KR101656568B1 - Bio-molecule detection method and system by automatic recording of resonant frequency shift based real-time recognition of bio molecular interaction - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체물질 검지방법에 관한 것으로, 구체적으로 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용하여 실시간 생체분자 간 상호작용에 따른 캔틸레버의 공진주파수 변화측정 자동화를 기반으로 한 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 통해 생체물질을 검지하는 방법에 관한 발명이다.The present invention relates to a biomolecule detection method, and more particularly, to a biomolecule detection method using quantitative analysis of interaction between biomolecules based on real-time biomolecule interactions based on automated measurement of resonance frequency change of a cantilever using a microcantilever for AFM, The present invention relates to a method for detecting a substance.
Description
본 발명은 생체물질 검지방법에 관한 것으로, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 통한 생체물질 검지방법 및 이를 위한 시스템에 관한 것이다.
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biomolecule detection method, and more particularly, to a biomolecule detection method and a system therefor by quantitative analysis of interactions between biomolecules based on an automatic measurement of real-time resonance frequency change using an AFM microcantilever.
마이크로 캔틸레버는 MEMS(micro electromechanical systems), NEMS(nano electromechanical systems)의 발전과 함께 그 구조 및 재료적으로 많은 개발이 이루어지고 있다. 이로 인해 마이크로 캔틸레버는 고감도(high sensitivity), 고선택성(highselectivity) 및 비표지 검출(labeling-free detection)이 가능해져 DNA 등과 같은 저분자 생체물질을 포함한 병원성 물질을 검출해 분석하는 바이오센서로써 각광받고 있다.Micro cantilevers have been developed in terms of structure and material along with development of micro electromechanical systems (MEMS) and nano electromechanical systems (NEMS). As a result, the microcantilever can be provided with high sensitivity, highselectivity and labeling-free detection, and is thus attracting attention as a biosensor for detecting and analyzing pathogenic substances including low molecular biomaterial such as DNA .
마이크로 캔틸레버를 이용한 바이오센서의 원리는 미량의 생체물질이 특이 결합하면서 이웃하는 물질 간에 서로 작용하는 힘과 특이 결합에 의하여 발생하는 구조변화에 의하여 캔틸레버 센서의 표면 스트레스가 발생하고 이로 인하여 마이크로 캔틸레버 센서의 휨 현상이나 공진주파수의 변화가 발생하는 것을 이용하는 것이다.The principle of a biosensor using a microcantilever is that a microstructure of a microcantilever sensor occurs due to a structural change caused by a specific interaction between a neighboring substance and a specific binding between a microbial substance and a microbial substance, A phenomenon of warping or a change in resonance frequency occurs.
마이크로 캔틸레버 센서의 휨 현상에 의한 상호작용의 비표지 검출은 캔틸레버 표면 상에 화학적 상호작용이 캔틸레버 굽힘 편향 변화량으로의 전환되는 것으로, Stoney 식으로 잘 기술되지만 표면 상의 분자 상호작용과 표면응력 (surface stress) 사이의 관계는 직접적이지 않기 때문에 표면 응력과 분자 상호작용 사이에 관계를 이론적으로 규명하기 어렵고 따라서 얼마나 많은 분자들이 분자 상호작용에 수반되는지 정량화하는 것은 더욱 어렵다.Non-labeling detection of interaction due to warping of microcantilever sensor is well described by Stoney's formula because the chemical interaction on the surface of the cantilever is converted to the cantilever bending deflection variation. However, molecular interaction and surface stress ) Is not straightforward, it is difficult to theoretically elucidate the relationship between surface stress and molecular interactions, and thus it is more difficult to quantify how many molecules are involved in molecular interactions.
반면, 캔틸레버 표면 상에 분자 상호작용에 의해 유발되는 캔틸레버의 공진주파수 변화량의 평가에 기초하는 비표지 검출은 분자간 상호작용 내에 수반되는 분자의 양을 정량화할 수 있게 한다. 분자 결합과 공진주파수 변위(shift) 사이 관계는 연속체 탄성 모델(continuum elastic model)에 기초하여 제시되었다. 구체적으로는, 캔틸레버 두께가 상기 캔틸레버 표면 상의 분자 단일막보다 상대적으로 큰 범위에서는, 공진주파수 변위는 상기 표면 상에 분자 결합(또는 상호작용)에 수반되는 분자들의 전체 질량에 선형적으로 비례한다는 것이다.On the other hand, unlabeled detection based on evaluation of the amount of change in the resonance frequency of the cantilever caused by molecular interaction on the cantilever surface enables quantification of the amount of molecules involved in the intermolecular interaction. The relationship between molecular bonding and resonant frequency shift is proposed based on the continuum elastic model. Specifically, in a range where the cantilever thickness is relatively larger than the molecular single film on the cantilever surface, the resonance frequency displacement is linearly proportional to the total mass of the molecules involved in the molecular bonding (or interaction) on the surface .
