KR101610353B1

KR101610353B1 - Ｃｄｃａ１ 펩티드 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101610353B1
Application number: KR1020107005388A
Authority: KR
Inventors: 야스하루 니시무라; 미치코 하라오; 타쿠야 쯔노다; 유스케 나카무라
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2016-04-07
Also published as: US8598125B2; IL203898A; MX2010002001A; WO2009025117A1; JP5493076B2; KR20100063060A; CN101835892A; EP2186889A1; BRPI0815578B8; AU2008290061A1; SG183698A1; BRPI0815578B1; DK2186889T3; RU2013112616A; TW200916114A; CA2696701A1; PT2186889E; RU2486195C2; RU2010110564A; JPWO2009025117A1

Abstract

본 발명은 하기의 (A) 또는 (B) 펩티드 및, 이 펩티드를 이용한 방법을 제공한다:
(A) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(B) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가되고, 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드.

Description

ＣＤＣＡ１ 펩티드 및 이를 포함하는 약학적 조성물{CDCA１ peptide and pharmaceutical agent comprising the same}

본 발명은 세포 분열 주기 관련 1(CDCA1)이 과발현되는 폐암 및 담관세포암과 같은 암에 대한 효과적인 백신 및, 암 치료 및 예방을 위한 상기 펩티드를 포함하는 약물에 관한 것이다.

최근 몇 년 동안, 폐암 환자의 수는 전 세계적으로 꾸준히 증가하고 있으며, 대략 100만 명의 사람들이 현재 전 세계적으로 매년 폐암으로 죽어가고 있다. 또한 일본에서는, 폐암 사망률이 증가하고 있으며, 2005년에는 123,000명으로 추정되었다. 폐암은 남성이 더욱 우세하며, 남녀의 비율은 3대 1이다. 폐암은 위암을 누르고 1993년에 남성의 암 사망 주요원인이었다. 더욱이, 여성 흡연자의 수가 증가하면서, 여성 환자들의 수가 증가가 예상된다. 폐암은 2000년 이후부터 암 사망 주요 원인이며, 고령화사회가 되어가면서 환자의 수가 더욱 미래에는 증가할 것으로 예상된다. 흡연은 폐암 발달의 가장 큰 원인으로 여겨지며, 다른 원인으로는 석면, 공기오염 등의 흡입이 있다. 조기 발견과 신속한 치료가 폐암 치료에 중요하다. 그러나, 근래에 의료 검진중에 검사하는 간단한 흉부 X-ray와 가래검사는 폐암의 조기 발견에 효과적이지 않으며, 암 사망률을 감소를 이끌지 못한다고 지적되었다. 폐암사망의 수가 미래에 지속적으로 증가할 것으로 예상되면서, 새로운 치료 전략들을 개발하는 것이 시급한 과제가 되었다.

일본에서는 담관암 사망 수가 증가하고 있으며, 2005년 16,586명의 사람이 담관암으로 사망하였다. 대부분의 담관암의 경우, 초기 단계에서 자각증상이 발견되지 않았다. 소화관 공간에 형성되는 암인 예를 들어 대장암과 결장암과 비교하면, 담관암은 초기 단계에 발견과 진단이 어렵다. 그러므로 많은 경우, 암이 발견되었을 때, 이미 암은 진행되어 수술로 제거할 수 없다. 수술치료 이외에, 방사선 치료와 화학 치료가 담관암에 이용되고 있으나, 이러한 치료는 치료학적으로 효과가 없으며, 새로운 치료 방법의 확립이 필요하다.

반면, 근래 분자 생물학과 암 면역학의 발전으로 암세포에서 특이적으로 과발현되는 단백질에서 분해되어 생성되고, HLA 분자를 통해서 암세포의 표면 또는 항원 제시 세포에 제시되며, 면역반응을 유도시켜 암 세포를 파괴하는 펩티드를 인식하는 세포 독성(킬러) T 세포와 헬퍼 T 세포가 밝혀졌다. 더욱이, 많은 암의 항원 단백질과 앞서 언급한 면역반응을 촉진시켜 암을 공격하는 펩티드로부터 파생된 펩티드들이 밝혀졌고, 항원 특이적 암 면역치료법이 임상에 적용되고 있다.

HLA 클래스Ⅰ분자는 신체의 모든 유핵세포의 표면에서 발현한다. HLA 클래스Ⅰ분자는 세포질 또는 핵에서 생성되는 단백질의 세포 내 분해에 의해서 생성되는 펩티드와 결합하고, 상기 펩티드를 세포 표면에 발현한다. 정상 세포의 표면에, 정상 자가조직의 단백질에서 파생된 펩티드가 HLA 클래스Ⅰ분자와 결합하고, 면역체계의 T 세포에 인식되지 않고, 파괴되지 않는다. 반면, 암의 발병 과정에서, 암 세포는 종종 정상 세포에서 거의 또는 소량 발현되는 단백질들이 대량 발현된다. HLA 클래스Ⅰ분자는 암세포에서 특이적으로 과발현된 단백질의 세포 내 분해에 의해서 생성되는 펩티드와 결합한 후, 암세포의 표면에서 상기 펩티드를 발현시킬 때, 세포 독성(킬러) T 세포는 오직 암세포만을 인식하고, 파괴한다. 이러한 암 특이적 항원 또는 펩티드를 개체에 투여함으로써, 암 세포는 파괴될 수 있고, 암 성장은 정상세포에 피해를 주지 않고 억제될 수 있다. 이를 암 특이적 항원을 이용한 암 면역치료법이라고 한다. HLA 클래스 Ⅱ 분자는 주로 항원 제시 세포의 표면에서 발현된다. 상기 분자는 암 특이적 항원의 세포 내부 분해에 의하여 생성된 암 특이적 항원에서 파생된 펩티드와 결합하고, 그 뒤에 상기 펩티드를 세포의 표면에 발현한다. 이러한 펩티드를 인식하는 헬퍼 T 세포는 활성화되고, 다른 면역 적격 세포를 활성화하는 다양한 사이토카인을 생성하는 암에 대한 면역반응을 유도또는 강화한다.

이러한 이유로, 만약 암 특이적이고 과발현되는 항원을 표적으로 하는 면역치료가 개발된다면, 그러한 치료는 정상 자가 기관에 어떠한 해로운 일도 발생하지 않고 오직 암세포만을 효과적으로 제거할 수 있을 것이다. 또한, 이러한 치료법은 다른 치료를 적용할 수 없는 말기 암 환자들에게 적용될 수 있을 것이라고 예상된다. 추가로, 암 특이적 항원 및 펩티드를 백신으로 암 발병률이 높은 개체에 미리 투여함으로써, 암의 발병을 방지할 수 있다.

비록 다양한 폐암 치료방법이 있으나, 폐암은 다른 암에 비해 예후가 좋지 않으며, 다루기 힘든 암중 하나이다. 그 이유는, 예를 들어, 빠른 진행, 및 많은 경우 암이 발견되었을 때에 암이 진행되어 있기 때문이다. 더욱이 수술은 매우 침습적이기 때문에, 수술이 적용 가능한 환자는 제한적이며, 방사선 치료 또는 화학치료로 완치가 어렵다. 만약 폐암에 과발현되는 특이적 항원을 표적으로 하는 면역 치료법이 개발된다면, 정상 자가 기관에 아무런 피해를 주지 않고, 그 치료법에 의해서 오직 암을 효과적으로 제거할 수 있을 것이다. 더욱이 이러한 치료학적 방법은 모든 말기 암 환자 및 폐기능이 극심하게 저하되어 다른 치료를 받지 못하는 환자들에게 적용될 것으로 예측된다. 또한, 폐암의 발병률은 흡연자들에게서 높기 때문에, 면역치료는 폐암 유발률이 높은 사람들의 폐암 예방에 이용될 수 있을 것이다.

cDNA 마이크로어레이를 이용한 게놈 범주 유전자 발현 분석을 통해서, 본 발명자들은 37건의 비소세포폐암, 배아의 장기 및 다양한 정상 성인의 장기 임상 사례에서 27,648개 인간 유전자들의 발현 패턴을 검사하였다. 그 결과, 발명자들은 CDCA1(세포 분열 주기 관련 1, 또한 Nuf2의 인간 호모로그(hNuf2)로 알려짐)(GenBank Accession No. NM_145697)가 많은 폐암 사례에서 과발현되고 있는 반면, 배아의 간 또는 면역체계에서 분리한 정소를 제외한 성인의 정상적인 장기에서 거의 발현되지 않음을 밝혔다. 더욱이, CDCA1은 담관세포암, 방광암 및 신세포암의 모든 사례에서 과발현하였다. CDCA1의 과발현은 또한 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암의 사례에서 40% 또는 그 이상 관찰되었다. 이런 사실은 CDCA1이 많은 암의 종류에서 함-특이적 항원으로서 역할할 수 있음을 제시한다.

HLA-A2는 종종 인종에 상관없이 사람들에게 관찰되며, 일본인의 약 30%가 HLA-A2를 가지고 있다. 그러므로, 만약 HLA-A2를 통해서 세포 독성(킬러) T 세포에 제시되는 암 항원 펩티드를 발견할 수 있다면, 이는 일본인 뿐만 아니라, 백인과 그 외의 사람들에게 널리 이용될 수 있다. 이에 따라, HLA-A2에 의해서 킬러 T 세포에 제시되는 암 항원 펩티드를 알아내는 것은 중요한 과제이다. 만일 그러한 암 항원 펩티드가 전 세계적으로 높은 치사율과 사망자수를 갖는 폐암의 면역 치료법에 이용된다면 큰 도움이 될 것이다.

본 발명과 관련된 선행기술 문헌은 하기와 같다.

DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V., and Salmon, E.D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells J. Cell Biol. 159: 549-555, 2002. DeLuca, J.G., Dong, Y., Hergert, P, Strauss, J., Hickey, J.M., Salmon, E.D., McEwen, B.F., Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites., Mol. Biol. Cell 16: 519-531, 2005. Hayama, S., Daigo, Y., Kato, T., Ishikawa, N., Yamabuki, T., Miyamoto, M., Ito, T., Tsuchiya, E., Kondo, S., and Nakamura, Y., Activation of CDCA1-KNTC2, Members of Centromere Protein Complex, Involv면역원성 조성물 in Pulmonary Carcinogenesis., Cancer Res. 66: 10339-10348, 2006. Liu, S.T., Rattner, J.B., Jablonski, S.A., and Yen, T.J., Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells., J.Cell Biol. 175: 41-53, 2006. DeLuca, J.G., Howell, B.J., Canman, J.C., Hickey, J.M., Fang, G., and Salmon, E.D., et al. Nuf2 and Hec1 Are Requir면역원성 조성물 for Retention of the Checkpoint Proteins Mad1 and Mad2 to Kinetochores., Current Biology 13: 2103-2109, 2003. Liu, D., Ding, D., Du, J., Cai, Xin., Huang, Y., Ward, T., Shaw, A., Yang, Y., Hu, R., Jin, C., and Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associat면역원성 조성물 Protein E and Is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J.Biol.Chem.282: 21415-21424, 2007.

본 발명에 의해서 이루고자하는 목적은 수술치료, 화학치료 및 방사선 치료로 치료하기 힘든 전이성 또는 불응성 암인 폐암, 담관암 등을 위한 치료 방법으로서, 암 환자의 암에 대항하는 면역력을 강화시켜 암 성장을 억제하는 면역 치료법을 수행하는 방법을 개발하는 것이다. 본 발명자들은 암 특이적으로 과발현되는 단백질에서 파생되고, HLA-A2에 의해서 킬러 T 세포에 제시되며, 따라서 CDCA1이 과발현되는 다양한 암을 가진 일본 환자의 30%에게 면역치료법으로 적용가능한 펩티드들을 동정하였다.

