KR101534494B1 - Phamaceutical Compostions for Preventing and Treating Vascular Diseases Comprising Docosahexaenoic Acid - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 DHA(docosahexaenoic acid)를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases comprising DHA (docosahexaenoic acid) as an active ingredient.
Sirt2(silent information regulator 2)는 NAD-의존성 히스톤 탈아세틸화 효소이며, SIRT1은 Sirt2의 포유류 상동기관(ortholog)으로서, 히스톤 및 eNOS와 같은 비-히스톤에서 라이신 잔기의 탈아세틸화를 타게팅하며, eNOS 탈아세틸화를 통해 내피 의존성 혈관확장을 촉진한다.Sirt2 (silent information regulator 2) is an NAD-dependent histone deacetylase and SIRT1 is a mammalian homolog of Sirt2 that targets deacetylation of lysine residues in non-histones such as histones and eNOS, while eNOS Deacetylation to promote endothelium-dependent vasodilation.
고도불포화지방산(n-3-polyunsaturated fatty acids; PUFAs)은 혈관 내피 기능, 면역 반응, 혈압 조절, 지질 상태, 세포 증식, 혈액 응고 및 염증에 유익한 역할을 한다. 그중 DHA(docosahexaenoic acid)는 혈관 내피 기능을 강화함으로써 래트와 사람에서 동맥 혈압 및 치명적인 부정맥을 감소시키며, 혈관 확장 메커니즘을 향상시킨다고 알려져 있다. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) play a beneficial role in vascular endothelial function, immune response, blood pressure control, lipid status, cell proliferation, blood coagulation and inflammation. Among them, DHA (docosahexaenoic acid) is known to enhance arterial blood pressure and lethal arrhythmia in rats and humans by enhancing vascular endothelial function and improve the vasodilatory mechanism.
그러나 혈관 내피 세포에서 eNOS의 활성과 NO의 생물학적 이용가능성 증가에 대한 정확한 메커니즘에 대해서는 밝혀진 바 없다.
However, the precise mechanisms for the activation of eNOS and the increased bioavailability of NO in vascular endothelial cells have not been elucidated.
이에, 본 발명의 목적은 혈관 기능 개선 효과를 갖는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition having an effect of improving vascular function.
이를 위하여, 본 발명은 DHA(docosahexaenoic acid)를 유효성분으로 포함하는 SIRT1(silent information regulator 1) 발현 유도용 조성물을 포함하는 혈관병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.To this end, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases comprising a composition for inducing SIRT1 (silent information regulator 1) expression comprising DHA (docosahexaenoic acid) as an active ingredient.
본 발명의 약학적 조성물은 SIRT1 발현을 조절함으로써 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 탈아세틸화를 유도하는 것을 특징으로 하며, eNOS 칼모둘린 결합 도메인의 라이신 496 또는 라이신 506 잔기의 탈아세틸화를 유도할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is characterized by inducing deacetylation of eNOS (endothelial nitric oxide synthase) by regulating SIRT1 expression and inducing deacetylation of lysine 496 or lysine 506 residue of eNOS calmodulin binding domain can do.
본 발명의 약학적 조성물은 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 탈아세틸화를 유도함으로써 혈중 NO(nitric oxide)의 생성능을 갖는다.The pharmaceutical composition of the present invention has the ability to produce nitric oxide (NO) in the blood by inducing deacetylation of eNOS (endothelial nitric oxide synthase).
본 발명에 있어서 상기 혈관병증은 심근경색, 동맥경화 및 고혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
In the present invention, the vascular disease can be selected from the group consisting of myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertension.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 혈중 NO(nitric oxide) 생성을 촉진시킴으로써 혈관 기능을 개선하는 효과를 나타내며, 심근경색, 동맥경화, 고혈압 등 혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition according to the present invention has an effect of improving vascular function by promoting the production of NO (nitric oxide) in blood and can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases such as myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertension .
