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KR101636538B1 - Cell penetrating peptide comprising NP2 polypeptide or dNP2 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same - Google Patents

Cell penetrating peptide comprising NP2 polypeptide or dNP2 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same Download PDF

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KR101636538B1
KR101636538B1 KR1020130120094A KR20130120094A KR101636538B1 KR 101636538 B1 KR101636538 B1 KR 101636538B1 KR 1020130120094 A KR1020130120094 A KR 1020130120094A KR 20130120094 A KR20130120094 A KR 20130120094A KR 101636538 B1 KR101636538 B1 KR 101636538B1
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KR
South Korea
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recombinant
polypeptide
egfp
cargo
lys
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KR1020130120094A
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KR20140046994A (en
Inventor
최제민
김연호
임상호
김홍태
김원주
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 산학협력단 filed Critical 한양대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 인간 NLBP 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것으로, (1)인간 NLBP 유래의 NP2 또는 그의 변이체를 포함하는 세포막 투과 도메인, 및 (2)상기 세포막 투과 도메인과 융합된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a cell-permeable peptide derived from human NLBP and a cargo delivery system using the same, which comprises (1) a cell membrane permeation domain comprising NP2 derived from human NLBP or a mutant thereof, and (2) And contacting the cargo with the cell. The transmembrane domain of the present invention is capable of introducing cargo protein into cells with high efficiency as compared with conventional cell permeable peptides, and is a polypeptide sequence derived from human proteins, And can be usefully used as a signal sequence for transferring a polymer substance into a cell of a human body.

Description

인간 ＮＬＢＰ 유래의 ＮＰ2 폴리펩티드 또는 ｄＮＰ2 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템{Cell penetrating peptide comprising NP2 polypeptide or dNP2 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same}[0001] The present invention relates to a cell penetrating peptide comprising a human NLBP-derived NP2 polypeptide or a dNP2 polypeptide, and a cargo delivery system using the same. [0002] The present invention relates to a cell penetrating peptide comprising an NP2 polypeptide or a dNP2 polypeptide derived from human NLBP,

본 발명은 세포 투과 펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 NLBP 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a cell permeable peptide, and more particularly, to a cell permeable peptide derived from human NLBP and a cargo delivery system using the same.

일반적으로, 살아있는 세포는 단백질 및 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다는 사실은, 단백질 또는 핵산을 포함하는 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 대한 제한 요인이 되고 있다. 한편, 대부분의 치료, 예방 및 진단의 목적으로 제조되는 물질들은, 이것의 진단, 예방 및 치료학적 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 이와 같이, 생체 외(in vitro)에서 세포 내로 거대 분자를 전달하는 방법에는 전기충격(electroporatio), 리포좀을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트랜스펙션(trasnfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 전형적으로 거대 분자를 주입시키고자 하는 전체 세포 수 중에서 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향이 있다. 또한, 생체 내에서 세포 내로 거대 분자를 실험적으로 이동시키는 방법으로서, 칼슘-인 침전, 라이포좀 등을 이용하는 방법이 있으나, 이러한 기술들은 생체 내에서 세포 내로 물질을 전달함에 있어 그 사용이 극히 제한적이라는 문제점이 있다.In general, living cells are impermeable to macromolecules such as proteins and nucleic acids. The fact that only a few substances can penetrate into the cell cytoplasm or nucleus inside the cell through the cell membrane of a living cell at a very low rate, whereas the fact that a macromolecule can not enter the cell can be attributed to the fact that a macromolecule containing a protein or nucleic acid It is becoming a limiting factor for treatment, prevention and diagnosis. On the other hand, substances produced for the purpose of most treatment, prevention and diagnosis are required to be delivered into cells in a diagnostic, preventive and therapeutically effective amount thereof, Methods have been developed. As such, methods of delivering macromolecules into cells in vitro include electroporation, membrane fusion using liposomes, high concentration projection using microtransfer coated with DNA on the surface, Transfection with DEAE-dextran, infection with modified viral nucleic acid, direct microinjection into single cells, and the like. However, these methods typically only deliver only a fraction of the total number of cells that they intend to inject macromolecules, and tend to have undesirable effects on many other cells. In addition, there is a method of experimentally transferring macromolecules into cells intracellularly by using calcium-phosphorus precipitation, lyphosome, etc. However, these techniques are very limited in their use for transferring substances into cells in vivo There is a problem.

이러한 문제점을 해결하기 위한 연구의 결과로서 제시된 것으로 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)(단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD) 또는 막 전달 서열(membrane translocating sequence, MTS)라고도 칭하나, 본 발명에서는 세포 투과 펩티드(CPP)로 통일하여 지칭하도록 한다.)가 있다. 이러한 CPP는 양전하를 띄는 짧은 길이의 펩티드로서, 세포막을 통과할 수 있다고 알려져 있으며, 단백질뿐 아니라 DNA, RNA, 지방, 탄수화물, 화합물 또는 바이러스까지도 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 알려져 있다. CPP가 세포막을 투과하는 원리는 아직 밝혀지지 않았으나, 수용체 비의존적이고, 엔도사이토시스(endocytosis)나 파고사이토시스(phagocytosis)에 비의존적이라고 생각되고 있다. As a result of studies for solving these problems, a cell penetrating peptide (CPP) (also referred to as a protein transduction domain (PTD) or a membrane translocating sequence (MTS) (CPP) to be referred to as a cell permeable peptide (CPP). These CPPs are known to be able to pass through cell membranes as short positively charged peptides and are capable of efficiently delivering not only proteins but also DNA, RNA, fats, carbohydrates, compounds or viruses into cells. The principle that CPP permeates the cell membrane is not yet known, but it is thought to be receptor-independent and independent of endocytosis or phagocytosis.

종래 가장 널리 알려진 CPP로는 HIV-1 TAT, HSV-1 VP22, 초파리의 Antp, 쥐의 전사인자의 Mph-1(대한민국 특허공개번호 제2004-0083429호), 그리고 최근에 밝혀진 HP4(PCT특허 출원번호 PCT/KR2006/000759, PCT/KR2006/000790) 등이 있다. 그 중 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1) Tat 단백질은 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질이다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991). 상기 Tat 단백질이 세포막을 투과하는데 결정적인 역할을 하는 11개의 아미노산 서열인 'YGRKKRRQRRR'이 CPP이고, 이를 TAT이라 칭한다. 상기 TAT을 이용해 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, PE 도메인(domain of Pseudomonas exotoxin A(PE)) 등을 세포 내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 위치(localization)에 대한 연구가 진행된 바 있다(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994). 또 다른 CPP로 알려져 있는 것 중 HSV-1(Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포막 투과 펩티드가 있다. 상기 BVP22는 'DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE'인 34개의 아미노산 서열로 이루어졌다. 상기 VP22 CPP 역시 단백질의 세포 내 전달 기작 연구 등을 위하여 Viral nucleoprotein, Bovine IFN-γ, Viral F protein 등을 세포내로 전달하는 실험에 이용된 바 있다(Dilber, M. S. et al., Gene Ther 6 : 12-21, 1999). 또한, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin(Antp)이라는 CPP, 그리고 인공적으로 조합/합성해낸 세포막 투과 펩티드인 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan이 있다(Barany-wallje, E. et al., Biophysical Journal 89 : 2513-2521, 2005, Pooga, M. et al., FASEB J 12 : 67-77, 1998). 뿐만 아니라, 인간과 가장 유사한 종인 쥐의 단백질로부터 유래된 세포막 투과 펩티드인 Mph-1(Hph-1)을 이용해서 면역 세포의 전사인자를 세포내로 전달해 면역 질환이 유도된 쥐의 질병 모델이 질병의 완화 및 치료 효과를 보인 연구결과도 있다(Choi, J. M. et al., Nat. Med. 12 : 574-579, 2006). CPP가 생체 내에서도 효과적으로 작용하며, 이를 이용한 단백질의 전달이 생체 내의 세포에서 효과적으로 그 기능을 수행함을 보인 연구라 할 수 있다.The most widely known CPPs are HIV-1 TAT, HSV-1 VP22, Drosophila Antp, rat transcription factor Mph-1 (Korean Patent Publication No. 2004-0083429), and recently discovered HP4 (PCT Patent Application No. PCT / KR2006 / 000759, PCT / KR2006 / 000790). Among them, HIV-1 (human immunodeficiency virus-1) Tat protein is the first protein that has been confirmed to pass through the cell membrane (Mann, D. A. et al., Embo J 10: 1733-1739, 1991). The 11 amino acid sequence 'YGRKKRRQRRR', which plays a crucial role in the permeation of the Tat protein through the cell membrane, is CPP and is referred to as TAT. The function and localization of β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, and PE domain (domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)) were carried out using TAT, , S. et al., PNAS 91: 664-668, 1994). Another known CPP is the same transmembrane peptide derived from VP22, a protein expressed by HSV-1 (Herpes simplex virus type 1). The BVP22 was composed of 34 amino acid sequences of 'DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE'. The VP22 CPP has also been used for the intracellular delivery of viral nucleoprotein, Bovine IFN-y, Viral F protein and the like for the study of intracellular delivery mechanisms of proteins (Dilber, MS et al., Gene Ther 6: 12 -21, 1999). In addition, there is a transportin comprising 27 amino acid sequences, Penetratin (Antp) CPP consisting of 16 amino acid sequences derived from Antennapedia homeoprotein, a transcription factor essential for the development of Drosophila, and artificially combined / synthesized transmembrane peptide Barany-wallje, E. et al., Biophysical Journal 89: 2513-2521, 2005, Pooga, M. et al., FASEB J 12: 67-77, 1998). In addition, Mph-1 (Hph-1), a transmembrane peptide derived from rat protein, which is the most similar species to human, is used to transduce the transcription factor of the immune cell into the cell, so that the disease model of the immune- (Kim et al., 2004). In addition, there are studies that showed mitigation and treatment effects (Choi, JM et al., Nat. Med. 12: 574-579, 2006). CPP effectively works in vivo, and the transfer of the protein using the CPP effectively functions in cells in vivo.

상기와 같은 종래의 CPP들은 모두 세포 에너지를 이용하여 특정 수용체나 채널 분자의 도움 없이 외부로부터 세포 내로 단백질을 전달할 수 있게 해 준다(Kelly, M. S. et al., Org. Biomol. Chem. 6 : 2242-2255, 2008). 또한, 단백질 뿐만 아니라 핵산이나 지방 등의 다른 고분자들을 세포내로 전달하는 것도 가능하다고 알려져 있어, 이를 이용한 유전자의 세포내 도입 혹은 치료 약물의 세포내 전달 등에 의한 연구가 진행되고 있는 상황이다(Lim, S. J. et al., BioWave 8 : No 14, 2006).All of the above conventional CPPs allow the transfer of proteins from the outside into cells without the aid of specific receptors or channel molecules using cellular energy (Kelly, MS et al., Org. Biomol. Chem. 6: 2242- 2255, 2008). In addition, it is known that it is also possible to transfer not only proteins but also other polymers such as nucleic acids and fats into cells, and studies are under way by intracellular introduction of genes using them or intracellular delivery of therapeutic drugs (Lim, SJ et al., BioWave 8: No 14, 2006).

상기와 같이, 세포 내로 단백질과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하기 위해 종래 수많은 연구를 통해 다양한 세포막 투과 펩티드들이 발견되거나 개발되어 왔다. 하지만 상기와 같이 종래의 세포막 투과 펩티드들은 HIV-1 또는 초파리 등과 같이 다른 종이 발현하는 단백질에서 유래한 것이거나, 세포막 투과 펩티드를 구성하는 아미노산 서열을 통해 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이었다. 이와 같이 CPP로서 역할을 하는 펩티드들이 인간에서 유래하지 않았다는 점으로 인하여, 인체에 적용해서 사용할 때에 원하지 않는 면역반응이 일어나는 등 부작용이 발생할 여지가 있다. 또한 종래의 세포막 투과 펩티드들은 10개 이상(VP22의 경우 34개의 아미노산으로 구성됨)의 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있기 때문에 상기와 같은 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 커지게 된다. 뿐만 아니라, 이렇게 긴 아미노산 서열의 CPP와 카고 물질이 융합된 재조합 물질의 상산에 비효율적인 영향을 나타낼 여지가 있다.As described above, various transmembrane peptides have been discovered or developed through numerous studies to deliver high molecular substances such as proteins into cells into cells. However, as described above, the conventional cell membrane permeable peptides originated from proteins expressing other species such as HIV-1 or Drosophila, or were amino acid sequences synthesized artificially through amino acid sequences constituting the cell membrane permeable peptides. Since peptides acting as CPPs are not derived from humans, there is a possibility that adverse effects such as an unwanted immune reaction occur when they are applied to a human body. In addition, conventional membrane permeable peptides are composed of long amino acid chains of 10 or more (composed of 34 amino acids in the case of VP22), so that the likelihood of causing such unwanted immune responses becomes larger. In addition, there is room for an ineffective effect on the uptake of the CPP of such a long amino acid sequence and the recombinant material fused with the cargo material.

