KR101522712B1

KR101522712B1 - 암 치료 또는 예방용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101522712B1
Application number: KR1020110069379A
Authority: KR
Inventors: 이지훈
Original assignee: 김찬숙; 이천아
Priority date: 2010-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2015-05-26
Also published as: JP2013530251A; KR20120006944A; KR20120006923A; US20120016017A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물, 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 I]

(식 중, 치환기 R은 C₂H₅ 또는 C₂H₃임).

Description

암 치료 또는 예방용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER}

본 발명은 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물, 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 상기 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 점점 더 증가되고 있는 심각한 질병 중의 하나이다. 암은 비정상 세포의 조절되지 않는 성장 및 확산을 특징으로 가지며, 신체의 모든 기관 및 조직에 부작용을 미칠 수 있고, 종종 죽음에까지 이르게 한다. 암의 개시 및 진행에는 다수의 인자들이 역할을 하며, 이는 암의 치료를 어렵게 하는 요인 중의 하나이다. 또한, 어린이들 사이에서 암의 발병률이 최근에 증가되고 있다. 미국에서 암은 2007년 약 1,444,000개의 새로운 케이스가 진단되고 있으며, 여기에는 방광을 제외한 임의의 부위의 비침투성암이 포함되어 있지 않으며, 기저 및 편평상피세포 피부암이 포함되어 있지 않다.

암의 분자상 진단은 정상세포보다 암세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원 또는 단백질인 바이오마커 분자이거나 또는 신규 합성된 바이오마커 분자에 의존한다. 이러한 바이오마커들은 종양세포에 의해 직접 제조되거나 또는 암의 존재에 반응하는 신체에 의해 제조될 수 있다. 환자의 샘플에서 바이오마커의 탐지는 암 진단에서 중요한 단계로서 주어질 수 있으며, 또한 암의 초기 단계에서 암을 검진해낼 수 있는 능력은 암환자의 생존률을 증가시킬 수 있게 해준다. 현재, 암치료를 위해 이용되는 많은 유형의 항암제가 있으며, 이는 여러 개의 다양한 카테고리로 분류된다. 가장 많이 사용되는 항암제의 카테고리 분류 및 그의 예 중 하나는 하기와 같다.

(1) DNA 손상제: 독소루비신은 인접 뉴클레오티드로 삽입되어 RNA와 DNA 합성을 차단하는 작용을 하는 안트라시클린 항생물질이다. 이러한 작용을 달성하기 위하여, 독소루비신은 DNA와 약물간의 강한 상호작용을 형성시키며, 또한 DNA 합성에 필수적인 효소 토포이소머라제 II를 억제한다. 독소루비신의 물질대사는 지질막의 과산화를 야기하는 자유 산소 라디칼을 생성하며, 칼슘은 심장조직으로부터 배출되는데, 이는 심근독성을 야기한다. 독소루비신의 주요한 임상 문제점은 약물 내성이다. 이러한 부작용에도 불구하고, 독소루비신은 광범위한 암에 사용되고 있으며 가장 널리 사용되는 안트라시클린이다.

(2) 알킬화제: 시클로포스파미드는 가장 흔하게 사용되는 알킬화제이다. 시토크롬 P-450 작용을 통해, 시클로포스파미드는 히드록실화 중간체로 변환되어 활성 포스포르아미드 머스타드 및 아크롤레인을 형성한다. 포스포르아미드 머스타드는 사슬내/사슬간 DNA 가교결합을 야기하며, 이는 광범위한 암세포의 세포사멸을 가져온다. 시클로포스파미드는 발암성을 갖고 있기 때문에, 이는 다른 암이 진행되는 위험을 증가시키며 면역계를 억제한다.

(3) 미세소관 억제제(MI): MI는 방추 미세소관 역학을 방해하며, 세포주기의 저지 및 세포자멸을 야기한다. 탁산류(파클리탁셀 및 도세탁셀)는 미세소관 중합제제이며, 빈카 알칼로이드는 미세소관 탈중합제제이다. 탁산류는 유방암 치료에 가장 활성제이다. 파클리탁셀은 β-튜블린에 결합하며, 미세소관 중합 및 안정성을 야기하며, 중기에서 후기로의 진행을 억제하며 세포자멸을 유도한다. 도세탁셀은 2세대 탁산이며, 파클리탁셀과 동일한 결합 부위를 가지며 친화도가 더 높다. 도세탁셀은 파클리탁셀보다 세포독성이 2 내지 4배 더 높다는 것이 입증되었다.

(4) 빈카 알칼로이드: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 포도필로톡신 및 노코다졸은 미세소관 말단에 높은 친화도를 가지고 그에 결합되며, 동원체에 미세소관이 부착되는 것을 방해한다. 이는 미세소관 접합의 억제를 야기하며, 미세소관을 불안정하게 하며, 세포자멸을 유도한다. 이는 탁산류와 결합 부위를 공유하지 않는다. 이러한 MI는 일반적으로 독소루비신, 시클로포스파미드 치료에 대해 보조 치료제로서 사용된다.

(5) 아로마타제 억제제(AI): 아로마타제는 안드로겐을 에스트로겐으로 전환시키며, 이에 따라 국부 에스트로겐 농도가 증가된다. 이는 유방암에 대해 발암 역할을 할 수 있다. 아로마타제 억제제는 아로마타제를 억제하지만 난소에서 에스트로겐을 생성하는 것을 차단하지 않으며, 이는 폐경기 후의 여성에게만 작용한다. 아로마타제 억제제는 심혈관계 및 골에서 에스트로겐의 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 심장 문제 및 골다공증이 주요한 부작용으로 나타난다.

(6) 비스테로이드성 호르몬 치료제: 타목시펜은 ER-음성 유방암 환자를 제외하고 골, 자궁 및 콜레스테롤 수준에서 에스트로겐성 효과를 갖는 한편, 유방에서 정상신호전달을 파괴하고 ER α/β에 직접 결합함으로써 항에스트로겐성 효과를 나타내는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)로서 작용한다. 자궁에 대한 전에스트로겐 효과는 타목시펜으로 치료된 유방암 환자에게서 자궁암의 진행 가능성을 증가시킨다. 랄록시펜은 차세대의 SERM으로서, 유방과 자궁 모두에서 항에스트로겐 효과를 갖는다. 따라서, 자궁내막의 성장이 자극되지 않는다. 랄록시펜은 2007년에 FDA에서 승인되었으며, 위험 내력이 높은 폐경기 후의 여성에게서 침습성 유방암의 위험 및 골다공증을 예방한다. 랄록시펜은 골 및 심장에서 전에스트로겐 효과를 가지며, 이는 골밀도를 높게 하고 콜레스테롤을 낮춘다.

상기 언급된 치료제 모두는 암세포를 사멸시키며 정상세포도 유사하게 사멸시킨다는 점에서 하나의 공통성을 가진다. 또한, 환자의 삶의 질을 매우 감소시키는 부작용이 존재한다.

최근에 2개의 추가의 유망한 항종양제가 개발되었다. 트라스투주마브(헤르셉틴)은 erbB-2 (her2/neu) 수용체에 결합하도록 특이적으로 설계된 모노클로날 항체이다. 이는 리간드 및 수용체 결합을 방해함으로써 세포외 성장신호를 억제한다. 트라스투주마브는 항체 의존성 세포성 세포독성을 유도할 수 있다. 그러나, 트라스투주마브 내성은 세포질 신호전달의 수준에서 발견되었으며, 페르투주마브와 같은 추가의 모노클로날 항체가 erbB 수용체 신호를 상승적으로 차단하기 위해 필요하다. 유망한 다른 약물은 티로신 키나제 억제제 글리벡(이마티니브 메실레이트)이다. 이마티니브는 다수의 티로신 키나제 효소의 특이적 억제제로서 작용하는 2-페닐아미노피리미딘 유도체이다. 이는 TK 활성 부위를 차지함으로써 기능하며, 활성의 감소를 야기한다. 이마티니브는 abl(아벨슨 원종양유전자), c-kit 및 PDGF-R(혈소판-유도 성장인자 수용체)에서 TK 도메인에 대해 특이적이다. 이마티니브는 bcr-abl의 ATP 결합 부위에 결합하고 단백질의 효소활성을 경쟁적으로 억제함으로써 작용한다. 이마티니브는 bcr-abl에 대해 선택적이며, 또한 상기 언급된 다른 타겟(ckit 및 PDGF-R)을 억제한다. 그러나, 글리벡으로 치료된 환자들에게서는 심장 문제, 빈혈 및 다른 부작용들을 발생시켰다.

따라서, 세포를 사멸시키는 수많은 방법들을 알고 있다고 하더라도, 표적 암세포를 특이적으로 사멸시키면서 부작용 및 세포독성을 매우 감소시키는 항암제의 개발이 여전히 요구되고 있다.