도 1은 DHA에 의한 SIRT1 발현 증가 효과를 나타내는 실험 결과로서, 도 1A는 DHA 농도 의존적으로 SIRT1 발현이 증가하는 것을 나타내며, 도 1B는 DHA 처리 시간이 증가할수록 SIRT1 발현이 증가하는 것을 나타내며, 도 1C는 DHA 처리 시간이 증가할수록 SIRT1 mRNA 발현이 증가하는 것을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 2는 DHA에 의한 eNOS의 탈아세틸화 유도 효과를 나타내는 실험 결과로서, 도 2A는 DHA 농도가 증가할수록 아세틸화 라이신이 감소하는 것을 나타내며, 도 2B는 RNAi에 의해 SIRT1 발현을 억제하였을 때 eNOS 탈아세틸화에 영향이 없음을 나타낸 결과이다.
도 3은 DHA에 의한 NO 증가를 나타내는 실험 결과로서, 도 3A는 DHA 농도가 증가할수록 SIRT1 발현 증가와 함께 NO 생성량이 증가하는 것을 나타내며, 도 3B는 eNOS의 탈아세틸화에 관여하는 라이신 잔기가 K469 및 K506이라는 것을 입증하는 결과이다.
도 4는 DHA가 래트 대동맥 고리에서 SIRT1 발현을 증가시키고, 생물학적으로 이용 가능한 NO 생성을 증가시킨다는 점을 나타내는 실험 결과이다.FIG. 1 shows the results of experiments showing the effect of increasing the expression of SIRT1 by DHA. FIG. 1A shows that SIRT1 expression increases in a DHA concentration-dependent manner. FIG. 1B shows that expression of SIRT1 increases with increasing DHA treatment time. Showed that SIRT1 mRNA expression increased as DHA treatment time increased.
FIG. 2 shows the results of experiments showing the effect of DHA on the deacetylation of eNOS. FIG. 2A shows that the acetylated lysine decreases as the DHA concentration increases. FIG. 2B shows that when the expression of SIRT1 is suppressed by RNAi, Acetylation. ≪ / RTI >
FIG. 3 shows the results of experiments showing an increase in NO by DHA. FIG. 3A shows that NO production is increased with increasing SIRT1 expression as DHA concentration increases. FIG. 3B shows that lysine residues involved in deacetylation of eNOS are K469 And K506. ≪ / RTI >
Figure 4 shows experimental results showing that DHA increases SIRTl expression in rat aortic rings and increases biologically available NO production.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 DHA(docosahexaenoic acid)를 유효성분으로 포함하는 혈관병증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of vascular diseases comprising DHA (docosahexaenoic acid) as an active ingredient.
본 발명의 조성물은 본 발명의 약학적 조성물은 SIRT1 발현을 조절함으로써 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 탈아세틸화를 유도하며, 혈관 내피 세포에서 생물학적으로 이용 가능한 NO(nitric oxide) 생성을 촉진함으로써 혈관 기능을 개선할 수 있다.In the composition of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention induces deacetylation of eNOS (endothelial nitric oxide synthase) by regulating SIRT1 expression and promotes the production of biologically available nitric oxide (NO) in vascular endothelial cells, The function can be improved.
본 발명의 조성물은 심근경색, 동맥경화 및 고혈압을 포함하는 혈관병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물일 수 있다.The composition of the present invention may be a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases including myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertension.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 도포하여 사용할 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally and can be applied and used in the form of a general pharmaceutical preparation. The preferred pharmaceutical preparations are those for oral administration such as tablets, hard or soft capsules, liquids, suspensions, etc. These pharmaceutical preparations can be prepared into conventional pharmaceutically acceptable carriers, for example, excipients such as excipients, Binders, disintegrators, lubricants, solubilizers, suspending agents, preservatives or extenders.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 체중, 심혈관의 손상 정도, 질환의 진행 정도 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.01 mg 내지 10 g, 바람직하게는 1 mg 내지 5 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. The dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be determined by a specialist depending on various factors such as the condition of the patient, age, weight, degree of cardiovascular damage, progress of the disease, etc. Generally, 0.01 mg to 10 g, preferably from 1 mg to 5 g. Also, the daily dosage of the pharmaceutical composition per unit dosage form, or a half, 1/3 or 1/4 dose thereof, may be contained, and may be administered 1 to 6 times per day. However, in the case of long-term ingestion, the amount may be less than the above range, and since the active ingredient has no problem in terms of safety, it may be used in an amount in the above range.
또한 본 발명의 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 조성물을 첨가하는 것도 포함된다.
