KR101639105B1

KR101639105B1 - 히알루론산의 정제 방법 및 제조 방법

Info

Publication number: KR101639105B1
Application number: KR1020127026920A
Authority: KR
Inventors: 마사노부 고사카; 가츠미 이시게; 가즈토시 히오키; 히로미츠 호시카; 하루코 사카이
Original assignee: 덴카 주식회사
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2016-07-12
Also published as: CN102803299A; JPWO2011114470A1; KR20130010077A; TWI522369B; TW201139462A; JP5603926B2; WO2011114470A1

Abstract

본 발명은, 간편하며 고수율로 고순도의 히알루론산류를 공업적 규모로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그 해결 수단으로서, 본 발명에 의하면, (1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법 및 제조 방법이 제공된다.

Description

히알루론산의 정제 방법 및 제조 방법{HYALURONIC ACID PURIFICATION METHOD AND PRODUCTION METHOD}

본 발명은 히알루론산류의 정제 방법 및 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 화장품의 보습제 외에, 안과, 정형외과, 피부과 등에서 의약품으로서 이용되고 있다. 히알루론산은 동물 조직, 예를 들면 닭의 계관, 소의 눈의 유리체 등으로부터의 추출물에 의해 제조할 수 있지만, 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해서 저분자량화되기 쉽기 때문에, 히알루론산 생산능을 갖는 미생물을 배양하여, 배양액으로부터 히알루론산을 제조하는 것(발효법)도 행해지고 있다(비특허문헌 1 및 특허문헌 1).

추출법이나 발효법에 의해서 제조되는 히알루론산에는 단백질이나 발열성 물질 등이 불순물로서 존재하기 때문에, 이들을 분리 제거하여 고순도의 제품을 얻는 방법이 검토되고 있다. 특히 제조 초기 단계에서의 불순물의 제거는, 이후의 정제 공정 부하의 경감을 가능하게 하여, 의약품으로서도 사용 가능한 고순도인 제품을 얻는 방법으로서의 개발이 기대되어 있다. 그 예로서, 예를 들면 발효액에 알코올 등의 유기 용제를 첨가함으로써 히알루론산을 석출하여 불순물과 분리하는 정제법이나, 음이온 교환 수지를 이용하여, 발효액으로부터 발열성 물질이나 단백질 등을 제거하는 히알루론산의 정제법이 개시되어 있다(특허문헌 2).

일본 특허 공고 (평)4-12960호 공보 일본 특허 공개 (소)63-12293호 공보

Journal of General Microbiology, 85, 372-375, 1976

그러나, 공업적 규모로 주사액 등의 의약품으로서 사용할 수 있는 고순도의 히알루론산류를 얻기 위해서는, (1) 초기 단계에서의 불순물의 제거가 충분히 이루어져 있지 않기 때문에 후속 공정에 대한 부하가 크고, (2) 조작이 번잡한 데다가, 히알루론산류의 회수율이 낮다는 등의 더욱 개선이 요구되는 점이 존재하고 있었다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 간편하며 고수율로 고순도의 히알루론산류를 공업적 규모로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 그 정제 방법에 이용되는 흡착제를 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 목적을 해결하기 위하여 히알루론산류 함유액으로부터 불순물을 효율적으로 분리 제거하여, 고순도의 히알루론산류를 간편하며 효율적으로 정제하는 방법에 대해서 다양하게 검토한 결과, 히알루론산류 용액을 활성탄과 접촉시킴으로써 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따르면, (1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이 제공된다. 이 정제 방법에 의하면, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, (1) 활성탄, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이 제공된다. 이 정제 방법에 의하면, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, (1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키고, 그에 따라 히알루론산 및/또는 그의 염을 정제하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 이 제조 방법에 의하면, 불순물을 효율적으로 흡착 제거함으로써 순도가 높은 히알루론산을 효율적으로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, (1) 활성탄, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키고, 그에 따라 히알루론산 및/또는 그의 염을 정제하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 이 제조 방법에 의하면, 불순물을 효율적으로 흡착 제거함으로써 순도가 높은 히알루론산을 효율적으로 제조할 수 있다.

