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KR101621426B1 - 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR101621426B1
KR101621426B1 KR1020140108613A KR20140108613A KR101621426B1 KR 101621426 B1 KR101621426 B1 KR 101621426B1 KR 1020140108613 A KR1020140108613 A KR 1020140108613A KR 20140108613 A KR20140108613 A KR 20140108613A KR 101621426 B1 KR101621426 B1 KR 101621426B1
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mangosteen
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티 뜨이 레
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바하드 구루방 릿
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선문대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 원-포트 효소 시스템을 이용한 하기 화학식 I로 표시되는 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 간편하고 경제적인 원-포트 효소 시스템을 통하여 물 용해도 및 항균 활성이 우수한 신규 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 제조할 수 있다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00010

Description

신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 이의 제조방법 {Novel Alpha-Mangostin Glycosides Derivates and Method for Preparing the Same}
본 발명은 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 원-포트 효소 시스템을 이용한 하기 화학식 I로 표시되는 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00001
대부분의 천연산물(NPs)은 자연적으로 당화(glycosylation)되며, 상당수가 그들의 생물학적 특성으로 인해 약물로 사용되고 있다(Griffith et al., Curr Opin Biotechnol 16:622-630, 2005 ). 당잔기는 생리활성 화합물과 표적 세포간의 특정 상호작용에 중요한 역할을 하며(Salas et al., Trends Microbiol 15:219-232, 2007), 아글리콘에 당의 부착은 화합물의 물리화학적 성질에 영향을 미친다. 따라서, 당화는 소수성 화합물의 용해도 증가, 불안정한 분자의 안정성 증진, 독성 감소 및 생물학적 활성 변형을 위한 방법으로 사용될 수 있으며, 천연산물의 구조적 유도체가 생성되는데 중요한 작용을 한다(Desmet et al., Chemistry 18:10786-10801, 2012). 또한, 프레닐화, 메틸화 및 수산화 같은 후 변형 역시 천연산물의 생리활성을 향상시킬 수 있다.
알파-망고스틴은 Garcinia mangostana Linn 유래의 천연 프레닐화 잔톤(xanthone)이다. 이 화합물은 항균, 항진균, 항바이러스, 항산화, 항-알러지, 항염증 및 항암 작용과 같은 뛰어난 생물학적 활성을 나타낸다(Chen et al., Food Chem Toxicol 46:688-693, 2008). 특히, 항암효과는 많은 인간 암세포주(백혈병, 대장암, 소세포폐암, 유방암, 흑색종암, 췌장암 및 전립선암)에서 널리 연구되고 있다(Johnson et al., Carcinogenesis 33:413-419, 2012). 그러나, 알파- 망고스틴의 낮은 수용성으로 인해 제약 적용에 한계가 있어, 많은 연구들은 물 용해도를 높이고 생물학적 특성을 향상시키기 위해, 그 구조를 변형시키는 노력을 하고 있다. 지금까지, 알파-망고스틴 유도체는 화학적 합성에 의해 제조되었고(Fei et al., Bioorg Med Chem Lett, 2014), 화학적으로 합성된 망고스틴 3, 6-디-O-글루코시드 유도체의 진정제 활성 및 혈압 상승 효과가 보고되어 있다(Pai et al., J Nat Prod 42:361-365, 1979). 그러나, 효소적 방법에 의한 알파-망고스틴 글리코시드의 합성은 아직까지 보고된 바 없다.
자연에 흔한 글리코실트랜스퍼라제(GT)는 활성화된 뉴클레오티드(NDP)-당류를 당의 공여체로 사용하고, 소분자를 기질로 이용하여 당화를 수행할 수 있다. 식물 유래 2차 대사산물의 대부분은 글루코스가 결합되어 있으며, 일부의 경우 갈락토스, 글루쿠론산 및 자일로스가 결합된 천연산물이 분리된다. 그러나, 식물의 2차 대사산물로부터 원하는 글리코시드의 생산은 고가이며, 계절에 영향을 받는 등의 어려움이 있어, 식물로부터 화합물을 분리하는 데는 한계가 있다. 반면, 천연산물 글리코시드의 화학적 합성은 긴 합성 단계와 유해한 시약들이 요구된다. 미생물을 이용한 또 다른 생산 방법은 간단한 발효에 의해 다양한 천연산물을 생산할 수는 있지만(Malla et al., Biotechnol Bioeng 110:2525-2535, 2013), 원하는 천연산물 글리코시드의 대량 생산을 위해서는 시스템의 개발 및 연구가 필수적이다. 많은 신규 천연산물 글리코시드가 뉴클레오티드(NDP)-당류을 이용한 in vitro 반응에 의해 합성될 수 있으나, 대량의 천연산물 글리코시드를 생산하기에는 뉴클레오티드(NDP)-당류가 고가라는 문제점이 있다. 뉴클레오티드(NDP)-당류의 비용을 낮추기 위한 노력으로, UDP-알파-글루코스(Lee et al., J Biochem Mol Biol 37:503-506, 2004) 및 TDP-알파-D-2-데옥시글루코스(Yang et al., J Mol Cat B: Enzymat 62:282-287, 2010)와 같은 상용 제품을 이용한 원-포트 효소적 합성방법이 개발되었다. In situ UDP-알파-글루코스 재사용을 이용한 원-포트 시스템은 몇몇 소분자의 글루코실화에 보고된 바 있다(Masada et al., FEBS Lett 581:2562-2566, 2007). 그러나, 이 시스템은 UDP-알파-글루코스 이외의 다른 뉴클레오티드(NDP)-당류에는 적용이 불가능하다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 저비용의 시재료로부터 UDP-알파-글루코스 및 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스를 생산하고, 그 후속 공정으로 바실러스 글루코스트랜스퍼라제(YjiC)를 사용하여 의약적으로 중요한 알파-망고스틴을 당화시키는 원-포트 반응을 이용하는 두개의 효소 시스템을 개발하고, 이로부터 수용성 및 항균 활성이 알파-망고스틴 보다 우수한 6개의 신규한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 제조하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수용성 및 항균 활성이 우수한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00002