본 발명자들은 폐암 조직의 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해 폐암에서 과발현되는 CDCA1 유전자(GenBank Accession No. NM_145697)를 동정하였다. 정상 조직에서 CDCA1의 발현은 면역체계에서 분리된 정소에서만 관찰된다. CDCA1 특이적 킬러 T 세포에 의해서 항암 면역력이 유도되는지를 검사하기 위하여, 대략 30%의 일본인에게서 발현되는 HLA-A2를 발현하는 HLA-A2 형질전환 마우스를 이용하였다. 구체적으로, 여기에서, 발명자들은 HLA-A2 형질전환 마우스가 HLA-A2 결합 모티프(motif)가 있는 인간 CDCA1에 의해서 자극된 마우스 골수-유래된 수지상 세포로 면역화시켰을때, HLA-A2 제한적 펩티드-특이적 킬러 T 세포가 유도되는지의 여부를 실험하였다. CDCA1 펩티드-특이적 킬러 T 세포들이 상기 면역화시킨 마우스의 비장 세포에서 유도 여부를 검사하기 위하여 HLA-A2에 의해서 제시되는 펩티드를 인식하여 활성화된 킬러 T 세포에서 생산하는 γ-인터페론(interferon)(IFN-γ)을 감지하는 ELISPOT 분석를 이용하여 검사하였다. 그 결과, HLA-A2 양성 암 환자를 표적으로 하는 면역 치료법에 이용될 수 있는 두 가지 종류의 새로운 CDCA1 펩티드가 발견되었다. 더욱이, 이러한 펩티드에 의해 활성화되는 암 환자 유래한 및 건강한 기증자 유래한 CTLs는 CDCA1을 발현하는 세포에 대하여 세포용해 활성을 나타냈다. 이는, 상기 펩티드들이 HLA-A2 제한된 인간 킬러 T 세포에 의해 인식될 수 있으며, HLA-A2 양성 암 환자의 암 면역 치료법에 활용될 수 있다고 예측된다.

보다 구체적으로, 본 발명은 하기에 기재된 것을 제공한다:

[1] 하기 (A) 또는 (B)의 펩티드:

(A) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

(B) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가되고, 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 갖는 상기 펩티드;

[2] 상기 [1]의 펩티드에서, N 말단에서 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)이다;

[3] 상기 [1]의 펩티드에서, C-말단 아미노산이 발린(valine) 또는 루신이다;

[4] [1]의 하나 또는 다수의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암에 대한 면역 유도제;

[5] [1]의 하나 또는 다수의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 치료 및/또는 예방제;

[6] [1]의 하나 또는 다수의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제;

[7] [1]의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제;

[8] [1]의 하나 또는 다수의 펩티드(들)를 유효성분으로 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포를 유도제;

[9] [1]의 펩티드에 대한 항체;

[10] [1]의 펩티드를 이용하여 유도되는 헬퍼 T 세포, 세포 독성(킬러) T 세포, 또는 이들을 포함하는 면역세포군;

[11] [1]의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 항원 제시 세포;

[12] 상기 [11]의 항원 제시 세포는 [6] 또는 [7]의 약제에 의해서 유도된다;

[13] [1]의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜(exosome);

[14] HLA 항원은 HLA-A2 (HLA-A2*0201)인 [13]의 엑소솜;

[15] 항원 제시 세포를 [1]의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법;

[16] [1]의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도 방법;

[17] T 세포를 [1]의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 독성(킬러) T 암 치료;

[18] [1]의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 면역 유도 방법;

[19] [1]의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법;

[20] 암에 대한 면역 유도제 제조를 위한 [1]의 펩티드의 용도;

[21] 암 치료 및/또는 예방제 제조를 위한 [1]의 펩티드의 용도;

[22] 암에 대한 면역 유도용 [1]의 펩티드;

[23] 암 치료 및/또는 예방을 위한 [1]의 펩티드.

도 1A는 HLA-A2 제한적인 킬러 T 세포에 의해서 인식되는 CDCA1 펩티드를 동정하는 프로토콜을 나타내고 있다. 면역화시킨 마우스로부터 비장세포를 얻은 날을 "0 일"로 지정한다. 도 1B는 ELISPOT 분석 결과를 나타낸다. ELISPOT 분석은 면역화시킨 마우스로부터 획득한 킬러 T 세포가 CDCA1 펩티드-자극된 세포와 특이적으로 반응하는지와 IFN-γ를 생성하는지의 여부를 확인하기 위하여 사용하였다. 그 결과, CDCA1-1 또는 CDCA1-4 펩티드에 의해 유도된 킬러 T 세포는 특이적으로 CDCA1 펩티드-자극된 T2A2 세포를 인식하며, IFN-γ를 생성하였다. 그러나, 다른 펩티드로 유도된 킬러 T 세포에서는 CDCA1 특이적 킬러 T 세포 면역 반응이 나타나지 않았다. 따라서, 상기 CDCA1-1 및 CDCA1-4 펩티드는 HLA-A2 제한적 킬러 T 세포에 특이적으로 CDCA1을 유도할 수 있는 에피토프(epitope) 펩티드라고 확정되었다. 도 1B에 나타난 상기 CDCA1 펩티드 수는 표 1의 "펩티드 위치"에 표시된 펩티드의 수와 일치하나, 하기에 기재된 서열 ID 수와 일치하지 않았다.
도 2는 CDCA1 펩티드를 특이적으로 인식한 결과 활성화된 T세포에 의해서 생성된 IFN-γ를 확인하는 ELISPOT 분석 결과를 나타낸다. 도 2A는 HLA-A2 유전자 변이 마우스의 골수에서 유래된 CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 펩티드-자극된 수지상 세포에 의해 자극되어 유도된 킬러 T 세포의 결과를 나타낸다. CDCA1 펩티드-자극된 T2A2 세포를 자극하는 세포로서 사용하였을 때, 스팟(spot) 수와 전체 스팟 부위는 HLA-A2 양성 비-CDCA1 자극 T2A2 세포를 자극하는 세포로 사용되었을 때보다 매우 컸다. 따라서, CDCA1-1 펩티드는 HLA-A2 제한적 킬러 T 세포를 유도할 수 있는 에피토프 펩티드로 결론지을 수 있다. 도 2B는 HLA-A2 유전자 변이 마우스의 골수에서 유래한 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드-자극된 수지상 세포에 의해 자극되어 유도된 킬러 T 세포의 결과를 나타낸다. CDCA1 펩티드-자극된 T2A2 세포를 자극하는 세포로서 사용하였을 때, 스팟 계수와 전체 스팟 부위는 HLA-A2 양성 비-CDCA1 자극 T2A2 세포가 자극하는 세포로 사용하였을 때보다 굉장히 컸다.
도 3은 건강한 기증자에게 유도된 CTLs의 CDCA1 특이적 면역 반응을 나타낸다. 도 3A는 PBMC로부터 CDCA1 특이적 CTLs를 유도하는 프로토콜을 나타낸다. PBMCs는 건강한 기증자로부터 분리하였고, CD8⁺ T 세포와 CD14⁺세포를마이크로비드(microbead)를 이용하여 분리하였다. 그 뒤, 펩티드 반응성 CD8⁺ CTLs가 생성되었으며, GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 5일 동안 배양하여 CD14 양성 세포에서 DCs가 생성되었다. DCs는 β2 마이크로글로불린(microglobulin)의 존재하에서 37℃에서 4시간 동안 배양되었고, HLA-A2 결합 펩티드에 의해서 자극되었다. 펩티드-자극된 DCs는 그 뒤에 방사능 처리되고, 자가 조직의 CD8 양성 T 세포와 1: 20의 비율로 혼합되었다. 세포는 IL-7이 첨가된 2% 면역혈청을 함유하는 AIM-V에서 배양되었다. 3일이 지난 후, IL-2가 배양 배지에 첨가되었다. 12번째와 19번째 날, T 세포는 펩티드-자극된 자가 면역 DCs로 다시 자극되었다. DCs는 상기 방법을 이용하여 제조하였다. IFN-γ ELISPOT 분석와 Cr 방출 분석은 세 번째 펩티드 자극 후 5일과 6일 후에 수행되었다. 도 3B 및 C는 CDCA1₆₅ _-73 (No. 1) 펩티드 및 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4) 펩티드를 각각 사용하여 기증자로부터 유도된 CTLs와 표적 세포를 같이 배양한 뒤에 ELISPOT 분석를 수행한 결과를 나타낸다. 펩티드-자극된 T2 세포에 대한 IFN-γ는 비-펩티드-자극된 T2 세포에 대한 것보다 훨씬 많이 생성되었다. 도 3D는 CDCA1 펩티드-자극된 T2 세포에 대해서 암 환자 기증자 1 및 건강한 기증자 1의 PBMCs에서 유래한 CTLs의 세포 독성을 나타낸다. 도 3E는 건강한 기증자 1에서 CDCA1_351-359펩티드로 유래한 CTLs의 양-의존적 반응을 나타낸다. CTLs는 0.2 ㎎/㎖ 또는 높은 E/T 5 비율의 펩티드로 자극한 T2 세포에 대한 반응으로 많은 양의 IFN-γ을 생성하였다.
도 4는 CDCA1 양성 암 세포에 대한 건강한 기증자에서 유도된 CTLs의 특이적 세포 독성을 나타낸다. 도 4A는 CDCA1 유전자 발현 벡터가 COLO201 세포에 도입되었을 때, COLO201 세포에서 발현을 나타낸다. CDCA1-HA 발현이 EF-1α 프로모터(promoter) 및 CMV 프로모터에 의해서 유도되는 렌티 바이러스가 CDCA1을 발현하지 않고, HLA-A2을 세배 더 발현하는 암 세포주(COLO201)에 감염시키는데 사용되었다. 세포 용해물은 안티-HA-항체(anti-HA antibody) (중간) 또는 안티-CDCA1-항체( anti-CDCA1 antibody) (위)를 이용한 웨스턴 블랏 분석에 사용되었다. 도 4B, C 및 D 는 COLO201/CDCA1에 대한 IFN-γ 생성을 나타낸다. IFN-γ는 형질변환된 COLO201 암 세포 주에서 형질변환되지 않은 COLO201 암 세포주보다 훨씬 더 생성되었다. 더욱이, 내인성으로 CDCA1 및 HLA-A2를 발현하는 PANC1에 대한 IFN-γ는 CDCA1과 HLA-A2를 모두 발현하지 않는 A549에 대한 것보다 더욱 많이 생성되었다. 도 4E 및 F는 기증자 유래한 CTLs와 표적 세포를 같이 배양하였을 때, ⁵¹Cr 방출 분석 결과를 나타낸다. 세포 독성은 PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+)에서 관찰되나, A549 (CDCA1+, HLA-A2-) 및 COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+)에서는 관찰되지 않았다. 도 4G는 CDCA1 펩티드 반응성 CTLs 및 CD8 양성 세포 중에서 HLA-A2-CDCA1 사량체(tetramer)간의 상호관계를 나타낸다. 왼쪽의 다이어그램(diagram)은 펩티드-자극된 T2 세포를 표적 세포로 이용하고, E/T 비율이 5인 ELISPOT 분석 결과를 나타낸다. 오른쪽 다이어그램은 FACS 분석 결과를 나타낸다. 왼쪽 다이어그램에서 분석한 세포는 건강한 기증자-1에서 유래한 CTLs를 대상으로 펩티드-자극된 DCs로 세 번 PBMC 자극한 세포이다. 오른쪽 다이어그램은 건강한 기증자 1의 PBMCs로부터 분리된 실험하지 않은 CD8 양성 세포를 분석한 결과이다.

본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술의 일반적인 기술의 하나로 통상적으로 이해될 수 있는 의미를 지닌다.

본 발명의 펩티드는 일본인과 백인의 인구집단에서 종종 발견되는 HLA 대립 형질인 HLA-A2에 제한적인 에피토프(epitope)이다. 구체적으로, HLA-A2에 대한 결합 친화성을 지표로 이용하여, CDCA1에서 파생된 HLA-A2에 결합 펩티드 후보를 선택하였다. 선택된 상기 펩티드들에서, HLA-A2 형질전환 마우스의 골수 세포-유래된 상기 펩티드로 자극된 수지상 세포(BM-DCs)를 상기 선택된 펩티드로 자극하여 HLA-A2 형질전환 마우스의 체내에 킬러 T 세포들이 유도되는지 여부를 평가하였다. HLA-A2 형질전환 마우스에서 CDCA1-1(YMMPVNSEV (서열번호: 1)) 및 CDCA1-4(KLATAQFKI (서열번호: 2))에 의해서 세포 독성 (킬러) T 세포가 생체 밖에서 유도되었다. 이러한 펩티드로 유도된 킬러 T 세포는 동일한 펩티드로 자극된 T2A2 세포에 대하여 면역반응을 보였다. 그러나 이러한 킬러 T 세포들은 비-펩티드-자극된 T2A2 세포에 대해서는 면역반응을 보이지 않았다. 더욱이, CDCA1-1 및 CDCA1-4로 유도된 암 환자 유래된 및 건강한 기증자 유래된 CTLs는 CDCA1을 발현하는 세포주에 대해서 세포 용해 반응을 보였다. 이러한 결과는 CDCA1에서 유래한 펩티드가 CDCA1을 제시하는 세포에 대하여 면역 반응을 유도하는 유용한 펩티드임을 보여준다. CDCA1은 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암의 대부분 경우의 암에 걸린 조직에서 과발현된다고 알려져 있다. 이러한 사실로부터 CDCA1을 다양한 암의 면역 치료학적 유용한 표적으로 생각할 수 있다.