이에, 종래의 비인간 유래의 단백질에서 유래한 CPP들을 대체하면서도 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 CPP의 개발이 필요한 실정이다.
Therefore, it is necessary to develop human-derived CPP capable of introducing cargo material into cells with high efficiency while replacing CPPs derived from conventional non-human-derived proteins.

본 발명의 목적은 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a human-derived cell penetrating peptide capable of introducing a cargo substance into cells with high efficiency.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 폴리펩티드군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 한번 이상 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is a polypeptide comprising a NP2 polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from human NLBP (Novel LZAP Binding Protein) and a polypeptide group consisting of a variant of the NP2 polypeptide Providing a cell membrane transmembrane domain comprising at least one polypeptide at least once.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고 단백질을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a recombinant cargo protein comprising the steps of: preparing a recombinant cargo protein having a cargo protein fused at the N-terminal or C-terminal of the transmembrane domain; And contacting the produced recombinant cargo protein with the cell.

본 발명의 인간 NLBP 유래 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.The human NLBP-derived cell membrane transmembrane domain of the present invention can introduce cargo proteins into cells at a higher efficiency than conventional cell-penetrating peptides, and can be used as a polypeptide sequence derived from human proteins, Bar, and various polymeric substances into the cells of the human body.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제작한 인간 NLBP 유래의 세포막 투과 도메인(NP2 및 dNP2)과 EGFP의 융합 단백질(재조합 EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 PCR 산물인 768bp 및 807bp의 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 젤 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제작한 재조합 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 절단하고 1% 아가로스 젤 전기영동하여, 상기 재조합 pRSET-b 벡터에 실시예 1에서 제작한 768bp 및 807bp의 재조합 EGFP 융합 단백질의 유전자가 제대로 삽입되었음을 확인한 젤 사진이다.
도 3은 재조합 pRSET-b 벡터의 맵을 나타내는 것으로서, (A)는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 벡터 맵을 나내는 것이고; (B)는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 백터 맵을 나타내는 것이다.
도 4는 재조합 EGFP 융합 단백질과 야생형(wild type) EGFP 단백질을 12% SDS 젤로 전기영동한 젤 사진으로서, EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP2은 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 5는 재조합 EGFP 융합 단백질이 농도 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프로서, (A) 및 (B)는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질과 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 세포 내 도입 효율을 측정한 결과이고, (C)는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질과 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 세포내 도입 효율을 재조합 TAT-EGFP 융합 단배질과 비교한 결과을 나타내는 것이다. 상기 도 5의 (A) 내지 (C)에서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP2-EGFP는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2-EGFP는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph-1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 6은 재조합 EGFP 융합 단백질이 시간 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 상기 도 6의 (A) 및 (B)에서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP2-EGFP는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2-EGFP는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph-1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 세포막 투과 도메인과 종래의 CPP들의 세포 내 도입 효율을 비교한 결과로서, (A)는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 카고 전달 효율을 비교한 그래프이고, (B)는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 카고 전달 효율을 비교한 그래프이다. 상기 도 7의 (A) 및 (B)에서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP2-EGFP는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2-EGFP는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph-1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이고; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며; R9-EGFP는 R9과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 8은 온도의 변화(A) 및 배지 내 혈청 농도의 변화(B)에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드들과 비교한 그래프로서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP2-EGFP는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2-EGFP는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 9는 헤파린의 선처리 농도에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드 TAT과 비교한 그래프로서, NP2-EGFP는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; dNP2-EGFP는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 10은 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질(A) 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질(B)가 HeLa 세포 내로 전달되었음을 확인한 현미경 사진이다.Figure 1 shows the results of PCR amplification of 768 bp and 807 bp double-stranded DNA fragments encoding the fusion protein (recombinant EGFP fusion protein) of EGFP and the cell membrane transmembrane domains (NP2 and dNP2) derived from human NLBP prepared in Example 1 of the present invention It is a gel photograph confirmed by 1% agarose gel electrophoresis.
FIG. 2 is a diagram showing the result of digesting a pRSET-b vector (recombinant pRSET-b vector) into which a polynucleotide sequence encoding a recombinant EGFP fusion protein prepared in Example 2 of the present invention has been inserted by using NheI and HindIII restriction enzymes and digesting 1% agarose Gel electrophoresis and confirmed that the genes of the 768 bp and 807 bp recombinant EGFP fusion proteins prepared in Example 1 were properly inserted into the recombinant pRSET-b vector.
Figure 3 shows a map of the recombinant pRSET-b vector, (A) representing the vector map of the vector into which the recombinant NP2-EGFP fusion protein was inserted; (B) represents a vector map of the vector into which the recombinant dNP2-EGFP fusion protein is inserted.
FIG. 4 is a gel photograph of a recombinant EGFP fusion protein and a wild type EGFP protein electrophoresed on 12% SDS gel, wherein EGFP represents a wild-type EGFP protein; NP2 represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2 represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein.
FIG. 5 is an intracellular fluorescence intensity analysis graph showing that the recombinant EGFP fusion protein was introduced into Jurkat cells in a concentration-dependent manner. FIGS. 5A and 5B are graphs showing changes in the concentration of the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2- (C) shows the results of comparing the intracellular introduction efficiency with the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein with the recombinant TAT-EGFP fusion protein. 5 (A) to 5 (C), Negative indicates a cell that has not been subjected to any treatment; EGFP represents a wild-type EGFP protein; NP2-EGFP represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2-EGFP represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein; Hph-1-EGFP represents a fusion protein of Hph-1 and EGFP; TAT-EGFP is a fusion protein of TAT and EGFP.
6 is an intracellular fluorescence intensity analysis graph showing that the recombinant EGFP fusion protein was introduced into Jurkat cells in a time-dependent manner. In FIGS. 6A and 6B, Negative represents cells that have not been subjected to any treatment; EGFP represents a wild-type EGFP protein; NP2-EGFP represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2-EGFP represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein; Hph-1-EGFP represents a fusion protein of Hph-1 and EGFP; TAT-EGFP is a fusion protein of TAT and EGFP.
FIG. 7 is a graph comparing the transmembrane domain of the present invention with the intracellular introduction efficiency of conventional CPPs, wherein (A) is a graph comparing cargo transfer efficiencies of recombinant NP2-EGFP fusion proteins, and (B) -EGFP < / RTI > fusion protein of the present invention. In FIGS. 7A and 7B, Negative indicates a cell that has not been subjected to any treatment; EGFP represents a wild-type EGFP protein; NP2-EGFP represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2-EGFP represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein; Hph-1-EGFP represents a fusion protein of Hph-1 and EGFP; TAT-EGFP represents a fusion protein of TAT and EGFP; R9-EGFP represents a fusion protein of R9 and EGFP.
FIG. 8 is a graph comparing changes in intracellular cargo transfer efficiency of the cell membrane permeation domain of the present invention with conventional cell membrane permeation peptides according to the change in temperature (A) and the change in serum concentration in medium (B) Represents cells that have not undergone anything; EGFP represents a wild-type EGFP protein; NP2-EGFP represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2-EGFP represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein; TAT-EGFP is a fusion protein of TAT and EGFP.
FIG. 9 is a graph comparing the change in the intracellular cargo transfer efficiency of the cell membrane permeation domain of the present invention with the pretreatment concentration of heparin and the conventional cell membrane permeation peptide TAT, wherein NP2-EGFP represents a recombinant NP2-EGFP fusion protein; dNP2-EGFP represents a recombinant dNP2-EGFP fusion protein; TAT-EGFP is a fusion protein of TAT and EGFP.
10 is a photomicrograph showing that the recombinant NP2-EGFP fusion protein (A) and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein (B) were transferred into HeLa cells.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.First, terms used in the specification of the present invention will be described.

본 발명에서 일컫는 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 4개 내지 1000개의 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 사슬 형태의 고분자를 의미하며, '폴리펩티드'와 상호 혼용가능한 의미이다. "Peptide" referred to in the present invention means a polymer in the form of a chain formed by bonding 4 to 1000 amino acid residues to each other by peptide bonding, and is capable of intermingling with a 'polypeptide'.

또한, 본 발명에서 일컫는 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미한다.In addition, 'polynucleotide' referred to in the present invention means a polymer compound in which a nucleotide, which is a chemical monomer composed of three elements of base, sugar, and phosphate, is linked in a chain form through a plurality of phosphate ester bonds.

또한, 본 발명에서 일컫는 '세포막 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)'는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 가진 펩티드를 의미하며, '세포막 투과 도메인'과 상호 혼용가능한 의미이다.In addition, 'cell penetrating peptide (CPP)' referred to in the present invention means a peptide capable of delivering cargo, which is a target to be delivered, in cells in vitro or in vivo, It is possible to intermix with the 'transmembrane domain'.

또한, 본 발명에서 일컫는 '카고(cargo)'는 상기 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 본래 세포 내로 도입될 수 없거나, 본래 유용한 속도로 세포 내로 도입될 수 없는 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질을 의미한다.In addition, 'cargo' referred to in the present invention is a biologically active function-controlling substance that binds to the transmembrane domain of the cell membrane and is delivered into cells to control all physiological phenomena in the living body. It can not be originally introduced into cells, Compounds capable of regulating cell functions such as vectors, polynucleotides, polypeptides, fats, carbohydrates and anticancer agents, therapeutic agents for immune diseases, antiviral therapeutic agents, animal growth, development or differentiation factors, etc. which can not be introduced into cells at a useful rate Means the same chemical.

또한, 본 발명에서 일컫는 '재조합 카고'란 세포막 투과 도메인 및 한 개 이상의 카고가 유전적 융합이나 화학 결합에 의해 재조합되어 형성된 복합체를 의미한다.Also, the term 'recombinant cargo' referred to in the present invention means a complex formed by recombination of transmembrane domain and one or more cargoes by genetic fusion or chemical bonding.

또한, 본 발명에서 일컫는 '접촉'이란 카고 또는 재조합 카고가 진핵 또는 원핵세포와 접하는 것을 의미하며, 이러한 접촉에 의하여 상기 카고 또는 재조합 카고가 상기 진핵 또는 원핵세포의 내로 전달된다.The term 'contact' as used in the present invention means that a cargo or a recombined cargo is in contact with a eukaryotic or prokaryotic cell, and the cargo or recombined cargo is transferred into the eukaryotic or prokaryotic cell by such contact.

아울러, 본 발명에서 단백질, 펩티드, 유기화합물 등을 세포 내로 '도입'시키는 것에 대하여 '운반', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'한다는 표현들과 상호 혼용한다.
In addition, in the present invention, the terms 'transport', 'infiltration', 'transport', 'transmission', 'permeation', or 'pass' are mutually interchanged with respect to the introduction of proteins, peptides, do.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. One. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고The transmembrane domain and the recombinant cargo containing it

본 발명의 일 측면은 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 폴리펩티드군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 한번 이상 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.One aspect of the present invention includes at least one polypeptide selected from the group consisting of a NP2 polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 derived from a human NLBP (Novel LZAP Binding Protein) and a polypeptide consisting of a variant of the NP2 polypeptide RTI ID = 0.0 > transmembrane < / RTI >

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고를 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a cell membrane-permeable domain; And a cargo fused to the N-terminal or C-terminal of the transmembrane transmissive domain, wherein the cell membrane permeability is improved.

본 발명의 세포막 투과 도메인은 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 폴리펩티드군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 한번 이상 포함한다. The transmembrane domain of the present invention comprises at least one polypeptide selected from the group consisting of NP2 polypeptides and polypeptides consisting of variants of said NP2 polypeptides.

상기 NP2 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 794개의 아미노산으로 구성되는 서열번호 12의 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 서열 중 444번째 내지 454번째 아미노산 서열에 해당하는, 11개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다. 상기 NP2 폴리펩티드는 상기 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.The NP2 polypeptide is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has 11 amino acid residues corresponding to the 444th to 454th amino acid sequence of the human NLBP (Novel LZAP Binding Protein) sequence of SEQ ID NO: 12 consisting of 794 amino acids Amino acid. The NP2 polypeptide derived from human NLBP can be used as a transmembrane domain of the present invention or as a part thereof because of its ability to transfer cargo as a carrier into cells in vitro or in vivo. The NP2 polypeptide is not particularly limited as long as it is a polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1, but is preferably encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 2.

