KR101606608B1 - 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 모노클로날 항체를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 배양된 형질 세포에 의해 생산되는 항체에 대해, 배양된 형질 세포의 기능, 결합 특이성, 에피토프 특이성 및/또는 독소 또는 병원체를 중화하는 그의 능력을 알아내는 검정을 행함으로써 항체를 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 항체 및 항체 절편 뿐만 아니라 상기 항체 및 항체 절편을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2008 년 10 월 22 일에 출원된 GB 출원 제 0819376.5 호, 2009 년 5 월 27 일에 출원된 U.S. 임시출원 일련 번호 61/181,582, 2009 년 7 월 27 일에 출원된 두 출원, PCT 출원 번호 PCT/US2009/051851 및 U.S. 출원 일련 번호 12/509,731 에 대해 우선권을 청구한다.
형질 세포 (plasma cell) 는 말기 분화된 비-증식성 세포이며, 매우 고속으로 항체를 분비한다 (매일 세포마다 약 30 내지 50 pg 에 해당하는, 초 당 수천 몰).
형질 세포로부터의 항체, 예를 들어 모노클로날 항체의 단리는 면역글로불린 유전자의 클로닝 및 발현에 좌우된다. 이는 형질 세포로부터 단리된 뒤섞여진 VH 및 VL 유전자의 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여, 또는 단세포 PCR 을 이용하는 단일 형질 세포로부터의 짝지워진 VH 및 VL 유전자의 단리에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 형질 세포에 의해 생산되는 항체를 스크리닝하기 위해서는, 면역글로불린 유전자는 인코딩되는 항체의 특이성 및 기능적 특성을 알아내기 위해 재조합체 형태로 클로닝 및 발현되어야 할 필요가 있다. 이러한 방법은 번잡하고, 비용이 많이 들고, 시간이 많이 소모되며, 고속처리에는 적합하지 않고 형질 세포의 전체 레퍼토리의 미소한 분획에 의해 생산되는 희소 항체 회수에 비효율적이다.
따라서, 형질 세포로부터 항체, 예를 들어 모노클로날 항체의 단리 및 스크리닝을 위한 고속 처리에 적합한 더욱 효율적인 방법을 찾아낼 필요가 있다.
개요
본 발명은 부분적으로는 면역글로불린 유전자의 클로닝 및 발현과 무관하게 항체의 특징분석을 가능케 하는 형질 세포로부터 항체를 효율적으로 및 고속으로 생산하는 방법의 발견을 근거로 한다. 본 발명의 방법으로 생산된 항체는 결합, 기능 및/또는 중화 검정을 포함하는 다중 스크리닝을 행함으로써 특징분석될 수 있다. 본 발명은 형질 세포에 의해 생산되는 희소 항체의 동정 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 국면에서, 본 발명은 형질 세포를 제한된 갯수로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 단세포 배양으로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 추가로 항체 또는 항체 분절의 특징분석하는 단계를 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 분절의 특징 분석은, 이에 제한되지 않으나, 항체 또는 항체 분절의 기능을 알아내기 위한 기능 검정, 항체 또는 항체 분절 또는 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프의 결합 특이성을 알아내기 위한 결합 검정 및/또는 독소 또는 병원체를 중화하는 항체 또는 항체 분절의 능력을 알아내기 위한 중화 검정을 행하는 단계를 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 항체 분절의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계, 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계, 생산된 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계, 및 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 항체 또는 항체 분절을 이용하는 다양한 상태 또는 질환의 진단 및/또는 치료 방법을 제공한다.
도 1 은 말초혈로부터 단리되고, 50 일 동안 간엽 기질 세포의 단층 상에서 배양된 CD 138+ 형질 세포에 의한 IgG 의 누적 생산량을 보여준다.
도 2 는 (A) 말초혈 및 (B) 골수로부터 단리된 단일 형질 세포를 포함하는 배양에서의 CD 138+ 형질 세포에 의한 IgG 의 누적 생산량을 보여준다.
도 3 은 말초혈로부터 단리되고, 간엽 기질 세포의 단층에서 배양된 CD138-high 형질 세포의 10 일 배양 상청액을 IgG, IgA, IgM 및 IgE 의 존재성에 대해 시험한 결과를 보여준다.
도 4 는 hMSC-TERT 세포 상에서 배양했을 때 IgG, IgA 또는 IgM 를 생산하는 항체-분비 세포 (ASC) 의, 상청액 내 검출가능한 양의 항체를 생산하기에 충분히 길게 생존하는 형질 세포의 백분율로 나타낸 플레이팅 효율 (plating efficiency) 을 보여준다.
도 5 는 파상풍 독소 (TT) 부스터 면역화 후 7 일째에 수집된 말초혈로부터 단리된 형질 세포로부터 파상풍 독소-특이적 IgG 를 분비하는 형질 세포의 동정을 보여준다.
도 6 은 파상풍 독소로 백신접종후 10 년째에 공여자의 혈액으로부터 단리된 배양된 형질 세포로부터 회수된 VH 및 VL 유전자의 클로닝 및 발현에 의해 생산되는 재조합체 항체의 파상풍 독소에 대한 결합을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역글로불린 유전자의 클로닝 및 발현과 무관하게 항체의 특징분석을 가능케 하는 형질 세포로부터 항체를 효율적으로 및 고속으로 생산하는 방법의 발견을 근거로 한다. 한 국면에서, 본 발명은 형질 세포를 제한된 갯수로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하여 생산된 항체는 결합, 기능 및/또는 중화 검정을 포함하고, 심지어는 제자리에서, 즉 형질 세포가 배양된 웰에서 수행될 수 있는 다중 스크리닝으로 편리하게 특징분석될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질 세포" 는 말초혈, 골수, 조직 또는 체액에서 발견되거나 또는 시험관내에서 B 세포로부터 생성되는 모든 초대 (primary) 항체 분비 세포 (ASC) 이다. 최근에는, 생성된 형질 세포는 "형질모구 (plasma blasts)" 로 지칭된다. 자연적으로 생성된 형질모구는 일반적으로 혈액, 특히 말초혈에서 발견된다. 형질모구는 또한 시험관내에서, B 세포를 TLR 아고니스트와 같은 폴리클로날 활성화제를 포함하는 다양한 자극으로 자극하여 생성될 수 있다. 본원에서, 용어 "형질 세포" 또는 "형질 세포들" 은 "형질 세포," "형질모구" 및 ASC 를 전부 포함하는 것으로 간주된다.
이론적으로는, 임의의 갯수의 형질 세포가 원하는 특징의 항체를 생산 및 동정하기 위해 배양 배지에서 배양될 수 있다. 실제로는, 배양될 수 있는 형질 세포의 갯수는 폴리클로날 세포 배양에 존재하는 다중 VH 및 VL 유전자 및 이들의 조합을 클로닝 및 발현할 수 있는 기법에 의해 제한된다. 한 구현예에서, "제한된 갯수의 형질 세포" 는 약 100 개 이하, 예를 들어 90 개 이하, 80 개 이하, 70 개 이하, 60 개 이하, 50 개 이하, 45 개 이하, 40 개 이하, 35 개 이하, 30 개 이하, 25 개 이하, 20 개 이하, 17 개 이하, 15 개 이하, 12 개 이하, 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 2 개 이하, 또는 1 개 이하인 형질 세포의 갯수를 지칭한다.
한 구현예에서, 본 발명은 배양 당 낮은 농도의 형질 세포로 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 배양 당 낮은 농도의 형질 세포는 일반적으로, 배양 당 약 1 내지 약 10 개, 또는 약 1 내지 약 15 개, 또는 약 1 내지 약 20 개, 또는 약 1 내지 약 25 개, 또는 약 1 내지 약 30 개, 또는 약 1 내지 약 40 개, 또는 약 1 내지 약 50 개, 또는 약 1 내지 약 60 개, 또는 약 1 내지 약 70 개, 또는 약 1 내지 약 80 개, 또는 약 1 내지 약 90 개, 또는 약 1 내지 약 100 개의 세포를 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서 형질 세포는 배양 당 낮은 농도의 세포로 희석된다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 감소된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 생물학적 공급원으로부터 단리되는 형질 세포의 갯수는 하기에 기재된 바와 같이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "감소된 갯수의 형질 세포" 는 상기 기재된 "제한된 갯수의 형질 세포" 와 호환되어 사용될 수 있다.
배양 내에서 원하는 갯수의 세포를 수득하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 기법에는, 이에 제한되지 않으나, 세포 희석 또는 세포 분류 (cell sorting) 및 침착 (deposition) 이 포함된다. 예를 들어, 제한된 또는 감소된 갯수의 형질 세포를 포함하는 배양은 세포 분류기를 이용해 단세포 침착으로 또는, 1, 2, 3 개 또는 더 많은 세포, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 세포가 마이크로타이터 배양 플레이트의 웰마다 존재하도록 충분한 배양 배지를 이용해 형질 세포의 현탁액을 희석하여 달성될 수 있다.
한 구현예에서, 단일 형질 세포가 배양된다. 단일 형질 세포에 의해 생산된 항체의 모노클로날 특성을 감안하면, 단세포 배양에서 형질 세포를 배양하는 것은 모노클로날 항체 집단을 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 단세포 배양으로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단세포 배양" 은 "단일 형질 세포를 배양함" 과 호환되어 사용되며, 대체로 단일 형질 세포를 포함하는 배양과 관련된다. 따라서, 다중-웰 플레이트, 예를 들어 96-웰, 384-웰 플레이트 또는 1536-웰 플레이트에서, 대부분의 웰은 단일 형질 세포를 포함할 것이고, 일부는 형질 세포를 포함하지 않을 것이고, 또다른 일부는 하나 이상의 형질 세포를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 형질 세포는 웰 당 평균 1 개 미만의 세포, 예를 들어, 0.8 개 세포/웰, 0.6 개 세포/웰, 0.5 개 세포/웰, 0.3 개 세포/웰 또는 0.1 개 세포/웰이 있는 배양에서 배양될 수 있다. 배양에서 단세포를 수득하는 기법은 상기 기재된 것과 유사하나, 단 여기서 마이크로타이터 웰 당 평균 1 개 또는 1 개 미만의 세포가 존재한다.
본 발명은 추가로, 항체 또는 항체 분절을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 임의의 방법에 따라 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계, 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계, 생산되는 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계 및 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
불멸화 (Traggiai et al., 2004, Nat Med 10:871-875; Lanzavecchia et al, 2007, Curr Opin Biotechnol. 18:523-528) 에 의해 항체 생산 세포의 클론들로 증대될 수 있는 기억 B 세포와는 달리, 형질 세포는 분할하지 않으며, 자극되거나 또는 불멸화되지 않는다. 따라서, 임의의 의미있는 수단에서 이들 "항체 공장" 의 사용을 활용하기 위해서는, 형질 세포는 배양에서 살아남은 채로 있어야 한다. 형질 세포는 연속적인 방식으로 항체를 생산 및 분비하며, 따라서 항체 집단의 크기는 시간의 함수로 증대된다. 형질 세포는 생체내에서 상당히 긴 기간 동안 생존하지만, 이들은 시험관내에서는 1 일을 넘겨 더 길게 생존하지는 않는다 (실험 데이터는 나타내지 않음). 따라서, 본 발명은, 이에 제한되지 않으나 단일 형질 세포를 포함하는 형질 세포를, 배양된 형질 세포의 생존을 연장시키는 외인성 구성성분 또는 구성성분들을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 배양된 형질 세포의 생존은, 항체가 항체의 특징분석에 필요한 양으로 생산되도록, 즉 배양 배지가, 이에 제한되지 않으나 결합 검정, 중화 검정 또는 항체의 기능을 알아내거나 또는 그렇지 않으면 특징분석하는 기타 검정을 포함하는 스크리닝 검정에 이용될 수 있도록 충분한 항체를 포함하도록, 충분한 시간 동안 연장된다. 이어서, 원하는 특이성의 항체를 포함하는 배양은 단리되고, 면역글로불린 유전자가 증폭, 서열분석 및 발현되어 모노클로날 항체를 생산할 수 있게 된다.
배양 내에서, 이에 제한되지 않으나 단일 형질 세포를 포함하는 형질 세포의 생존은 단기간 또는 장기간 동안 연장될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단기간" 은 2 일 이상 내지 약 9 일의 기간, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 약 9 일을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "장기간" 은 10 일 이상의 기간, 예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 약 150 일을 지칭한다.
단기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은 형질 세포의 생존을 장기간 동안 유지할 때만큼 많은 항체를 생산하지는 못하지만, 본원에 기재된 바와 같이 단기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은 더욱 용이하고, 더욱 신속하고 더욱 경제적이며, 민감한 검정에서 항체를 스크리닝함에 있어서 특히 유용하다. 장기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은, 항체의 특징 분석이 다중 스크리닝 검정 또는 낮은 감수성의 검정을 필요로 하는 상황에 특히 적합하다.
