KR101498833B1

KR101498833B1 - 항―Ｎ３ｐＧｌｕ 아밀로이드 베타 펩티드 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101498833B1
Application number: KR1020137003412A
Authority: KR
Inventors: 지롱 루; 잉 탕; 로날드 브래들리 데마토스
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2015-03-04
Also published as: CN103068848B; DK3042917T3; PH12013500277A1; ES2764728T3; PE20130817A1; WO2012021469A1; CY1120144T1; CN105111308A; LT3042917T; PT3339323T; CN105111308B; MY163521A; DOP2013000029A; US20130142806A1; AU2011289629B2; EA201270813A1; IL224030B; NZ626665A; CA2805114A1; MX2013001716A

Abstract

본 발명은 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.

Description

항―Ｎ３ｐＧｌｕ 아밀로이드 베타 펩티드 항체 및 그의 용도{ANTI-N3pGlu AMYLOID BETA PEPTIDE ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 N3pGlu 아밀로이드 베타 펩티드에 선택적으로 결합하는 항체, 및 아밀로이드 베타 (Aβ (A베타로 또한 지칭됨)) 펩티드에 관련된 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

순환 형태의 Aβ 펩티드는 전구체 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 (APP: amyloid precursor protein)의 절단으로부터 초래되는 38-43개의 아미노산 (대부분 38개, 40개 또는 42개의 아미노산)으로 구성된다. 가용성 형태에서 β-시트 함량이 높은 불용성 형태로 Aβ가 전환되는 것 및 이러한 불용성 형태가 뇌 내에 신경 및 뇌혈관 플라크로서 침착되는 것이 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군, 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)이 포함되는 다수의 상태 및 질환과 연관되었다.

플라크에서 발견되는 침착물은 Aβ 펩티드들의 이종성 혼합물로 주로 구성된다. N3pGlu Aβ (N3pE 또는 Aβ_p3 _-42로 또한 지칭됨)는 플라크에서만 발견되는 말단절단 형태의 Aβ 펩티드이다. N3pGlu Aβ는 Aβ의 N-말단의 처음 2개의 아미노산 잔기가 결여되고, 세 번째 아미노산 위치에 글루탐산으로부터 유래된 피로글루타메이트가 있다. N3pGlu Aβ 펩티드는 뇌 내의 침착된 Aβ의 미량 성분이지만, N3pGlu Aβ 펩티드가 적극적인 응집 성질이 있고 침착 케스케이드에서 초기에 축적된다는 것이 연구에서 입증되었다.

N3pGlu Aβ 펩티드를 표적으로 하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체들이 기존에 기술되었지만 (미국 7,122,374 및 WO 2010/009987), 생체 내의 표적과 교전(engagement)하고 (즉, 플라크 결합), 이어서 플라크 수준을 저하시키기 위해 고친화도 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체가 여전히 요구된다. 또한, 아미노-말단 및 카르복실-말단 항-Aβ 항체가 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)과 관련된 미세출혈의 증가에 이른다는 것을 고려하여, 장기간의 치료가 침착된 플라크의 유의한 감소를 초래하더라도 미세출혈 증가를 초래하지 않는 항-N3pGlu Aβ 항체가 요구된다.

본 발명의 범주 내의 항체는 다수의 바람직한 성질을 보유하는 치료적으로 유용한 N3pGlu Aβ 펩티드 길항제이다. 본 발명의 항체는 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 높은 친화도로 결합하고, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)과 관련된 미세출혈의 증가 없이 용량-의존적인 생체내 플라크 저하를 나타낸다.

본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 1×10^-9 M 미만인 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 9×10^-10 M 미만인 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 7×10^-10 M 미만인 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 9×10^-10 M 내지 1×10^-10 M인 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 9×10^-10 M 내지 1×10^-10 M인 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 1×10^-9 M 미만, 또는 9×10^-10 M 미만, 또는 7×10^-10 M 미만, 또는 9×10^-10 M 내지 1×10^-10 M이고, 생체 내에서 플라크를 저하시키는 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 25℃에서의 Kd가 1×10^-9 M 미만, 또는 9×10^-10 M 미만, 또는 7×10^-10 M 미만, 또는 9×10^-10 M 내지 1×10^-10 M이고, CAA와 관련된 미세출혈을 증가시키지 않으면서 생체 내에서 플라크를 저하시키는 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 KSX₁X₂SLLYSRX₃KTYLN (서열 51)이고, LCDR2가 AVSKLX₄S (서열 52)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYX₅FTX₆YYIN (서열 53)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGX₇TVY (서열 54)이며, 식 중, X₁은 S 또는 T이고, X₂는 Q 또는 R이고, X₃은 G 또는 S이고, X₄는 D 또는 G이고, X₅는 D 또는 T이고, X₆은 R 또는 D이며, X₇은 I, T, E, 또는 V인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 또한 제공한다.

본 발명은 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 이때 상기 LCVR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1, LCDR2, LCDR3 폴리펩티드를 포함하고, HCVR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1, HCDR2, HCDR3 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다:

a) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYDFTRYYIN (서열 6)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGITVY (서열 9)임;

b) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTRYYIN (서열 7)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGTTVY (서열 10)임;

c) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTDYYIN (서열 40)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGETVY (서열 41)임;

d) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLGS (서열 35)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTRYYIN (서열 7)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGTTVY (서열 10)임; 및

e) LCDR1이 KSTRSLLYSRSKTYLN (서열 45)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTDYYIN (서열 40)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGVTVY (서열 46)임.

한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 서열 3이고, LCDR2가 서열 4이고, LCDR3이 서열 5이고, HCDR1이 서열 6이고, HCDR2가 서열 8이며, HCDR3이 서열 9인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 서열 3이고, LCDR2가 서열 4이고, LCDR3이 서열 5이고, HCDR1이 서열 7이고, HCDR2가 서열 8이며, HCDR3이 서열 10인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 서열 3이고, LCDR2가 서열 4이고, LCDR3이 서열 5이고, HCDR1이 서열 40이고, HCDR2가 서열 8이며, HCDR3이 서열 41인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 서열 3이고, LCDR2가 서열 35이고, LCDR3이 서열 5이고, HCDR1이 서열 7이고, HCDR2가 서열 8이며, HCDR3이 서열 10인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 이때 LCDR1이 서열 45이고, LCDR2가 서열 4이고, LCDR3이 서열 5이고, HCDR1이 서열 40이고, HCDR2가 서열 8이며, HCDR3이 서열 46인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 이때 상기 LCVR 및 HCVR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다:

a. 서열 11의 LCVR 및 서열 12의 HCVR;

b. 서열 11의 LCVR 및 서열 13의 HCVR;

c. 서열 11의 LCVR 및 서열 42의 HCVR;