상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-글루코피라노시드인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), N-아세틸-D-글루코사민 키나아제(N-AGK), 포스포만노뮤테이즈(PMM), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 2-데옥시글루코스를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00003
상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-2-데옥시글루코피라노시드인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 간편하고 경제적인 원-포트 효소 시스템을 통하여 물 용해도 및 항균 활성이 우수한 신규 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 제조할 수 있다.
도 1은 재조합 단백질의 발현 및 YjiC의 정제를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 1:PMM (50 kDa) 및 N-AGK (40 kDa); 2: YjiC (45 kDa) 및 GalU (38 kDa); 3:ACK (38 kDa); 4:UMK (27 kDa); 5: 단백질 마커; 6: 10mM imidazole 용출 YjiC; 7:100mM imidazole 용출 YjiC; 8:200mM imidazole 용출 YjiC;
도 2는 글루코스-1-포스페이트 및 2-데옥시글루코스를 시재료로 이용하여 기질인 UDP-알파-글루코스 및 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스를 합성하고, 이 기질로부터 (a) 알파-망고스틴 글루코피라노시드 및 (b) 알파-망고스틴 2-데옥시글루코피라노시드를 생성하는 원-포트 효소 시스템의 도식도이다. UDP 및 ADP는 부산물로 생성되며 재활용된다.
도 3은 (a) UDP-알파-글루코스, (b) UDP-알파-D-2-데옥시글루코스와 알파-망고스틴의 당화 반응을 HPLC-PDA로 분석한 결과이다. (i) 15분 동안 원-포트 반응, (ii) 1시간 동안 원-포트 반응, (iii) 15분 동안 일반 반응, (iv) 1시간 동안 일반 반응.
도 4는 알파-망고스틴 및 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 HR-QTOF ESI/MS과 연결된 HPLC-PDA로 분석한 결과이다. (a) α-mangostin [M+H]+ m/z+ ~411.1813; (b) α-mangostin 3,6-di-O-β-D-glucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~735.2889; (c) α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~573.2348; (d) α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~573.2344; (e) α-mangostin 3,6-di-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~703.2974; (f) α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~557.2391; and (g) α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside[M+H]+ m/z+ ~557.2397.
도 5는 (a) 알파-망고스틴 글루코피라노시드와 알파-망고스틴의 1H NMR 비교 결과이다: (i) 알파-망고스틴, (ii) 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드, (iii) 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드, (iv) 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드. (b) 알파-망고스틴 2-데옥시글루코피라노시드와 알파-망고스틴의 1H NMR 비교 결과이다: (i) 알파-망고스틴, (ii) 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드, (iii) 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드, (iv) 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드.
도 6은 알파-망고스틴의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 7은 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(Mg1)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 8은 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(Mg2)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 9는 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(Mg3)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 10은 알파-망고스틴 3, 6-D-2-데옥시글루코피라노시드(Mdg1)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 11은 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(Mdg2)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 12는 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(Mdg3)의 (a) 1H-NMR, (b) 13C NMR 구조분석 결과이다.
도 13은 원-포트 반응의 각각 다른 타임 포인트에서 생성된 (a) 알파-망고스틴 글루코피라노시드 및 (b) 알파-망고스틴 2-데옥시글루코피라노시드의 유도체이다: (Mg1) 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드; (Mg2) 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드; (Mg3) 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드; (Mgd1) 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드; (Mgd2) 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드; (Mgd3) 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드.