The composition of the present invention may also be a food composition. The food is not limited to health supplements, health functional foods, functional foods and the like, and includes the addition of the composition of the present invention to natural foods, processed foods, and general food ingredients.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
<실험 방법 및 재료><Experimental Methods and Materials>
1. 세포 배양 및 생존력 분석법1. Cell culture and viability assay
세포 시료 HUVECs는 클로네틱스(USA)에서 구입하였으며, 내피 성장 배지에서 배양하였다. HUVEC의 생존력에 대한 DHA의 효과는 ADAM-MC 자동 세포 계수기(Digital Bio, KR)로 측정하였다.
Cell samples HUVECs were purchased from Cronetics (USA) and cultured in endothelial growth medium. The effect of DHA on the viability of HUVEC was measured with an ADAM-MC automated cell counter (Digital Bio, KR).
2. 항체 및 면역블로팅 방법2. Antibodies and Immunoblotting Methods
항-eNOS 항체 및 항-SIRT1 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, USA)에서 구입하였으며, 항-아세틸 라이신 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, USA)에서 구입하였다. Anti-eNOS antibodies and anti-SIRT1 antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology, USA and anti-acetyl lysine antibodies were purchased from Cell Signaling Technology, USA.
eNOS의 라이신 아세틸화는 아세틸 라이신(Ac-K) 항체로 면역침강시킨 eNOS의 면역블로팅에 의해 측정하였다. 2 μg의 항체를 1 mg의 세포 용해물(lysate) 또는 조직 균질액에서 하룻밤 동안 배양하여 eNOS의 면역침강을 수행하으며, 다음으로 4시간 동안 30-μL 단백질 A-세파로스 슬러리 (Amersham, USA)를 첨가하였다. 세척 후 면역침강물을 SDS-PAGE 젤 로딩 버퍼에서 놓고, 전기영동에 의해 분리하였으며, 니트로셀룰로스 필터로 옮겨서 eNOS 및 Ac-K 항체와 적당한 퍼옥시다제 결합 2차 항체(Santa Cruz, USA)로 검출하였다. 화학발광 신호는 Super Signal West Pico or Femto Substrate (Pierce, USA)로 현상하였다. 적당한 1차 및 2차 항체를 사용하여 50 μg 전체 세포 용해물 또는 조직 균질액의 웨스턴 블롯을 수행하였고, Quantity One 소프트웨어(Bio-Rad, USA)를 이용한 Gel Doc 2000 Chemi Doc 시스템으로 블럿을 이미지화, 정량화 하였으며, β-액틴을 대조군으로 하여 표준화하였다.
lysine acetylation of eNOS was measured by immunoblotting of eNOS immunoprecipitated with acetyl-lysine (Ac-K) antibody. 2 μg of antibody was incubated overnight in 1 mg of lysate or tissue homogenate to perform immunoprecipitation of eNOS followed by a 30-μL protein A-Sepharose slurry (Amersham, USA ). After washing, the immunoprecipitates were placed in SDS-PAGE gel loading buffer, separated by electrophoresis, transferred to a nitrocellulose filter, and detected with eNOS and Ac-K antibodies and a suitable peroxidase-conjugated secondary antibody (Santa Cruz, USA) . Chemiluminescent signals were developed with Super Signal West Pico or Femto Substrate (Pierce, USA). Western blotting of 50 μg whole cell lysate or tissue homogenate was performed using appropriate primary and secondary antibodies and the blot was imaged with the Gel Doc 2000 Chemi Doc system using Quantity One software (Bio-Rad, USA) , And β-actin was standardized as a control.
3. Real-time PCR 방법3. Real-time PCR method
세포 또는 쥐의 가슴 대동맥으로부터 AGPC법(Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. Super Script III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, USA)를 사용한 Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)로 RT-PCR을 수행하였으며, 인간 SIRT1의 프라이머로서 5'-AAG TAC AAT CCA CTC CGG AAT GA-3'과 5'-GGG CCC CAG GGA TGA AG-3'를 사용하였다. 인간 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 대조군으로 사용하였으며, 이의 프라이머로는 5'-ATG ACA TCA AGA AGG TGG TG-3'과 5'-CAT ACC AGG AAA ATG AGC TTG-3'을 사용하였다. 프라이머 이량체의 이상 형성을 체크하기 위해 해리곡선을 관찰하였다.