상기에서 알 수 있듯이, 이제까지 개발된 항암제는 항암효과가 우수한 경우 독성이 너무 강하여 신체기능이 약한 어린이, 노약자 또는 말기암 환자에게 적절하지 않다는 문제점이 있으며, 독성이 낮은 경우에는 항암효과가 저하되거나 항암효과를 빠른 시간 내에 나타내지 못하는 문제점이 있다. 또한, 대부분의 종래의 항암제는 혈액 독성, 위장 독성, 신경 독성, 피부 독성, 탈모, 불임 등의 부작용을 수반한다. 뿐만 아니라, 종래의 항암제는 암세포와 정상세포를 구분하지 못함에 따라 암세포 외에 정상세포까지도 파괴시킨다. 특히, 파클리탁셀은 전세계적으로 널리 사용되고 있는 항암제 중 하나이지만, 이는 난용성 물질로서 증류수에 거의 분산되지 않기 때문에 주사제로 사용하기 위해서는 또다른 물질을 혼합하여 사용하여야 하며, 임상적으로 이러한 물질의 과량 투여는 심장독성과 과민반응을 발생시키는 것으로 보고되고 있다.

본 발명의 목적은 종래의 항암제의 문제점을 해결하기 위하여, 암세포와 같은 이상 증식된 변이 세포만을 제거하고, 오히려 정상세포를 활성화시키고 손상된 정상세포를 복구시킬 수 있으며, 독성이 없고, 말기암 환자와 같은 신체기능이 약한 인간에게도 적합하게 적용할 수 있으며, 온화한 조건에서 제조가 가능하며, 기존의 유기용매를 사용하는 제조방법에 비해 훨씬 안전하고 친수성 약물로서 주사제 및 경구 모두로 이용할 수 있으며, 약의 효과가 나타나는 속도가 매우 빠른 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물에 관한 것이다:

[화학식 I]

(식 중, 치환기 R은 C₂H₅ 또는 C₂H₃임).

또한, 본 발명은 상기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 암에는 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 대장암, 골육종, 뇌종양, 자궁경부암, 갑상선암, 위암 등이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 본 발명에 따른 조성물은 모든 암의 종류에 효과가 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물과 함께 약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있으며, 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물의 유효성을 감소시키지 않는 한 다른 성분들을 추가로 함유할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 이미 잘 알려져 있으며, 당업자라면 특정 투여 경로에 적합한 담체를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 정제수 1ml 당 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물이 0.3mg 이상 포함되며, 본 발명에서 달성하고자 하는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흉막내, 소포내 또는 포막내), 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여간격은 치료대상인 암의 유형, 환자의 연령, 환자의 체중과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:

a) (i) 2-메틸부티르산, 및 (ii) 악티게닌-4-O-글루코시드, 3,5,7,9-테트라인 또는 알라닌을 2:1의 비율로 반응시키는 단계,

b) 3:1의 비율로 혼합한 (i) 구리 및 (ii) 루테올린-7-람노글루코시드, 사포닌, 피넨, 트랜스-게라니올, 리나롤(linalol) 또는 클로로겐산을 상기 a) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,

c) 1:1의 비율로 혼합한 (i) 비텍시카르핀 또는 헤스페리딘, 및 (ii) 3'-히드록시포르모노네틴, 캠페롤 또는 물을 상기 b) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,

d) 상기 c) 단계에서 수득한 생성물에 시니그린을 반응시키는 단계, 및

e) 상기 d) 단계에서 수득한 생성물에 발린을 반응시켜, 화학식 I의 화합물을 생성하는 단계.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 반응은 80~120℃에서 10~30분 동안 수행되며, 상기 b) 단계의 반응은 120~170℃에서 10분 동안 수행되며, 상기 c) 단계의 반응은 80~120℃에서 5~8분 동안 수행되며, 상기 d) 단계의 반응은 100~140℃에서 5~10분 동안 수행되며, 상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행한 후에, 80~230℃에서 5~30분 동안 수행된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계 내지 e) 단계에서 용매는 물(H₂O)을 사용한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과함으로써 정제한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 하기 단계에 따라 정제한다:

(i) 100~150℃의 물에 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 용해하여 여과하는 단계,

(ii) 70~100℃에서 상기 (i) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,

(iii) 40~60℃에서 상기 (ii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,

(iv) 15~30℃에서 상기 (iii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,

(v) -1~15℃에서 상기 (iv) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계, 및

(vi) 상기 (v) 단계에서 수득된 용액을 건조시킨 수득된 고체 화합물을 수득하는 단계.

(ii) 30~100℃에서 상기 (i) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,

(iii) -5~30℃에서 상기 (ii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계, 및

(iv) 상기 (iii) 단계에서 수득된 용액을 건조시킨 수득된 고체 화합물을 수득하는 단계.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 여과에 사용된 필터는 공극크기가 10^-6m 이하이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 인체 내에 투여시, 신경전달물질을 전체적으로 활성화시키고 비장 기능을 향상시키며 혈액을 정화하는 것으로 나타났다. 즉, 신체의 신경전달물질과 호르몬의 분비를 촉진하고 활성화시키며, 이에 따라 비장 활동이 촉진되고 체열이 내려간다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 인체 내 림프 기능을 전체적으로 향상시키며 비장 내의 림프구와 대식세포를 증식시킴에 따라, 림프와 혈액이 정화되는 것으로 나타났다. 암환자는 전체적으로 신체기능이 저하되어 있거나 합병증을 앓고 있는 경우가 많기 때문에, 독성이 강한 종래의 항암제를 견디는데 어려움이 있으나, 본 발명에 따른 조성물은 독성이 없어 정상세포를 해하지 않고 오히려 환자의 저하된 신체기능을 향상시켜 항암 치료에 유리한 신체 상태를 형성하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 말기암 환자에게도 부작용이나 약물에 의한 쇼크를 발생시키지 않고 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 인체 내에 투여시 암세포가 일시적으로 활동을 멈추고 검은색의 테두리를 갖는 다각형의 모양으로 조직의 구성이 변화하면서 세포가 터져 사멸하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 골수를 자극하여 NK 및 NKT 세포를 생성하고, 이는 T세포, B세포로 분화되어 혈액이 미치는 모든 범위 내에 있는 암세포를 제거한다는 것이 발견되었다.

본 발명에 따른 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 모든 암을 치료 또는 예방할 수 있는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 암세포와 정상세포를 구분하지 못하는 종래의 항암제와 달리, 암세포와 같은 이상 증식된 변이 세포만을 타겟으로 하여 제거하면서, 정상세포에는 세포독성이 없고 오히려 정상세포를 활성화시키고 손상된 정상세포를 복구시킨다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 수용성이기 때문에, 주사제 및 경구제 등의 형태로서 사용이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약의 효과가 나타나는 속도가 매우 빠르며, 암 또는 합병증에 의해 약화된 신체기능을 회복시키는 작용을 할 수 있기 때문에, 말기암 환자에 대해 유용성이 매우 높을 뿐만 아니라, 어린이, 노약자에게 투여하는 데에도 적합하다. 더욱이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 체내에 잠복해 있는 종양을 제거하고 혈액내 면역세포를 강화하므로, 암백신으로서 작용하여 암의 발병을 예방할 수 있다.