(1) 본 발명의 펩티드 및 상기 펩티드를 포함하는 암에 대한 면역 유도제

본 발명의 펩티드는 하기의 (A) 내지 (D) 중의 어느 하나이다.

(A) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.

(B) 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가되고, 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드;

(C) 상기 (B) 펩티드에서, N 말단에서 두 번째 아미노산이 루신(leucine) 또는 메티오닌인(methionine)인 펩티드.

(D) 상기 (B) 펩티드에서, C 말단의 아미노산이 발린(valine) 또는 루신인 펩티드.

여기에서, "킬러 T 세포를 유도하는 활성을 보이는 펩티드"란 " 킬러 T 세포 (세포 독성 T 세포/CTLs)를 자극하는 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드"를 의미한다.

본 발명의 펩티드는 약 40개 이하의 아미노산을 갖는 에피토프 펩티드로, 바람직하게는 20개 이하이고, 더욱 바람직하게는 15개의 이하이며, 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 킬러 T 세포의 활성을 보인다. 더욱이, 본 발명의 펩티드(에피토프 펩티드들)는 킬러 T 세포를 유도하는 능력이 유지되는 한, 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되는 펩티드를 포함한다. 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되는 잔기(residue)의 수는 일반적으로 5 개 또는 그 이하이며, 바람직하게는 4개 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 3개 또는 그 이하, 이보다 더 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산이다.

변형 펩티드들(즉, 최초의 아미노산 서열에 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기들을 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가로 변형되어 얻어진 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들)은 원래의 생물학적 활성을 유지한다고 알려져 있다(Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al . (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). 상기 아미노산 변형은 바람직하게는 원래의 아미노산 서열의 측쇄의 성질은 유지된다. 아미노산 측쇄의 성질의 예는 다음을 포함한다: 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V); 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); 및 다음의 기능적 그룹 또는 성질을 공통으로 갖는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기-포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자-포함하는 측쇄(C, M); 카르복실기- 및 아미드-포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기-포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족 환- 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 괄호 안의 문자들은 아미노산의 한 문자 코드를 나타낸다.

바람직한 실시예에서, 본 발병의 펩티드들(면역원성 펩티드)은 노나펩티드 (nonapeptides), (9-머(mer)) 또는 데카펩티드, (10-머)이다.

높은 결합 친화성 및 킬러 T 세포 유도 활성을 가진 펩티드를 얻기 위해서, 천연적으로 생긴 CDCA1의 부분적인 펩티드의 아미노산 서열은 하나, 둘 또는 다수의 아미노산을 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가하여 변형될 수 있다. 여기에서 "다수"란 용어는 5개 또는 그 이하의 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 3개 또는 그 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개 또는 그 이하의 아미노산이다. 더욱이, HLA 항원에 대해 높은 친화력이 있는 펩티드 서열의 규칙성이 알려져 있기 때문에(Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), 본 발명의 펩티드들(에피토프 펩티드들)은 HLA 항원들에 대한 친화성을 증가시키기 위해서 규칙성의 근거하여 변형될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 결합 친화성이 높은 펩티드는 N-말단의 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환하여 얻을 수 있다. 비슷하게, HLA-A2에 대한 결합 친화성이 높은 펩티드는 C-말단에서 아미노산을 발린 또는 루신으로 치환하여 얻을 수 있다.

상기 에피토프 펩티드의 서열이 다른 기능을 갖는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 일부와 동일할 때, 특정 물질에 대한 자가면역 이상 또는 알레르기 증상과 같은 부작용이 유발될 수 있다. 이러한 부작용을 피하기 위해서, 변형된 에피토프 펩티드는 상기 알려진 단백질의 아미노산 서열과 일치하면 안 된다. 이러한 목적을 위해서 가능한 데이터베이스를 이용하여 상기 변형된 에피토프와 100% 상동성을 보이는 다른 기능을 갖는 내인성 또는 외인성 단백질이 없는지 확인하는 상동성 검색을 수행해야할 필요가 있다. 이러한 과정을 수행함으로써, HLA 항원에 대한 결합 친화성을 높이기 및/또는 킬러 T 세포 유도 활성 상승을 위해서 상기 언급한 아미노산 서열 변형으로 유발되는 위험들을 피할 수 있다.

비록 HLA 항원들에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 상기 언급한 펩티드들이 암 백신으로 매우 유용할 것으로 예측되나, 높은 결합 친화성을 지표로 이용하여 후보 펩티드들을 선택하여 이 펩티드들이 킬러 T 세포 유도 활성을 실제로 하는지 검사할 필요가 있다. 상기 킬러 T 세포 유도 활성은 다음에 의해서 확인될 수 있다: 인간 MHC 항원(예를 들어, B 림프구, 대식세포 및 수지상 세포)을 갖는 항원 제시 세포를 유도함, 더욱 구체적으로 인간 말초혈액 단핵 백혈구에서 유래한 수지상 세포를 유도함; 관심 있는 펩티드로 세포들을 자극함; 그 뒤 CD8 양성 세포들과 혼합함; 및 표적 세포를 향한 세포 독성을 측정함. 반응성 체계로서, 인간 HLA 항원(예를 들어, BenMoham L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79, Relat면역원성 조성물 Articles, Books, 및 Linkout에 기재됨)을 발현하는 형질전환 동물들이 사용되었다. 예를 들어, 세포 독성을 측정하기 위해서, 표적 세포는 ⁵¹Cr 또는 그 외의 물질로 방사성 표지를 한다. 상기 표적 세포의 세포 독성은 고정된 펩티드를 갖는 항원 제시 세포의 존재하에서 킬러 T 세포에 의해서 생성 및 방출된 IFN-γ 생성을 측정하여 검사할 수 있다; 그리고 안티-IFN-γ 단일클론 항체를 이용하여 배양 배지에 있는 IFN-γ 생성 부위를 가시화한다.

실시예에 나와있듯이, 펩티드의 상기 킬러 T 세포 유도 활성을 측정한 결과 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성이 있는 펩티드가 반드시 킬러 T 세포 유도 활성을 갖지는 않았다. 그러나 CDCA1-1(YMMPVNSEV (서열번호: 1)) 및 CDCA1-4 (KLATAQFKI (서열번호: 2))의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들은 특히 높은 킬러-T 세포 유도 활성을 보였다.

상기 기재하였듯이, 본 발명은 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 펩티드, 보다 구체적으로는 서열번호: 1 또는 2 및 변형물들(예를 들어, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열)을 포함하는 펩티드를 제공한다. 바람직하게는 서열번호: 1 또는 2의 9개 아미노산 및 그 변형물들을 포함하는 상기 펩티드는 다른 내인성 단백질의 아미노산과 일치하지 않는다. 특히, 높은 HLA-A2 결합 친화성을 갖는 펩티드는 N 말단에서 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환 및/또는 C-말단 아미노산을 발린 또는 루신으로 치환하여 얻을 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 킬러 T 세포 유도 활성을 잃지 않는 한, 당쇄화 (glycosylation), 측쇄 산화 및 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 예를 들어, 상기 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 사용되는 D-아미노산 및 다른 아미노산 유사체를 포함한다.

본 발명의 펩티드를 얻고 생성하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 화학적으로 합성된 펩티드 또는 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 펩티드를 사용될 수 있다.

화학적으로 합성된 본 발명의 펩티드는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법(fluorenylmethyloxycarbonyl method) 및 t-부틸옥시카르보닐 방법(t-butyloxycarbonyl method)등과 같은 화학 합성 방법에 따라 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 다양한 상업적으로 이용가능한 펩티드 합성기를 활용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 상기 펩티드 또는 이의 변형물 또는 상동물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA들을 얻고, 이 DNA들을 적합한 발현 시스템에 도입하여 재조합 단백질을 생성할 수 있다.

바람직하게는, 사용되는 발현 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나 또는 숙주 세포의 염색체에 들어갈 수 있고, 펩티드-암호화 유전자의 발현이 이루어지는 적절한 위치에 자리 잡은 프로모터를 포함한다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 가진 형질전환체는 상기 언급한 발현 벡터를 숙주에 도입함으로써 생성할 수 있다. 상기 숙주는 박테리아, 효모균, 동물 세포 및 곤충 세포의 어느 하나일 수 있으며, 숙주에 따라 알려진 방법을 이용하여 발현 벡터를 숙주에 도입할 수 있다.

본 발명에서, 상기 재조합 펩티드들은 상기 기재된 바와 같이 제조된 형질전환체를 배양하고, 상기 배양에서 상기 펩티드를 생산 및 축적하고, 상기 배양으로부터 상기 펩티드를 수집함으로써 분리될 수 있다.

상기 형질전환체가 E. coli와 같은 원핵생물 또는 효모와 같은 진핵생물일 때, 이러한 미생물을 위한 배양 배지는 미생물들이 이용할 수 있고, 형질전환체가 효과적으로 배양될 수 있는 탄소원, 질소원, 미네랄 등이 포함되어 있는 한, 천연 또는 합성 배지일 수 있다. 상기 배양 조건은 상기 미생물을 배양하는데 사용되는 통상적으로 이용되는 조건들일 수 있다. 배양 후, 본 발명의 펩티드들은 종래의 펩티드를 분리 및 정제하는 방법을 이용하여 상기 형질전환체의 배양액으로부터 분리되고 정제될 수 있다.

서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 뉴클레오티드 정보에 기반하여 당업자에 의해서 적절히 생성되고 또는 얻어질 수 있다. 특히, 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하고, 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 유전자는 화학 합성, 유전 공학 기법 및 돌연변이 생성과 같은 분야의 당업자에게 알려진 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 유전 공학 기술의 하나인 부위-지정 돌연변이 생성 방법은 특정 돌연변이를 특정 위치에 도입할 수 있기 때문에 유용하다. 부위-지정 돌연변이 생성 방법은 Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989(이하에서는 Molecular Cloning의 2번째 판을 의미함)및 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement1-38, JohnWiley&Sons(1987-1997), (이하에서는 Current Protocols in Molecular Biology를 의미함) 등에 기재된 방법에 따라서 수행될 수 있다.

상기 기재된 본 발명의 펩티드들은 하기 실시예에 나와있듯이, 암에 대한 면역 유도할 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 펩티드를 포함하는 암에 대한 면역 유도제를 제공한다.

본 발명의 면역 유도제는 둘 또는 그 이상의 에피토프 펩티드들이 혼합된 제형으로 제조될 수 있다. 다양한 종류의 펩티드가 혼합되어 제조된 면역 유도제는 칵네일이거나 또는 표준 기술을 이용하여 상호 결합될 수 있다. 상기 혼합된 에피토프 펩티드들은 동일한 유전자에서 파생된 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상이한 유전자에서 파생된 아미노산 서열의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 펩티드가 투여되었을 때, 상기 투여된 펩티드들은 항원 제시 세포의 HLA 항원에 높은 밀도로 제시되고, 그 뒤에, 상기 투여한 펩티드와 상기 HLA 항원 사이에 형성된 복합체와 특이적으로 반응하는 킬러 T 세포가 유도된다. 대안적으로, 개체로부터 채취된 수지상 세포(또는 본 발명의 펩티드로 자극된 개체에서 수집한 자극된 수지상 세포들)를 본 발명의 펩티드와 접촉시킴으로써, 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 항원 제시 세포를 획득할 수 있다. 이러한 항원 제시 세포를 거꾸로 개체에 투여하여, 킬러 T 세포가 상기 개체의 신체에서 유도될 수 있고, 그 결과, 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대한 면역 반응이 강화될 수 있다.