도 14는 알파-망고스틴 및 글리코시드 유도체의 용해도를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 원-포트 반응시켜, 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 수득하였다. 첨가된 UMP는 ATP, 아세틸포스페이트 및 UMK에 의해 UDP를 생성하며, 생성된 UDP는 ACK에 의해 UTP를 생성한다. 또한, 첨가된 글루코스 1-포스페이트는 GalU에 의해 UDP-알파-D-글루코스를 생성하며, 생성된 UDP-알파-D-글루코스와 YjiC가 반응하여 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성한다. 이 시스템은 UDP, ATP 등의 보조 인자들을 재사용함으로써, 반응하는 동안 보조인자의 추가가 필요 없다(도 2). 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3, 6-di-O-β-D-glucopyranoside)인 신규한 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체 3가지로 구성된다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00004
상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-글루코피라노시드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3, 6-di-O-β-D-glucopyranoside)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), N-아세틸-D-글루코사민 키나아제(N-AGK), 포스포만노뮤테이즈(PMM), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 2-데옥시글루코스를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 원-포트 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 수득하였다. 첨가된 UMP는 ATP, 아세틸포스페이트 및 UMK에 의해 UDP를 생성하며, 생성된 UDP는 ACK에 의해 UTP를 생성한다. 또한, 첨가된 2-데옥시글루코스는 ATP, 아세틸포스페이트 및 N-AGK에 의해 2-데옥시글루코스 6-포스페이트를 생성하며, 생성된 2-데옥시글루코스 6-포스페이트는 GalU에 의해 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스를 생성한다. 마지막으로 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스와 YjiC가 반응하여 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성한다. 이 시스템은 UDP, ATP 등의 보조 인자들을 재사용함으로써, 반응하는 동안 보조인자의 추가가 필요 없다(도 2). 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시 유도체드는 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)인 신규한 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체 3가지로 구성된다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), N-아세틸-D-글루코사민 키나아제(N-AGK), 포스포만노뮤테이즈(PMM), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 2-데옥시글루코스를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00005
상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-2-데옥시글루코피라노시드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis ) 유래인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법은 원-포트 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하며, 상기 원-포트 반응은 37℃에서 30분 내지 8시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1시간 내지 7시간인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(-mangostin) 글리코시드 유도체에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure 112014079008845-pat00006
상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자, β-D-글루코피라노시드 및 β-D-2-데옥시글루코피라노시드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3, 6-di-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 3가지 그람 양성균 및 2가지 그람 음성균에 대해 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 항균 활성을 측정하였다. 그 결과, 알파-망고스틴의 C-3 위치의 당화에 의해 생성된 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 항균활성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.
[실시예]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: 효소 단백질들의 발현과 정제
본 실시예에서는 재조합 단백질 UMK (27 kDa), ACK (38 kDa), GalU (38 kDa), N-AGK (40 kDa), PMM (50 kDa) 및 YjiC (45 kDa)을 E.coli BL21(DE3)(Stratagene, USA)에서 과발현시킨 후, 수용성 분획을 수득하였다(도 1).
각각의 단백질을 코딩하는 유전자는 공지된 방법(Lee et al. 2004; Yang et al. 2010)에 따라 발현 벡터에 도입하여 제조한 후(UMP kinase:UMK-pET15b, acetate kinase:ACK-pET24ma, UDP-a-D-glucose synthase:GalU-pET24ma, phosphomannomutase:PMM-pET24ma, N-acetyl-D-glucosamine kinase:N-AGK-pET32a, glycosyltransferase:YjiC-pET28a), N-AGK와 PMN(NA-PM) 그리고 GalU와 Yji(G-Y)를 하나의 형질전환체에 동시발현시켰다. 재조합 균주는 항생제가 포함된 LB 배지에서 3시간 배양 후, 50mL LB 배지에 접종하여 600nm 흡광도(OD600)가 0.5-0.7에 이를 때까지 37℃에서 배양하였다. 이후, 0.5mM IPTG를 첨가하여 20℃에서 18시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 조추출 단백질을 수득하기 위해, 세포를 4℃에서 3,000rpm으로 원심분리한 후 소니케이션을 수행하고, 4℃에서 12000rpm으로 30분간 다시 원심분리하여 수용성 부분과 불용성 부분을 분리하였다. 단백질의 발현은 12% SDS-PAGE로 확인하였으며, 조추출 효소는 원-포트 반응에 사용하였다.
일반 반응용 YjiC는 YjiC 발현 형질전환체를 배양한 후, TALON 금속 니켈 어피니티 레진(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정제하였다. YjiC 단백질은 각각 다른 농도의 imidazole로 용출하여(도 1), 각 분획은 12% SDS-PAGE로 확인하였으며, 단백질 농도는 Bradford 분석 방법(Bradford 1976)으로 측정하였다.