[용어의 설명]

본 명세서에 있어서의 「히알루론산류」에는 유리된 히알루론산, 및 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 사용 가능한 임의의 히알루론산염(이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염 등의 금속염이나, 염산염, 인산염, 시트르산염 등의 산부가물 등)이나 수화물, 이들의 혼합물이 포함된다. 여기서, 히알루론산이란 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 결합한 2당 단위가 반복 연쇄되어 이루어지는 고분자량의 다당류를 말하며, 각종 염은 주로 글루쿠론산 부분이 염의 형태로 된 것을 말한다. 히알루론산은 절첩 가능한 쇄 부분과, D-글루쿠론산 부분의 카르복실기의 마이너스 전하의 상호 작용에 의해서 공간에 전개되기 쉽고, 이에 따라 대량의 물과 결합하여 겔을 형성할 수 있다. 또한, 저농도에서도 분자간의 힘이 강하기 때문에 비교적 높은 점성을 갖는다. 이러한 작용으로부터, 예를 들면 관절의 습윤 작용, 피부의 유연 작용 등을 가지고, 생리적으로도 이들의 역할을 담당하고 있다.

히알루론산류 중에서도 분자량 약 200만 Da의 히알루론산나트륨은, 분자량 약 80만 Da인 것에 비하여 의약품으로서, 변형성 무릎 관절증, 어깨 관절 주위염, 만성 관절 류마티스 등의 치료에 우수한 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다(문헌[약리와 치료, Vol.22, No.9, 289 (1994)]; 문헌[약리와 치료, Vol.22, No.9, 319 (1994)]). 또한, 그밖에 외과 수술 후의 유착 방지용으로서, 아울러 피부과 영역, 안과 영역에서도 의약품으로서의 효과가 알려져 있고, 일부는 임상적으로 일반적으로 사용되고 있다. 의약품으로서 이용하는 경우에는, 평균 분자량이 100만 이상인 히알루론산류를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 입수나 취급의 용이성을 감안하면, 평균 분자량 100만 내지 500만 Da의 히알루론산류가 의약품으로서는 바람직하고, 평균 분자량 150만 내지 400만 Da의 히알루론산류가 특히 바람직하다. 또한, 이러한 고분자량의 히알루론산류는 화장품 용도로서 사용했을 때에도, 그의 높은 보습력으로부터 우수한 효과를 발휘한다.

의약품으로서 히알루론산류를 용해하는 주사용 용해액으로서는, 주사용수, 생리 식염수 등에 산, 알칼리, 인산염과 같은 완충제를 포함하는 pH 조정제 등을 첨가한 일반적으로 이용되는 주사용 용해액(예를 들면, 각국 약전에서 인정되고 있는 것)을 적절하게 사용할 수 있다.

이들 히알루론산류는 동물 조직으로부터 추출하는 추출법에 의해 제조한 것일 수도 있고, 히알루론산 생산 미생물 균주를 이용하여 발효시켜 얻는 발효법으로 제조한 것일 수도 있다. 그러나, 동물 조직으로부터 추출한 것에는 다른 뮤코 다당 등의 불순물이 비교적 많고 분자량도 작기 때문에, 발효법으로 얻어지는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 적합한 발효법의 일례로서는, 예를 들면 스트렙토코커스속의 미생물을 사용하여 기지의 방법으로 히알루론산류를 얻을 수 있다.

발효법에 의해 얻어진 발효액을 본 발명의 방법 등에 이용하는 경우에는, 기지의 방법, 예를 들면 원심 분리나 여과 처리 등으로 제균한 액을 사용하는 것이 바람직하다. 경우에 따라서는, 투석 처리, 한외 여과 등에 의한 저분자 화합물의 제거, 정밀 여과 처리에 의한 수불용 미립자의 제거 등의 조작을 행할 수도 있고, 알코올 등의 수용성 유기 용매를 첨가하여 히알루론산을 석출 정제한 것을 사용할 수도 있다. 또한, 알루미나 등로 처리한 것을 이용할 수도 있다.