상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP2 폴리펩티드의 일부 아미노산 잔기가 유사한 물리적 성질을 가지는 다른 종류의 아미노산으로 치환된 다양한 종류의 아미노산 서열들로서, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들은 하기 화학식 1의 아미노산 서열로 구성된다.Variants of the NP2 polypeptide are various kinds of amino acid sequences in which some amino acid residues of the NP2 polypeptide are substituted with other kinds of amino acids having similar physical properties, and variants of the NP2 polypeptide are composed of the amino acid sequence of the following formula (1).

[화학식 1][Chemical Formula 1]

XX 1One -Ile-X-Ile-X 22 -X-X 33 -Val-X-Val-X 44 -X-X 55 -X-X 66 -Gly-X-Gly-X 77 -X-X 88

상기 화학식 1에서, X1 내지 X8은 서로 독립적으로 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 일 수 있다(단, X1 내지 X6 및 X8이 리신(Lys)이고, X7이 아르기닌(Arg)인 경우는 상기 NP2 폴리펩티드와 서열이 동일해 지므로 제외한다.). 특히, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들은 상기 화학식 1에서 상기 X1 내지 X8이 서로 독립적으로 아르기닌(Arg) 및 리신(Lys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 일 예로, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 화학식 1에서 상기 X1 내지 X8이 모두 리신(Lys) 또는 모두 아르기닌(Agr)인 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP2 폴리펩티드와 유사한 물리적·화학적 성질을 가지기 때문에, 상기 NP2 폴리펩티드와 같이 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다.In Formula 1, X 1 to X 8 may independently be any amino acid selected from the group consisting of arginine (Arg), lysine (Lys) and histidine (wherein X 1 to X 6 and When X 8 is lysine (Lys) and X 7 is arginine (Arg), the sequence is the same as that of the NP2 polypeptide. In particular, mutants of the NP2 polypeptide are preferably composed of an amino acid sequence of any one selected from the group consisting of arginine (Arg) and lysine (Lys), wherein X 1 to X 8 in the above formula (1) are independently from each other. For example, the variant of the NP2 polypeptide may be an amino acid sequence in which X 1 to X 8 in the above general formula (1) are both lysine or arginine (Agr). Since the variant of the NP2 polypeptide has similar physical and chemical properties to the NP2 polypeptide, it is capable of delivering the cargo to be delivered in vitro or in vivo, such as the NP2 polypeptide, Can be used as the transmembrane domain of the present invention itself or a part thereof.

상기 세포막 투과 도메인은 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 한 번 포함할 수 있다. 즉, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP2 폴리펩티드를 한 번만 포함하여 구성되거나, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들 중 어느 하나를 한 번만 포함하여 구성될 수 있다. The transmembrane domain may include any one polypeptide selected from the group consisting of NP2 polypeptides and variants of the NP2 polypeptides. That is, the transmembrane domain may comprise the NP2 polypeptide only once, or may comprise any one of the variants of the NP2 polypeptide only once.

또한, 상기 세포막 투과 도메인은 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 폴리펩티드군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 두 번 이상 포함할 수 있다. 즉, 상기 세포막 투과 도메인은 NP2 폴리펩티드를 두 번 이상 포함하여 구성되거나, NP2 폴리펩티드의 변이체들 중에서 어느 하나의 폴리펩티드를 두 번 이상 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들 중에서 선택되는 서로 다른 두 개의 폴리펩티드를 각각 한 번 이상씩 포함하여 구성될 수도 있다.In addition, the transmembrane domain may include at least one polypeptide selected from the group consisting of NP2 polypeptides and variants of the NP2 polypeptides. That is, the transmembrane domain may comprise two or more NP2 polypeptides or two or more polypeptides of the NP2 polypeptide. In addition, the transmembrane domain may comprise two or more different polypeptides selected from mutants of the NP2 polypeptide.

특히, 상기 세포막 투과 도메인이 NP2 폴리펩티드를 두 번만 포함하여 구성되는 경우, 상기 세포막 투과 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 dNP2 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 dNP2 폴리펩티드는 상기 NP2 폴리펩티드 두 개가 "-Gly-Ser-"에 의하여 서로 연결된 폴리펩티드로서, 종래 TAT, Mph-1(Hph-1), R9 등의 세포막 투과 도메인에 비하여 월등히 우수한 세포막 투과 활성을 가진다. 상기 dNP2 폴리펩티드는 상기 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.In particular, when the transmembrane domain comprises the NP2 polypeptide only twice, the transmembrane domain may comprise a dNP2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The dNP2 polypeptide is a polypeptide in which two NP2 polypeptides are linked to each other by "-Gly-Ser-", and exhibits a remarkably superior cell membrane permeation activity as compared with the transmembrane domains such as TAT, Mph-1 (Hph-1) and R9 . The dNP2 polypeptide is not particularly limited as long as it is a polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 7, but is preferably encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 8.

또한, 상기 세포막 투과 도메인은 카고를 세포 내로 도입시키는 효율이 유지되는 범위 내에서 상기 세포막 투과 도메인을 구성하는 아미노산의 개수에는 특별한 제한이 없으나, 11개 내지 100개의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하고, 상기 세포막 투과 도메인은 11개 내지 70개의 아미노산으로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 상기 세포막 투과 도메인은 11개 내지 50개의 아미노산으로 구성되는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 상기 세포막 투과 도메인이 상기 NP2 폴리펩티드를 한 번만 포함하여 구성되는 경우, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP2 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 0개 내지 89개의 아미노산이 추가적으로 결합되어 구성될 수 있다. 상기와 같이 NP2 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 추가되는 아미노산 서열 또한 인간 NLBP에서 유래한 것이 바람직하고, 서열번호 12로 구성되는 인간 NLBP의 폴리펩티드 서열 중 연속되는 일부 서열로서, NP2 폴리펩티드를 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP2 폴리펩티드 자체만으로 구성될 수 있다.In addition, the number of amino acids constituting the transmembrane domain is not particularly limited within the range in which the efficiency of introducing cargo into cells is maintained, but it is preferably composed of 11 to 100 amino acids, More preferably, the transmembrane domain comprises 11 to 70 amino acids, and most preferably the transmembrane domain comprises 11 to 50 amino acids. For example, when the transmembrane domain comprises the NP2 polypeptide only once, the transmembrane domain may comprise 0 to 89 amino acids at the N- or C-terminus of the NP2 polypeptide . The amino acid sequence added to the N-terminal or C-terminal of the NP2 polypeptide as described above is also preferably derived from human NLBP, and is a partial sequence of the polypeptide sequence of human NLBP consisting of SEQ ID NO: 12, which comprises NP2 polypeptide But the present invention is not limited thereto, and the cell membrane transmembrane domain may be composed of only the NP2 polypeptide itself.

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인은 종래 잘 알려진 CPP인 TAT 서열, Mph-1(Hph-1) 서열 또는 R9 서열 등에 비하여 카고를 세포 내로 도입시키는 효율이 우수하다.The transmembrane domain of the present invention is superior in efficiency of introducing cargo into cells compared to the well known CPPs such as TAT sequence, Mph-1 (Hph-1) sequence or R9 sequence.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 11개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 1의 NP2 폴리펩티드로 구성된 세포막 투과 도메인 또는 24개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 7의 dNP2 폴리펩티드로 구성된 세포막 투과 도메인을 EGFP 단백질에 융합하여 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 도입 효율이 현저히 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 또한, 종래의 TAT 서열, Mph-1(Hph-1) 서열 또는 R9 서열에 비하여 EGFP의 세포 도입 효율이 더욱 향상됨을 확인하였다(도 7의 (A) 및 (B) 참조).In a specific embodiment of the present invention, the cell membrane transmembrane domain consisting of 11 amino acid NP2 polypeptides of SEQ ID NO: 1 or the dNP2 polypeptide of SEQ ID NO: 7 consisting of 24 amino acids is fused to the EGFP protein to form Jurkat cells and HeLa Cells. As a result, it was confirmed that the cell introduction efficiency of EGFP was remarkably improved (see FIGS. 5 and 6). In addition, it was confirmed that the cell introduction efficiency of EGFP was further improved as compared with the conventional TAT sequence, Mph-1 (Hph-1) sequence or R9 sequence (see FIGS. 7A and 7B).

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에는 카고가 결합될 수 있다. 상기 카고는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질일 수 있다. 상기 카고는 상기 세포막 투과 도메인과 융합하거나, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 결합됨으로써 진핵 또는 원핵세포 내로의 도입 효율이 향상된다. 특히, 상기 카고가 단백질(카고 폴리펩티드)인 경우, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질(카고 폴리펩티드)이 융합된 재조합 카고 단백질(재조합 카고 폴리펩티드)이 되고, 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 세포 내 도입 효율이 향상된다.Cargo may be attached to the N-terminal or C-terminal of the transmembrane domain of the present invention. The cargo may be a chemical substance such as a polynucleotide, a polypeptide, a fat, a carbohydrate, and a compound capable of regulating cell function such as an anticancer drug, an immune disease drug, an antiviral drug, an animal growth, development or differentiation factor. The cargo is fused with the transmembrane domain of the cell membrane or is chemically or physically bound, thereby improving the introduction efficiency into eukaryotic or prokaryotic cells. Particularly, when the cargo is a protein (cargo polypeptide), the recombinant cargo protein (recombinant cargo polypeptide) in which the cargo protein (cargo polypeptide) is fused to the N-terminal or C-terminal of the transmembrane transmembrane domain becomes wild type ) Than the cargo protein of the present invention.

상기 카고의 물리적 또는 화학적 성질은 카고의 세포 내 도입 효율에 큰 영향을 미치지 아니한다. 비록, 상기 카고는 크기에 따라 세포 내 도입 효율에 미차가 발생할 수 있으나, 이는 도입 효율의 차이일 뿐, 상기 카고는 크기에 관계없이 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 도입될 수 있는 카고의 종류에는 원칙적으로 제한이 없다. 특히, 상기 카고가 단백질(또는 폴리펩티드)인 경우, 상기 카고는 약물로 활용 가능성이 높은 인간 유래의 단백질 일 수 있고, 상기 인간 유래의 단백질은 그 크기가 약 150 kDa 이하인 것이 바람직하며 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 효율적으로 세포 내로 도입될 수 있다.The physical or chemical properties of the cargo do not significantly affect the intracellular introduction efficiency of the cargo. Although the cargo may have an intrinsic difference in intracellular introduction efficiency depending on its size, it may be introduced into the cell by the transmembrane domain regardless of its size, which is a difference in introduction efficiency. Accordingly, there is no limitation in principle on the kinds of cargo that can be introduced into the cell by binding to the transmembrane domain of the present invention. In particular, when the cargo is a protein (or polypeptide), the cargo may be a human-derived protein that is highly likely to be used as a drug, and the human-derived protein preferably has a size of about 150 kDa or less, Can be efficiently introduced into cells.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 6의 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질, 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 12의 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질 및 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 각각 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리하여 세포 내 도입 효율을 비교한 결과, 서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질 및 서열번호 12의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 야생형의 EGFP 단백질에 비해 현저히 우수함을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 상기와 같은 결과로부터, 서열번호 1로 기재되는 NP2 폴리펩티드 또는 서열번호 7로 기재되는 dNP2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 서열을 세포막 투과 도메인으로 이용하는 경우, 카고 물질인 EGFP 단백질의 세포 내 도입 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.
In a specific embodiment of the present invention, the recombinant NP2-EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 6 fused with the EGFP protein, the recombinant dNP2 of SEQ ID NO: 12 fused with the EGFP protein to the polypeptide of SEQ ID NO: -EGFP fusion protein and wild-type EGFP protein were treated with Jurkat cells and HeLa cells, respectively. As a result, the recombinant EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 6 and the recombinant EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 12 It was confirmed that intracellular introduction efficiency was remarkably superior to that of the wild-type EGFP protein (see FIGS. 5 and 6). From the above results, when the polypeptide sequence comprising the NP2 polypeptide of SEQ ID NO: 1 or the dNP2 polypeptide of SEQ ID NO: 7 was used as the cell membrane permeation domain, the intracellular introduction efficiency of the EGFP protein as a cargo substance was remarkably improved Able to know.

2. 2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드Polynucleotides encoding the transmembrane transmembrane domain

본 발명의 다른 측면은 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a genetic construct comprising a polynucleotide encoding the transmembrane transmembrane domain described in the section & quot; 1. Cell Membrane Transmission Domain and Recombinant Cargo Containing It. "

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 제공한다.Another aspect of the present invention provides an expression vector for expression of a recombinant cargo protein having improved cell membrane permeability, which comprises the gene construct.