실시예 2: UDP-당류를 이용한 알파-망고스틴의 당화 반응 조건
알파-망고스틴 2-데옥시글루코피라노시드 합성은 100mM Tris 완충액, 20mM MgCl2, 200mM acetyl phosphate, 50mM 2-데옥시글루코스, 1mM ATP, 2mM UMP, 2mM(제조규모 반응은 15mM) 알파-망고스틴 및 실시예 1에서 분리한 각각의 ~50 mg/mL 조추출 단백질(UMK, ACK, NA-PM 및 G-Y)을 포함하는 혼합물로 원-포트 반응을 수행하였으며, 알파-망고스틴 글루코피라노시드 합성은 100mM Tris 완충액, 20mM MgCl2, 150mM acetyl phosphate, 50mM 글루코스-1-포스페이트, 1mM ATP, 2mM UMP, 2mM(제조규모 반응은 15mM) 알파-망고스틴 및 실시예 1에서 분리한 각각의 ~50 mg/mL 조추출 단백질(UMK, ACK 및 G-Y)을 포함하는 혼합물로 원-포트 반응을 수행하였다. 일반 반응은 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 10mM MgCl2, 2mM 알파-망고스틴, 50mg/mL 정제된 YjiC 및 2mM UDP-a-D-글루코스 또는 2mM UDP-a-D-2-데옥시글루코스가 포함된 혼합물로 수행하였다.
UDP-a-D-글루코스, UDP-a-D-2-데옥시글루코스, IPTG, ATP, UMP 및 아세틸포스페이트는 GeneDhem(대전, 한국)에서 구입하였으며, 2-데옥시글루코스는 Carbosynth(Berkshire, UK)에서 구입하였다. 또한, 알파-망고스틴, 메탄올 및 DMSO는 Sigma-Aldrich(ST.Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
반응은 37℃에서 수행하였으며, 시간에 따른 생성물의 분석을 위해 각각의 다른 시간에 10㎕ 반응 샘플을 500㎕ 메탄올에 희석하였다. 이후, 12000rpm으로 5분간 원심분리하여 HPLC-PDA 분석을 실시하였다. 제조규모의 당화는 15mM 알파-망고스틴을 5시간 동안 반응시킨 후, 메탄올로 반응 정지시키고 12000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 증발건조하여 농축하고, 3mL 메탄올에 용해시켜 HPLC로 정제하였다.
실시예 3: 알파-망고스틴의 당화 반응 산물의 분석
반응 산물은 UV 흡광도 243nm에서 역상 컬럼(Mightysil RP-18 GP 250-4.6(5㎛))을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피-광 다이오드 어레이(HPLC-PDA) 분석을 수행하였다. 이원 이동성 위상은 용매 A(0.025% TFA) 및 용매 B(100% acetonitrile, CH3CN)로 구성되며, 전체 유량은 20분 동안 1mL/min으로 유지하였다. 아세토니트릴의 농도 흐름은 20-50%(0-4min), 100%(4-8min), 100%(8-12min), 20%(12-20min)로 변하였다. HR-QTOF ESI/MS(high-resolution quadruple-time of flight-electrospray ionization-mass spectrometry) 분석은 SYNAPT G2-S(Water Corp, 미국)와 결합된 ACQUITY(UPLC, Water Corp, 미국) 컬럼을 이용하여 양이온 모드로 수행하였다. 정제는 아세토니트릴 전체 유량을 10mL/min으로 유지하면서, 20%(0-5min), 40%(5-10min), 40%(10-15min), 90%(15-25min), 90%(25-30min) 및 10%(30-35min)의 농도 흐름의 36분 이진법 프로그램을 이용하여,UV 검출기(243nm)가 연결된 C18 컬럼(YMC-Pack ODS-AQ (150 x 20 mm I.D., 10㎛)이 장착되어 있는 분취-HPLC로 수행하였다. 정제된 산물은 건조, 동결 및 DMSO-d 6 또는 methanol-d 4 에 용해시켜, 1H 및 13C NMR 분광계로 분석하였다.
반응산물의 HPLC-PDA 분석 결과, 두개의 반응에서 각각 3개씩의 피크가 확인되었다(도 3a 및 3b). 다시 각각의 피크를 HR-QTOF ESI/MS과 연결된 HPLC-PDA로 분석한 결과, UDP-알파-D-글루코스가 포함된 반응산물에서는 Mg2(Retention time(t R): 12.4min, [M+H]+ m/z calculated exact mass for (C30H37O11): 573.2336, observed mass: 573.2348) 및 Mg3 (t R: 12.8min, [M+H]+ m/z calculated exact mass for (C30H37O11): 573.2336, observed mass: 573.2344)의 2개의 모노글루코피라노시드와, 알파-망고스틴 디글루코피라노시드의 정확한 질량으로 표시되는 Mg1(t R: 10.57min, [M+H]+ m/z + calculated exact mass for (C36H47O16): 735.2864, observed mass: 735.2889)이 확인되었다(도 4b-d). 또한, UDP-알파-D-2-데옥시글루코스가 포함된 반응산물에서도 Mdg2(t R: 13.4min, [M+H]+ m/z calculated exact mass for (C30H37O10): 557.2387, observed mass: 557.2391) 및 Mdg3(t R: 13.7min, [M+H]+ m/z calculated mass for (C30H37O10): 557.2387, observed mass: 557.2397)의 2개의 모노-2-데옥시글루코피라노시드와, Mdg1(t R: 12.2min, [M+H]+ m/z calculated mass for (C36H47O14): 703.2966, observed mass: 703.2974)의 디-2-데옥시글루코피라노시드가 확인되었다(도 4e-g).
