바람직한 예에 있어서, 제1 모체 식물은 표 2에 열거된 식물들 중에서 선택된다.

제2 모체 식물은 임의의 상추일 수 있지만, 바람직하게는 아이스버그 레티스 실비나스 RZ 등의 재배한 상추이다.

"손상-유발성 형질 변색이 감소된 형질"로 본원에서 언급되는 형질은 실시예 1에 기술된 핑킹 테스트(pinking test)의 점수가 3 미만, 바람직하기로는 2 미만, 가장 바람직하게는 1 미만인 식물에 존재한다.

현재, 변이는 자연적으로 발생하는 개체군에서 발견될 뿐만 아니라 돌연변이 유발에 의해 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는, 여러가지 변이 소스들을 조합하여, 손상-유발성 변색을 선례가 없는 매우 낮은 수준으로 나타나게 할 수 있다. 손상-유발성 변이가 감소된 여러가지 소스의 조합은, 이들을 교배함으로써 수행할 수 있으며, 결과적으로 하나 이상의 잡종 종자를 만들 수 있다. 만일 이러한 종자들 중 하나로부터 키운 잡종 식물에서 손상-유발성 변색이 훨씬 더 감소된다면, 이는 바로 실무에 사용할 수 있다.

임의의 경우에, 잡종 식물은 자가-수정하여 F2-개체군을 수득할 수 있다. 이러한 F2-개체군을 이용하여 대립성(allelism)을 테스트할 수 있으며, 즉 양쪽 소스가 동일한 위치에서 변색을 감소시키는 대립유전자를 제공하는지를 테스트할 수 있다. 대립성이 없다면, 손상-유발성 표면 변색이 정상적이고 높은 수준으로 나타나는 F2-개체들 뿐만 아니라 양쪽 모체 보다 손상 표면 변색 수준이 훨씬 감소된 F2-개체들을 발견할 수 있을 것이다. 후자의 F2-식물은 양쪽 모체로부터 나온 변색 감소 관련 대립유전자의 조합을 가지고 있으며, 이후의 육종에 이용할 수 있다.

변색 감소와 관련있는 대립유전자를 조합하는 방법은 AFLP, SFP 등의 분자 마커에 의해 지원될 수 있다. 성숙 식물의 저장한 자른 잎에 대한 육안 평가와 같은 여러가지 변색 감소 수준을 구별하기 위한 추가적인 분석을 이용하여, 여러가지 소스 유래의 대립유전자들의 조합의 결과로 손상 표면 변색이 크게 감소된 식물을 동정할 수 있다.

본 발명은 하기의 단지 예시의 목적으로 제공되는 실시예를 통해 더욱 상세히 설명될 것이다. 실시예에서, 하기 도면들을 참조한다.

도 1: 락투카 수탁물의 잎 디스크 핑킹 분석. 수탁물들에서 다양한 분홍색 변색 정도로서 나타나는 반응의 가변성을 관찰한다.
도 2: 변색이 감소된 07V.67586과 정상적인 변색을 보이는 cv.'Silvinas'의 아이스버그 레티스의 사진이다.
도 3: 신선한 자른 가지의 갈변 반응. 좌측 과실 조직은 실온에서 잘라 저장한 지 수분 후에 갈변을 보인다. 우측 과실 조직에서는 실온에서 24시간 배양하였을 때 갈변이 생긴다. 종자의 갈변화를 명확하게 관찰할 수 있다.
도 4: 가지의 자른 단편과 갈변 반응. 좌측의 2개의 ½ 단편은 50 mM mes 버퍼(pH = 5.5)에서 24시간 실온으로 인큐베이션한 것이다. 우측의 2개의 ½ 단편은 10 mM L-시스테인이 더욱 첨가된 것을 제외하고는 상기 조건과 동일한 조건 하에서 인큐베이션한 것이다.
도 5: 4 mM L-DOPA가 포함된 용액에 종자를 인큐베이션하였을 때 가지 종자의 흑변화. 웰 1: 음성 대조군(완충액 단독), 웰 2 - 6: 4 mM L-DOPA, 웰 3-6: 각각 0.1, 1.0, 5.0 및 10 mM L-시스테인 첨가.
도 6: 종자와 PPO 기질인 L-DOPA의 인큐베이션을 기초로 한, 종자-관련 PPO 활성 변이용 가지의 유전자 물질의 스크리닝. 2, 4 및 6번 컬럼 횡의 웰에는 4 mM L-DOPA이 있으며, 1, 3 및 5번 컬럼 횡에는 버퍼만 존재한다. 이 플레이트에서 가지 종자 형태에서 각 유전자 물질을 분석한다. 각 종자 배치(batch)는 L-DOPA 첨가 및 무첨가된 경우를 A1 및 A2, A3 및 A4, A5 및 A6, B1 및 B2, B3 및 B4, B5 및 B6, C1 및 C2, C3 및 C4, C5 및 C6, D1 및 D2, D3 및 D4, D5 및 D6 위치로 두어 나란히 분석한다. C5 및 C6, D1 및 D2, D3 및 D4, D5 및 D6 위치의 배치들에서 가장 높은 종자-관련 PPO 활성이 나타난다.