한 구현예에서, 배양 배지 내에 존재하는 외인성 구성성분은 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 동안 연장한다. 또다른 구현예에서, 배양 배지 내에 존재하는 외인성 구성성분은 배양된 형질 세포의 생존을 장기간 동안 연장한다. 외인성 구성성분은 형질 세포 또는 하나 이상의 비-형질-세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드일 수 있다.
배양된 형질 세포의 생존 연장에 유용한 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 리간드의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 싸이토카인, 케모카인 및 기타 리간드가 포함된다. 한 구현예에서, 상기 리간드는 IL-5, IL-6, 기질 세포-유도성 인자-1 (SDF-1), TNF-α, 또는 CD44 에 대한 리간드, 예를 들어 히알루론산이다. 또다른 구현예에서, 외인성 구성성분은 IL-5, IL-6, 기질 세포-유도성 인자-1 (SDF-1), TNF-α, CD44 에 대한 리간드, 예를 들어 히알루론산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드를 포함하며, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어서 유용하다.
배양된 형질 세포의 생존 연장에 유용한 비-형질 세포의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 간엽 기질 세포, 섬유아세포 (fibroblast) 또는 파골세포가 포함된다. 한 구현예에서, 비-형질 세포는 간엽 기질 세포, 선유아세포 또는 파골세포이며, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어 유용하다. 또다른 구현예에서, 비-형질 세포는 간엽 기질 세포이고, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어 유용하다. 간엽 기질 세포는, 이에 제한되지 않으나 인간 간엽 기질 세포를 포함하는 포유류 간엽 기질 세포일 수 있다. 간엽 기질 세포는 선택적으로는 배양에 사용하기 전에 불멸화될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 3 내지 약 7 일 동안 또는 약 5 내지 약 9 일 동안 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일, 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 50 일 이상 하나 이상의 유형의 비-형질-세포의 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일, 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 50 일 이상 간엽 기질 세포 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 약 50 일, 또는 약 55 일 또는 약 60 일, 또는 약 65 일, 또는 70 일 이상 하나 이상의 유형의 비-형질 세포 및 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 존재 하의 배양에서 배양된다.
한 구현예에서, 배양된 세포의 플레이팅 효율은 약 30% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 40% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 50% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 55% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 60% 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플레이팅 효율" 은 상청액 내에 검출가능한 양의 항체를 생산하기에 충분히 길게 생존하는 형질 세포의 백분율에 관련된다.
배양된 형질 세포는 원하는 종으로부터 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 형질 세포는 마우스, 래트, 토끼, 낙타 또는 원숭이 형질 세포이다. 또다른 구현예에서, 배양된 형질 세포는 인간 형질 세포이고, 생산된 항체는 인간 항체이다. 또다른 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 형질 세포를 단세포 배양으로 배양하여 생산된다.
형질 세포, 예를 들어 인간 형질 세포는 인간의 말초혈로부터 단리될 수 있다. 상기 인간 형질 세포는 "말초혈 형질 세포" 또는 "순환 형질 세포" 로 언급될 수 있다. 형질 세포, 예를 들어 인간 형질 세포는 또한 인간의 골수, 조직 또는 이에 제한되지 않지만 활액, 뇌척수액 및 삼출액을 포함하는 체액으로부터 단리될 수 있다. 용어 "조직" 은 인체 내 존재하는 임의의 조직을 포괄하는 것을 의도로 하며, 심장 조직, 신경 조직, 근육 조직, 상피, 연결 조직 및 흉선, 비장 및 림프절과 같은 림프 장기를 포함할 수 있다.
형질 세포는 일반적으로 CD138 의 발현, 및 선택적으로는 CD27, CD38, CD9, CD44 및 MHC 클래스 II 분자의 추가적인 발현을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 세포는 CD138 의 발현에 따라 말초혈, 조직, 골수 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. CD27, CD38, CD9, CD44 및 MHC 클래스 II 분자와 같은 표면 마커는 또한, 단리 과정을 개선하고 형질 세포 하위셋트를 동정하기 위해 CD138 에 추가하여 이용될 수 있다 (Arce et al., 2004, J Leukoc Biol, 75:1022-1028). 또다른 구현예에서, 형질 세포는 자석 마이크로-비드를 이용하여 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 고정화된 항-CD 138 항체로 코팅되어 있는 자석 마이크로-비드를 이용하여 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 자석 마이크로-비드를 이용한 형질 세포의 풍부화는 세포 분류에 후속될 수 있다.
한 구현예에서, 형질 세포는 백신접종 후 인간 공여체의 말초혈로부터 단리될 수 있다. 백신접종은 면역 응답성을 유도할 수 있는 임의의 항원의 투여를 지칭한다. 백신은 현재 공지되어 있거나 또는 이후 당업자에 의해 이용가능한 임의의 백신일 수 있고, 이에 제한되지 않으나 파상풍 독소, 인플루엔자, 황열, 파상풍-디프테리아, B 형 간염, 종두 및 암 백신이 포함된다. 또다른 구현예에서, 백신은 부스터 백신일 수 있다. 형질 세포는 백신접종 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일 후 또는 더 지나서 공여자로부터 단리될 수 있다. 한 구현예에서, 형질 세포는 공지된 독소에 응답하는 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 미지의 병원체에 응답하는 공여자로부터 단리될 수 있다. 추가 구현예에서 형질 세포는 알러지가 있는 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 항정 상태 하의 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 자가면역 질환이 있는 공여자로부터 단리될 수 있다.
또다른 구현예에서, 형질 세포는 B 세포의 자극에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다. 상기 자극은 나이브 (naive) 또는 기억 B 세포의 폴리클로날 또는 항원-특이적 자극을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다 (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199-2202).
본 발명의 방법은 임의의 이소타입의 임의의 항체를 분비하는 형질 세포 배양에 이용될 수 있다. 한 구현예에서 형질 세포는 IgG 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgA 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgM 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgD 형질 세포일 수 있고, 추가 구현예에서 형질 세포는 IgE 형질 세포일 수 있다. 또다른 구현예에서, 단리된 집단의 형질 세포는 두가지 이상의 이소타입을 포함하는 혼합된 집단의 형질 세포일 수 있다.
단리된 인간 형질 세포는 효소 연계 면역흡광 스팟 (ELISPOT) 검정 (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199-2202) 을 이용하여 계수될 수 있다. 상기 검정은 관심대상의 세포에 의해 분비되는 생성물을 가시화함으로써 결과를 제공하며, 이로써 검정에 의해 제공된 각각의 스팟은 단세포를 나타낸다.
한 구현예에서, 인간 형질 세포는 제한 희석에 의해 또는 단세포 침착에 의해 단세포로서 시딩될 수 있다. 한 국면에서, 인간 형질 세포는 간엽 기질 세포의 존재 하에 단세포로서 시딩될 수 있다. 또다른 구현예에서, 인간 형질 세포는 폴리클로날 배양으로서 시딩될 수 있다. 형질 세포는 간엽 기질 세포의 존재 하에 폴리클로날 세포 배양으로서 시딩될 수 있다. 폴리클로날 인간 형질 세포 배양은, 대안적으로는 제한 희석을 이용하여 단세포 배양으로 분리될 수 있다. 또다른 국면에서, 폴리클로날 인간 형질 세포 배양은 단세포 침착을 이용하여 단세포 배양으로 분리될 수 있다.
간엽 기질 세포는 선유아세포-형 세포이나, 선유아세포보다 더 큰 분화 잠재성을 갖고 있으며, 조골세포, 연골 세포 및 지방 세포로 분화할 수 있다. 간엽 기질 세포는 이종성 집단으로서 발견되며, 이들이 잔류하는 조직의 지지체적 구조를 형성한다. 골수에서, 간엽 기질 세포는 조혈 세포의 성장 및 분화, 백혈구 세포의 유지에 필요하다. 초대 간엽 기질 세포는 적당한 배지에서 단리될 수 있고, 수회 계대 동안 그러나 노쇠 전 제한된 시간 동안만 배양될 수 있다. 텔로머라아제 역전사효소 (TERT) 를 이용한 형질전환은 간엽 기질 세포의 생리학적 성장 속도 및 기능적 특징을 유지하면서, 시험관내에서 무기한으로 증식하는 간엽 기질 세포를 불멸화하기 위해 이용되어 왔다.
배양에 사용되는 간엽 기질 세포는 골수-유도성 간엽 기질 세포일 수 있다. 간엽 기질 세포는 포유류 간엽 기질 세포, 예를 들어 인간 간엽 기질 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 간엽 기질 세포는 적당한 배지에서의 배양에 의한 착생 골수 세포로부터 단리될 수 있다. 상기 배지는 히드로코르티손을 포함할 수 있다. 간엽 기질 세포는 또한 다른 조직으로부터 유도될 수 있다.
실용적인 이유로, 간엽 기질 세포는 본 발명의 방법에서의 이용 전에 불멸화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "불멸화된" 은 간엽 기질 세포가, 접촉으로 인한 성장 저해를 견뎌내는 역량을 포함하는, 형질 세포를 지속할 수 있도록 하는 모든 특징들을 유지하면서, 개선된 증식 역량을 갖는 것을 의미한다. 한 구현예에서, 간엽 기질 세포는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 1 주간 생존할 수 있다. 또다른 구현예에서, 불멸화된 간엽 기질 세포는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 2 주 동안, 또는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 3 주 동안, 또는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 4 주 동안 생존할 수 있다.
간엽 기질 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 불멸화될 수 있다. 한 구현예에서, 간엽 기질 세포는 텔로머라아제 역전사효소 유전자를 이용한 형질전환에 의해 불멸화된다. 또다른 구현예에서, 간엽 기질 세포는 [Mihara et al., 2003 Br J Haematol 120: 846-849] 에 기재된 방법에 따라 TERT 유전자를 이용한 형질전환에 의해 불멸화될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 항체 또는 항체 분절을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계, 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계, 생산되는 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계 및 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분절" 및 "항체 분절" 은 호환되어 이용되며, 본 발명의 항체의 임의의 분절을 지칭한다. 한 구현예에서, 항체 분절은 항체의 항원-결합 활성을 보유한다. 또다른 구현예에서, 항체 분절은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개 또는 더 많은 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예시 항체 분절은 하나 이상의 Fc, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 분절, 중쇄, 경쇄, 힌지 (hinge) 영역, 항원 결합 부위, 단쇄 항체 또는 이들의 임의의 일부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 은 이에 제한되지 않으나 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA 를 포함하는 모든 형태의 핵산을 포괄한다. 항체 또는 항체 분절의 클로닝 및 이종성 발현은 당업자의 재량에 따라 분자생물학 및 재조합체 DNA 의 통상적인 기법을 이용하여 행해질 수 있다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 JMol Biol 358, 764-772). 상기 기법은 문헌, 예를 들어 [Sambrook, 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition] 에 전부 설명되어 있다. VH/VL 서열의 회수 및 발현을 위해서는 [Tiller et al., J Immunol Methods 2008 329: 112-124] 의 방법이 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 항체는 진핵 세포에서 적당한 벡터 또는 바이러스를 이용하여 발현된다. 진핵 세포는 CHO, 293T, 293F, 또는 효모 세포일 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체는 원핵 세포에서 적당한 벡터 또는 파지를 이용하여 발현된다. 원핵 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 대장균 (E. coli) 세포일 수 있다. 추가 구현예에서, 이종성 발현 시스템은 셀 프리 시스템 (cell free system) 일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 항체 및 항체 분절은 널리 확립된 방법론을 이용하여 용이하게 단리될 수 있다 (Coligan et al., Eds. Current Protocol in Immunology 1: 2.7). 한 구현예에서, 본 발명의, 모노클로날 항체 또는 항체 분절을 포함하는 항체 또는 항체 분절은 원심분리 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 항체 분절은 그들의 결합 특이성에 따라 단리될 수 있다. 예를 들어 항체는 적당한 고정화된 항원을 포함하는 고체 지지체에 적용됨으로써 단리될 수 있다. 추가 구현예에서, 항체는, 일부의 경우 고정될 수 있는 항-IgG, -IgE, -IgA, -IgD 또는 -IgM 항체를 이용하여 단리될 수 있다.
Ig 또는 특이적인 항체를 분비하는 형질 세포는 면역친화성 방법으로 단리될 수 있다. 먼저, 분비된 생성물은 분비 세포의 표면 상에 적당한 공유결합으로 결합된 포획 시약을 이용하여 포획될 수 있다. 이어서, 포획된 생성물은 형광으로 표지된 2 차 항체 또는 항원을 이용하여 밝혀질 수 있다 (Manz et al., 1998 Int Immunol 10, 1703-1711).