본 명세서에 첨부되어 있는 도면에서, 실험군은 하기의 실시예에서 수득한 화합물 II 및 III를 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군을 나타내며, 대조군은 하기의 실시예에서 탁솔 또는 시스플라틴으로 처리한 군을 나타내며, 비처리군은 하기의 실시예에서 특정 물질로 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 1은 화학식 II의 화합물의 NMR 데이터를 나타낸다.
도 2는 화학식 III의 화합물의 NMR 데이터를 나타낸다.
도 3은 화학식 III의 화합물의 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)을 나타낸다.
도 4는 세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 5는 세포주 HCC 1419에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 6은 세포주 HCC 1419에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 7은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 48시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경(inverted microscope)으로 배율 x200으로 촬영한 사진이다.
도 8은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이며, 위의 사진은 배율 x40으로 관찰한 것이고, 아래 사진은 배율 x200으로 관찰한 것이다.
도 9는 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이며, 위의 사진은 배율 x40으로 관찰한 것이고, 아래 사진은 배율 x200으로 관찰한 것이다.
도 10은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다. 여기서, 실험군은 세포들이 단일 군집을 이루고 있는 반면, 대조군은 세포들이 웰 전체에 퍼져 있다.
도 11은 세포주 MCF-7에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 제1주(LC50)의 세로축은 세포수를, 제2주(회복기)의 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 12는 세포주 MDA-MB-468에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 13은 세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 14는 세포주 SKBR3에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 15는 세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 16은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 17은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 18은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 19는 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 20은 세포주 PC3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 21은 세포주 PC3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 22는 세포주 PC3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 23은 세포주 HT1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 24는 세포주 HT1299에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 25는 세포주 HT1299에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 26은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 27은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 28은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 29는 세포주 Saos-2에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 30은 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 31은 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 32는 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 33은 세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 34는 세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 35는 세포주 C-6에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 36은 세포주 C-6에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 37은 세포주 AsPc에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 38은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 39는 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 40은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 41은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 42는 세포주 MDA-MB-231에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 43은 세포주 MDA-MB-231에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 44는 세포주 MDA-MB-231에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 45는 세포주 MDA-MB-231에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 46은 세포주 RKO에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 47은 세포주 RKO에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 48은 세포주 RKO에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 49는 세포주 RKO에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 50은 HeLa 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 51은 HeLa 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 52는 HeLa 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 53은 HeLa 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 54는 TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 55는 TT 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 56은 TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 57은 TT 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 58은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 59는 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 60은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 61은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 62는 HepG2 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/100의 값을 나타낸다.
도 63은 HepG2 세포에 대해, 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 64는 HepG2 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 65는 HepG2 세포에 대해, 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 66은 HepG2 세포에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 4일째에 배율 200의 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 67은 N87 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/100의 값을 나타낸다.
도 68은 N87 세포에 대해, 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 69는 N87 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 70은 N87 세포에 대해, 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 71은 세포주 HME 50 HT에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 72는 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 48시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 73은 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 74는 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 0일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 75는 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 76은 세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 제1주(LC50)의 세로축은 세포수의 값, 제2주(회복기)의 세로축은 세포수의 1/1000의 값을 나타낸다.
도 77은 세포주 BJ에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 78은 세포주 BJ에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 79는 세포주 BJ에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 80은 세포주 BJ에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 81 및 도 82는 세포주 CCD-1074sk에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다. 다만, 도 82의 세로축은 세포수의 5배의 값을 나타낸다.
도 83은 세포주 CCD-1074sk에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 84 및 도 85는 세포주 CCD-1074sk에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 86은 세포주 CCD-1074sk에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 87은 누드마우스에 WM-266-4(인간 악성 흑색종)를 투여한 후에 비처리군, 실험군 및 대조군의 시간 경과에 따른 종양의 크기를 비교한 그래프이다.
도 88은 암수 Sprague-Dawley 래트에 본 발명에 따른 조성물을 투여한 후 시간 경과에 따른 체중(g)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 89는 누드마우스에서 본 발명에 따른 조성물이 투여된 이후에 나타나는 발모 현상을 촬영한 사진이다.
도 90에서, 상단 2개의 사진은 HME 50 HT 정상 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 4일째에 촬영한 사진이며, 하단 2개의 사진은 BJ 정상 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 4일째에 촬영한 사진이다.
도 91에서, 상단 2개의 사진은 HT1299 암 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 7일째에 촬영한 사진이며, 하단 2개의 사진은 AsPc 암 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제2주(회복기)의 48시간째에 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 효과에 대해 실시예 및 도면에 기초하여 설명한다. 다만, 본 발명을 실시예 및 도면에 한정하려는 취지는 아니며, 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형을 통하여 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.

실시예 1

2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 120℃ 및 3.0atm에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 물을 첨가한 후, 80~120℃ 및 2.7~3.5atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 100℃ 및 2.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 200~230℃ 및 1atm에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.

상기 반응에 따라 수득한 생성물에 대해, 제1정제 방법으로서 상기 생성물을 115~125℃의 물에 용해한 후, 공극크기가 0.2㎛인 25mm 나일론 시린지 필터(VWR사 제조)를 사용하여 여과하였다. 이어서, 75~85℃, 55~65℃, 27~33℃, 2~22℃에서 순차적으로 각각 동일한 필터를 이용하여 여과하였다. 그 후, 상기 여과된 용액을 진공건조시켜 고체 화합물을 수득하였다.

또한, 상기 반응에 따라 수득한 생성물에 대해, 제2정제 방법으로서 상기 생성물을 110~130℃의 물에 용해한 후, 공극크기가 0.2㎛인 25mm 나일론 시린지 필터(VWR사 제조)를 사용하여 여과하였다. 이어서, 70~90℃, 23~27℃에서 순차적으로 각각 동일한 필터를 이용하여 여과하였다. 그 후, 상기 여과된 용액을 진공건조시켜 고체 화합물을 수득하였다.

상기 제1정제 방법 및 제2정제 방법에 따라 수득한 고체 화합물을 분석한 결과, 이는 모두 도 1의 NMR을 나타내었으며, 이로부터 수득된 화합물은 하기 화학식 II를 갖는다는 것이 확인되었다.

[화학식 II]

실시예 2

2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 물을 첨가한 후, 80~120℃ 및 2.7~3.5atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.

상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물을 분석한 결과 이는 모두 도 2의 NMR 및 도 3의 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)을 나타내었으며, 이로부터 수득된 화합물은 하기 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.

[화학식 III]

도 3의 질량 스펙트럼의 m/z=191.2에서 주된 봉우리(화살표로 표시됨)가 나타나는 것이 관찰된다. 이 봉우리는 화학식 III의 화합물에 2개의 물 분자가 수화된 형태를 나타내는 것으로 해석된다.

실시예 3

2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 캠페롤을 첨가한 후, 80~120℃ 및 1.3atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.

상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물은 모두 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.

실시예 4

2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 3'-히드록시포르모노네틴을 첨가한 후, 120℃ 및 2.7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.

실시예 5

2-메틸부티르산 및 악티게닌-4-O-글루코시드를 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 루테올린-7-람노글루코시드를 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.7atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 비텍시카르핀 및 3'-히드록시포르모노네틴을 첨가한 후, 120℃ 및 2.7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.

실시예 6 - 시험관내(in vitro) 실험

하기에서, 본 발명에 따른 조성물의 값은 실시예 1에서 수득한 화학식 II의 화합물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군의 값과 실시예 2 내지 5에서 수득한 화학식 III의 화합물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군의 값의 평균값을 기재하였다.

암 세포주에 속하는 HCC 1419, MCF-7, MDA-MB-468, SKBR3, PC3, HT1299, Saos-2, C-6, AsPc, MDA-MB-231, RKO, HeLa, TT, HepG2 및 N87 세포와 정상 세포주에 속하는 HME 50 HT, BJ 및 CCD-1074sk에 대해, 물질대사(XTT 분석법) 및 세포 사멸(셀 카운트)의 변화 정도를 각각 실험하였다. 각각의 세포주에 대해서는 하기 표 1에 나타낸 배양배지에서 배양하였다.

세포주	배양배지
HCC 1419	DMEM + 10% 소태아혈청
MCF-7	DMEM + 10% 소태아혈청
MDA-MB-468	DMEM + 10% 소태아혈청
SKBR3	McCoy's 5a Medium Modified + 10% 소태아혈청
PC3	Ham's F12K + 10% 소태아혈청
HT1299	DMEM + 10% 소태아혈청
Saos-2	McCoy's 5a Medium Modified + 15% 소태아혈청
C-6	RPMI 1640 + 10% 소태아혈청
AsPc	RPMI 1640 + 10% 소태아혈청
HME 50 HT	무혈청 배지(Clonetics Co.회사의 SF-171)
BJ	DMEM + 10% 소태아혈청
CCD-1074sk	IMDM + 10% 소태아혈청
MDA-MB-231	DMEM + 10% 소태아혈청
RKO	EMEM + 10% 소태아혈청
HeLa	EMEM + 10% 소태아혈청
TT	Ham's F12K + 10% 소태아혈청
HepG2	EMEM + 10% 소태아혈청 및 1% Pen/Strep
N87	RPMI 배지 + 10% 소태아혈청 및 1% Pen/Strep

상기 표 1에서 DMEM은 Dulbecco's Minimum Essential Medium의 약자이며, IMDM은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium의 약자이며, EMEM은 Eagle's Minimum Essential Medium의 약자이다.

정상 세포주에 대해서는 20,000 개의 세포의 밀도로, 암 세포주에 대해서는 10,000-20,000 개의 세포의 밀도로, 48-웰 Corning CellBind™ 플레이트에 세포를 파종하였으며, 파종으로부터 24 내지 48h 후에, 본 발명에 따른 조성물을 4.5e-2M의 농도로 상기 배양 세포에 첨가하였으며, 본 발명에 따른 조성물이 처음 투여된 시간을 0h로 하였다. 본 발명에 따른 조성물이 처음 투여된 때로부터 3일째 되는 날, 세포배양액을 교체하면서 본 발명에 따른 조성물을 동일한 농도로 배양배지에 첨가하였다.

반면, 양성 대조군으로서 탁솔을 파종으로부터 24 내지 48h 후에 2.2e-7M의 농도로 24시간 동안 병행 배양 세포에 첨가하였으며, 음성 대조군으로서 배양배지에 어떠한 물질도 첨가하지 않았다.

세포수 측정(cell count):

각 시점에서 트립신-EDTA를 사용하여 세포들을 채취하였다. 각각의 웰에서 총 세포수를 Beckman-Coulter Z1 Particle Characterization Unit을 사용하여 측정한 경우에는 본 명세서에 첨부된 도면의 그래프에서 세로축이 세포수의 1/20의 값으로 표시되었으며, 총 세포수를 Beckman-Coulter Vi-Cell을 사용하여 측정한 경우에는 세로축이 세포수의 값으로 표시되었다. 세포주에 대해 각각 2개의 48-웰 플레이트를 사용하였으며, 웰 내에서 생존 세포의 세포수를 0h, 12h, 24h, 48h, 4d 및 7d에서 측정하였다. 첫번째 플레이트에서, 세포를 0h 및 3d에서 본 발명에 따른 조성물로 처리하고 배지를 교환하였으며, 탁솔은 24h 동안 처리하였다. 이에 따라 제1주의 LC-50 곡선을 얻었다. 두번째 플레이트에서, LC-50 7d는 회복기 0h와 동일하다. 회복기 0h에서, LC-50 7d의 잔여물에 대해 배지를 비처리 배지로 교환하였다. 비처리군은 제1주 말기에 과잉생산됨으로 인해 회복기에서 측정하지 않았다. 이에 따라 제2주의 회복 곡선을 얻었다.