d. 서열 36의 LCVR 및 서열 37의 HCVR; 및

e. 서열 47의 LCVR 및 서열 48의 HCVR.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 LCVR 및 서열 12의 HCVR을 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 LCVR 및 서열 13의 HCVR을 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 LCVR 및 서열 42의 HCVR을 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 36의 LCVR 및 서열 37의 HCVR을 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 47의 LCVR 및 서열 48의 HCVR을 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 이때 LC 및 HC 폴리펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체를 또한 제공한다:

a) 서열 14의 LC 및 서열 15의 HC;

b) 서열 14의 LC 및 서열 16의 HC;

c) 서열 14의 LC 및 서열 44의 HC;

d) 서열 38의 LC 및 서열 39의 HC; 및

e) 서열 49의 LC 및 서열 50의 HC.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 14의 LC 및 서열 15의 HC를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 14의 LC 및 서열 16의 HC를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 14의 LC 및 서열 44의 HC를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 38의 LC 및 서열 39의 HC를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 49의 LC 및 서열 50의 HC를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 이러한 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 LC는 서열 14의 폴리펩티드이고 각각의 HC는 서열 15의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 LC는 서열 14의 폴리펩티드이고 각각의 HC는 서열 16의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 LC는 서열 14의 폴리펩티드이고 각각의 HC는 서열 44의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 LC는 서열 38의 폴리펩티드이고 각각의 HC는 서열 39의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 LC는 서열 49의 폴리펩티드이고 각각의 HC는 서열 50의 폴리펩티드이다.

본 발명은 본 발명의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 치료 성분을 추가적으로 포함한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩티드 활성과 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 본 발명의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, Aβ 펩티드 활성과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 전구성 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 CAA로 이루어진 군으로부터 선택된 상태의 치료를 필요로 하는 인간에게 본 발명의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한, 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 전구성 알츠하이머병, 다운 증후군, 또는 임상 또는 전임상 CAA로부터 선택된 상태의 치료에서 사용하기 위한, 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료에서 사용하기 위한, 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 전구성 알츠하이머병, 임상 또는 전임상 CAA로부터 선택된 상태의 예방에서 사용하기 위한, 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 예방에서 사용하기 위한, 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 전구성 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 CAA로 이루어진 군으로부터 선택된 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 의약의 제조에서의 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.

전장 항체는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 이뮤노글로불린 분자이다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 내부에 함유된 상보성 결정 영역 (CDR)들을 통해 항원 인식을 주로 담당하는 아미노산 약 100-110개 이상의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다.

CDR들에는 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 보존된 영역들이 산재된다. 각각의 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3"으로 지칭되고, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3"으로 지칭된다. CDR들은 항원과의 특이적 상호작용을 형성하는 잔기 대부분을 함유한다. LCVR 및 HCVR 영역 내의 CDR 아미노산 잔기들의 번호매김 및 위치 결정은 주지된 카바트(Kabat) 번호매김 관행에 따른다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류되고, 당업계에 공지된 바와 같은 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형(isotype)을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로 규정한다. IgG 항체는 서브클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로 추가로 분류될 수 있다. 각각의 중쇄 유형은 당업계에 주지된 서열의 특정한 불변 영역을 특징으로 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" (Mab)는 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론이 예를 들어 포함되는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래되거나 단리된 항체를 지칭하고, 이러한 항체가 생산되는 방법을 지칭하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 Mab는 균질한 또는 실질적으로 균질한 집단 내에 존재한다. 완전한 Mab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. "항원-결합 단편"이라는 구절은, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 단일쇄 Fv 단편을 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어, CDR-그라프팅(grafting), 또는 이같은 기술들의 조합, 또는 당업계에 공지된 기타 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 마우스를 인간 항-N3pGlu Aβ 또는 그의 단편으로 면역화시킬 수 있고, 생성된 항체들을 회수 및 정제할 수 있으며, 이들이 본원에 개시된 항체 화합물과 유사하거나 동일한 결합 및 기능적 성질을 보유하는지 여부의 결정을 본질적으로 하기 실시예에 기술된 바와 같이 개시된 방법에 의해 평가할 수 있다. 항원-결합 단편을 통상적인 방법에 의해 또한 제조할 수 있다. 항체 및 항원-결합 단편의 생산 및 정제를 위한 방법들이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2]에서 확인할 수 있다.

"조작된 인간 항체"라는 구절은 본 발명에 따른 결합 및 기능적 성질을 갖고, 비-인간 항체로부터 유래된 CDR을 둘러싸는 실질적으로 인간의 것이거나 완전히 인간의 것인 프레임워크 영역이 있는 모노클로날 항체를 지칭한다. 이같은 조작된 인간 항체의 "항원-결합 단편"에는, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 단일쇄 Fv 단편이 포함된다. "프레임워크 영역" 또는 "프레임워크 서열"은 프레임워크 영역 1 내지 4 중 임의의 하나를 지칭한다. 본 발명에 포함되는 조작된 인간 항체 및 그의 항원-결합 단편에는 프레임워크 영역 1 내지 4 중 임의의 하나 이상이 실질적으로 또는 완전히 인간의 것인, 즉 개별적인 실질적으로 또는 완전히 인간의 것인 프레임워크 영역 1 내지 4의 가능한 조합 중 임의의 것이 존재하는 분자가 포함된다. 예를 들어, 여기에는 프레임워크 영역 1 및 프레임워크 영역 2, 프레임워크 영역 1 및 프레임워크 영역 3, 프레임워크 영역 1, 2 및 3 등이 실질적으로 또는 완전히 인간의 것인 분자가 포함된다. 실질적으로 인간의 것인 프레임워크는 공지된 인간 배선 프레임워크 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 약 80％인 것이다. 바람직하게는, 실질적으로 인간의 것인 프레임워크는 공지된 인간 배선 프레임워크 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 99％이다.

완전히 인간의 것인 프레임워크는 공지된 인간 배선 프레임워크 서열과 동일한 것이다. 인간 프레임워크 배선 서열은 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) (IMGT)로부터 그의 웹사이트 http://imgt.cines.fr을 통해, 또는 문헌 [The Immunoglobulin Facts Book, Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351]로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 배선 경쇄 프레임워크가 A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, 및 O8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 배선 중쇄 프레임워크 영역이 VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, 및 VH5-51로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에 개시된 것들에 더하여, 유사한 본 발명에 따른 기능적 성질을 나타내는 조작된 인간 항체가 여러 상이한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 본원에 개시된 특정 항체 화합물이 추가적인 항체 화합물을 제조하기 위한 주형 또는 모(parent) 항체 화합물로서 사용될 수 있다. 한 접근법에서, 모 항체 화합물의 CDR들이 모 항체 화합물 프레임워크와의 서열 동일성이 높은 인간 프레임워크 내로 그라프팅된다. 새로운 프레임워크의 서열 동일성은 모 항체 화합물 내의 상응하는 프레임워크의 서열에 대해 일반적으로 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 99％ 동일할 것이다. 이러한 그라프팅은 모 항체의 것과 비교하여 결합 친화도에서의 감소를 초래할 수 있다. 그러한 경우, 프레임워크가 문헌 [Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869]에 개시된 특정 규범을 기초로 특정 위치에서 모 프레임워크로 역-돌연변이될 수 있다. 마우스 항체를 인간화시키는데 유용한 방법이 기술되어 있는 추가적인 참고문헌에는 미국 특허 번호 4,816,397; 5,225,539, 및 5,693,761; 문헌 [Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620]에 기술되어 있는 바와 같은 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD; 및 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; 및 [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536])이 포함된다.

