KR101588309B1

KR101588309B1 - 펩티드, 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101588309B1
Application number: KR1020107018616A
Authority: KR
Inventors: 아나 마리사 쥬드진스키-타바시; 자나이나 드 소자 벤투라; 린다 크리스티안 카리조 카바로
Original assignee: 푼다싸웅 지 앙빠루 아 뻬스끼자 두 에스따두 지 싸웅 파울루 - 에피아뻬에에씨뻬; 바이오랩 세너스 팔마씨우티카 엘티디에이.; 아나 마리사 쥬드진스키-타바시
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2016-01-25
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: BRPI0907469B1; CA2712807C; US20110034390A1; CN101965398B; CA2712807A1; ES2559195T3; EP2245149A2; IL207174A0; AU2009207302B2; WO2009093189A2; IL207174A; BRPI0907469B8; AU2009207302A1; JP2011510060A; CN101965398A; WO2009093189A3; KR20100118122A; EP2245149B1; JP5777886B2; US8883740B2

Abstract

다른 응용 중에서, 조직 재생 및 상처 회복을 위한 조성물이, 설명되어 있다.

Description

펩티드, 조성물 및 그의 용도{PEPTIDES, COMPOSITIONS, AND USES THEREOF}

발명의 배경

세포외 기질(ECM)은 생체 시스템 내의 세포를 둘러싸고 지지하는 복잡한 구조물이다. 포유류 조직에서 ECM은 힘줄, 연골, 뼈 또는 피부의 진피와 같은 연결 조직에서 가장 일반적으로 발견된다.

ECM은 조직의 생성과 상처의 회복을 가이드하므로, 여러 의학적 증상들은 불완전하게 만들어진 ECM (예를 들면, 괴혈병); 계속적으로 변성되는 ECM (예를 들면, 치주 질환, 비-치유 궤양); 또는 악화되는 ECM이나 줄어드는 ECM 생산(예를 들면, 노화 조직)때문이다. ECM의 중요성은 조직 생성, 상처 회복, 질병과 노화 치료제, 및 화장용 용도로 사용하기 위한 ECM을 공급하는 테라피의 개발을 자극하여 왔다.

발명의 요약

본 발명은 세포(예, 섬유아세포)에서 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 단백질의 생산을 자극할 수 있어서, 그래서 조직과 피부를 위한 생성제(generating agent)로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 화장품으로도 사용될 수 있는 펩티드를 특징으로 한다.

일부 측면에서, 본 명세서는 YAIGYSC (SEQ ID NO: 6)인 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 펩티드는 ECM 단백질(예를 들면, 피브로넥틴, 테나신(tenascin), 콜라겐, 프로콜라겐, 또는 그들의 조합)의 생산을 자극한다.

일부 측면에서, 본 명세서는 SEQ ID NO:6와 실질적으로 동종이거나(homologous) 동일한 분리된 펩티드를 제공한다.

일부 측면에서, 본 명세서는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3와 실질적으로 동종인 분리된 펩티드를 제공한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 여기에서 설명된 펩티드(예를 들면, 하나 이상의 화장용으로 허용가능한 부형제와 조합하여)를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 여기에서 설명된 펩티드(예를 들면, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명이 하기에서 더 개시하듯이, 우리는 본 발명이 아미노산 서열 YAIGYSC (SEQ ID NO:6)과 적어도 70% 동일한(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일) 아미노산 서열로 구성되거나 그것을 포함하는 분리된 펩티드들을 포함하는 것을 여기에 적는다. 펩티드들은 섬유아세포에서 하나 이상의 세포외 기질 단백질의 생산을 자극할 수 있다(예를 들어, 그들은 생체 내(in vivo) 또는 조직 배양에서 생산을 자극할 수 있다). 분리된 펩티드는 아미노산 서열 YAIGYSCKDYK (SEQ ID NO:1)과 적어도 70% 동일한(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일) 아미노산 서열로 구성되거나 그것을 포함할 수 있다. 또한 그러한 펩티드는 세포(예를 들어, 섬유아세포 내)에서 하나 이상의 ECM 단백질의 생산을 자극할 수 있다. 분리된 펩티드는 아미노산 서열 APLWILSTDYDNYAIGYSC (SEQ ID NO:3)과 적어도 70% 동일한(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일) 아미노산 서열로 구성되거나 그것을 포함할 수 있다. 또한 그러한 펩티드는 세포(예를 들어, 섬유아세포 내)에서 하나 이상의 단백질의 생산을 자극할 수 있다. 분리된 펩티드는 아미노산 서열 APLWILSTDYDNYAIGYSCKDYK (SEQ ID NO:5)과 적어도 70% 동일하다(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다). 또한 그러한 펩티드는 세포(예를 들어, 섬유아세포 내)에서 하나 이상의 ECM 단백질의 생산을 자극할 수 있다.

하나 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하는 것에 의하여 참조 서열(예를 들면, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, 또는 SEQ ID NO:5)과 다른 아미노산 서열로 구성되거나 그것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분리된 펩티드는 최대 4개까지 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 결실에 의하여 SEQ ID NO:6로 나타내는 펩티드와 다를 수 있다. 펩티드는 섬유아세포에서 하나 이상의 ECM 단백질의 생산을 자극할 수 있다. 다른 분리된 펩티드는 최대 6개까지 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실에 의하여 SEQ ID NO:1과 다를 수 있고, 섬유아세포에서 하나 이상의 ECM 단백질의 생산을 자극할 수 있다. 다른 분리된 펩티드는 최대 12개까지 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실에 의하여 SEQ ID NO:5과 다를 수 있고, 섬유아세포에서 하나 이상의 세포외 기질 단백질의 생산을 자극할 수 있다.

본 발명은 본 명세서에서 개시된 펩티드(예를 들어, 아미노산 서열 YAIGYSC (SEQ ID NO:6)과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열로 구성되거나 그것을 포함하는 펩티드)를 포함하는 약제학적 조성물을 더 포함한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 수용성 희석제)를 포함할 수 있고 액체 또는 연고의 형태로 존재할 수 있다. 약제학적 조성물은 상처 치료제를 더 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 구강(oral), 근육내(intramuscular), 혈관내(intravenous), 피하(subcutaneous), 국소부위(topical), 폐(pulmonary), 비내(intranasal), 협측(buccal), 직장내(rectal), 혀밑(sublingual), 피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 또는 척수강내(intrathecal) 용도를 위해 만들어질 수 있다.

본 발명의 방법은 피검체(예를 들어, 사람인 환자)의 세포에 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여함으로써 피검체에게서 세포 사멸 및/또는 조직 변성(degeneration)을 줄이는 방법을 포함한다. 피검체는, 예를 들어, 질병, 외상, 또는 노화에 의해 야기된 세포 사멸 및/또는 조직 변성을 경험하는 것으로 식별될 수 있다. 상기 방법은 상처 치료제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 피검체(예를 들어, 사람인 환자)에게 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여함으로써 피검체에게서 상처 치유 및/또는 조직을 재생하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 치료할 필요가 있는 환자를 식별하는 단계를 포함할 수 있고, 선택적으로, 상처 치료제를 더 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

조성물 중 어느 것도 치료학적인 유효량으로 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 범주는 약제의 제조에 있어서 본 명세서에서 개시되는 것처럼 분리된 펩티드의 용도이다. 약제는 세포 사멸 및/또는 조직 변성을 감소시키기 위한 것이거나 또는 상처 치유 및/또는 조직 재생을 위한 것일 수 있다.