XTT 세포 생존도 분석(XTT Cell Viability Assay):

XTT 분석은 항암제 또는 다른 약학 화합물의 생존도/세포독성에 대한 분석방법으로 알려져 있다. 정상 세포주에 대해서는 10,000 개의 세포의 밀도로, 암 세포주에 대해서는 5,000 개의 세포의 밀도로, 96-웰 조직 배양 플레이트에 세포를 파종하였다. 배양 기간 동안 형성된 포르마잔(formazan) 염을 ELISA 리더를 이용하여 정량하였다. 최적의 파장으로서 500nm를 사용하였으며, 0h, 12h, 24h, 48h, 4d 및 7d에서 각각 측정하였다. 이에 따라 정량된 값은 소프트웨어 SoftMax Pro 4.8을 이용하여 획득하였다.

XTT 분석에 의한 세포독성(cytotoxicity) 측정:

제조사의 지시에 따른 식을 이용하여 실험군 및 대조군 각각에 대해 하기와 같이 세포 생존도를 계산하였다(블랭크는 배지에 대해서만 XTT로 측정한 값을 나타낸다):

[처리군(본 발명에 따른 조성물 또는 탁솔) - 블랭크]/비처리군 x 100%

세포독성은 제조사의 지시에 따라 하기와 같이 세포독성을 계산하였다:

[비처리군의 흡수값 - (처리군(본 발명에 따른 조성물 또는 탁솔) - 블랭크)]/비처리군 x 100%

상기 기재된 실험방법을 실험군, 대조군, 비처리군 모두에 대해 동일하게 수행하고 측정하였다. 하기에는 개별 세포주에 대해 각각 수득한 값을 구체적으로 나타내었다.

(1) HCC 1419

세포주 HCC 1419는 원발성 유관 상피암 세포주로서, 이 세포는 저분화형이며, Her2-neu 과잉발현, p53을 발현하지 않는다. HCC 1419는 상피세포 특정 마커인 상피 당단백질2(EGP2: epithelial glycoprotein 2)와 시토케라틴 19를 표현하는 반면, 에스트로겐 리셉터 및 프로게스테론 리셉터를 표현하지 않는다.

세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 4).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	2727	3057	2782	847	451	152
	3142	3096	2672	624	404	113
	2392	2906	2651	573	227	133
평균값	2754	3020	2702	681	361	133

대조군(탁솔)	2626	3451	3488	3502	2940	1710
	3788	3553	2664	3199	2975	1794
	3055	3434	2957	2232	1716	1718
평균값	3156	3479	3036	2978	2544	1741

비처리군	2633	2717	6776	6995	25178	15380
	2954	5101	6256	5943	23320	10355
평균값	2794	3909	6516	6469	24249	12868

세포주 HCC 1419에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 4).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	69	57	81	52	32
	122	28	14	29	58
	89	18	40	107	75
평균값	93	34	45	63	55

대조군(탁솔)	8522	5340	4901	5721	7316
	9639	7966	5431	6317	3792
	8472	5755	5830	6001	6604
평균값	8878	6354	5387	6013	5904

상기 결과로부터, 실험군에서는 암세포수가 급격히 감소한 후 회복하지 못하였으나, 대조군에서는 암세포수가 감소하다가 더 이상 줄어들지 않고 그 개체수를 유지하고 있음을 알 수 있다.

세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 5 및 도 6).

세포주 HCC 1419에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 5 및 도 6).

상기 결과로부터, 실험군에서는 세포 생존도가 0에 가깝고 웰 내에 잔존해있는 암세포수가 거의 없음을 알 수 있다.

또한, HCC 1419 실험에서 다음과 같은 현상이 관찰되었다. 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포는 군집을 이루어 한 장의 종이처럼 뭉쳐 있었으며, 이는 웰에서 떨어진 모두 죽은 세포로서, 세포수측정을 위해 웰을 세척할 경우 모두 씻겨나갔다. 반면, 탁솔을 처치한 세포주는 웰 전체에 퍼져 흩어져 성장하고 있었다. 이는 본 발명에 따른 조성물이 암세포의 전이 성질을 억제한다는 것을 보여준다(도 7 내지 10).

(2) MCF-7

세포주 MCF-7은 유방암 세포주로서, 3-이소폼(isoform)의 에스트로겐 리셉터를 표현하며, 이 에스트로겐 리셉터에 의해 성장이 조절된다.

이 세포주에 대해 제1주에서 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군은 탁솔 처리군에 비해 세포사멸의 차이가 크지 않지만, 제2주에는 전체 세포가 모두 죽었고 어떠한 회복도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상당한 회복을 나타내고 적은 개체수를 계속해서 유지해 나간 탁솔 처리군과는 대조적이다.

세포주 MCF-7에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 11).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	45000	68000	120000	2000	0
	66000	56000	13000	4000	0
	62000	100000	7000	8000	2000
평균값	57667	74667	46667	4667	667

대조군(탁솔)	67000	54000	19000	7000	4000
	60000	38000	30000	27000	5000
	39000	39000	21000	31000	4000
평균값	55333	43667	23333	21667	4333

비처리군	34000	88000	150000	250000	120000
	37000	81000	78000	230000	97000
평균값	35500	84500	114000	240000	108500

세포주 MCF-7에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 11).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	3181	563	652	325	271
	4035	702	461	417	151
	2646	517	581	666	234
평균값	3287	594	565	469	219

대조군(탁솔)	1648	807	2010	1892	1693
	2087	728	2517	2011	1524
	2361	404	1726	2135	2098
평균값	2032	646	2084	2013	1772

(3) MDA-MB-468

세포주 MDA-MB-468은 전이성 선암을 갖는 환자에게서 적출한 조직에서 얻어졌다. 세포당 1x10⁶ 개의 EGF 리셉터가 표현된다.

이 세포주의 경우, 웰에 세포가 거의 남아 있지 않으며, 남은 세포들은 매우 스트레스를 받았거나 죽은 것처럼 보인다. 실험군의 결과를 대조군의 결과와 비교할 때, 본 발명에 따른 조성물은 MDA-MB-468 세포주에 부정적인 영향을 끼친 것이 명백한 반면, 탁솔로 처치한 세포주는 점차 회복되고 있음을 알 수 있다. 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포수는 계속해서 감소하고 있는 반면, 탁솔을 처치한 세포수는 증가하고 있다. 본 발명에 따른 조성물이 정상세포에는 어떠한 독성도 보이지 않았다는 사실을 감안할 때, 본 발명에 따른 조성물을 더 장기간 처치하거나 더 고농도로 처치하면 암세포의 사멸에 더 효과적일 것이다.

세포주 MDA-MB-468에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 12).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	32000	39000	21000	10000	6000
	33000	21000	25000	13000	1000
	24000	25000		15000	13000
평균값	29667	28333	23000	12667	6667

대조군(탁솔)	32000	30000	12000	18000	7000
	40000	16000	17000	20000	3000
		24000	10000	15000	17000
평균값	36000	23333	13000	17667	9000

비처리군	38000	45000	61000	82000	23000
	30000	39000	78000	60000	47000
평균값	34000	42000	69500	71000	35000

세포주 MDA-MB-468에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 12).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	17000	16000	20000	20000	4000
	23000	8000	10000	18000	9000
	13000	9000	20000	4000	15000
평균값	17667	11000	16667	14000	9333

대조군(탁솔)	12000	3000	4000	10000	11000
	9000	4000	4000	9000	15000
	4000	4000	17000	9000	9000
평균값	8333	3667	8333	9333	11667

상기 결과로부터, 실험군에서는 계속해서 암세포의 수가 감소하였으나, 대조군에서는 제2주에 암세포의 수가 다시 회복되고 있음을 알 수 있다.

(4) SKBR3

세포주 SKBR3은 전이성 흉막 삼출증을 앓는 환자에게서 적출된 유방암 세포주이다.

세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 10에 기재하고, 생존도를 하기 표 11에 기재하였다(도 13 및 14). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	4000	12000	5000	4000	4000
	5000	8000	4000	3000	4000
	4000	5000	4000	8000	4000
평균값	4333	8333	4333	5000	4000

대조군(탁솔)	2000	11000	4000	1000	1000
	4000	11000	4000	1000	4000
	2000	6000	4000	1000	4000
평균값	2667	9333	4000	1000	3000

비처리군	7000	7000	4000	6000	12000
	3000	6000	6000	9000	27000
평균값	5000	6500	5000	7500	19500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	100	79	67	100	60
	100	78	80	100	50
	100	83	40	50	25
평균값	100	80	62	83	45

대조군(탁솔)	100	69	0	0	100
	100	69	0	100	50
	100	71	50	0	0
평균값	100	70	17	33	50

비처리군	75	63	100	86	86
	67	86	88	90	77
평균값	71	75	94	88	82

세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 12에 기재하였다(도 15).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	67000	22500	30000	8000	2000
	80000	25000	32000	4000	4000
	72000	20000	22000	8000	1000
평균값	73000	22500	28000	6667	2333

대조군(탁솔)	80000	60000	36000	12500	12000
	72000	56000	40000	22000	8000
	60000	32000	56000	15000	10000
평균값	70667	49333	44000	17250	10000

세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 13에 기재하였다(도 16 및 도 17).

