KR101495225B1

KR101495225B1 - Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법

Info

Publication number: KR101495225B1
Application number: KR1020130110253A
Authority: KR
Inventors: 왕홍타오; 박상열; 김현정; 이원희
Original assignee: 바디텍메드 주식회사
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2015-02-25
Also published as: CN106537147A; EP3045916A1; EP3045916A4; US10228373B2; WO2015037907A1; US20160223544A1

Abstract

본원은 생물학적 시료 중 바이오마커로서, 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 중 하나 이상 마커의 검출시약을 포함하는 간질환 진단 또는 모니터링용 키트, 방법 및 상기 검출에 사용되는 항체를 개시한다.
본원에 따른 방법은 기존의 효소 활성 측정법과 비교하여, 생물학적 시료 특히 혈액 시료 중에 존재하는 cAST 또는 mAST의 양의 측정을 통해 높은 민감도로 간질환을 진단 또는 예후를 보다 정확하게 측정할 수 있다.

Description

AST 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법 {Kit and method for diagnosis, prognosis or monitoring liver disease by determing the amount of AST present in biological samples}

본 발명은 면역학적인 방법을 이용한 바이오마커의 검출을 통한 간질환 진단 방법 분야에 관한 것이다.

간 질환은 인류의 가장 흔한 질병으로 여러 타입이 있으며, 일부 질환은 치명적이다. 특히 간세포암의 경우는 세계적으로 암 사망 원인의 5번째를 차지하고 있으며 이로 인해 사망하는 경우도 계속 늘고 있다. 환자들은 간이 심각하게 손상될때까지 주목할 만한 자가 증상을 느끼지 못하므로 간 질환의 조기 발견을 위한 정확한 진단방법을 개발하는 것이 중요하다.

간 기능을 나타낼 수 있는 몇 가지 파라미터가 사용되고 있다. 이들 중 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)는 간세포 내에 많이 존재하는데, 독성 물질, 바이러스 감염, 알콜, 또는 비만 등의 여러 요소에 의해 야기되는 손상된 간세포로부터 혈액 순환계로 분비된다. 이는 L-아스파르테이트 및 알파-케토글루타레이트를 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트로 전환하는 반응을 가역적으로 촉매하며, 간이 건강한지 여부를 평가하는데 사용되고 있다.

포유류의 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제는 두 가지 아이소엔자임을 가지고 있는데, 하나는 세포질에 존재하는 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST)이며, 다른 하나는 미토콘드리아에 존재하는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)이다. AST 아이소엔자임을 임상학적으로 이용하기 위한 몇 가지 시도들이 있지만, 이들 방법들은 임상진단을 목적으로 널리 사용되고 있지 않다. 그 이유는 피리독살 5-포스페이트(AST의 코엔자임)가 테스트 결과에 영향을 미칠 수 있어 정확하지 않기 때문이다. 또한 현재의 AST 분석방법은 cAST 및 mAST 의 활성이 합쳐진 총 AST의 효소 활성을 측정하는 것이다. 그러나 AST 아이소엔자임이 간 조직으로부터 혈액 순환계로 방출되었을 때 순환되는 동안 분해되거나 개질될 수 있으므로, 효소 활성의 측정은 혈액 내 AST 단백질의 정확한 양을 반영하지 못할 수 있다.

생화학적인 효소 활성 측정 방법 보다 AST 아이소엔자임의 단백질양을 면역학적 방법으로 측정하는 것이 간의 상태를 더욱 정확히 알 수 있으므로, AST 아이소엔자임의 양을 측정하려는 몇몇 시도들이 있었다.

하지만 이전 연구들은 간, 심장, 골격계 근육, 신장 및 뇌는 AST의 주요 원천이며 총 AST가 주로 몇몇 인간 조직에 위치하고 있음을 기술하고 있을 뿐, cAST와 mAST가 분리하여 분포하는 것으로 기술하고 있지 않다.

한편, 한국공개특허 제2002-0053113호에는 면역분석법을 이용한 AST 등의 혈청 효소의 정량적 측정방법 및 이를 이용한 간질환 검사방법을 개시하고 있지만 cAST와 mAST 를 분리하여 측정하는 방법을 기술하고 있지는 않다.

미국 특허 제7981627호에는 대상자의 혈액 내 AST 효소 활성 레벨을 측정하는 것을 포함하는 간섬유증을 진단, 모니터링하기 위한 방법을 개시하고 있다.

미국 공개특허 제2006-0172286호에는 대상자의 혈청이나 혈액 내 AST와 같은 바이오마커의 효소활성을 측정하는 것을 포함하는 간질환의 진단방법을 개시하고 있다.

하지만 이들 문헌은 혈청 내에서 총 AST를 측정하고 있을 뿐 세포질형 및 미토콘드리아형을 분리 측정하거나 간 질환 진단과의 관련성에 대하여는 개시하고 있지 않다.

본원은 간질환과 관련되어 혈액과 같은 생물학적 시료에 존재하는 cAST 또는 mAST의 양을 측정하여 이를 간질환 진단에 사용할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

한 양태에서 본원은 생물학적 시료 중 바이오마커로서 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 중 하나 이상 각 마커의 검출시약을 포함하는 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트 또는 조성물을 제공한다.

본원에 따른 키트 또는 조성물은 생물학적 시료로, 예를 들면 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함하는 혈액을 사용하며, 본원에 따른 일 구현예에서는 혈청이 사용된다.