Total RNA was isolated from cells or rat thoracic aorta using AGPC method (Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform). RT-PCR was performed with a Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA) using Super Script III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, USA) and 5'-AAG TAC AAT CCA CTC CGG AAT GA-3 'and 5'-GGG CCC CAG GGA TGA AG-3' were used. Human GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) was used as a control, and 5'-ATG ACA TCA AGA AGG TGG TG-3 'and 5'-CAT ACC AGG AAA ATG AGC TTG-3' were used as primers. The dissociation curves were observed to check for the formation of abnormalities in the primer dimer.
4. RNA 간섭 및 트랜스펙션 방법4. RNA interference and transfection methods
인증된 SIRT1의 siRNA (5'-GCA ACA GCA UCU UGC CUG AUU UGU A-3', 인간 SIRT1 mRNA의 1152-1175 잔기)와 적절한 iRNA 대조군은 Invitrogen(네덜란드)에서 구입하여 사용했다. 10-100 nM siRNA 이중체(duplexes)의 단일 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)을 이용하여 수행되었으며, 유전자 넉다운을 위해 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.A validated iRNA control was purchased from Invitrogen (The Netherlands) and used siRNA (5'-GCA ACA GCA UCU UGC CUG AUU UGU A-3 ', 1152-1175 residue of human SIRT1 mRNA) Single transfection of 10-100 nM siRNA duplexes was performed using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) and cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C for gene knockdown.
5. 조직학적 분석 방법5. Histological analysis method
탈파라핀화된 래트와 마우스 대동맥 고리를 투과성이 있는 절편으로 자르고, Vecrastain Universal Quick Kit (PK-8800, Vector Laboratories)를 이용하여 처리하였다. SIRT1 1차 항체는 1:50으로 희석하였고, 비오티닐화된 2차 항체와 함께 배양하였으며, 스트렙트아미딘 퍼옥시다제 용액, 3,3-디아미노 벤지딘 퍼옥시다제 기질 및 헤마톡실린 대조염색 시약으로 시각화하였다. 절편은 Zeiss Axiovert 200 현미경을 이용하여 디지털 이미지화 하였다.
The deparaffinized rats and mouse aortic rings were cut into permeable sections and processed using the Vecrastain Universal Quick Kit (PK-8800, Vector Laboratories). The SIRT1 primary antibody was diluted 1:50 and incubated with biotinylated secondary antibody and stained with streptamidine peroxidase solution, 3,3-diaminobenzidine peroxidase substrate and hematoxylin contrast dye Visualized with reagents. The sections were digitally imaged using a Zeiss Axiovert 200 microscope.
6. 아질산염(nitrite) 및 질산염(nitrate) 분석 방법6. Nitrite and nitrate analysis methods
NO의 대사물질인 아질산염(nitrite, NO2-) 및 질산염(nitrate, NO3-)은 안정적인 NO 분해 생성물로서 상용화된 Nitrate/Nitrite Fluorometric Assay Kit(Cayman Chemicals, USA)를 이용하여 정량화하였다. 10-kDa 컷오프 필터(Micro-con YM10 Millipore)를 사용하여 배지의 단백질을 제거하였고, 형광을 뺀 값을 표준화하여 전체 단백질 양을 구하였다.
Nitrite (NO 2 -) and nitrate (NO 3 -), the metabolites of NO, were quantified using a commercially available Nitrate / Nitrite Fluorometric Assay Kit (Cayman Chemicals, USA) as stable NO degradation products. The protein in the medium was removed using a 10-kDa cut-off filter (Micro-con YM10 Millipore), and the amount of total protein was determined by standardizing the subtracted fluorescence.
7. 혈관 반응성 측정 방법7. Measurement of vascular reactivity
3~4월령 Wistar-Kyoto 래트를 펜토바르비탈 나트륨을 과량 주입하여 희생시키고, 빠르게 흉골 중앙부를 절개(mid-sternal split)하여 가슴 대동맥을 절개한 후, 차가운 Krebs buffer(118.3 mM NaCl; 4.7 mM KCl; 2.5 mM CaCl2; 1.2 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3; 1.2 mM MgSO4; 11 mM glucose; 0.0026 mM CaNa2 EDTA)에 넣었다. 대동맥에서 여분의 지방을 씻어내고, 가로로 5~10개의 고리(2.0~3.0 mm)를 잘라내었다. 각각의 고리는 30 μM DHA로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 대동맥 고리에서 생물학적으로 이용 가능한 NO는 종래 알려진 방법으로 측정하였다.