또한, UDP-알파-D-글루코스가 글루코스 공여체로 사용된 경우, 95% 이상 대부분의 알파-망고스틴이 1시간 내에 글루코피라노시드로 전환된 것과, 반면, UDP-알파-D-2-데옥시글루코스가 사용된 경우에는 58% 정도만 알파-망고스틴이 2-데옥시글루코피라노시드로 전환된 것을 HPLC-PDA 분석으로 확인할 수 있었다. 두개의 일반 당화 반응을 비교하여, YjiC가 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스 보다 UDP-알파-D-글루코스에 좀 더 특이성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: 알파-망고스틴 글리코시드의 구조분석
알파-망고스틴 글리코시드의 구조 확인 및 분석을 위해, 각각 생성물을 분취-HPLC로 분리하여 1H 및 13C NMR 분광계로 분석하였다.
Mg1의 1H-NMR 분광분석 결과, 두개의 당 모이어티가 베타 배열을 나타내고, d 5.17 (J = 27.0 Hz) 및 5.26 (J = 7.5 Hz)에서 두개의 더블릿을 가지는 두개의 아노머 양성자로 관찰되었다. 반면, 당 모이어티의 다른 양성자 시그널은 d (3.0-4.0) ppm 부위에서 관찰되었다(도 7a). C-4 및 C-5의 두개의 분리된 양성자에 대응하는 d 6.68 및 d 7.22ppm에서의 두개의 싱글릿은 모화합물의 시그널과 비교할때 각각 d 6.33 및 6.78ppm에서 이동되었다(표 1 및 도 5). 또한, d 10.86ppm에서의 C-3 및 C-6 두개의 수산기 그룹 양성자 시그널은 Mg1의 1H-NMR 분광분석에는 나타나지 않았다. 아글리콘의 다른 양성자는 알파-망고스틴 모화합물과 같은 시그널을 나타낸다(표 1 및 도 6a, 7a). 13C NMR 분석에 의하면, d 101.04 및 100.55ppm에서 아글리콘의 24개 탄소 외에 두개의 당 모이어티가 두개의 아노머 탄소 C-1' 및 C-1"에서 나타난다. 하기 표 1 및 표 2에서 비교하였다. 따라서, Mg1은 알파-망고스틴 3,6-디-O-β-D-글루코피라노시드로 확인되었다.
Mg2의 1H-NMR 분광분석 결과, d 5.22 ppm(J = 14.2 Hz)에서의 아노머 양성자 시그널은 베타 배열을 가진 아글리콘에 한개의 글루코스 분자가 부착한 것을 확인할 수 있다. 알파-망고스틴 모 화합물과 비교하여, C-4 위치(d 6.57 ppm)의 양성자 시그널이 이동함에 따라 글루코스 모이어티의 위치가 C-3로 할당되었다(표 1 및 도 8a). 총 30개의 탄소가 13C NMR 분석에 의해 나타나며, C30H37O11 분자식을 확인할 수 있었다.
Mg3의 1H-NMR 분광분석 결과, 5.12ppm(J = 7.2 Hz)에서 한개의 더블릿을 가지는 아노머 양성자가 관찰되었으며, 베타 배열을 가지는 하나의 글루코스 모이어티가 존재함을 확인함에 따라 또 다른 모노글루코피라노시드인 알파-망고스틴-3-O-β-D-글루코피라노시드를 확인할 수 있었다(도 9).
Mdg1의 1H-NMR 분광분석 결과는 Mg1의 1H-NMR 분광분석 결과와 비슷하였다. 두개의 당잔기 일부(moieties)가 베타 배열을 나타내고, d 5.56 (J = 9.5 Hz) 및 5.46 (J = 8.7 Hz)에서 두개의 더블릿을 가지는 두개의 아노머 양성자가 관찰되었다. C-2' 및 C-2"에서의 양성자 시그널은 d 2.23 및 d 1.62ppm으로 당 모이어티는 2-데옥시글루코피라노시드로 확인되었다(도 10a). d 10.86ppm에서의 양성자 시그널의 부재와 C-4(d 6.66ppm) 및 C-5(d 7.16ppm)의 양성자 시그널의 이동은 2개의 2-데옥시글루코피라노시드 모이어티의 위치가 C-3 및 C-6라는 것을 나타낸다(표 1). 13C NMR 분석에 의해 d 97.46 및 d 97.31에서 2개의 아노머 탄소가 관찰되어, Mdg1은 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드로 확인되었다(표 2).