항체 특징분석
형질 세포는 표면 면역글로불린을 발현하지 않으며, 따라서 이소타입 또는 항원 특이성에 따라 선별될 수 없다. 따라서, 형질 세포에 의해 생산된 항체는 특징분석되기 위해서는 단리되어야만 한다. 현재, 형질 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 당업계에서 원래 사용되는 두가지 방법이 있다. 그들 중 첫번째는, 면역 공여자의 전체 골수로부터 제공되는 항체의 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것이다 (Williamson et al., 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4141-4145). 그러나, 상기 방법은 골수 시료의 입수로 인해 제한된다.
두번째 방법은, 단세포 PCR 을 이용하여 개별 형질 세포로부터 Ig 유전자 회수에 후속해 부스터 면역화 후, 순환 형질 세포의 단리를 수반한다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 J Mol Biol 358, 764- 772). 상기 방법은 부스터 면역화 후 6 내지 8 일째에 순환 형질 세포의 크기를 가늠할 수 있는 분획이 면역화 항원에 대해 특이적이라는 사실에 근거한다. 그러나, 상기 접근법은 항체 특이성 평가 전에 집중적인 유전자 클로닝 및 발현 작업을 필요로 하며, 따라서 형질 세포 응답성이 복합 병원체와 같은 다중적 면역원에 대한 것일 때에는 별로 실용적이지 않다. 따라서, 인간 형질 세포의 장기간 배양 시스템의 개발은 시험관내 결합 검정, 기능 검정 및 추가로 항체 특징 분석을 행하기에 충분한 항체를 회수하고, 관심대상의 항체를 제공하는 형질 세포를 선별하기 위해 특별히 유용하다.
형질 세포 또는 기타 항체 분비 세포로부터 항체를 단리하는 대안적인 방법은 마이크로조작 (micromanipulation) 을 근거로 하며, 세포를 반고체 배지 중에 (Harriman WD et al J Immunol Methods 341; 135-145 2009) 또는 마이크로어레이에 (Jin A et al Nat Medicine 15; 1088 2009) 플레이팅하는 단계를 포함하며, 분비된 항체는 형광 프로브를 이용하여 제자리에서 검출된다. 일단 동정되면, 형질 세포는 마이크로조작에 의해 회수되고, VH 및 VL 유전자는 증폭되고 서열분석된다. 단기간 배양 및 분비된 항체의 국소적 검출을 기반으로 하는 상기 방법들은 항체 분비 세포의 마이크로조작을 위한 특별한 장비를 필요로 하며, 바이러스 또는 독소 중화와 같은 기능적 특성에 대해 항체를 시험하기에는 적합하지 않다. 본 발명의 방법은 임의의 마이크로조작을 기반으로 하지도, 그것을 필요로 하지도 않으며, 생산되는 항체로 하여금, 이에 제한되지 않으나 결합 검정, 기능 검정 및/또는 중화 검정을 포함하는 다중 검정에서 스크리닝되도록 한다. 한 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 제한된 갯수로 배양하는 단계 및 항체를 특징분석하는 단계를 포함하며, 항체 분비 형질 세포를 회수하기 위한 마이크로조작을 포함하지 않는, 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법으로 단리된 항체 또는 항체 분절의 특징분석을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절의 결합 특이성을 알아내는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프를 알아내는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 항체 또는 항체 분절 및/또는 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프의 결합 특이성은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 알아낼 수 있다. 한 구현예에서, 결합 특이성 및/또는 인식되는 에피토프는 단리된 항체 또는 항체 분절을 표지하고, 표지된 항체 또는 항체 분절을 항원 라이브러리에 제시하고, 그의 인식 항원에 결합된 표지된 항체 또는 항체 분절을 검출함으로써 알아낼 수 있다. 또다른 구현예에서, 표지된 항체 또는 항체 분절은 고정화된 항원 분자를 포함하는 정제 컬럼에 적용될 수 있고, 컬럼 상의 표지된 항체 또는 항체 분절의 존재성 또는 부재성은 항체 특이성 및/또는 인식되는 에피토프의 표식으로 이용될 수 있다. 특별한 항원으로 면역화되었거나 또는 특별한 항원에 노출된 공여자의 말초혈로부터 단리된 형질 세포가 항원 또는 병원체에 결합하는 항체 또는 항체 분절을 생산할 것이라는 점은 당업자에게 자명하다. 그럼에도 불구하고, 병원체, 특히 복합 병원체는 다수의 항원을 포함할 공산이 크며, 특별한 항체 또는 항체 분절의 결합 특이성 및/또는 인식되는 에피토프는 여전히 밝혀내야할 수도 있다.
본 발명의 단세포 배양 방법은 항체를 인코딩하는 핵산이 널리 확립된 방법론을 이용하여 용이하게 단리될 수 있는 특이적 항체를 생산하는 단일 형질 세포를 제공한다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 J Mol Biol 358, 764-772). 한 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절을 인코딩하는 핵산의 서열분석을 수반할 수 있다. 핵산 서열분석은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 행해질 수 있다. 한 구현예에서, 핵산 서열분석은 사슬 종결을 이용하여 행해질 수 있으며, 여기서 방사활성, 형광 또는 기타 염료가 이용될 수 있다. 또다른 국면에서, 핵산 서열분석은 자동화된 서열분석 방법을 이용하여 행해질 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 특징분석은 항체 단백질 서열분석을 수반할 수 있다. 항체 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 서열분석될 수 있다. 한 구현예에서, 항체 단백질은 N-말단 분석법, C-말단 분석법 또는 Edman 분해에 의해 서열분석될 수 있다. N-말단 분석법은 하기 단계를 포함할 수 있다: i) 단백질을 아아미노 말단 아미노산을 선별적으로 표지할 시약과 반응시키는 단계; ii) 단백질을 가수분해하는 단계; 및 iii) 크로마토그래피 및 표준과의 비교에 의해 아미노 말단 아미노산을 알아내는 단계. 상기 국면에서, 이에 제한되지 않으나, 생거 (Sanger's) 시약, 댄실 유도체, 예컨대 댄실 클로라이드 및 페닐이소티오시아네이트를 포함하는 임의의 표지 시약이 이용될 수 있다. C-말단 분석법은 단백질을 카르복시펩티다아제와 인큐베이션시키는 단계 및 시료를 적당한 간격으로 취해 아미노산 농도 대 시간의 그래프를 작성하는 단계를 포함할 수 있다.
항체 단백질의 서열 분석에 후속하여, 본 발명은 또한 동정된 항체 서열을 근거로 결합 단백질을 화학적으로 합성하는 것을 포함할 수 있다. 화학물 합성은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 행해질 수 있다. 한 구현예에서, 화학물 합성은 아미노산의 카르복시기를 불용성 고체 지지체에 부착시키고, 고정화된 항체를 서열 내 후속 항체의 카르복시기와 반응시킴으로써 행해질 수 있다. 이어서, 상기 방법은 필요한 아미노산 서열이 제조될 때까지 반복될 수 있고, 완결 단백질은 고체 지지체로부터 끊을 수 있으며, 올바른 단백질 폴딩 (folding) 이 되도록 하거나 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 포함한다.
항체의 약제학적 용도
본 발명은 예를 들어 알러지, 감염성 상태 또는 질환, 암 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료에서 사용하기 위한, 치료요법에서의 사용을 위해 본 발명의 임의의 방법으로 생산되는 항체 또는 항체 분절을 제공한다.
용어 "알러지" 에는, 이에 제한되지 않으나 알러지성 피부염, 알러지성 비염, 혈관부종, 과민증, 아스피린 민감성, 천식, 국소 피부염, 조류 알러지, 카나리아 알러지, 고양이 알러지, 화학물 민감성, 닭 알러지, 결막염, 만성 피로, 접촉성 피부염, 화장품 알러지, 우유 알러지, 피부염, 개 알러지, 약물 반응, 오리 알러지, 먼지 알러지, 진드기 알러지, 습진, 거위 알러지, 유리 알러지, 건초열, 두통, 심율동이상 (heart irregularity), 두드러기, 아동에서의 활동항진, 저혈당증, 호흡 및 접촉 알레르겐, 락토오스 과민증, 편두통 두통, 우유 알러지, 응애 알러지, 두드러기, 앵무새 알러지, 잉꼬 알러지기, 지속성 비염, 비둘기 알러지, 화분 알러지, 비염, 옻나무 알러지, 살리실레이트 민감성, 부비동염, 피부 발진, 참새 알러지, 칠면조 알러지, 유카리아 (ucaria), 및 효모 알러지를 포함하는, 비-기생충성 항원에 의해 야기되는 모든 형태의 과민감성 반응이 포함된다.
용어 "감염성 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생체 및 진균을 포함하는 병원체성 미생물 제제의 존재로 인한 임의의 임상적으로 분명한 질환이 포함된다. 용어 "감염성 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나 AIDS, AIDS 관련 복합질환, 수두, 일반적인 감기, 싸이토메갈로바이러스 감염, 콜로라도 틱 열 (Colorado tick fever), 뎅기열, 에볼라 출혈열, 수족구병, 간염, 헤르페스 단순포진, 대상 포진, HPV, 인플루엔자 (독감), 라사열, 홍역, 말버그 (marburg) 출혈열, 전염성 단핵증, 볼거리, 노로바이러스, 소아마비, 진행성 다소성 백질뇌병증, 광견병, 풍진, SARS, 두창 (바리올라; variola), 바이러스성 뇌염, 바이러스상 장염, 바이러스성 뇌수막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일 병 (west nile disease), 황열, 탄저병, 박테리아성 뇌수막염, 보툴리즘증 (botulism), 브루셀라병, 캄필로박터병, 고양이 발톱 병 (cat scratch disease), 콜레아, 디프테리아, 발진 티푸스, 임질, 농가진-레지오넬라증 (impetigo-legionellosis), 나병 (한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임 관절염, 멜리오이도증, 류마티스열; MRSA 감염, 노카르디아증, 백일해 (Whooping Cough), 흑사병, 폐구균성 폐렴, 앵무병, Q 열 (Q fever), 록키산 홍변열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 세균성이질, 매독, 파상풍, 트라코마 (trachoma), 결핵, 야토병, 장티푸스, 티푸스-요관염 (typhus-urinary tract infections), 아프리카 수면병, 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 샤가스병, 간흡충증, 크립토스포리디움증, 낭미충증, 긴촌충증, 연충증, 단포조충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유 생활 아메바 감염, 람블편모충증, 악구층증, 왜소조충증, 등포자충증, 흑열병, 리슈만편모충증, 말라리아, 요꼬가와흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이 기생증, 요충 감염, 공수병, 주혈흡충중, 조충증, 고양이회충증, 주혈원충증, 톡소포자충증, 선모충증, 편충증, 트리코모나스증, 트리파노소마증, 아스페르길루스증, 효모균증, 칸디다증, 콕시디오이드증, 효모균증, 히스토플라즈마증, 발 무좀, 전염성 해면상뇌증, 소 해면상 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥 병, 쿠루 (kuru), 치명적 가족성 불면증 및 알퍼 증후군 (alpers syndrome) 이 포함된다.
용어 "자가면역 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브 병, 경피증, 셀리악병, 크론 병, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 굿파스튜어 증후군, 애디슨 병, 베게너 육아종증, 담즙성 간경변, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 류마티스 관절염, 자가면역 갑상선 질환, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 건선성 관절염, 교감성 안염, 자가면역 신경염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 림프증식 증후군, 항인지질항체 증후군, 루푸스, 다내분기 결핍 증후군, 1 형 다내분기 결핍 증후군, 2 형 다내분기 결핍 증후군, 면역 혈소판감소 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근무력증, 복합 교원성 질환, 원발성 사구체신염, 백반증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 만성소화장애증, 애르마티티스 헤르페티포르미스 (aermatitis herpetiformis), 엠피구스 (emphigus), 천포창, 낙엽상 천포창, 수포성 유천포창, 자가면역 심근염증, 자가면역 맥관육종, 자가면역 안 질환, 원형 탈모증, 자가면역 동맥경화, 베체트병, 자가면역 척추염, 자가면역 혈우병, 자가면역 사이질 방광염, 자가면역 요붕증, 자가면역 자궁내막증, 다발연골염, 강직성 척추염, 자가면역 담마진, 신생물연관 자가면역 증후군, 피부근염, 밀러 피셔 증후군 및 IgA 신염을 포함하는, 면역계가 자신의 항원에 대해 반응하는 모든 형태의 질환이 포함된다.
본 발명은 또한 알러지, 감염성 상태 또는 질환, 암 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료를 위한 의약 제조에서의 사용을 위해 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 투여하는 단계를 포함하는, 알러지, 감염성 상태 또는 질환 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절 또는 상기 항체 또는 항체 분절을 인코딩하는 핵산을 약제학적으로 허용되는 조성물로 제형화하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 하나 이상의 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 2, 3, 4, 5 개, 또는 그보다 더 많은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 투여를 허용하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독성이어서는 안 된다. 적당한 담체에는 큰, 느리게 물질대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자가 포함된다.