본 발명의 상기 유전자 컨스트럭트는 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 또는 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 한 번 이상 포함한다.The gene construct of the present invention comprises at least one NP2 polypeptide derived from human NLBP or a polynucleotide encoding a mutant sequence of the NP2 polypeptide.

상기 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 유전자 컨스트럭트에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.The NP2 polypeptide derived from human NLBP and the variant of the NP2 polypeptide are the same as those described in the above item & quot; 1. Cell Membrane Transmission Domain and Recombinant Cargo Containing It. " Therefore, a description thereof will be omitted for the sake of explanation of the " 1. cell membrane transmission domain and the recombinant cargo containing the same ", and the detailed description will be omitted, and only the constitution specific to the gene construct will be described below.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 NLBP의 NP2 폴리펩티드 또는 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 제한되지 않는다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1의 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 것인 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.The polynucleotide is not particularly limited as long as it is a NP2 polypeptide of human NLBP having the polypeptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a variant of the NP2 polypeptide. In particular, when the polynucleotide encodes the NP2 polypeptide of SEQ ID NO: 1, the polynucleotide is preferably a polynucleotide of SEQ ID NO: 2.

상기 유전자 컨스트럭트는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 벡터를 이용하여 세포막 투과 도메인을 반복적으로 양산해 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 세포 내로 도입되어야 하는 카고가 특히 단백질인 경우, 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)에 상기 카고 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킴으로써, 세포막 투과 도메인과 상기 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 양산할 수 있다. 즉, 상기의 발현 벡터를 이용하여 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 재조합 카고 단백질 용이하게 반복적으로 양산할 수 있는 것이다. 상기 벡터에 의하여 양산된 재조합 카고 단백질은 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 보다 높은 효율로 세포 내 도입될 수 있다.The gene construct may be contained within an expression vector. By using the vector, the transmembrane domain can be repeatedly mass-produced. In addition, when cargo to be introduced into cells is a protein, a polynucleotide encoding the cargo protein is inserted into a multi-cloning site (MCS) of an expression vector containing the gene construct, The recombinant cargo protein in which the cell membrane permeation domain and the cargo protein are fused can be produced. That is, the recombinant cargo protein described in the item & quot; 1. Cell Membrane Transmission Domain and Recombinant Cargo Containing the Cell Membrane "can be easily and repeatedly produced using the above expression vector. The recombinant cargo protein produced by the vector can be introduced into cells at a higher efficiency than the wild type cargo protein.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 2로 기재되는 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 8로 기재되는 dNP2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 각각 도 3의 (A) 및 (B)와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 3 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 또는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 Jurkat 세포 및 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 내 도입 효율이 야생형(wild type)에 비하여 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).
In a specific embodiment of the present invention, a polynucleotide of SEQ ID NO: 5 or a dNP2 polypeptide of SEQ ID NO: 8, which is a polynucleotide encoding a human NLBP-derived NP2 polypeptide and a polynucleotide encoding EGFP, The polynucleotide of SEQ ID NO: 10, in which the polynucleotide encoding EGFP and the polynucleotide encoding EGFP are combined, is prepared and inserted into the pRSET-b vector to obtain a recombinant expression vector of the map as shown in Figs. 3 (A) and 3 (See Fig. 3). The recombinant NP2-EGFP fusion protein or the recombinant dNP2-EGFP fusion protein was repeatedly produced by transforming the vector into Escherichia coli BL21 (DE3) star pLysS strain. The recombinant NP2-EGFP fusion protein was isolated and purified and treated with Jurkat cells and HeLa cells, It was confirmed that the intracellular introduction efficiency of EGFP was improved as compared with the wild type (see FIGS. 5 and 6).

3. 3. 세포막 투과 도메인을 이용한 세포 내로의 카고 전달 방법Transfer of cargo into cells using transmembrane domain

본 발명의 또 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is a method for producing a recombinant cargo comprising the steps of: preparing a recombinant cargo fused with cargo at the N-terminal or C-terminal of the transmembrane domain; And contacting the produced recombinant cargo with a cell.

본 발명의 세포 내로의 카고 전달 방법은 1) 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.The method for cargo transfer into cells of the present invention comprises the steps of: 1) preparing a recombinant cargo; And 2) contacting the recombinant cargo produced in step 1) with the cells.

상기 단계 1)의 재조합 카고는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 인간 NLBP 유래의 세포막 투과 도메인과 카고가 유전적 융합 또는 화학적 결합에 의하여 재조합됨으로써 형성된 복합체를 의미하는 것으로서, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고를 물리적 또는 화학적으로 결합하여 제조할 수 있다. 이러한 재조합 카고의 제조는 카고의 물리적 또는 화학적 성질에 따라 당업자가 적절한 방법을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 카고가 단백질인 경우에는 상기 세포막 투과 도메인과 카고를 인위적인 펩티드 결합으로 화학 결합시킬 수도 있지만, 상기 "2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 " 항목에서 설명한 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 이용함으로써 반복적으로 양산할 수 도 있다. 그러나, 이는 재조합 카고를 제조하는 한 예시일 뿐, 그 방법이 이에 한정되지 아니하고, 당업자가 적절한 방법을 선택하여 적절히 제조할 수 있다.The recombinant cargo in the above step 1) means a complex formed by genetic fusion or chemical bond recombination between the transmembrane domain of human NLBP derived from the human NLBP described in " 1. Cell Membrane Transmission Domain and Recombinant Cargo Containing It " And can be prepared by physically or chemically bonding cargo to the N-terminal or C-terminal of the transmembrane domain. The production of such a recombinant cargo may be carried out by a person skilled in the art by selecting an appropriate method depending on the physical or chemical properties of the cargo. For example, when the cargo is a protein, the transmembrane domain of the cell membrane and the cargo may be chemically bonded by an artificial peptide bond, but the expression for the recombinant cargo protein expression described in the item " 2. Polynucleotide encoding the cell membrane permeation domain " It can also be repeatedly mass-produced by using a vector. However, this is merely an example of producing a recombinant cargo, and the method is not limited thereto, and a person skilled in the art can appropriately prepare it by selecting an appropriate method.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 2로 기재되는 인간 NLBP의 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 8로 기재되는 dNP2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 각각 도 3의 (A) 및 (B)와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 3 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 재조합 카고인 재조합 NP2-EFGP 단백질 또는 재조합 dNP2-EGFP 단백질을 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, a polynucleotide of SEQ ID NO: 5 or a polynucleotide of SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide of SEQ ID NO: 2, which encodes a polynucleotide encoding an NP2 polypeptide of human NLBP and a polynucleotide encoding EGFP, (SEQ ID NO: 10), which is a polynucleotide encoding EGFP and a polynucleotide encoding EGFP, is prepared and inserted into a pRSET-b vector to obtain a recombinant expression vector of the map shown in FIGS. 3 (A) and 3 (See Fig. 3). The vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) star pLysS strain, and the recombinant EGFP fusion protein was repeatedly produced. The recombinant EGFP fusion protein was isolated and purified to prepare a recombinant cargo-like NP2-EFGP protein or a recombinant dNP2-EGFP protein.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 수행될 수 있다. 상기 접촉이 인 비트로(in vitro) 상에서 진행될 경우, 시험관 내의 세포에 재조합 카고가 포함된 배지를 처리하여 세포를 배양시키는 과정에 의해 상기 접촉이 이루어진다. 상기 접촉이 인 비보(in vivo) 상에서 진행될 경우, 상기 재조합 카고는 근육내(intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravein), 경구(oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale) 등의 경로를 통해 생체 내로 주입(injection)되고, 생체 내에서 세포와 재조합 카고의 접촉이 이루어지게 된다.The contact of the cells with the recombinant cargo of step 2) above can be carried out in vitro or in vivo. When the contact proceeds in vitro, the contact is made by a process of culturing the cells by treating the medium containing the recombinant cargo in the cells in the test tube. When the contact proceeds in vivo, the recombinant cargo may be administered intramuscularly, intraperitoneally, intravein, oral, nasal, subcutaneous, Is injected in vivo through a pathway such as intradermal, mucosal or inhale, and the contact between the cell and the recombinant cargo is made in vivo.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉에 의하여 상기 재조합 카고가 세포 내로 도입되게 된다. 상기 재조합 카고의 도입은 ⅰ) 처리되는 재조합 카고의 농도가 높으면 높을수록 재조합 카고의 도입 양이 증가하고, ⅱ) 재조합 카고가 처리되는 시간이 길면 길수록 재조합 카고의 도입 양이 증가한다. 본 발명의 인간 NLBP 유래 세포막 투과 도메인은 에너지-의존적이면서도, 다른 물질들과 상호 경쟁적인 작용 기작에 의하여 카고를 세포 내로 도입한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 재조합 EGFP 융합 단백질을 처리하고 온도를 달리하여 배양한 결과, 온도가 낮아질수록 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다(도 8의 (A) 참조). 또한, 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 5% 및 10%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 Jurkat 세포에 처리하여 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포막 투과 효율을 측정하고, 헤파린을 0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 선처리한 Jurkat 세포에 10 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정한 결과, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 상기 NP2 폴리펩티드 또는 dNP2 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인의 카고 전달 효율이 영향을 받는다는 점을 간접적으로 확인하였다(도 8의 (B) 참조).
The recombination cargo is introduced into the cell by the contact of the cell with the recombination cargo in the step 2). The introduction of the recombinant cargo increases i) the higher the concentration of the recombinant cargo to be treated, the greater the introduction amount of the recombinant cargo, and ii) the longer the time the recombinant cargo is treated, the greater the introduction amount of the recombinant cargo. The human NLBP-derived cell membrane transmembrane domain of the present invention introduces cargo into cells by an action mechanism that is energy-dependent and mutually competitive with other substances. In a specific example of the present invention, the recombinant EGFP fusion protein was treated and cultured at different temperatures. As a result, it was confirmed that the efficiency of introducing the recombinant EGFP fusion protein into the cell through the cell membrane was lowered as the temperature was lowered (A)). In addition, recombinant EGFP fusion protein at a concentration of 5 μM was prepared by varying the concentrations of serum added to the medium to 0%, 5%, and 10%, respectively, and treated with Jurkat cells to measure the cell membrane permeation efficiency of the recombinant EGFP fusion protein. The intracellular efficiency of recombinant EGFP fusion protein at 10 μM concentration in Jurkat cells pretreated with 0 ㎍ / ㎖, 10 ㎍ / ㎖, 20 ㎍ / ㎖ and 50 ㎍ / ㎖ was measured. (FIG. 8 (B)) that the efficiency of cargo transfer of the cell membrane transmissive domain containing the NP2 polypeptide or the dNP2 polypeptide is influenced by competition or interaction of the NP2 polypeptide or the dNP2 polypeptide.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
It is to be understood, however, that the following examples are intended to assist the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

인간 NLBP 유래의 세포막 투과 도메인과 EGFP의 융합 단백질(재조합 EGF 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작Production of a polynucleotide sequence encoding a fusion protein of a human NLBP-derived cell membrane transmembrane domain and EGFP (recombinant EGF fusion protein)

<1-1> <1-1> NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작Producing a polynucleotide sequence encoding a fusion protein of NP2 polypeptide and EGFP

인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①NheI 제한효소 인식 부위, ②NP2 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③BamHI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 3의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머에서 ①NheI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③BamHI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.In order to prepare a nucleotide sequence coding for a fusion protein (recombinant EGFP fusion protein) of NP2 polypeptide derived from human NLBP and EGFP, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 coding for (1) a NheI restriction enzyme recognition site, (2) an NP2 polypeptide , (3) a BamHI restriction enzyme recognition site, and (4) a polynucleotide sequence encoding a part of the N-terminus of EGFP in sequence from the 5 'to the 3' direction (Bionix) (1) HindIII restriction enzyme recognition site (2) Reverse primer of SEQ ID NO: 4 containing a polynucleotide sequence encoding a part of C-terminal of EGFP in the 5 '- &gt; 3' direction was prepared (Bionix). (1) the NheI restriction enzyme recognition site is for DNA cloning, (3) the BamHI restriction enzyme recognition site is the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and (4) a polynucleotide sequence encoding a part of the N-terminus of (4) EGFP in the forward primer of SEQ ID NO: To connect. Also, the HindIII restriction enzyme recognition site of the reverse primer of SEQ ID NO: 4 is also for DNA cloning.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 35주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다. A PCR reaction was carried out using the pRSET-b vector containing the EGFP gene as a template and the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, thereby obtaining a fusion protein of human NPL polypeptide and EGFP derived from NLBP Of the polynucleotide sequence. The PCR reaction was carried out for 3 minutes at 95 ° C for 3 minutes, followed by 20 seconds of heat denaturation at 95 ° C, 20 seconds of primer-template binding at 50 ° C, and 30 seconds of extension reaction at 72 ° C 35 cycles were performed using a PCR reactor (Biorad).