역-돌연변이에 고려되는 잔기의 확인을 하기와 같이 수행할 수 있다:

아미노산이 하기의 카테고리에 포함되는 경우, 사용될 인간 배선 서열 ("수용자(acceptor) 프레임워크")의 프레임워크 아미노산이 모 항체 화합물의 프레임워크 ("공여자 프레임워크")로부터의 프레임워크 아미노산으로 교체된다:

(a) 수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 영역 내의 아미노산은 이러한 위치에서 인간 프레임워크에 대해 일상적이지 않은 한편, 공여자 이뮤노글로불린 내의 상응하는 아미노산은 이러한 위치에서 인간 프레임워크에 대해 전형적임;

(b) 아미노산의 위치가 CDR들 중 하나에 바로 인접함; 또는

(c) 프레임워크 아미노산의 임의의 측쇄 원자가 3차원 이뮤노글로불린 모델에서 CDR 아미노산의 임의의 원자로부터 약 5-6 옹스트롬 (중심 대 중심) 이내에 있음.

수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 영역 내의 각각의 아미노산 및 공여자 프레임워크 내의 상응하는 아미노산이 이러한 위치에서 인간 프레임워크에 대해 일반적으로 일상적이지 않은 경우, 이같은 아미노산이 이러한 위치에서 인간 프레임워크에 대해 전형적인 아미노산으로 교체될 수 있다. 이러한 역-돌연변이 규범은 모 항체 화합물의 활성을 회복할 수 있게 한다.

본원에 개시된 항체 화합물과 유사한 기능적 성질을 나타내는 조작된 인간 항체를 생성시키는 또다른 접근법은 그라프팅된 CDR 내의 아미노산을 프레임워크를 변화시키지 않으면서 무작위로 돌연변이시키는 단계, 및 생성된 분자를 모 항체 화합물의 것만큼 양호하거나 또는 이보다 더 양호한 결합 친화도 및 기타 기능적 성질에 대해 스크리닝하는 단계를 수반한다. 또한 각각의 CDR 내의 각각의 아미노산 위치에 단일 돌연변이가 도입된 후, 결합 친화도 및 기타 기능적 성질에 대한 이같은 돌연변이의 효과를 평가할 수 있다. 성질 개선을 일으키는 단일 돌연변이들을 조합하여, 서로 조합되었을 때의 이들의 효과를 평가할 수 있다.

추가로, 상기 접근법들 둘 모두의 조합이 가능하다. CDR 그라프팅 후, CDR 내에 아미노산 변화를 도입하는 것에 더하여 특정 프레임워크 영역을 역-돌연변이시킬 수 있다. 이러한 방법론이 문헌 [Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162]에 기술되어 있다.

본 발명의 교시내용을 적용할 때, 당업자는 본원에서 개시된 CDR 및 프레임워크 서열 내의 아미노산을 치환하고, 이에 의해 모 서열로부터 유래된 추가적인 가변 영역 아미노산 서열을 생성시키기 위해 통상적인 기술, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발을 사용할 수 있다. 모든 별법적인 천연 발생 아미노산이 특정 치환 부위에서 도입될 수 있다. 이어서, 지시된 생체내 기능이 있는 서열을 확인하기 위해 이러한 추가적인 가변 영역 아미노산 서열들을 스크리닝하는데 본원에 개시된 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 조작된 인간 항체 및 그의 항원-결합 부분을 제조하는데 적절한 추가적인 서열을 확인할 수 있다. 바람직하게는, 프레임워크 내에서의 아미노산 치환이 본원에 개시된 4개의 경쇄 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 중 임의의 하나 이상 내의 1개, 2개 또는 3개의 위치에 제한된다. 바람직하게는, CDR 내에서의 아미노산 치환이 3개의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 중 임의의 하나 이상 내의 1개, 2개 또는 3개의 위치에 제한된다. 상기 기술된 이러한 프레임워크 영역 및 CDR 내에서의 다양한 변화들의 조합이 또한 가능하다.

용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")는 기존의 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 느리게 하거나, 중단시키거나, 저지하거나, 제어하거나, 정지시키거나, 감소시키거나 또는 역전시키는 것을 수반하는 프로세스를 지칭하지만, 항-N3pGlu Aβ 항체와 연관된 모든 질환-관련 증상, 상태 또는 장애의 완전한 제거를 반드시 수반하지는 않는다.

본 발명의 항체는 다양한 경로로 투여되는 인간 의학에서의 의약으로서 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이같은 조성물은 비경구 투여용이다. 이같은 제약 조성물은 당업계에 주지된 방법에 의해 제조될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.] 참조), 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

하기 검정들의 결과는 본 발명의 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 단편이 Aβ 펩티드 활성과 연관된 상태 예컨대 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 CAA를 치료하는데 유용하다는 것을 입증한다.

실시예 1: 항체 생산

최초의 항체 생성: FVB 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 응집물을 형성하도록 밤새 37℃에서 예비처리된, N-말단이 말단절단되고 피로글루타메이트로 변형된 인간 아밀로이드 β 펩티드 3-42 (N3pGlu)로 면역화시켰다. 마우스 비장 세포를 수확하고, Aβ1-40 반응성 B 세포를 MACS에 의해 고갈시켰다. 나머지 세포들을 응집된 N3pGlu Aβ 펩티드에 결합하는 것에 대해 분류하였다. 선별된 B-세포로부터 RNA를 단리하고, 올리고 dT를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 항체 신호 서열 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득하고, 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발에 의해 파지 벡터 내로 클로닝하여, Fab 라이브러리를 제조하였다. Fab 라이브러리를 응집된 N3pGlu 펩티드에 결합하는 것에 대해 단일-지점(Single-Point) ELISA (SPE)에 의해 스크리닝하고, Aβ1-40에 대해 대비-염색하였다. DNA 서열분석, fab 발현, 및 N3pGlu Aβ 펩티드에 결합하는 것, 및 가용성 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 펩티드에 결합하는 것의 결여에 의해 양성 클론을 특성화하였다.