Between 3 and 4 months of age, Wistar-Kyoto rats were sacrificed by overdosing pentobarbital sodium, and the mid-sternal split was performed to quickly dissect the thoracic aorta, followed by cold Krebs buffer (118.3 mM NaCl; 4.7 mM KCl ; 2.5 mM CaCl 2 ; 1.2 mM KH 2 PO 4 ; 25 mM NaHCO 3 ; 1.2 mM MgSO 4 ; 11 mM glucose; 0.0026 mM CaNa 2 EDTA). Excess fats were washed away from the aorta, and 5 to 10 rings (2.0 to 3.0 mm) were cut out laterally. Each ring was treated with 30 μM DHA and incubated at 37 ° C for 24 hours. Biologically available NO in the aortic rings was measured by a conventional method.
실시예 1 : DHA의 세포독성 실험Example 1: Cytotoxicity test of DHA
DHA가 내피 세포 독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, PI 염색법을 이용한 HUVEC 생존력을 실험하였다. 0.3 ~ 30 μM의 DHA에 노출시킨 HUVEC과 대조군을 비교하였을 때 생존력에 영향이 없는 것으로 나타났으며, 이로부터 DHA 처리에 세포독성이 없음을 알 수 있었다.
To investigate the effect of DHA on endothelial cell toxicity, HUVEC viability using PI staining was examined. When HUVECs exposed to 0.3 ~ 30 μM of DHA were compared with the control group, there was no effect on viability, indicating that DHA treatment was not cytotoxic.
실시예 2 : SIRT1의 발현에 대한 DHA의 효과Example 2: Effect of DHA on the expression of SIRT1
DHA와 SIRT1 발현의 연관 관계를 알아보기 위하여, HUVEC을 0.3 ~ 30 μM의 DHA와 함께 24시간 동안 배양하였고, 10 μM의 DHA와 함께 3 ~ 24시간 동안 배양함으로써 DHA가 SIRT1 단백질 발현에 영향을 미치는지 실험하였다. 배양이 끝난 세포를 수거하여 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 수행하였다. To investigate the relationship between DHA and SIRT1 expression, HUVECs were incubated with 0.3 to 30 μM of DHA for 24 hours and cultured for 3 to 24 hours with 10 μM of DHA to determine whether DHA affects SIRT1 protein expression Respectively. The cultured cells were harvested and subjected to Western blotting and RT-PCR.
그 결과를 도 1에 나타내었다. SIRT1 단백질의 발현은 DHA 농도 의존적으로 증가하였으며(도 1A), DHA에 노출되는 시간이 증가함에 따라 SIRT1 단백질(도 1B) 및 mRNA(도 1C)의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
The results are shown in Fig. The expression of SIRT1 protein was increased in a DHA concentration-dependent manner (FIG. 1A), and the expression of SIRT1 protein (FIG. 1B) and mRNA (FIG. 1C) increased with increasing exposure time to DHA.
실시예 3 : DHA의 eNOS 아세틸화에 대한 영향Example 3: Effect of DHA on eNOS acetylation
SIRT1은 eNOS를 포함하여 많은 히스톤 및 비히스톤 단백질을 조절하는 것으로 알려져 있다. DHA가 내피 세포에서 NOS의 탈아세틸화에 관여하는지 알아보기 위하여, RNAi에 의해 내생적 SIRT1의 발현을 차단시킨 HUVECs에서 eNOS의 아세틸화를 분석하였다.SIRT1 is known to regulate many histone and non-histone proteins, including eNOS. To determine whether DHA is involved in the deacetylation of NOS in endothelial cells, we analyzed the acetylation of eNOS in HUVECs that blocked the expression of endogenous SIRT1 by RNAi.
그 결과를 도 2에 나타내었으며, DHA에 의해 유도된 SIRT1 발현의 증가는 DHA 농도 의존적으로 라이신 잔기에서 내생적 eNOS의 아세틸화를 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 또한 이와 유사하게 니코틴아마이드(NAM)로 내생적 eNOS의 활성을 억제했을 때 아세틸 라이신 eNOS 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2A).The results are shown in FIG. 2, and it was found that DHA-induced increase in SIRT1 expression decreases endogenous eNOS acetylation in lysine residues in a DHA concentration-dependent manner. Similarly, when the activity of endogenous eNOS was inhibited by nicotinamide (NAM), the level of acetyllain eNOS expression was increased (FIG. 2A).