실시예

실시예 1

감소된 손상 표면 변색에 대한 상추 개체군의 스크리닝

상추 수탁물들을 손상-유발성 변색을 보일 가능성에 대해 스크리닝하였다. 종자를 온실의 화분 흙이 담겨 있는 트레이에서 상추를 생육시키는 표준 조건 하에서 발아시켰다. 3-4개의 본 잎이 생긴 묘목을 콜크 보러(cork borer)로 샘플을 취하였다. 그렇게 수득한 잎 디스크를 젖은 여과지 사이에 두고, 용기내 6 ℃에서 인큐베이션하였다. 1주일 후, 분홍으로의 변색을 1에서 5점의 점수로 매겼으며, 이때 1은 분홍 변색이 없는 것이고, 5는 매우 선명한 최대 분홍 변색이 나타난 것이다. 그 결과는 표 1에 나타낸다. 이 표에는 내부 표시(internal reference)와 이의 각각의 점수가 기재되어 있다. 감소된 분홍 변색을 보이는 것으로 확인된 수탁물들은 하기에서 동정된다.

핑킹 잎 디스크 분석을 이용한 여러가지 수탁물들의 핑킹 반응에서 관찰되는 차이점의 예는 도 1에 나타낸다.

놀랍게도, 몇가지 수탁물들에서 변색 감소가 확인되었다. 변색을 유도하는 경로는 식물을 상처난 곳을 통해 도입되는 생물학적 스트레스 및 비생물학적 스트레스 인자들로부터 보호하기 위한 것으로 생각되어, 그러한 형질은 자연적이고 재배자의 조건하에서는 불리할 것으로 생각되었기 때문에, 이러한 결과는 예상하지 못한 것이었다.

본 테스트에서 가장 주목할만한 수탁물들을 다시 파종하여, 전술한 동일 프로토콜로 재평가하였다. 분홍 변색의 감소는 번호 651968 (L.virosa; plot nr. 366, NCIMB 41489)에서 검증되었다. 추가적인 수탁물들은 전술한 동일 프로토콜로 테스트하고, 검증을 위해 다시 테스트하였다. 분홍 변색의 감소는 번호 650147 (L.saligna; NCIMB 41485)에서 확인되었고 검증되었다. 감소된 손상-유발성 표면 변색을 보이는 것으로 확인된 수탁물들은 표 2에 나타낸다.

'아이스버그' 및 '살리나스' 등의 잘 알려져 있는 수탁물들은 본 테스트에서 분홍 변색이 감소되는 어떠한 징후도 보이지 않았다.

[표 1]

여러가지 락투카 수탁물들의 분홍 변색의 점수. 각 필드 번호는 각 수탁물을 지칭한다. 1 수탁물에서 2개의 식물로부터 샘플을 취하였다. 점수는 분홍 변색의 정도를 나타낸다: 1 = 분홍 변색 없음 - 5 = 강한 분홍 변색. 2개의 식물에서 분홍 변색의 정도가 다른 경우에는, 점수 2가지를 표시한다. 2개의 식물에서 점수가 하나인 경우에는 2개의 식물이 본 테스트에서 동일하게 반응한 것이다.

손상 표면의 변색이 감소된 수탁물에 대한 개괄적인 사항

번호	종	타입	기탁 번호
651968	L. virosa		NCIMB 41489
650147	L. saligna		NCIMB 41485
07V.67586	L.sativa	crisphead	NCIMB 41569

번호 651968, 650147 및 07V.67586의 종자들을, 영국 AB21 9YA 스콜틀랜드 애버딘 벅스번 크라입스톤 에스테이트 페르구슨 빌딩 NCIMB Ltd에 기탁하였다.