기존의 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 유전자, 단백질 및 여러 화학물질 검지방법은 복잡한 MEMS/NEMS 공정을 통해 만들어진 마이크로캔틸레버의 사용을 바탕으로 하는 방법(Spitzer Denis, et al. 2012. Bio-Inspired Nanostructured Sensor for the Detection of Ultralow Concentrations of Explosives, Angewandte Chemie International Edition, Vol. 51, 5334-5338)으로 증착 및 식각공정 등 여러 과정이 필요할 뿐만 아니라 각 공정에서 환경조절이 필요하다는 점에서 번거롭고 오랜 시간이 소요되어 비효율적이다.Atomic force microscope (AFM) Conventional methods of detecting genes, proteins, and chemicals using cantilevers are based on the use of microcantilevers made through complex MEMS / NEMS processes (Spitzer Denis, et al. 2012 (1986), pp. 51-53 (1986), pp. 513- 5333). In addition to the need for various processes such as deposition and etching processes, it is necessary to control the environment in each process It is cumbersome and time-consuming and inefficient.
이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명의 발명자는 상용화된 원자힘현미경(AFM)용 캔틸레버를 이용한 효소 단백질의 검지방법(Lee G, et al. 2012. Real-Time Quantitative Monitoring of Specific Peptide Cleavage by a Proteinase for Cancer Diagnosis, Angewandte Chemie International Edition, Vol. 51, 5837-5841)을 발표한 바 있으며, 간단한 실험방법으로 암세포의 특성과 세포 간 신호전달경로를 규명해 암을 조기에 진단할 수 있다는 점을 새로이 규명하였다. 그러나 상기 방법은 실험과정 중에 모든 기록을 수기로 작성해야 하는 단점이 있다. In order to overcome these disadvantages, the inventors of the present invention have developed a method for detecting enzyme proteins using commercialized cantilevers for atomic force microscopy (AFM) (Lee G, et al. 2012. Real-Time Quantitative Monitoring of Specific Peptide Cleavage by a Proteinase for In this study, we used a simple experimental method to identify the characteristics of cancer cells and the pathway of intercellular signal transduction pathways to identify early diagnosis of cancer. Respectively. However, this method has a disadvantage in that all records must be written manually during the experiment.
또한 환경 조절을 통해 보다 정확한 캔틸레버의 공진주파수 측정을 이루기 위한 한국등록특허 제583,233호와 마이크로 캔틸레버의 감도를 향상시킨 한국등록특허 제999,424호와 같은 캔틸레버의 공진주파수 측정에 대한 정밀도를 높이기 위한 개발은 이루어지고 있으나 측정 자체 편의성을 높여 바이오센서로써의 마이크로 캔틸레버의 활용성을 극대화하기 위한 개발은 미비한 실정이다.Korean Patent No. 583,233 for measuring the resonance frequency of a cantilever more precisely through environmental control and Korean Patent No. 999,424 for improving the sensitivity of a microcantilever have been developed to increase the precision of resonant frequency measurement of a cantilever However, the development of the microcantilever as a biosensor for maximizing the utilization of the microcantilever is not yet achieved.
따라서 이러한 단점을 극복한 더 발전된 생체분자 상호작용 검지방법 개발을 위해 본 발명은 캔틸레버의 공진주파수 기록 자동화를 위해 매크로시스템을 이용해 실시간으로 공진주파수를 기록하고 기록화된 공진주파수의 피크(peak)점만을 뽑아내어 시간 별로 나열(plot)해주는 매트랩 코드(matlab code)를 이용함으로써 상용화된 AFM용 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자상호작용 검지방법을 개발하기에 이르렀다.
In order to develop a biomolecule interaction detection method that overcomes these disadvantages, the present invention uses a macro system to record a resonance frequency in real time to automate the recording of the resonance frequency of the cantilever, and only the peak point of the recorded resonance frequency And matlab code for plotting time by time to develop a method for detecting biomolecule interaction based on an automated measurement of real time resonance frequency change using a commercially available cantilever for AFM.
본 발명의 목적은 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반으로 하여 공진주파수의 변화량을 자동 산출함으로써 이에 비례하는 캔틸레버의 질량 변화량을 통해 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 할 수 있는 생체물질 검지방법 및 이를 위한 시스템을 제공하는데 있다.