세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 14에 기재하였다(도 18 및 도 19).

(5) PC-3

세포주 PC-3은 전립샘 선암의 골전이에서 분리된 세포주이다. PC-3 세포주는 저 산성인산분해효소와 테스토스테론-5-알파(남성호르몬의 일종) 환원효소 활성을 보인다. PC-3 인체 전립선 암세포주는 전형적인 전립선암 세포주이며 높은 전이 가능성을 가지며 p53 및 p63을 표현하지 않는다. 다른 연구에서도 PC-3 세포가 탁솔에 비교적 내성이 있다는 점이 증명되었으나, 본 발명에 따른 조성물은 PC-3 세포를 사멸하는데 매우 효과적이었으며, 또한 PC-3 세포의 회복이 관찰되지 않았다.

세포주 PC-3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 20).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	4285	4650	5555	1994	491	371
	3200	5920	7330	1937	345	535
	5075	5755	5570	1097	536	159
평균값	4187	5442	6152	1676	457	355

대조군(탁솔)	5445	5805	4820	1969	975	1796
	9845	5775	6435	2248	1250	1542
	4450	4805	4360	1821	861	829
평균값	6580	5462	5205	2013	1029	1389

비처리군	5550	11870	10020	13280	6175	2275
	2665	8580	8245	13601	6172	4649
평균값	4108	10225	9132.5	13440.5	6173.5	3462

세포주 PC-3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 20).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	485	151	60	434	17
	86	161	105	272	58
	177	170	50	142	13
평균값	249	161	72	283	29

대조군(탁솔)	389	328	303	1376	753
	760	318	378	1023	550
	392	269	369	1574	145
평균값	514	305	350	1324	483

세포주 PC-3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 21 및 도 22).

세포주 PC-3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 21 및 도 22).

(6) HT 1299

세포주 HT 1299는 비소세포 폐암 세포주이다. HT 1299 세포는 부분 삭제된 p53단백질 동종접합을 가지고 있으며, p53 단백질 표현이 적다. 본 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처치한 후 생존해있는 HT 1299 세포를 발견하기가 어려웠다.

세포주 HT 1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 23).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	2760	5750	4115	1250	655	539
	3080	5620	4860	1574	685	496
	1965	3845	4130	950	434	426
평균값	2602	5072	4368	1258	591	487

대조군(탁솔)	2270	3085	4255	1526	536	736
	5520	5350	2690	1484	712	629
	3420	2680	2810	1382	488	982
평균값	3737	3705	3252	1464	579	782

비처리군	2045	3825	4275	8818	9108	9131
	2985	8630	7445	4061	8317	10597
평균값	2515	6227.5	5860	6439.5	8712.5	9864

세포주 HT 1299에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 23).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	331	766	747	704	68
	1215	376	742	819	43
	740	612	339	549	202
평균값	762	585	609	691	104

대조군(탁솔)	789	129	499	545	144
	776	262	386	470	107
	1193	291	410	322	104
평균값	919	227	432	446	118

세포주 HT 1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 24 및 도 25).

세포주 HT 1299에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 24 및 도 25).

또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 26 내지 28).

(7) Saos-2

세포주 Saos-2는 골암 세포주이다.

세포주 Saos-2에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 29).

	0h	12h	24h	48h	4d
실험군	2016	1647	2040	1982	1494
	2151	1804	1978	1940	1652
	2314	1735	2094	1852	1420
평균값	2160	1729	2037	1925	1522

대조군(탁솔)	2221	1790	1376	822	570
	2135	1705	1452	776	435
	2143	1756	1529	857	255
평균값	2166	1750	1452	818	420

비처리군	2726	1740	2234	2406	4421
	2361	2325	2203	2755	1034
평균값	2544	2033	2219	2581	2728

세포주 Saos-2에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 29).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	995	722	707	912	263
	1026	800	787	670	454
	980	764	798	674	337
평균값	1000	762	764	752	351

대조군(탁솔)	291	165	249	589	289
	759	126	165	602	793
	778	258	312	416	822
평균값	609	183	242	536	635

또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 30 내지 32).

(8) C-6

세포주 C-6 교모세포종은 가장 흔한 악성 신경교종으로, 여러 치료방법에 저항력을 보이며, 대부분의 환자는 진단 1년 이내에 사망한다. 쥐 C-6 신경아교종 세포주는 N,N'-니트로소-메틸우레아에 노출된 위스터 퍼쓰 쥐에서 만들어졌으며, 쥐의 뇌에 주입했을 때 형태학적으로 GBM과 비슷하여, 이런 종류의 종양 연구를 위한 생체내, 시험관내 연구에 모두 사용되고 있다.

본 실험에서, 상기 세포는 탁솔에 저항력을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포는 4일 후에 사멸하였고 회복하지 못하였다.

세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 33).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	5035	4600	2464	7947	7116	17
	6102	3934	4777	6888	3248	8
	5525	4234	5447	5283	6303	30
평균값	5554	4256	4229	6706	5556	18

대조군(탁솔)	7077	5442	3853	5378	6751	2671
	4897	4240	3340	6722	6905	3426
	6111	3726	3895	6630	6026	7253
평균값	6028	4469	3696	6243	6561	4450

비처리군	5384	5320	5877	20286	29190	32825
	5873	4002	6305	15960	24075	29837
평균값	5629	4661	6091	18123	26633	31331

세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 34).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	542	54	105	38	34
	231	39	33	95	31
	271	58	39	27	43
평균값	348	50	59	53	36

대조군(탁솔)	3948	4285	5457	4083	4316
	4207	3984	3930	3184	3634
	2984	3392	3166	4825	3989
평균값	3713	3887	4184	4031	3980

세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 35 및 도 36).

세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 35 및 36).

(9) AsPc

세포주 AsPc는 췌장암 세포주이다.

세포주 AsPc에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 37).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	2743	1602	2705	2420	1640	1350
	2601	1762	2454	1920	1480	1710
	2519	1898	2480	2177	1847	790
평균값	2621	1754	2546	2172	1656	1283

대조군(탁솔)	2039	2279	2161	2130	2020	2174
	2111	2550	2310	1800	2100	1902
	2340	2833	2336	2810	2007	1393
평균값	2163	2554	2269	2247	2042	1823

비처리군	2796	2705	2941	4416	5693	7700
	2402	3917	3106	4682	5343	4900
평균값	2599	3311	3023.5	4549	5518	6300

세포주 AsPc에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 37).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	1180	1242	1135	475	82
	1281	1164	1171	457	32
	1192	1148	790	470	42
평균값	1218	802	769	311	38

대조군(탁솔)	1213	1372	1490	327	101
	1770	1357	1202	724	85
	1301	1358	1210	842	73
평균값	1428	1362	1301	631	86

실험군에서는 암세포의 세포막이 검게 변하여 죽어가고 있음이 관찰되었으며, 이러한 암세포는 다시 재생될 가능성은 매우 희박하다(도 38).

또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 39 내지 41).

(10) MDA-MB-231

유방암 세포주인 MDA-MB-231은 본 발명에 따른 조성물에 의해 유의적인 영향을 받았다. 실험군의 결과를 대조군의 결과와 비교할 때, 제1주(LC50)의 4일째에 실험군의 세포수가 대조군의 세포수보다 작다는 것을 알 수 있다. 따라서, 제1주(LC50)의 4일째가 세포 사멸의 중요한 전환점이 된다.

또한, 대조군에서 제1주(LC50) 동안 생존한 세포들은 제2주(회복기) 동안 성장하고 회복되는 반면, 실험군에서 제1주(LC50) 동안 생존한 세포들은 제2주(회복기) 동안 성장하지 못하고 모두 사멸하였다.