본원에 따른 키트 또는 조성물에 포함되는 검출시약은 상기 각 바이오마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약이다. 본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 키트에 포함되는 각 바이오마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약은 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 본원의 키트에 포함되는 각 바이오마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약은 예를 들면 각 바이오 마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약은 상기 각 바이오 마커를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 수용체, 펩티도모방체(peptidomimetics), 리간드 또는 보조인자이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서, 검출용 시약으로는 모노클로날 항체가 사용되며, 이러한 항체는 기탁번호 KCTC 12483BP; KCTC 12484BP ; 및 KCTC 12485BP 로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 모노클로날 항체이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 키트는 상기 키트는 생물학적 시료 중 바이오마커로서 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 중 하나 이상 각 마커의 양 또는 농도의 검출이 가능한 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 ELISA 분석용, 면역크로마토그래피 분석용, 또는 마이크로어레이 분석용으로 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 키트를 사용하여, 진단, 모니터링 또는 예후를 측정할 수 있는 간 질환은 간염, 간경변 또는 간암을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니며, 질환으로 확정되지 않았으나, 의심이 되는 경우도 포함하는 것이다.

다른 측면에서 본원은 또한 간질환 진단, 예후 또는 모니터링에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (mAST) 중 하나 이상의 바이오마커의 단백질 양 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계; 상기 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 상기 바이오마커의 단백질 양에 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간질환으로 판정하는 단계를 포함하는, 간질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 상기 각 마커의 단백질 양 또는 이의 존재여부의 검출 방법 앞서 언급한 것을 참조할 수 있으며, 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이 방식을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 그 외 본원의 방법에 적용되는 간질환, 생물학적 시료 등은 앞서 언급한 것을 참조할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)의 항체를 제공하는 단계; 상기 항-cAST 또는 항-mAST 항체 중 하나 이상의 항체를 대상체의 혈액 시료와 반응시킴으로써, 상기 대상체의 혈액 시료에 존재하는, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 본원에 따른 정량적 측정 방법은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있으며, 예를 들면 샌드위치 방식의 효소매개면역분석법 (ELISA)으로 정량된다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 키트 또는 상기 방법 들에 사용될 수 항체는 모노클로날 항체이다. 예를 들면 상기 항-cAST 항체는 표 1에 HCC 1 내지 10으로 기재된 어느 하나의 항체이고, 상기 항-mAST 항체는 표 1에 기재된 HCM 1 내지 HCM 10 중 어느 하나의 항체이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 상기 항-cAST 항체는 HCC4 또는 HCC5이고, 상기 항-mAST 단일클론 항체는 HCM4 또는 HCM8이다. 다른 구현예에서 상기 항체는 기탁번호 KCTC 12483BP ; KCTC 12484BP ; 또는 KCTC 12485BP 로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 항체이다.

다른 측면에서 본원은 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST)를 특이적으로 인식하는 기탁번호 KCTC 12483BP; 또는 KCTC 12484BP로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 2013년 9월 4일자로 기탁된 모노클로날 항체, 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)를 특이적으로 인식하는 기탁번호 KCTC 12485BP로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 2013년 9월 4일자로 기탁된 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에 따른 상기 항체는 상응하는 각 항원을 높은 특이성으로 인식하여, 본원에 따른 키트 및 방법에 사용되어, 생물학적 시료 중에 존재하는 상응하는 각 단백질의 양 또는 농도 측정에 사용될 수 있다.

본원의 방법에 따른 만성간염(CH), 간경변(LC) 및 간암 (HCC) 환자 그룹에서 혈청 cAST 및 mAST에 대한 면역학적 측정 방법이 기존의 효소활성 분석방법과 비교하여 보다 높은 정확성을 보여, 간 질환의 진단 또는 예후 또는 모니터링을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 간질환 환자의 cAST 및 mAST양은 정상인의 혈청에서 발견되는 단백질의 양보다 월등히 많아, 간질환의 진단, 예후 측정 또는 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 항체를 이용한 면역학적인 방법으로 검출 가능한 cAST 및 mAST 양의 범위는 0-400㎍/l로, 민감성(sensitivity)이 매우 높다. 따라서 기존의 생화학적인 검출 방법에 비해 적은 양도 검출할 수 있기 때문에 인간 혈청 내의 미량의 mAST 및/또는 cAST의 양을 정량하는데 사용될 수 있다. 본원에 따른 항 cAST 단일클론항체와 항 mAST 단일클론항체 사이에 교차반응성이 없으며, 이는 cAST와 mAST를 정확하게 구별하여 측정을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