<1-2> <1-2> dNP2와 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작Production of polynucleotide sequences encoding dNP2 and EGFP fusion proteins

인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드가 두 번 포함된 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①BamHI 제한효소 인식 부위, ②NP2 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③EcoRI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 9의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 6의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 9의 정방향 프라이머에서 ①BamHI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③EcoRI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 6의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.(1) BamHI restriction enzyme recognition site, (2) coding for the NP2 polypeptide (SEQ ID NO: 1) and (2) coding for the nucleotide sequence encoding the fusion polypeptide of the human NLBP-derived NP2 polypeptide twice and the fusion protein of EGFP (recombinant dNP2- EGFP fusion protein) (3) an EcoRI restriction enzyme recognition site, and (4) a polynucleotide sequence encoding a part of the N-terminus of EGFP in sequence from the 5 'to the 3' direction (SEQ ID NO: 9) ), (1) reverse primer of SEQ ID NO: 6 in which the HindIII restriction enzyme recognition site and (2) the polynucleotide sequence encoding the C-terminal part of EGFP were sequentially included in the 5 'to 3' direction (Bionix). The BamHI restriction enzyme recognition site is for DNA cloning, and the EcoRI restriction enzyme recognition site is the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the polynucleotide sequence of part of the N-terminus of 4) EGFP in the forward primer of SEQ ID NO: To connect. Also, the HindIII restriction enzyme recognition site of the reverse primer of SEQ ID NO: 6 is also for DNA cloning.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 9 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.
ID NO: 9 and SEQ ID NO: 6, respectively, using the pRSET-b vector containing the EGFP gene as a template, thereby to obtain a fusion protein of NP2 polypeptide derived from human NLBP with EGFP Of the polynucleotide sequence. The PCR reaction was carried out for 3 minutes at 95 ° C for 3 minutes, followed by 20 seconds of heat denaturation at 95 ° C, 20 seconds of primer-template binding at 50 ° C, and 30 seconds of extension reaction at 72 ° C And 30 cycles were performed using a PCR reactor (Biorad).

재조합 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)의 제조Preparation of pRSET-b vector (recombinant pRSET-b vector) with inserted polynucleotide sequence encoding recombinant EGFP fusion protein

<2-1> <2-1> NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터)의 제조Preparation of a pRSET-b vector (recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector) with a polynucleotide sequence encoding a fusion protein of NP2 polypeptide and EGFP

서열번호 6의 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위해 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 768bp의 폴리뉴클레오티드 절편을 제한효소 및 연결효소를 이용하여 단백질 발현 벡터인 pRSET-b에 삽입하여 도 3의 (A)와 같은 구조의 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다. 보다 구체적으로는 하기와 같이 제조된다.In order to express the recombinant NP2-EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 6, the 768-bp polynucleotide fragment prepared in Example <1-1> was inserted into a protein expression vector pRSET-b using a restriction enzyme and a linking enzyme Recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector having the structure shown in (A) of FIG. 3 was prepared. More specifically, it is prepared as follows.

상기 실시예 <1-1>에서 제조된 폴리뉴클레오티드 절편을 NheI과 HindIII(NEB)로 DNA의 5' 및 3' 말단이 접착성 말단(sticky end)이 되도록 효소 반응시키는 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSET-b 벡터를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSET-b 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다. 상기와 같이 분리된 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편과 pRSET-b 벡터를 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켰다. 상기와 같이 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 원형의 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양하였으며, 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 분리하였다.The polynucleotide fragment prepared in Example <1-1> was reacted with NheI and HindIII (NEB) to make the 5 'and 3' ends of the DNA become sticky ends, while the same two restriction enzymes , The pRSET-b vector was subjected to an enzymatic reaction to make a linear pRSET-b vector having NheI and HindIII insertion sites. After each enzyme reaction, PCR was carried out using a purification kit (Kosomogin Tech). The polynucleotide fragment of the recombinant NP2-EGFP fusion protein thus separated and the pRSET-b vector were subjected to enzymatic reaction at 25 ° C for 2 hours using T4 Ligase (NEB). The circular pRSET-b vector in which the polynucleotide fragment of the recombinant NP2-EGFP fusion protein was inserted was transformed into DH5a E. coli strain and cultured in an LB plate medium containing 50 μg / ml of ampicillin as an antibiotic The transformed E. coli forming the colonies were selected. The selected E. coli colonies were inoculated into liquid LB medium containing 50 / / ml of ampicillin, and then the recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector was isolated using plasmid Mini Preparation Kit .

상기와 같이 제작된 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하였고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다.By using the recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector prepared as described above as a template and carrying out a PCR reaction using the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the NP2 polypeptide derived from human NLBP encodes a fusion protein of EGFP A polynucleotide sequence was obtained, and the polynucleotide sequence was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis.

그 결과, 768bp의 폴리뉴클레오티드 절편이 제작되었음을 확인하였다(도 1). As a result, it was confirmed that a 768 bp polynucleotide fragment was produced (Fig. 1).

또한, 상기와 같은 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터)인지 여부를 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동시켜 확인하였고, 잘려진 단편의 염기 서열을 분석하였다.In order to confirm whether or not the plasmid vector isolated as described above is a pRSET-b vector (recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector) into which a polynucleotide fragment of the recombinant NP2-EGFP fusion protein is inserted, NheI and HindIII After enzymatic reaction with restriction enzymes, 1% agarose gel electrophoresis was performed, and the nucleotide sequences of the cleaved fragments were analyzed.

그 결과, 768bp에 해당하는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 2.9kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였고(도 2), 768bp에 해당하는 밴드를 일루션(elusion)하여 염기서열을 분석한 결과, 상기 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 서열번호 5의 염기서열을 가짐을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the polynucleotide fragment of the recombinant NP2-EGFP fusion protein corresponding to 768 bp was inserted into the pRSET-b vector corresponding to 2.9 kbp (FIG. 2), and the band corresponding to 768 bp was elusion As a result of analyzing the base sequence, it was confirmed that the polynucleotide inserted into the vector had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

<2-2> <2-2> dNP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 dNP2-EGFP_pRSET-b 벡터)의 제조Preparation of a pRSET-b vector (recombinant dNP2-EGFP_pRSET-b vector) with a polynucleotide sequence encoding a fusion protein of dNP2 polypeptide and EGFP

서열번호 11의 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위해, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 BamHI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 EFGP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분이 제거시키고, BamHI 및 HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 만들었다. 상기와 같이 절단된 선형의 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터와 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켜, 도 3의 (B)와 같은 구조를 갖는 원형의 재조합 dNP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 원형의 재조합 dNP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다.In order to express the recombinant dNP2-EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 11, the recombinant NP2-EGFP_pRSET-b vector prepared in Example <2-1> was digested with BamHI and HindIII restriction enzymes to obtain a polynucleotide portion encoding EFGP And a linear NP2-EGFP_pRSET-b vector was constructed with BamHI and HindIII insertion sites. The linear NP2-EGFP_pRSET-b vector cut out as described above and the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 prepared in Example <1-2> were incubated for 2 hours at 25 ° C using T4 ligase (NEB) To thereby prepare a circular recombinant dNP2-EGFP_pRSET-b vector having the structure shown in FIG. 3 (B). A circular recombinant dNP2-EGFP_pRSET-b vector prepared as described above was prepared.

상기와 같이 제작된 재조합 dNP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 dNP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하였고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다.By using the recombinant dNP2-EGFP_pRSET-b vector prepared as described above as a template and carrying out PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, a polynucleotide sequence encoding a fusion protein of dNP2 polypeptide and EGFP , And the polynucleotide sequence was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis.

그 결과, 807bp의 폴리뉴클레오티드 절편이 제작되었음을 확인하였다(도 1).As a result, it was confirmed that a polynucleotide fragment of 807 bp was produced (FIG. 1).

또한, 상기와 같은 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 dNP2-EGFP_pRSET-b 벡터)인지 여부를 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동시켜 확인하였고, 잘려진 단편의 염기 서열을 분석하였다.In order to confirm whether the plasmid vector isolated as described above is a pRSET-b vector (recombinant dNP2-EGFP_pRSET-b vector) having inserted a polynucleotide fragment of the recombinant dNP2-EGFP fusion protein, NheI and HindIII After enzymatic reaction with restriction enzymes, 1% agarose gel electrophoresis was performed, and the nucleotide sequences of the cleaved fragments were analyzed.

그 결과, 807bp에 해당하는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 2.9kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였고(도 2), 807bp에 해당하는 밴드를 일루션(elusion)하여 염기서열을 분석한 결과, 상기 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 서열번호 9의 염기서열을 가짐을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the polynucleotide fragment of the recombinant dNP2-EGFP fusion protein corresponding to 807 bp was inserted into the pRSET-b vector corresponding to 2.9 kbp (FIG. 2), and a band corresponding to 807 bp was elongated As a result of analyzing the base sequence, it was confirmed that the polynucleotide inserted in the vector had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.

대장균을 이용한 재조합 EGFP 융합 단백질의 발현 및 정제Expression and Purification of Recombinant EGFP Fusion Protein Using Escherichia coli

재조합 EGFP 융합 단백질을 발현 및 정제하기 위하여, 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에서 제조된 재조합 pRSET-b 벡터를 액체 LB 배지 상태(100 ㎕)의 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 첨가해 준 뒤, 42℃로 가열한 항온 수조에서 45 초간 열 활성(Heat Shock)기법으로 형질전환 시킨 후 항생제인 34 ㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)과 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50 ㎖에 접종하여 37 ℃에서 14시간 배양한 다음, 이를 새로운 액체 LB 배지 500 ㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 O.D 값이 0.5가 될 때까지 대장균을 배양한 후, IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 온도를 20℃로 낮추고, 150 rpm으로 회전하는 진탕 배양기에서 14 시간 동안 더 배양하여 대장균 내에서 pRSET-b 벡터에 삽입된 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질이 발현되도록 하였다. 상기와 같이 대장균주에서 발현된 단백질은 pRSET-b 벡터에 의하여 자체적으로 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 N-말단 부분에 발현되도록 코딩된 6X-His tag을 포함하고 있다. 상기 6X-His tag을 이용해 하기와 같은 방법으로 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 정제하였다.To express and purify the recombinant EGFP fusion protein, the recombinant pRSET-b vector prepared in Examples <2-1> and <2-2> was inoculated into 100 μl of E. coli BL21 (DE3) star pLysS The transformant was transformed with heat shock method for 45 seconds in a constant temperature water bath heated to 42 ° C. and then transformed with 34 μg / ml of chloramphenicol and 50 μg / ml of ampicillin, Was inoculated into 50 ml of liquid LB medium and incubated at 37 占 폚 for 14 hours and then inoculated into 500 ml of fresh liquid LB medium. Escherichia coli was cultured at the same temperature until the OD value became 0.5, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, the temperature was lowered to 20 ° C, and further cultured in a shaking incubator rotating at 150 rpm for 14 hours, The recombinant NP2-EGFP fusion protein inserted into the pRSET-b vector and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were expressed. As described above, the protein expressed in Escherichia coli contains a 6X-His tag tagged to express itself at the N-terminal part of the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein by the pRSET-b vector. The recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were purified using the 6X-His tag in the following manner.

배양액을 원심분리로 모은 후 원 조건(native condition)의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아둔 다음, 초음파 세포 파쇄기(VCX-130(Sonics & Materials))를 이용하여 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤, Ni-NTA 아가로스(agarose)(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합시키고, 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA 아가로스(agarose)와 결합된 단백질 산물만이 컬럼(column)에 결합될 수 있도록 하였다. 20mM의 이미다졸(imidazole) 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 이용해 최종적으로 용출(elution)해 내었다. 상기와 같이 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 분리함으로써, 서열번호 6으로 기재되는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 서열번호 11로 기재되는 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 정제하였다(도 4).
The culture was collected by centrifugation and resuspended in a native solution (0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0). The cells were suspended in a solution for 10 minutes in order to break the cell wall and membrane of Escherichia coli, and then the cells were pulverized using an ultrasonic cell crusher (VCX-130 (Sonics & Materials)) and centrifuged to separate the supernatant . The separated supernatant was filtered once with a 0.45 μm filter (Advantec), bound to Ni-NTA agarose (Qiagen) at room temperature for 1 hour, and analyzed using a histidine column (His-column, Biorad) Only the protein product bound to the NTA agarose was allowed to bind to the column. After washing with 20 mM imidazole solution, the solution was finally eluted with 250 mM imidazole solution. The eluted protein product was applied to a PD-10 desalting column (Amersham Bioscience) to separate the recombinant NP2-EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 6 and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein of SEQ ID NO: 11 (Fig. 4).