본 명세서에 있어서의 「스트렙토코커스」에는, 히알루론산을 생산할 수 있는 스트렙토코커스(Streptococcus)속의 임의의 세균·그의 변이주가 포함된다. 특히, 특허문헌 2에 기재된 스트렙토코커스 에퀴(streptococcus equi) FM-100(미공연균기 제9027호), 일본 특허 공개 (평)2-234689호 공보에 기재된 스트렙토코커스 에퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)과 같은 고수율로 안정적으로 히알루론산을 생산하는 변이주를 이용하는 것이 바람직하다. 히알루론산의 생산에 적합한 스트렙토코커스속의 세균의 예로서는 그 밖에, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 이들 변이주 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「평균 분자량」에 대해서, 특별히 기재하지 않는 한 히알루론산류의 평균 분자량을 나타낼 때에는 점도 평균 분자량을 말한다. 점도 평균 분자량은 당업자가 통상 행하는 방법에 의해 구할 수 있다. 바람직하게는, 각국의 약전 등에서 일반적으로 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있고, 보다 바람직하게는 일본 약전으로 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있다. 일례로서는, 예를 들면 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 그 평균 분자량은 극한 점도 [η]를 이용하여 다음 식에 의해 구할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「활성탄」이란, 시판되어 일반적으로 이용되고 있는 분리· 제거· 정제용의 다공질의 탄소를 말하며, 석탄 또는 목재 등의 원료의 유래나, 약정부활(藥晶賦活) 또는 수증기 부활 등의 제조 방법으로 한정되는 것은 아니고, 나아가 분말 활성탄, 입상 활성탄 등의 형상이나, 건식, 습식 등의 성상으로 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 방법 등에 있어서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 목재 유래의 활성탄을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 마찬가지로 수증기 부활에 의해 제조된 것(습식 활성탄)을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 자비(煮沸) 등의 전처리가 된 것(습윤화 처리 활성탄)이 바람직하다. 또한, 마찬가지로 분말 활성탄을 이용하는 것이 바람직하다.

활성탄의 구체예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 쯔루미콜 GL-30S, 쯔루미콜 HC-30S[이상 입상·(주)쯔루미콜 제조], 시라사기 WH5C8/32, 시라사기 LH2C20/48, 시라사기 WH2C8/32SS[이상, 입상·다케다 야꾸힝 고교(주) 제조], 시라사기 A, 시라사기 P, 정제 시라사기, 특성 시라사기, 카르보라핀[이상, 분말상·다케다 야꾸힝 고교(주) 제조], 호꾸에쯔 SD, 호꾸에쯔 GSA[이상, 분말상·호꾸에쯔 탄소 고교(주) 제조], 실버 A, 하나 F, 유끼 A[이상, 분말상·다이산 고교(주) 제조] 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「무기 흡착제」란, 예를 들면 Al₂O₃, SiO₂, MgO, CaO, Al(OH)₃등의 무기 화합물을 포함하는 흡착제이고, 그의 배합비나 제조 방법, 수화물의 유무 등으로 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 명세서에 있어서의 「무기 흡착제」에는, 활성탄은 포함되지 않는 것으로 한다.

무기 흡착제의 구체예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 몬모릴로나이트의 산 처리물을 포함하는 활성 백토, 예를 들면 닛카나이트 GHC-36, 닛카나이트 G-36, 닛카겔 M-30; SiO₂·Al₂O₃을 포함하는 흡착제, 예를 들면 닛카겔 S-6, 닛카겔 S-65[이상, 닛본 갓세이 하꾸도(주) 제조]; Al₂O₃·10SiO₂·xH₂O를 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-700NS; Al₂O₃·xH₂O을 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-200NS; Al(OH)₃·NaHCO₃을 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-400NS; 6MgO·Al₂O₃·CO₂·H₂O를 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-500NS; MgO·3SiO₂·xH₂O를 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-600NS; MgO를 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-100G, 토믹스 AD-100GG; MgO·Al₂O₃·2SiO₂를 포함하는 흡착제, 예를 들면 토믹스 AD-300NSS, 토믹스 AD-800과립, Q-Fiae2000, Q-Fiae3000[이상, 도미타 세이야꾸(주) 제조]; 합성 제올라이트 A-4, 합성 제올라이트 F-9[이상, 도요 소다 고교(주) 제조]; 천연 제올라이트[닛본 갓세이 하꾸도(주) 제조]; 벤토나이트[와코 준야꾸 고교(주) 제조] 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「유기 흡착제」란 유기 화합물을 포함하는 흡착제를 말하며, 그의 구조로 한정되는 것은 아니다.