본원에 따른 방법은 cAST와 mAST를 구별하지 않은 총 AST 측정 방법에 비하여 각각을 측정함으로서 보다 정학한 간질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 정제된 인간 재조합 cAST 및 mAST 단백질을 전기영동 및 웨스턴블랏 결과이다. 인간의 cAST와 mAST 재조합 단백질은 IPTG로 발현 유도 후, 정제된 단백질을 12% SDS-PAGE ((A) 및 (C))를 이용하여 분리하고, 각 단백질에 특이적인 항체로 웨스턴블랏을 수행하였다 ((B) 및 (D)). (A),(B),(C) 및 (D)의 각 라인은 다음과 같다: 1열: 비유도; 2열: 유도; 3열: 유도 후 정제.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 항-cAST와 항-mAST 항체의 교차활성 여부를 분석한 결과이다. (A) 간접 ELISA 분석 결과로, 항원, cAST 및 mAST를 각각 ELISA 플레이트에 코팅하였고, 본원에 따른 항-mAST 항체(HCM4)와 항-cAST항체(HCC4)를 1차 항체로 사용하였다: 1: cAST 코팅; 2: mAST 코팅. (B)는 웨스턴블랏 결과로, a: SDS-PAGE; b: 1차 항체 HCC4; c: 1차 항체는 HCM4를 이용한 결과이고, 각 사진에서 1열은 cAST; 2열은 mAST를 나타낸다. 교차활성이 없는 것으로 나타났다.
도 3은 cAST와 mAST의 펩타이드 맵핑 결과를 나타낸다. 정제된 재조합 단백질 cAST 및 mAST를 프로테아제로 분해한 후, 웨스턴블랏을 수행하여 본원에서 제조된 단일클론항체가 동일한 에피토프를 인식하는지 여부를 분석하였다. A는 cAST 분석결과로, 1 내지 10번열에는 각각 HCC1 내지 HCC10의 1차 항체가 사용되었고, B는 mAST 분석결과로. 1 내지 10번열은 각각 HCM1 내지 HCM10의 1차 항체가 사용되었다.
도 4는 hepG2 세포에서 cAST와 mAST 발현을 확인한 결과이다. 배양된 hepG2 세포의 전체 융해물 (1열), 상등액 (2열) 및 펠렛 (3열)에 대하여 웨스턴블랏을 수행하였다: (A) SDS-PAGE; (B) cAST의 웨스턴블랏, 1차 항체는 HCC4; (C) mAST의 웨스턴블랏, 1차 항체는 HCM4. D 내지 E는 hepG2 세포에 대한 면역형광분석 결과로, HCC4 (D-F)와 HCM4를 (G-I)를 1차 항체(1μg/ml)로 사용했고, 2차 항체는 FITC 복합체를 사용하였다: (D) 및 (G)는 알렉사(Alexa), (E) 및 (H)는 DAPI, (F) 및 (I)는 머지(merge)한 결과이다.
도 5는 본원에 따라 제조된 cAST와 mAST의 단일클론 항체를 이용한 정상인과 간질환 환자의 혈청에서의 cAST 및 mAST에 대한 항원 특이적 결합을 분석한 전기영동 (A, B) 및 웨스턴블랏 (B, D) 결과이다. 윗패널 (A, B)은 cAST, 아래패널 (C. D)은 mAST 항체를 이용한 결과이다. 각 사진에서 1열은 재조합 단백질, 2열은 건강한 혈청(10 IU/L), 3열은 간 질환 환자의 혈청(760 IU/L) 시료를 이용한 분석결과이다.
도 6은 면역조직분석법으로 간세포에서 cAST와 mAST의 발현 및 위치를 분석한 결과이다. 배율 : x20
도 7은 혈청 cAST 및 mAST를 샌드위치 시스템을 이용하여 측정한 결과이다. (A)는 cAST에 대한 결과로, 단 클론 항체 HCC4와 HCC5는 각각 포획 항체, 검출 항체로 사용되었고, 재조합 단백질 cAST는 기준 단백질로 사용되었다. 재조합 단백질 cAST는 1/5 정상 혈청(10 IU/L)과 4/5 PBS로 희석되었다. 사용된 재조합 단백질 cAST의 농도는 0μg/l, 6.25μg/l, 12.5μg/l, 25μg/l, 50μg/l, 100μg/l, 200μg/l, 400μg/l 이었다. (B)는 mAST에 대한 결과로 단일클론 항체 HCM4와 HCM8이 각각 포획 항체, 검출 항체로 사용되었고, 재조합 단백질 mAST는 기준 단백질로 사용되었다. 다른 단계는 A와 동일하다. 측정 커브의 스파이크 포인트(spike point)는 각 농도에서 3회 독립적 실험의 평균값이다.
도 8은 간질환 환자 (CVH, LC, HCC)의 혈청에서 얻어진 cAST의 양 및 효소 활성에 대한 ROC 커브로, 건강한 사람과 간 질환 환자의 혈청 중 cAST의 양의 측정과 이의 효소활성의 민감성 및 특이성을 분석한 결과이다. (A) 모든 환자; (B) CVH; (C) LC; (D) HCC이고, 검정 실선은 cATS의 양, 점선은 AST의 효소 활성을 나타낸다.

이하, 명세서에 사용된 용어의 정의를 포함하여 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.

본원은 간 질환의 경과에 따른 간 손상에 의해 혈액 중으로 배출되는 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)의 양이 증가하고, 이의 검출을 통해 간질환을 진단할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 생물학적 시료 중 바이오마커로서, 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 중 하나 이상 마커의 검출시약을 포함하는 간질환 진단 또는 모니터링용 키트 또는 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어,"진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 “예후”는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 질환 예컨대 간세포암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 “모니터링”은 정상인 또는 질환이 의심되는 환자의 간질환 발병여부를 관찰하거나 또는 질환이 있는 환자의 치료 전 및/또는 후의 경과를 관찰하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본원에서 “생물학적 시료”란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 간세포암 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 한 구현예에서는 혈액 시료가 사용된다. 본원에서 사용되는 혈액 시료는 환자 및 정상인을 포함하는 대상체의 혈액으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 혈액 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 혈액 또는 임의의 혈액 구성분일 수 있으며, 혈액, 혈장 또는 혈청을 포함한다.

또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "간질환" 이란, 간 기능에 장해가 있는 증상을 가리킨다. 예를 들어, 바이러스성 급성 또는 만성간염, 간경변 및 간암 또는 간세포암을 들 수 있다. 병명이 확실치 않은 경우라도, GOT, GPT, γ-GTP 등의 간 기능의 지표에 이상이 관찰되는 증상도 간질환에 포함된다.