세포주 MDA-MB-231에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 31에 기재하고, 생존도를 하기 표 32에 기재하였다(도 42 및 도 43). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	40000	50000	56000	12500	7500
	41500	46000	42000	16000	1200
	32000	32000	50000	18000	2000
평균값	37833	42667	49333	15500	3567

대조군(탁솔)	42000	39000	16000	24000	9000
	53000	22000	23000	26500	4000
	47000	32000	13000	19500	16000
평균값	47333	31000	17333	23333	9667

비처리군	48000	55000	75000	110000	120000
	36000	48000	95000	75000	150000
	42000	52000	84000	120000	150000
평균값	42000	51667	84667	101667	140000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	95	82	50	43	10
	93	80	72	35	16
	93	90	60	55	26
평균값	94	84	61	44	17

대조군(탁솔)	92	84	56	39	50
	90	80	82	56	50
	86	86	67	48	35
평균값	89	83	68	48	45

비처리군	91	94	80	78	77
	95	82	86	80	81
	89	88	85	83	67
평균값	91.7	88	83.7	80.3	75

세포주 MDA-MB-231에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 세포수를 하기 표 33에 기재하고, 생존도를 하기 표 34에 기재하였다(도 44 및 도 45). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	9000	8000	9000	4000	4000
	12500	9000	7000	2000	2000
	8000	4000	12500	4000	0
평균값	9833	7000	9500	3333	2000

대조군(탁솔)	17500	32000	36000	31000	39000
	22000	24000	12500	22500	42000
	12500	16000	25000	13000	15000
평균값	17333	24000	24500	22167	32000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	33.3	12.5	0	50	0
	25	17.1	25	100	100
	37	37.1	18.2	0	0
평균값	31.8	22.2	14.4	50.0	33.3

대조군(탁솔)	50	35	40	32	46.7
	45.9	22.3	39	52.7	33.3
	36.7	42.2	50	23.1	51
평균값	44.2	33.2	43.0	35.9	43.7

(11) RKO

대장암 세포주인 RKO는 본 발명에 따른 조성물에 대해 명백한 민감도를 나타내었다. 실험군에서, 제1주(LC50)의 48시간째가 본 발명에 따른 조성물에 의해 세포사멸이 빠르게 나타나기 시작하는 중요한 전환점이 된다. 또한, 제2주(회복기) 동안 내내, 실험군에서 생존한 세포들의 수는 대조군에서 생존한 세포들의 수보다 작았다.

세포주 RKO에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 35에 기재하고, 생존도를 하기 표 36에 기재하였다(도 46 및 도 47). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	55000	57800	34200	14000	24600
	52600	83200	34200	22800	27200
	50800	102400	81000	23600	24600
평균값	52800	81133	49800	20133	25467

대조군(탁솔)	49000	98000	52600	36000	25400
	54000	99800	49800	36000	22800
	48000	101600	133800	36000	38600
평균값	50333	99800	78733	36000	28933

비처리군	48000	125200	246800	288000	412000
	51600	114600	259000	349000	445000
평균값	49800	119900	252900	318500	428500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	95.5	95	66.7	49.2	18
	93.8	98.3	61.5	54	19.2
	96.6	97.2	64.5	56.3	17.1
평균값	95	97	64	53	18

대조군(탁솔)	94.4	95.5	78.3	50	42
	95.8	94.6	78.9	50	38.6
		93.9	76	62.4	33
평균값	95	95	78	54	38

비처리군	94.2	97.2	97.9	84.8	90
	95.5	93.9	98.3	81.2	94
평균값	95	96	98	83	92

세포주 RKO에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 37에 기재하고, 생존도를 하기 표 38에 기재하였다(도 48 및 도 49). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	24600	15800	14800	22000	15800
	27200	12200	21800	14800	9600
	24600	21800	24600	20000	12200
평균값	25467	16600	20400	18933	12533

대조군(탁솔)	58000	31000	38000	31000	18000
	53000	39000	30000	26000	39000
	57000	26000	35000	39000	48000
평균값	56000	32000	34333	32000	35000

비처리군	48000	125200	246800	288000	412000
	51600	114600	259000	349000	445000
평균값	49800	119900	252900	318500	428500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	17.8	19.4	15	38	34
	18.8	17.7	23.9	43.6	17.5
	16.3	22	28	48	26.4
평균값	18	20	22	43	26

대조군(탁솔)	27.3	28.6	56	67.5	25
	41.4	50	48.3	66.7	33
	50	50	62.2	55.6	45
평균값	40	43	56	63	34

(12) HeLa 세포

자궁경부암 세포주인 HeLa 세포에 대한 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 제1주(LC50) 동안 세포수가 유의적으로 감소하였다. 제1주(LC50)의 48시간째에 본 발명에 따른 조성물이 탁솔보다 더 많은 세포사멸을 가져왔다.

세포주 HeLa 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 39에 기재하고, 생존도를 하기 표 40에 기재하였다(도 50 및 도 51). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	214000	289000	35000	66000	82000
	162000	246000	61000	83000	89000
	188000	551000	53000	68000	88000
평균값	188000	362000	49667	72333	86333

대조군(탁솔)	136000	276000	70000	39000	34000
	184000	219000	79000	31000	32000
	158000	158000	105000	26000	36000
평균값	159333	217667	84667	32000	34000

비처리군	127000	306000	350000	1147000	1072000
	131000	319000	311000	1418000	1418000
평균값	129000	312500	330500	1282500	1245000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	93.4	92.4	37.5	86.7	57.1
	89.2	87.3	82.4	84.2	56
	90.7	92.3	33.3	82	40
평균값	91.1	90.7	51.1	84.3	51

대조군(탁솔)	90.3	77.8	75	66.7	74.5
	90.5	78	88.9	71.4	37.5
	88.9	75	70.8	66.7	85.7
평균값	89.9	76.9	78.2	68.3	65.9

비처리군	89.7	90.4	88.9	63	65
	86.7	88.6	90.1	72.2	56.3
평균값	88.2	89.5	89.5	67.6	60.65

세포주 HeLa 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 41에 기재하고, 생존도를 하기 표 42에 기재하였다(도 52 및 도 53). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	92000	31000	27000	9000	9000
	109000	22000	18000	0	9000
	88000	48000	12500	4000	18000
평균값	96333	33667	19167	4333	12000

대조군(탁솔)	34000	26000	23500	18000	18000
	35000	9000	22000	13000	18000
	31000	35000	12000	22000	18000
평균값	33333	23333	19167	17667	18000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	50	28.5	17.1	0	0
	56.3	35.7	22.2	0	40
	47.2	18.2	14.5	8.3	0
평균값	51.2	27.5	17.9	2.8	13.3

대조군(탁솔)	66.7	16.7	33.3	50	100
	82.3	20	27.6	25	0
	77.1	50	25	40	25
평균값	75.4	28.9	28.6	38.3	41.7

(13) TT 세포

갑상선암 세포주인 TT 세포에 대한 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 경우의 세포수는 매우 급격하게 감소되었다. 세포수와 생존율은 모두 제1주(LC50)의 48시간째에 유의적으로 감소하였다. 또한, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 세포들은 제2주(회복기)에서도 회복하지 못함을 알 수 있었다. 반면, 탁솔로 처리된 세포들은 실험군보다 더 많이 생존하였다.

TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 43에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 44에 기재하였다(도 54 및 도 55). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	120000	236000	57000	32000	9000
	139000	302000	54000	22000	9000
	114000	149000	79000	27500	0
평균값	124333	229000	63333	27167	6000

대조군(탁솔)	117500	74000	109000	72500	26000
	123000	96000	114000	56000	35000
	133000	149000	175000	84000	35000
평균값	124500	106333	132667	70833	32000

비처리군	125000	302000	477000	989000	1120000
	136000	376000	538000	893000	1160000
평균값	130500	339000	507500	941000	1140000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	83.3	90.7	30.8	17.5	0
	85.3	79.7	33.3	25	0
	82	64.7	35.3	13.2	0
평균값	83.5	78.4	33.1	18.6	0

대조군(탁솔)	80.8	64.7	72	70.1	66.7
	78.4	72.7	76.9	66.7	37.5
	79.5	76.5	72.5	66.7	75
평균값	79.6	71.3	73.8	67.8	59.7

비처리군	83.3	82.6	62.7	90.4	95
	85.7	84.9	96.7	91.5	91.4
평균값	84.5	83.75	79.7	90.95	93.2

TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 45에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 46에 기재하였다(도 56 및 도 57). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	9000	0	4000	2000	0
	9000	18000	4000	1000	2000
	4000	4000	4000	2000	2000
평균값	7333	7333	4000	1667	1333

대조군(탁솔)	53000	9000	31000	15000	9000
	35000	26000	26000	12500	17500
	44000	18000	35000	22500	8000
평균값	44000	17667	30667	16667	11500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	50	0	100	0	0
	0	25	0	100	0
	0	0	0	0	0
평균값	16.7	8.3	33.3	33.3	0

대조군(탁솔)	75	0	42.9	35	25
	50	83.3	50	25	42.3
	70	40	12.5	52.7	33.3
평균값	65	41.1	35.1	37.6	33.5

TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 47에 기재하였다(도 58 및 도 59).

TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 48에 기재하였다(도 60 및 도 61).

(14) HepG2 세포

HepG2 간종양 세포주(ATCC HB-8065)는 탁솔 처리에 대해 강한 내성을 나타낼 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 조성물에 대해서도 매우 약화된 반응을 나타내었다. 그러나, 탁솔과 유사하게 본 발명에 따른 조성물에 의한 효과는 지연되었지만, 처리 후 48시간 후에 효과가 나타나는 것이 관찰되었다(도 66).

비처리군은 세포성장을 보증하고 처리군에 유의성이 있는지 여부를 확인하기 위하여 제2주(회복기) 동안 한 번 수행되었다. 본 발명에 따른 조성물이 배지에 존재하지 않는 제2주(회복기)는 48시간째에 비처리군과 탁솔 처리군에 대해 유의적인 차이를 보여주었다. 이 시점에서부터, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 세포들은 회복되지 못하였으나, 탁솔로 처리된 세포들은 내성이 더 강해진 것으로 나타났다.