An object of the present invention is to provide a method and apparatus for automatically analyzing a resonance frequency by automatically calculating a change in resonance frequency based on an automatic measurement of real-time resonance frequency change using an AFM microcantilever, A method for detecting a substance and a system therefor.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AFM(원자힘현미경, Atomic force microscope)용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시키는 단계; 상기 고정화된 제1 생체분자와 결합하는 제2 생체분자를 상기 마이크로 캔틸레버에 처리하여 결합 반응에 따른 상기 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 자동 기록하는 단계; 및 상기 자동 기록된 공진주파수의 피크(peak)점을 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 시간별로 나열(plot)하여 공진주파수의 변화를 실시간으로 측정하는 단계를 포함하고, 여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용의 정량분석 방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for manufacturing a microcantilever, comprising: immobilizing a first biomolecule on a surface of a microcantilever for an AFM (Atomic Force Microscope); Treating the micro-cantilever with a second biomolecule bound to the immobilized first biomolecule to automatically record a change in the resonance frequency of the cantilever according to the binding reaction; And plotting the peak points of the automatically recorded resonance frequency using matlab codes according to time to measure a change in the resonance frequency in real time, A memory allocation and a clean step; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number using an AFM microcantilever Provides a method for quantitative analysis of biomolecular interactions based on automated measurement of real-time resonance frequency changes.
또한 본 발명은 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 검지 시스템으로서, 표면에 고정화된 생체분자를 포함하는 AFM용 마이크로 캔틸레버를 포함하고, 상기 생체분자가 고정화된 AFM용 마이크로 캔틸레버에 처리되는 검지 대상인 표적 생체분자와 고정화된 생체분자 간의 결합 반응 시 캔틸레버의 공진주파수를, 매크로 시스템을 이용해 실시간으로 자동 기록하여 기록된 정보를 기반으로 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 생체분자 간 결합에 의한 캔틸레버의 질량 변화와 비례하는 공진 주파수의 변화를 측정함으로써 정량적인 생체분자 간 상호작용을 검지하고, 여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체물질 검지 시스템을 제공한다.
Further, the present invention provides a detection system based on a cantilever sensor, comprising: a microcantilever for AFM including biomolecules immobilized on a surface, wherein the biomolecule is immobilized on the microcantilever for AFM, The resonance frequency of the cantilever is automatically recorded in real time using the macro system in the coupling reaction between the immobilized biomolecules, and the mass change of the cantilever due to the intermolecular bonding using the following matlab code based on the recorded information Detecting quantitative inter-biomolecule interactions by measuring changes in resonance frequency proportional to the frequency of the resonant frequency, wherein the MATLAB code comprises memory allocation and clean steps; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number using an AFM microcantilever Provides an automated biomaterial detection system that measures real-time resonance frequency changes.
본 발명에 따른 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 통한 생체물질 검지방법 및 이를 위한 시스템은 단지 생체분자 간의 상호작용을 검지할 뿐만 아니라 검지하고자 하는 표적 생체분자와 이와 결합하는 다른 생체분자 간의 결합 정도를 정량적으로 측정이 가능하고, 화학 반응일 경우 반응속도까지 측정 가능한 검지방법이다. 또한, 시스템의 특성상 쉬운 생체분자 고정화 방법을 갖고 있으며, 짧은 측정 시간을 통해 실시간 검지가 가능하고, 자동화 시스템을 통해 편의성과 정확성을 추구하였다. 따라서 본 발명의 생체물질 검지방법은 다양한 생체분자 간 상호작용을 검지하는데 매우 유용하며 빠른 암 진단과 병 진행과정 모니터링 및 수술 후 예후 진단까지 여러 의학 분야에 적용될 가능성을 갖고 있다. 특히 상용화된 AFM(원자힘현미경, Atomic force microscope)용 캔틸레버 사용과 자동화 시스템으로 실험자의 숙련도가 필요하지 않아 넓은 범위에서 응용될 가능성이 있다.
The method and system for detecting biomolecules by quantitative analysis of biomolecule interactions based on automated measurement of real-time resonance frequency change using AFM microcantilever according to the present invention can be used not only for detecting biomolecule interaction, Is a detection method capable of quantitatively measuring the degree of binding between a target biomolecule and other biomolecules bound thereto and measuring the reaction rate in the case of a chemical reaction. In addition, due to the nature of the system, it has easy biomolecule immobilization method, real time detection is possible through short measurement time, and convenience and accuracy are pursued through automation system. Therefore, the biomolecule detection method of the present invention is very useful for detecting interactions between various biomolecules, and has a possibility to be applied to various medical fields ranging from rapid cancer diagnosis, disease progression monitoring, and postoperative prognosis diagnosis. Especially, the cantilever use and automation system for AFM (Atomic force microscope), which is commercialized, is not required for the skill of the experimenter.
도 1은 시간에 따른 AFM용 마이크로 캔틸레버의 공진주파수 변화를 통한 DNA-DNA 상호작용 검지를 나타낸 그래프이다(탐침DNA: 5 μM, 표적DNA: 5 μM, 0.05 μM).