Jurkat 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입Introduction of recombinant EGFP fusion protein into Jurkat cells

상기 실시예 3에서 정제된 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 암화된 인간 T 세포의 세포주인 Jurkat 세포주 내로 도입하면서 그 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)로 배양하고, 350 ㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-웰(24-well) 플레이트(SPL lifescience)의 각 웰에 세포수가 1×106 개만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하여 세포를 분주했다. 처리할 재조합 EGFP 융합 단백질은 제조할 농도에 따른 적절한 양을 50 ㎕의 D-PBS(WelGen)와 혼합하여, 총 부피가 500㎕가 되도록 제조하여 상기 Jurkat 세포주에 처리하였다.The recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein purified in Example 3 were introduced into a Jurkat cell line, which is a cell line of humanized T cells, to confirm the efficiency. Jurkat cells were cultured in RPMI medium (HyClone), and each well of a 24-well plate (SPL lifescience) in which 350 μl of RPMI medium was dispensed was coated with 100 μl of cells containing 1 × 10 6 cells Of RPMI medium was added and the cells were dispensed. The recombinant EGFP fusion protein to be treated was mixed with 50 μl of D-PBS (WelGen) in an appropriate amount according to the concentration to be prepared, and the resulting Jurkat cell line was treated so as to have a total volume of 500 μl.

<4-1> <4-1> 처리 농도에 따른 도입 효율 분석Analysis of introduction efficiency by treatment concentration

재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 도입 효율을 분석하기 위하여, 각각 1 μM 및 5 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 2시간 동안 처리하였다. 대조군으로 NP2 또는 dNP2 폴리펩티드가 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 처리하였다. 2시간 경과 후, 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. 또한, 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 500 ㎕의 D-PBS로 재부유시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.In order to analyze the efficiency of introduction of recombinant NP2-EGFP fusion protein and recombinant dNP2-EGFP fusion protein, recombinant EGFP fusion proteins at concentrations of 1 μM and 5 μM, respectively, were incubated in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 2 hours Respectively. A wild type EGFP protein without a NP2 or dNP2 polypeptide ligated was treated as a control. After 2 hours, all the cells were collected and transferred to a tube, and the supernatant was removed by centrifugation. In addition, the procedure of washing, resuspension and centrifugation was repeated twice with 1 ml of D-PBS so that it was not affected by the presence of the cell surface or the culture medium remaining in the medium. Cells obtained after the above two washing steps were finally resuspended in 500 μl of D-PBS and the intracellular fluorescence was measured by a flow cytometry (FACS machine, BD science FACScalibur) to obtain cells of the recombinant EGFP fusion protein And the introduction efficiency was measured.

그 결과, 상기 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질이 처리된 재조합 EGFP 융합 단백질의 농도에 의존적으로 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were delivered into Jurkat cells depending on the concentration of the treated recombinant EGFP fusion protein (FIG. 5).

<4-2> <4-2> 처리 시간에 따른 도입 효율 분석Analysis of introduction efficiency by processing time

5 μM 농도의 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 Jurkat 세포가 분주되어 있는 플레이트의 각 well에 처리하고 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 30분 내지 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 NP2 또는 dNP2 폴리펩티드가 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질과 재조합 TAT-EGF 융합 단백질을 처리하였다. 상기 각각의 시간 동안 단백질을 도입시킨 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.5 μM recombinant NP2-EGFP fusion protein and recombinant dNP2-EGFP fusion protein were treated in each well of a plate in which Jurkat cells were distributed and cultured in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C for 30 minutes to 24 hours. As a control, wild-type EGFP protein and recombinant TAT-EGF fusion protein without NP2 or dNP2 polypeptide were treated. The cells were recovered in the same manner as in Example <4-1> and the intracellular fluorescence was measured by flow cytometry (FACS machine, BD science FACScalibur) to obtain recombinant NP2 -EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were measured.

그 결과, 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질은 처리 시간에 의존적으로 상기 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다. 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 경우에는 종래의 널리 알려진 세포막 투과 도메인인 TAT과 비슷한 정도의 효율로 상기 Jurkat 세포 내로 전달되었고, 특히, 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질의 경우에는 12시간까지 세포 내로 도입된 단백질의 양이 꾸준히 증가되었고, 종래의 널리 알려진 세포막 투과 도메인인 TAT 보다도 더욱 효율적으로 상기 Jurkat 세포 내로 전달됨을 확인하였다(도 6). As a result, it was confirmed that the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were transferred into the Jurkat cells depending on the treatment time. In the case of the recombinant NP2-EGFP fusion protein, the recombinant dNP2-EGFP fusion protein was transferred into the Jurkat cell at an efficiency similar to that of the conventional well known cell membrane permeation domain, TAT. In particular, in the case of the recombinant dNP2- Was increased steadily and it was confirmed that it was more efficiently transferred into the Jurkat cell than the conventional well-known cell membrane permeation domain TAT (FIG. 6).

<4-3> <4-3> 다른 종류의 세포막 투과 도메인과의 도입 효율 비교Comparison of introduction efficiency with other types of transmembrane domain

NP2 폴리펩티드, dNP2 폴리펩티드와 종래의 세포막 투과 도메인들의 도입 효율을 비교하기 위하여, 동일한 조건에서 다른 세포막 투과 도메인들을 이용하여 EGFP를 Jurkat 세포 내로 도입하였고, 그 도입 효율을 측정하였다. 보다 구체적으로, 하기 표 1의 재조합 단백질들을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 처리하여 30분, 1시간, 2시간, 3시간 및 6시간 동안 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 배양한 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정함으로써 각 재조합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.In order to compare the introduction efficiency of NP2 polypeptide and dNP2 polypeptide with conventional cell membrane transmissive domains, EGFP was introduced into Jurkat cells using different transmembrane domains under the same conditions and their introduction efficiency was measured. More specifically, Jurkat cells were treated with recombinant proteins of the following Table 1 at a concentration of 5 μM and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 cell incubator for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 6 hours, Cells were recovered in the same manner as in Example <4-1> and the intracellular fluorescence of each recombinant protein was measured by flow cytometry (FACS machine, BD science FACScalibur).

실시예 <4-3>에서 이용된 재조합 EGFP 단백질The recombinant EGFP protein used in Example < 4-3 > 음성 대조군Negative control group 야생형 EGFPWild-type EGFP 실험군Experimental group 실시예 3에서 정제한 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질The recombinant NP2-EGFP fusion protein purified in Example 3
양성 대조군
Positive control group
TAT-EGFPTAT-EGFP Mph-1(Hph-1)-EGFPMph-1 (Hph-1) -EGFP

실시예 <4-3>에서 이용된 재조합 EGFP 단백질The recombinant EGFP protein used in Example < 4-3 > 음성 대조군Negative control group 야생형 EGFPWild-type EGFP 실험군Experimental group 실시예 3에서 정제한 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질The recombinant dNP2-EGFP fusion protein purified in Example 3
양성 대조군
Positive control group
TAT-EGFPTAT-EGFP R9-EGFPR9-EGFP

그 결과, 본 발명의 NP2 폴리펩티드는 종래 널리 알려진 Mph-1(Hph-1) 보다 높고 TAT과 비슷한 정도의 전달 효율을 나타내었고(도 7의 (A)), dNP2 폴리펩티드는 종래의 세포막 투과 도메인들(TAT 및 R9)에 비하여 현저히 높은 전달 효율로 EGFP를 세포 내로 도입시킴을 확인하였다(도 7의 (B)).As a result, the NP2 polypeptide of the present invention was higher than the conventionally known Mph-1 (Hph-1) and exhibited a transmission efficiency similar to that of TAT (Fig. 7 (A)), (TAT and R9), it was confirmed that EGFP was introduced into cells with a remarkably high transfer efficiency (Fig. 7 (B)).

<4-4> <4-4> 인간 NLBP 유래 세포막 투과 도메인의 작용 기작 규명Identification of mechanism of action of human NLBP-derived cell membrane transmembrane domain

NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드이 어떠한 기작으로 세포막을 투과하여 단백질을 전달하는 것인지 확인하기 위하여, 상기 표 1에 기재된 재조합 단백질을 이용하여 온도 및 배지 내의 혈청 농도에 따른 EGFP 단백질의 도입 효율을 측정하였다.In order to confirm the mechanism by which the NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide permeate the cell membrane and transfer the protein, the recombinant protein described in Table 1 above was used to measure the temperature and efficiency of introduction of EGFP protein according to the serum concentration in the medium.

먼저, 표 1의 재조합 단백질들(Mph-1(Hph-1)-EGFP 제외)을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 2시간 동안 처리하되, 세포 배양 온도를 각각 독립적으로 4℃, 25℃ 및 37℃로 달리 하였다.First, the recombinant proteins (except for Mph-1 (Hph-1) -EGFP) in Table 1 were treated with Jurkat cells for 2 hours at a concentration of 5 μM, Lt; / RTI &gt;

그 결과, 온도가 낮아질수록 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 온도 조건에서 dNP2 폴리펩티드는 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT보다 월등히 높은 도입 효율을 나타내었고, NP2 폴리펩티드는 TAT과 비슷한 정도의 도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 8의 (A)). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 NLBP 유래 세포막 투과 도메인이 에너지에 의존하여 단백질을 세포내로 전달하는 것임을 간접적으로 알 수 있다.As a result, it was confirmed that the efficiency of introducing the recombinant EGFP fusion protein purified in Example 3 into the cells through the cell membrane was lowered as the temperature was lowered. In all the temperature conditions, the dNP2 polypeptide was found to have a higher affinity than the conventional cell membrane permeation domain TAT It was confirmed that the introduction efficiency was remarkably high, and that the NP2 polypeptide showed an introduction efficiency similar to that of TAT (Fig. 8 (A)). From the above results, it can be indirectly shown that the transmembrane domain of human NLBP derived from the present invention is energy-dependent and transfers the protein into cells.

다음으로, RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 5% 및 10%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 처리하고, 표 1에 기재된 각 재조합 단백질들(Mph-1(Hph-1)-EGFP 제외)의 도입 효율을 분석하였다. Next, recombinant EGFP fusion proteins at a concentration of 5 μM were prepared and treated by varying the concentrations of serum added to the RPMI medium to 0%, 5%, and 10%, respectively, and the respective recombinant proteins (Mph-1 Hph-1) -EGFP).

그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 실시예 3에서 정제한 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 혈청 농도 조건에서 dNP2 폴리펩티드는 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT보다 월등히 높은 도입 효율을 나타내었고, NP2 폴리펩티드는 TAT과 비슷한 정도의 도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 8의 (B)). 상기와 같은 결과로부터, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 본 발명의 세포막 투과 도메인이 카고 전달 효율에 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 알 수 있다.As a result, it was confirmed that the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein purified in Example 3 lowered the efficiency of introduction of the fusion protein into the cell through the cell membrane as the serum concentration of the medium increased, , The dNP2 polypeptide showed a much higher introduction efficiency than the conventional cell membrane permeation domain, TAT, and the NP2 polypeptide showed an introduction efficiency similar to that of TAT (Fig. 8 (B)). From the above results, it can be indirectly seen that the transmembrane domain of the present invention is influenced by cargo transfer efficiency by competition or interaction with other proteins.

마지막으로, NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드가 세포 표면에 존재하는 헤파란 황산염(heparan sulfate)과 직·간접적으로 상호작용함으로써 세포막 투과 활성을 나타낼 것으로 예상되어, 상기 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드와 상기 헤파란 황산염의 결합을 억제한 뒤 단백질이 세포내 도입 효율을 확인하였다. 상기 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드가 상기 헤파란 황산염과 결합하는 것을 방해할 수 있는 헤파린(Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma)을 0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 Jurkat 세포에 30분 동안 선처리한 다음, 10 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 D-PBS와 섞어 부피가 100 ㎕로 되게 하여 상기 Jurkat 세포에 처리하고, 1시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 1시간 경과 후, 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. 또한, 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1 ㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 500 ㎕의 D-PBS로 재부유시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.Finally, the NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide are expected to exhibit cell membrane permeability by directly or indirectly interacting with heparan sulfate present on the cell surface, and the NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide and the heparan sulfate After the binding was inhibited, the efficiency of intracellular introduction of the protein was confirmed. 10 μg / ml, 20 μg / ml and 50 μg / ml of heparin, which can prevent the binding of the NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide to the heparan sulfate, Ml, and the recombinant EGFP fusion protein at a concentration of 10 [mu] M was mixed with D-PBS to prepare a volume of 100 [mu] l. Then, the cells were treated with the Jurkat cells and incubated for 1 hour at 37 [deg. CO 2 cell incubator. After 1 hour, all the cells were collected and transferred to a tube, and the supernatant was removed by centrifugation. In addition, the process of washing, resuspension and centrifugation was repeated twice with 1 ml of D-PBS to avoid the influence of the presence of the cell surface or the medium remaining in the measurement of the efficiency. Cells obtained after the above two washing steps were finally resuspended in 500 μl of D-PBS and the intracellular fluorescence was measured by a flow cytometry (FACS machine, BD science FACScalibur) to obtain cells of the recombinant EGFP fusion protein And the introduction efficiency was measured.