유기 흡착제의 구체예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 셀룰로오스 유도체계 수지를 포함하는 흡착제, 예를 들면 DEAE-셀룰로오스, TEAE-셀룰로오스, ECTEOLA-셀룰로오스[이상, Serva Finebiochemica GmbH & Co 제조]; 폴리아미노산 유도체계 수지를 포함하는 흡착제, 예를 들면 PMLG, PMLG-ED, PMLG-PD, PMLG-BD; 세파덱스 유도체계 수지를 포함하는 흡착제, 예를 들면 DEAE-세파덱스, QAE-세파덱스[이상, 파마시아(주) 제조]; 키토산 유도체계 수지를 포함하는 흡착제, 예를 들면 쿠림바[이상, 구리다 고교(주) 제조]; 역상 크로마토그래피용 충전제로서 옥틸기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 예를 들면 YMC·GEL Co-300-S5; 옥타데실기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 예를 들면 YMC·GEL ODS-AQ60-S50, DS-AM-120-S50, YMC·GEL ODS-A120-S30/50, YMC·GEL ODS-AQ60-S50, YMC·GEL ODS-AD120-S50[이상, YMC 제조]; 옥타데실기를 합성 수지에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 예를 들면 ODP-400[이상, 아사히 가세이(주) 제조], OP-4 PW[이상, 도소(주) 제조]등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「불순물」이란, 히알루론산류, 물 이외의 용매 성분, 무기염 이외의 물질, 특히 최종 제품으로서의 히알루론산류를 이용할 때에 불이익을 줄 수 있는 물질(발열성 물질 등)을 말한다. 주된 불순물원으로서는, 히알루론산류의 생산 단계에서의 조직, 미생물 또는 배양액(배지) 유래의 것, 또는 그 후의 정제 단계 등에서 혼입된 것을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의 불순물의 예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 조직 또는 균체, 단백질, 핵산, 다당류, 저분자 화합물 또는 엔도톡신 등을 들 수 있다. 불순물로서의 조직 또는 균체에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 각각 추출법에서 이용한 추출 원료로서의 조직 유래의 조직편 등이나, 발효법에서 이용한 미생물의 균체 또는 균체편 등이 포함된다. 불순물로서의 단백질에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 조직, 균 유래의 단백질이나, 생산 후의 공정에서 혼입된 단백질 등이 포함된다. 불순물로서의 엔도톡신에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 균 유래의 리포 다당류 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「저분자 화합물」이란, 히알루론산류와 비교하여 분자량이 비교적 작은 화합물을 말하며, 예를 들면 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 분자량 2000 Da 이하, 또는 분자량 1000 Da, 또는 분자량 500 Da 이하의 화합물을 말한다. 이러한 저분자 화합물에는, 각종 아미노산, 유기산(예를 들면, 락트산), 당(예를 들면, 글루코오스) 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「클린 환경」이란, 공기 조절 관리함으로써 환경 유래의 균이나 엔도톡신 등의 불순물이 제품을 오염시킬 가능성이 매우 낮은 환경, 특히 의약(균, 엔도톡신-프리(Endotoxin-free)) 상당 제품의 제조 환경을 말한다.

클린 환경의 일례로서, 예를 들면 대상 물질이 이하와 같이 규제된 환경을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「제거」에는, 대상의 물질을 완전히 제거하는 것에 더하여, 부분적으로 제거하는(그 물질의 양을 감소시키는) 것도 포함된다. 본 명세서에 있어서의 「정제」에는, 임의의 또는 특정한 불순물을 제거하는 것이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 각각의 수치 범위에 대해서는, 「~」로 표시되는 상한값 및 하한값을 각각 포함하는 것으로 한다. 예를 들면, 「A~B」인 기재는 A 이상 B 이하인 것을 의미한다. 또한 「~를 함유한다」에는, 「~으로 실질적으로 이루어진다」 및 「~으로 이루어진다」가 포함되는 것으로 한다.

[실시 형태]

본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하의 실시 양태에 관한 것이다.

실시 양태 1:

(1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.

실시 양태 2:

(1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키고, 그에 따라 히알루론산 및/또는 그의 염을 정제하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염을 제조하기 위한 방법.

실시 양태 3:

상기 히알루론산류 용액의 pH가 2 내지 5인, 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.

실시 양태 4:

활성탄에, 상기 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 실시 양태 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 방법.

실시 양태 5:

상기 활성탄이 습윤화 처리 활성탄인, 실시 양태 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 6:

상기 접촉 공정 전에, 염화나트륨을 상기 히알루론산류 용액에 첨가하는 공정을 포함하는, 실시 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 7:

상기 불순물이, 균체, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 또는 엔도톡신을 포함하는 것인, 실시 양태 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 8:

상기 불순물이 단백질 또는 엔도톡신을 포함하는 것인, 실시 양태 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 9:

정제 후의 상기 히알루론산 및/또는 그의 염의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da인, 실시 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 10:

상기 히알루론산류 용액 내의 히알루론산 및/또는 그의 염의 농도가 1 내지 10 g/L인, 실시 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 11:

상기 공정이 클린 환경하에서 이루어지는 것인, 실시 양태 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 방법.

이하, 본 발명의 양태에 대해서 설명한다.