본원에서 사용된 용어 “바이오마커” 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 간질환이 발생한 대상체, 이에서 유래된 조직 또는 세포를 정상 세포 또는 적절한 치료를 받은 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 생물학적 시료와 비교하여 증가 양상을 보이는 단백질로, 본원에서는 포유류의 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (Aspartate Aminotransferase, GOT) 가 사용된다. AST는 세포질에 존재하는 세포질 cAST와 미토콘드리아에 존재하는 mAST의 두 종류의 아이소엔자임이 존재하면, 본원에서는 상기 각 효소는 양적인 측면에서 개별적으로 측정된다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 시료에 존재하는 양의 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법 및 시약을 선택할 수 있을 것이다.

분석용 키트는 다양한 검출방법을 사용하여 시료 중의 바이오마커를 분석할 수 있다. 일 구현예에서는 ELISA 분석, 면역크로마토그래피를 기반으로 하는 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석, 마이크로어레이, 또는 면역분석 등과 같은 분석용 키트로 사용될 수 있다.

본원의 키트와 사용될 수 있는 정성적/정량적 분석 방법에는 예를 들면 항원- 항체 반응을 기본으로 하는 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 또는 항체와 같은 단백질 어레이 또는 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 또는 질량분석기 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 또는 RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 g수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

그 외 기타 다른 면역 반응 기반의 방법의 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis), 방사선면역분석, 면역확산법, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 질량분석, 단백질 마이크로어레이 또는 보체 고정 분석법이 사용될 수 있다.

본원에 따른 키트는 구체적 검출 방법에 따라 다양한 검출시약을 포함할 수 있으며, 예를 들면 단백질 수준(농도)의 검출 시약, 및/또는 단백질 존재여부 검출 시약을 포함할 수 있다.

일구현예에서, 본원에 따른 바이오 마커 단백질을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 기질, 핵산, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자를 포함한다.

다른 구현예에서는 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약을 포함한다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다.

상술한 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본 발명에서는 면역분석법이 사용되며, 이에 사용되는 항체는 단일클론 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다.

다른 구현예에서 본 발명에서는 면역분석법이 사용되며, 이에 사용되는 항체는 본원 표 1에 HCC 1 내지 10으로 기재된 어느 하나의 항체이고, 상기 항-mAST 항체는 표 1에 기재된 HCM 1 내지 HCM 10 중 어느 하나의 항체를 포함한다. 본원에 따른 항체는 면역원으로는 정제된 cAST 및 mAST 재조합체를 balb/c 마우스에 투여한 후, 세포 융합 및 스크리닝을 수행하여 cAST 및 mAST의 단일클론 히브리도마를 선정하고, 이를 마우스에게 복강내 주사하여 복수를 얻어 이를 정제하여 단일클론 항체를 수득한다. 정제된 단일클론 항체를 특성화하여 샌드위치 매치 페어(Sandwich match pairs)를 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 항 cAST 항체와 mAST 항체 사이에는 교차반응성이 없는 것이 바람직하다. 또한 면역분석법의 사용을 위해 항체간 분석 매치 페어를 선택할 수 있으며, 예를 들면 표 1에 나타난 바와 같이 cAST 또는 mAST에 대한 단일클론항체를 간접 ELISA, 항체 아이소타입 및/또는 웨스턴블랏을 이용한 특징을 규명하여 매치 페어를 선택할 수 있다. 본원에 따른 키트에서 사용되는 매치 페어 항체로 항-cAST 단일클론 항체는 HCC4 또는 HCC5이고, 상기 항-mAST 단일클론 항체는 HCM4 또는 HCM8이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

이러한 측면에서 본원은 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST)를 특이적으로 인식하는 2013년 9월 4일에 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12483BP로 기탁된 항체, 또는 KCTC 12484BP로 기탁된 모노클로날 항체에 관한 것이다.

다른 측면에서 본원은 또한 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)를 특이적으로 인식하는 2013년 9월 4일에 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12485BP로 기탁된 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본원에 따른 키트는 상술한 다양한 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 ELISA 키트, 면역크로마토그래피 스트립 키트, 화학발광분석용 키트 및 루미넥스(luminex®)키트 등을 들 수 있다.

일 구현예에서 본원의 키트는 ELISA 키트로 이는 바이오마커에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 바이오마커에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 바이오마커에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클론항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또다른 구현예에서 본원의 키트는 루미넥스 키트로 사용될 수 있다. 루미넥스 키트는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100 종류의 분석물을 동시에 측정할 수 있는 대용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 민감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 예를 들면 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 분석방법으로 두 종류의 레이져 검출기를 이용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도의 차이를 보이며 그 사이의 비드들은 레드와 오렌지 색의 비율이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 물질에 대한 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 바이오마커의 정량이 가능하다.

본 발명의 루미넥스 분석을 수행할 수 있는 키트는 바이오마커에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 바이오마커에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 바이오마커에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 물질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미세입자(micro particle)와 접합된 항체일 수 있으며, 또한 상기 미세입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

다른 구현예에서 본원의 키트는 약 5분내 분석결과를 알 수 있는 딥스틱 방식의 면역크로마토그래피 스트립과 같은 래피드 테스트 키트로 사용된다. 이를 위해 본원의 키트는 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드; (b) 시료 내의 바이오마커 물질과 결합하는 결합 패드; (c) 바이오마커에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 반응선 및 대조선이 처리되어 있는 반응 막; (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드; 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립에 사용되는 각 바이오마커에 특이적인 항체는 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 바이오마커에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본원에 따른 키트는 간 질환의 진단, 모니터링 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다. 또한 환자에서 치료 후 해당 바이오마커가 정상 범위 내로 회복되는 지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다.