단일 아미노산 돌연변이체 라이브러리를 구축하고, 응집된 N3pGlu Aβ 펩티드에 결합하지만, Aβ1-42에는 결합하지 않는 것에 대해 SPE에 의해 스크리닝하였다. 이로운 돌연변이들을 조합형 라이브러리로 조합하였다. 친화도가 최적화된 조합형 변이체를 선별하고, 면역조직화학에 의한 Aβ 플라크 결합 및 비아코어(BIACORE)®에 의한 친화도 측정을 위해 마우스 IgG1으로 전환시켰다. 식별된 클론으로부터, 생체내 효능 연구를 위해 마우스 IgG1 (mE8) 및 IgG2a (mE8c) 이소형 둘 모두로 mAb 단백질이 제조되었다. mE8은 마우스 N3pGlu Aβ 서열 (mpE3-16) 또는 인간 Aβ1-42에 결합하지 않는다.

인간 배선 프레임워크인 VH1-69/JH6 및 Vk-A18/JK2를 최초의 인간화에 사용하였다. mE8 항체의 CDR (4개의 친화도 돌연변이가 있음)이 인간 프레임워크 내로 그라프팅되어, 항체 hE8-C6이 생성되었다. 추가적인 친화도 최적화를 hE8-C6 백본 상에서 수행하였고, 이로운 돌연변이들을 조합하여, 고친화도의 인간화 변이체인 R5, R17, R24 및 2420을 제조하였다.

약물 개발성을 개선하기 위한 2차 최적화 라운드: 2개의 인간화 변이체인 hE8-C6 및 R17을 세포에 대한 비-특이적 결합을 감소시키는 것에 의해 항체 혈청 반감기를 개선하기 위해, 그리고 가용성 N3pGlu Aβ 펩티드에 대한 항체 친화도를 증가시키기 위해 2차 최적화 라운드용 백본으로서 선택하였다. N3pGlu Aβ의 N-말단의 14개의 아미노산으로 이루어지는 비오틴화 가용성 펩티드 (pE3-16B)가 합성되었고, 항체 mE8 결합에 대해 N3pGlu Aβ 펩티드와 등가인 것으로 평가되었다. pE3-16B를 사용하는 고-처리량 필터 리프트(filter lift) 검정이 개발되었고, 이를 모든 후속 라이브러리 스크리닝에 적용하였다. 필터 리프트 스크린으로부터의 모든 히트(hit)를 응집된 N3pGlu Aβ에 결합하는 것에 의해 확인하였다.

hE8-C6 변이체들의 라이브러리를 필터 리프트 검정을 사용하여 다시 스크리닝하였고, 이로운 돌연변이들의 집합을 식별하였다. 이들의 부분집합을 사용하여 조합형 라이브러리를 제조하였다. 4개의 콤비(combi) 변이체 (CoII-E10, CoII-G2, CoII-G8 및 CoII-E2)가 이러한 접근법에서 선별되었다.

컴퓨터 모델링을 사용하여 hE8-C6, R17, R24 및 기타 변이체의 V-영역 구조 모델을 생성시켰다. 세포에 대한 항체의 비-특이적 결합의 잠재적인 원인인, 결합 부위 내에 클러스터링된 친화도 최적화를 위해 도입된 양성 전하들이 구조 모델 분석에서 식별되었다. 모델링을 기초로, 표면 정전기 전위의 균형을 맞추도록 변화를 도입하기 위해 여러 위치를 선택하였다. 라이브러리 스크리닝으로부터의 일부 이로운 돌연변이 및 구조 모델링에 의해 규정된 변화를 조합함으로써 조합형 라이브러리를 합성하였다. 3개의 변이체 (R17m-B4, R17m-A12 및 R17m-B12)를 추가적인 연구를 위해 이러한 노력으로부터 선별하였다.

경쇄 프레임워크 잔기 Y36과 중쇄 CDR3 내의 잔기들 사이의 입체적 충돌이 구조 모델 분석에서 또한 발견되었다. Y36L 돌연변이를 hE8-C6 경쇄에 도입하여, 변이체 hE8L을 생산하였다. 이러한 프레임워크 변화 단독이 항체 친화도를 증가시키는 것 및 비-특이적 세포 결합을 감소시키는 것 둘 모두에 유의한 영향을 주는 것으로 발견되었다.

기타 노력은 여러 인간 프레임워크를 인간화에 대해 시험하는 것이었다. mE8 항체의 CDR을 프레임워크 VH5-51/VKO2 및 VH3-23/VKA2 상에 그라프팅하였다. VH5-51/VKO2가 있는 인간화 Fab (hE8-51O2)가 N3pGlu Aβ 결합에서 hE8-C6보다 더 양호하지는 않더라도 이와 등가인 것으로 결정되었다. hE8-51O2 내로 추가적인 이로운 돌연변이들이 도입되어 콤비 변이체 CI-A1, CI-B6, CI-C7 및 CI-B8이 생성되었다.

항원 특이성 및 친화도에 대한 ELISA 및 비아코어®, 비-특이적 세포 결합, 및 IHC 염색이 포함되는 모든 시험관내 검정을 통과한 후에, B12L, CI-C7, hE8L, R17L 및 R17인 5개의 변이체 mAb가 선별되었다.

본질적으로 하기와 같이 항체를 제조 및 정제할 수 있다. 적합한 숙주 세포, 예컨대 HEK 293 EBNA 또는 CHO를 최적의 미리 정해진 HC:LC 벡터 비, 또는 HC, 예컨대 서열 56, 및 서열 43, 및 LC, 예컨대 서열 55 둘 모두를 코딩하는 단일 벡터 시스템을 사용하여 항체 분비를 위한 발현 시스템으로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시켰다. 항체가 분비된 정화 배지를 다수의 통상적으로 사용되는 기술 중 임의의 것을 사용하여 정제하였다. 예를 들어, 편리하게 배지를 혼화성 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 단백질 A 또는 G 세파로스 FF 칼럼에 적용할 수 있었다. 칼럼을 세척하여 비-특이적 결합 성분을 제거하였다. 결합된 항체를, 예를 들어, pH 구배 (예컨대 0.1 M 인산나트륨 완충제 pH 6.8 → 0.1 M 시트르산나트륨 완충제 pH 2.5)에 의해, 용리시켰다. 항체 분획을, 예컨대 SDS-PAGE에 의해, 검출한 후, 풀링(pooling)하였다. 의도되는 용도에 따라, 추가적인 정제가 선택적이었다. 통상적인 기술을 사용하여 항체를 농축 및/또는 멸균 여과할 수 있었다. 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 포함되는 통상적인 기술에 의해 가용성 응집물 및 다량체를 효과적으로 제거할 수 있었다. 이러한 크로마토그래피 단계들 후의 항체의 순도는 99％를 초과하였다. 생성물을 즉각적으로 -70℃에서 동결시키거나 또는 동결건조시킬 수 있었다. 이러한 본 발명의 항체들에 대한 아미노산 서열이 하기에서 제공된다.