HepG2 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 49에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 50에 기재하였다(도 62 및 도 63). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	210000	220000	180000	79000	35000
	96000	200000	110000	110000	66000
	120000	180000	140000	53000	48000
평균값	142000	200000	143333	80667	49667

대조군(탁솔)	150000	170000	88000	70000	48000
	88000	200000	160000	66000	26000
	190000	170000	140000	74000	39000
평균값	142667	180000	129333	70000	37667

비처리군	110000	230000	160000	190000	157000
	110000	160000	130000	170000	144000
평균값	110000	195000	145000	180000	150500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	75	92	68	89	88
	82	98	84	81	87
	70	86	78	92	91
평균값	76	92	77	87	89

대조군(탁솔)	88	82	90	94	67
	85	92	64	87	84
	88	82	79	88	67
평균값	87	85	78	90	73

비처리군	69	93	84	82	70
	92	83	72	97	90
	80.5	88	78	89.5	80
평균값	80.5	88	78	89.5	80

HepG2 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 51에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 52에 기재하였다(도 64 및 도 65). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	13000	13000	9000	4000	0
	13000	22000	18000	4000	2000
	0	4000	13000	4000	4000
평균값	8667	13000	13333	4000	2000

대조군(탁솔)	26000	31000	48000	44000	56000
	22000	18000	18000	61000	48000
	4000	22000	48000	57000	32000
평균값	17333	23667	38000	54000	45333

비처리군	39000	13000	53000	74000	81000
	48000	70000	79000	92000	86000
평균값	43500	41500	66000	83000	83500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	50	33	50	44	0
	100	40	25	56	50
	0	100	0	25	25
평균값	50	58	25	42	25

대조군(탁솔)	100	100	91	90	87
	80	75	50	64	72
	100	100	55	46	50
평균값	93	92	65	67	70

비처리군	56	67	58	77	75
	92	75	61	67	69
평균값	74	71	59.5	72	72

(15) N87 세포

N87 세포주(ATCC CRL-5822)는 위암종의 간 전이 부위로부터 유래된 것이다. 이 세포는 처치에 대한 반응 패턴이 RKO 세포와 유사하게 나타났다. 즉, 48시간 후에 세포수 및 세포 생존도 측면에서 유의적인 감소가 관찰되었으며, 이러한 감소는 지속적으로 유지되었으며, 세포들은 회복을 나타내지 못하였다.

N87 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 53에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 54에 기재하였다(도 67 및 도 68). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	57000	97000	123000	22000	17000
	62000	112000	110000	25000	12000
	53000	125000	95000	19000	17000
평균값	57333	111333	109333	22000	15333

대조군(탁솔)	59000	103000	57000	33000	25000
	54000	110000	52000	31000	27000
	64000	93000	75000	46000	24000
평균값	59000	102000	61333	32000	25333

비처리군	50000	120000	253000	297000	398000
	58000	119000	249000	301000	422000
평균값	55000	119500	251000	299000	410000

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	96	92	82	50	20
	93	97	79	58	12
	96	97	69	55	15
평균값	95	95	77	54	16

대조군(탁솔)	93	96	78	50	43
	97	96	80	50	39
	92	94	72	66	30
평균값	94	95	77	55	37

비처리군	97	97	96	85	90
	95	94	92	88	92
평균값	96	96	94	87	91

N87 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 55에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 56에 기재하였다 (도 69 및 도 70). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	22000	14000	14000	18000	4000
	15000	12000	17000	16000	9000
	14000	14000	15000	13000	8000
평균값	17000	13333	15333	15667	7000

대조군(탁솔)	32000	35000	33000	36000	42000
	28000	32000	38000	29000	23000
	21000	34000	42000	37000	21000
평균값	27000	33667	37667	34000	28667

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	15	15	15	33	12
	20	15	25	38	15
	18	20	22	17	25
평균값	18	17	21	29	17

대조군(탁솔)	25	33	52	61	33
	39	50	50	68	33
	50	50	61	50	45
평균값	38	44	54	60	37

(16) HME 50 HT - 정상 상피 세포

인체 유방상피세포인 HME는 인접 정상 조직에서 유래된 세포주이다. 본 실험에서, 실험군에서는 어떠한 세포독성도 관찰되지 않았다. 오히려, HME 50 HT 세포는 잘 성장하였으며 회복기에는 세포들이 넘칠 정도로 자랐으며 매우 건강하고 스트레스를 받지도 않았다.

세포주 HME 50 HT에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 71).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	17000	25000	20000	26000	28000	41000
	22000	26000	21000	28000	28000	49000
	23000	27000	21000	25000	28000	66000
평균값	20667	26000	20667	26333	28000	46667

대조군(탁솔)	11000	23000	11000	18000	9000	19000
	21000	13000	9000	11000	9000	14000
	12000	14000	14000	18000	9000	17000
평균값	14667	16667	11333	15667	9000	16667

비처리군	18000	25000	28000	31000	32000	67000
	20000	25000	29000	29000	38000	32000
평균값	19000	25000	28500	30000	35000	49500

세포주 HME 50 HT에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 71).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	50000	52000	60000	56000	60000	59000
	46000	57000	52000	57000	58000	69000
	39000	47000	62000	55000	65000	64000
평균값	45000	52000	58000	56000	61000	64000

대조군(탁솔)	17000	13000	15000	16000	19000	19000
	13000	15000	11000	17000	12000	15000
	19000	13000	12000	18000	18000	14000
평균값	16333	13667	12667	17000	16333	16000

상기 결과로부터, 실험군은 비처리군과 유사하게 성장하는 모습을 알 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 조성물이 정상세포에 부정적인 영향이 없음을 나타내는 것이다. 즉, 실험군에서는 일주일 동안 약물에 노출되어 있음에도 불구하고, 약에 노출된 기간 및 회복 기간 동안 모두에서 개체수가 증가되고 있다. 반면, 탁솔로 처치된 군에서는 하루동안 약물에 노출되었음에도 불구하고 이후 2주동안 개체수가 증가되지 못하고 그 수를 유지할 뿐이었으며, 이는 정상세포가 탁솔에 의해 받는 스트레스가 크다는 것을 의미한다.

또한, 대조군에서는 정상세포의 형태가 파괴되고 스트레스를 많이 받는 모습이 관찰되는 반면, 실험군에서는 정상세포가 매우 건강하게 자라고 있는 모습이 관찰되었다(도 72 내지 75).

(17) BJ - 정상 섬유아 세포

세포주 BJ는 신생아의 정상 표피에서 유래된 것이며 텔로머라제를 발현하지 않는다. 본 발명에 따른 조성물로 처치한 군에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 세포들은 매우 건강했고 스트레스를 받지 않았으며 강화된 세포 성장이 관찰되었다.

세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 76).

	0h	12h	24h	48h	4d	7d
실험군	13000	14000	20000	24000	59000	63000
	9000	10000	22000	34000	61000	67000
	15000	17000	13000	28000	58000	61000
평균값	12333	13667	18333	28667	59333	63667

대조군(탁솔)	17000	9000	17000	10000	5000	9000
	18000	12000	11000	11000	5000	4000
	14000	12000	10000	14000	9000	7000
평균값	16333	11000	12667	11667	6333	6667

비처리군	10000	20000	24000	29000	33000	47000
	11000	16000	25000	34000	31000	34000
평균값	10500	18000	24500	31500	32000	40500

세포주 BJ에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 76).

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	56	67	100	77	63
	73	72	74	88	85
	60	65	82	56	90
평균값	63	68	85	74	79

대조군(탁솔)	49	7	14	7	29
	4	9	16	18	19
	5	7	8	8	35
평균값	19	8	13	11	28

상기 결과로부터, 정상세포는 실험군에서 비처리군보다 더 잘 성장하는 모습을 보이고 있는 반면, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인한 스트레스 때문에 세포수가 감소하다가 회복기의 4일째가 지난 뒤에 회복의 모습을 나타내고 있다.

세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 77 및 도 78).

세포주 BJ에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 77 및 도 78).

상기 결과로부터, 실험군에서는 정상 세포의 생존율이 1에 가깝거나 그 이상의 값을 나타내고 있으며, 세포 독성이 0에 가깝다는 것을 알 수 있다.

또한, 실험군에서의 정상세포들은 비처리군과 매우 유사한 세포 성장 모습이 관찰된 반면, 대조군에서는 세포 형태가 완전히 파괴된 모습이 관찰되었다(도 79 및 도 80).

(18) CCD-1074sk

정상의 인간 피부 섬유아세포인 세포주 CCD-1074sk는 제1주(LC50) 동안 본 발명에 따른 조성물로 처리하였을 때 어떠한 물질로도 처리되지 않을 때와 유사한 정도로 성장하였다. 반면, 탁솔로 처리된 대조군에서는 제1주(LC50) 동안 세포의 성장이 저해되었으며, 제2주(회복기)에서도 회복이 매우 느리게 나타났다.