본 발명의 제1 양태(예를 들면, 실시 양태 1)는, (1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이다. 이 정제 방법에서는, 특정한 흡착제를 이용함으로써 불순물을 효율적으로 흡착·제거할 수 있다.

상기 제1 양태에 있어서 이용되는 흡착제는, 바람직하게는 (1) 활성탄, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 (1) 활성탄이다.

본 발명의 제2 양태(예를 들면, 실시 양태2)는, (1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키고, 그에 따라 히알루론산 및/또는 그의 염을 정제하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염을 제조하기 위한 방법이다. 이 제조 방법에서는, 특정한 흡착제를 이용하여 불순물을 효율적으로 흡착·제거함으로써, 순도가 높은 히알루론산을 효율적으로 제조할 수 있다.

상기 제2 양태에 있어서 이용되는 흡착제는, 바람직하게는 (1) 활성탄, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 (1) 활성탄이다.

상기 양태의 방법에 있어서 복수의 흡착제를 히알루론산류 용액과 접촉시킬 때에는, 동시에 접촉시킬 수도 있고 따로따로 접촉시킬 수도 있다. 또한, 복수의 흡착제를 혼합시킨 혼합 흡착제를 이용할 수도 있다.

상기 양태의 방법에 있어서는, 흡착제와 히알루론산류 용액을 접촉시킨 후 흡착제를 분리할 수도 있고, 그 경우 예를 들면 여과 또는 원심 분리 등에 의해 여액을 회수할 수 있다. 분리의 효율성이나 작업이 번잡성 등의 면에서, 분리 수단으로서는 여과를 행하는 것이 바람직하다.

분리의 수단으로서 여과를 행하는 경우, 흡착제 및 그에 흡착된 불순물을 분리할 수 있기만 하면 여과 방법이나 여과재가 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 막, 필터, 칼럼, 여과지 등을 이용하여, 상압하에서(자연 여과) 또는 가압하여 행해진다. 여과재의 재질은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 폴리프로필렌제 등의 각종 부직포, 세라믹, 셀룰로오스(여과지) 등을 들 수 있다. 또한, 규조토 등의 여과 보조제를 이용할 수도 있지만, 불순물(특히 금속/중금속)의 혼입 방지 측면에서는 여과 보조제를 이용하지 않는 것이 보다 바람직하다. 여과재의 공경에 대해서도 흡착제 및 그에 흡착된 불순물을 분리할 수 있으면 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 0.2 내지 50㎛의 공경의 것을 사용할 수 있다.

상기 양태의 방법 등에서 이용되는 무기 흡착제의 양은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 0.5 내지 20.0 중량％인 것이 바람직하고, 5.0 내지 20.0 중량％인 것이 더욱 바람직하다. 이들 범위 내에서는 보다 높은 정제(흡착) 작용을 기대할 수 있다.

상기 양태의 방법 등에서 이용되는 유기 흡착제의 양은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 0.5 내지 20.0 중량％인 것이 바람직하고, 5.0 내지 20.0 중량％인 것이 더욱 바람직하다. 이들 범위 내에서는 보다 높은 정제(흡착) 작용을 기대할 수 있다.

상기 양태의 방법에서 이용되는 활성탄의 양은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 0.5 내지 20.0 중량％인 것이 바람직하고, 5.0 내지 20.0 중량％인 것이 더욱 바람직하다. 이들 범위 내에서는 보다 높은 정제(흡착) 작용을 기대할 수 있다.

또한, 활성탄은 수성액 내에서의 가열 처리 등의 전처리를 실시한 습윤화 처리 활성탄인 것이 바람직하다. 습윤화 처리를 실시함으로써 활성탄의 불순물 흡착량이 높아지고 분산성이 상승하기 때문에, 불순물을 효율적으로 흡착·제거할 수 있는데다가, 정제시에 있어서 히알루론산류의 분자량의 저하를 감소시키는 것도 가능하고, 특히 고분자량(예를 들면, 정제 후(예를 들면, 흡착 처리에 계속되는 여과 후)의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da)의 히알루론산류의 정제에 있어서 우수한 효과를 발휘한다.

또한 활성탄의 원료로서는, 특히 생체에 적용할 때에 문제가 될 수 있는 불순물 등 측면에서는 목재 유래가 바람직하고, 그의 형상은 분산성이나 흡착 효율 측면에서 분말상이 바람직하다.