실시예 2: 가용성 N3pGlu 에 대한 결합 친화도

비아코어® 2000 기구로 측정된 표면 플라즈몬 공명을 사용하여, 항-N3pGlu 항체들에 대한 N3pGlu Aβ의 결합을 측정하였다. 언급된 경우를 제외하고는, 모든 시약 및 물질은 비아코어® 아베(BIACORE® AB) (스웨덴 웁살라)의 것이었다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 샘플을 HBS-EP 완충제 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.005％ (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES, pH 7.4)에 용해시켰다.

위치 변화가 있는 일련의 A베타 펩티드 (글리신 돌연변이체)를 합성하여, 항체 결합에 대한 소정의 잔기의 효과를 평가하고, 이에 의해 항체 인식에 요구되는 서열 및 특성을 식별하였다:

말단절단 (des 1,2) 및 변형 형태의 글루탐산 (3 pyr-E 또는 3 pyr-Glu)의 중요성을 Aβ 1-42 결합 대 Aβ 3-16 대 pE3-16 (각각 서열 1 대 서열 26 대 서열 25)을 비교함으로써 평가하였다. 결합 실험을 위해 희석하기 전에 펩티드들을 PBS에 5 ㎎/㎖로 용해시켰다.

항체 포획, 펩티드 주입/회합, 해리를 위한 장기간의 완충제 흐름 및 표면 재생의 분석 사이클을 다중으로 사용하여 결합을 평가하였다. 항체 포획 단계를 위해, 포획될 항체의 유형에 따라, CM5 칩에 단백질 A 또는 염소 항-마우스 Fc를 고정시켰다. 마우스 항체를 제외하고는, 각각의 사이클은 약 5-7 ㎕의 10 ㎍/㎖ 항-N3pGlu 항체를 5 ㎕/분으로 주입하는 단계 (약 3,000 RU를 포획함), 100 ㎕의 펩티드를 50 ㎕/분으로 주입하는 단계 (각각의 사이클에 대해 2배 단계 희석으로 1000 nM - 62.5 nM), 그 후 10분 동안 해리시키는 단계로 이루어졌다. 마우스 항체에 대해서는, 유량이 50 ㎕/분이었고, 20 ㎕의 50 ㎍/㎖의 마우스 항체를 주입하였다. 두 경우 모두, 20 ㎕의 10 mM 글리신 히드로클로라이드 (pH 1.5)를 사용하여 칩 표면을 재생시켰다. 그 후, 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 분석 소프트웨어 내의 1:1 결합 모델을 사용하여 각각의 사이클에 대한 회합 및 해리 속도로부터 결합 친화도 (K_D)를 수득하였다. 항-N3pGlu 항체인 B12L 및 R17L 및 모(parental) 마우스 항체 (mE8C)는 1 nM 미만의 K_D로 N3pGlu Aβ를 특이적으로 인식하였다. 항-N3pGlu 항체인 B12L 및 R17L 및 모 마우스 항체 (mE8C)는 유사한 친화도로 pE3-16에 또한 결합하였고, 이는 에피토프가 펩티드의 이러한 영역 내에 위치한다는 것을 가리킨다. 글리신 돌연변이체 펩티드에 대한 항체의 결합 분석은 결합에 결정적인 잔기가 3 내지 7이었음을 나타냈다: 위치 3의 pyroE, 위치 4의 F, 위치 5의 R, 위치 6의 H, 위치 7의 D. Aβ_1-40에 대한 검출가능한 결합은 본 발명의 항체에 대해 검출되지 않았다.

실시예 3: 응집된 N3pGlu 에 대한 결합 친화도

비아코어® 실험을 응집된 N3pGlu Aβ에 대한 항-N3pGlu 항체의 결합을 모니터링하기 위해 또한 수행하였다. 이러한 실험에서, N3pGlu Aβ 펩티드를 아민 커플링 화학을 통해 CM-5 칩 상의 유동 셀(flow cell) 2 (저밀도, LD), 3 (중간 밀도, MD), 및 4 (고밀도, HD)에 상이한 밀도로 고정시켰다. 여러 수준의 N3pGlu Aβ 펩티드를 고정시켜, 항-N3pGlu 항체의 결합에 대한 표면 밀도의 효과를 시험하였다. 고정 시, 단량체성 펩티드만 인식하는 대조군 Mab의 결합이 결여되는 것에 의해 입증된 바와 같이 대다수의 N3pGlu Aβ가 표면 상에서 응집하였다. 이러한 응집된 형태의 펩티드는 원섬유 또는 아밀로이드 형태의 응집된 a베타 펩티드의 성질을 모방하고, 이때 펩티드의 N-말단 영역은 노출되고, 항체가 이를 표적으로 할 수 있다.

25℃에서 다중 분석 사이클을 사용하여 결합을 평가하였다. 각각의 사이클은 50 ㎕/분의 유량으로 수행되었고, 하기의 단계들로 이루어졌다: 250 ㎕의 N3pGlu 항체 용액을 주입하는 단계 (500 nM로 시작하고, 각각의 사이클에 대해 2배 단계 희석을 사용함), 그 후 20분 동안 해리시키는 단계, 및 약 30 ㎕의 10 mM 글리신 히드로클로라이드 (pH 1.5)를 사용하여 재생시키는 단계. 각각의 사이클에 대한 회합 및 해리 속도를 비아이밸류에이션 분석 소프트웨어 내의이종성 리간드 모델을 사용하여 평가하였다. 1:1 결합 모델이 데이터에 맞지 않았기 때문에, 이종성 피트(fit) 모델로 2개의 결합 친화도 (낮은 친화도 및 높은 친화도)가 산출되었다. R17L 및 B12L 항체 및 모 뮤린(murine) 항체 mE8c는 응집된 N3pGlu Aβ에 높은 친화도 K_D _,1 < 100 pM 및 더 낮은 친화도 K_D _,2 < 10 nM로 결합하였다. 최대 결합 신호 (Rmax)가 낮은 친화도 및 높은 친화도 결합으로부터의 Rmax의 합으로서 계산되었다. 밀도가 더 높은 표면에서 더 많은 결합 부위가 이용가능할 때 예상되는 바와 같이, 표면 상의 펩티드의 밀도가 증가함에 따라 Rmax가 증가하는 것으로 보였다. 이러한 결합 연구는 본 발명의 항체가 응집된 N3pGlu Aβ에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 4: 생체외 표적 교전 연구