도 1은 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라조리움 브로마이드 (MTT : 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)로 테스트한 세포의 생존력에 있어서 4개의 펩티드의 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 1% FBS로 보충한 배지에서 120시간 동안 배양한 내피 세포의, MTT로 테스트한, 생존력에 있어서 펩티드 CNF011.05B의 영향을 보여주는 선 그래프이다.
도 3은 1% FBS로 보충한 배지에서 120시간 동안 배양한 내피 세포의, MTT로 테스트한, 생존력에 있어서 펩티드 CNF011.05D의 영향을 보여주는 선 그래프이다.
도 4는 1% FBS로 보충한 배지에서 120시간 동안 배양한 호중구(neutrophils)의, 유세포 분석기(flow cytometry)로 테스트한, 생존력에 있어서 L-NAME를 더한 펩티드 CNF011.05D의 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 5는 1% FBS로 보충한 배지에서 120시간 동안 배양한 초기 내피 세포의 , 유세포 분석기(flow cytometry)로 시험한, 생존력에 있어서 L-NAME를 더한 펩티드 CNF011.05D 의 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 그리스 반응(Griess reaction)을 사용하여 측정했을 때, 호중구에 의한 NO₂ 생산에 있어서 L-NAME를 더한 펩티드 CNF011.05D 의 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 0.35㎍과 5㎍의 펩티드 CNF011.05D와 함께 배양하여 피브로넥틴(fibronectin)을 생산하는 섬유아세포의 퍼센트를 나타내는 플롯이다.
도 8은 0.35㎍과 5㎍의 펩티드 CNF011.05D와 함께 배양하여 ㅌ테텐테나신(tenascin)을 생산하는 섬유아세포의 퍼센트를 나타내는 플롯이다.
도 9는 0.35㎍과 5㎍의 펩티드 CNF011.05D와 함께 배양하여 프로콜라겐(procollagen)을 생산하는 섬유아세포의 퍼센트를 나타내는 플롯이다.

본 출원은 2008년 1월 22일 출원된 미국 가출원 제 61/022,747호를 우선권으로 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 전체 참조로 통합된다.

발명의 상세한 설명

본 명세서는 ECM 단백질, 특히 피브로넥틴(fibronectin), 테나신(tenascin), 콜라겐(collagen), 및 프로콜라겐(procollagen)의, 생산을 자극하는데 유용한 신규한 펩티드를 특징으로 한다. 여기에 개시된 것은 그러한 펩티드를 사용하는 방법, 그러한 펩티드를 만드는 방법, 및 그러한 펩티드는 포함하는 키트와 조성물이다.

펩티드들은 세포외 기질 단백질, 특히, 피브로넥틴, 테나신, 콜라겐, 및 프로콜라겐을 생성하는데 사용될 수 있다. 펩티드들은 질병을 앓거나, 손상되거나 또는 손실된 조직(예를 들어, 상처, 외상, 외과적 절차나 조직 이식, 골 질환, 미용상(cosmetic) 결함, 연골 질환, 치주 질환(periodontal disease), 광 노화나 시간적 노화(photo or chrono aging), 순환계 장애에 의해 야기된 피부 상처, 당뇨병, 감염성 질환 등에 기인한)의 생성과 같은 다양한 이로운 목적에 사용될 수 있다. 펩티드들은 조직 질환, 외상, 또는 노화에 기인한 조직 변성(degeneration)(예를 들어, 약해지는 조직 구조나 조직 손실)의 예방을 위해 사용될 수 있다. 펩티드들은 상처 회복을 위해 사용될 수 있다. 펩티드들은 감소된 흉터(scarring)(예를 들어, 치료하지 않은 것에 비해 치료 후에 반흔 조직(scar tissue)이나 밀도 있는 섬유성 연결 조직의 양이 줄어든) 를 가지는 상처 회복을 위해 사용될 수 있다. 또한 그들은 콜라겐이나 ECM 구성물의 기능 장애와 관련있는 다른 질병(예를 들어, 천식)에서 사용될 수 있다.

본 발명의 용도 및 실시태양의 기술은 단지 설명일 뿐이고 제한하려는 의도는 아니다.

정의

"세포외 기질" 또는 ECM은 생체 시스템 내의 세포를 둘러싸고 지지하는 복잡한 구조물이다. 포유류 조직에서, ECM은 힘줄, 연골, 뼈 및 피부의 진피와 같은 연결 조직에서 가장 흔히 발견된다. ECM은 그것이 거주하는 세포에 의해 생산되고 유지된다.

"세포외 기질" 또는 ECM 단백질은 하나 이상의 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 테나신(tenascin), 엔탁틴(entactin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엘라스틴(elastin), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브릴린(fibrillin), 메로신(merosin), 안코린(anchorin), 콘드로넥틴(chondronectin), 연결 단백질(link protein), 골 타액단백질(bone sialoprotein), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오폰틴(osteopontin), 에피넥틴(epinectin), 히알루로넥틴(hyaluronectin), 안둘린(undulin), 에피리그린(epiligrin), 및 카리닌(kalinin)이다. 상기 용어는 그들의 특징 때문에, 세포외 기질 단백질이 기술분야에서 보통의 기술의 하나에 의해 결정될 때, 미래에 발견될 수 있는 현재 알려지지 않은 세포외 기질 단백질을 포함한다.

"실질적으로 동종의(Substantially Homologous)"는, 예를 들어, BLAST 알고리즘, (Altschul et al., JMB 215:403-410 (1990)), Smith & Waterman의 상동성 알고리즘 (Adv . Appl . Math. 2:482 (1981)), Needleman & Wunsch의 상동성 알고리즘 (JMB 48:443 (1970)), 및 Pearson & Lipman 의 유사성 탐색 방법(PNAS USA 85:2444 (1988)과 같은 서열 비교 알고리즘의 사용을 통해 최대 상응을 위해 비교하거나 정렬했을 때, 아미노산 서열(예를 들어 SEQ ID NO:1로 표현되는 아미노산 서열)과 적어도 70%(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들을 말한다. 여러 컴퓨터 프로그램이 이러한 알고리즘(예를 들어, CAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Computer Group, USA)을 실행할 수 있다.

외상

조직은 찔린 외상, 화상(burn trauma) 및 둔상(blunt trauma)을 포함하여, 다양한 상해를 견딜 수 있다. 모든 이러한 상해는 상처 부위로 특수화된 세포의 운동에 의해 특징지워지는, 정연한 일련의 사건들인, 치유반응과 관련된 움직임을 시작한다. 조직이 파괴되면, 특수화된 세포들이 결함을 치료하고 해부학상 구조와 기능을 회복시키기 위해 상처 부위로 필요한 세포외 기질 단백질(예를 들어, 콜라겐)을 축적한다. 너무 적은 세포외 기질 단백질이 쌓이면, 상처가 약해져서 벌어질 수 있다.