도 2는 말단에 형광물질(FITC)을 표지한 표적DNA 사용해 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용을 분석한 후 사용된 캔틸레버를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a graph showing the detection of DNA-DNA interaction through a change in resonance frequency of an AFM microcantilever with time (probe DNA: 5 μM, target DNA: 5 μM, 0.05 μM).
FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of interactions between biomolecules based on an automatic measurement of real-time resonance frequency change using a microcantilever for AFM using a target DNA labeled with a fluorescent material (FITC) at the end thereof, and then using the confocal microscope, As shown in FIG.
본 발명은 AFM(원자힘현미경, Atomic force microscope)용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시키는 단계; (b) 상기 고정화된 제1 생체분자와 결합하는 제2 생체분자를 상기 마이크로 캔틸레버에 처리하여 결합 반응에 따른 상기 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 자동 기록하는 단계; 및 (c) 상기 자동 기록된 공진주파수의 피크(peak)점을 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 시간별로 나열(plot)하여 공진주파수의 변화량을 실시간으로 산출하는 단계를 포함하고, 여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반 생체분자 간 상호작용의 정량분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of immobilizing a first biomolecule on a surface of a microcantilever for AFM (Atomic Force Microscope); (b) treating a second biomolecule bound to the immobilized first biomolecule with the microcantilever to automatically record a change in the resonance frequency of the cantilever according to the binding reaction; And (c) plotting the peak points of the automatically recorded resonance frequency in real time by plotting the peak points of the resonance frequency with time using the following matlab code, The MATLAB code in memory allocates and cleans memory; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number using an AFM microcantilever The present invention relates to a method for quantitative analysis of interactions between biomolecules based on automated measurement of real-time resonance frequency variation.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 (b)단계에서 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 자동 기록 하는 것은 매크로 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.In one embodiment according to the present invention, the automatic recording of the resonance frequency change of the cantilever in the step (b) may be performed using a macro system.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, AFM용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시키는 단계 이전에 상기 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 AFM용 마이크로 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 상기 캔틸레버 표면을 아민 기를 포함하는 화합물과 반응시킴으로써 아민화하거나, 상기 캔틸레버 표면에 금 박막을 코팅하여 상기 금 박막 표면과 생체 분자의 화학적으로 처리된 말단(termini)인 티올(thiol)기를 반응시킴으로써 상기 캔틸레버 표면을 기능화 시킬 수도 있으나 기능화의 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment according to the present invention, the step of functionalizing the cantilever surface prior to the step of immobilizing the first biomolecule on the surface of the microcantilever for AFM may be further included. For example, the surface of the cantilever for functionalizing the surface of the AFM microcantilever may be aminated by reacting with a compound containing an amine group, or a gold thin film may be coated on the surface of the cantilever to chemically treat the surface of the gold thin film and the biomolecule The surface of the cantilever may be functionalized by reacting a thiol group, which is a termini, but the functionalization method is not limited thereto.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 AFM용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시킨 후 비특이적 결합을 최소화기 위하여 빈 공간을 메르캡토헥산올(mercaptohexanol), 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 및 탈지유(skim milk)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로 고정화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 빈공간을 메르캡토헥산올로 고정화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, after the first biomolecule is immobilized on the surface of the AFM microcantilever, mercaptohexanol, Bovine serum albumin (BSA ) And skim milk, and most preferably, the step of immobilizing the empty space with mercaptohexanol may further include the step of immobilizing the hollow space with mercaptohexanol.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 각각 독립적으로 핵산, 단백질 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment according to the present invention, each of the first biomolecule and the second biomolecule may be independently selected from the group consisting of a nucleic acid, a protein and a carbohydrate.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 제1 생체분자 또는 제2 생체분자는 핵산일 수 있으며. 보다 구체적으로 DNA, RNA, PNA, LNA 및 그들의 혼성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment according to the present invention, the first biomolecule or the second biomolecule may be a nucleic acid. More specifically, it may be selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA, and their hybrids.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 제1 생체분자는 탐침 DNA이고 제2 생체분자는 탐침 DNA와 상보적으로 결합하는 검지대상이 되는 유전자의 표적 DNA인 것일 수 있다. 예를 들어 표적 DNA는 유전자 변이를 포함하는 암유전자로 암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the first biomolecule may be a probe DNA, and the second biomolecule may be a target DNA of a gene to be detected that binds complementarily to the probe DNA. For example, a target DNA can be an cancer gene that includes a gene mutation and can provide information necessary for cancer diagnosis.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 제1 생체분자 또는 제2 생체분자는 단백질일 수 있으며, 보다 구체적으로 항원, 항체, 효소, 기질, 리간드, 압타머, 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment according to the present invention, the first biomolecule or the second biomolecule may be a protein, and more specifically, is selected from the group consisting of an antigen, an antibody, an enzyme, a substrate, a ligand, .