그 결과, 헤파린의 선처리 농도가 높아질수록 상기 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드의 카고 전달 효율이 현저하게 낮아짐을 확인하였다(도 9). 상기와 같은 결과로부터, 상기 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드가 다른 단백질(헤파란 황산염 등)들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 본 발명의 세포막 투과 도메인이 카고 전달 효율에 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 알 수 있다.
As a result, it was confirmed that the cargo transfer efficiency of the NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide was remarkably lowered as the pretreatment concentration of heparin was increased (FIG. 9). From the above results, it is indirectly known that the NPN polypeptide and the dNP2 polypeptide are affected by competition or interaction with other proteins (such as heparan sulfate) .

HeLa 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입Introduction of recombinant EGFP fusion protein into HeLa cells

상기 실시예 4에서 확인한 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드의 세포막 투과 기능을 다시 한번 확인하면서, 상기 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 및 dNP2 폴리펩티드에 의하여 도입된 재조합 단백질의 세포 내 위치를 확인하고, 실제로 세포 안으로 도입된 것인지 여부를 직접 확인하기 위하여, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 내로 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질을 도입하고 형광현미경을 이용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 6-웰 플레이트(6-well plate)(SPL lifescience)의 각 웰에 미리 현미경용 원형 커버글라스(Marin field)를 깔아두고 5×105 개의 HeLa 세포를 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지(HyClone)에서 배양하여 HeLa 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 배지를 모두 흡입(suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 900 ㎕를 넣어주고, 실시예 3에서 정제한 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질을 D-PBS와 각각 섞어 20 μM의 농도가 되도록 혼합하여 100 ㎕를 처리한 다음, 2시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후, 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하고 4% 포름알데히드 완충용액(4% formaldehyde buffer solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하고, 세포 내 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:10000으로 희석한 2 ㎖의 Hoechst(Hoechst AG)를 이용해 핵이 형광을 띄도록 10분 동안 염색하고, 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스 위에 마운팅하고 공초점 형광현미경(AX-10 (Confocal fluorescence microscope, Carl zeiss))으로 EGFP가 세포 내로 도입되었는지 여부 및 세포 내에서의 위치를 확인하였다.The intracellular location of the NP2 polypeptide derived from the human NLBP and the recombinant protein introduced by the dNP2 polypeptide was confirmed while confirming the cell membrane permeation function of the human NLBP-derived NP2 polypeptide and the dNP2 polypeptide confirmed in Example 4, To directly determine whether or not the recombinant EGFP fusion protein was introduced into the cell, the recombinant EGFP fusion protein purified in Example 3 was introduced into the cervical cancer cell line HeLa cell and analyzed using a fluorescence microscope. More specifically, 5 × 10 5 HeLa cells were placed in each well of a 6-well plate (SPL lifescience) with a circular cover glass for microscope, And cultured in DMEM medium (HyClone) to allow HeLa cells to attach to cover glasses. The recombinant NP2-EGFP fusion protein purified in Example 3 and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein were mixed with D-PBS to give a concentration of 20 μM. 100 쨉 l of the mixture was treated and then cultured in a 5% CO 2 cell incubator at 37 째 C for 2 hours. Subsequently, the culture medium was inhaled to remove proteins outside the cell, and the cells were washed three times with 1 ml of D-PBS, and 1 ml of 4% formaldehyde buffer solution (formalin, SIGMA) To fix the cells. After fixation, the plate was washed three times with 1 ml of D-PBS. To confirm the position of the nuclei in the cells, 2 ml of Hoechst (Hoechst AG) diluted 1: 10000 was used to stain the nuclei fluorescently for 10 minutes And washed three times with 1 ml of D-PBS. The cover glass thus prepared was mounted on a slide glass using a mounting medium (SIGMA) and confocal fluorescence microscope (AX-10, Confocal fluorescence microscope, Carl Zeiss) was used to confirm whether EGFP was introduced into the cell and its position in the cell Respectively.

그 결과, 실시예 3의 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질 및 재조합 dNP2-EGFP 융합 단백질은 세포막을 투과하여 HeLa 세포 내로 도입되었고, 상기 HeLa 세포 내에서 세포질(cytoplasm)에 위치해 있음을 확인하였다(도 10).
As a result, it was confirmed that the recombinant NP2-EGFP fusion protein and the recombinant dNP2-EGFP fusion protein of Example 3 were introduced into HeLa cells through the cell membrane and were located in cytoplasm in the HeLa cells (FIG. 10) .

실제 동물 개체를 이용한 NP2 및 dNP2의 The use of NP2 and dNP2 in vivoin vivo 상에서 갖는 카고 단백질 전달 기능 확인 Cargo protein transfer function

본 발명에서 개발된 NP2 및 dNP2 폴리펩티드가 생체 내에서도 카고 단백질 전달 기능을 갖는 것을 확인하기 위하여 상기에서 밝힌 방법으로 정제해낸 NP2-EGFP 및 dNP2-EGFP 단백질을 5 mg/800 μl로 마우스에 복강주사로 주입하여 각 장기에 녹색형광단백질이 전달되는지 여부를 확인하였다. 주입 후 두 시간이 지났을 때 경추탈골 기법으로 마우스를 안락사 시키고, 간, 뇌, 신장, 소장에 해당하는 장기를 적출하였다. 적출된 장기는 O.C.T. 컴파운드를 이용하여 -80℃에서 동결시켰으며 이것을 6 μm의 두께로 동결절편을 만들어 슬라이드글라스에 부착시키고 PBS 세척하였다. 그리고 델타-비전 이미징 시스템(Delta-vision imaging system)을 이용하여 조직 내의 형광 단백질 전달 여부를 확인하였다. In order to confirm that the NP2 and dNP2 polypeptides developed in the present invention have a cargo protein transfer function in vivo, NP2-EGFP and dNP2-EGFP proteins purified by the method described above are injected into mice at 5 mg / 800 μl by intraperitoneal injection To determine whether or not the green fluorescent protein was transferred to each organ. Two hours after the injection, mice were euthanized by cervical dislocation technique and organs corresponding to liver, brain, kidney, and small intestine were excised. The organs extracted were O.C.T. Frozen at -80 ° C using a compound, and frozen sections were prepared in a thickness of 6 μm and attached to a slide glass and washed with PBS. We then used a Delta-vision imaging system to confirm the presence of fluorescent protein in the tissue.

그 결과 대조군인 EGFP 주입 마우스의 장기에 비하여 NP2-EGFP 및 dNP2-EGFP가 주입된 마우스의 장기는 매우 진한 녹색형광을 나타내고 있었고, 이를 통하여 NP2 및 dNP2 폴리펩티드가 생체 내에서도 매우 높은 효율로 카고 단백질을 전달할 수 있음을 확인하였다(도 11).
As a result, the organs of mice injected with NP2-EGFP and dNP2-EGFP exhibited a very dark green fluorescence compared with the organs of control EGFP-injected mice, and NP2 and dNP2 polypeptides could deliver cargo proteins in vivo (Fig. 11).