실시예 2

필드 스크리닝

자른 결구(crisphead)형 상추 헤드의 육안 판단으로 필드(field) 스크리닝을 수행하였다. 손상 표면의 변색이 감소된 한가지 수탁물이 관찰되었다(도 2). 그 수탁물은 번호 07V.67586이었다. 이를, 하기와 같은 필드 시험의 육안 검사로 다시 테스트하여, 감소된 변색을 가지는 것을 검증하였다. 이러한 육안 검사는 자른 후 다음날 수행하였다. 놀랍게도, 실시예 1에 기술된 프로토콜에 따른 추적 테스트에서 분홍 변색의 감소는 확인되지 않았다. 이는, 번호 07V.67586에서의 변색 감소가 실시예 1에서 기술한 다른 수탁물들과는 상이한 유전적 요인에 의한 것임을 의미하는 것일 수 있다.

실시예 3

가지에서의 변색 감소

가지 열매를 잘라 포장하면, 신속한 갈변 반응을 관찰할 수 있다. 잘린 과일 조직의 손상 표면은 빠르게 갈색이 되는데, 이는 제품의 품질을 떨어뜨린다. 더 중요한 점은, 과육내에 들어 있는 종자가 도 3에 나타낸 바와 같이 백그라운드에 비해 두드러진 강한 갈변화된다는 것이다.

자른 신선한 가지 또는 가지를 신선한 제품으로 산업적으로 이용하기 위해서는, 종자의 갈변을 방지하여야 한다. 잘린 가지 열매의 갈변에 있어 생화학적 특성을 알아보기 위해, 갈변 반응을 폴리페놀 옥시다제(PPO)의 강력한 저해제인 L-시스테인이 첨가되거나 첨가되지 않은 2가지 조건에서 관찰하였다. 이 분석의 결과는 도 4에 나타낸다.

도 4에 나타낸 결과는, 갈변 반응이 PPO 저해제인 L-시스테인을 외부에서 제공함으로써 저해시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 갈변 반응은 명백하게 PPO-매개 반응인 것이다.

유전자적 방법을 이용하여 종자에 의한 가지의 갈변을 방지하기 위해, 종자-관련 PPO 활성 변이에 대해 유전자 물질을 스크리닝하였다. 이를 위해, L-DOPA와 같은 기질의 멜라닌 등의 유색 색소로의 변환을 이용하는 방법을 이용하였다.

PPO 기질로서 디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA)가 함유된 용액내에서 가지 종자를 인큐베이션하면, 흑변으로서 명확하게 보이는 멜라닌 형성이 나타난다. 이러한 흑변은 도 5에 나타낸 바와 같이 L-시스테인에 의해 완전히 저해될 수 있기 때문에 PPO-매개 반응이다.

가지의 L-DOPA 매개 종자 변색을 이용하여 종자-관련 PPO 활성이 감소된 유전자 물질을 동정하였다. 이러한 스크리닝으로 종자-관련 PPO 활성에 현저한 감소를 보이는 유전자 물질을 동정하였다. 이러한 스크리닝의 결과는 도 6에 예시되어 있다.

이러한 스크리닝 방법으로 통해 취하였으며, 종자-관련 PPO 활성의 강력한 감소를 보인 가지 물질은 표 3에 요약 개시되어 있다. 본 스크리닝에서, 일부 육종주들에서는 종자-관련 PPO 활성에 상당한 감소가 나타났지만(13, 14, 42, 49), 일부에서는 강력한 갈변이 나타났다(7, 27, 34, 47).

번호	육종주/코드	PPO 활성 감소
13	AB5480	+
14	AB5701	+
19	05N.1130-1	+
22	SNL.109	+
24	06N.1268-1	+
25	SNL.111	+
42	AB5028	+
49	AB5103	+
7	AB5261	-
27	06N.244-2	-
34	AB5007	-
47	AB5101	-

종자-관련 PPO 활성에 감소를 보이는 2가지 주들을 교배하여, 신선 판매 용도로서 산업성이 더욱 적합한 잡종을 수득한다. 또한, 가지(19)에 더 가깝거나 또는 관계가 보다 먼(22, 24, 25) 천연형 수탁물을 발견하였으며, 이들은 종자-관련 PPO 활성이 매우 강하게 감소되어 있었다. 이들 수탁물을, 신선 판매 용도로서 산업성이 보다 적합한 육종주와 잡종을 만드는 역교배 프로그램의 출발물질로서 사용한다. 역교배에서, 전술한 스크리닝 방법을 사용하여, 종자-관련 PPO 활성이 가장 많이 감소된 것을 선별하는데 이용한다.