Mdg2의 1H-NMR 분광분석 결과, d 5.37ppm(d, J = 9.5 Hz)에서의 아노머 양성자와 d 2.21 및 d 1.62ppm에서의 C-2 양성자의 두 개의 시그널이 나타나, 하나의 2-데옥시글루코스가 존재함을 확인하였다(표 1 및 도 11a). C-4 양성자(d 6.66ppm)는 C-3 O-당화로 재배치되어 스펙트럼이 이동하였다. Mdg2는 13C NMR 분석에 의해 총 30개의 탄소가 나타나고, 분자식 C30H37O10인 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드인 것을 확인할 수 있었다(도 11b).
Mdg3의 1H-NMR 분광분석 결과, d 5.46ppm(J = 9.0 Hz)에서 양성자를 가지는 하나의 더블릿에 의해 하나의 2-데옥시글루코스 모이어티가 존재하는 것을 확인하였으며, 2-데옥시글루코스 양성자 시그널은 Mdg2와 유사하였다(도 6 및 도 12a). 당화 위치는 알파-망고스틴과 비교하여, C-5 양성자(d 7.13ppm)의 싱글릿이 C-6로 이동하였다(표 1). 13C NMR 분석에 의하면, d 97.64ppm에서 아노머 탄소 시그널과 함께 총 30개 탄소 시그널이 관찰됨에 따라(도 12b 및 표2), Mdg3는 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드로 확인되었다.
알파-망고스틴과 알파-망고스틴 글리코피라노시드 유도체의 1H-NMR 결과
No Mangostin
(DMSO- d 6 ) 		Mg1
(DMSO- d 6 ) 		Mg2
(Methanol- d 4 ) 		Mg3
(Methanol- d 4 ) 		Mdg1
(DMSO- d 6 ) 		Mdg2
(DMSO- d 6 ) 		Mdg3
(DMSO- d 6 )
1 13.71 (s, 1H) 13.57 13.54 (s) 13.67 (s) 13.58 (s)
3 10.86 (s, 2H) 10.99 (s, 1H)
4 6.33 (s, 1H) 6.68 6.57 6.27 6.66 6.66 6.37
4a
5 6.78 (s, 1H) 7.22 6.68 7.07 7.16 6.83 7.13
6 10.86 (s, 1H) 11.20 (s, 1H)
7OMe 3.69 (s, 3H) 3.77 3.74 3.82 3.72 3.71 3.71
11 3.2 (d, 2H) 3.19 3.24 3.17 3.17
12 5.32-5.49 (m, 2H) 5.16 5.08 5.13 5.13 5.15 5.13
14 1.74 (dd, 6H) 1.75 1.82 1.78 1.73 1.72 1.73
15 1.61 (d, 6H) 1.62 1.65 1.66 1.62 1.62 1.62
16 4.00 (d, 2H) 4.05 4.03 4.11 4.02 4.00 4.02
17 5.32-5.49 (m, 2H) 5.12 5.08 5.13 5.13 5.15 5.13
19 1.74 (dd, 6H) 1.78 1.82 1.83 1.77 1.77 1.77
20 1.61 (d, 6H) 1.62 1.66 1.66 1.62 1.62 1.62
1' 5.26 (d, J=7.5 Hz) 5.22 (d, J=14.2 Hz) 5.56(d, J=9.5 Hz) 5.37 (d, J=8.6 Hz) 5.46 (d, J=9.0)
2' 3.17-3.73 3.34-3.56 2.25&1.62 2.21&1.62 2.27&1.62
3' 3.57 3.77 3.75
4' 3.11 3.12 3.11-3.54
5' 3.57 3.34
6' 3.57 3.35
1" 5.17 (d, J=27.0 Hz) 5.12 (d, J=7.2 Hz) 5.46(d, J=8.7 Hz)
2" 3.17-3.73 3.29-3.57 2.25&1.62
3" 3.57
4" 3.11
5" 3.57
6" 3.57
알파-망고스틴과 알파-망고스틴 글리코피라노시드 유도체의 13C NMR 결과
No. Mangostin
(DMSO- d 6 ) 		Mg1
(DMSO- d 6 ) 		Mg2
(Methanol- d 4 ) 		Mdg1
(DMSO- d 6 ) 		Mdg2
(DMSO- d 6 ) 		Mdg3
(DMSO- d 6 )
1 160.88 160.14 160.09 160.10 160.09 160.85
1a 102.87 104.53 104.43 104.46 104.31 103.05
2 110.62 112.57 111.38 112.07 110.99 110.86
3 163.31 162.37 161.59 161.73 161.55 163.65
4 93.28 93.16 92.48 93.23 93.33 93.34
4a 155.89 157.08 157.38 156.43 158.32 156.17
5 102.80 102.74 102.00 102.91 102.77 103.05
6 155.17 155.43 155.22 155.40 155.25 155.25
7 144.33 144.99 144.09 144.85 144.54 144.67
7OMe 61.14 61.65 60.51 61.51 61.19 61.50
8 137.38 137.26 137.72 137.29 137.51 137.17
9 182.30 182.80 182.50 182.75 182.61 182.39
9a 110.93 112.71 112.53 112.70 111.92 112.66