시험관 내 또는 생체 내로 사용될 때, 바람직하게는 시험관 내로 사용될 때, 본 발명의 암에 대한 면역 유도제는 헬퍼(helper) T 세포, 킬러 T 세포 또는 이러한 세포들을 포함하는 면역세포 군을 유도하여, 암에 대한 면역 유도할 수 있다.

(2) 본 발명(암 백신)의 암 치료 및/또는 예방제(암 백신)

실시예에서 보인 바와 같이, 본 발명의 펩티드들은 암 세포 특이적 킬러 T 세포를 생체 내에서 유도할 수 있다. 반면, 선행발명에서는 CDCA1이 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암 등의 대부분에서 과발현된다는 것이 보고된 바 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 면역 유도제가 암 치료 및/또는 예방제로 유용할 것으로 예상된다. 즉, 암을 공격하는 킬러 T-세포의 유도 및 활성은 본 발명의 펩티드가 적합한 보조제와 함께 신체에 투여되거나, 또는 수지상 세포와 같은 자극된 항원 제시 세포를 펩티드로 자극하고, 자극된 항원 제시 세포를 신체에 투여함으로써 예상된다. 따라서, 이에 따른 항암 효과가 기대된다. 더욱이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자는 적합한 벡터에 삽입될 수 있다. 인간 항원 제시 세포(수지상 세포 등) 및 재조합 DNA와 함께 형질 전환된 BCG 결핵군과 같은 박테리아, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 DNA를 자신의 게놈(genome)에 삽입하는 우두 바이러스와 같은 바이러스는 인간 암 치료 및/또는 예방을 위한 살아있는 백신으로 유용하게 사용될 수 있다. 암 백신의 투여량과 투여 방법은 종래의 천연두 및 BCG 백신과 동일하다.

본 발명에서, 용어 "백신"(소위 면역원성 조성물이라고 함)은 동물에게 주사하였을 때, 다양한 암을 억제하고 항암 면역력을 증진시키는 물질을 일컫는다. 본 발명에 따르면, 서열번호:1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 CDCA1 제시 세포에 대한 강하고, 특이적이고 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A2 제한적 에피토프이다. 따라서, 본 발명은 서열번호:1 또는 2 또는 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 또는 삽입된 서열번호:1 또는 2의 변형물을 포함하는 펩티드를 이용하여 항암 면역 유도하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 항암 면역력은 다음의 면역반응을 포함한다:

(1) CDCA1 발현 세포를 포함하는 암에 대한 킬러 T 세포의 유도,

(2) CDCA1 발현 세포를 포함하는 암을 인식하는 항체의 유도, 및

(3) 항암 사이토카인 생성의 유도.

특정 펩티드가 동물에게 주사하여 이러한 면역 반응들 중 어느 하나가 유도되면, 상기 펩티드는 항암 면역 유도 효과가 있다고 결론내릴 수 있다. 상기 펩티드로 인해서 항암 면역 유도는 상기 펩티드를 넣은 뒤, 숙주의 면역 반응을 시험관 내 또는 생체 내로 관찰하여 발견할 수 있다.

예를 들어, 상기 킬러 T 세포의 유도를 검출하는 방법은 잘 알려져 있다. 살아있는 개체에 침입한 외부 물질이 T 세포 및 B 세포에 항원 제시 세포(APCs)에 의해서 제시된다. 항원-특이적 방식으로 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원에 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극을 통해 킬러 T 세포(소위 세포 독성 T 림프구 또는 CTLs라고 함)로 분화하며, 그 뒤 증식한다. 여기에서, 이러한 과정을 T 세포의 "활성"이라고 부른다. 특정 펩티드에 의해서 킬러 T 세포가 유도되는 것은 펩티드-자극된 항원 제시 세포를 이용하여 T 세포에 상기 펩티드가 제시되고 킬러 T 세포가 유도됨을 감지하여 측정될 수 있다. 더욱이, 항원 제시 세포는 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 대식세포, 호산 백혈구 및 NK 세포를 활성화하는 효과가 있다. 또한 CD4⁺ T 세포는 항암 면역력에 있어서 중요하기 때문에, 펩티드의 항암 면역-유도 작용은 이러한 세포를 활성화하는 효과를 지표로 이용하여 평가할 수 있다.

수지상 세포(DCs)를 항원 제시 세포로 이용한 상기 킬러 T 세포 유도 효과를 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원 제시 세포 중, DCs는 가장 강력한 T 세포 유도 효과를 갖고 있다. 이 방법에 있어서, 우선, 시험용 펩티드를 DCs와 접촉시키고, 그 뒤에 DCs는 T 세포와 접촉시킨다. 표적 세포에 대한 세포 독성 효과를 갖는 T 세포를 DCs와 접촉한 T 세포 중에서 검출한다. 만약 T 세포가 상기 표적 세포에 대해서 세포 독성 효과를 보인다면, 이는 상기 시험용 펩티드가 세포 독성 T 세포를 유도하는 효과를 지님을 의미한다. 암과 같은 표적 세포에 대한 킬러 T 세포의 활성은 예를 들어 ⁵¹Cr-표지된 암 세포의 용해를 표지로 이용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, ³H-티미딘(thymidine) 흡수 활성 또는 LDH(락토오스 디하이드로제네이즈) 방출을 지표로 이용하여 암세포의 손상 정도를 측정될 수 있다.

이러한 방법으로 확인된 킬러 T 세포 유도 활성을 갖는 상기 시험용 펩티드는 DC 활성 효과 및 이로 인한 킬러 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드이다. 그러므로, 암 세포에 대한 킬러 T 세포를 유도 활성을 보이는 상기 펩티드는 CDCA1을 제시하는 암에 대한 백신으로 유용하다. 더욱이, 상기 펩티드와 접촉을 통해서 암에 대하여 킬러 T 세포를 유도 활성을 갖게 된 항원 제시 세포는 암에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 더욱이, 항원 제시 세포에 의해서 상기 펩티드가 제시된 결과로서 얻은 세포 독성을 갖는 킬러 T 세포는 또한 CDCA1을 제시하는 암에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 항원 제시 세포 및 킬러 T 세포에 의한 항암 면역력을 이용한 암 치료 방법들을 세포면역치료방법이라고 부른다.

일반적으로, 세포면역치료방법에 펩티드를 이용할 때, 킬러 T 세포를 유도 효율은 상이한 구조를 갖는 다양한 펩티드들을 혼합함으로써 높일 수 있다. 그러므로, 단백질 단편들로 DCs를 자극할 때, 다양한 종류의 펩티드 단편들을 혼합하여 사용하는 것이 유리하다.

펩티드에 의한 항암 면역 유도는 암에 대한 항체 생성 유도를 관찰하여 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 실험 동물에게 상기 펩티드로 면역화시킴으로써, 펩티드에 대한 항체가 유도되고, 이 항체가 암 세포의 성장, 분열, 및/또는 전이를 억제한다면, 상기 펩티드는 항암 면역 유도한다고 결론지을 수 있다.

항암 면역력은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도될 수 있으며, 상기 항암 면역 유도는 암 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다. 암 치료 및/또는 암 발달의 예방의 효과는 암 세포 성장의 저해, 암 세포의 퇴행 및 암 세포 발달의 억제를 포함한다. 암 유발자의 사망률 감소, 혈액 내 암 표지자의 감소 및 암과 관련된 감지할 수 있는 증상의 감소 역시 암 치료 및/또는 예방의 효과에 포함된다. 암에 대한 백신의 치료학적 또는 예방 효과는 바람직하게는 백신을 투여받지 않은 대조군의 효과에 비해서 통계적으로 유의하다. 예를 들어, 그 효과는 바람직하게는 5% 또는 그 이하의 유의적인 차이가 관찰된다. Student t-test, Mann-Whitney U test 및 ANOVA와 같은 통계학적 방법이 통계적인 유의성을 결정짓는데 사용될 수 있다.

본 발명에서, 개체는 바람직하게는 포유류이다. 포유류의 예는 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 펩티드는 개체에 생체 내 또는 생체외(ex vivo)로 투여할 수 있다. 더욱이, 암 치료 및/또는 예방용 면역원 조성물을 생성하기 위해서, 본 발명의 면역원성 즉, 서열번호:1 및 2 및 그 변형 펩티드의 아미노산 서열로부터 선택된 노나펩티드를 사용할 수 있다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함한 암 치료용 또는 암의 성장, 전이 등을 예방용 약제를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 구체적으로 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장과 같은 암 치료에 유용하다.

본 발명의 펩티드는 보편적인 제형 방법으로 제형화된 약제로 개체에 직접 투여할 수 있다. 이러한 제형은 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 필요할 경우, 약학적으로 허용가능한 담체, 참가제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제는 다양한 암 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

더욱이, 세포의 면역력을 효과적으로 확립하기 위해서, 보조제는 하나 혹은 다수의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 치료 및/또는 예방용 면역원 조성물에 혼합될 수 있다. 상기 약제는 항암제와 같은 다른 유효 성분과 공동 투여될 수 있다. 또한, 적합한 제형은 과립을 포함한다. 적합한 보조제는 문헌(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89)에 기재되어 있다. 보조제의 예로는 Freund's incomplete 보조제, BCG, 트레할로스 디미콜레이트(trehalose dimycolate, TDM), 지질다당체(LPS), 황산알루미늄칼륨 보조제, 실리카 보조제, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄 및 명반을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱이 리포솜 제형, 약제가 수 마이크로미터의 직경을 갖고 있는 비드에 결합된 과립 제형, 및 지질이 상기 언급한 펩티드에 결합된 제형이 편리하게 사용될 수 있다. 투여방법은 경구투여, 피내 주사, 피하 주사, 정맥 주사 등이 될 수 있으며, 표적 암 근처의 국소 투여 및 전신 투여를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드의 투여량은 치료할 병, 환자의 나이 및 몸무게, 투여방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 상기 투여량은 보통 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎이고, 바람직하게는 0.01 ㎎ ~ 100 ㎎이며, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎎ ~10 ㎎이다. 바람직하게, 투여는 수일에서 수개월에 한 번씩 시행되나 당업자가 적절한 투여량 및 투여방법을 손쉽게 결정할 수 있고, 이러한 기준의 선택과 최적화가 종래의 기술 범위 안에서 이루어진다. 상기 제형의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 동결 건조될 수 있으며, 또는 당과 같은 첨가제를 첨가하여 과립화 될 수 있다.

킬러 T 세포의 유도 활성을 증가시키는 본 발명의 약제에 첨가될 수 있는 보조제에는 BCG 박테리아의 구성요소 및 무라밀 디펩티드(MDP), Nature, vol. 344, p873 (1990)에 기재되어 있는 ISCOM, J. Immunol. vol. 148, p1438 (1992)에 기재되어 있는 사포닌 계열의 QS-21, 리포솜, 및 수산화 알루미늄과 같은 물질을 포함한다. 더욱이, 렌티난(lentinan), 시조피란(sizofiran) 및 피시바닐(picibanil)과 같은 면역 자극제를 보조제로서 사용할 수 있다. T 세포의 성장과 분화를 증진시키는 사이토카인인 IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, 및 암괴사인자(Tumor necrosis factor,TNF)뿐만 아니라, NK T 세포를 활성화하는 알파-갈락토실세라마이드(α-galactosylceramide) 및 톨유사수용체(Toll-like receptors)에 결합하여 천연적인 면역 체계를 활성화하는 CpG 및 지질다당체(lipopolysaccharides, LPS) 등 또한 보조제로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 킬러 T 세포에 대비하는 구성요소를 포함한다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에 대항하는 물질로 동정되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기는 라이신(lysine) 잔기의 ε-아미노군 및 α-아미노군에 결합하고, 본 발명의 면역원성에 연결될 수 있다. 지질이 첨가된 펩티드는 교질입자 또는 입자에 포함되어 투여되거나, 리포솜에 캡슐화되거나, 또는 보조제에 유화되어 직접 투여될 수 있다. 다른 지질 대비의 예는 적절한 펩티드에 공유 결합할 때, E. coli를 트리팔미토일-황-글리세릴-시스테이닐세릴-세린(tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinylseryl-serine, P3CSS)과 같은 지단백으로 대비하는 것이 있다(Deres K., et al ., (1989) Nature 342:561-4).