치유와 치유과정(Healing Cascade)은 3 단계(phase)로 구성된다: 염증 단계, 증식 단계, 및 리모델링 단계이다. 염증 단계는 상처 형성 동안 노출된 콜라겐에 의해 시작되어, 혈액 응고 단백질을 활성화시킨다. 잠시 후, 염증 세포는 상처로 이동한다. 첫번째 반응 세포인, 혈소판은, 피브로넥틴을 포함한 여러 단백질들을 방출해서, 출혈을 조절하고 다른 세포를 화학적으로 끌어당긴다(chemoattract). 두번째 반응 세포인, 호중구는, 세균을 죽이고, 외부 이물질(debris)을 제거한다. 다음 반응 세포인, 백혈구와 대식세포는, 상처를 세정하는 콜라게나제(collagenase)와, 콜라겐 생성 및 섬유아세포에 의한 혈관 신생(angiogenesis)을 자극하는 사이토카인(cytokines)을 포함하는, 여러 단백질을 방출한다.

증식 단계는 상피화(epithelialization), 혈관 신생(angiogenesis), 및 새살 형성(granulation)을 포함한다. 상피화에서, 기저막이 손상되지 않았다면(1도 화상에서처럼), 상피 세포는 정상적으로 상처로 이동한다. 파괴되었다면(2도 및 3도 화상에서처럼), 상피 세포는 표면에서부터 상처를 재상피화한다. 새살 형성 과정에서, 내피 세포는 상처로 이동하고 모세혈관이 형성된다. 새살 조직 형성과 콜라겐 축적에서, 섬유아세포는 분화하여 상처에 세포간 물질(ground substance)(예를 들어, 세포외 기질 단백질(예, 프로콜라겐))을 축적한다.

성숙 단계는 새로운 세포외 기질의 교차결합과 조직화(예를 들어 콜라겐의 특수한 효소적 분해)로 구분된다.

상처의 치료(Treatments )는 두 개의 큰 범주로 분류된다:(1) 1차 치유(intention): 보통 봉합, 테이프, 스테이플, 붕대, 등에 의한 상처의 물리적인 폐쇄를 포함한다. 1차 치유 동안 치료(healing)의 주요 메카니즘은 연결 조직 기질 축적이고, 콜라겐, 프로테오글리칸 및 접착 단백질이 새로운 세포외 기질을 형성하기 위해 축적된다; 그리고 (2) 2차 치유: 상처를 열려진 채로 놓아 두고 위축(contraction)에 의해 치유한다; 세포와 기질 사이의 상호작용이 상처의 중앙 방향으로 세포와 조직을 움직이게 한다.

본 명세서에 개시된 펩티드를 사용하여 재생될 수 있고 회복될 수 있는 조직의 예는 신경 조직(nervous tissue), 피부(skin), 혈관 조직(vascular tissue), 심장 조직(cardiac tissue), 심장 주변 조직(pericardial tissue), 근육 조직(muscle tissue), 안구 조직(ocular tissue), 치주 조직(periodontal tissue), 연골, 힘줄, 인대와 같은 연결 조직(connective tissue), 신장 조직 및 간 조직과 같은 기관 조직, 이자 조직, 유방 조직, 및 부신 조직과 같은 선 조직(glandular tissue), 방광 조직(bladder tissue) 및 수뇨관 조직(ureter tissue)과 같은 비뇨기과 조직(urological tissue), 그리고 장 조직(intestinal tissues)과 같은 소화기 조직(digestive tissue)을 포함한다.

노화

노화된 조직, 예를 들어, 피부는, 손상되는 ECM이나 줄어든 ECM의 생산, 및 ECM의 기초(foundation) 손상으로 구분된다. 이러한 특성은 조직 구조를 약하게 만든다. 노화된 조직은 더 어린 피부보다 더 약하고 덜 탄성이 있고, 덜 유연하다. 그것은 스태미나(stamina)를 잃어서 노화된 피부는 리플링(rippling)(예를 들어, 주름)을 경험한다.

주름(및 반흔(scars))의 치료는 결함이 있거나 원하는 조직 부위에서 가장 가까운 피부의 진피층으로 필러를 주입하는 것을 포함한다. 필러의 예는 미네랄 오일, 지방, 우형 콜라겐(bovine collagen), 및 인간 콜라겐을 포함한다. 모든 필러는 기록에 의해 충분히 입증된 한계를 가진다. 예를 들어, 인간 콜라겐은 주름을 감소시키는 데 부분적으로 효과가 있지만, 신체에 의한 콜라겐 흡수를 보충하기 위해 큰 바늘로 고통스런 주사를 반복적으로 요한다.

펩티드

본 발명은 펩티드들이 세포외 기질(ECM) 단백질(예를 들어, 피브로넥틴, 테나신, 콜라겐, 및 프로콜라겐)의 생산을 자극할 수 있어서, 따라서 조직이나 피부의 발생(generation)을 생성시키거나 촉진시키는 약제로서, 그리고 상처 회복제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 서열 YAIGYSC (SEQ ID NO:6), YAIGYSCKDYK (SEQ ID NO:1), APLWILSTDYDNYAIGYSC (SEQ ID NO:3), 또는 APLWILSTDYDNYAIGYSCKDYK (SEQ ID NO:5)로 구성되거나 그것을 포함하는 펩티드를 포함한다. SEQ ID NO:1로 구성된 펩티드는 본 명세서에서 CNF011.05D 펩티드라고 부른다.

또한 SEQ ID NO:6와 실질적으로 동종(homologous)인 펩티드들을 포함하고, SEQ ID NO:6의 펩티드와 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산에 의해 암호화되는 펩티드들을 포함한다.

또한 SEQ ID NO:1와 실질적으로 동종(homologous)인 펩티드들을 포함하고, SEQ ID NO:1의 펩티드와 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산에 의해 암호화되는 펩티드들을 포함한다.

또한 SEQ ID NO:3와 실질적으로 동종(homologous)인 펩티드들을 포함하고, SEQ ID NO:3인 펩티드와 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산에 의해 암호화되는 펩티드들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되었듯이, "매우 엄격한 조건하에서 혼성화한다"는 용어는 혼성화와 워싱(washing)을 위한 조건을 설명한다. 혼성화 반응을 수행하는 지침은 참조에 의해 통합되는, John Wiley & Sons의, Molecular Biology(N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)에 있는 커런트 프로토콜(Current Protocols)에서 찾을 수 있다. 매우 엄격한 혼성화 조건은 0.2X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 또는 이와 실질적으로 유사한 조건에서 한 번 이상 워싱한 후 약 45℃에서, 6X SSC에서 혼성화하는 것을 포함한다.

또한 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열여덟, 열아홉, 스물, 스물-하나, 또는 스물-둘의 산 치환, 첨가 또는 결실에 의해 SEQ ID NO:5의 서열과 다른 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 펩티드들을 포함한다. 상기 치환, 첨가 또는 결실은 예를 들어, 내부(internal) 또는 말단(terminal)(예를 들어, N말단 또는 C말단)의 어떠한 포지션에서도 있을 수 있다.

펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단은 안정성을 증가시키기 위해, 예를 들어,분해(degaradation), 예를 들어 단백용해성 분해(proteeolytic degradation)를 줄이기 위해, 변형될 수 있다.