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 생체분자 간 상호작용은 일예로 항체-항원 반응 또는 효소-기질 반응일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며 생체물질 검지를 위한 모든 생체분자 간 상호작용을 포함할 수 있다.In one embodiment according to the present invention, the biomolecule interactions may be, for example but not limited to, antibody-antigen reactions or enzyme-substrate reactions, and may include interactions between all biomolecules for biomolecule detection have.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 공진 주파수의 변화는 생체분자 간 결합 유무로 인한 AFM용 마이크로 캔틸레버의 질량 변화와 비례하는 것이며, 상기 공진 주파수의 변화는 제1 생체분자가 고정화되기 전의 캔틸레버 자체의 공진주파수를 기준 공진주파수로 하여 이로부터 실시간으로 측정한 공진주파수의 차이로 측정될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the change in the resonance frequency is proportional to the change in the mass of the AFM microcantilever due to the presence or absence of biomolecule bonding, and the change in the resonance frequency is caused by the cantilever itself Can be measured as the difference of the resonance frequency measured in real time from the resonance frequency as the reference resonance frequency.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 생체분자 상호작용이 화학 반응일 경우, 실시간 공진주파수 변화 측정을 통해 반응속도를 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, when the biomolecule interaction is a chemical reaction, the reaction rate can be measured by measuring changes in real-time resonance frequency.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 검지대상이 되는 표적 생체분자인 제2 생체분자는 마이크로 캔틸레버에 처리되기 전 말단을 형광물질로 표지하는 단계를 추가적으로 수행하여 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 완료한 다음 사용된 캔틸레버를 공초점 현미경으로 분석함으로써 제1 생체분자와 제2 생체분자 간 결합을 재확인할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the second biomolecule, which is the target biomolecule to be detected, is further subjected to a step of labeling the end with a fluorescent material before being treated in the microcantilever, After the quantitative analysis of the interaction is completed, the cantilever used can be analyzed with a confocal microscope to reaffirm the binding between the first biomolecule and the second biomolecule.
본 발명은 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 검지 시스템으로서, 표면에 고정화된 생체분자를 포함하는 AFM용 마이크로 캔틸레버를 포함하고, 상기 생체분자가 고정화된 AFM용 마이크로 캔틸레버에 처리되는 검지 대상인 표적 생체분자와 고정화된 생체분자 간의 결합 반응 시 켄틸레버의 공진주파수를 매크로시스템을 이용해 실시간으로 자동 기록하여 기록된 정보를 기반으로 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 생체분자 간 결합에 의한 캔틸레버의 질량 변화량과 비례하는 공진 주파수의 변화를 자동 측정함으로써 정량적인 생체분자 간 상호작용을 검지하고, 여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체물질 검지 시스템에 관한 것이다.A detection system based on a cantilever sensor comprising a microcantilever for AFM including biomolecules immobilized on a surface, the target biomolecule to be detected to be processed by the AFM microcantilever to which the biomolecule is immobilized, In the coupling reaction between biomolecules, the resonance frequency of the cantilever is automatically recorded in real time using a macro system. Based on the recorded information, the amount of change in the mass of the cantilever due to the intermolecular bonding using the following matlab code Detecting quantitative inter-biomolecule interactions by automatically measuring changes in a proportional resonant frequency, wherein the MATLAB code comprises a memory allocation and a clean step; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number using an AFM microcantilever The present invention relates to an automated-based biomaterial detection system for real-time resonance frequency variation measurement.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 생체분자는 핵산, 단백질, 또는 탄수화물일 수 있다.In one embodiment according to the present invention, the biomolecule may be a nucleic acid, a protein, or a carbohydrate.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 생체분자 상호작용이 화학 반응일 경우, 실시간 공진주파수 변화측정을 통해 반응속도를 측정할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, when the biomolecule interaction is a chemical reaction, the reaction rate can be measured by measuring changes in real-time resonance frequency.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도는 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. It should be understood, however, that the same is by way of illustration and example only and is not intended to limit the scope of the present invention.
[실시예] 유방암과 관련된 BRCA1 유전자 검지[Example] Detection of BRCA1 gene related to breast cancer
1. 실시방법1. Procedure
1-1. AFM용 마이크로 캔틸레버에 탐침DNA 고정1-1. Fix probe DNA to AFM microcantilever
상용화된 AFM용 마이크로 캔틸레버에 피라나(piranha) 용액을 처리하여 세척 및 수산기(hydroxyl group, -OH)를 활성화시켰고, 수산기가 활성화된 캔틸레버 위에 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제된 올리고뉴클리오티드(oligonucleotides)가 결합된 티올기(thiol group, -HS)를 이용해 BRCA1 유전자와 상보적으로 결합하는 DNA를 탐침DNA로서 고정화시킨 후 비특이적 결합(non-specific binding)을 최소화하기 위해, 탐침DNA가 고정화되지 않은 빈공간을 메르캡토헥산올(mercaptohexanol)로 고정화시켰다.