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the scope of the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be possible to change it appropriately.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cell penetrating peptide comprising NP2 polypeptide or dNP2 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same <130> PN130475P <150> 12/0112118 <151> 2012-10-09 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aag 33 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 3 cggctagcaa gattaagaaa gtcaagaaga aaggaagaaa gggatccgtg agcaagggcg 60 aggagctgtt cac 73 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 4 caagctttta cttgtacagc tcgtc 25 <210> 5 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 5 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <210> 6 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 6 Ala Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Val 1 5 10 15 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 20 25 30 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 35 40 45 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 65 70 75 80 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 85 90 95 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 100 105 110 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 115 120 125 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 130 135 140 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 145 150 155 160 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 165 170 175 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 180 185 190 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 195 200 205 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 210 215 220 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 245 250 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for dNP2 <400> 7 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for dNP2 <400> 8 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aagggatcca agattaagaa agtcaagaag 60 aaaggaagaa ag 72 <210> 9 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant dNP2-EGFP fusion protein <400> 9 cgggatccaa gattaagaaa gtcaagaaga aaggaagaaa ggaattcgtg agcaagggcg 60 aggagctg 68 <210> 10 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant dNP2-EGFP fusion protein <400> 10 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60 aagaagaaag gaagaaagga attcgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 120 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 180 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 240 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 300 cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 360 gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 420 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 480 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 540 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 600 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 660 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 720 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 780 atggacgagc tatacaagta a 801 <210> 11 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for recombinant dNP2-EGFP fusion protein <400> 11 Ala Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Glu Phe Val Ser Lys Gly 20 25 30 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 35 40 45 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 50 55 60 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 65 70 75 80 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 85 90 95 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 100 105 110 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 115 120 125 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 130 135 140 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 165 170 175 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 180 185 190 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 195 200 205 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 210 215 220 Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 225 230 235 240 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 245 250 255 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 260 265 <210> 12 <211> 794 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Asp Ala Trp Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ala Ala Asp Phe Gln 1 5 10 15 Arg Ala Gln Phe Ala Glu Ala Thr Gln Arg Leu Ser Glu Arg Asn Cys 20 25 30 Ile Glu Ile Val Asn Lys Leu Ile Ala Gln Lys Gln Leu Glu Val Val 35 40 45 His Thr Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Ile Thr Pro Ala Gln Ile Ser Lys 50 55 60 Glu Met Arg Asp Glu Leu His Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Ile Val 65 70 75 80 Asp Leu Gln Gln Val Ile Asn Val Asp Leu Ile His Ile Glu Asn Arg 85 90 95 Ile Gly Asp Ile Ile Lys Ser Glu Lys His Val Gln Leu Val Leu Gly 100 105 110 Gln Leu Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Asp Arg Leu Ala Glu Glu Val Asn 115 120 125 Asp Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gln Val Thr Ile Ser Glu Leu Cys Lys 130 135 140 Thr Tyr Asp Leu Pro Gly Asn Phe Leu Thr Gln Ala Leu Thr Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Arg Ile Ile Ser Gly His Ile Asp Leu Asp Asn Arg Gly Val 165 170 175 Ile Phe Thr Glu Ala Phe Val Ala Arg His Lys Ala Arg Ile Arg Gly 180 185 190 Leu Phe Ser Ala Ile Thr Arg Pro Thr Ala Val Asn Ser Leu Ile Ser 195 200 205 Lys Tyr Gly Phe Gln Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Val Leu Glu Glu Leu 210 215 220 Val Asn Ser Gly Arg Leu Arg Gly Thr Val Val Gly Gly Arg Gln Asp 225 230 235 240 Lys Ala Val Phe Val Pro Asp Ile Tyr Ser Arg Thr Gln Ser Thr Trp 245 250 255 Val Asp Ser Phe Phe Arg Gln Asn Gly Tyr Leu Glu Phe Asp Ala Leu 260 265 270 Ser Arg Leu Gly Ile Pro Asp Ala Val Ser Tyr Ile Lys Lys Arg Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Gln Leu Leu Phe Leu Lys Ala Ala Cys Val Gly Gln Gly 290 295 300 Leu Val Asp Gln Val Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Ile Ser Ser Gly 305 310 315 320 Thr Trp Val Asp Ile Ala Pro Leu Leu Pro Thr Ser Leu Ser Val Glu 325 330 335 Asp Ala Ala Ile Leu Leu Gln Gln Val Met Arg Ala Phe Ser Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Thr Val Val Phe Ser Asp Thr Val Val Val Ser Glu Lys Phe 355 360 365 Ile Asn Asp Cys Thr Glu Leu Phe Arg Glu Leu Met His Gln Lys Ala 370 375 380 Glu Lys Glu Met Lys Asn Asn Pro Val His Leu Ile Thr Glu Glu Asp 385 390 395 400 Leu Lys Gln Ile Ser Thr Leu Glu Ser Val Ser Thr Ser Lys Lys Asp 405 410 415 Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Ala Thr Glu Gly Ser Gly Ser Met 420 425 430 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Arg Glu Tyr Lys Ile Lys Lys Val 435 440 445 Lys Lys Lys Gly Arg Lys Asp Asp Asp Ser Asp Asp Glu Ser Gln Ser 450 455 460 Ser His Thr Gly Lys Lys Lys Pro Glu Ile Ser Phe Met Phe Gln Asp 465 470 475 480 Glu Ile Glu Asp Phe Leu Arg Lys His Ile Gln Asp Ala Pro Glu Glu 485 490 495 Phe Ile Ser Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Lys Pro Leu Asn Lys Thr 500 505 510 Tyr Leu Glu Val Val Arg Ser Val Phe Met Ser Ser Thr Thr Ser Ala 515 520 525 Ser Gly Thr Gly Arg Lys Arg Thr Ile Lys Asp Leu Gln Glu Glu Val 530 535 540 Ser Asn Leu Tyr Asn Asn Ile Arg Leu Phe Glu Lys Gly Met Lys Phe 545 550 555 560 Phe Ala Asp Asp Thr Gln Ala Ala Leu Thr Lys His Leu Leu Lys Ser 565 570 575 Val Cys Thr Asp Ile Thr Asn Leu Ile Phe Asn Phe Leu Ala Ser Asp 580 585 590 Leu Met Met Ala Val Asp Asp Pro Ala Ala Ile Thr Ser Glu Ile Arg 595 600 605 Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Glu Glu Thr Lys Val Ala Leu Thr 610 615 620 Lys Leu His Asn Ser Leu Asn Glu Lys Ser Ile Glu Asp Phe Ile Ser 625 630 635 640 Cys Leu Asp Ser Ala Ala Glu Ala Cys Asp Ile Met Val Lys Arg Gly 645 650 655 Asp Lys Lys Arg Glu Arg Gln Ile Leu Phe Gln His Arg Gln Ala Leu 660 665 670 Ala Glu Gln Leu Lys Val Thr Glu Asp Pro Ala Leu Ile Leu His Leu 675 680 685 Thr Ser Val Leu Leu Phe Gln Phe Ser Thr His Ser Met Leu His Ala 690 695 700 Pro Gly Arg Cys Val Pro Gln Ile Ile Ala Phe Leu Asn Ser Lys Ile 705 710 715 720 Pro Glu Asp Gln His Ala Leu Leu Val Lys Tyr Gln Gly Leu Val Val 725 730 735 Lys Gln Leu Val Ser Gln Ser Lys Lys Thr Gly Gln Gly Asp Tyr Pro 740 745 750 Leu Asn Asn Glu Leu Asp Lys Glu Gln Glu Asp Val Ala Ser Thr Thr 755 760 765 Arg Lys Glu Leu Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile Lys Asp Leu Val Leu 770 775 780 Lys Ser Arg Lys Ser Ser Val Thr Glu Glu 785 790 <210> 13 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant BamHI-dNP2-EcoRI-EGFP fusion protein <400> 13 ggatccaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg aattcgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cell penetrating peptide comprising NP2 polypeptide or dNP2          polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system          using the same <130> PN130475P <150> 12/0112118 <151> 2012-10-09 <160> 13 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys   1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aag 33 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 3 cggctagcaa gattaagaaa gtcaagaaga aaggaagaaa gggatccgtg agcaagggcg 60 aggagctgtt cac 73 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 4 caagctttta cttgtacagc tcgtc 25 <210> 5 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP2-EGFP fusion          protein <400> 5 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aagaccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <210> 6 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for recombinant NP2-EGFP fusion protein <400> 6 Ala Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Val   1 5 10 15 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu              20 25 30 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly          35 40 45 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr      50 55 60 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr  65 70 75 80 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His                  85 90 95 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr             100 105 110 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys         115 120 125 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp     130 135 140 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 145 150 155 160 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile                 165 170 175 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln             180 185 190 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val         195 200 205 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys     210 215 220 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys                 245 250 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for dNP2 <400> 7 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys   1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys              20 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for dNP2 <400> 8 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga 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caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 540 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 600 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 660 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 720 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 780 atggacgagc tatacaagta a 801 <210> 11 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for recombinant dNP2-EGFP fusion protein <400> 11 Ala Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys   1 5 10 15 Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Glu Phe Val Ser Lys Gly              20 25 30 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly          35 40 45 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp      50 55 60 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys  65 70 75 80 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val                  85 90 95 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe             100 105 110 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe         115 120 125 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly     130 135 140 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His                 165 170 175 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn             180 185 190 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp         195 200 205 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro     210 215 220 Asp His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 225 230 235 240 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly                 245 250 255 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys             260 265 <210> 12 <211> 794 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Asp Ala Trp Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ala Ala Asp Phe Gln   1 5 10 15 Arg Ala Gln Phe Ala Glu Ala Thr Gln Arg Leu Ser Glu Arg Asn Cys              20 25 30 Ile Glu Ile Val Asn Lys Leu Ile Ala Gln Lys Gln Leu Glu Val Val          35 40 45 His Thr Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Ile Thr Pro Ala Gln Ile Ser Lys      50 55 60 Glu Met Arg Asp Glu Leu His Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Ile Val  65 70 75 80 Asp Leu Gln Gln Val Ile Asn Val Asp Leu Ile His Ile Glu Asn Arg                  85 90 95 Ile Gly Asp Ile Ile Lys Ser Glu Lys His Val Gln Leu Val Leu Gly             100 105 110 Gln Leu Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Asp Arg Leu Ala Glu Glu Val Asn         115 120 125 Asp Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gln Val Thr Ile Ser Glu Leu Cys Lys     130 135 140 Thr Asp Leu Pro Gly Asn Phe Leu Thr Gln Ala Leu Thr Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Arg Ile Ile Ser Gly His Ile Asp Leu Asp Asn Arg Gly Val                 165 170 175 Ile Phe Thr Glu Ala Phe Val Ala Arg His Lys Ala Arg Ile Arg Gly             180 185 190 Leu Phe Ser Ala Ile Thr Arg Pro Thr Ala Val Asn Ser Leu Ile Ser         195 200 205 Lys Tyr Gly Phe Gln Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Val Leu Glu Glu Leu     210 215 220 Val Asn Ser Gly Arg Leu Arg Gly Thr Val Val Gly Gly Arg Gln Asp 225 230 235 240 Lys Ala Val Phe Val Pro Asp Ile Tyr Ser Arg Thr Gln Ser Thr Trp                 245 250 255 Val Asp Ser Phe Phe Arg Gln Asn Gly Tyr Leu Glu Phe Asp Ala Leu             260 265 270 Ser Arg Leu Gly Ile Pro Asp Ala Val Ser Tyr Ile Lys Lys Arg Tyr         275 280 285 Lys Thr Gln Leu Leu Phe Leu Lys Ala Ala Cys Val Gly Gln Gly     290 295 300 Leu Val Asp Glu Val Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Ile Ser Ser Gly 305 310 315 320 Thr Trp Val Asp Ile Ala Pro Leu Leu Pro Thr Ser Leu Ser Val Glu                 325 330 335 Asp Ala Ile Leu Leu Gln Gln Val Met Arg Ala Phe Ser Lys Gln             340 345 350 Ala Ser Thr Val Val Phe Ser Asp Thr Val Val Val Ser Glu Lys Phe         355 360 365 Ile Asn Asp Cys Thr Glu Leu Phe Arg Glu Leu Met His Gln Lys Ala     370 375 380 Glu Lys Glu Met Lys Asn Asn Pro Val His Leu Ile Thr Glu Glu Asp 385 390 395 400 Leu Lys Gln Ile Ser Thr Leu Glu Ser Val Ser Thr Ser Lys Lys Asp                 405 410 415 Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Ala Thr Glu Gly Ser Gly Ser Met             420 425 430 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Arg Glu Tyr Lys Ile Lys Lys Val         435 440 445 Lys Lys Lys Gly Arg Lys Asp Asp Asp Ser Asp Asp Glu Ser Gln Ser     450 455 460 Ser His Thr Gly Lys Lys Lys Pro Glu Ile Ser Phe Met Phe Gln Asp 465 470 475 480 Glu Ile Glu Asp Phe Leu Arg Lys His Ile Gln Asp Ala Pro Glu Glu                 485 490 495 Phe Ile Ser Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Lys Pro Leu Asn Lys Thr             500 505 510 Tyr Leu Glu Val Val Arg Ser Val Phe Met Ser Thr Thr Ser Ala         515 520 525 Ser Gly Thr Gly Arg Lys Arg Thr Ile Lys Asp Leu Gln Glu Glu Val     530 535 540 Ser Asn Leu Tyr Asn Asn Ile Arg Leu Phe Glu Lys Gly Met Lys Phe 545 550 555 560 Phe Ala Asp Asp Thr Gln Ala Ala Leu Thr Lys His Leu Leu Lys Ser                 565 570 575 Val Cys Thr Asp Ile Thr Asn Leu Ile Phe Asn Phe Leu Ala Ser Asp             580 585 590 Leu Met Met Ala Val Asp Asp Pro Ala Ala Ile Thr Ser Glu Ile Arg         595 600 605 Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Glu Glu Thr Lys Val Ala Leu Thr     610 615 620 Lys Leu His Asn Ser Leu Asn Glu Lys Ser Ile Glu Asp Phe Ile Ser 625 630 635 640 Cys Leu Asp Ser Ala Ala Glu Ala Cys Asp Ile Met Val Lys Arg Gly                 645 650 655 Asp Lys Lys Arg Glu Arg Gln Ile Leu Phe Gln His Arg Gln Ala Leu             660 665 670 Ala Glu Gln Leu Lys Val Thr Glu Asp Pro Ala Leu Ile Leu His Leu         675 680 685 Thr Ser Val Leu Leu Phe Gln Phe Ser Thr His Ser Met Leu His Ala     690 695 700 Pro Gly Arg Cys Val Pro Gln Ile Ile Ala Phe Leu Asn Ser Lys Ile 705 710 715 720 Pro Glu Asp Gln His Ala Leu Leu Val Lys Tyr Gln Gly Leu Val Val                 725 730 735 Lys Gln Leu Val Ser Gln Ser Lys Lys Thr Gly Gln Gly Asp Tyr Pro             740 745 750 Leu Asn Asn Glu Leu Asp Lys Glu Gln Glu Asp Val Ala Ser Thr Thr         755 760 765 Arg Lys Glu Leu Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile Lys Asp Leu Val Leu     770 775 780 Lys Ser Arg Lys Ser Ser Val Thr Glu Glu 785 790 <210> 13 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant          BamHI-dNP2-EcoRI-EGFP fusion protein <400> 13 ggatccaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg aattcgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aagaccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762

Claims (15)

인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드를 한번 이상 포함하는 세포막 투과 도메인. 1. A cell membrane permeation domain comprising at least one NP2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from human NLBP (Novel LZAP Binding Protein). 제1항에 있어서, 상기 NP2 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.2. The transmembrane domain of transmembrane domain according to claim 1, wherein the NP2 polypeptide is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 2. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 NP2 폴리펩티드가 두 번 포함되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.2. The transmembrane domain of claim 1, wherein the NP2 polypeptide is included twice. 제7항에 있어서, 상기 두 번 포함되는 NP2 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 dNP2 폴리펩티드의 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.8. The transmembrane domain of transmembrane domain of claim 7, wherein the NP2 polypeptide is included in the form of a dNP2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. 제8항에 있어서, 상기 dNP2 폴리펩티드는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.9. The transmembrane domain of transmembrane domain of claim 8, wherein said dNP2 polypeptide comprises a polypeptide encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 8. 제1항의 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.The transmembrane domain of claim 1; And a cargo fused to the N-terminal or C-terminal of the transmembrane transmembrane domain. 제10항에 있어서, 상기 카고는 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.11. The recombinant cargo according to claim 10, wherein the cargo is a protein. 제1항의 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트.A genetic construct comprising a polynucleotide encoding the transmembrane domain of claim 1. 제12항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터. An expression vector for expression of recombinant cargo protein having improved cell membrane permeability, comprising the gene construct of claim 12. 제13항에 있어서, 상기 벡터는 제1항의 세포막 투과 도메인과 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질이 발현될 수 있도록, 카고 단백질을 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터. 14. The vector according to claim 13, wherein the vector further comprises a gene encoding a cargo protein so that the recombinant cargo protein in which the cargo protein is fused with the transmembrane domain of the first claim is additionally contained in the recombinant cargo Expression vector for protein expression. 제1항의 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 재조합 카고를 분리된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 분리된 세포 내로의 카고 전달 방법.
Preparing a recombinant cargo fused with a cargo at the N-terminal or C-terminal of the transmembrane transmission domain of claim 1; And
And contacting said produced recombinant cargo with isolated cells.
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