특정 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또한 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질은 그와 같은 조성물에 존재할 수 있고, 약제학적 조성물이 대상체에 의한 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 서스펜션으로 제형화되도록 할 수 있다.
약제학적 조성물은 이에 제한되지 않으나, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강, 장, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 5.5 내지 8.5, 일부 구현예에서는 6 내지 8, 추가 구현예에서는 약 7 의 pH 를 가질 수 있다. 상기 pH 는 완충액의 이용으로 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 발열체가 없는 것일 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절은 진단 시약 제조를 위해 진단 부형제와 조합될 수 있다. 한 구현예에서, 진단 시약은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 하나 이상의 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다. 예를 들어, 진단 시약은 2, 3, 4, 5 개, 또는 그보다 더 많은, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다.
진단 부형제는 환자에 대한 진단 시약의 투여를 가능케 하기 위해 투여를 허용하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독성이어서는 안 된다. 적당한 담체는 큰, 느리게 물질대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 시약은 약제학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질이 존재할 수 있다.
진단 시약은 생체내, 시험관내 또는 생체외 진단에 이용될 수 있다. 생체내 사용을 위해, 진단 시약은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강, 장 (enteral), 설하, 질내 또는 직장 경로를 비제한적으로 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
진단 시약은 5.5 내지 8.5, 일부 구현예에서는 6 내지 8, 추가 구현예에서는 약 7 의 pH 를 가질 수 있다. 상기 pH 는 완충액의 이용으로 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 발열체가 없는 것일 수 있다. 진단 시약은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
한 구현예에서, 진단 시약은 항체 표지를 포함할 수 있다. 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 합텐 (hapten) 및 효소 표지를 포함하는 생물학적 표지로부터 선택될 수 있다.
진단 시약은 특별한 항원의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 상기 정보는 특별한 병원체의 존재 또는 부재를 알아내기 위해, 따라서 특별한 장애 또는 질환의 존재성을 알아내기 위해 외삽될 수 있다. 본 발명의 한 국면에서, 질환은 알러지, 감염성 상태 또는 질환 또는 자가면역 상태 또는 질환일 수 있다. 진단 시약을 이용하여 수득한 정보는 특별한 환자의 적당한 치료 과정을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 진단 시약은 알레르겐의 존재 또는 부재를 알아내기 위해 이용될 수 있다.
용어 "알레르겐" 은, 이에 제한되지 않으나 고양이, 모피, 비듬, 바퀴벌레, 양모, 진드기, 진드기 분비물, 페니실린, 술폰아미드, 살리실레이트, 국소 마취제를 포함하는 마취제, 셀러리, 큰뿌리 셀러리, 곡식, 옥수수, 밀, 난류 (eggs), 알부민, 과일, 호박, 콩과식물, 콩류, 완두콩, 넛트, 땅콩, 대두, 우유, 해물, 참깨, 콩, 견과류, 호두, 아몬드, 곤충의 침, 벌침독, 말벌침 독, 모기침, 곰팡이 포자, 라텍스, 금속, 식물 꽃가루, 독보리 및 큰조아재비를 포함하는 풀, 돼지풀, 질경이, 쐐기풀, 쑥, 명아주 및 수영을 포함하는 잡초류, 자작나무, 오리나무, 개암나무, 서어나무, 칠엽수, 버드나무, 포플라, 플라타너스, 피나무, 올리브나무, 노간주나무를 포함하는 나무를 포함하는, 개체에서 과민감성 반응을 자극할 수 있는 임의의 비-기생충성 항원을 포함한다.
단백질 정제에서의 단리된 항체의 사용
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 고체 지지체 상에 고정화하는 방법을 포함한다. 용어 "고체 지지체" 는 고체 및 반-고체 지지체를 모두 포함하며, 단리된 항체 또는 항체 분절을 고정화하기 위해 이용될 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 고체 지지체는, 유리 구체 또는 자석 비드, 컬럼, 관, 마이크로타이터 플레이트의 웰 또는 플라스틱 시트를 포함하는, 겔, 메쉬, 비드를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 고정화된 항체 또는 항체 분절은 단백질 정제에 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 고정화된 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 이용될 수 있다. 관심대상의 단백질을 함유하는 용액은 관심 대상의 단백질에 대한 친화성이 공지되어 있는, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 고정화된 항체 또는 항체 분절을 포함하는 고체 지지체에 적용될 수 있다. 항체 또는 항체 분절은, 예를 들어 일부 구현예에서 컬럼 내 유지될 수 있는 비드 상에 고정화될 수 있다.
일반적인 내용
용어 "포함하는" 은 "함유하는" 뿐만 아니라 "이루어지는" 을 포함하며, 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X만으로 이루어질 수 있거나 부가적인 것, 예컨대 X + Y를 포함할 수 있다.
단어 "실질적으로" 는 "완전히"를 배제하지는 않으며, 예컨대 Y 가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y 가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 χ 와 관련된 용어 "약" 은, 예를 들어 χ±10% 를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "질환" 은, 용어 "장애" 및 "상태"(의학적 상태로서)와 일반적으로 같은 의미를 의도하는 것이며 호환되어 사용되는데, 이들 모두 정상적인 기능을 손상시키는, 인간이나 동물의 신체 또는 그 일부 중 하나의 비정상적인 상태를 반영하고, 구별되는 징후 및 증상에 의해 통상적으로 나타나며, 인간이나 동물의 수명 또는 삶의 질을 감소시킨다는 점에서 그러하다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 환자의 "치료" 에 대한 언급에는 예방 및 치료요법을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "환자" 는 인간을 포함한 모든 포유동물을 의미한다.
도 2 는 (A) 말초혈 및 (B) 골수로부터 단리된 단일 형질 세포를 포함하는 배양에서의 CD 138+ 형질 세포에 의한 IgG 의 누적 생산량을 보여준다.
도 3 은 말초혈로부터 단리되고, 간엽 기질 세포의 단층에서 배양된 CD138-high 형질 세포의 10 일 배양 상청액을 IgG, IgA, IgM 및 IgE 의 존재성에 대해 시험한 결과를 보여준다.
도 4 는 hMSC-TERT 세포 상에서 배양했을 때 IgG, IgA 또는 IgM 를 생산하는 항체-분비 세포 (ASC) 의, 상청액 내 검출가능한 양의 항체를 생산하기에 충분히 길게 생존하는 형질 세포의 백분율로 나타낸 플레이팅 효율 (plating efficiency) 을 보여준다.
도 5 는 파상풍 독소 (TT) 부스터 면역화 후 7 일째에 수집된 말초혈로부터 단리된 형질 세포로부터 파상풍 독소-특이적 IgG 를 분비하는 형질 세포의 동정을 보여준다.
도 6 은 파상풍 독소로 백신접종후 10 년째에 공여자의 혈액으로부터 단리된 배양된 형질 세포로부터 회수된 VH 및 VL 유전자의 클로닝 및 발현에 의해 생산되는 재조합체 항체의 파상풍 독소에 대한 결합을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역글로불린 유전자의 클로닝 및 발현과 무관하게 항체의 특징분석을 가능케 하는 형질 세포로부터 항체를 효율적으로 및 고속으로 생산하는 방법의 발견을 근거로 한다. 한 국면에서, 본 발명은 형질 세포를 제한된 갯수로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하여 생산된 항체는 결합, 기능 및/또는 중화 검정을 포함하고, 심지어는 제자리에서, 즉 형질 세포가 배양된 웰에서 수행될 수 있는 다중 스크리닝으로 편리하게 특징분석될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질 세포" 는 말초혈, 골수, 조직 또는 체액에서 발견되거나 또는 시험관내에서 B 세포로부터 생성되는 모든 초대 (primary) 항체 분비 세포 (ASC) 이다. 최근에는, 생성된 형질 세포는 "형질모구 (plasma blasts)" 로 지칭된다. 자연적으로 생성된 형질모구는 일반적으로 혈액, 특히 말초혈에서 발견된다. 형질모구는 또한 시험관내에서, B 세포를 TLR 아고니스트와 같은 폴리클로날 활성화제를 포함하는 다양한 자극으로 자극하여 생성될 수 있다. 본원에서, 용어 "형질 세포" 또는 "형질 세포들" 은 "형질 세포," "형질모구" 및 ASC 를 전부 포함하는 것으로 간주된다.
이론적으로는, 임의의 갯수의 형질 세포가 원하는 특징의 항체를 생산 및 동정하기 위해 배양 배지에서 배양될 수 있다. 실제로는, 배양될 수 있는 형질 세포의 갯수는 폴리클로날 세포 배양에 존재하는 다중 VH 및 VL 유전자 및 이들의 조합을 클로닝 및 발현할 수 있는 기법에 의해 제한된다. 한 구현예에서, "제한된 갯수의 형질 세포" 는 약 100 개 이하, 예를 들어 90 개 이하, 80 개 이하, 70 개 이하, 60 개 이하, 50 개 이하, 45 개 이하, 40 개 이하, 35 개 이하, 30 개 이하, 25 개 이하, 20 개 이하, 17 개 이하, 15 개 이하, 12 개 이하, 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 2 개 이하, 또는 1 개 이하인 형질 세포의 갯수를 지칭한다.
한 구현예에서, 본 발명은 배양 당 낮은 농도의 형질 세포로 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 배양 당 낮은 농도의 형질 세포는 일반적으로, 배양 당 약 1 내지 약 10 개, 또는 약 1 내지 약 15 개, 또는 약 1 내지 약 20 개, 또는 약 1 내지 약 25 개, 또는 약 1 내지 약 30 개, 또는 약 1 내지 약 40 개, 또는 약 1 내지 약 50 개, 또는 약 1 내지 약 60 개, 또는 약 1 내지 약 70 개, 또는 약 1 내지 약 80 개, 또는 약 1 내지 약 90 개, 또는 약 1 내지 약 100 개의 세포를 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서 형질 세포는 배양 당 낮은 농도의 세포로 희석된다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 감소된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 생물학적 공급원으로부터 단리되는 형질 세포의 갯수는 하기에 기재된 바와 같이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "감소된 갯수의 형질 세포" 는 상기 기재된 "제한된 갯수의 형질 세포" 와 호환되어 사용될 수 있다.
배양 내에서 원하는 갯수의 세포를 수득하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 기법에는, 이에 제한되지 않으나, 세포 희석 또는 세포 분류 (cell sorting) 및 침착 (deposition) 이 포함된다. 예를 들어, 제한된 또는 감소된 갯수의 형질 세포를 포함하는 배양은 세포 분류기를 이용해 단세포 침착으로 또는, 1, 2, 3 개 또는 더 많은 세포, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 세포가 마이크로타이터 배양 플레이트의 웰마다 존재하도록 충분한 배양 배지를 이용해 형질 세포의 현탁액을 희석하여 달성될 수 있다.
한 구현예에서, 단일 형질 세포가 배양된다. 단일 형질 세포에 의해 생산된 항체의 모노클로날 특성을 감안하면, 단세포 배양에서 형질 세포를 배양하는 것은 모노클로날 항체 집단을 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 단세포 배양으로 배양하는 단계를 포함하는 형질 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단세포 배양" 은 "단일 형질 세포를 배양함" 과 호환되어 사용되며, 대체로 단일 형질 세포를 포함하는 배양과 관련된다. 따라서, 다중-웰 플레이트, 예를 들어 96-웰, 384-웰 플레이트 또는 1536-웰 플레이트에서, 대부분의 웰은 단일 형질 세포를 포함할 것이고, 일부는 형질 세포를 포함하지 않을 것이고, 또다른 일부는 하나 이상의 형질 세포를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 형질 세포는 웰 당 평균 1 개 미만의 세포, 예를 들어, 0.8 개 세포/웰, 0.6 개 세포/웰, 0.5 개 세포/웰, 0.3 개 세포/웰 또는 0.1 개 세포/웰이 있는 배양에서 배양될 수 있다. 배양에서 단세포를 수득하는 기법은 상기 기재된 것과 유사하나, 단 여기서 마이크로타이터 웰 당 평균 1 개 또는 1 개 미만의 세포가 존재한다.