A commercially available microcantilever for AFM was treated with piranha solution to activate the hydroxyl group (-OH), and purified by high performance liquid chromatography (HPLC) on a hydroxyl-activated cantilever In order to minimize non-specific binding of DNA complementarily binding to BRCA1 gene using thiol group (-HS) linked oligonucleotides as probe DNA , And an empty space in which probe DNA was not immobilized was immobilized with mercaptohexanol.
1-2. 탐침DNA와 표적DNA의 혼성화에 따른 실시간 캔틸레버의 공진주파수 측정1-2. Measurement of resonance frequency of real-time cantilever by hybridization of probe DNA and target DNA
탐침DNA가 고정화된 캔틸레버를 검지대상이 되는 BRCA1 유전자를 표적DNA로 혼성화시킬 시 실시간으로 캔틸레버의 공진주파수 변화를 측정하였다. 이때 캔틸레버의 공진주파수는 매크로시스템을 통해 15초마다 자동 측정되어 AFM과 연결되어 있는 컴퓨터에 자동으로 기록 및 저장되었다.
When the cantilever immobilized with the probe DNA was hybridized with the target DNA to be detected, the resonance frequency of the cantilever was measured in real time. At this time, the resonant frequency of the cantilever was automatically measured every 15 seconds through the macro system and automatically recorded and stored in the computer connected to the AFM.
2. 기록된 공진주파수를 이용한 탐침DNA와 표적DNA 간 상호작용 분석2. Analysis of interaction between probe DNA and target DNA using recorded resonance frequency
1-2.에서 저장된 캔틸레버의 공진주파수 정보를 기반으로 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 상기 공진주파수의 피크(peak)점 만을 뽑아내어 시간 별로 나열(plot)해 캔틸레버의 공진주파수 변화가 측정되게 하였다. 상기 캔틸레버의 공진주파수 변화는 탐침DNA와 표적DNA의 혼성화에 따른 캔틸레버의 질량 변화와 비례하므로 도 1에 나타난 바와 같이 5 μM농도의 탐침DNA가 고정화될 때 변화하는 공진주파수의 변화와 5 μM농도의 표적DNA가 탐침DNA에 혼성화될 때 변화하는 공진주파수의 변화가 - 0.0029로 동일해 고정화된 탐침DNA 모두가 표적DNA와 혼성화 되었다는 것을 확인할 수 있었다.Based on the resonance frequency information of the cantilever stored in steps 1-2, only the peak point of the resonance frequency is extracted using matlab code, and the resonance frequency change of the cantilever is measured Respectively. The change in resonance frequency of the cantilever is proportional to the change in the mass of the cantilever due to hybridization of the probe DNA and the target DNA. Therefore, as shown in FIG. 1, the change in the resonance frequency when the probe DNA is immobilized at a concentration of 5 μM, When the target DNA was hybridized to the probe DNA, the change in the resonant frequency was changed to -0.0029, confirming that all the probe DNA immobilized was hybridized with the target DNA.
또한, 도 1에서 나타난 바와 같이 탐침DNA가 고정화 될 때는 60분의 시간이 걸리지만, 표적DNA가 탐침DNA에 혼성화될 때는 80분의 시간이 걸리므로 단일 DNA가 표면에 고정화되는 화학반응이 표적DNA와 탐침DNA의 상호작용 보다 반응속도가 빠르다는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 1, when the probe DNA is immobilized, it takes 60 minutes. However, when the target DNA is hybridized with the probe DNA, it takes 80 minutes. Therefore, And that the reaction rate was faster than the interaction of probe DNA.
3. 탐침DNA와 표적DNA 간 혼성화 재확인 방법3. Re-confirmation of hybridization between probe DNA and target DNA
탐침DNA와 표적DNA의 혼성화 확인을 위하여 캔틸레버에 표적DNA를 처리하기 전 표적DNA 말단에 형광물질(Fluorescein isothiocyanate, FITC)을 표지하여 상기의 실시방법으로 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반 생체분자 간 상호작용의 정량분석을 시행한 후 사용된 캔틸레버를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 녹색파장대역의 빛을 측정하여 표적DNA가 캔틸레버 위에 고정화된 탐침DNA와 혼성화되었음을 확인하였다(도 2).Fluorescein isothiocyanate (FITC) was labeled at the end of the target DNA before the cantilever was treated with the target DNA for the hybridization of the probe DNA and the target DNA. The cantilever used was hybridized with the probe DNA immobilized on the cantilever by measuring light in the green wavelength band using a confocal microscope (FIG. 2).