또한 eNOS의 아세틸화가 SIRT1 발현을 변화시키는지 실험한 결과, SIRT1 RNAi에 의해 SIRT1 발현을 감소시켰을 때 DHA에 의한 eNOS 라이신 잔기의 아세틸화의 감소가 억제된다는 것을 확인하였다(도 2B). 이와 같은 결과는 DHA가 SIRT1의 발현을 증가시킴으로써 NOS의 라이신 잔기에서 아세틸화를 감소시킨다는 점을 시사한다.
Furthermore, it was confirmed that the acetylation of eNOS changed the expression of SIRT1. As a result, it was confirmed that the reduction of SIRT1 expression by SIRT1 RNAi inhibited the decrease of acetylation of eNOS lysine residues by DHA (Fig. 2B). These results suggest that DHA decreases acetylation in lysine residues of NOS by increasing the expression of SIRT1.
실시예 4 : DHA의 NO 생성에 대한 영향Example 4: Effect of DHA on NO production
DHA가 eNOS에 의한 NO 생성을 조절할 수 있는지 알아보기 위하여, 24시간 동안 DHA로 처리한 HUVECs 배지에 대한 아질산염(nitrite) 및 질산염(nitrate) 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.To determine whether DHA can regulate NO production by eNOS, nitrite and nitrate analyzes were performed on HUVECs medium treated with DHA for 24 hours, and the results are shown in FIG.
그 결과 DHA 농도에 따라 SIRT1 발현 수준이 증가하였으며, 그와 동시에 eNOS에 의한 NO 생성이 증가하였다. 그러나 SIRT1 RNAi가 주입된 HUVECs에서는 DHA에 의해 NO 레벨이 증가하지 않았다(도 3A). 이로부터 DHA는 HUVECs에서 NOS의 탈아세틸화를 유도하며, 내피 세포에서 eNOS의 아세틸화는 DHA에 의해 유도되는 SIRT1 발현과 반대의 관계가 있음을 알 수 있었다.As a result, the expression level of SIRT1 was increased according to DHA concentration, and at the same time, NO production by eNOS was increased. However, NO levels were not increased by DHA in SIRT1 RNAi injected HUVECs (Fig. 3A). From this, DHA induces deacetylation of NOS in HUVECs, and the acetylation of eNOS in endothelial cells is inversely related to DHA - induced expression of SIRT1.
SIRT1에 의하여 어떤 라이신 잔기가 조절되는지 알아보기 위하여 eNOS 칼모둘린 결합 도메인 (calmodulin-binding domain, CBD)에서 라이신496과 라이신506 잔기를 아세틸화되지 않는 알지닌으로 치환시켰다 (K496R, K506R). 그 결과, 야생형(WT) eNOS에서 NO 생성이 현저하게 증가된 것과 대조적으로, 라이신 잔기가 알지닌으로 치환된 eNOS(K496R) 또는 eNOS(K506R)을 주입한 HEK293 세포에서는 NO가 생성되지 않았다. 또한, WT ENOS와 대조적으로 eNOS(K496R) 또는 eNOS(K506R)를 주입한 HEK293 세포에서는 DHA에 의한 NO 생성의 증가도 발견되지 않았다(도 3B). 이와 같은 결과로부터, K496 및 K506이 DHA에 의한 NO 생성을 자극시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
To investigate what lysine residues are regulated by SIRT1, lysine 496 and lysine 506 residues were replaced with non-acetylated arginine in the eNOS calmodulin-binding domain (CBD) (K496R, K506R). As a result, NO production was not generated in HEK293 cells injected with eNOS (K496R) or eNOS (K506R), in which lysine residues were replaced with arginine, in contrast to the remarkable increase in NO production in wild-type (WT) eNOS. Also, in contrast to WT ENOS, no increase in NO production by DHA was found in HEK293 cells injected with eNOS (K496R) or eNOS (K506R) (Fig. 3B). From these results, it was found that K496 and K506 play an important role in stimulating NO production by DHA.