고정된 PDAPP 뇌 (24개월령)로부터의 뇌 절편 상에서의 생체외 표적 교전을 결정하기 위해 면역조직화학 분석을 외인성으로 첨가된 Aβ 항체로 수행하였다. PDAPP 트랜스제닉 마우스는 알츠하이머병과 연관된 많은 병리학이 발달되는 것으로 나타났다. 뮤린 항체에 대해, 이러한 실험이 뮤린 조직 상에서 수행되었기 때문에 비오틴 태그(tag)를 표지로 사용하였고, 따라서 비오틴화되지 않은 비-뮤린 항-N3pGlu 항체들 사이의 직접적인 비교는 적합하지 않았다. 비오틴화 3D6 N 말단 (1-5) 항체는 PDAPP 해마 내의 유의한 양의 침착된 Aβ를 강건(robust)하게 표지한 반면, 비오틴화 mE8은 침착물들의 부분집합만 표지하였다. 인간 AD 뇌와 달리, PDAPP 뇌 내의 대부분의 침착된 Aβ는 전장이다. 비오틴화되지 않은 항-N3pGlu 항체, 예컨대 B12L 및 R17L에 대한 유사한 플라크 표지 (mE8에 비교됨)가 관찰되었다. 마우스 또는 인간 대조군 IgG에 대해서는 특이적 플라크 표지가 관찰되지 않았다. 침착된 Aβ의 조성 및 가능하게는 구조가 극적으로 AD 뇌에서 상이하기 때문에, 비오틴화되지 않은 항-N3pGlu (3 ㎍/㎖) 항체들을 신선하게 동결된 AD 뇌로부터의 뇌 절편 상의 침착된 Aβ에 이들이 결합하는지 여부를 결정하기 위해 조사하였다. 양성 대조군 항체 (비오틴화 3D6)는 AD 뇌 내의 많은 Aβ 플라크를 강하게 표지한 반면, 음성 대조군 항체 (뮤린 및 인간 IgG)에서는 어떠한 인지가능한 결합도 결여되었다. B12L 및 R17L과 같은 몇몇 비오틴화되지 않은 항-N3pGlu 항체는 침착된 Aβ에 유사하게 결합하였다. 이러한 조직학적 연구는 본 발명의 항-N3pGlu 항체가 생체 외의 침착된 Aβ 표적과 교전할 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 5: 생체내 표적 교전 연구

생체 내의 침착된 표적과 교전하는 항-N3pGlu 항체의 능력을 측정하였다. 매주 복강내 (IP) 투여된 40 ㎎/㎏의 비오틴화 뮤린 항체 3D6 및 mE8c로 준-장기(sub-chronic) 4주 연구를 수행하였다. 실험 종료 시 뇌를 수확하였고, 표적 교전 수준을 뇌의 조직학적 검사에 의해 결정하였다. 비오틴화 3D6을 주사한 동물에서는 해마 고랑을 따라서만 플라크가 표지된 반면, 비오틴화 mE8c를 주사한 마우스는 해마 및 피질 영역에서 강건한 플라크 표지를 나타냈다. 매우 유사한 표적 교전 패턴이 더욱 급성인 3일 검정에서 관찰되었다 (3D6는 해마 고랑을 염색하였고, mE8은 해마 및 피질 영역 둘 모두를 표지하였다). 이러한 결과는 가용성 및 불용성 Aβ 둘 모두에 결합하는 3D6 항체가 가용성 Aβ로 포화되고 있었고, 따라서 원하는 침착된 표적과 교전할 수 없었음을 강하게 시사한다. 완전히 대조적으로, 뮤린 항-N3pGlu 항체 mE8c는 중대한 뇌 영역들 둘 모두 내의 의도되는 표적과 일관적으로 교전하였다. 고용량 및 저용량의 R17L 및 B12L 항-N3pGlu 항체를 유사한 3일 생체내 연구에서 평가하였다. 항체들을 10 ㎎/㎏ (저용량) 또는 40 ㎎/㎏ (고용량)으로 IP 주사하였다. 연구 종료 시, 혈장 및 뇌를 수확하고, 혈장 PK를 결정하였다. 뇌를 절편화하고, 항-인간 항체 (결합된 항-N3pGlu 항체 결정용) 및 3D6 (절편 내의 침착된 표적의 총량 결정용)으로 자매 섹션 상에서 면역조직화학을 수행하였다. 생체내 표적 교전 수준을 더 잘 정량하기 위해, 항-N3pGlu 항체가 결합한 면적 백분율을 가능한 표적 (외인성 3D6 면역조직화학에 의해 가시화된 총 침착된 Aβ)의 총 면적 ％에 대해 표준화하였다. 추가적으로, 전체 표적 교전 백분율을 각각의 개별적인 마우스에 대한 혈장 약동학 (PK) 값에 대해 표준화하였는데, 이는 유의한 노출이 연구 종료 시 검출되기 때문이었다. R17L 및 B12L 항-N3pGlu 항체 둘 모두는 뮤린 항-N3pGlu 항체 (mE8)로 관찰된 것과 유사한 분포로 침착된 플라크와 교전하는 것으로 발견되었다. 이러한 결과는 R17L 및 B12L 항-N3pGlu 항체는 말초 투여되었을 때 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있고 침착된 Aβ인 의도된 표적과 교전할 수 있는 반면, 가용성 및 불용성 Aβ 둘 모두에 결합하는 항체는 가용성 Aβ로 포화되게 되어 의도된 침착된 표적과 교전할 수 없다는 것을 입증한다.