본 발명의 면역원성는 바이러스 벡터 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현할 수 있다. 적절한 발현 벡터의 예는 우두 및 계두와 같은 비악성 바이러스 숙주가 포함된다. 예를 들어, 우두 바이러스는 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 벡터로서 사용될 수 있다. 상기 재조합 우두 바이러스를 숙주 세포에 도입함으로써, 면역원성 펩티드가 발현되고, 면역 반응을 이끌어낸다. 우두 바이러스를 이용한 면역반응은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또한, 바실 칼메트-게랭(Bacille Calmette-Guerine, BCG)가 사용될 수 있다. BCG 벡터는 Stover CK, et al ., (1991) Nature 31:456-60에 기재되어 있다. 아데노 바이러스 벡터(adenovirus vectors), 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors), 장티푸스균(Salmonellar typhi) 벡터 및 무독화시킨 탄저병 독소 벡터를 포함하는 치료학적 투여 또는 면역화를 위한 다양한 벡터가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Shata MT, et al ., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; 및 Hipp JD, et al ., (2000) In Vivo 14:571-85.에 나와 있다.

환자에게서 채취한 세포 또는 몇몇의 HLA 대립 형질(동종 이계의 세포)를 공유한 다른 개인에게서 채취한 세포에서 시험관 내로 항원 펩티드를 첨가하고, 항원을 제시하고, 상기 세포를 상기 환자에게 정맥, 암 국소적으로 투여하여 상기 환자의 신체에서 킬러 T 세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 대안적으로, 환자의 말초 혈액 림프구에 펩티드를 첨가하여 시험관 내에서 킬러 T 세포를 유도하여, 이들을 시험관 내에서 배양한 후, 환자에게 정맥을 통해서, 암 국소적으로 그 세포를 투여할 수 있다. 이러한 세포 전이 치료는 암 치료로서 이미 사용되고 있으며, 당업자에게 잘 알려진 방법이다.

본 발명에서 암의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 구체적인 예는 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암 등을 포함한다. 본 발명이 적용될 수 있는 적합한 암의 종류에는 폐암이 포함된다.

(3) 본 발명의 항체들

또한, 본 발명은 상기 언급한 에피토프(항원)로서 본 발명의 펩티드 전체 또는 부분을 인식하는 항체와 관련되고, 상기 단백질 또는 펩티드를 이용하여 시험관 내에서 자극으로 유도된 킬러 T 세포와 관련된다. 일반적으로, 상기 킬러 T 세포는 상기 항체보다 강력한 항암 효과를 보인다.

더욱이, 본 발명의 펩티드와 유사하게, 본 발명의 항체들은 CDCA1 암 항원의 활성을 억제할 수 있는 한, CDCA1 항원을 발현하는 암에 대하여 예방제 및/또는 치료제로 유용하다. 실제 사용에 있어서, 본 발명의 상기 펩티드 또는 항체는 그 자체 또는 필요한 보조제와 함께 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이러한 투여는 분무 등을 이용하여 점막을 통한 경피 흡수 등을 통해 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 여기에서, 인간 혈청 알부민(albumin)은 담체의 한 종류이고; 인산 완충 용액(Phosphate buffered saline, PBS), 증류수 등이 희석제의 예이다.

본 발명의 항체는 다클론성 항체 또는 단일 클론성 항체일 수 있으며, 당업자에게 알려진 방법으로 생산될 수 있다.

예를 들어, 다클론성 항체는 본 발명의 펩티드를 항원으로 이용하여 포유류 또는 조류를 면역화된 후, 상기 포유류 또는 조류로부터 혈액을 채취한 다음, 상기 채취한 혈액으로부터 항체를 분리하고 정제하여 얻을 수 있다. 예를 들어 마우스, 햄스터, 기니아 피그, 닭, 랫트, 토끼, 개, 염소, 양 및 소와 같은 포유류 또는 조류가 면역화될 수 있다. 면역화 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 상기 항원은 예를 들어, 7일에서 30일의 간격에 두 번 또는 세 번 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 투여량은 투여당 0.05 ㎎ ~ 2 ㎎항원이 될 수 있다. 상기 투여의 경로는 특별히 제한적이지 않으며, 피하 투여, 피내 투여, 복강 투여, 정맥 투여 및 근육 투여에서 적절히 선택될 수 있다. 더욱이, 적절한 버퍼, 예를 들어, Freund's complete 보조제 및 수산화 알루미늄과 같은 종래의 보조제를 포함하는 버퍼에 항원을 용해한 뒤 사용될 수 있다.

상기 면역화된 포유류 또는 조류는 일정 시간 동안 사육되고, 상기 항체의 농도가 증가할 때, 예를 들면, 추가적으로 100 ㎍ ~ 1000 ㎍의 상기 항원으로 면역화될 수 있다. 마지막으로 펩티드를 투여한 후 1달에서 2달 후 상기 면역화된 포유류 또는 조류로부터 혈액을 모으고, 상기 혈액은 원심분리, 황산암모늄(ammonium sulfate) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 이용한 침전, 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)와 같은 크로마토그래피 등의 종래의 방법으로 분리 및 정제될 수 있다.

반면, 단일 클론성 항체는 하이브로도마(hybridomas)를 제조하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 골수종세포주의 항체 생성 세포를 융합하여 획득될 수 있다. 본 발명의 단일 항체를 생성하는 하이브리도마는 하기에 기재된 방법으로 세포융합을 하여 얻을 수 있다.

비장 세포, 림프절 세포, B 림프구 및 면역화된 동물로부터 얻은 세포들은 항체 생성 세포로 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 항원으로서 사용된다. 마우스 및 랫트와 같은 동물은 면역화된 동물로서 사용될 수 있으며, 이러한 동물들에게 항원의 투여는 종래의 방법으로 수행된다. 예를 들어, 동물은 Freund's complete 보조제 및 Freund's incomplete 보조제와 함께 본 발명의 펩티드를 항원으로서 본 발명의 펩티드의 상층액 또는 유화액을 Freund's complete 보조제 및 Freund's incomplete 보조제와 함께 여러 번 정맥, 피하, 피내, 복강 등의 방법으로 상기 동물에게 투여하여 면역력을 갖추게 할 수 있다. 비장과 같은 항체 생성 세포는 상기 면역화된 동물로부터 얻을 수 있으며, 알려진 방법(G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975))에 의해서 골육종세포와 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다.

마우스에서, 세포 융합을 위한 골육종세포주는 예를 들어 P3X63Ag8, P3U1 및 Sp2/0주 등이 있다. 폴리에틸렌 글리콜 및 센다이 바이러스(Sendai virus)와 같은 융합-촉진제가 세포 융합에 이용될 수 있으며, 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘(hypoxanthine/aminopterin/thymidine, HAT) 배지를 세포 융합 후 종래의 기술을 이용하여 하이브리도마를 선택하는데 이용할 수 있다. 세포 융합으로 얻은 하이브리도마는 한계 희석 방법 등으로 복제될 수 있다. 필요에 따라서는, 본 발명의 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일 클론성 항체를 생성하는 세포주는 본 발명의 펩티드를 효소 면역 분석 방법에 이용한 스크리닝에서 얻을 수 있다.

상기 언급한 방법들 이외에도, 면역화된 세포는 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 발현하는 세포 또는 그 용해물을 이용하여 시험관 내에서 EB 바이러스 감염된 림프구와 같은 인간 림프구를 자극하여 조절될 수 있다. 본 발명의 펩티드와 결합하는 인간 항체들은 U266(일본 특허 출원 Kokai Publication No. (JP-A) S63-17688 (심사되지 않은, 공개된 일본 특허 출원))과 같은 인간 유래된 골수 세포와 면역화된 림프구를 융합하여 얻을 수 있다.

하이브리도마에서 관심 있는 단일 클론성의 항체를 얻기 위해서, 상기 하이브리도마는 종래의 방법 또는 복수 형성 방법으로 배양될 수 있고, 상기 단일 클론성 항체는 배양 상층액 또는 복수에서 정제될 수 있다. 배양 상층액 또는 복수에서 단일 항체의 정제는 종래의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 황산 암모늄 분획, 겔 정제(gel filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 적합하게 혼합하여 사용될 수 있다.

인간 항체 유전자의 그룹을 갖는 형질전환 동물은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 발현하는 세포 또는 그 용해물을 이용하여 면역화될 수 있다. 항체 생성 세포는 상기 면역화된 형질전환 동물에서 얻을 수 있고, 하이브리도마를 얻기 위해서 상기 기재된 골육종세포주와 융합될 수 있다. 따라서, 관심 있는 단일 클론성 항체는 상기 하이브리도마(WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735; WO96/34096)로부터 생성될 수 있다.

더욱이, 면역화된 림프구와 같은 항체 생성 면역 세포는 암 유전자를 이용하여 불사화될 수 있으며, 단일 클론성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.

이와 같이 얻어진 단일 클론성 항체는 유전자 조작 기술(Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies)을 이용하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체는 하이브리도마 및 면역화된 림프구와 같은 항체 생성 세포로부터 유래한 항체를 암호화하는 DNA를 복제되고, 이를 적절한 벡터에 삽입한 다음, 숙주세포에 도입시킴으로써 만들 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드와 결합하는 한, 항체 단편 또는 변환된 항체일 수 있다. 항체 단편들은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H와 L 사슬에서 유래된 Fv 단편들이 적합한 링커(linker)(Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83)로 연결되어 있는 단일 사슬 Fv(scFV)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 항체 단편들은 항체를 파파인(papain) 및 펩신(pepsin)과 같은 효소로 처리하여 제조될 수 있다(Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).

본 발명의 항체들은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 다양한 분자에 항체가 결합하여 얻은 변형된 항체를 포함한다. 상기 항체는 당업계에 알려진 종래의 화학 변형방법으로 변형될 수 있다.

본 발명의 항체는 비-인간 항체에서 유래한 가변 부위 및 인간 항체에서 유래한 불변 부위를 포함하는 키메릭(chimeric) 항체, 비-인간 항체에서 유래한 상보성 결정 부위(CDR), 인간 항체에서 유래한 구조형성 지역(FR) 및 인간 항체에서 유래한 불변 지역을 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 이러한 항체들은 당업계에 알려진 종래의 방법으로 제조될 수 있다. 인간화 항체는 인간 항체의 CDR 서열 부위를 원하는 결합 활성이 있는 설치류의 CDR 부위로 치환함으로써 얻을 수 있다(Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). 이에 따라, 키메릭 항체와 비교하면, 인간화 항체들은 인간 항체의 작은 부위가 비-인간 종의 상응하는 부위로 치환된 항체이다.

인간 가변 부위뿐만 아니라 구조형성 및 불변 영역을 갖고 있는 완전한 인간 항체 역시 생성될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 방법으로 인간 항체 단편들을 나타내는 박테리오파지(bacteriophage)의 재조합 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 수행할 수 있다(Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). 유사하게, 인간 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자좌를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적 또는 완전히 비활성화된 형질전환 마우스에 도입됨으로써, 인간 항체가 생성될 수 있다(미국 특허 번호. 6,150,584, 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 및 5,661,016).

상기 기재된 방법으로 획득한 항체는 당업계의 종래 기술을 이용하여 동종성에 따라 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리 및 정제의 일반적인 방법들이 이용될 수 있다. 상기 항체는 친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동, 등전점초점(isoelectric focusing) 등에 의해서 분리되고 정제될 수 있다; 그러나, 분리 및 정제 방법은 이에 한정되지 않는다(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼용으로 사용될 수 있다. 단백질 A 컬럼 의 예는 HyperD, POROS 및 Sepharose F.F(Pharmacia)가 포함된다.

친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피의 예에는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 등이 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). HPLC 및 FPLC와 같은 지질 크로마토그래피를 크로마토그래피로 사용할 수 있다.