본 발명은 추가로, 항체 또는 항체 분절을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 임의의 방법에 따라 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계, 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계, 생산되는 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계 및 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
불멸화 (Traggiai et al., 2004, Nat Med 10:871-875; Lanzavecchia et al, 2007, Curr Opin Biotechnol. 18:523-528) 에 의해 항체 생산 세포의 클론들로 증대될 수 있는 기억 B 세포와는 달리, 형질 세포는 분할하지 않으며, 자극되거나 또는 불멸화되지 않는다. 따라서, 임의의 의미있는 수단에서 이들 "항체 공장" 의 사용을 활용하기 위해서는, 형질 세포는 배양에서 살아남은 채로 있어야 한다. 형질 세포는 연속적인 방식으로 항체를 생산 및 분비하며, 따라서 항체 집단의 크기는 시간의 함수로 증대된다. 형질 세포는 생체내에서 상당히 긴 기간 동안 생존하지만, 이들은 시험관내에서는 1 일을 넘겨 더 길게 생존하지는 않는다 (실험 데이터는 나타내지 않음). 따라서, 본 발명은, 이에 제한되지 않으나 단일 형질 세포를 포함하는 형질 세포를, 배양된 형질 세포의 생존을 연장시키는 외인성 구성성분 또는 구성성분들을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 배양된 형질 세포의 생존은, 항체가 항체의 특징분석에 필요한 양으로 생산되도록, 즉 배양 배지가, 이에 제한되지 않으나 결합 검정, 중화 검정 또는 항체의 기능을 알아내거나 또는 그렇지 않으면 특징분석하는 기타 검정을 포함하는 스크리닝 검정에 이용될 수 있도록 충분한 항체를 포함하도록, 충분한 시간 동안 연장된다. 이어서, 원하는 특이성의 항체를 포함하는 배양은 단리되고, 면역글로불린 유전자가 증폭, 서열분석 및 발현되어 모노클로날 항체를 생산할 수 있게 된다.
배양 내에서, 이에 제한되지 않으나 단일 형질 세포를 포함하는 형질 세포의 생존은 단기간 또는 장기간 동안 연장될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단기간" 은 2 일 이상 내지 약 9 일의 기간, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 약 9 일을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "장기간" 은 10 일 이상의 기간, 예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 약 150 일을 지칭한다.
단기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은 형질 세포의 생존을 장기간 동안 유지할 때만큼 많은 항체를 생산하지는 못하지만, 본원에 기재된 바와 같이 단기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은 더욱 용이하고, 더욱 신속하고 더욱 경제적이며, 민감한 검정에서 항체를 스크리닝함에 있어서 특히 유용하다. 장기간 동안 형질 세포의 생존을 연장하는 것은, 항체의 특징 분석이 다중 스크리닝 검정 또는 낮은 감수성의 검정을 필요로 하는 상황에 특히 적합하다.
한 구현예에서, 배양 배지 내에 존재하는 외인성 구성성분은 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 동안 연장한다. 또다른 구현예에서, 배양 배지 내에 존재하는 외인성 구성성분은 배양된 형질 세포의 생존을 장기간 동안 연장한다. 외인성 구성성분은 형질 세포 또는 하나 이상의 비-형질-세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드일 수 있다.
배양된 형질 세포의 생존 연장에 유용한 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 리간드의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 싸이토카인, 케모카인 및 기타 리간드가 포함된다. 한 구현예에서, 상기 리간드는 IL-5, IL-6, 기질 세포-유도성 인자-1 (SDF-1), TNF-α, 또는 CD44 에 대한 리간드, 예를 들어 히알루론산이다. 또다른 구현예에서, 외인성 구성성분은 IL-5, IL-6, 기질 세포-유도성 인자-1 (SDF-1), TNF-α, CD44 에 대한 리간드, 예를 들어 히알루론산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드를 포함하며, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어서 유용하다.
배양된 형질 세포의 생존 연장에 유용한 비-형질 세포의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 간엽 기질 세포, 섬유아세포 (fibroblast) 또는 파골세포가 포함된다. 한 구현예에서, 비-형질 세포는 간엽 기질 세포, 선유아세포 또는 파골세포이며, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어 유용하다. 또다른 구현예에서, 비-형질 세포는 간엽 기질 세포이고, 배양된 형질 세포의 생존을 단기간 또는 장기간 동안 연장함에 있어 유용하다. 간엽 기질 세포는, 이에 제한되지 않으나 인간 간엽 기질 세포를 포함하는 포유류 간엽 기질 세포일 수 있다. 간엽 기질 세포는 선택적으로는 배양에 사용하기 전에 불멸화될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 3 내지 약 7 일 동안 또는 약 5 내지 약 9 일 동안 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일, 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 50 일 이상 하나 이상의 유형의 비-형질-세포의 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일, 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 50 일 이상 간엽 기질 세포 존재 하의 배양에서 배양된다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 예를 들어 단세포 배양에서, 약 5 내지 7 일, 또는 약 10 일, 또는 약 15 일, 또는 약 20 일, 또는 약 25 일, 또는 약 30 일, 또는 약 35 일 또는 약 40 일, 또는 약 45 일, 또는 약 50 일, 또는 약 55 일 또는 약 60 일, 또는 약 65 일, 또는 70 일 이상 하나 이상의 유형의 비-형질 세포 및 형질 세포에 의해 발현되는 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 존재 하의 배양에서 배양된다.
한 구현예에서, 배양된 세포의 플레이팅 효율은 약 30% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 40% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 50% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 55% 이상일 수 있고, 또다른 구현예에서 상기 플레이팅 효율은 약 60% 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플레이팅 효율" 은 상청액 내에 검출가능한 양의 항체를 생산하기에 충분히 길게 생존하는 형질 세포의 백분율에 관련된다.
배양된 형질 세포는 원하는 종으로부터 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 형질 세포는 마우스, 래트, 토끼, 낙타 또는 원숭이 형질 세포이다. 또다른 구현예에서, 배양된 형질 세포는 인간 형질 세포이고, 생산된 항체는 인간 항체이다. 또다른 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 형질 세포를 단세포 배양으로 배양하여 생산된다.
형질 세포, 예를 들어 인간 형질 세포는 인간의 말초혈로부터 단리될 수 있다. 상기 인간 형질 세포는 "말초혈 형질 세포" 또는 "순환 형질 세포" 로 언급될 수 있다. 형질 세포, 예를 들어 인간 형질 세포는 또한 인간의 골수, 조직 또는 이에 제한되지 않지만 활액, 뇌척수액 및 삼출액을 포함하는 체액으로부터 단리될 수 있다. 용어 "조직" 은 인체 내 존재하는 임의의 조직을 포괄하는 것을 의도로 하며, 심장 조직, 신경 조직, 근육 조직, 상피, 연결 조직 및 흉선, 비장 및 림프절과 같은 림프 장기를 포함할 수 있다.
형질 세포는 일반적으로 CD138 의 발현, 및 선택적으로는 CD27, CD38, CD9, CD44 및 MHC 클래스 II 분자의 추가적인 발현을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 세포는 CD138 의 발현에 따라 말초혈, 조직, 골수 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. CD27, CD38, CD9, CD44 및 MHC 클래스 II 분자와 같은 표면 마커는 또한, 단리 과정을 개선하고 형질 세포 하위셋트를 동정하기 위해 CD138 에 추가하여 이용될 수 있다 (Arce et al., 2004, J Leukoc Biol, 75:1022-1028). 또다른 구현예에서, 형질 세포는 자석 마이크로-비드를 이용하여 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 고정화된 항-CD 138 항체로 코팅되어 있는 자석 마이크로-비드를 이용하여 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 자석 마이크로-비드를 이용한 형질 세포의 풍부화는 세포 분류에 후속될 수 있다.
한 구현예에서, 형질 세포는 백신접종 후 인간 공여체의 말초혈로부터 단리될 수 있다. 백신접종은 면역 응답성을 유도할 수 있는 임의의 항원의 투여를 지칭한다. 백신은 현재 공지되어 있거나 또는 이후 당업자에 의해 이용가능한 임의의 백신일 수 있고, 이에 제한되지 않으나 파상풍 독소, 인플루엔자, 황열, 파상풍-디프테리아, B 형 간염, 종두 및 암 백신이 포함된다. 또다른 구현예에서, 백신은 부스터 백신일 수 있다. 형질 세포는 백신접종 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일 후 또는 더 지나서 공여자로부터 단리될 수 있다. 한 구현예에서, 형질 세포는 공지된 독소에 응답하는 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 미지의 병원체에 응답하는 공여자로부터 단리될 수 있다. 추가 구현예에서 형질 세포는 알러지가 있는 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 항정 상태 하의 공여자로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 형질 세포는 자가면역 질환이 있는 공여자로부터 단리될 수 있다.
또다른 구현예에서, 형질 세포는 B 세포의 자극에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다. 상기 자극은 나이브 (naive) 또는 기억 B 세포의 폴리클로날 또는 항원-특이적 자극을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다 (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199-2202).
본 발명의 방법은 임의의 이소타입의 임의의 항체를 분비하는 형질 세포 배양에 이용될 수 있다. 한 구현예에서 형질 세포는 IgG 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgA 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgM 형질 세포일 수 있고, 또다른 구현예에서 형질 세포는 IgD 형질 세포일 수 있고, 추가 구현예에서 형질 세포는 IgE 형질 세포일 수 있다. 또다른 구현예에서, 단리된 집단의 형질 세포는 두가지 이상의 이소타입을 포함하는 혼합된 집단의 형질 세포일 수 있다.
단리된 인간 형질 세포는 효소 연계 면역흡광 스팟 (ELISPOT) 검정 (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199-2202) 을 이용하여 계수될 수 있다. 상기 검정은 관심대상의 세포에 의해 분비되는 생성물을 가시화함으로써 결과를 제공하며, 이로써 검정에 의해 제공된 각각의 스팟은 단세포를 나타낸다.
한 구현예에서, 인간 형질 세포는 제한 희석에 의해 또는 단세포 침착에 의해 단세포로서 시딩될 수 있다. 한 국면에서, 인간 형질 세포는 간엽 기질 세포의 존재 하에 단세포로서 시딩될 수 있다. 또다른 구현예에서, 인간 형질 세포는 폴리클로날 배양으로서 시딩될 수 있다. 형질 세포는 간엽 기질 세포의 존재 하에 폴리클로날 세포 배양으로서 시딩될 수 있다. 폴리클로날 인간 형질 세포 배양은, 대안적으로는 제한 희석을 이용하여 단세포 배양으로 분리될 수 있다. 또다른 국면에서, 폴리클로날 인간 형질 세포 배양은 단세포 침착을 이용하여 단세포 배양으로 분리될 수 있다.
간엽 기질 세포는 선유아세포-형 세포이나, 선유아세포보다 더 큰 분화 잠재성을 갖고 있으며, 조골세포, 연골 세포 및 지방 세포로 분화할 수 있다. 간엽 기질 세포는 이종성 집단으로서 발견되며, 이들이 잔류하는 조직의 지지체적 구조를 형성한다. 골수에서, 간엽 기질 세포는 조혈 세포의 성장 및 분화, 백혈구 세포의 유지에 필요하다. 초대 간엽 기질 세포는 적당한 배지에서 단리될 수 있고, 수회 계대 동안 그러나 노쇠 전 제한된 시간 동안만 배양될 수 있다. 텔로머라아제 역전사효소 (TERT) 를 이용한 형질전환은 간엽 기질 세포의 생리학적 성장 속도 및 기능적 특징을 유지하면서, 시험관내에서 무기한으로 증식하는 간엽 기질 세포를 불멸화하기 위해 이용되어 왔다.
배양에 사용되는 간엽 기질 세포는 골수-유도성 간엽 기질 세포일 수 있다. 간엽 기질 세포는 포유류 간엽 기질 세포, 예를 들어 인간 간엽 기질 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 간엽 기질 세포는 적당한 배지에서의 배양에 의한 착생 골수 세포로부터 단리될 수 있다. 상기 배지는 히드로코르티손을 포함할 수 있다. 간엽 기질 세포는 또한 다른 조직으로부터 유도될 수 있다.
실용적인 이유로, 간엽 기질 세포는 본 발명의 방법에서의 이용 전에 불멸화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "불멸화된" 은 간엽 기질 세포가, 접촉으로 인한 성장 저해를 견뎌내는 역량을 포함하는, 형질 세포를 지속할 수 있도록 하는 모든 특징들을 유지하면서, 개선된 증식 역량을 갖는 것을 의미한다. 한 구현예에서, 간엽 기질 세포는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 1 주간 생존할 수 있다. 또다른 구현예에서, 불멸화된 간엽 기질 세포는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 2 주 동안, 또는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 3 주 동안, 또는 컨플루언스에 도달한 후 적어도 약 4 주 동안 생존할 수 있다.