이러한 측면에서, 본원은 간질환 진단, 예후 또는 모니터링에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 본원에 따른 키트 또는 조성물을 이용한 간질환 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 대상체의 생물학적 시료로부터 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (mAST) 중 하나 이상의 바이오마커의 단백질 양 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계; 상기 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 상기 바이오마커의 단백질 양에 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간질환으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 용어, "대상체"는 포유류, 예를 들면 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

본원에 따른 방법에서 상술한 검출 방법 및 시약을 이용하여, 본원에 따른 마커의 정성 및 정량 분석이 가능하며, 이를 대조군과 비교함으로써 간질환의 발병여부, 진행단계, 모니터링 또는 예후 등을 예측 및 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 대상체의 혈청을 수득하여, 상기 시료 중의 cAST 및/또는 mAST의 농도를 면역학적 방법을 수행하여 측정한 다음, 상기 측정치를 정상 대조군과 비교하여 진단, 모니터링 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다.

그 예로 정상 대조군에서 해당 바이오마커의 정상범위의 임계값(cutoff, 증가하는 바이오마커의 경우에는 상한치/감소하는 바이오마커의 경우에는 하한치)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 경우 해당 바이오마커의 양이 임계값보다 약 50% 이상 증가한 경우, 약 100% 이상 증가한 경우, 간질환 환자로 진단할 수 있다.하지만 수치는 이에 한정되는 것이 아니고, 질환의 진단을 위해 사용되는 구체적 방법 및/또는 시약 및/또는 시료의 종류에 따라 달라질 수 있다.

이러한 본원에 따른 방법은 단독으로 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 상기와 같은 진단, 모니터링 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 혈액 시료 분석 결과에 추가하여, 환자의 혈액 시료 이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 마커분석이외의 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 초음파, 전산화 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 혈관조영술, 내시경적 역행성 췌담관 조영술, 초음파 내시경, 종양 표지자, 또는 복강경 검사를 포함한다.

본원은 상술한 바와 같이 인간의 간이 손상되면, 손상된 간세포에서 순환되는 혈액쪽으로 cAST와 mAST가 방출되며, 이러한 cAST와 mAST 농도의 측정을 통해, 간질환을 진단할 수 있다는 것에 기반을 둔 것이다.

이러한 측면에서 본원은 또한 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)의 생물학적 시료 특히 혈액, 예를 들면, 전혈, 혈장, 혈청 중의 상기 바이오마커 중 하나 이상의 정량적으로, 예를 들면 농도를 측정하는 것이다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 방법은 상기 각 바이오마터를 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론 항체를 이제공하는 단계; 상기 항-cAST 또는 항-mAST 단일클론 항체 중 하나 이상의 항체를 대상체의 혈액 시료와 반응시킴으로써, 상기 대상체의 혈액 시료에 존재하는, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법에 사용되는, 항체를 비롯한 정량적 검출 방법 및 시약에 관하여는 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실 시 예

재료

단백질을 정제하기 위하여, Ni-NTA 아가로스를 퀴아겐(Qiagen (독일))에서, 6x his-tag항체를 타카라(Takara (일본))에서 구입하였다. 단일클론항체를 생산하기 위하여, 완전 프로인트 항원보강제(complete Freund’s adjuvant) 및 불완전 프로인트 항원보강제(incomplete Freund’s adjuvant)를 라이프 테크놀로지사(USA)로부터 구입하였다. 소태아 혈청(FBS) 및 둘배코 변형 이글 배지(DMEM) 파우더는 인비트로젠(Invitrogen corporation (USA))로부터 구입하였다. 웨스턴블랏을 하기 위해, 아머샴 바이오사이언그(Amersham Biosciences (스웨덴))에서 ECL 플러스 웨스턴블랏 검출 시스템을 구입하였다. 코닥(Kodak (USA))에서 X-Omat AR 필름을 구입하였다. 항체의 아이소타입 때문에 임뮨퓨어 단일클론 항체 아이소타입핑 킷트를 피어스(Pierce (USA))에서 구입하였다. 효소활성 측정을 위해 지오 및 지피-트랜스아미나제 킷트(GO and GP-Transaminase Kit)를 시그마 디아그노스틱사(Sigma diagnostics Inc (USA))에서 구입하였다. 면역형광현미경법을 위해 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific (USA))에서 커버슬립 및 슬라이드를 구입하였다. 플로레슨트 마운팅 미디움(Fluorescent mounting medium)은 다코(Dako (Denmark))로부터 구입하였다.

실시예 1. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제의 정제

1-1. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제의 발현 및 정제

인간 간 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 재조합체 유전자는 cAST 및 mAST의 mRNA를 인간 간 조직에서 분리하여 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 얻었다. 증폭된 PCR 산물을 T-벡터에 클로닝하고 이어 6x-his 태그 유전자 시퀀스를 포함하는 PET21a (+)에 클로닝하였다.

이어 발현을 위해 cAST 및 mAST의 재조합체는 OD 값:0.5-0.7; IPTG: 0.1mM; 배양시간: 3시간; 온도: 37°C 조건에서 발현하였고 Ni-NTA 레진으로 정제하였다. 정제된 단백질은 웨스턴블랏으로 확인하였다.

인간 간 cAST의 유전자는 414개의 아미노산으로 인코딩할 수 있는 1245bp를 함유하고 있으며, 이에 단백질의 예상 크기는 약 45kDa 이다. 인간 간 mAST의 유전자는 430개의 아미노산으로 인코딩할 수 있는 1293bp를 함유하고 있으며, 이에 단백질의 예상 크기는 약 47kDa이다. 융합 단백질은 웨스턴블랏으로 확인하였으며, 1차 항체는 마우스 항-his tag lgG이다. 결과는 도 1에 나타나있다.