본 발명의 항체의 항원 결합 친화성은 예를 들어, 흡광도 측정, 효소결합면역흡착검정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소면역검사(enzyme immunoassay, EIA), 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 면역형광법(immunofluorescence assay)을 이용하여 측정될 수 있다; 그러나, 상기 방법은 이에 한정되지 않는다. 효소결합면역흡착검정법에서, 본 발명의 항체는 플레이트(plate)에 고정되고, 본 발명의 펩티드가 첨가된 후, 항체 생성 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체를 포함한 시료를 첨가한다. 그 후, 항원-결합 친화성을 측정하고자하는 항체를 인식하고, 검출할 수 있는 표지가 있는 2차 항체를 첨가한다. 상기 플레이트를 세척한 후, 상기 2차 항체를 검출할 수 있는 시약을 첨가하고, 흡광도 등을 측정한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소가 2차 항체를 표지하는데 사용될 수 있으며, 피-니트로페닐-포스파타아제(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 검출하는 시약으로 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)는 상기 항체의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 시료에 포함된 본 발명의 펩티드를 검출할 수 있다. 구체적으로, 암 조직에 있는 본 발명의 펩티드는 예를 들어, 암 세포 생체검사에서 본 발명의 펩티드와 접촉시킴으로써 확인될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 암 치료 및/또는 예방에 이용하기 전에, 치료하기 전에 본 발명의 항체를 이용하여 치료할 암에서 본 발명의 펩티드의 발현을 평가하여 치료 대상에게 효과가 있을지를 예상할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 항체는 다양한 암 세포에서 과발현되는 CDCA1 펩티드 단편들을 인식하기 때문에, 이의 활용이 진단뿐만 아니라 치료에도 적용 가능할 것으로 예상된다.

(4) 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포

또한, 본 발명은 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 자극하여 유도된 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포뿐만 아니라 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포를 포함하는 면역 세포군과 관련된다. 예를 들어, 암 반응 활성화된 T 세포는 말초혈액 단핵 림프구 또는 암 침투성 림프구가 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 자극될 때, 유도되며, 이렇게 활성화된 T 세포는 양자 면역 치료법으로써 효과적으로 이용될 수 있다. 대안적으로, 강력한 항원 제시 세포인 수지상 세포는 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 펩티드로 자극되거나, 시험관 내 또는 생체 내에서 상기 수지상 세포를 이용하여 T 세포 자극으로 항암 면역 반응을 유도할 수 있다.

바람직하게, 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 생체내 또는 시험관 내에서 본 발명의 펩티드 및 보조제로 자극되어 유도될 수 있다. 여기에 사용된 보조제는 세포성장인자 및 사이토카인을 포함한다.

이렇게 얻어진 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군을 암 등에 국소적, 혈관 등으로 주입함으로써, 종양이 억제되고, 암이 예방 및/또는 치료될 수 있다.

상기 기재된 암을 억제할 수 있는 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 본 발명의 펩티드를 이용하여 생성될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 암을 억제할 수 있는 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 이 세포 배양 배지를 이용하여 만들 수 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 기재된 세포 배양 배지 및 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군을 생성하기 위한 세포 배양 혈관을 포함하는 세포 배양 키트(kit)를 제공한다.

(5) 항원 제시 엑소솜(exosome)

본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원으로 형성된 복합체의 표면에 제시되는 "엑소솜"이라고 불리는 내포낭(endocytic vesicle)을 제공한다. 엑소솜은 예를 들어, 일본 특허 공개 Kohyo Publication No. (JP-A) H11-510507(국제 공개되지 않은, 심사되지 않은 일본 국내 단계 공개) 및 JP-A (Kohyo) 2000-512161의 일본 번역문에 자세하게 기재되어 있는 방법으로 제조할 수 있다. 바람직하게, 엑소솜은 치료 및/또는 예방을 받은 개체에서 얻은 항원 제시 세포를 이용하여 제조된다. 본 발명의 엑소솜은 암 백신으로서 본 발명의 펩티드와 유사한 방식으로 주입될 수 있다.

본 발명에 사용된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방이 필요한 개체의 HLA 항원의 종류와 반드시 일치해야 한다. 예를 들어, HLA 항원의 종류는 HLA-A2이고, 바람직하게는 HLA-A2(HLA-A*0201)이다. "HLA-A2"는 단백질을 의미하며, 현재 상기 단백질의 부분을 표현하는 용어가 부족하므로, "HLA-A*0201"는 상기 단백질의 부분에 해당하는 유전자를 의미한다.

(6) 항원 제시 세포 및 킬러 T 세포 유도하는 방법들

본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 항원 제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 항원 제시 세포는 말초혈액 단핵에서 유도된 수지상 세포를 상기 수지상 세포를 자극하는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드와 접촉시켜 유도될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드를 그 세포 표면에서 제시하는 항원 제시 세포가 상기 개체의 체내에 유도될 수 있다. 대안적으로, 항원 제시 세포를 본 발명의 펩티드와 접촉시킨 뒤, 상기 세포를 개체에 백신으로서 투여하는 생체 밖 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 생체 밖 투여는 하기의 단계들을 포함할 수 있다:

(1) 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계; 및

(2) 단계 (1)의 항원 제시 세포와 본 발명의 펩티드와 접촉하는 단계

(단계 (1)의 항원 제시 세포를 본 발명의 펩티드로 자극하는 단계).

상기 단계 (2)에서 얻은 항원 제시 세포는 개체에 백신으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 높은 수준의 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 시험관 내 방법으로 항원 제시 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계를 포함한다. 형질감염시키는 유전자는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 형질감염을 위해서, 당업계에서 종래에 사용된 다양한 방법, 예를 들어 리포펙션(lipofection), 전기 천공법(electroporation) 및 인산칼슘(calcium phosphate) 방법이 적절히 이용될 수 있으나, 상기 방법은 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로, 형질감염은 Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; 및 WO99/08521의 공개된 일본 번역문에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. 항원 제시 세포에 상기 유전자가 형질감염되었을 때, 유전자들은 세포 내에서 전사되고(transcribed), 번역된다(translated). 그 결과 생성된 단백질은 다음에 MHC class I 및 class II 전달회로를 통해서 처리되고, 항원 제시 전달회로를 통해서 부분적인 펩티드로 상기 항원 제시 세포의 표면에 제시된다.

또한, 본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 킬러 T 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 개체에 투여함으로써, 킬러 T 세포는 상기 개체의 체내에서 유도되고, 따라서, 암 조직에서 CDCA1을 제시하는 암세포를 표적으로 하는 면역 체계가 강화된다. 대안적으로, 활성화된 킬러 T 세포는 항원 제시 세포 및 상기 개체의 CD8 양성 세포를 시험관 내에서 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드와 접촉하여 유도될 수 있으며, 말초 혈액 단핵 백혈구와 상기 세포를 시험관 내에서 자극하는 항원 제시 세포를 접촉하여 유도할 수 있다. 생체 밖 치료학적 방법에서, 개체의 암 조직에서 CDCA1을 제시하는 암세포를 표적으로 하는 상기 면역 체계는 상기 개체의 체내로 활성화된 T 세포를 돌려보냄으로써 강화될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 단계들을 포함한다:

(1) 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계;

(2) 상기 단계 (1)의 항원 제시 세포와 본 발명의 펩티드(단계 (1)의 항원 제시 세포를 자극한 본 발명의 펩티드)를 접촉하는 단계;

(3) 상기 단계 (2)의 항원 제시 세포와 CD8⁺T 세포를 혼합하고, 공동 배양하여 세포 독성 T 세포를 유도하는 단계; 및

(4) 상기 단계 (3)의 CD8⁺T 세포를 수집하는 단계.

상기 단계 (4)에서 얻은 세포 독성을 갖는 CD8⁺T 세포는 개체에 백신으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 유도된 분리된 킬러 T 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 킬러 T 세포는 치료 및/또는 예방을 받은 개체로부터 유래 된다. 상기 세포는 항원 제시 세포를 함유하는 다른 약제와의 조합으로 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드를 제시하는 엑소솜과 함께 투여될 수 있다. 상기 획득된 상기 T 세포는 유도를 위해서 사용된 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포 특이적이다. 표적 세포는 FOXM1을 내인성으로 발현하거나, 또는 FOXM1 유전자를 형질감염시킨 세포이다. 본 발명의 펩티드로 자극함으로써, 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포, 예를 들어 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암 등의 암 세포는 공격의 표적이 될 수 있다.

(7) T 세포 수용체들(TCR)

본 발명은 나아가 CDCA1-1 및 CDCA-4를 인식하는 T 세포의 수용체들(TCRs)의 구성요소를 형성하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. TCR은 최소한 7개의 막 관통 단백질들을 포함한다. 이황화 결합과 연결된 (α,β) 헤테로다이머(heterodimer)는 클로노타입(clonotype)의 항원 인식 단위를 형성하는 반면, ε,γ,δ,ζ 및 η 사슬로 구성된 불변 CD3 사슬은 리간드(ligand) 결합과 신호 전달회로를 연결하여, T 세포 활성 및 세포의 면역 반응을 유도한다. 상기 언급한 바와 같이 항원을 인식할 수 있는 상기 α와 β 구성요소는 T 세포가 특정 표적에 대한 특이적인 인식을 하는데 필요하다. 그러므로, 본 발명의 펩티드를 특이적으로 인식하는 TCRs를 합성하기 위하여, 본 발명의 펩티드를 이용한 유도된 CTLs로부터 유래된 TCR 구성요소인 α 및 β의 핵산 서열은 당업자에게 알려진 방법으로 동정될 수 있다(WO2007/032255; and Morgan et al ., J. Immunol., (2003) 171, 3288). 상기 동정된 TCR 구성 요소로부터 형성된 TCRs는 CDCA1 펩티드 제시 표적 세포와 결합하기 때문에, TCRs는 세포 사멸 효과가 있는 세포에 도입되었을 때 유용할 수 있다.

상기 TCR 구성 요소를 암호화하는 핵산은 적합한 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors))에 도입될 수 있다. 벡터는 당업자에게 알려진 방법으로 생성될 수 있다. 상기 TCR 구성요소가 도입된 벡터는 T 세포의 도입에 사용될 수 있다. 구체적으로, 환자 유래된 T 세포에 형질전환함으로써, CDCA1 발현 세포를 특이적으로 인식하고 공격하는 T 세포(CTLs)를 획득할 수 있다. 이렇게 얻어진 TCR 도입된 CTLs는 일반적인 방법(Kawakami et al ., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989))에 의해서 배양하여 성장될 수 있다. 상기 언급한 상법에 의해서 획득한 CTLs는 세포 면역 치료용으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 HLA 항원 및 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드가 형성하는 복합체를 제시하는 형성 항원 제시 세포를 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드 또는 그러한 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드와 접촉하는 상기 항원 제시 세포는 바람직하게는 치료 및/또는 예방을 받은 개체로부터 얻는다. 상기 펩티드, 엑소솜 또는 활성화된 킬러 T 세포를 제시하는 본 발명의 펩티드 또는 항원 제시 세포는 다른 약물과 혼합하여 백신으로서 투여될 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 선행 문헌은 본 명세서에 참조로 통합된다.

본 발명은 하기의 실시예를 참조로 하여 상세히 설명될 것이다; 그러나 이에 한정되는 것으로 이해되지 않는다.

실시예

[실시예 1]

(1) HLA-A2에 친화성을 보이는 CDCA1 펩티드 레퍼토리(repertoire)의 선택

인간 CDCA1의 아미노산 서열을 BIMAS 시스템을 이용하여 검색하였고, 41 종류의 펩티드를 HLA-A2에 대한 추정 결합 친화성에 대한 내림 차순으로 선택하였다(표 1).

본 발명에서 확인한 HLA-A2 제한적 킬러 T 세포 에피토프는 밑줄로 표시하였다.

[실시예 2]

우선, 수지상 세포(dendritic cells, DCs)를 이전에 발표된 방법(Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006)을 이용하여 HLA-A2 형질전환 마우스의 골수 세포로부터 유도하였다. 이렇게 얻어진 수장세포(BM-DC)는 CDCA1 펩티드(10 mM)로 자극하여 얻었고, 마우스 당 5 x 10⁵의 세포를 HLA-A2 형질전환 마우스에게 복강 내 투여하였다.상기 마우스는상기와동일한 투여방법으로 일주일에 두 번 간격으로 면역화된 다음, 마우스의 비장 세포를 모아서 킬러 T 세포를 검출하는데 사용하였다. CD8⁺ T 세포로부터 유래된 킬러 T 세포의 유도를 확실하게 검사하기 위해서, 상기 비장을 적출한 후, MACS 비드를 이용하여 CD4⁺T 세포를 상기 비장으로부터 제거하고, 남은 세포를 사용하였다.

도 1A는 HLA-A2 형질전환 마우스에서 킬러 HLA-A2 제한적 T 세포에 의해서 인식되는 CDCA1 펩티드를 결정하는 프로토콜을 나타낸다. 면역화된 마우스에서 비장 세포를 얻은 날은 "0 일"로 지정한다.