세포주 CCD-1074sk에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 63에 기재하고, 생존도를 하기 표 64에 기재하였다(도 81, 도 82 및 도 83). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	7000	7000	11000	25000	27000
	4000	13000	15000	17000	25000
	9000	18000	15000	8000	41000
평균값	6667	12667	13667	16667	31000

대조군(탁솔)	9000	15000	10000	6000	11000
	7000	16000	11000	3000	12000
평균값	8000	15500	10500	4500	11500

비처리군	10000	13000	11000	12000	24000
	6000	25000	17000	14000	43000
평균값	8000	19000	14000	13000	33500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	100	50	100	76	78
	50	73	72	84	82
	70	90	71	67	92
평균값	73	71	81	76	84

대조군(탁솔)	70	71	80	43	92
	75	89	83	33	57
평균값	73	80	82	38	75

비처리군	100	80	63	79	89
	100	82	63	88	94
평균값	100	81	63	84	92

세포주 CCD-1074sk에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 65에 기재하고, 생존도를 하기 표 66에 기재하였다(도 84, 도 85 및 도 86). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	21000	25000	31000	19000	41000
	18000	39000	29000	20000	33000
	18000	32000	33000	22000	29000
평균값	19000	32000	31000	20333	34333

대조군(탁솔)	10000	8000	10000	4000	18000
	11000	21000	6000	7000	9000
평균값	10500	14500	8000	5500	13500

	0h	24h	48h	4d	7d
실험군	88	79	100	96	87
	87	68	88	96	91
	85	84	85	96	94
평균값	87	77	91	96	91

대조군(탁솔)	82	71	27	43	19
	75	89	57	33	37
평균값	79	80	42	38	28

실시예 7 - 생체내(in vivo) 실험

(1) 생체내 항암 효과

암세포주는 WM-266-4(인간 악성 흑색종)를 선택하였다. 이 세포 10⁵개를 PBS에 부유시키고, Matrigel(BD biosciences)와 1:1로 혼합하였다. 이에 따라 제조된 상기 세포주가 포함되어 있는 혼합액 80μl를 5주령 암컷 누드마우스(BALB/c nu/nu) 14마리 각각의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다.

그 후, 종양 부하량(tumor burden)의 평균이 1,000이 되었을 때, 상기 누드마우스 중 5마리에는 아무런 처리도 안 하였으며(비처리군), 다른 5마리에는 시스플라틴 0.0025mg/g(시료의 질량/마우스의 체중)을 투여하였으며(대조군), 다른 4마리에는 화학식 II 및 III의 화합물을 각각 0.00035mg/g(시료의 질량/마우스의 체중)의 농도로 1일 2회 투여하였다(실험군). 여기에서, 종양 부하량(tumor burden) = π/6 × 0.5 × 길이 × (너비)²으로 계산되었다.

2일마다 상기 마우스의 종양의 크기와 체중을 측정하였다. 마우스가 폐사된 후에는 종양을 적출하여 종양의 크기와 체중을 측정하였다. 이에 따른 결과는 도면에 그래프로 나타내었다.

상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군이 시스플라틴으로 처리한 군에 비해 종양의 크기가 현저하게 작다는 것을 알 수 있다(도 87).

(2) 누드마우스의 T세포 분화

5주령 암컷 누드마우스(BALB/c nu/nu) 3마리에게 18일 동안 PBS를 경구투여하였으며, 다른 3마리에게 18일 동안 1일 2회 화학식 II의 화합물을 0.00033mg/g(화합물의 질량/마우스의 체중)의 농도로 경구투여하였다. 그 후, 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 혈액을 채취하여 T 세포수를 FACS로 분석하였으며, 이 때 1차 항체는 항마우스 CD8을 사용하였으며, 2차 항체는 FITC-컨쥬게이티드 래트 항마우스 IgG(FITC-conjugated rat anti-mouse IgG)를 사용하였다.

실험결과를 하기 표 67에 나타내었으며, 이로부터 본 발명에 따른 조성물로 처치한 실험군의 T 세포수가 PBS를 투여한 대조군의 T 세포수의 약 2배에 달하였음을 알 수 있다. 또한, 실험군에서 나타내는 T 세포수는 야생형의 정상 래트의 T 세포수에 근접하고 있음을 알 수 있다.

흉선이 없는 마우스에서 T 세포가 증가되었다는 것은 줄기세포에 의해서만 가능하므로, 상기 실험결과는 본 발명에 따른 조성물이 줄기세포 분화를 유도하여 T 세포를 분화시키도록 작용했음을 의미한다.

CD8-양성 T 림프구 %	PBMC
야생형	4.92
PBS-처리 누드 마우스	1.94
본 발명에 따른 조성물-처리 누드 마우스	3.84

실시예 8 - 부작용 확인 실험

(1) 설치류에 대한 독성 시험

Sprague-Dawley 래트에 본 발명에 따른 조성물을 단회 경구투여하여 독성을 시험하였다. 대조군(물)에 비해, 실험군(본 발명에 따른 조성물)에서는 암수 각 5마리에 시험물질을 80ml/kg(조성물의 부피/래트의 중량), 즉 28mg/Kg(화합물의 중량/래트의 중량)의 용량으로 단 회 투여하였다.

실험결과, 본 발명에 따른 조성물을 투여하더라도 사망한 동물이 없었으며, 일반증상에서 이상 소견이 없었으며, 시험물질 투여와 관련된 체중 변화에 이상이 없었으며, 부검 결과 역시 이상 소견이 없었다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 투여와 관련된 이상 증상이 전혀 관찰되지 않았다(도 88).

(2) 누드마우스의 발모

누드마우스에 2주 동안 1일 2회 본 발명에 따른 조성물을 투여하였다.

그 결과, 도 89로부터 누드마우스에서 발모가 나타남을 확인할 수 있으며, 이는 누드마우스의 비정상적인 유전자가 본 발명에 따른 조성물의 일정 기간 투여에 따라 야생형 흰 생쥐의 정상 유전자로 돌아가는 변화 과정에서 나타나는 증상이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물을 항암제로서 투여하더라도 탈모의 부작용이 발생하지 않는다(도 89).

(3) 정상세포의 성장 형태

본 발명에 따른 조성물로 처치한 정상세포들은 어떠한 물질로도 처리되지 않은 정상세포들과 매우 유사한 세포 성장의 모습을 나타내었다. 그러나, 탁솔로 처치한 정상세포들은 탁솔의 독성으로 인한 스트레스로 인해 세포 형태가 파괴되는 모습을 나타내었다. 즉, 탁솔은 암세포 뿐만 아니라 정상세포도 정상적으로 성장하지 못하게 하며, 이는 세포의 종류에 대한 탁솔의 선택성이 매우 낮다는 것을 보여준다(도 90).

(4) 암세포의 사멸 형태

시험관내에서 본 발명에 따른 조성물로 처치한 모든 암세포들은 생물학적 마커 표현에 무관하게 탁솔에 비해 상대적으로 깨끗하게 암세포를 사멸시켰다. 이와 같이 깨끗하게 암세포가 사멸될 경우, 신체는 잔여물을 처리하기 위한 부담을 덜하게 되므로, 신체기능이 저하된 환자에게 적합하게 투여할 수 있다(도 91). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 정상세포에 대해서는 독성 없이 잘 성장할 수 있도록 하는 반면, 암세포에 대해서는 깨끗하게 사멸시킬 수 있는 선택적이고 특이적인 효과를 나타낸다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물:
[화학식 I]

(식 중, 치환기 R은 C₂H₅ 또는 C₂H₃임).
제1항에 따른 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 암이 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 대장암, 골육종, 뇌종양, 자궁경부암, 갑상선암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
비경구, 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법:
a) (i) 2-메틸부티르산, 및 (ii) 악티게닌-4-O-글루코시드, 3,5,7,9-테트라인 또는 알라닌을 2:1의 중량비로 반응시키는 단계,
b) 3:1의 중량비로 혼합한 (i) 구리 및 (ii) 루테올린-7-람노글루코시드, 사포닌, 피넨, 트랜스-게라니올, 리나롤(linalol) 또는 클로로겐산을 상기 a) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
c) 1:1의 중량비로 혼합한 (i) 비텍시카르핀 또는 헤스페리딘 및 (ii) 3'-히드록시포르모노네틴, 캠페롤 또는 물을 상기 b) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
d) 상기 c) 단계에서 수득한 생성물에 시니그린을 반응시키는 단계, 및
e) 상기 d) 단계에서 수득한 생성물에 발린을 반응시켜, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물을 생성하는 단계.
제5항에 있어서,
상기 a) 단계의 반응은 80~120℃에서 10~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 b) 단계의 반응은 120~170℃에서 10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 c) 단계의 반응은 80~120℃에서 5~8분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 d) 단계의 반응은 100~140℃에서 5~10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행하거나 또는 80~230℃에서 5~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행하고, 이어서 80~230℃에서 5~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 a) 단계 내지 e) 단계에서 용매는 물(H₂O)을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 e) 단계에서 수득된 생성물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 e) 단계에서 수득된 생성물을 100~150℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 70~100℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 40~60℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제16항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 15~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 -1~15℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 30~100℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제19항에 있어서,
상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과에 사용된 필터는 공극크기가 10^-6m 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.