실시예 6: 치료적 플라크 저하 연구

23개월령 PDAPP 마우스에서의 치료적 플라크 저하 연구를 하기의 항체로 수행하였다: 음성 대조군 항체 (IgG2a), 3D6, mE8 (IgG1), 및 mE8c (IgG2a). 노령의 PDAPP 마우스에게 12.5 ㎎/㎏의 각각의 항체를 3개월 동안 매주 피하 주사하였다. 23개월령에서의 초기 플라크 부하를 결정하기 위해 일군의 마우스를 연구를 시작할 때 (시점 0) 부검하였다. 연구 종료 시에, 혈장을 수득하고, 뇌를 생화학적 및 조직학적 결과를 위해 프로세싱하였다 (각각 1개의 뇌반구). 해마 및 피질 영역을 5M 구아니딘에서 균질화하고, Aβ 함량을 산 요소 겔에 이어지는 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. 23개월령 시점 0 및 음성 항체 대조군 (26개월령) 코호트로부터의 해마 구아니딘 용해물의 분석은 침착된 Aβ_1-42의 유의하지 않은 증가를 나타냈고, 이에 의해 PDAPP 마우스의 뇌가 플라크 플래토(plateau)에 있다는 것이 확증되었다. 노령 PDAPP 마우스에서의 이전의 연구와 유사하게, 비교물 항체 3D6으로의 처치는 플라크 저하에 대한 효과가 없었다. 어느 한쪽 N3pGlu 항체 (mE8 또는 mE8c)로의 처치는 IgG2a 음성 대조군 항체와 비교하여 유의한 플라크 저하를 초래하였다 (각각 p<0.01 및 p<0.001) (표 2). mE8 및 mE8c는 해마 Aβ_1-42를 각각 약 38％ 및 약 53％만큼 저하시켰다. 이펙터 기능이 최대인 N3pGlu 항체 mE8c는 최소 이펙터 기능 항체 mE8보다 더욱 효과적인 경향이 있었지만 (대조군에 비교됨), 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다. 또한, mE8c 항체는 시점 0 마우스에 비교했을 때 해마에서 Aβ_1-42의 유의한 약 30％ 저하가 있었고 (t-검정; p<0.0066), 따라서 이전에 침착된 플라크의 소거를 가리킨다. 이펙터 기능이 최대인 mE8c만 Aβ_1-42 침착을 유의하게 감소시켰다는 것을 제외하고는, 피질 구아니딘 용해물의 분석에서 매우 유사한 결과가 산출되었다. 이러한 결과들은 이러한 실시예의 N3pGlu 항체로의 만성 처치가 노령 PDAPP 마우스 내의 플라크 침착을 이펙터 기능에 의존적인 방식으로 유의하게 감소시켰다는 것을 입증한다. 추가적으로, 이러한 결과들은 (노쇠와 반대로) 가용성 및 불용성 Aβ 둘 모두에 결합하는 Aβ 항체에 대한 불량한 표적 교전이 치료 패러다임에서 사용될 때의 그의 효능 결여에 대한 원인 요소였다는 가설을 지지한다.

실시예 7: 노령 PDAPP 마우스에서의 미세출혈 분석

노령 PDAPP 마우스에서의 감소된 플라크 저하에 이르는 N3pGlu 항체의 작용 메커니즘이 CAA-관련 미세출혈의 악화를 초래할지 여부를 조사하기 위해 조직학적 연구를 수행하였다. 이전의 연구에서, 노령 APP 트랜스제닉 마우스를 특정 항-Aβ 아미노-말단 및 카르복실-말단 항체로 처치하는 것이 CAA-관련 미세출혈의 증가에 이를 것임이 입증되었다 (문헌 [Pfeifer et al. 2002]; [Wilcock et al. 2004]; [Racke et al. 2005]). 이러한 잠재적인 유해 사례의 기저를 이루는 메커니즘은 불명확하지만, 2개의 상호 배타적이지 않은 가설이 제안되었다: 대뇌 혈관 내로의 Aβ 재분배 (문헌 [Wilcock et al. 2004]) 또는 기존의 CAA에 대한 항체의 직접적인 결합 (문헌 [Racke et al. 2005]). Aβ_p3 _-x가 AD 환자 및 노령 PDAPP 마우스 둘 모두에서 CAA의 구성물이라는 것이 생화학적 및 조직학적 분석에서 입증되었다. N3pGlu 및 대조군 항체로 치료적으로 처치된 노령 PDAPP 마우스 (23 내지 26개월령)에서의 미세출혈에 대한 상세한 조직학적 분석을 12.5 ㎎/㎏을 매주 피하 주사하면서 3개월 동안 수행하였다. 미세출혈 분석에 대한 양성 대조군은 3D6으로 만성적으로 처치된 동물이었고, 이러한 항-Aβ 아미노-말단 항체가 미세출혈을 유의하게 악화시킨다는 것이 기존에 이러한 동물에서 입증되었다 (문헌 [Racke et al. 2005]). 연구 종료 시에, 각각의 동물로부터의 뇌반구 1개를 4％ 포름알데히드에 점적-고정(drop-fix)하고, 파라핀에 포매하였다. 2 ㎜의 조직을 포함하는 관상 절편(coronal section)을 50개의 슬라이드 상에 절편화하였다 (슬라이드 당 4개의 10 ㎛ 절편). 2 ㎜의 조직에 걸친 동일한 간격으로부터의 11개의 슬라이드를 헤모시데린(hemosiderin) (미세출혈로 인한 세포성 철 축적)을 가시화하기 위해 펄스 블루(Perls Blue)로 염색하였다. 슬라이드 당 2개의 절편을 맹검 방식으로 수동으로 카운팅하였다. 3D6 (양성 대조군)으로의 노령 PDAPP 마우스의 만성 처치는 미세출혈을 극적으로 증가시켰다 (p<0.001). 중요하게, mE8 (IgG1) 또는 mE8c (IgG2a)로의 처치가, 비록 이러한 N3pGlu 항체들이 이러한 동물들 내의 침착된 Aβ를 유의하게 저하시켰더라도, 미세출혈을 악화시키지 않았다는 것이 입증되었다. 이러한 결과는 이러한 실시예의 N3pGlu 항체가 노령 PDAPP 마우스에서 CAA-관련 미세출혈을 악화시키지 않는다는 것을 입증한다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-N3pGlu AMYLOID BETA PEPTIDE ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> X19093 <150> 61/373026 <151> 2010-08-12 <150> PCT/US2011/046994 <151> 2011-08-09 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(42) <223> This sequence represents amyloid beta 1-42 <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> This sequence represents N3pE amyloid beta <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <400> 2 Xaa Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> This sequence represents LCDR1-B12L/R17L/hE8L/R17 <400> 3 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> This sequence represents LCDR2-B12L/R17L/he8L/CI-C7 <400> 4 Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> This sequence represents LCDR3-B12L/R17L/hE8L/R17/CI-C7 <400> 5 Val Gln Gly Thr His Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> This sequence represents HCDR1-B12L <400> 6 Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> This sequence represents HCDR1-R17L/R17 <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> This sequence represents HCDR2-B12L/R17L/R17/CI-C7 <400> 8 Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> This sequence represents HCDR3-B12L <400> 9 Glu Gly Ile Thr Val Tyr 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> This sequence represents HCDR3-R17L/R17 <400> 10 Glu Gly Thr Thr Val Tyr 1 5 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> This sequence represents LCVR-B12L/R17L/hE8L <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-B12L <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-R17L <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> This sequence represents LC-B12L/R17L <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(444) <223> This sequence represents HC-B12L <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 16 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(444) <223> This sequence represents HC-R17L <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 17 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(336) <223> This sequence represents LCVR DNA-B12L/R17L <400> 17 gatattgtga tgactcagac tccactctcc ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgca agtcaagtca gagcctctta tatagtcgcg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ctcctgcaga agccaggcca atctccacag ctcctaattt atgcggtgtc taaactggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggccgaaga tgttggggtt tattactgcg tgcaaggtac acattaccca 300 ttcacgtttg gccaagggac caagctggag atcaaa 336 <210> 18 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(345) <223> This sequence represents HCVR DNA-B12L <400> 18 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggtta cgacttcact agatactata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaatcctg gaagcggtaa tactaagtac 180 aatgagaaat tcaagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggc 300 atcacggtct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 19 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(345) <223> This sequence represents HCVR DNA-R17L <400> 19 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggtta caccttcact agatattata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaatcctg gaagcggtaa tactaagtac 180 aatgagaaat tcaagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggc 300 acaacggtct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> This sequence represents LCVR-mE8 <400> 20 Asn Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-mE8 <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> This sequence represents LC-mE8 and mE8c <400> 22 Asn Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(439) <223> This sequence represents HC-mE8 <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 210 215 220 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 340 345 350 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 405 410 415 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 420 425 430 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 <210> 24 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(445) <223> This sequence represents HC-mE8c <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln 260 265 270 Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 275 280 285 Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu 290 295 300 Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro 340 345 350 Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr 355 360 365 Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys 370 375 380 Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val 405 410 415 Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This seqence represents pE3-16 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 25 Xaa Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents E3-16 <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 26 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents pEG4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 27 Xaa Gly Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> rattus rattus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents mpE3-16 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 28 Xaa Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents pEG6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 29 Xaa Phe Arg Gly Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents pEG7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 30 Xaa Phe Arg His Gly Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> This sequence represents LCVR-hE8-C6 <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-hE8-C6 <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> This sequence represents LC-hE8-C6 <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Gln Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 34 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(444) <223> This sequence represents HC-hE8-C6 <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> This sequence represents LCDR2-R17 <400> 35 Ala Val Ser Lys Leu Gly Ser 1 5 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> This sequence represents LCVR-R17 <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents pEG8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 37 Xaa Phe Arg His Asp Gly Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> This sequence represents LC-R17 <400> 38 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> This sequence represents pEF10 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys at position 14 is modified with biotin <400> 39 Xaa Phe Arg His Asp Ser Gly Phe Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> This sequence represents HCDR1-hE8L/CI-C7 <400> 40 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> This sequence represents HCDR3-hE8L <400> 41 Glu Gly Glu Thr Val Tyr 1 5 <210> 42 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-hE8L <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 1332 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1332) <223> This sequence represents HC DNA-R17L <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1332) <223> This sequence represents HC DNA-R17L <400> 43 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggtta caccttcact agatattata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaatcctg gaagcggtaa tactaagtac 180 aatgagaaat tcaagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggc 300 acaacggtct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tcccgctagc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg acgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcccc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gt 1332 <210> 44 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(444) <223> This sequence represents HC-hE8L <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> This sequence represents LCDR1-CI-C7 <400> 45 Lys Ser Thr Arg Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> This sequence represents HCDR3-CI-C7 <400> 46 Glu Gly Val Thr Val Tyr 1 5 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> This sequence represents LCVR-CI-C7 <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Arg Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Ser Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 48 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> This sequence represents HCVR-CI-C7 <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Val Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> This sequence represents LC-CI-C7 <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Arg Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Ser Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 50 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(444) <223> This sequence represents HC-CI-C7 <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Val Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> This sequence represents LCDR1 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X at position 3 = S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X at position 4 = Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X at position 11 = G or S <400> 51 Lys Ser Xaa Xaa Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Xaa Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> This sequence represents LCDR2 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X at position 6 = D or G <400> 52 Ala Val Ser Lys Leu Xaa Ser 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> This sequence represents HCDR1 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X at position 3 = D or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X at position 6 = R or D <400> 53 Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> This sequence represents HCDR3 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X at position 3 = I, T, E or V <400> 54 Glu Gly Xaa Thr Val Tyr 1 5 <210> 55 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(657) <223> This sequence represents LC DNA-B12L/R17L <220> <221> misc_feature <222> (1)..(657) <223> This sequence represents LC DNA-B12L/R17L <400> 55 gatattgtga tgactcagac tccactctcc ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgca agtcaagtca gagcctctta tatagtcgcg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ctcctgcaga agccaggcca atctccacag ctcctaattt atgcggtgtc taaactggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggccgaaga tgttggggtt tattactgcg tgcaaggtac acattaccca 300 ttcacgtttg gccaagggac caagctggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgc 657 <210> 56 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1332) <223> This sequence represents HC DNA-B12L <400> 56 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggtta cgacttcact agatactata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaatcctg gaagcggtaa tactaagtac 180 aatgagaaat tcaagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggc 300 atcacggtct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tcccgctagc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg acgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcccc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gt 1332