21일: (1) 골수-유래 수지상 세포(이하, 수장세포(BM-DC)로 언급함)의 유도는 GM-CSF를 상기 HLA-A2 형질전환 마우스의 골수 세포에 첨가하여 시작하였다.

14일: (2) 4가지 종류의 CDCA1 펩티드 혼합물을 상기 유도된 수장세포(BM-DC)에 첨가하고, 2시간 후, 이를 마우스당 5 x 10⁵의세포로 복강에 투여하였다.

(1) 및 (2)는 일주일에 두 번 간격으로 반복하였다.

0 일: 상기 면역화된 HLA-A2 형질전환 마우스부터 비장 세포를 채취한 후, CDCA1 펩티드와 2시간 동안 반응시킨 수장세포(BM-DC)와 공동 배양하였다. 그 후 6일 동안 배양하였다.

6 일: 특이적으로 CDCA1 펩티드를 인식하는 킬러 T 세포를 검출하기 위하여, 항원 자극한 한 뒤 감마 인터페론(gamma interferon)을 생성하는 T 세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 정량화하였다. 표적 세포로서, 각각의 단일 CDCA1 펩티드로 자극한 BM-CDs 및 자극하지 않은 BM-CDs를 사용하였다.

ELISPOT 분석을 이용한 CDCA1 특이적 킬러 T 세포의 활성 측정:

CDCA1에 특이적으로 반응하여 IFN-γ를 생성하는 킬러 T 세포가 상기 유도된 킬러 T 세포 중에서 실제로 있는지의 여부를 ELISPOT 분석을 이용하여 판단하였다. IFN-γ는 마우스 IFN-γ ELISPOT 세트(BD Biosciences)를 이용하여 측정하였다. 킬러 T 세포(실행기)가 자극하는 세포(표적)에 반응하여 IFN-γ를 생성할 때, 킬러 T 세포는 적색 스팟(spot)으로 표시된다. 표적 세포로서, CDCA1을 발현하지 않는 HLA-A2 양성 T2A2 세포 및 CDCA1 펩티드 자극된 T2A2 세포를 사용하였다. HLA-A2 유전자를 마우스 TAP 유전자 발현이 결손된 T2 세포주에 도입하여 생성된 T2A2 세포는 RIKEN Cell Bank에서 구입하였다. 이러한 세포에서 TAP 유전자 결손으로 인해서, HLA-A2 분자 및 외인성으로 첨가한 펩티드 간에 형성된 복합체는 상기 펩티드가 HLA-A2 분자에 대한 결합능력이 있을 때에만 상기 세포 표면에서 발현한다. 우선, ELISPOT 플레이트(BD Biosciences)를 안티-마우스 IFN-γ 항체로 18시간 동안 코팅하였다. 그 뒤, 상기 플레이트는 10% FCS/RPMI으로 2시간 동안 블로킹하였다. 실행기 세포(100 ㎖/웰) 및 표적 세포(100 ㎖/웰)를 혼합하고, 37℃에서 22시간 동안 배양하였다. 상기 실험은 실행기/표적 세포 비율(E/T 비율)을 5:1로 하여 수행하였다. 상기 플레이트는 그 뒤 증류수로 세척하고, 비오티닐화된(biotinylated) 안티-마우스 IFN-γ 항체로 2시간 동안 반응시키고, 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP)으로 1시간 더 반응시켰다. IFN-γ 양성 스팟은 기질 용액을 이용하여 측정하였다. MINERVA TECH의 자동 분석 소프트웨어를 스팟을 계수하는데 사용하였다. 펩티드 번호 1번에서 20번까지의 결과는 도 1B에 나타낸다. 유사한 실험으로부터, CDCA1 특이적 킬러 T 세포 면역 반응은 41개의 펩티드 중 CDCA1_65-73 (No. 1), (서열번호: 1) 또는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 유도된 킬러 T 세포에서 관찰하였다(도 2).

CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 또는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 유도된 킬러 T 세포의 분석 결과는 각각 도 2A 및 도 2B에 나타난다.

[실시예 3]

환자, 혈액 시료 및 세포주:

NSCLC 환자로부터 유래된 혈액 시료는 통상적인 진단 검사를 통해서 얻었다. CDCA1 음성 인간 대장암 세포주 COLO201은 건강 과학 연구 자원 은행(Health Science Research Resources Bank)에서 제공되었다. 이러한 시료에서 HLA-A2 발현은 HLA-A2 단일 클론성의 항체 BB7.2(One Lambda Inc., Canoga Park, CA)를 이용한 유세포 분석(flow cytometry)으로 확인하였다.

레트로바이러스 유전자 전이:

레트로바이러스 벡터-매개된 유전자 전이는 Tahara-Hanaoka S, (2002) et al. Exp. Hematol., 30:11-17에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. 간략하게, 17 ㎎ 의 CDCA1 cDNA를 갖고 있는 CSII-CMV-RfA 및 CSIIEF-RfA 자가 비활성 벡터(Miyoshi H, et al., (1998) J. Virol., 72:8150-8157) 및 10 ㎍ pCMV-VSV-G-RSV-Rev 및 pHIVgp를 10 ㎝ 배양 디쉬의 293T 세포에 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질감염시켰다. 60시간 후, 상기 배양 배지를 모으고, 바이러스 입자를 초원심분리(ultracentrifugation) (50,000 ×g , 2 시간)를 이용하여 펠릿(pellet)으로 만들었다. 상기 펠릿은 50 ㎕의 RPMI 1640 용액에서 현탁되었고, 10 ㎕의 바이러스 현탁액은 한 웰당 5 x 10⁴의COLO201 세포가 있는 U 바닥형 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 형질감염시킨 CDCA1 유전자의 발현은 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 확인하였다.

CDCA1 반응성 인간 CTLs의 유도:

단핵 백혈구-유래된 DC 세포는 HLA 제시하는 펩티드에 반응하는 CTLs를 유도하기 위하여 항원 제시 세포로서 사용하였다. DCs는 이전에 시험관 내 방법으로 발표된 방법(Suda T, et al ., (2007) Cancer Sci.; Nakahara S, (2003) et al . Cancer Res., 63:4112-8)에 의해서 얻었다. 간략하게, HLA-A*0201 양성인 건강한 지원자 및 NSCLC 환자로부터 Ficoll-Paque 용액(GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK)을 이용하여 분리한 말초 혈액 단핵 백혈구(PBMCs)는 CD8 양성 CD14 양성 군을 MicroBeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 스크리닝하는데 사용하였다. DCs를 얻기 위하여, 상기 CD14 양성 군은 2% 자가 혈장(plasma)을 포함하는 AIM-V(Invitrogen) 배지에 100 ng/㎖의 인간 과립구 대식세포 집락 촉진인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 및 10 ng/㎖의 인터루킨-4(interleukin(IL)-4)(PeproTec Inc., New Jersey, USA)의 존재하에 배양하였다. 4일의 반응 후, DCs를 발달시키기 위해서 상기 디쉬에 OK-432를 첨가하였다. 사이토카인-유도된 DCs 배양 시작 5일 후, 상기 세포는 20 ㎍/㎖의 HLA-A2 결합 펩티드로 4 ㎍/㎖의 β2-마이크로글로불린(microglobulin)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 존재하는 AMI-V에서 2시간 동안 37℃에서 자극되었다. 이러한 펩티드-자극된 DCs는 방사능 처리되었고(3,500 cGy), 안티-CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를이용하여 PBMCs로부터 얻은 자가 CD8 양성 T 세포와 1:50의 비율로 혼합하였다. 상기 반응은 각 웰당 2% 자가 혈장, 1 x 10⁴펩티드 자극된 DCs, 10⁵ CD8 양성 T 세포 및 10 ng/㎖의 인간 IL-7(Wako, Osaka, Japan)이 포함된 AIM-V 0.5 ㎖이 담겨있는 48-웰 플레이트를 이용하여 수행하였다. 3일 동안 반응을 시킨 후, 인간 IL-2(PeproTec Inc.)를 20 IU/㎖로 첨가하였다. 더욱이, 상기 T 세포는 펩티드-자극된 자가 DCs로 12일과 19일에 재자극하였다. DCs는 상기 언급한 방법에 의해서 적절하게 제조되었다. 25일째에 세 번째 펩티드 자극을 한 6일 후, 항원-특이적 CTL 반응을 크로뮴 (Cr) 방출 분석 및 IFN-γ ELISPOT 분석를 이용하여 측정하였다.

표적 세포에 대한 CTL 반응:

CTLs는 다양한 실행기 세포/표적 세포 비율로 표적 세포인 다양한 암 세포주 및 펩티드로 자극 또는 무자극된 T2 세포를 표적세포로 하여 공동 배양되었고, ⁵¹Cr 방출 분석 및 IFN-γ ELISPOT 분석을 종래의 방법(Komori H, et al ., (2006) Clin. Cancer Res., 12:2689-2697; Makita M, et al ., (2002) Clin. Cancer Res., 8:2626-31; Yokomine K, et al ., (2007) Cancer Sci., 98:1930-5)을 이용하여 수행하였다. 간략하게, 표적 세포는 CO₂ 배양기에서 1시간 동안 37℃에서 3.7 KBq Na₂ ⁵¹Cr₄ (Perkin Elmer Life Sciences)을 이용하여 표지하였다. 상기 표지된 표적 세포는 세 번 세척하고, 37℃에서 세 시간 동안 20 ㎍/㎖의 펩티드와 반응시켜서 펩티드-자극된 세포를 제조하였다. 상기 표적 세포는 실행기 세포와 최종 부피가 200 ㎕이 되도록 평평한 바닥 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 혼합한 다음, 반응시켰다. 반응 6시간 후, 50 ㎕의 상기 상층액을 각각의 웰에서 모으고, 방사능을 감마 카운터를 이용하여 수량화하였다. 특이적 세포 독성 활성은 기존의 방법(Suda T, et al ., (2007) Cancer Sci., 98:1803-8)에 따라 ⁵¹Cr 특이적 방출 속도를 계산하여 측정하였다. 또한, ELISPOT 분석은 기존의 방법(Komori H, et al ., (2006) Clin. Cancer Res., 12:2689-97)에 따라 수행하였다.

HLA-A2 양성 건강한 기증자로부터 유래된 PBMCs의 CDCA2 반응성 CTLs 유도:

PBMCs는 HLA-A2(A*0201) 양성 건강한 기증자로부터 분리하였다. CD8⁺ T 세포는 CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 또는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 자극된 단핵 백혈구-유래된 DCs와 공동 배양하였고, CD8⁺ T 세포는 일주일에 3회 자극하였다(도 3A).

암 환자 또는 건강한 기증자로부터 유도된 CTLs는 표적 세포와 공동 배양하였다. CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 또는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2)펩티드로 자극된 T2 세포는 표적 세포로서 사용하였고, ELISPOT 분석 및 ⁵¹Cr 방출 분석을 수행하였다. 도 3B에 나타나있듯이, 암 환자 기증자 1에 관하여, 자극되지 않은 T2 세포보다 CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 펩티드-자극된 T2세포로 상기 세포가 자극되었을 때, CTLs에 의한 IFN-γ 생성이 훨씬 컸다. 건강한 기증자 1에서 유도된 CTLs는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드-자극된 T2 세포에 반응하여 상당한 양의 IFN-γ를 생성하였다(웰당 300 스팟 이상) (도 3C). 더욱이, 암 환자 기증자 1 및 건강한 기증자 1에서 유래한 CTLs는 ⁵¹Cr 방출 분석에서 CDCA1_65-73 (No. 1), (서열번호: 1) 또는 CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 자극된 T2 세포에 대해서 세포 독성 활성을 나타냈다(도 3D). 도 3E에 나타나있듯이, 다양한 농도의 상기 CDCA1 펩티드로 자극된 T2 세포에 의해서 CTLs가 자극될 때, 상기 CTLs는 양-의존적 방식으로 상기 CDCA1 펩티드-자극된 T2 세포에 반응하였다. 자극되지 않은 T2 세포 또는 HLA-A2 바인딩(binding) HIV-파생된 펩티드에 의해 자극된 T2 세포의 반응을 비교하였을 때, CTLs는 0.2 ㎍/㎖ 또는 그 이상의 펩티드 농도로 자극된 T2 세포에 반응하여 IFN-γ를 상당량 생성한다. 상기 언급한 결과는 이러한 CTLs가 펩티드-특이적 세포 독성이 있음을 보여준다.