1-2. cAST 및 mAST 재조합 단백질의 효소 활성

인간 cAST 및 mAST는, 아세테이트 및 알파-케토글루타레이트를 옥살로아세테이트 및 글루타메이트로로 전환시키는 반응 및 그 역반응을 촉매하는 호모다이머이다. 인간 간 cAST 및 mAST 재조합 단백질의 효소 활성은 시그마 키트(Sigma kit)를 제조자의 방법대로 사용하여 테스트하였다. 재조합 cAST 및 mAST의 활성은 각각 1086 IU/mg와 843 IU/mg였다.

실시예 2. 단일클론 항체의 생산

면역화, 세포융합 및 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 스크리닝은 하기의 방법에 따라 수행하였다. 요약하면 면역력이 있는 6~8주된 balb/c 마우스에게 항원으로 정제된 재조합 단백질 cAST와 mAST를 각각 투여하였다. 세포 융합 및 스크리닝을 수행하였고, cAST와 mAST의 단일클론 히브리도마 세포주 10개씩을 각각 선정하였다. 20개의 단일클론 히브리도마 세포를 마우스(6~8주된 balb/c)에 복강내 주사하여 복수를 얻었다. 상기 복수를 정제하여 20의 정제된 단일클론 항체를 얻었고, 상기 항-cAST 항체를 HCC1-HCC10으로 명명하였고, mAST의 항체는 HCM1-HCM10으로 명명하였다.

2-1. 완전 및 불완전 둘배코 변형 이글 배지(DMEM)의 제조

분말 배지 2개 백(bag)을 약 1700ml의 이중 증류수 (DDW)에 용해하였고, DDW로 백을 세척하여 모든 파우더가 DDW에 완전히 녹도록 하였다. 그후, 소듐 바이카보네이트 7.4g을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 배지에 0.5N HCl를 넣어 pH 6.9로 조절하여, 2,000ml로 제조하였고, 클린 벤치에서 0.45μm 크기의 필터 멸균 유닛에 통과시켜 멸균하였다. 네 개의 멸균된 병에 450ml의 배지, 50ml의 FBS 및 5ml의 페니실린-스트렙토마이신 스톡 용액을 첨가하여 완전 둘배코 변형 이글 배지를 제조하였고; 한 개의 병에는 200ml의 멸균 배지를 첨가하여, 이를 불완전 둘배코 변형 이글 배지라 하였다. 이들 배지들을 4℃에 보관하였다.

2-2. 항원의 제조 및 주사

재조합 cAST 및 mAST를 상기에서 기재한 바와 같이 정제하였다. 0.3 ml의 cAST 및 mAST (150μg)를 각각 같은 용량의 완전 프로인트 항원보강제로 유화하여 6-8 주령 Balb/c 마우스에 복강 내 주사하여 면역화하였다. 첫 번째 주사 후 같은 양의 면역원을 불완전 프로인트 항원보강제로 유화하여 2 내지 3주 간격으로 3 내지 4회의 부스팅을 행하였다. 3회 주사 후 마우스 꼬리로부터 혈청을 얻어 항체 타이터를 테스트하였다. 마지막 부스팅은 항원보강제 없이 세포 융합 3 또는 4일 전에 행해졌다.

2-3. 융합을 위한 세포 준비

2-3-1 골수종 세포의 제조

세포 융합 4일 전에 얼린 SP2/O 세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 37℃ 수조에서 가능한 빨리 녹여 30ml의 불완전 DMEM을 녹인 세포에 가하고 상기 세포를 1500rpm에서 1분간 스핀다운하였다. 그리고 나서 불완전 DMEM을 버린 후 완전 DMEM에 현탁하여 75ml 플라스크에 옮기고 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포에 격일마다 배지를 새로 공급하였다. 세포 융합이 행해졌을 때 SP2/O 세포는 50ml 멸균 튜브에 옮기고 1500rpm 1분간 스핀 다운 후 상등액을 버리고 펠렛을 20ml의 incomplete DMEM에 현탁하였다. 매 융합실험마다 5x10⁷ 세포가 소요되었다.

2-3-2 피더 세포의 준비

피더 세포(feeder cells)는 세포 융합 하루 전에 준비하였다. 12-18 주령 마우스(스트레인 무관)를 경추 탈골 치사시켜 70% 에탄올로 세척 후, 복부의 피부를 조심스럽게 제거하였다. 얼음으로 차갑게 한 11.6%의 수크로스 용액 5ml를 복강에 주사하고 약 4ml의 주사 용액을 뽑아내어, 1500rpm에서 1분 원심분리하여 복막세포를 회수하였다. 60ml의 완전 DMEM (50X HAT 첨가됨)에 세포를 현탁시켜 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 2 방울씩 가하였다. 보통 5개의 플레이트가 소요되었다. 상기 피더셀이 적혈구에 오염된 경우에는, 새로 제조하였다. 상기 피더 세포는 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

2-3-3 췌장세포의 준비

항원이 주사된 마우스를 경추 탈골 치사시켜 70% 에탄올로 깨끗이 닦아내었다. 멸균된 가위와 겸자로 흉부의 중앙선을 따라 목까지 피부를 절개하고 췌장 바깥의 모든 지방을 제거하는 시도 후에 췌장을 10ml의 불완전 DMEM를 포함하고 있는 멸균 페트리 접시에 놓았다. 췌장을 미세한 겸자로 찢어 내어 췌장 세포를 상기 배지에 두고 상기 세포를 15ml 멸균 원심분리 튜브에 담았다.