Claims

경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 이때 상기 LCVR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 폴리펩티드를 포함하고, HCVR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
a) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYDFTRYYIN (서열 6)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGITVY (서열 9)임;
b) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTRYYIN (서열 7)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGTTVY (서열 10)임;
c) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTDYYIN (서열 40)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGETVY (서열 41)임;
d) LCDR1이 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열 3)이고, LCDR2가 AVSKLGS (서열 35)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTRYYIN (서열 7)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGTTVY (서열 10)임; 및
e) LCDR1이 KSTRSLLYSRSKTYLN (서열 45)이고, LCDR2가 AVSKLDS (서열 4)이고, LCDR3이 VQGTHYPFT (서열 5)이고, HCDR1이 GYTFTDYYIN (서열 40)이고, HCDR2가 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열 8)이며, HCDR3이 EGVTVY (서열 46)임.
제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 이때 상기 LCVR 및 HCVR이
a) 서열 11의 LCVR 및 서열 12의 HCVR;
b) 서열 11의 LCVR 및 서열 13의 HCVR;
c) 서열 11의 LCVR 및 서열 42의 HCVR;
d) 서열 36의 LCVR 및 서열 37의 HCVR; 및
e) 서열 47의 LCVR 및 서열 48의 HCVR
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 이때 LC 및 HC 폴리펩티드가
a) 서열 14의 LC 및 서열 15의 HC;
b) 서열 14의 LC 및 서열 16의 HC;
c) 서열 14의 LC 및 서열 44의 HC;
d) 서열 38의 LC 및 서열 39의 HC; 및
e) 서열 49의 LC 및 서열 50의 HC
로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제3항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 이때 각각의 경쇄 및 각각의 중쇄가
a) 서열 14의 LC 및 서열 15의 HC;
b) 서열 14의 LC 및 서열 16의 HC;
c) 서열 14의 LC 및 서열 44의 HC;
d) 서열 38의 LC 및 서열 39의 HC; 및
e) 서열 49의 LC 및 서열 50의 HC
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드인, 조작된 인간 항-N3pGlu Aβ 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
삭제
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조작된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 전구성 알츠하이머병, 다운 증후군, 또는 임상 또는 전임상 아밀로이드 혈관병증 (CAA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조작된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제