NCIMB Ltd. NCIMB41485 20070629 NCIMB Ltd. NCIMB41489 20070629 NCIMB Ltd. NCIMB41569 20080702

Claims (47)

1. 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해, 감소된 손상-유발성 표면 변색 또는 손상-유발성 표면 변색의 부재를 나타내는 유전 물질을 포함하는 락투카 (Lactuca) 식물 또는 식물 일부분으로서, 상기 유전 물질은, 대표적인 종자가 수탁번호 NCIMB 41489, NCIMB 41485 및 NCIMB 41569로 기탁된 식물에 함유되어 있는, 식물.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물의 일부분이 잎, 헤드(head), 새싹, 뿌리, 덩이 줄기, 줄기, 꽃, 열매, 종자, 발아한 종자 및 이들의 단편 및 세포 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
3. 제1항에 있어서, 상기 식물의 일부분이 잎 디스크인 것을 특징으로 하는 식물.
4. 제1항에 있어서, 상기 식물의 일부분이 주맥 조직의 디스크인 것을 특징으로 하는 식물.
5. 제1항에 있어서, 상기 식물은, 락투카 식물 또는 식물의 일부분에 대해, 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 감소된 손상-유발성 표면 변색 또는 손상-유발성 표면 변색의 부재를 나타내는 식물 또는 식물의 일부분을 테스트하기 위한 방법을 수행하여 수득가능하며, 상기 테스트하기 위한 방법은,
   a) 손상된 표면을 가진 락투카 식물 또는 식물의 일부분을 제공하는 단계로서, 상기 식물 또는 식물의 일부분은 유전자 변이를 보이는 식물 집단으로부터 얻어지는 것인, 락투카 식물 또는 식물 일부분을 제공하는 단계;
   b) 상기 식물 또는 식물의 일부분 또는 식물에 발생된 손상된 표면을 수계 환경에서 인큐베이션하여, 그 내부나 그 위에서 변색이 이루어지도록 하는 단계;
   c) 상기 식물 또는 식물의 일부분의 내부 또는 그 위에서 변색을 관찰하는 단계;
   d) 관찰된 변색을 대조군 식물 또는 식물의 일부분에서 관찰되는 변색과 비교하여, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되었는 지를 평가하는 단계; 및
   e) 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 변색이 감소된 식물을, 감소된 손상-유발성 변색 형질을 지닌 식물로서 동정하는 단계를 포함하는,
   식물.
6. 제5항에 있어서, 상기 단계 a)에서 식물 또는 식물의 일부분은 유전자 은행으로부터 얻어지는 것인, 식물.
7. 제5항에 있어서, 상기 수계 환경이 젖은 여과지를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
8. 제5항에 있어서, 상기 수계 환경이 물 또는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
9. 제5항에 있어서, 상기 수계 환경이 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
10. 제1항에 있어서, 상기 대조군 식물이 7일간 5 ℃에서 젖은 여과지 2장 사이에 잎 디스크를 배양하였을 때 가장자리에 분홍 변색이 나타나는 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
11. 제1항에 있어서, 상기 식물은, 락투카 식물 또는 식물의 일부분에 대해, 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 감소된 손상-유발성 표면 변색 또는 손상-유발성 표면 변색의 부재를 나타내는 식물 또는 식물의 일부분을 테스트하기 위한 방법을 수행하여 수득가능하며, 상기 테스트하기 위한 방법은,
    a) 유전자 변이를 보이는 식물 집단으로부터 얻어지는 락투카 식물 또는 식물 일부분을 제공하는 단계;
    b) 상기 식물 또는 식물의 일부분을 유색 색소로 변환될 수 있는 기질과 인큐베이션하여, 그 내부나 그 위에서 변색이 이루어지도록 하는 단계;
    c) 상기 식물 또는 식물의 일부분의 내부 또는 그 위에서 변색을 관찰하는 단계;
    d) 관찰된 변색을 대조군 식물 또는 식물의 일부분에서 관찰되는 변색과 비교하여, 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 변색이 감소되었는 지를 평가하는 단계; 및
    e) 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 상기 식물 또는 식물의 일부분에 변색이 없거나 또는 변색이 감소된 식물을, 감소된 손상-유발성 변색 형질을 지닌 식물로서 동정하는 단계를 포함하는,