예를 들어, 펩티드의 동정(identification)이나 정제(purification)를 돕기 위한, 에피토프 태그(예를 들어, His (예를 들어, 6x His 또는 poly-His), Myc, HA, GST, MBP, VSV, 티오레독신(Thioredoxin), 베타-갈락토시다제(Beta-galactosidase), FLAG, 형광 단백질(예를 들어, GFP) 태그, 등)를 함유하기 위해 변형될 수 있다. 절개 부위(예를 들어, 펙터 Xa 프로테아제(Factor Xa Protease), 엔테로키나제(enterokinase), 트롬빈(thrombin), TEV 프로테아제(TEV protease), 프레시션 프로테아제(PRESCISSION protease), 인테인 1이나 인테인 2(intein 1 or intein 2), 또는 시그날 펩티다제(signal peptidase), 등)는 태그와 펩티드 서열 사이에 선택적으로 위치되어 있을 수 있어서 태그가 펩티드로부터 절개될 수 있다. 그러한 테크닉은 기술 분야에서 알려져 있다. 또한 분자 생물학( John Wiley and Sons, Inc, New York, NY)의 커런트 프로토콜에서도 볼 수 있다.

펩티드 제조

본 명세서에 설명된 펩티드들은 생체 시스템 내에서 또는 화학적으로 합성되어 제조될 수 있다.

생체 시스템 내에서 펩티드들을 생산하기 위해, 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO:5로 나타내는 펩티드는 핵산 서열 gca-ccg-ctg-tgg-att-ctt-tct-act-gat-tac-gac-aac-tat-gct-atc-ggc-tac-tcc-tgc-aaa-gac-tac-aag (SEQ ID NO:7) 또는 그 유전 암호에 따른 관련된 서열에 의해 암호화될 수 있고; 그리고 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:1, 및 SEQ ID NO:3로 나타내는 펩티드는 SEQ ID NO:7에서 파생된 핵산 서열 또는 그 유전 암호에 따른 관련된 서열에 의해 암호화될 수 있다)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터는 생체 시스템(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유류 발현 시스템)으로 도입될 수 있고, 표준 기술을 사용하여 발현될 수 있다. 그리고 나서 펩티드는 표준 정제 기술(예를 들어, 펩티드의 물리적이거나 화학적인 성질 또는 친화성 정제 기술에 기초한 분리 기술을 사용하여)를 사용하여 생체 시스템(예를 들어, 세포나 배지)으로부터 정제된다. 그러한 기술은 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 분자 생물학 3판(John Wiley and Sons, Inc, New York, NY)의 커런트 프로토콜을 보면 된다.

펩티드들은 액체 또는 고체 상(phase) 합성을 사용하는 것과 같이, 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, Atherton, E., Sheppard, R.C. 고체상 펩티드 합성: 실체적 접근, IRL Press, Oxford, England, 1989; Stewart J.M., Young, J.D. 고체상 펩티드 합성, 2판, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Carpino (J. Am. Chem . Soc. 115:4397-4398 (1992)) 을 보면, 그러한 기술은 기술 분야에서 표준이다. 펩티드들은 카르복실기나 한 아미노산의 C-말단이 아미노기나 또 다른 N-말단과 짝지워져서 합성된다.

화장용 조성물

본 명세서의 펩티드는 화장료 조성물, 예를 들어, 피부에 처치하기 쉽게 투여되기 위한, 로 만들어질 수 있다. 펩티드는 단독으로 또는 동일 조성물 안에서이거나 분리된 조성물로 다른 화장료와 조합하여 투여될 수 있다.

일반적으로, 화장료 조성물은 화장용으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된, "화장용으로 허용가능한 담체"는 모든 고체, 반고체, 및 액체 농축제(thickeners); 부형제, 희석제; UV 여과 특성을 가진 물질; 향료(perfumes); 화장용 베이스(bases); 및 화장용 제제(formulations)를 포함한다.

화장용 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체 용액, 파우더, 포마드(pomades), 젤, 크림, 접착제, 등과 같은 액체, 반-고체 및 고체 투여 형태를 포함한다.

약제학적 조성물

개시된 펩티드는, 예를 들어 조직을 생성시키거나 피부를 회복시키기 쉬운 투여를 위해, 약제학적 조성물로 만들어질 수 있다. 펩티드는 단독으로 또는 통일 조성물 안에서이거나 분리된 조성물로 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다.

일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 대로, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 모든 용매, 부형제, 분산매, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 리포좀, 미세입자, 미소 구체(microsheres), 나노 구체(nanosheres), 등을 포함한다.

약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 펩티드의 염, 예를 들어, 산 부가 염이나 염기 부가 염(예를 들어, Berge et al. J.　 Pharm . Sci. 66:1-19 (1977)를 보면)을 포함한다. 약제학적 제제는 잘 확립된 기술이고, 예를 들어, Gennaro (ed.), Remington에서: 과학과 약학 실습(The Science and Practice of Pharmacy), 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., 약제학적 투약 형태와 약 전달 시스템(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems), 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); and Kibbe (ed.), 약제학적 부형제 미국 약제학 협회의 핸드북(Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association), 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X)에 더 개시되어 있다.

일 실시태양에서, 부형제는 염류, 염화 나트륨, 제2인산 나트륨 칠수화물, 제1인산 나트륨, 및 안정화제를 포함한다.

약제학적 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체 용액(예, 주사가능하고 불용성 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 파우더, 좌약, 젤, 또는 연고와 같은 액체, 반-고체 및 고체 투약 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여의 형태와 치료적 적용에 의존할 수 있다.

약제학적 조성물은 국부, 예를 들어, 상처 부위에, 투여를 위해 만들어질 수 있다. 국부적 투여는, 예를 들어, 경피(epicutaneous), 비강(intranasal), 흡입(inhalational), 및 질(vaginal) 투여를 포함한다. 조성물은 피부(예를 들어, 화상, 물집, 또는 베인 부위), 입술, 치은, 치아, 구강, 눈, 귀, 네일 베드(nail bed), 또는 목구멍, 등, 예를 들어, 상처 부위에서 투약될 수 있다. 국부적 투여를 위한 조성물은 크림, 젤, 로션, 또는 연고(salve), 등일 수 있다.

특정 실시태양에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는, 임플란트와 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하여, 빠른 방출 또는 분해에 대항하여(예를 들어, 조절된 방출 제제를 제조하기 위해) 펩티드를 보호할 수 있다. 생분해성의, 생체적합성의 폴리머가 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜릭 산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락틱산과 같이 사용될 수 있다. 그러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허 되어 있거나 예를 들어, 지속적이고 조절된 방출 약 전달 시스템(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)과 같이 일반적으로 알려져 있다.

특정 실시태양에서, 약제학적 조성물은 상처 치료제와 합께 제조될 수 있다. 여기에서 사용된 대로, 상처 치료제는 상처 회복, 조직 발생을 증진시키거나 조직 분해를 예방하거나 막는 모든 제제를 포함한다. 상처 치료제의 예는 세포외기질(ECM) 단백질, ECM의 구조적인 인자들(예를 들어, 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸), 성장 인자 및 분화 요소의 생산을 자극하는 제제를 포함한다(Adams et al ., 발생(Development ) 117:1183-1198 (1993) 및 Kreis et al. (eds.), 세포외 기질 및 접착 단백질의 가이드북("Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins,") Oxford University Press (1993) (hereinafter "Kreis et　al."), 및 스캐폴드 물질(scaffolding materials)(미국 특허 출원 제 20030211793호). Adams et al. 와 Kreis et al.의 교시는 참조에 의해 본 명세서에 통합되고, 분화와 발생을 조절하는 성장 인자와 ECM 구성물을 개시하고 있다.