2-3-4 세포 융합 과정

준비된 췌장 및 SP2/O 세포 현탁액을 서로 혼합하고 1500rpm 1분간 원심분리 후, 상등액을 완전히 제거하였다. 이어, 세포 펠렛을 혼합하고, 37℃에서 계속 천천히 돌려주면서 90초 동안 1ml의 50% PEG 1500을 천천히 튜브에 가하였다. 융합 과정은 37℃에서 추가로 90초 동안 진행하였다. 이어 PEG 용액을 추가 후 정확히 3분 후 완전 DMEM을 첨가함으로써 융합반응을 중지시켰다. 삼투압 쇼크를 피하기 위하여, 10ml의 완전 DMEM를 처음 1분간 서서히 첨가하였고, 총 1.5분 동안 총 30ml의 완전 DMEM을 첨가하였다. 1500rpm에서 1분 동안 원심분리로 세포를 회수하고 모든 상등액을 버린 후, 펠렛을 혼합하여 60ml의 HAT 완전 DMEM에 현탁하였다. 상기 세포 현탁액 두 방울을 피더 세포를 포함하는 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 이어 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.

세포 융합 6일 후 배양 상등액은 흡입으로 제거하고 HAT 완전 DMEM 두 방울을 각 웰에 첨가하였다. 하이브리도마 콜로니는 역상현미경에서 융합 4일 후부터 보이기 시작하는데, 상기 세포를 배지 교환한 1일 후 항체 스크리닝을 위해 사용하였다.

2-3-5 하이브리도마 콜로니 스크리닝

하이브리도마 콜로니를 스크리닝하기 위해 간접적 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. PBS 내 최종 농도가 2 μg/ml 가 되도록 항원을 희석하고 항원 희석액의 50μl를 RIA 플레이트의 웰에 가하였다. 플레이트를 점착 플라스틱으로 덮고 인규베이터에서 37℃에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 코팅용액을 버리고 웰을 PBST(PBS 내 0.3% Tween 20)로 세 번 세척하였다. 300μl의 블로킹 버퍼(500ml의 PBS 중 11.1 ml의 45% 젤라틴, 25g 수크로스 및 1ml의 10% 소디움 아자이드 용액, 5μm 필터 멤브레인으로 여과됨)를 웰당 첨가하여 코팅된 웰 내에 남아있는 단백질 결합 부위를 블로킹하였다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어 PBST로 세 번 세척하였다. 하이브리도마 세포의 배양 상등액 50μl를 PVC 플레이트의 각 웰에 첨가하여 인규베이터에서 37°C, 1시간 배양하고 상기 플레이트를 PBST로 세 번 세척하였다. HRP(horseradish peroxidase) 결합 2차 항체 50μl를 첨가하고, 희석버퍼(500ml의 PBS 중의 11.1ml의 45% 젤라틴 및 1.5ml의 Tween 20, 5μm 필터 멤브레인으로 여과됨)로 최적 농도(제조사에 따름)로 사용 전 즉시 희석하였다. 플레이트를 점착 플라스틱으로 덮고 인큐베이터 내에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 세 번 플레이트를 세척하고, TMB(3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine) 기질 50ul를 첨가하여 실온에서 15분 배양하였다. 정지 용액(0.2N sulfuric acid) 50μl를 각 웰에 첨가하고 마이크로플레이트 판독기로 OD 값을 읽었다.

상기 스크리닝 방법으로 선별된 양성 클론은 24웰 플레이트에 옮기고 1ml의 HT 완전 DMEM을 각 웰에 첨가하고 2일 후에 상기에 기재된 간접적 ELISA로 상기 클론을 스크리닝하였다. 양성 클론을 6웰 플레이트에 옮기고 조직 배양 플라스크(75cm²)에서 최종적으로 배양 후 액체 질소로 냉동되었다. 모든 양성 클론은 하기와 같이 처음에 얼린 후 녹여 클로닝하였다.

2-3-6 세포 동결

배양 플라스크(75cm²)에서 자란 세포들은 1500rpm 1분간 원심분리로 펠렛화하고 상등액을 완전히 제거하였다. 상기 세포를 1ml 동결 배지(10% DMSO와 혼합된 90% FBS)에 현탁하여 동결 바이알에 옮겼다. 상기 바이알을 NALGENE^TMCryo 1℃ 동결 용기에 넣어 초저온 냉동고(-70℃)에 2시간동안 두었다. 그리고 나서 상기 바이알을 액체질소 탱크에 보관하였다. 세포를 초저온 냉동고에 3시간 이상 두었을 때, 해동시킨 세포의 생존력이 매우 낮았다.

2-3-7 한정 희석에 의한 클로닝

성장 단계의 로그 페이스에 있는 하이브리도마 세포를 PBS로 희석하여, 뉴바우어 세포 계수기(Neubauer cell counter)를 이용하여 대략의 세포 수를 계산하고, HT 완전 DMEM으로 연속적으로 희석하여 ml 당 15개 세포수가 되도록 조절하였다. 한정 희석(limiting dilution) 하루 전에 만들어진 피더 세포 100μl를 함유하는 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 두 방울을 첨가하였다. 6일 후 각 웰의 상등액을 100μl의 HT 완전 DMEM으로 교환하였다. 다음날 하이브리도마 세포를 스크리닝하기 위해 간접적 ELISA를 행하였다. 양성 클론을 선택하여 24 웰 플레이트에 옮기고, 2일 후 상기 클론을 스크리닝하여, 한정 희석을 다시 행할 양성 클론을 선택하였다. 최종적으로, 양성 클론을 액체 질소 탱크에서 동결시겼다.