간엽 기질 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 불멸화될 수 있다. 한 구현예에서, 간엽 기질 세포는 텔로머라아제 역전사효소 유전자를 이용한 형질전환에 의해 불멸화된다. 또다른 구현예에서, 간엽 기질 세포는 [Mihara et al., 2003 Br J Haematol 120: 846-849] 에 기재된 방법에 따라 TERT 유전자를 이용한 형질전환에 의해 불멸화될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 항체 또는 항체 분절을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계, 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계, 생산되는 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계 및 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분절" 및 "항체 분절" 은 호환되어 이용되며, 본 발명의 항체의 임의의 분절을 지칭한다. 한 구현예에서, 항체 분절은 항체의 항원-결합 활성을 보유한다. 또다른 구현예에서, 항체 분절은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개 또는 더 많은 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예시 항체 분절은 하나 이상의 Fc, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 분절, 중쇄, 경쇄, 힌지 (hinge) 영역, 항원 결합 부위, 단쇄 항체 또는 이들의 임의의 일부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 은 이에 제한되지 않으나 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA 를 포함하는 모든 형태의 핵산을 포괄한다. 항체 또는 항체 분절의 클로닝 및 이종성 발현은 당업자의 재량에 따라 분자생물학 및 재조합체 DNA 의 통상적인 기법을 이용하여 행해질 수 있다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 JMol Biol 358, 764-772). 상기 기법은 문헌, 예를 들어 [Sambrook, 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition] 에 전부 설명되어 있다. VH/VL 서열의 회수 및 발현을 위해서는 [Tiller et al., J Immunol Methods 2008 329: 112-124] 의 방법이 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 항체는 진핵 세포에서 적당한 벡터 또는 바이러스를 이용하여 발현된다. 진핵 세포는 CHO, 293T, 293F, 또는 효모 세포일 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체는 원핵 세포에서 적당한 벡터 또는 파지를 이용하여 발현된다. 원핵 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 대장균 (E. coli) 세포일 수 있다. 추가 구현예에서, 이종성 발현 시스템은 셀 프리 시스템 (cell free system) 일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 항체 및 항체 분절은 널리 확립된 방법론을 이용하여 용이하게 단리될 수 있다 (Coligan et al., Eds. Current Protocol in Immunology 1: 2.7). 한 구현예에서, 본 발명의, 모노클로날 항체 또는 항체 분절을 포함하는 항체 또는 항체 분절은 원심분리 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 항체 분절은 그들의 결합 특이성에 따라 단리될 수 있다. 예를 들어 항체는 적당한 고정화된 항원을 포함하는 고체 지지체에 적용됨으로써 단리될 수 있다. 추가 구현예에서, 항체는, 일부의 경우 고정될 수 있는 항-IgG, -IgE, -IgA, -IgD 또는 -IgM 항체를 이용하여 단리될 수 있다.
Ig 또는 특이적인 항체를 분비하는 형질 세포는 면역친화성 방법으로 단리될 수 있다. 먼저, 분비된 생성물은 분비 세포의 표면 상에 적당한 공유결합으로 결합된 포획 시약을 이용하여 포획될 수 있다. 이어서, 포획된 생성물은 형광으로 표지된 2 차 항체 또는 항원을 이용하여 밝혀질 수 있다 (Manz et al., 1998 Int Immunol 10, 1703-1711).
항체 특징분석
형질 세포는 표면 면역글로불린을 발현하지 않으며, 따라서 이소타입 또는 항원 특이성에 따라 선별될 수 없다. 따라서, 형질 세포에 의해 생산된 항체는 특징분석되기 위해서는 단리되어야만 한다. 현재, 형질 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 당업계에서 원래 사용되는 두가지 방법이 있다. 그들 중 첫번째는, 면역 공여자의 전체 골수로부터 제공되는 항체의 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것이다 (Williamson et al., 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4141-4145). 그러나, 상기 방법은 골수 시료의 입수로 인해 제한된다.
두번째 방법은, 단세포 PCR 을 이용하여 개별 형질 세포로부터 Ig 유전자 회수에 후속해 부스터 면역화 후, 순환 형질 세포의 단리를 수반한다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 J Mol Biol 358, 764- 772). 상기 방법은 부스터 면역화 후 6 내지 8 일째에 순환 형질 세포의 크기를 가늠할 수 있는 분획이 면역화 항원에 대해 특이적이라는 사실에 근거한다. 그러나, 상기 접근법은 항체 특이성 평가 전에 집중적인 유전자 클로닝 및 발현 작업을 필요로 하며, 따라서 형질 세포 응답성이 복합 병원체와 같은 다중적 면역원에 대한 것일 때에는 별로 실용적이지 않다. 따라서, 인간 형질 세포의 장기간 배양 시스템의 개발은 시험관내 결합 검정, 기능 검정 및 추가로 항체 특징 분석을 행하기에 충분한 항체를 회수하고, 관심대상의 항체를 제공하는 형질 세포를 선별하기 위해 특별히 유용하다.
형질 세포 또는 기타 항체 분비 세포로부터 항체를 단리하는 대안적인 방법은 마이크로조작 (micromanipulation) 을 근거로 하며, 세포를 반고체 배지 중에 (Harriman WD et al J Immunol Methods 341; 135-145 2009) 또는 마이크로어레이에 (Jin A et al Nat Medicine 15; 1088 2009) 플레이팅하는 단계를 포함하며, 분비된 항체는 형광 프로브를 이용하여 제자리에서 검출된다. 일단 동정되면, 형질 세포는 마이크로조작에 의해 회수되고, VH 및 VL 유전자는 증폭되고 서열분석된다. 단기간 배양 및 분비된 항체의 국소적 검출을 기반으로 하는 상기 방법들은 항체 분비 세포의 마이크로조작을 위한 특별한 장비를 필요로 하며, 바이러스 또는 독소 중화와 같은 기능적 특성에 대해 항체를 시험하기에는 적합하지 않다. 본 발명의 방법은 임의의 마이크로조작을 기반으로 하지도, 그것을 필요로 하지도 않으며, 생산되는 항체로 하여금, 이에 제한되지 않으나 결합 검정, 기능 검정 및/또는 중화 검정을 포함하는 다중 검정에서 스크리닝되도록 한다. 한 구현예에서, 본 발명은 형질 세포를 제한된 갯수로 배양하는 단계 및 항체를 특징분석하는 단계를 포함하며, 항체 분비 형질 세포를 회수하기 위한 마이크로조작을 포함하지 않는, 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법으로 단리된 항체 또는 항체 분절의 특징분석을 포함한다. 한 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절의 결합 특이성을 알아내는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프를 알아내는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 항체 또는 항체 분절 및/또는 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프의 결합 특이성은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 알아낼 수 있다. 한 구현예에서, 결합 특이성 및/또는 인식되는 에피토프는 단리된 항체 또는 항체 분절을 표지하고, 표지된 항체 또는 항체 분절을 항원 라이브러리에 제시하고, 그의 인식 항원에 결합된 표지된 항체 또는 항체 분절을 검출함으로써 알아낼 수 있다. 또다른 구현예에서, 표지된 항체 또는 항체 분절은 고정화된 항원 분자를 포함하는 정제 컬럼에 적용될 수 있고, 컬럼 상의 표지된 항체 또는 항체 분절의 존재성 또는 부재성은 항체 특이성 및/또는 인식되는 에피토프의 표식으로 이용될 수 있다. 특별한 항원으로 면역화되었거나 또는 특별한 항원에 노출된 공여자의 말초혈로부터 단리된 형질 세포가 항원 또는 병원체에 결합하는 항체 또는 항체 분절을 생산할 것이라는 점은 당업자에게 자명하다. 그럼에도 불구하고, 병원체, 특히 복합 병원체는 다수의 항원을 포함할 공산이 크며, 특별한 항체 또는 항체 분절의 결합 특이성 및/또는 인식되는 에피토프는 여전히 밝혀내야할 수도 있다.
본 발명의 단세포 배양 방법은 항체를 인코딩하는 핵산이 널리 확립된 방법론을 이용하여 용이하게 단리될 수 있는 특이적 항체를 생산하는 단일 형질 세포를 제공한다 (Wrammert et al., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al., 2006 J Mol Biol 358, 764-772). 한 구현예에서, 항체 특징분석은 항체 또는 항체 분절을 인코딩하는 핵산의 서열분석을 수반할 수 있다. 핵산 서열분석은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 행해질 수 있다. 한 구현예에서, 핵산 서열분석은 사슬 종결을 이용하여 행해질 수 있으며, 여기서 방사활성, 형광 또는 기타 염료가 이용될 수 있다. 또다른 국면에서, 핵산 서열분석은 자동화된 서열분석 방법을 이용하여 행해질 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 특징분석은 항체 단백질 서열분석을 수반할 수 있다. 항체 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 서열분석될 수 있다. 한 구현예에서, 항체 단백질은 N-말단 분석법, C-말단 분석법 또는 Edman 분해에 의해 서열분석될 수 있다. N-말단 분석법은 하기 단계를 포함할 수 있다: i) 단백질을 아아미노 말단 아미노산을 선별적으로 표지할 시약과 반응시키는 단계; ii) 단백질을 가수분해하는 단계; 및 iii) 크로마토그래피 및 표준과의 비교에 의해 아미노 말단 아미노산을 알아내는 단계. 상기 국면에서, 이에 제한되지 않으나, 생거 (Sanger's) 시약, 댄실 유도체, 예컨대 댄실 클로라이드 및 페닐이소티오시아네이트를 포함하는 임의의 표지 시약이 이용될 수 있다. C-말단 분석법은 단백질을 카르복시펩티다아제와 인큐베이션시키는 단계 및 시료를 적당한 간격으로 취해 아미노산 농도 대 시간의 그래프를 작성하는 단계를 포함할 수 있다.
항체 단백질의 서열 분석에 후속하여, 본 발명은 또한 동정된 항체 서열을 근거로 결합 단백질을 화학적으로 합성하는 것을 포함할 수 있다. 화학물 합성은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 행해질 수 있다. 한 구현예에서, 화학물 합성은 아미노산의 카르복시기를 불용성 고체 지지체에 부착시키고, 고정화된 항체를 서열 내 후속 항체의 카르복시기와 반응시킴으로써 행해질 수 있다. 이어서, 상기 방법은 필요한 아미노산 서열이 제조될 때까지 반복될 수 있고, 완결 단백질은 고체 지지체로부터 끊을 수 있으며, 올바른 단백질 폴딩 (folding) 이 되도록 하거나 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 포함한다.
항체의 약제학적 용도
본 발명은 예를 들어 알러지, 감염성 상태 또는 질환, 암 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료에서 사용하기 위한, 치료요법에서의 사용을 위해 본 발명의 임의의 방법으로 생산되는 항체 또는 항체 분절을 제공한다.
용어 "알러지" 에는, 이에 제한되지 않으나 알러지성 피부염, 알러지성 비염, 혈관부종, 과민증, 아스피린 민감성, 천식, 국소 피부염, 조류 알러지, 카나리아 알러지, 고양이 알러지, 화학물 민감성, 닭 알러지, 결막염, 만성 피로, 접촉성 피부염, 화장품 알러지, 우유 알러지, 피부염, 개 알러지, 약물 반응, 오리 알러지, 먼지 알러지, 진드기 알러지, 습진, 거위 알러지, 유리 알러지, 건초열, 두통, 심율동이상 (heart irregularity), 두드러기, 아동에서의 활동항진, 저혈당증, 호흡 및 접촉 알레르겐, 락토오스 과민증, 편두통 두통, 우유 알러지, 응애 알러지, 두드러기, 앵무새 알러지, 잉꼬 알러지기, 지속성 비염, 비둘기 알러지, 화분 알러지, 비염, 옻나무 알러지, 살리실레이트 민감성, 부비동염, 피부 발진, 참새 알러지, 칠면조 알러지, 유카리아 (ucaria), 및 효모 알러지를 포함하는, 비-기생충성 항원에 의해 야기되는 모든 형태의 과민감성 반응이 포함된다.
용어 "감염성 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생체 및 진균을 포함하는 병원체성 미생물 제제의 존재로 인한 임의의 임상적으로 분명한 질환이 포함된다. 용어 "감염성 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나 AIDS, AIDS 관련 복합질환, 수두, 일반적인 감기, 싸이토메갈로바이러스 감염, 콜로라도 틱 열 (Colorado tick fever), 뎅기열, 에볼라 출혈열, 수족구병, 간염, 헤르페스 단순포진, 대상 포진, HPV, 인플루엔자 (독감), 라사열, 홍역, 말버그 (marburg) 출혈열, 전염성 단핵증, 볼거리, 노로바이러스, 소아마비, 진행성 다소성 백질뇌병증, 광견병, 풍진, SARS, 두창 (바리올라; variola), 바이러스성 뇌염, 바이러스상 장염, 바이러스성 뇌수막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일 병 (west nile disease), 황열, 탄저병, 박테리아성 뇌수막염, 보툴리즘증 (botulism), 브루셀라병, 캄필로박터병, 고양이 발톱 병 (cat scratch disease), 콜레아, 디프테리아, 발진 티푸스, 임질, 농가진-레지오넬라증 (impetigo-legionellosis), 나병 (한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임 관절염, 멜리오이도증, 류마티스열; MRSA 감염, 노카르디아증, 백일해 (Whooping Cough), 흑사병, 폐구균성 폐렴, 앵무병, Q 열 (Q fever), 록키산 홍변열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 세균성이질, 매독, 파상풍, 트라코마 (trachoma), 결핵, 야토병, 장티푸스, 티푸스-요관염 (typhus-urinary tract infections), 아프리카 수면병, 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 샤가스병, 간흡충증, 크립토스포리디움증, 낭미충증, 긴촌충증, 연충증, 단포조충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유 생활 아메바 감염, 람블편모충증, 악구층증, 왜소조충증, 등포자충증, 흑열병, 리슈만편모충증, 말라리아, 요꼬가와흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이 기생증, 요충 감염, 공수병, 주혈흡충중, 조충증, 고양이회충증, 주혈원충증, 톡소포자충증, 선모충증, 편충증, 트리코모나스증, 트리파노소마증, 아스페르길루스증, 효모균증, 칸디다증, 콕시디오이드증, 효모균증, 히스토플라즈마증, 발 무좀, 전염성 해면상뇌증, 소 해면상 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥 병, 쿠루 (kuru), 치명적 가족성 불면증 및 알퍼 증후군 (alpers syndrome) 이 포함된다.