10a 155.59 155.57 156.02 155.53 155.84 155.29
11 21.98 22.20 21.61 22.20 22.19 21.98
12 124.72 124.24 124.13 124.24 124.49 124.39
13 131.40 131.81 131.10 131.83 131.74 131.64
14 18.99 19.05 17.29 19.04 19.05 19.02
15 26.58 26.60 25.19 26.58 26.60 26.59
16 26.73 26.71 26.33 26.71 26.79 30.06
17 123.51 123.17 122.97 122.07 122.95 123.33
18 131.32 131.72 131.10 131.76 131.57 131.59
19 18.70 18.80 17.55 18.76 18.72 18.72
20 26.50 26.57 25.16 26.55 26.55 26.52
1' 101.04 100.71 97.46 97.72 97.64
2' 74.24 74.09 72.14 72.10 72.09
3' 77.49 77.46 78.42 75.61 75.61
4' 70.58 70.40 71.09 71.17 71.15
5' 78.10 77.49 78.47 78.46 78.52
6' 61.72 61.67 61.92 61.83 61.50
1'' 100.55 97.31
2'' 74.35 72.14
3'' 77.49 78.42
4'' 70.62 71.09
5'' 78.10 78.47
6'' 61.72 61.92
실시예 5: 알파-망고스틴의 당화를 위한 원-포트 시스템
본 실시예에서는 천연산물의 당화에 일반적으로 사용되는 고가의 뉴클레오티드(NDP)-당 공여체로 인한 대량 생산이 어려운 한계를 극복하기 위하여, 뉴클레오티드(NDP)-당 공여체인 UDP-알파-D-글루코스 및 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스를 생산할 수 있는 원-포트 반응 시스템을 적용하였다. 이 시스템은 UDP, ATP 등의 보조 인자들을 재사용함으로써, 반응하는 동안 보조인자의 추가가 필요 없다(도 1).
원-포트 시스템과 일반 반응의 효율을 비교한 결과, 일반 반응은 2mM UMP가 대부분 2mM UDP-알파-D-글루코스 또는 UDP-알파-D-2-데옥시글루코스로 남아있으며, 원-포트 반응은 원-포트 시스템 초기 단계 15분 내에 디글리코피라노시드(알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드 또는 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드)로 빠르게 전환된다(도 3). 또한, UDP-당류의 추가는 원-포트 시스템의 YjiC GT의 활성을 더욱 증진시켜, 효과적이다. 만약 UDP가 없으면, 디글리코실레이션 반응 역시 중단된다. 따라서, 원-포트 글라이코실레이션 시스템은 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 대량생산에 적용된다.
실시예 6: 원-포트 시스템에 의한 알파-망고스틴 글리코시드 유도체의 생산
충분한 알파-망고스틴(15mM)을 추가하여 반응시켜 당화 산물을 수득하였다. 알파-망고스틴 글루코피라노시드(4.8mg/mL) 및 알파-망고스틴 2-데옥시글루코피라노시드(4.0mg/mL)의 최대 수율은 4시간째 얻을 수 있었다(도 13). 이 결과는 원-포트 반응의 높은 당화 수율을 나타내지만, 반응 시간에 따른 반응산물의 비율은 많은 차이가 있다. UDP-알파-D-글루코스 시스템은 디글루코피라노시드 생산 비율이 가장 높지만, UDP-알파-D-2-데옥시글루코스 시스템은 모노글리코피라노시드의 생산비율이 더 높다. UDP-알파-D-글루코스 시스템에서 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드는 1.5시간내에 고농도(3.6mg/mL)로 수득된다. 또한, UDP-알파-D-2-데옥시글루코스 시스템에서 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드 및 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드는 2.5시간 내에 각각 1.86mg/mL 및 1.8mg/mL의 고농도로 수득된다.
3,6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드의 생산을 위해서는, 원-포트 반응 시작 시점에 2mM의 알파-망고스틴을 첨가하고 1시간 간격으로 동량의 알파-망고스틴을 추가하여야 하며, 이로써 3 ,6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드는 5.5시간째에 2.46mg/mL의 농도로 주요 생성물(ratio 0.8)로 수득된다(도 13b-f). 그러나, UDP-알파-D-글루코스 시스템에서는, YjiC에 의해 알파-망고스틴이 모두 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드로 전화되므로, 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드 및 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드의 생산을 증가시키기가 어렵다.