성장 인자와 분화 인자의 예는 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 신경 성장 인자, 비만 세포-자극 인자, 혈소판- 유도 성장 인자, 형질전환 성징 인자, 혈소판-유도 성장 인자, 산란 인자(scatter factor), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor) 및 슈만 세포 성장 인자(Schwann cell growth factor)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

펩티드가 상처 치료제와 조합하여 사용될 때, 두 제제는 분리되거나 함께 만들어질 수 있다.

투여

펩티드는 피검체, 예를 들어, 인간 피검체, 에게 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 많은 적용에서, 투여의 루트는 비경구적(예를 들어, 정맥 주사나 수액(intravenous injection or infusion) (IV), 동맥 내 주사(intraarterial injection), 피하 주사(subcutaneous injection)(SC), 복막 내(intraperitoneally)(IP), 심장 내 주사(intracardiac injection), (intraosseous infusion), 골수 내 주사(intradermal injection), 복막 수액이나 주사(intraperitoneal infusion or injection), 유리체내 주사(intravitreal injection), 근육 내 주사(intramuscular injection), 협막내 주사(intrathecal injection), 관절 내 주사(intra-articular injection), 또는 경막 외 투여(epidural administration) 중의 하나)이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 펩티드는 장내(enteral) 루트(예를 들어, 경구)로 투여된다. 펩티드는 지역적으로, 예를 들어, 국부적으로(예, 경피로(epicutaneously), 비강으로(intranasally), 흡입하여(inhalationally), 질에(vaginally), etc.) (e.g., in a cream, gel, lotion, or salve), 예를 들어 피부나 입술이나 치은이나 구강이나 목구멍을 통해, 예를 들어 상처 부위에서, 투여된다. 어떤 경우에, 투여는 필요한 세포외 기질 부위로 직접적으로 될 수 있다.

펩티드는 지역적으로 또는 체계적으로 투여될 수 있다. 펩티드는 예를 들어, 주사, 융합, 발산, 이식, 국부적 적용, 또는 경구 전달에 의해 투여될 수 있다.

펩티드는 고정 복용량(fixed dose)으로, 또는 ㎍/kg 이나 mg/kg 복용량으로 투여될 수 있다.

또한 복용량은 펩티드에 대항하는 항체의 생산을 줄이거나 피하기 위해 선택될 수 있다.

또한 펩티드의 투여의 루트 및/또는 모드는, 예를 들어, 피검체를 평가하거나 모니터링함으로써, 예를 들어, 근전도 검사(electromyography),신경 전도 연구, 유발 전위 연구, 자기 공명 화상법, 신경학적 검사, X-레이, 및/또는 예를 들어 요통을 평가하는 기준과 같은 특정 장애와 관련된 표준 파라미터를 사용함으로써, 개개인의 케이스에 따라 설계될 수 있다.

복용량 처방은 원하는 반응, 예를 들어, 치료적인 반응 또는 조합 치료 효과, 를 제공하기 위해 조정된다. 일반적으로 펩티드(및 선택적인 2차적 제제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된)의 복용량(분리되거나 함께 만들어진)의 어떠한 조합은 생물학적 활성 양으로 펩티드와 함께 피검체에게 공급하기 위하여 사용된다. 예를 들어, 0.1 ㎍/kg-10 mg/kg, 1 ㎍/kg-1 mg/kg, 1 ㎍/kg-100 ㎍/kg, 5 ㎍/kg-500 ㎍/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.5-100 mg/kg, 1 mg/kg-100 mg/kg, 0.5-20 mg/kg, 또는 1-10 mg/kg 의 범위의 복용량이 투여될 수 있다. 또한 다른 복용량이 사용될 수 있다.

복용량 단위 형태 또는 본 명세서에서 사용된 "고정 복용량"이란 처치될 환자에게 있어 단일한 함량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하고; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 관련이 있고 선택적인 다른 제제와 관련이 있는 원하는 치료적 효과를 제공하기 위해 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다. 단일 또는 복합(multiple) 복용량이 주어질 수 있다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 펩티드가 지속적인 주입 경로로 투여될 수 있다.

펩티드는, 예를 들어, 하루에 한번 또는 두 번, 또는 일주일에 약 한 번 내지 네 번, 또는 바람직하게는 주별로, 격주로, 또는 매달, 예를 들어, 약 1 내지 10주 동안, 또는 피검체가 치료에 긴 기간이 걸린다면 필요한 만큼 더 오랫동안 투여될 수 있다. 숙련된 기술자는 피검체를 치료하는데 효과적이라고 요구되는 복용량과 시간에 영향을 줄 수 있는 특정 요인들을 고려할 것이고, 이는 매우 힘든 질병이나 장애, 제제화, 전달 루트, 이전의 치료, 피검체의 일반적인 건강 및/또는 나이, 현재의 다른 질병 및 피검체가 받고 있는 다른 치료들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 게다가, 치료학적으로 유효량의 펩티드로 피검체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있고, 또는, 바람직하게, 시리즈의 치료를 포함할 수 있다. 또한 동물 모델은 유용한 복용량, 예를 들어, 최초의 복용량 또는 처방,을 결정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물 연구는 펩티드 지속에 의해 세포외 기질이 얼마나 오랫동안 촉진되는지를 측정하는데 사용될 수 있다.

만약 피검체가 조직 손상, 질병, 또는 외상 때문에 조직 변성(예를 들어, 조직 구조가 노화나 조직 손실로 손상되는)의 위험에 있다면, 펩티드는 조직 변성을 야기할 수 있는 사건 전이나 그 동안, 예를 들어, 예방 처치로, 투여될 수 있다. 그러한 예방적 치료 지속기간은 펩티드의 단일 투약이 될 수 있거나 또는, 예를 들어 피검체에서 손실을 최소화하기 위해, 그 사건 이전, 그 사건 동안, 및/또는 그 사건 이후의 시점부터 (예를 들어, 복합 투약) 계속될 수 있다. 예를 들어, 조직의 위험에 있는 피검체는, 일어날 조직 손실을 예방하기 위해 또는 경험할 조직 손실의 양을 줄이기 위해, 조직 변성을 일으킬 수 있는 사건 이전에 수시간 또는 수일 동안 펩티드로 치료될 수 있다.

약제학적 조성물은 본 명세서에 설명된 펩티드의 "약제학적으로 유효량"을 포함할 수 있다. 그러한 유효량은 투여되는 제제(예, 펩티드)의 효과, 또는 만약 더 사용되는 하나 이상의 제제가 있다면 그 제제의 조합적인 효과에 기초해서 결정될 수 있다. 또한 제제의 치료학적으로 유효량은 통증, 질병 상태, 나이, 성별, 및 피검체의 무게, 및 피검체에서 원하는 반응,예를 들면, 상처 회복, 을 이끌어내는 제제의 능력과 같은 요인들에 따라 변화시킬 수 있다. 또한 치료학적으로 유효량은 치료학적으로 유익한 효과가 조성물의 어떠한 독성이 있거나 해로운 효과를 능가하는 것이다.

본 명세서에 개시된 대로, "피검체"는 손상되거나, 질병이 들었거나, 상실되어서 조직을 생성시키거나 회복시키기 위한 세포외 기질의 회복, 재건, 또는 대체의 필요가 있는 어떠한 개체, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간, 농장 동물(예, 말, 당나귀, 노새, 소, 젖소, 황소, 양, 돼지, 등), 가정내 애완동물(예, 개, 고양이, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 기니어피그, 패럿, 등), 또는 동물원 동물(예, 기린, 사자, 호랑이, 곰, 얼룩말, 원숭이, 고릴라, 고래, 돌고래, 등)이 될 수 있다.