또한 활성탄을, 무기 흡착제와 유기 흡착제 중 어느 것 또는 쌍방과 혼합하여 혼합 흡착제로서 이용하는 경우, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 활성탄의 양은 상기 양태에 알맞는 범위 내인 것이 바람직하고, 혼합 흡착제의 총량은 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 20.0 중량％를 초과하지 않는 것이 바람직하고, 0.5 내지 20.0 중량％인 것이 더욱 바람직하고, 5.0 내지 20.0 중량％인 것이 가장 바람직하다. 이들 범위 내에서는 보다 높은 정제(흡착) 작용을 기대할 수 있다.

또한, 그 후에 필요해지는 분리·정제 공정 등을 고려하면, 추가의 정제 공정을 필요로 하는 성분의 혼입을 피하는 것이 바람직하다. 즉, 새로운 불순물의 혼입을 피하기 위한 본 발명의 다른 양태는, 상기 제1 양태에 있어서 흡착제로서 활성탄을 이용하고, 활성탄에 상기 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는 정제 방법 또는 대응하는 제조 방법, 나아가 상기 히알루론산류 용액을, 활성탄과 동시에 무기 흡착제 또는 유기 흡착제와 접촉시키는 공정을 포함하지 않는 정제 방법 또는 대응하는 제조 방법이다. 활성탄 단독으로도 충분한 흡착·분리 효과를 발휘하는 것이 가능하기 때문에, 새로운 불순물의 혼입을 피하는 것을 중시하는 경우에는 흡착제로서 활성탄 단독으로 처리하는 것이 바람직하다. 물론, 이 경우에도 활성탄에 의한 흡착 처리와는 별도로, 다른 정제 처리 등의 공정을 행할 수는 있다.

상기한 활성탄, 무기 흡착제, 유기 흡착제 또는 혼합 흡착제를 정제 대상인 히알루론산 용액과 접촉시킬 때에는, 이들 흡착제를 일회 현탁하고 그대로 유지하여도 좋지만, 지속적으로 현탁·교반하는 것이 바람직하다. 교반을 행하는 경우에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 10분간 내지 2시간의 교반이 바람직하고, 20분간 내지 1시간의 교반이 더욱 바람직하다.

상기 양태의 방법으로서는, 종래에는 처리가 곤란하였던 비교적 고농도(예를 들면, 1 g/L 내지 10 g/L)의 히알루론산류 용액에 대해서도 효율적으로 처리할 수 있다. 히알루론산류 농도는, 히알루론산류 용액의 용액 점도의 높이에 기인하는 취급의 곤란성 및 히알루론산류의 용해도 측면에서, 이것으로 한정되는 것은 아니지만 0.1 내지 20 g/L가 바람직하고, 0.5 내지 15 g/L가 더욱 바람직하고, 1 내지 10 g/L가 가장 바람직하다.

또한, 상기 양태의 방법에 있어서 히알루론산류 용액의 점도를 내릴 목적으로, 히알루론산류 용액에 염화나트륨 등의 염류를 공존시킬 수도 있다. 이 경우, 정제 효과가 손상되지 않도록 고농도의 염의 공존은 피하는 것이 바람직하다. 이러한 염의 공존의 구체예로서는, 0.1 내지 5 중량％의 염화나트륨을 히알루론산류 용액에 첨가하는 것을 들 수 있다.

상기 양태의 방법을 이용할 때의 히알루론산류 용액의 온도는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만 0 내지 80℃인 것이 바람직하다. 온도가 80℃ 이하이면, 처리 중의 히알루론산류의 분해 및 분자량의 저하를 강하게 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는, 히알루론산류 용액의 pH가 2 내지 5인 상기 양태의 방법이다. 이 정제 방법 또는 제조 방법에서는 특정한 pH 조건 하에서 흡착제, 특히 활성탄을 이용함으로써, 히알루론산류의 저분자량화는 낮게 억제하면서도 불순물을 효율적으로 흡착·제거할 수 있다. pH의 조정에 대해서는, 알맞는 pH 범위에 있는 히알루론산류 용액을 이용할 수도 있고, 산·염기를 이용하여 그 pH로 조정하는 pH 범위로 조정할 수도 있고, 또는 흡착·여과의 작업 공정에서 작업 용액을 특정한 pH로 조정할 수도 있다.