    식물.
12. 제11항에 있어서, 상기 단계 a)는 유전자 은행으로부터 얻어지는 락투카 식물 또는 식물 일부분을 제공하는 단계인, 식물.
13. 제11항에 있어서, 상기 기질이 L-DOPA인 것을 특징으로 하는 식물.
14. 제11항에 있어서, 상기 식물 또는 식물의 일부분이 기질과 인큐베이션하기 전에 손상되며, 상기 손상 부위 또는 그 근처에서 변색이 관찰되는 것을 특징으로 하는 식물.
15. 제11항에 있어서, 상기 식물의 일부분이 종자, 발아한 종자 또는 잎 디스크인 것을 특징으로 하는 식물.
16. 제11항에 있어서, 상기 변색은 L-시스테인에 의해 저해 또는 역전(reverse)되는 것을 특징으로 하는 식물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 식물을 감소된 변색 형질의 소스로 이용하여 감소된 변색 및 용인되는 농경학적 특성을 가진 작물을 생산하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 감소된 변색은 감소된 손상-유발성 표면 변색인, 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 감소된 변색 형질은 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질인, 방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 용인되는 농경학적 특성을 가진 식물이 상업 작물인 것을 특징으로 하는, 방법.
21. 제17항에 있어서, 상기 감소된 변색 형질의 소스인 식물이 락투카 비로사(L. virosa) 수탁물 651968 (NCIMB 41489), 락투카 살리그나(L.saligna) 수탁물 650147(NCIMB 41485) 및 락투카 사티바(L.sativa) 수탁물 07V.67586 (NCIMB 41569) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 감소된 변색 형질은 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질인, 방법.
23. 제17항에 있어서, 상기 감소된 변색 및 용인되는 농경학적 특성을 가진 작물은, 상기 소스 식물로부터 수득가능한, 감소된 변색 형질을 유전자 변형 방법에 의해 수여체 식물에 도입함으로써 생산되는 것을 특징으로 하는, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 감소된 변색은 감소된 손상-유발성 표면 변색인, 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 감소된 변색 형질은 손상-유발성 표면 변색이 감소된 형질인, 방법.
26. 대조군 식물 또는 식물의 일부분에 비해 손상-유발성 표면 변색이 감소되거나 없는 형질을 나타내는 락투카 식물의 생산 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 락투카 식물로부터의 자손을 생산하는 단계를 포함하며, 상기 자손은 상기 형질을 나타내는 유전 물질을 가지고 있으며, 상기 유전 물질은 대표적인 종자가 수탁번호 NCIMB 41489, NCIMB 41485 및 NCIMB 41569로 기탁된 식물에 함유되어 있는,
    락투카 식물의 생산 방법.
27. 손상-유발성 표면 변색이 감소된 또는 손상-유발성 표면 변색이 없는 형질을 나타내는 락투카 식물을 생산하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제1 모체 식물을 제2 모체 식물과 교배하여 F1 종자를 수득하는 단계;
    b) F1 종자로부터 F1 식물을 키운 다음 F1 식물을 자가-수정하여 F2 종자를 수득하는 단계;
    c) 변색 수준이 적어도 제2 모체 식물의 변색 수준 보다 낮은 F2 식물을 선별하는 단계를 포함하며, 선별되는 락투카 식물은 상기 형질을 나타내는 유전물질을 가지고 상기 형질을 나타내며, 상기 유전 물질은 대표적인 종자가 수탁번호 NCIMB 41489, NCIMB 41485 및 NCIMB 41569로 기탁된 식물에 함유되어 있는,
    락투카 식물의 생산 방법.
28. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 수탁번호 NCIMB 41489, NCIMB 41485 및 NCIMB 41569로 기탁된 종자로부터 성장한, 식물.
29. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 식물로 성장될 수 있는 종자.
30. 제29항에 있어서, 상기 종자가 수탁번호 NCIMB 41489, NCIMB 41485 및 NCIMB 41569로 기탁된 종자인 것을 특징으로 하는 종자.
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