시험관 내( in vitro ) 사용

팹티드는, 예를 들어, 연구, 또는 손상되거나 병든 조직을 대체하기 위한 인공 보철물이나 임플란트(implants)를 만들기 위해, 세포, 예를 들어, 호스트 세포(host cell),에 의해 점유되었을 때, 기능을 하는 조직이 되기 위해 리모델링되는, 스캐폴드(scaffolds)를 제공하기 위한 모델 시스템으로서, 시험관 내 사용될 수 있다.

장치 및 키트

펩티드를 포함하는 약학 조성물은 의학적 장치와 함께 투여될 수 있다. 장치는, 예를 들어, 펩티드를 포함하는 약제학적 제제를 저장하기 위한 하나 이상의 하우징(housing)을 포함할 수 있고, 펩티드의 하나 이상의 단위 복용량을 전달하기 위해 구성될 수 있다. 그 장치는, 펩티드를 또한 포함하는 단일 약제학적 조성물로서이거나 또는 두 개의 분리된 약제학적 조성물로서, 2차 제제(예를 들어, 본 명세서에 개시된 조직 생성 또는 상처 회복 제제)를 투여하기 위해 더 구성될 수 있다.

예를 들어, 약제학적 조성물은 임플란트, 모듈, 또는 펌프(예, 미국 특허 4,487,603; 4,447,233; 4,447,224)에 의한; 피부 투여 장치(예, 미국 특허 제4,486,194호)에 의한, 그리고 삼투 약 전달 시스템(예, 미국 특허 제4,439,196호)에 의한, 바늘이 없는 피하용 주사 장치(예, 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556)로 투여될 수 있다. 여러 다른 장치, 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 역시 알려져 있다.

펩티드는 키트로 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 키트는 (a)본 명세서에 개시된 펩티드를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 및 선택적으로 (b) 보충 재료를 포함한다. 보충 재료는 설명적, 교육적, 홍보적일 수 있고, 또는 본 명세서에 개시된 방법 및/또는 치료적인 이점을 위한 펩티드의 사용과 관련이 있는 다른 재료일 수 있다.

일 실시태양에서, 또한 키트는 조직 생성 또는 상처 회복을 위한 2차 제제, 예를 들어, 본 명세서에 설명된 다른 제제, 를 포함한다. 예를 들어, 키트는 펩티드를 포함하는 조성물을 포함하는 1차 용기, 2차 제제와 선택적인 보충 재료를 포함하는 2차 용기를 포함한다.

펩티드 이외에, 키트 안의 조성물은, 용매나 버퍼, 안정화제, 또는 보존제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 펩티드는, 예를 들어, 액체, 건조되거나 동결 건조된 형태, 바람직하게 실질적으로 순수한(pure) 그리고/또는 증류된, 어떠한 형태로 제공될 수 있다. 제제가 건조된 형태로 제공될 때, 일반적으로 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성된다. 용매, 예를 들어, 증류수나 버퍼,는 선택적으로 키트안에서 제공될 수 있다.

키트는 선택적으로 조성물의 투여에 적합한 장치, 예를 들어, 세척기 또는 다른 적합한 전달 장치,를 포함한다. 장치는, 하나 또는 둘의 제제로 사전 로딩되어(pre-loaded) 제공되거나, 비어있지만 로딩에 적합하게 제공될 수 있다.

실시예

본 발명에 기술된 실시예는 표 1에 나타낸 합성 펩티드를 이용하였고, 오르페젠 파마(ORPEGEN Pharma(Germany))에 의해 합성되었다.

펩티드	분자량	서열
CNF011.05A	2452.8	VSKFDMNAYQGTWYEIKKFP	SEQ ID NO:2
CNF011.05B	2165.4	APLWILSTDYDNYAIGYSC	SEQ ID NO:3
CNF011.05C	2305.7	IWILSRTKTLNESSKSTVNK	SEQ ID NO:4
CNF011.05D	1310.5	YAIGYSCKDYK	SEQ ID NO:1

실시예 1

세포 생존력( Viability )의 효과

세포 생존력(% 생존력)에 대한 테스트는 감소된(reduced) 혈청 조건과 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라조리움 브로마이드) 비색 분석법(Mosmann, 1983)을 사용하여 실험하였다. 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1은 1% FBS로 RPMI 1640에서 48시간 동안 함께 배양했을 때 내피 세포(HUVEC)의 세포 생존력(% 생존력)에 있어서 펩티드(5　㎍/ml)의 효과를 나타낸 것이다. 대조군은 1% FBS(펩티드 없이)로 RPMI 1640에서 배양한 세포를 가진다.

도 2는 1% FBS로 보충된 RPMI 1640에서 120시간 동안 함께 배양했을 때 내피 세포의 세포 생존력(% 생존력)에 있어서 CNF011.05B의 농도 차이에 대한 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 1% FBS로 보충된 RPMI 1640에서 48시간 동안 함께 배양했을 때 내피 세포의 세포 생존력(% 생존력)에 있어서 CNF011.05D의 농도 차이에 대한 효과를 나타낸 것이다.

결과는 펩티드 CNF011.05B와 CNF011.05D (5　㎍/ml)가 우태아 혈청(FBS)의 결핍에 의해 유도된, 아마, 예정된 세포 죽음 및 아폽토시스를 저해하는 메커니즘을 통해, 아폽토틱(apoptotic) 조건 하에서 세포 생존력을 상승시키는 것을 증명한다.

세포 생존력에서의 증강은, (1) 상처에서 세포 생존력을 증가시키고 (2) 상처에서 기질 상실을 방지할 수 있는 그러한 증강을 위해(Gilbert et . al., Tissue Eng., 2009, Jan 2., electronic PubMed submission), 상처 회복에 있어서 CNF011.05B 및 CNF011.05D의 사용을 지지한다. 또한 세포 생존력에서 그러한 증강은 조직 생성과 조직 변성의 방지에 있어서 이들 펩티드의 사용을 지지한다.

실시예 2

일산화질소( NO )의 생산

위스타 래트(Wistar Rats)의 호중구 또는 초기 배양된 내피 세포를 CNF011.05D (3.0㎍/mL) 및/또는 NO 합성효소의 저해제(그리고 따라서, NO 의 저해제와 그 결과인 대사 산물 NO₂ 생산)인, 1M L-NAME의 존재 하에서, 감소된 혈청 배지(1%)에서 배양하였다. 24시간 후에, 세포 생존력을 FITC 애넥신(annexin) V (1:500)와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) (50　mg/ml의 10 ㎕)로 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용하여 측정하였다. 호중구(도 4)와 초기 내피 세포(도 5) 모두의 생존력이 펩티드 CNF011.05D 단독으로는 증가하였고, 이러한 증가는 L-NAME의 존재하에서 감소하였다.

일산화질소( NO )의 측정

CNF011.05D (1.5 ㎍/ml)와 함께 18시간동안 배양된 호중구와, 배지(culture)로 분비된 NO₂ 대사 산물인 NO 생산을 그리스 반응(Griess reaction)을 사용하고, 550nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 도 9는 펩티드 CNF011.05D가 NO₂의 생산을 증가시키고, 따라서 치료된 세포에서 NO의 생산을 증가시키는 것을 증명한다.