실시예 5 : DHA의 내피 의존성 혈관 긴장도의 영향Example 5 Effect of Endothelium-dependent Vascular Tension of DHA
DHA에 의해 매개되는 내피 의존성 혈관 긴장도(endothelium-dependent vascular tone) 조절에 있어서 SIRT1의 발현이 중요한 역할을 하는지 알아보기 위하여, 래트 대동맥 고리에 24시간 동안 DHA를 처리한 후 혈관 운동 신경 기능을 정량화하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.To examine whether expression of SIRT1 plays an important role in the regulation of endothelium-dependent vascular tone mediated by DHA, vasomotor nerve function was quantified after DHA treatment in the rat aortic rings for 24 hours , And the results are shown in Fig.
그 결과, 대조군에 비하여 DHA를 처리한 래트 대동맥 고리에서 SIRT1의 발현이 증가한 것을 확인하였고(도 4A, B), 내피 의존성 혈관 이완에는 영향이 없음을 알 수 있었으며(도 4C), DHA를 처리한 대동맥 고리에서 생물학적으로 이용 가능한 NO 레벨이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 4D). 이와 같은 결과로부터 DHA가 SIRT1 발현을 조절함으로써 NO의 혈관 내 생물학적 이용 가능성에 중요한 역할을 한다는 점을 알 수 있었다.
As a result, it was confirmed that the expression of SIRT1 was increased in DHA-treated rat aortic rings compared to the control group (Fig. 4A, B), and it was found that there was no effect on endothelium-dependent vasorelaxation (Fig. 4C) It was confirmed that the level of biologically available NO in the aortic rings was remarkably increased (Fig. 4D). These results suggest that DHA plays an important role in the intravascular bioavailability of NO by controlling SIRT1 expression.
Claims (11)
The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases comprising DHA (docosahexaenoic acid) as an active ingredient. The composition has a silent information regulator 1 (SIRT1) inducing ability and a nitric oxide (NO) The present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases.
상기 혈관병증은 심근경색, 동맥경화 및 고혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 혈관병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 6,
Wherein the vascular disease is selected from the group consisting of myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertension.
A pharmaceutical composition for reducing endothelial nitric oxide synthase (eNOS) acetylation for the prevention and treatment of vascular diseases, comprising SIRT1 (silent information regulator 1) inducing agent DHA (docosahexanoic acid) as an active ingredient.
상기 약학 조성물은 eNOS 칼모둘린 결합 도메인의 라이신 496 또는 라이신 506 잔기의 탈아세틸화를 유도하는 것을 특징으로 하는 eNOS 아세틸화 저감용 약학 조성물.
The method of claim 8,
Wherein said pharmaceutical composition induces deacetylation of lysine 496 or lysine 506 residue of the eNOS calmodulin binding domain.
상기 약학 조성물은 혈중 NO(nitric oxide)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 eNOS 아세틸화 저감용 약학 조성물.
The method of claim 8,
Wherein the pharmaceutical composition increases the production of nitric oxide (NO) in the blood.
상기 혈관병증은 심근경색, 동맥경화 및 고혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 eNOS 아세틸화 저감용 약학 조성물.
The method of claim 8,
Wherein said vascular disease is selected from the group consisting of myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertension.
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| KR1020140002998A KR101534494B1 (en) | 2014-01-09 | 2014-01-09 | Phamaceutical Compostions for Preventing and Treating Vascular Diseases Comprising Docosahexaenoic Acid |
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| KR (1) | KR101534494B1 (en) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2023223943A1 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | サントリーホールディングス株式会社 | Vascular endothelium function-improving composition |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120111726A (en) * | 2009-10-23 | 2012-10-10 | 프로노바 바이오파마 너지 에이에스 | Coated capsules and tablets of a fatty acid oil mixture |
-
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- 2014-01-09 KR KR1020140002998A patent/KR101534494B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| KR20120111726A (en) * | 2009-10-23 | 2012-10-10 | 프로노바 바이오파마 너지 에이에스 | Coated capsules and tablets of a fatty acid oil mixture |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Docosahexaenoic acid improves vascular function via Up-Regulation of SIRT1 Expression in Endothelial cells, 충남대학교 학위논문, 권민아(2013.08.) * |
| Docosahexaenoic acid improves vascular function via Up-Regulation of SIRT1 Expression in Endothelial cells, 충남대학교 학위논문, 권민아(2013.08.)* |
| 논문1: 서울대학교 대학원 약학과 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023223943A1 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | サントリーホールディングス株式会社 | Vascular endothelium function-improving composition |
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