CDCA1이 도입된 COLO201(COLO201 / CDCA1, CDCA1+, HLA-A2+; 도 4A)는 CTLs의 상기 CDCA1 특이적 면역 반응을 측정하기 위하여 표적 세포로 이용하였다. 도 4B에 나와있듯이, CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 펩티드로 자극된 건강한 기증자 유래한 CTLs는 CDCA1을 발현하지 않는 공 벡터-형질감염된 COLO201보다 상당한 양의 IFN-γ를 COLO201/CDCA1에 대하여 생성하였다. CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 자극된 건강한 기증자 2-유래한 CTLs 역시 COLO201/CDCA1에 대하여 특이적인 면역반응을 보였다(도 4C). 더욱이, 이러한 CTLs는 PANC1 세포(CDCA1+, HLA-A2+)에 대해서 면역 반응을 보였고, A549 세포(CDCA1+, HLA-2-)에 대해서는 보이지 않았다(도 4D).

CDCA1 파생된 펩티드를 암 면역치료에 적용하기 위해서, 상기 CDCA1 펩티드 반응성 CTLs가 내인성으로 CDCA1을 발현하는 종앙 세포에 대해서 특이적인 세포 독성을 보일수 있는지가 가장 중요하다. 도 4E에 나와있듯이, 암 환자 기증자 1에 대해서 CDCA1₆₅ _-73 (No. 1), (서열번호: 1) 펩티드를 이용하여 얻은 CDCA1 반응성 CTLs는 PANC1 세포(CDCA1+, HLA-A2+)에 대해서 세포 독성 활성을 나타내었으나, A549 세포(CDCA1+, HLA-2-) 또는 COLO201 세포(CDCA1-, HLA-A2+)에 대해서는 나타내지 않았다. 유사하게, CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4), (서열번호: 2) 펩티드로 자극된 건강한 기증자 1-유래된 CTLs는 PANC1 세포(CDCA1+, HLA-A2+)에 대해서 세포 독성 활성을 나타냈으나, A549 세포(CDCA1+, HLA-2-)에 대해서는 나타내지 않았다. 이러한 결과는 이러한 펩티드들이 암세포에서 천연적으로 처리되고, HLA-A2와 함께 암 세포의 표면에 제시되고, CTLs에 의해서 인식될 수 있다는 것을 보여준다.

HLA-A2 제한적 CDCA1 특이적 CTLs를 검출하기 위해서, 상기 CDCA1₃₅₁ _-359 펩티드 결합된 PE 표지된 HLA-A*0201 테트라머(tetramer)는 Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. (Nagoya, Japan)에서 구입하였다. 도 4G에 나타냈듯이, CD8 양성 세포 중에서 CDCA1₃₅₁ _-359 펩티드 반응성 CTLs와 상기 테트라머에 대한 양성 CTLs 사이에 밀접한 상관관계가 관찰되었다. 이 결과는 HLA-A2 제한적 CDCA1 펩티드-특이적 CTLs가 본 연구에서 사용된 CD8 양성 T 세포 중에서 제시되고 있다는 것을 증명한다.

고찰:

천연적으로 암 세포에서 처리되고 제시되는 TAA-파생된 펩티드의 동정은 펩티드 기반된 암 면역치료법의 설립에 있어서 중요하다. 새로운 암/정소 항원인 CDCA1은 NSCLC 및 정상 정소를 이용한 cDNA 마이크로에레이 분석으로 동정 되었다. CDCA1은 NSCLC 및 정상 정소에서 과발현되나, 이 mRNA 또는 단백질은 검사한 다른 정상 조직에서는 발현하지 않았다. 상기 정소는 면역 체계로부터 분리한 조직이기 때문에, CDCA1 반응성 CTLs는 오직 NSCLC만을 공격한다.

면역 유도 치료의 결과로서 암 세포에 의한 면역 회피를 위한 수단으로서 TAA의 삭제, 변이 또는 발현 감소의 위험성을 최소화하기 위하여, 면역 치료의 표적으로 사용될 수 있는 NSCLC의 분열 또는 생존에 필수적인 TAA를 동정하는 것이 바람직하다(Yoshitake Y, et al ., (2004) Clin. Cancer Res., 10:6437-48). CDCA1의 방추 미세소관과 동원체 사이에 부착되는 기능을 하며, 세포 주기의 유지에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(DeLuca JG, et al ., (2002) J. Cell Biol., 159:549-55). 더욱이, CDCA1은 유사분열 동안 적절한 염색체 분리에 있어서 중요한 역할을 수행하고, 종에 관계없이 높게 보존되어 있는 핵 분열 주기(NDC) 복합체의 구성요소이다(DeLuca JG, et al ., (2003) Curr. Biol., 13:2103-9). CDCA1은 헬라(HeLa) 세포에서 중심립(CENP-E)의 동원체의 위치에 필수적이다. siRNA에 의한 CDCA1 발현의 억제는 유사분열의 방해 및 이어지는 세포사멸로 인한 비정상적인 염색체 분리를 유발할 수 있다(Liu D, et al ., (2007) J. Biol. Chem., 282:21415-24). 이러한 비정상적인 유사분열의 이탈은 세포사멸 및 카타스트로프(catastrophe)의 두 가지 성격을 갖는다(DeLuca JG, et al ., (2002) J. Cell Biol., 159:549-55). 즉, CDCA1이 세포 기능에 필수적이고, 암 세포의 분열 및 생존에 중요한 역할을 한다.

CDCA1 및 동원체 관련된 2(KNTC2)는 진화적으로 보존된 중심립 단백질 복합체의 구성요소이다(Hayama S, et al ., (2006) Cancer Res, 66:10339-48). 면역 염색은 이들의 증가한 발현이 NSCLC 환자의 좋지 않은 예후와 관련 있음을 나타낸다(Hayama S, et al ., (2006) Cancer Res, 66:10339-48). 따라서, NSCLC 조직 내에서 상기 CDCA1의 발현 수준은 외과 수술 후 NSCLC의 예후를 예측하는데 유용한 마커이다. CDCA1의 NSCLC의 진행에 수반하는 것이 제안되었다. 따라서, CDCA1을 표적으로 하는 면역 치료법은 좋지 않은 예후의 NSCLC 환자에게 유용할 수 있다.

본 발명에서, HLA-A2 제한적 마우스 CTLs의 생성을 촉진하는 2개의 HLA-A2 제한적 CDCA1 에피토프 펩티드를 HLA-A2 형질전환 마우스를 이용하여 동정되었다. 추가적으로, CDCA1 반응성 인간 CTLs는 이러한 펩티드로 자극된 건강한 기증자 유래된 PBMCs로부터 제조될 수 있다. 이러한 CDCA1 펩티드-특이적 CTL 선들은 HLA-A2 제한적 방식으로 CDCA1을 발현하는 암 세포를 사멸시킨다(도 4).

HLA-A0201 분자에 대한 높은 결합 친화성을 가질 것으로 예상되는 CDCA1 파생된 펩티드는 BIMAS 소프트웨어를 이용하여 선택되었다; 그러나, 몇몇의 아미노산 서열은 인간과 마우스 CDCA1 사이에 보존되어 있지 않았다. 인간과 마우스의 CDCA1_65-73 (No. 1) 펩티드에 2개의 아미노산 서열의 차이가 있으며(인간: YMMPVNSEV / 마우스: YMMPMNIEV), CDCA1₃₅₁ _-359 (No. 4) 펩티드에는 1개의 아미노산 차이가 있다(인간: KLATAQFKI / 마우스: KLATARFKI). 그러나, 본 발명에서 상기 언급한 건강한 기증자의 에피토프 펩티드 반응성 CTLs의 유도가 확인되었다.

상기 CDCA1 펩티드를 이용한 시험관 내 자극된 건강한 기증자 유래된 PBMCs로부터 CDCA1 반응성 CTLs를 유도하였다. 펩티드-제시된 DCs로부터 유도된 CTLs는 HLA-A2 제한적 방식으로 CDCA-발현 암세포에 대해서 세포 독성 활성을 나타냈다. 건강한 기증자 유래된 CDCA1 특이적 CTLs의 유도는 TAAs에 대한 더 나아간 연구의 지속을 위해서 의미가 있다. 더욱이, NSCLC, 소 세포 암, 담관세포암, 방광암 및 신세포암 화자에게서 분리한 PBMCs의 CDCA1 반응성 CTLs의 유도는 현재 시도되고 있다. 펩티드 또는 단백질 백신접종(Rosenberg SA, et al ., (1998) Nat Med, 4:321-7), 펩티드로 자극된 수지상 세포, 단백질 또는 암 용해물의 면역접종(Kugler A, et al ., (2000) Nat Med, 6:332-6) 및 암-특이적 CTL 라인을 이용한 생체 밖 양자전이(Falkenburg JH, et al ., (1999) Blood, 94:1201-8)를 포함한 세포 연관된 다수의 암 면역치료 방법이 있다. 본 발명에서 밝혀진 상기 CDCA1 펩티드는 이러한 면역 치료법에 적용될 수 있다.

만약 본 발명에서 밝혀진 HLA-A2를 통한 킬러 T 세포에 제시되는 펩티드를 이용한 암 면역치료법의 안정성과 효용성을 조사 의료에서 보일 수 있다면, 백인에 대한 임상응용이 가능할 것이다. 더욱이, 일본인이 아니라 백인이 종종 소유하는 HLA-A2를 통한 킬러 T 세포에 제시되는 펩티드를 밝힘으로써, 30%의 일본 및 백인 폐암 환자에게 활용가능한 암 면역치료제 개발될 수 있는 가능성이 크다.

산업상 이용가능성

HLA-A2는 일본인구의 약 30%에 가 갖는 HLA 클래스 Ⅰ 대립 형질이다. 본 발명에 따른 CDCA1 펩티드는 상기 펩티드 및 HLA-A2 분자의 복합체를 발현하는 암 세포에 해를 끼치는 인간 세포 독성 T 세포를 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 펩티드는 HLA-A2 양성 환자인 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신 세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암의 면역 치료법에 적용될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드는 상기 암의 분열 및 발전을 억제하는 치료제 개발에 유용하다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE INC. <120> CDCA1 PEPTIDE AND PHARMACEUTICAL AGENT COMPRISING THE SAME <130> 10fpi-02-04 <150> JP 2007-214000 <151> 2007-08-20 <160> 41 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Lys Leu Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Arg Leu Asn Glu Leu Lys Leu Leu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT 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Claims

하기의 (A) 또는 (B)의 15개 아미노산 미만의 펩티드:
(A) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;
(B) 서열번호: 2의 아미노산 서열에서 하기의 (a) 또는 (b)의 치환을 가진 아미노산 서열, 또는 하기의 (a) 및 (b)의 치환을 모두 가진 아미노산 서열을 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드;
(a) N 말단에서 2번째 아미노산이 메티오닌(methionine)으로 치환; 및
(b) C-말단 아미노산이 발린(valine) 또는 루신(leucine)으로 치환.
삭제
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하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암에 대한 면역 유도제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 시험관 내에서의 항원 제시 세포 유도제.
제 1항의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 시험관 내에서의 항원 제시 세포 유도제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 시험관 내에서의 세포 독성(킬러) T 세포 유도제.
제 1항의 펩티드에 대한 항체.
제 1항의 펩티드를 이용하여 유도되는 세포 독성(킬러) T 세포.
제 1항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 항원 제시 세포.
제 6항의 항원 제시 세포 유도제에 의해 유도되는 항원 제시 세포.
제 7항의 항원 제시 세포 유도제에 의해 유도되는 항원 제시 세포.
제 1항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜(exosome).
제 14항에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A*0201인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
항원 제시 세포를 제 1항의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는,
시험관내(in vitro)에서 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법.
제 1항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는,
시험관내(in vitro)에서 세포 독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도 방법.
T 세포를 제 1항의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는,
시험관내(in vitro)에서 세포 독성(킬러) T 세포 유도 방법.
제 1항의 펩티드를 포함하는 암에 대한 면역 유도용 백신.
제 1항의 펩티드를 포함하는 암 치료 및/또는 예방용 백신.
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제 1항의 펩티드와 접촉시킨 항원-제시세포, 및 CD8⁺T 세포를 공동-배양(co-culturing)시키는 단계를 포함하는,
시험관내(in vitro)에서 세포 독성(킬러) T 세포의 유도 방법.