용어 "자가면역 질환" 에는, 이에 제한되지 않으나, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브 병, 경피증, 셀리악병, 크론 병, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 굿파스튜어 증후군, 애디슨 병, 베게너 육아종증, 담즙성 간경변, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 류마티스 관절염, 자가면역 갑상선 질환, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 건선성 관절염, 교감성 안염, 자가면역 신경염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 림프증식 증후군, 항인지질항체 증후군, 루푸스, 다내분기 결핍 증후군, 1 형 다내분기 결핍 증후군, 2 형 다내분기 결핍 증후군, 면역 혈소판감소 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근무력증, 복합 교원성 질환, 원발성 사구체신염, 백반증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 만성소화장애증, 애르마티티스 헤르페티포르미스 (aermatitis herpetiformis), 엠피구스 (emphigus), 천포창, 낙엽상 천포창, 수포성 유천포창, 자가면역 심근염증, 자가면역 맥관육종, 자가면역 안 질환, 원형 탈모증, 자가면역 동맥경화, 베체트병, 자가면역 척추염, 자가면역 혈우병, 자가면역 사이질 방광염, 자가면역 요붕증, 자가면역 자궁내막증, 다발연골염, 강직성 척추염, 자가면역 담마진, 신생물연관 자가면역 증후군, 피부근염, 밀러 피셔 증후군 및 IgA 신염을 포함하는, 면역계가 자신의 항원에 대해 반응하는 모든 형태의 질환이 포함된다.
본 발명은 또한 알러지, 감염성 상태 또는 질환, 암 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료를 위한 의약 제조에서의 사용을 위해 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절을 투여하는 단계를 포함하는, 알러지, 감염성 상태 또는 질환 및 자가면역 상태 또는 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 항체 또는 항체 분절 또는 상기 항체 또는 항체 분절을 인코딩하는 핵산을 약제학적으로 허용되는 조성물로 제형화하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 하나 이상의 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 2, 3, 4, 5 개, 또는 그보다 더 많은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 투여를 허용하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독성이어서는 안 된다. 적당한 담체에는 큰, 느리게 물질대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자가 포함된다.
특정 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또한 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질은 그와 같은 조성물에 존재할 수 있고, 약제학적 조성물이 대상체에 의한 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 서스펜션으로 제형화되도록 할 수 있다.
약제학적 조성물은 이에 제한되지 않으나, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강, 장, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 5.5 내지 8.5, 일부 구현예에서는 6 내지 8, 추가 구현예에서는 약 7 의 pH 를 가질 수 있다. 상기 pH 는 완충액의 이용으로 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 발열체가 없는 것일 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절은 진단 시약 제조를 위해 진단 부형제와 조합될 수 있다. 한 구현예에서, 진단 시약은 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 하나 이상의 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다. 예를 들어, 진단 시약은 2, 3, 4, 5 개, 또는 그보다 더 많은, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 함유할 수 있다.
진단 부형제는 환자에 대한 진단 시약의 투여를 가능케 하기 위해 투여를 허용하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독성이어서는 안 된다. 적당한 담체는 큰, 느리게 물질대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 시약은 약제학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질이 존재할 수 있다.
진단 시약은 생체내, 시험관내 또는 생체외 진단에 이용될 수 있다. 생체내 사용을 위해, 진단 시약은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강, 장 (enteral), 설하, 질내 또는 직장 경로를 비제한적으로 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
진단 시약은 5.5 내지 8.5, 일부 구현예에서는 6 내지 8, 추가 구현예에서는 약 7 의 pH 를 가질 수 있다. 상기 pH 는 완충액의 이용으로 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 발열체가 없는 것일 수 있다. 진단 시약은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
한 구현예에서, 진단 시약은 항체 표지를 포함할 수 있다. 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 합텐 (hapten) 및 효소 표지를 포함하는 생물학적 표지로부터 선택될 수 있다.
진단 시약은 특별한 항원의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 상기 정보는 특별한 병원체의 존재 또는 부재를 알아내기 위해, 따라서 특별한 장애 또는 질환의 존재성을 알아내기 위해 외삽될 수 있다. 본 발명의 한 국면에서, 질환은 알러지, 감염성 상태 또는 질환 또는 자가면역 상태 또는 질환일 수 있다. 진단 시약을 이용하여 수득한 정보는 특별한 환자의 적당한 치료 과정을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 진단 시약은 알레르겐의 존재 또는 부재를 알아내기 위해 이용될 수 있다.
용어 "알레르겐" 은, 이에 제한되지 않으나 고양이, 모피, 비듬, 바퀴벌레, 양모, 진드기, 진드기 분비물, 페니실린, 술폰아미드, 살리실레이트, 국소 마취제를 포함하는 마취제, 셀러리, 큰뿌리 셀러리, 곡식, 옥수수, 밀, 난류 (eggs), 알부민, 과일, 호박, 콩과식물, 콩류, 완두콩, 넛트, 땅콩, 대두, 우유, 해물, 참깨, 콩, 견과류, 호두, 아몬드, 곤충의 침, 벌침독, 말벌침 독, 모기침, 곰팡이 포자, 라텍스, 금속, 식물 꽃가루, 독보리 및 큰조아재비를 포함하는 풀, 돼지풀, 질경이, 쐐기풀, 쑥, 명아주 및 수영을 포함하는 잡초류, 자작나무, 오리나무, 개암나무, 서어나무, 칠엽수, 버드나무, 포플라, 플라타너스, 피나무, 올리브나무, 노간주나무를 포함하는 나무를 포함하는, 개체에서 과민감성 반응을 자극할 수 있는 임의의 비-기생충성 항원을 포함한다.
단백질 정제에서의 단리된 항체의 사용
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 단리된 항체 또는 항체 분절을 고체 지지체 상에 고정화하는 방법을 포함한다. 용어 "고체 지지체" 는 고체 및 반-고체 지지체를 모두 포함하며, 단리된 항체 또는 항체 분절을 고정화하기 위해 이용될 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 고체 지지체는, 유리 구체 또는 자석 비드, 컬럼, 관, 마이크로타이터 플레이트의 웰 또는 플라스틱 시트를 포함하는, 겔, 메쉬, 비드를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 고정화된 항체 또는 항체 분절은 단백질 정제에 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 고정화된 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 이용될 수 있다. 관심대상의 단백질을 함유하는 용액은 관심 대상의 단백질에 대한 친화성이 공지되어 있는, 본 발명의 임의의 방법으로 생산된 고정화된 항체 또는 항체 분절을 포함하는 고체 지지체에 적용될 수 있다. 항체 또는 항체 분절은, 예를 들어 일부 구현예에서 컬럼 내 유지될 수 있는 비드 상에 고정화될 수 있다.
일반적인 내용
용어 "포함하는" 은 "함유하는" 뿐만 아니라 "이루어지는" 을 포함하며, 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X만으로 이루어질 수 있거나 부가적인 것, 예컨대 X + Y를 포함할 수 있다.
단어 "실질적으로" 는 "완전히"를 배제하지는 않으며, 예컨대 Y 가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y 가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 χ 와 관련된 용어 "약" 은, 예를 들어 χ±10% 를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "질환" 은, 용어 "장애" 및 "상태"(의학적 상태로서)와 일반적으로 같은 의미를 의도하는 것이며 호환되어 사용되는데, 이들 모두 정상적인 기능을 손상시키는, 인간이나 동물의 신체 또는 그 일부 중 하나의 비정상적인 상태를 반영하고, 구별되는 징후 및 증상에 의해 통상적으로 나타나며, 인간이나 동물의 수명 또는 삶의 질을 감소시킨다는 점에서 그러하다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 환자의 "치료" 에 대한 언급에는 예방 및 치료요법을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "환자" 는 인간을 포함한 모든 포유동물을 의미한다.
실시예
본 발명의 예시적인 구현예들이 하기의 실시예에 제공된다. 하기 실시예는 단지 예시로써 통상의 기술을 가진 자가 본 발명을 사용하는 것을 돕기 위해 제공되는 것이다. 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
1.
간엽
기질 세포 배양에서의 형질 세포
본 발명자들은 표준 방법 (Pittenger et al, 1999, Science 284:143-147; Bieback et al, 2004 Stem cells 22:625-634; Dominici et al, 2006, Cytotherapy 8:315-317; Sotiropoulou et al 2006, Stem Cells 24:462-471) 에 따라 정상 골수로부터 확립된 인간 간엽 기질 세포의 초대 배양이 항체 분비 세포를 포함한다는 점을 관찰했다. 상기 세포들은 ELISPOT 로 검출했으며, 형질 세포로 동정되었다. 간엽 기질 세포 배양 내 형질 세포는 시험관내에서 3 주 후에도 여전히 검출가능했다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예
2.
50 일까지의
인간 형질 세포의 배양
개별 형질 세포가 살아있는 채로 유지되어 생산된 항체가 배양 시간의 함수로서 누적될 수 있는 배양 시스템을 개발하기 위해, 본 발명자들은 표준 방법에 의해 제조된 초대 간엽 기질 세포의 상이한 공급원들을 시험했다. 간략하게, 조직 배양 플라스크를 FCS 로 1 시간 동안 예비코팅했다. 골수 세포들은 30% FCS 및 10-8M Dexamethasone 로 보충된 완전 IMDM 배지에서 밤새 유착되도록 했다. 비유착 세포들은 헹구어내고, 유착 세포들은 완전 DMEM-10% FCS 에서 배양했다. 시험한 7 개의 세포주들 중 3 개가 인간 형질 세포의 생존을 지지했으나, 수 회 계대 후에는 증식을 정지했다. 후속 실험에서, 텔로머라아제 역전사효소 유전자 (MSC-TERT) 를 이용해 형질전환해 불멸화된 간엽 기질 세포를 이용했다. 상기 세포들은 [Mihara et al. (Br J Haematol 2003, 120, 846-849)] 에 따라 단리했다.
말초혈 단핵 세포들은 PE-표지된 항-CD 138 모노클로날 항체로 염색하고, 항-PE 마이크로 비드 (Miltenyi) 를 이용해 풍부화하고, 세포 분류에 의해 추가로 정제하여 CD138-양성 세포를 단리했다. 회수된 IgG-분비 형질 세포의 갯수는 이소타입-특이적 ELISPOT 를 이용하여 알아냈다. 상이한 갯수의 CD138-양성 세포들을 10% 우태아 혈청 (Hyclone), 불필수 아미노산, 피루베이트 및 glutamax (GIBCO) 를 보충한 RPMI 1640 이 있는 96-웰 배양 플레이트 내의 간엽 기질 세포 단층에 시딩했다. 플레이팅시 수행된 ELISPOT 을 근거로, 도 1 에 제시된 배양은 7 개의 IgG-분비 세포를 포함했다. 배양 상청액의 절반을 상이한 시점에 수집했고, 신선한 배지로 교체했다. 추가로, 18 일 및 34 일째에는 배지를 완전히 제거하고 신선한 것으로 대체했다. 배양 당 IgG 의 1 일 생산 속도 및 형질 세포 당 추산되는 IgG 의 1 일 생산 속도를 알아냈다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배양 집단에 의해 생산되는 약 7 개의 세포인 IgG 의 양은 50 일에 걸쳐 배양 시간의 선형적 함수로서 증가했고, 676 pg/일의 생산 속도와 부합했고, 96 pg/세포/일의 생산으로 추산되었다.
실시예
3. 3 주간의 개별 형질 세포의 배양
말초혈 또는 골수 유래의 형질 세포는 PE-콘쥬게이션된 항-CD138 항체에 이어 항-PE 마이크로비드를 이용하고 세포 분류하여 단리하고, 96-웰 플레이트에 0.5 세포/웰로 간엽 기질 세포 단층 상에 시딩했다. IgG 포함 배양은 정기적인 샘플링 (sampling) 에 의해 22 내지 23 일의 기간 동안 모니터링했다. 배지는 16 일째에 교환했다. 모노클로날 배양에서의 IgG 생산 속도는 일정했고, 배양 전체 기간에 걸쳐 72 내지 134 pg/세포/일의 범위였다 (도 2a, 말초혈 유도성 (4 개 배양); 도 2b, 골수 유도성 (5 개 배양)).