또한, 상기 양태의 방법에 의하면 특정한 pH 조건하에서 흡착제, 특히 활성탄을 이용함으로써 히알루론산류의 소실은 낮게 억제하면서도, 불순물로서, 일반적으로 활성탄에 의해 제거 가능해지는 고분자 화합물(예를 들면, 균체, 단백질, 핵산, 엔도톡신)뿐만 아니라, 저분자 화합물(예를 들면, 아미노산, 당, 유기산)까지도 효율적으로 분리·제거하는 것이 가능하였다. 또한, 상기 양태의 방법은 특정한 pH 조건하에서 흡착제, 특히 활성탄을 이용함으로써 생균, 단백질, 아미노산, 및/또는 엔도톡신의 제거에 우수한 효과를 발휘하고, 특히 단백질 및/또는 엔도톡신의 제거에 있어서는 더욱 우수한 효과를 발휘한다.

또한, 상기 양태의 방법에 의하면, 흡착 처리를 특정한 pH 범위에서 행함으로써 정제시에 있어서의 히알루론산류의 분자량의 저하를 감소시킬 수 있고, 특히 고분자량(예를 들면, 정제 후(예를 들면, 흡착 처리에 계속되는 여과 후)의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da)의 히알루론산류의 정제에서 우수한 효과를 발휘한다.

본 발명의 다른 양태는, 히알루론산류 용액의 pH가 4 내지 5인 상기 양태의 방법이다. 이 정제 방법 또는 제조 방법에서는 흡착제 또는 활성탄과 균체와의 흡착이 더욱 양호해지기 때문에, 정제의 정밀도가 상승함과 동시에 비교적 큰 공경(예를 들면, 균의 크기(약 1㎛)보다 큰 공경 등)의 여과재를 이용하여 여과하는 경우에도, 균체를 여과해 낼(균 누설을 막을) 수 있어 통액도 용이해진다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 양태에 있어서 히알루론산류가 스트렙토코커스 에퀴 FM-100(미공연조기 제9027호) 또는 스트렙토코커스 에퀴 FM-300(미공연조기 제2319호)에 의해 생산된다. 이들 미생물에 의해 생산된 히알루론산류를 정제 대상으로서 이용함으로써, 보다 불순물이 적게 고분자량의 히알루론산류 정제물을 얻을 수 있어, 특히 의약으로서 이용할 때는 우수한 효과를 발휘한다.

상기 양태의 정제 방법을 이용함으로써 히알루론산류의 분리·정제 공정의 부하를 경감시킬 수 있기 때문에, 상기 양태에 관한 정제 방법은 히알루론산류 제조의 공업적인 공정의 비교적 초기 단계에서 이용하는 것이 특히 유효하다.

또한, 상기 양태의 정제 방법을 클린 환경하에서 행함으로써, 종래에는 곤란하였던, 의약품에 요구되는 고품질의 히알루론산류의 공업적 규모에서의 효율적인 정제가 가능해진다. 이러한 정제 방법은 의약품용의 히알루론산류의 생산에 있어서 매우 높은 산업적 유용성을 갖는다.

또한, 상기 실시 양태, 상기 양태에 의해 설명되는 정제 방법 등은 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 예시하는 것을 의도하여 개시되어 있는 것이다. 본 발명의 기술적 범위는 특허 청구 범위의 기재에 의해 정해지는 것으로, 당업자는 특허 청구 범위에 기재된 발명의 기술적 범위에서 다양한 설계적 변경이 가능하다.

예를 들면, 상기 정제 방법은 또 다른 공정을 포함하거나, 또는 상기 정제 방법에 이어 또 다른 공정·방법이 실시되어 히알루론산류 등을 제조하는 방법일 수도 있다. 그와 같은 공정·방법으로서는, 예를 들면 히알루론산 생산 미생물 균주를 배양하는 공정, 히알루론산 생산 미생물 균주 배양액으로부터 배양 여액을 제조하는 공정, 정제 대상액을 원심 분리하는 공정, 대상액을 중화하는 공정, 정제 대상액을 정밀 여과하는 공정, 대상액을 투석 처리하는 공정, 정제 대상액에 방향족계 흡착 수지를 첨가하여 교반 및 한외 여과하는 공정, 대상액을 크로마토그래피로 정제하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 분리하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 제거하는 공정, 유기 용매를 첨가하여 히알루론산류를 침전시키는 공정, 히알루론산류를 결정화하는 공정, 히알루론산류를 건조시키는 공정 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

스트렙토코커스 에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호)을 이용하여 배양한 발효액 150 ml(히알루론산나트륨 농도 3.5 g/l, pH 4.0)를 300 ml의 유리 비이커에 채취하고, 표 1 또는 2에 나타내는 조건으로 흡착제 처리를 행하고, 자기 교반 막대를 이용하여 400 rpm에서 30분간 현탁 교반 처리하였다. 그 처리액을 여과지를 이용하여 가압 여과하고, 여액 150 ml에 염화나트륨 4.5 g(3.0 중량％)을 첨가한 후, 에탄올 600 ml로 히알루론산나트륨을 석출시켰다. 이 석출 히알루론산나트륨을 에탄올 300 ml로 세정한 후, 40℃에서 진공 건조시켜 히알루론산나트륨 0.5 g을 얻었다.