Claims (18)
(b) 상기 AFM용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시킨 후 비특이적 결합을 최소화기 위하여 빈 공간을 메르캡토헥산올(mercaptohexanol)로 고정화시키는 단계;
(c) 상기 고정화된 제1 생체분자와 결합하는 제2 생체분자를 상기 마이크로 캔틸레버에 처리하여 결합 반응에 따른 상기 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 자동 기록하는 단계; 및
(d) 상기 자동 기록된 공진주파수의 피크(peak)점을 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 시간별로 나열(plot)하여 공진주파수의 변화량을 실시간으로 산출하는 단계를 포함하고,
여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진,
AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
(a) immobilizing a first biomolecule on a surface of a microcantilever for an AFM (Atomic Force Microscope);
(b) immobilizing an empty space with mercaptohexanol to immobilize the first biomolecule on the surface of the AFM microcantilever to minimize non-specific binding;
(c) processing the second biomolecule bound to the immobilized first biomolecule to the microcantilever to automatically record the change in resonance frequency of the cantilever according to the binding reaction; And
(d) plotting a peak point of the automatically recorded resonance frequency in real time by plotting the peak point of the resonance frequency by using a matlab code according to time,
Here, the MATLAB code includes memory allocation and clean steps; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number,
A Method for Quantitative Analysis of Interaction between Biomolecules Based on Automated Measurement of Real - Time Resonant Frequency Change Using AFM Microcantilever.
AFM용 마이크로 캔틸레버 표면에 제1 생체분자를 고정화시키는 단계 이전에 상기 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계를 추가로 포함하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
The present invention further provides a method for quantitatively analyzing biomolecular interactions based on an automated measurement of real-time resonance frequency change using a microcantilever for AFM, which further comprises functionalizing the surface of the cantilever prior to immobilizing the first biomolecule on the surface of the AFM microcantilever Way.
상기 AFM용 마이크로 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계는 상기 캔틸레버 표면을 아민화하거나, 또는
상기 캔틸레버 표면을 금 박막으로 코팅하여 상기 금 박막 표면에 티올기를 개질화하는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
3. The method of claim 2,
The step of functionalizing the surface of the AFM microcantilever may include:
Wherein the surface of the cantilever is coated with a gold thin film to reform the thiol group on the surface of the gold thin film, and a method for quantitative interaction analysis between biomolecules based on automated measurement of real time resonance frequency change using the microcantilever for AFM.
상기 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 각각 독립적으로 핵산, 단백질 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first biomolecule and the second biomolecule are independently selected from the group consisting of a nucleic acid, a protein, and a carbohydrate, wherein the biomolecule interaction quantification based on an automatic measurement of the real-time resonance frequency change using the AFM microcantilever Analysis method.
상기 제1 생체분자 또는 제2 생체분자는 핵산인 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first biomolecule or the second biomolecule is a nucleic acid, wherein the first biomolecule or the second biomolecule is a nucleic acid.
상기 핵산은 DNA, RNA, PNA, LNA 및 그들의 혼성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the nucleic acid is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA, and a mixture thereof. 2. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA and a mixture thereof.
상기 제1 생체분자는 탐침 DNA이고 제2 생체분자는 탐침 DNA와 상보적으로 결합하는 검지대상이 되는 유전자의 표적 DNA인 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first biomolecule is a probe DNA and the second biomolecule is a target DNA of a gene to be detected which is complementarily bound to the probe DNA, based on a real-time resonance frequency change measurement using an AFM microcantilever Quantitative analysis of interactions between biomolecules.
상기 제1 생체분자 또는 제2 생체분자는 단백질인 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first biomolecule or the second biomolecule is a protein, and wherein the first biomolecule or the second biomolecule is a protein.
상기 단백질은 항원, 항체, 효소, 기질, 리간드, 압타머, 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
10. The method of claim 9,
Quantitative analysis of interactions between biomolecules based on automated measurement of real-time resonant frequency changes using AFM microcantilevers, characterized in that the protein is selected from the group consisting of antigens, antibodies, enzymes, substrates, ligands, Way.
상기 생체분자간 상호작용은 항체-항원 반응인 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the interaction between the biomolecules is an antibody-antigen reaction, based on an automated measurement of real-time resonance frequency change using an AFM microcantilever.
상기 생체분자간 상호작용은 효소-기질의 반응인 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the interaction between biomolecules is an enzyme-substrate reaction. 2. The method according to claim 1, wherein the biomolecule interaction is an enzyme-substrate reaction.