유도된 NO의 생산은 상처 회복에서 CNF011.05D 의 사용을 지지하는데, (1) 상처에서 세포는 치유의 증식 단계와 치유 과정 동안 NO를 생산하고(Witte and Barbul, Am . J. Surg. 183:406-12 (2002))); 그리고 (2) 상처에서 NO는, 예를 들어, 상처에서 혈관신생(angiogenesis)을 증가시키고, 치유에 중요한 염증 세포를 상처로 모집하여(Zhu et . al., J.　 Burn Care Res. 29:804-14 (2008)), 치유를 증강한다

실시예 3

세포외 기질 단백질의 생산

인간 섬유아세포는 10세 내지 40세의, 5명의 아프리카계-브라질인인 여성 제공자로부터, 귓볼 피부 절편(0.5 x 0.5 cm)을 얻어서, 각각 2/05, 3/05, 4/05, 6/05 및 8/05라고 불렀다. 제공자들은 자발적인 동의 후에 외과적 수술 환경에서 절개 생검(excisional biopsies)에 따랐다.

6번째 2차배양(subculture)에서의 세포를 증류된 배양 플레이트에 놓고 4일 동안 배양액에서 0.35　㎍ 와 5　㎍ 농도의 CNF011.05D와 함께 배양하였다. 대조군 그룹은, 생리 식염수 용액(CNF011.05D의 용매)이 CNF011.05D를 대신하여 첨가된, 같은 조건 하에서 배양된 섬유아세포로 구성되었다.

간접적인 면역형광법을 항-피브로넥틴(Anti-fibronectin)(세포의) mAb 또는 항-인간 테나신 mAb (Sigma-USA); 및 (2)Alexa Fluor 488 (Molecular Probes-USA)를 사용하여 수행하였다.

피브로넥틴의 생산

테스트된 샘플은 FBN-CN (식염수로 처리된 세포), FBN-0.35 (0.35㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포), 및 FBN-5㎍(5㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포)이다.

피브로넥틱의 생산을 위한 간접 면역 형광으로부터 결과를 도 7에 나타내었고, 그 결과는 0.35㎍의 CNF011.05D와 함께 배양된 섬유아세포에 의한 피브로넥틴의 생산에 있어서 상당한 증대(p<0.001)를 증명한다.

테나신의 생산

테스트된 샘플은 CN (식염수로 처리된 세포), TN-0.35 (0.35㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포), 및 TN-5㎍(5㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포)이다.

도 8에서 테나신 생산을 위한 간접 면역 형광으로부터 결과는 0.35㎍의 CNF011.05D와 함께 배양된 섬유아세포에 의한 테나신 생산에 있어서 상당한 차이(p<0.001)를 보여주었다.

프로콜라겐의 생산

테스트된 샘플은 %프로콜/대조군(식염수로 처리된 세포), %프로콜/0.35(0.35㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포), 및 %프로콜/5㎍(5㎍의 CNF011.05D로 처리된 세포)이다.

도 9에서 프로콜라겐 생산을 위한 간접 면역 형광으로부터 결과는 0.35㎍의 CNF011.05D와 함께 배양된 섬유아세포에 의한 프로콜라겐 생산에 있어서 상당한 차이(p<0.001)를 보여주었다.

실시예 4

진피에서의 콜라겐 생산

콜라겐의 수준을 CNF011.05D의 다른 투여 후에 시험하였다: 한번 피하 투여, 두 번 피하 투여, 그리고 네 번 피하 투여하였다.

CNF011.05D(0.30㎍)(그룹 AE와 BE) 또는 식염수(그룹 AD와 BD)의 한번 피하 투약 후의 동물의 진피에서의 퍼센트 콜라겐. 값은 최종 투여 후 1주, 2주, 또는 12주일 때 얻었다.

대조군 피부		콜라겐 (%)	투여 후의 평가	처치 횟수	한번 투여	처치된 피부		콜라겐 (%)
동물	피부	콜라겐 (%)	투여 후의 평가	처치 횟수	한번 투여	동물	피부	콜라겐 (%)
G2S1AD	2ad	27.83	1 주	1	0.30	G2S1Ae	2ae	41.20
G2S1BD	2bd	38.07	1 주	1	0.30	G2S1Be	2be	57.15

G2S2AD	8ad	32.78	2 주	1	0.30	G2S2Ae	8be	43.78
G2S2BD	8bd	33.99	2 주	1	0.30	G2S2Be	8ae	39.20

G2S5AD	19ad	28.24	12 주	1	0.30	G2S5Ae	19ae	29.57
G2S5BD	19bd	21.68	12 주	1	0.30	G2S5Be	19be	27.22

CNF011.05D(0.30㎍)(그룹 AE와 BE) 또는 식염수(그룹 AD와 BD)의 두 번 피하 투여 후의 동물의 진피에서의 퍼센트 콜라겐. 투여를 일 주 분리하여 실시하였고, 값은 최종 투약 후 1주 또는 12주일 때 얻었다.

대조군 피부		콜라겐 (%)	투여 후의 평가	처치 횟수	총 투여	처치된 피부		콜라겐 (%)
동물	피부	콜라겐 (%)	투여 후의 평가	처치 횟수	총 투여	동물	피부	콜라겐 (%)
G6S2AD	9ad	24.27	2 주	2	0.60	G6S2AE	9ae	44.19
G6S2BD	9bd	30.00	2 주	2	0.60	G6S2BE	9be	37.91

G6S6AD	21ad	24.71	12 주	2	0.60	G6S6AE	21ae	39.23
G6S6BD	21bd	29.12	12 주	2	0.60	G6S6BE	21be	47.33

(0.30㎍)(그룹 AE와 BE) 또는 식염수(그룹 AD와 BD)의 네 번 피하 투여 후의 동물의 진피에서의 퍼센트 콜라겐. 연속적인 투여는 일 주씩 하였고, 값은 최종 투약 후 4주 일 때 얻었다.

대조군 피부		콜라겐(%)	투여 후의 평가	처치 횟수	전체	처치된 피부		콜라겐(%)
동물	피부	콜라겐(%)	투여 후의 평가	처치 횟수	전체	동물	피부	콜라겐(%)
G6S4AD	13ad	25.23	4 주	4	1.20	G6S4AE	13ae	37.60
G6S4BD	13bd	24.42	4 주	4	1.20	G6S4BE	13be	34.94

실시예 5

래트에서의 상처 치유

펀치(punch) 상처의 크기와 현미경에 의한 외관을 CNF011.05D 한번 투여 후 래트에서 측정하였다. 래트는 6 내지 8 주령의 위스타 래트(Wistar rats)였고, 마취시킨 후 그들의 뒷면의 등쪽에서 수술을 하였다. 털을 깎아내고 멸균하여 세정한 다음, 6mm 펀치 생검(biopsy punch)을 사용하여 각각의 래트에 상처를 만들었다. 상처를 낸 후 멸균 거즈로 건조시킨 후, 상처에 붕대를 감거나(표준 케어) 또는 (2)붕대를 감은 다음 CNF011.05D의 적용 (식염수에서 235nM)하였다. 3, 7, 14,및 21일에 상처를 수의사에 의해 측정하였고,그 날 이후-부상, 및 cm² 내의상처의 크기에 대해 정상적으로 치유되었는지에 관해 기록하였다.