이와 같이 하여 얻어진 히알루론산나트륨을, 표 4에 나타내는 평가 항목, 평가 기준을 이용하여 평가하였다. 정제 조건 및 평가 결과를 표 2 및 3에 나타냈다.

또한, 흡착 처리시의 용액의 pH가 1일 때에는, 정제 대상인 히알루론산을 포함하는 배양액이 겔화되어 정제 공정(흡착 처리 등)을 할 수 없었다.

이상의 실험으로부터, 본 발명에 따른 정제 방법을 이용함으로써 히알루론산류 용액으로부터 불순물을 효과적으로 흡착 제거하여, 정제할 수 있다는 것이 확인되었다.

이상, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 이 실시예는 어디까지나 예시이고, 다양한 변형예가 가능하다는 것, 또한 그러한 변형예도 본 발명의 범위에 있다는 것은 당업자에게 이해되는 바일 것이다.

Claims

(1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하며,
상기 활성탄이 습윤화 처리 활성탄이고,
상기 무기 흡착제가, 활성 백토, SiO₂·Al₂O₃, Al₂O₃·10SiO₂·xH₂O, Al₂O₃·xH₂O, Al(OH)₃·NaHCO₃, 6MgO·Al₂O₃·CO₂·H₂O, MgO·3SiO₂·xH₂O, MgO, MgO·Al₂O₃·2SiO₂, 합성 제올라이트, 천연 제올라이트 또는 벤토나이트를 포함하고,
상기 유기 흡착제가, 셀룰로오스 유도체계 수지, 폴리아미노산 유도체계 수지, 세파덱스 유도체계 수지, 키토산 유도체계 수지, 옥틸기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 옥타데실기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 또는 옥타데실기를 합성 수지에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제를 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.
(1) 활성탄, (2) 무기 흡착제, (3) 무기 흡착제와 유기 흡착제, (4) 무기 흡착제와 활성탄, (5) 무기 흡착제와 유기 흡착제와 활성탄, (6) 유기 흡착제, 및 (7) 유기 흡착제와 활성탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 흡착제에, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 접촉시키고, 그에 따라 히알루론산 및/또는 그의 염을 정제하는 공정을 포함하며,
상기 활성탄이 습윤화 처리 활성탄이고,
상기 무기 흡착제가, 활성 백토, SiO₂·Al₂O₃, Al₂O₃·10SiO₂·xH₂O, Al₂O₃·xH₂O, Al(OH)₃·NaHCO₃, 6MgO·Al₂O₃·CO₂·H₂O, MgO·3SiO₂·xH₂O, MgO, MgO·Al₂O₃·2SiO₂, 합성 제올라이트, 천연 제올라이트 또는 벤토나이트를 포함하고,
상기 유기 흡착제가, 셀룰로오스 유도체계 수지, 폴리아미노산 유도체계 수지, 세파덱스 유도체계 수지, 키토산 유도체계 수지, 옥틸기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 옥타데실기를 실리카겔에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제, 또는 옥타데실기를 합성 수지에 화학적으로 결합시킨 역상 크로마토그래피용 충전제를 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염을 제조하기 위한 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루론산류 용액의 pH가 2 내지 5인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 활성탄에, 상기 히알루론산류 용액을 접촉시키는 공정을 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접촉 공정 전에, 염화나트륨을 상기 히알루론산류 용액에 첨가하는 공정을 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 불순물이, 균체, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 또는 엔도톡신을 포함하는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 불순물이 단백질 또는 엔도톡신을 포함하는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 정제 후의 상기 히알루론산 및/또는 그의 염의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루론산류 용액 내의 히알루론산 및/또는 그의 염의 농도가 1 내지 10 g/L인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정이 클린 환경하에서 이루어지는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 활성탄의 양이, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 5.0 내지 20.0 중량％이고,
상기 무기 흡착제의 양이, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 5.0 내지 20.0 중량％이며,
상기 유기 흡착제의 양이, 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 5.0 내지 20.0 중량％인, 방법.