상기 공진 주파수의 변화는 생체분자 간 결합 유무로 인한 AFM용 마이크로 캔틸레버의 질량 변화와 비례하는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the change in the resonance frequency is proportional to a change in the mass of the AFM-based microcantilever due to the presence or absence of biomolecule bonding. .
상기 공진 주파수의 변화는 제1 생체분자가 고정화되기 전의 캔틸레버 자체의 공진주파수를 기준 공진주파수로 하여 이로부터 실시간으로 측정한 공진주파수의 차이로 측정되는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
14. The method of claim 13,
Wherein the change in the resonance frequency is measured as a difference in resonance frequency measured in real time from the resonance frequency of the cantilever itself before the first biomolecule is immobilized as a reference resonance frequency, A method for quantitative analysis of interaction between biomolecules based on measurement of resonance frequency change.
상기 생체분자 상호작용이 화학 반응일 경우, 실시간 공진주파수 기록을 통해 반응속도를 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는, AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체분자 간 상호작용 정량분석 방법.
The method according to claim 1,
The quantitative analysis of interactions between biomolecules based on an automated measurement of real-time resonance frequency change using an AFM microcantilever, wherein the reaction rate can be measured through real-time resonance frequency recording when the biomolecular interaction is a chemical reaction. Way.
표면에 고정화된 생체분자 및 비특이적 결합을 최소화기 위하여 빈 공간에 고정화된 메르캡토헥산올(mercaptohexanol)을 포함하는 AFM용 마이크로 캔틸레버를 포함하고,
상기 생체분자가 고정화된 AFM용 마이크로 캔틸레버에 처리되는 검지 대상인 표적 생체분자와 고정화된 생체분자 간의 결합 반응 시 켄틸레버의 공진주파수를,
매크로시스템을 이용해 실시간으로 자동 기록하여 기록된 정보를 기반으로 하기의 매트랩 코드(matlab code)를 이용하여 생체분자 간 결합에 의한 캔틸레버의 질량 변화와 비례하는 공진 주파수의 변화를 자동 측정함으로써 정량적인 생체분자 간 상호작용을 검지하고,
여기에서 매트랩 코드는, 메모리 할당(allocation) 및 클린 단계; 변수 초기화 단계(variables initialization); AFM 공진주파수 데이터 로딩 및 분류 단계; 로딩된 데이터에서 최대값(max value)을 추출하여 해당 주파수 데이터 넘버를 플롯(plot)팅 하기 위하여 for문 반복루프를 통해 이벤트값(event value)을 저장하는 알고리즘으로 이루어진,
AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체물질 검지 시스템.
1. A detection system based on a cantilever sensor,
A microcantilever for AFM comprising biomolecules immobilized on a surface and mercaptohexanol immobilized in an empty space in order to minimize non-specific binding,
The resonance frequency of the cantilever during the coupling reaction between the target biomolecules to be detected and the immobilized biomolecules to be processed in the AFM microcantilever to which the biomolecules are immobilized,
Based on the recorded information by using the macro system in real time, the matlab code is used to automatically measure the change in the resonance frequency proportional to the mass change of the cantilever due to the intermolecular bonding, Intermolecular interactions are detected,
Here, the MATLAB code includes memory allocation and clean steps; Variables initialization; AFM resonant frequency data loading and classification; And an algorithm for extracting a maximum value from the loaded data and storing an event value through an iteration loop for plotting the corresponding frequency data number,
Real - Time Resonant Frequency Change Measurement Using Microcantilever for AFM.
상기 생체분자는 핵산, 단백질, 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는, 정량적인 생체분자 간 상호작용을 검지하는 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체물질 검지 시스템.
17. The method of claim 16,
Wherein the biomolecule is a nucleic acid, a protein, or a carbohydrate, wherein the biomolecule is a nucleic acid, a protein, or a carbohydrate.
상기 생체분자 상호작용이 화학 반응일 경우, 실시간 공진주파수 변화측정을 통해 반응속도를 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는, 정량적인 생체분자 간 상호작용을 검지하는 AFM용 마이크로 캔틸레버를 이용한 실시간 공진주파수 변화측정 자동화 기반의 생체물질 검지 시스템.17. The method of claim 16,
Time resonance frequency change using a microcantilever for AFM for detecting quantitative interaction between biomolecules, wherein the reaction rate can be measured through measurement of real-time resonance frequency change when the biomolecule interaction is a chemical reaction. Biomaterial detection system based on measurement automation.
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| US20110252891A1 (en) | 2008-12-08 | 2011-10-20 | Imec | Method and Apparatus for Determining Topography of an Object |
| US20130027706A1 (en) * | 2011-03-21 | 2013-01-31 | University Of Calcutta | Nano sensing of temperature using equal intensity double plasmon resonance (eidpr) |
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