표 5에서는 시간 지점마다 8 래트에 대한 수술 후의 다른 시간에서 펀치 상처의 크기를 나타낸 것이다. CNF011.05D 는 더 빠른 속도로 상처 크기를 줄이는 것을 증명한다.

샘플	3 일 크기	7 일 크기	14 일 크기	21 일 크기
표준(Standard)	0.229 cm²	0.093 cm²	0.069 cm²	반흔(Scar)
CNF011.05D	0.200 cm²	0.084 cm²	0.053 cm²	반흔(Scar) **

21일 시간지점은 닫혀진 상처와 반흔을 보여준다. CNF011.05D로 처치된 상처는 표준 케어(음성 대조군)에 비하여 감소된 크기와 색의 반흔을 가졌다.

실시예 6

돼지(Pigs)에서의 상처 치유

새살 조직 형성의 수준- 치유(과정)의 증식 단계의 마커-는 매일 CNF011.05D 또는 양성 대조군(베캅러민 젤(Bacaplermin gel) 0.01%)의 투여 후의 펀치 상처를 측정하였다. 상처입은 동물은 20주령의 국내 요크셔 잡종 돼지였고, 마취시킨 후 그들의 뒷면의 등쪽에서 수술을 하였다. 털을 깎아내고 멸균하여 세정한 다음, 8mm 펀치 생검(biopsy punch)을 사용하여 각각의 돼지에게 8개의 가득한 두꺼운 상처를 만들었다.

상처를 낸 후 멸균 거즈로 건조시킨 후, 붕대를 감흔 다음 다른 처치(표 6과 7)를 적용하였다. 긴 수술 후 모니터링은 14일 동안 수술 부위의 매일 점검을 포함하였다. 매일의 점검은, 붕대를 다시 감은 다음, 상처의 소독, 같은 처치의 재적용-표준 케어 또는 양성 대조군 또는 CNF011.05D (1x) 또는 CNF011.05D (100x)-를 포함하였다. 1, 4, 7, 10, 및 14일에 상처를 수의사에 의해 측정하였고,그 날 이후 부상, 및 전체 상처를 필링하는(filling) 새살 조직의 초기 모습에 대해 상처가 정상적으로 치유되었는지에 관해 기록하였다.

상처를 낸 후 멸균 거즈로 건조하고, (1)4개의 상처는 붕대(표준 케어)를 감고; (2)4개의 상처는 붕대를 감은 후 양성 대조군을 적용하고; (3)6개의 상처는 붕대를 감은 후 CNF011.05D (1x) (식염수에서 1.57 ㎍/ml로 1ml) 을 적용하고; (4) 6개의 상처는 붕대를 감은 후 CNF011.05D (식염수에서 157 ㎍/ml로 1ml)(100X)을 적용하였다.

전체 상처를 필링하는 새살 조직의 초기 모습을 가진 상처를 표 6에서 Yes 줄로 표시하였다. CNF011.05D (1x)와 CNF011.05D (100x)는 표준 케어(음성 대조군) 보다 전체 필링 속도가 더 빠른 것을 증명한다.

샘플	새살 조직 필링(Granulation Tissue Filling)	1 일	5 일	7 일	10 일	14 일
표준(Standard)	Yes	-	1	2	3	3
표준(Standard)	No	4	3	2	1	1
양성(Positive)	Yes	-	2	3	3	4
양성(Positive)	No	4	1	1	1	-
CNF011.05D 1x	Yes	-	3	4	6	6
CNF011.05D 1x	No	6	3	2	-	-
CNF011.05D 100x	Yes	-	-	1	6	6
CNF011.05D 100x	No	6	6	5	-	-

상처를 낸 후 멸균 거즈로 건조하고, (1) 2개의 상처는 붕대를 감은 후 CNF011.05D (1x) (히드록시에틸 셀룰로스/글리세린(20%/80%)에서 1.57 ㎍/ml로 1ml 연고)를 적용하고; 그리고 (2) 2개의 상처는 붕대를 감은 후 CNF011.05D (100x) (히드록시에틸 셀룰로스/글리세린(20%/80%)에서 157 ㎍/ml로 1ml 연고)를 적용하였다.

전체 상처를 필링하는 새살 조직의 초기 모습을 가진 상처를 표 7에서 Yes 줄로 표시하였다. CNF011.05D 연고는 표준 케어(음성 대조군) 또는 CNF011.05D 식염수(표 6)에 비하여 전체 필링 속도가 더 빠른 것을 증명한다.

샘플	새살 조직 필링(Granulation Tissue Filling)	1 일	5 일	7 일	10 일	14 일
CNF011.05D 1x	Yes	-	2	2	2	2
CNF011.05D 1x	No	2	-	-	-	-
CNF011.05D 100x	Yes	-	2	2	2	2
CNF011.05D 100x	No	2	-	-	-	-

<110> CHUDZINSKI TAVASSI, Ana Marisa Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo-FAPESP Biolab Sanus Farmaceutica Ltda. <120> PEPTIDES, COMPOSITIONS, AND USES THEREOF <130> IF10P089BR <150> US 61/022,747 <151> 2008-01-22 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 1 Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Cys Lys Asp Tyr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 2 Val Ser Lys Phe Asp Met Asn Ala Tyr Gln Gly Thr Trp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Lys Lys Phe Pro 20 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 3 Ala Pro Leu Trp Ile Leu Ser Thr Asp Tyr Asp Asn Tyr Ala Ile Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Cys <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 4 Ile Trp Ile Leu Ser Arg Thr Lys Thr Leu Asn Glu Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Val Asn Lys 20 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 5 Ala Pro Leu Trp Ile Leu Ser Thr Asp Tyr Asp Asn Tyr Ala Ile Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Cys Lys Asp Tyr Lys 20 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 6 Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Cys 1 5 <210> 7 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <400> 7 gcaccgctgt ggattctttc tactgattac gacaactatg ctatcggcta ctcctgcaaa 60 gactacaag 69

Claims

YAIGYSCKDYK (SEQ ID NO:1)인 아미노산 서열로 구성된 분리된 펩티드.
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제1항에 있어서, 상기 펩티드는 섬유아세포에서 하나 이상의 세포외 기질 단백질의 생산을 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
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제1항에 따른 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 피검체의 조직 재생용 또는 상처 치료용 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 수용성 희석제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 액체 또는 연고의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 상처 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 구강(oral), 근육내(intramuscular), 혈관내(intravenous), 피하(subcutaneous), 국소부위(topical), 폐(pulmonary), 비내(intranasal), 협측(buccal), 직장내(rectal), 혀밑(sublingual), 피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 또는 척수강내(intrathecal) 용도를 위해 만들어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 국소 부위 용도 또는 피내 용도를 위해 만들어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 피검체의 세포 사멸을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 세포 사멸은 질병, 외상, 또는 노화에 의해 야기된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 피검체의 조직 변성(degeneration)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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제16항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
제28항에 있어서, 상기 키트는 상처 치료제를 더 포함하는 것인 키트.
제28항에 있어서, 상기 키트는 보충 자료를 더 포함하며, 상기 보충 자료는 상기 약학적 조성물이 상처 치료제와 조합하여 사용될 수 있음을 설명하는 것인 키트.
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