5 회 제한 희석 실험에서, 혈액 및 골수 형질 세포의 플레이팅 효율은 30% 내지 65% 의 범위였다 (데이터는 나타내지 않음). 추가로, 폴리클로날 배양으로부터 회수된 형질 세포는 단세포 배양에 다시 플레이팅하면, 거기서 일정한 속도의 Ig 분비를 유지했다 (데이터는 나타내지 않음). IgG 의 선형적 누적은 일정하게 고속으로 IgG 를 분비하는 개별 세포의 보존과 부합했다. 배양된 형질 세포에 의한 IgG 생산은, TLR 아고니스트에 의해 자극된 기억 B 세포의 증식 및 분화를 완전하게 막는 수준의 조사에 의해 영향받지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예
4.
IgG
,
IgA
,
IgM
및
IgE 를
생산하는 형질 세포의 배양
IgG, IgA, IgM 및 IgE 를 생산하는 말초혈 CD138-양성 세포는 건강한 공여자로부터 단리했고, 617 회 복제 배양에 간엽 기질 세포 단층을 포함하는 384-웰 플레이트에 5 세포/웰로 플레이팅했다. 10 일째에, 배양 상청액을 이소타입-특이적 ELISA 를 이용하여 IgG, IgA, IgM 및 IgE 의 존재성에 대하여 시험했다. 네가지 이소타입의 전체량을 배양 상청액에서 측정했다 (도 3 참고). IgG, IgA, IgM 및 IgE 형질 세포에 대한 생산성의 중간값은 각각 10 일 동안 860, 770, 1100 및 1800 pg, 즉 86, 77, 110 및 180 pg/세포/일이었다.
실시예
5.
시험관내
형질 세포 생존의 효율
말초혈 유도성 인간 형질 세포를 CD138 발현에 따라 7 명의 공여자로부터 단리하고, 1 또는 25 세포/웰로 시딩했다. 배양 시작시 IgG-, IgA- 및 IgM-항체 분비 세포의 갯수는 이소타입 특이적 ELISPOT 로 계산했다. 플레이팅 효율은 프와종 분포 (Poisson distribution) 분석에 따라 IgG-, IgA- 및 IgM-항체 분비 세포 상에서 계산하고, IgG 에 대해서는 50% 내지 74%, IgA 에 대해서는 31% 내지 78%, IgM 에 대해서는 0 내지 26% 의 범위였다 (도 4 참고). 추가로, 폴리클로날 배양으로부터 회수된 형질 세포는 단세포 배양으로 다시 플레이팅되어, 거기서 일정한 속도의 IgG 분비를 유지했다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예
6. 희소
IgE
모노클로날
항체의 단리
형질 세포를 알러지성 개체의 말초혈로부터 단리하고, 10 개의 384-웰 마이크로플레이트 중의 hMSC-TERT 단층 상에 1 세포/웰로 플레이팅했다. 5 개의 배양 상청액이 IgE 생산에 대해 양성을 기록했다. IgE-양성 배양을 RT-PCR 에 적용하고, 2 개의 짝지워진 VH/VL 유전자를 회수하고 서열분석했다 (표 1). [Wardemann et al., (Science 301, 1374-1377, 2003)] 에 따라 V 유전자를 경쇄 (카파 또는 람다) 또는 인간 IgG 또는 IgE 중쇄 발현을 위한 발현 벡터에 클로닝했다. IgG 또는 IgE 항체를 293T 세포의 일시적 형질전환에 의해 생산했다. 본 실시예는 희소 형질 세포를 회수하고, 대표적인 IgE 모노클로날 항체를 단리하는 가능성을 설명한다.
표 1. 순환 형질 세포로부터 회수된 두가지 IgE 모노클로날 항체.
실시예
7.
간엽
기질 세포 존재 하에 배양된 형질 세포 유래의 항원-특이적 모노클로날 항체의 단리
형질 세포를, 파상풍 독소 (TT) 를 이용한 부스터 백신접종 7 일 후 공여자의 말초혈로부터 단리하고, 384 웰 마이크로플레이트에서 MSC-TERT 단층 상의 클로날 조건 (clonal condition) 에서 시딩했다. 10 일째에, 배양 상청액을 전체 IgG (ng/배양) 뿐만 아니라 TT-특이적 IgG 항체 (OD405) 의 존재성에 대해 분석했고, TT-특이적 항체를 생산하는 모노클로날 배양을 동정했다 (도 5 참고). 본 실시예는 부스터 면역화에 후속하여 다수의 항원-특이적 형질 세포를 동정하는 가능성을 설명한다.
실시예
8.
IL
-6 존재 하에 배양된 형질 세포 유래의 항체를 중화하는 강력하고 광범위하게 반응성인 인플루엔자
A 의
단리
7 일 전에 계절 인플루엔자 백신으로 면역화시킨 공여자로부터의 CD138-양성 세포를 10 ng/ml IL-6 존재 하에 0.5 세포/웰로 16 개의 384 웰-플레이트에 시딩했다. 6 일 및 8 일째에, 배양 상청액을 항원 재조합체 H5 또는 H9 바큘로바이러스-유도성 재조합체 헤마글루티닌 (HA) 및 무관한 항원 파상풍 독소 (TT) 를 이용하는 세가지 병행 ELISA 에서 시험했다. 스크리닝한 4,928 개의 배양 상청액들 중에서, 12 개는 H5 HA 에 결합하고, 25 개는 H9 HA 에 결합하고, 54 개는 H5 및 H9 의 두가지 모두에 결합했다. 최고 OD 신호가 있던 후자의 것들 중 일부를 RT-PCR 에 적용했고, 2 개의 짝지워진 VH/VL 유전자를 회수했다. 2 가지 모노클로날 항체, FI6 및 FI28 는 대부분의 V, D 및 J 유전자 절편 (IGHV3-30*01, IGHD3-9*01, IGHJ4*02 및 IGKV4-1*01) 을 공유했으나, IGKJ 사용 및 체세포 돌연변이의 패턴에서의 N 영역에서 상이했으며, 따라서 클론에 의하여 연관되지 않았다.
FI6 및 FI28 의 V 유전자를 발현 벡터에 클로닝하고, 재조합체 항체는 293T 세포를 형질전환하여 생산했다. 그들의 특이성은 상이한 서브타입에 속하는 재조합체 HA 의 패널을 이용하여 ELISA 에 의해 조사했다 (표 2). FI6 는 군 1 (H1, H5 및 H9) 및 군 2 (H3 및 H7) 를 포함하는 시험한 모든 인플루엔자 A HA 서브타입에 결합한 반면, 인플루엔자 B 유래의 HA 에는 결합하지 않았다. 대조적으로, FI28 는 군 1 HA 에만 결합했다.
표 2. 형질 세포 유도성 인간 모노클로날 항체의 인플루엔자 HA 에 대한 결합
후속하여, 슈도바이러스 (pseudoviruses) 및 감염성 바이러스를 이용하여 군 1 및 군 2 인플루엔자 A 서브타입을 중화하는 FI6 및 FI28 의 역량에 대해 그들을 시험했다. 현저하게, FI6 은 항원과 관련하여 갈라져나온 계통 분기 0, 1, 2.1, 2.2 및 2.3 에 속하는 6 가지 H5 단리체 및 2 가지 H7 조류 단리체를 포함하는, 모든 시험한 슈도바이러스를 중화했다 (표 3). 추가로, FI6 은 최근의 유행성 돼지-기원 H1N1 단리체 A/Cal/04/09 에까지 이르는 70 년의 기간에 걸친, 2 가지 H3N2 바이러스 및 4 가지 H1N1 바이러스를 포함하는 모든 시험한 감염성 바이러스를 중화한다. 대조적으로, FI28 는 모든 H5 슈도바이러스를 중화했으나, H7 슈도바이러스 및 시험한 모든 감염성 바이러스 중화에는 실패했다 (표 3 및 4).
표 3. 인간 모노클로날 항체에 의한 H5 및 H7 슈도바이러스의 중화
표 4. 인간 모노클로날 항체에 의한 인플루엔자 바이러스 중화, nd, 수행하지 않음
상기 기재된 방법은 5 내지 10 일 내에 약 8 내지 16 ng/ml 로 50 μl 의 모노클로날 항체를 전달한다는 점에 유의해야 한다. 상기 부피 및 항체 농도는 다중 검정을 행하기에 충분하다. 이들 검정들은 ELISA (5 μl 를 이용해 표준 얕은 384 플레이트 포맷에서 수행될 수 있음) 와 같은 결합 검정 뿐만 아니라, 해당 감수성 범위 내에서 슈도타입화 중화 (pseudotyped neutralization) 와 같은 기능 검정도 포함한다 (표 3 참고). 중요하게는, 다중 병행 검정을 행하는 능력은 다중 항원 변이체에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 희소 형질 세포를 신속하게 동정하기 위해 핵심적이다.
실시예
9. 백신접종 10 년 후
말초혈로부터
단리된
배양된 형질 세포 유래의 파상풍 독소-특이적
모노클로날
항체의 단리
CD 138+ HLA-DR+ CD62L+ 형질 세포를 파상풍-독소 (TT) 백신접종 10 년 후 공여자의 말초혈로부터의 세포 분류에 의해 단리했다. 총 1,700 개의 세포를 0.5 세포/웰로 384-웰 마이크로플레이트에 시딩하고, 세포 배양 상청액을 7 일째에 파상풍-독소 특이적 IgG 항체의 존재성에 대해 ELISA 로 스크리닝했다. 1 개의 파상풍 독소-특이적 배양물을 동정했고, 8 일째에는 VH/VL 유전자를 RT-PCR 로 회수하고 서열분석했다 (표 5 참고). 유전자를 발현 벡터에 클로닝하고, 재조합체 항체 (TT14) 를 293T 세포의 일시적 형질전환에 의해 생산했다. 항체를 상이한 농도에서 파상풍 독소 또는 무관한 항원 (음성 대조군) 에 대한 결합에 대해 ELISA 에 의해 시험했다 (도 6 참고).
표 5. 백신접종 10 년 후 순환 형질 세포로부터 회수된 파상풍 독소-특이적 모노클로날 항체
본 발명을 행하는 대안적인 방법이 있으며, 본 발명의 범위 및 진의를 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능하다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 본 발명의 구현예들은 설명적인 것이지 제한적인 것은 아니며, 본 발명은 본원에 제공된 상세한 사항들에 제한되지 않고, 첨부되는 특허청구범위의 범위 및 등가물 내에서 변형될 수 있다.
Claims (20)
- 하기 단계를 포함하는, 형질 세포로부터 항체를 생산하는 방법: 형질 세포를 IL-6 또는 간엽 기질 세포의 존재 하에서 제한된 갯수로 배양하는 단계 및 그로부터 상기 항체를 수득하는 단계, 여기서 배양된 형질 세포의 갯수는 1 개 내지 10 개임.
- 하기 단계를 포함하는, 형질 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 방법: 단세포 배양에서 IL-6 또는 간엽 기질 세포의 존재 하에 형질 세포를 배양하는 단계 및 그로부터 상기 항체를 수득하는 단계.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체가 인간 항체이고, 형질 세포가 인간 형질 세포인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체의 특징분석에 필요한 양만큼 항체가 생산되기에 충분한 시간 동안, 형질 세포가 형질 세포의 생존을 연장시키는 IL-6 또는 간엽 기질 세포를 함유하는 배양 배지에서 배양되는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 형질 세포의 생존이 단기간 동안 연장되고, 상기 단기간이 5 내지 7 일인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 형질 세포의 생존이 장기간 동안 연장되고, 상기 장기간이 10 일 이상인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 형질 세포의 생존이 20 일 이상 연장되는 방법.
- 하기 단계를 포함하는 항체 또는 항체 분절의 생산 방법:
a. 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 따라 제한된 갯수의 형질 세포를 배양하는 단계;
b. 원하는 특징을 가진 항체를 생산하는 배양을 동정하는 단계;
c. 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계; 및
d. 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체 또는 항체 분절의 특징분석 단계를 추가로 포함하며, 여기서 항체 또는 항체 분절의 특징분석이 항체 또는 항체 분절의 기능을 알아내기 위한 기능 검정, 항체 또는 항체 분절 또는 항체 또는 항체 분절에 의해 인식되는 에피토프의 결합 특이성을 알아내기 위한 결합 검정, 및/또는 독소 또는 병원체를 중화하는 항체 또는 항체 분절의 능력을 알아내기 위한 중화 검정을 행하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 형질 세포의 생존이 30 일 이상 연장되는 방법.
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