실시예 7: 망고스틴 글리코시드 유도체의 용해도
충분한 양의 샘플(10mg)을 1mL PBS(pH 7.4)에 혼합하여 30분간 vortex 한 후, 13000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 수득하여, 0.45㎛ 시린지 필터로 필터링 후, 메탄올로 2번 희석하였다. 그 다음 243nm에서 HPLC로 분석하고, 알파-망고스틴 및 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 PBS에 용해시킨 후 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 알파-망고스틴의 물 용해도는 글루코피라노시드 또는 2-데옥시글루코피라노시드 모이어티의 결합으로 인해 변형된다. 글루코피라노시드 잔기는 2-데옥시글루코피라노시드 보다 알파-망고스틴의 용해도를 더 높일수 있다. 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(1.8㎍/mL) 및 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(1.66㎍/mL)은 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시루코피라노시드(1.27㎍/mL) 및 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(0.99㎍/mL)보다 높은 물 용해도를 나타낸다. 그러나, C-6 수산화기 그룹의 당화는 용해도에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8: 항균 활성
알파-망고스틴 및 그의 글리코시드 유도체의 항균 활성을 3가지 그람 양성균 Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus와 2가지 그람 음성균 Pseudomonas aeruginosa 및 Enterobacter cloaceae sub disolvens 에 대해 아가 디스크 확산법으로 측정하였다. 107CFU/mL의 접종원을 Mueller-Hinton agar(MHA) plate에 스프레드한 후, 각각 50㎍의 화합물이 포함된 멸균 필터 페이퍼 디스크(6mm 지름)를 아가 플레이트 위에 올렸다. 이후, 37℃에서 5시간 배양하고 항균 지역의 크기를 측정하였다.
5가지 박테리아는 면역저하 환자와 영유아에서 심각한 건강 문제를 야기하는 것으로 알려져있다. 50㎍의 알파-망고스틴과 각각의 알파-망고스틴 글리코시드 유도체를 37℃에서 5시간 반응시킨 결과는 표 3에 나타냈다.
그 결과, 모든 그람 양성균에 대해서는 모든 화합물이 항균 활성을 나타냈으나, 그람 음성균에 대해서는 알파-망고스틴 또는 어떤 알파-망고스틴 유도체도 항균 활성을 나타내지 않았다. 각각의 글루코피라노시드 유도체의 항균 활성은 각각의 박테리아에 대해 차이를 나타낸다. 특히, 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(Mg1) 및 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(Mg2)는 M. luteus 에 대해 ~1.45 및 ~2.54배 이상 향상된 항균 활성을 나타냈다. 그러나, B. subtilis 및 S. aureus 에 대한 항균 활성은 글루코피라노시드 형태에서는 관찰되지 않았다. 다른 글루코피라노시드 유도체인 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(Mg3)는 3가지 그람 양성균 모두에 대해 알파-망고스틴보다 낮은 항균 활성을 나타냈다. 또한, 모든 2-디옥시글루코피라노시드 유도체는 상기 3가지 그람 양성균에 대해 알파-망고스틴보다 낮은(~1.38 내지 ~1.69배 이하의) 항균 활성을 나타냈다. 알파-망고스틴의 C-3 위치의 당화는 M. luteus 같은 그람 양성균에 대한 항균 활성을 증진시킨다.
알파-망고스틴 및 글리코시드 유도체의 그람 양성균에 대한 항균 활성 측정
Zone of inhibition (mm)
Bacteria M Mg1 Mg2 Mg3 Mdg1 Mdg2 Mdg3
M. luteus 11 16 28 10.5 8.7 6.5 6.5
B. subtilis 9 0 11.5 7.5 8 8.5 8
S. aureus 9 0 12.5 6.5 6.5 6.5 6.5
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법:
    (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 글루코스 1-포스페이트를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 회수하는 단계;
    [화학식 I]
    Figure 112014079008845-pat00007
    .
    상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-글루코피라노시드인 것을 특징으로 한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3, 6-di-O-β-D-glucopyranoside)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법.
  3. 다음 단계를 포함하는 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법:
    (a) 유리딘 모노포스페이트 키나아제(UMK), 아세테이트 키나아제(ACK), N-아세틸-D-글루코사민 키나아제(N-AGK), 포스포만노뮤테이즈(PMM), UDP-알파-D-글루코스 합성효소(GalU) 및 글리코실트랜스퍼라제(YjiC)의 존재하에, UMP, ATP, 아세틸포스페이트 및 2-데옥시글루코스를 포함하는 기질 혼합물과 알파-망고스틴을 반응시켜 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 회수하는 단계;
    [화학식 I]
    Figure 112014079008845-pat00008
    .
    상기 화학식 I에서, R1 및 R2는 수소원자 또는 β-D-2-데옥시글루코피라노시드인 것을 특징으로 한다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시 유도체드는 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 원-포트 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 원-포트 반응은 37℃에서 1~7시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체의 제조방법.
  8. 하기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체:
    [화학식 I]
    Figure 112015123920018-pat00009

    상기 화학식 I에서, R1과 R2는 수소원자, β-D-글루코피라노시드 및 β-D-2-데옥시글루코피라노시드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이되, 단, R1 및 R2는 동시에 수소원자가 아니다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체는 알파-망고스틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-글루코피라노시드(α-mangostin 3, 6-di-O-β-D-glucopyranoside), 알파-망고스틴 3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴 6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴 3, 6-디-O-β-D-2-데옥시글루코피라노시드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체.
  10. 제8항 또는 제9항의 알파-망고스틴(α-mangostin) 글리코시드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물.
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