2-3-8 복수(ascites fluid)의 생산

종양을 유도하기 위하여. BALB/c 마우스에 0.5ml의 프리스태인을 주사하였다. 일 주일 후에 0.5ml의 멸균된 PBS 중의 1x10⁷ 개 세포를 마우스에 복강 내로 주사하였다. 보통, 일주일이 지나면 부풀어 오른 복부가 관찰된다. 캔 내의 메토페인으로 3분간 마우스를 마취하고, 마우스 배에 18-게이지 바늘을 삽입하여 50ml의 복수를 원심분리 튜브에 모았다. 마지막에 마우스를 경추 탈구로 치사시켰다. 상기 튜브를 실온에서 30분간 두었다가 3000rpm에서 10분간 원심분리시켰다. 상등액을 15 ml 새 튜브에 모으고 0.2% 소듐 아지드를 첨가하여 -20℃에서 보관하였다.

2-3-9 복수로부터의 단일클론 항체의 정제

단일클론항체를 정제하기 위해서, 3ml의 복수를 3,000rpm 20분간 원심분리하고 상등액을 PBS로 두 번 희석하였다. 단일클론 항체(mAbs)는 같은 용량의 포화 암모니움 설페이트를 가하여 30분간 부드럽게 저어주면서 혼합함으로써 침전시켰다. 상기 용액을 15,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 펠렛은 3ml의 PBS에 현탁시켜 PBS로 4회 투석하였고, 4시간마다 PBS를 교환하여 주었다. 컬럼을 준비하여, 단백질 G 슬러지를 컬럼(1ml 패킹 용량)에 넣은 후 5 용량의 0.1M 글리신(pH 2.6)을 사용하여 단백질 G를 세척하였다. 그 후, 상기 컬럼을 포스페이트 버퍼(50mM phosphate, 500mM NaCl, pH 6.0)로 깨끗이 세척하였다. 상기 투석된 용액을 15,000rpm으로 30분간 원심분리하여 불용성 응집체를 제거하고 상등액을 컬럼에 적용하여, 컬럼을 천천히 통과하도록 하였다. 컬럼을 동일한 포스페이트 버퍼로 깨끗이 세척하고 항체를 0.1M 글리신 (pH 2.6)으로 용출시켰다. 용출된 항체에 0.5M 소듐 포스페이트(2가)를 첨가하여 중화시켰다. 상기 항체를 PBS로 투석하였다. 단일클론 항체의 농도는 브래드포드법으로 테스트하였다.

실시예 3. 단일클론 항체의 특성 규명

실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 항체의 특성을 규명하였다. cAST와 mAST의 단일클론 히브리도마 세포주에서 수득한 단일클론 항체를 각각 HCC1-HCC10와 HCM1-HCM10으로 명명하였다. 이들 단일클론항체의 특징을 규명하기 위해서, 간접 ELISA, 항체 아이소타입 및 웨스턴블랏을 실행하였다.

결과는 표 1에 요약하였다. 10개 단일클론항체에서 cAST 단백질 테스트에 사용할 수 있는 최적의 일치쌍(optimal match pair)으로, 두개의 단일클론항체(포획 항체로서 HCC4, 검출 항체로서 HCC5)를 선택하였다. mAST 단백질에서는, HCM4(포획 항체)과 HCM8(검출 항체)이 선택되었다. 이 4개의 단일클론항체는 본 실시예의 실험을 수행하는데 사용되었다. 또한 상기 모노클로날 항체 중 HCC4 (cAST 1A2C6), HCC5 (cAST, 5C3F8)은 각각 기탁번호 KCTC 12483BP 및 12484BP 로 상기 항체 중 HCM4 (mAST, 2E6D1) 은 기탁번호 KCTC 12485BP mAST 로 2013년 9월 4일 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁되었다.

[표 1]

표 1에서 HCC는 항-cAST에 대한 항체를 나타내고, HCM은 항-mAST에 대한 항체를 나타내며, a와 b 및 c와 d는 각각 본원에 개시된 실시예의 cAST ELISA 분석에서 캡처 및 디텍터, mAST ELISA 분석에서 캡처 및 디텍터로 사용된 것을 나타낸다.

3-1. 단일클론 항체의 역가

간접적 ELISA로 정제된 항체의 역가를 테스트하였다. 절차는 상기에서 기술한 것과 같이 수행되었으며, 배양 상등액에서 얻은 최초 항체를 정제된 항체 (2μg/ml)로 교환하였다.

3-2. 단일클론 항체의 아이소타입

단일클론 항체의 아이소타입을 테스트하기 위해서, 임뮨 단일클론 항체 아이소타이핑 키트 I를 사용하여 설명서에 따라 수행하였다.

3-3. 웨스턴블랏

SDS-PAGE로 단백질을 분리하였다. 겔에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전송하기 위해 세미드라이 트랜스퍼를 이용하였다. SDS-PAGE 종결 20분 전에 4개의 필터 페이퍼와 한 개의 니트로셀룰로오스 막을 트랜스퍼 버퍼(50mM Tris, 40mM glycine, 0.04% SDS, 10% 메탄올)에 담그고, SDS-PAGE가 끝나면 겔을 니트로셀룰로오스 막에 두면, 120 mA에서 35-40분동안 니트로셀룰로오스 막으로 단백질이 트랜스퍼되었고, TBST (10mM Tris, 150mM NaCl, 0.3% Tween20)로 상기 막을 한번 헹구고 블로킹 버퍼(10mM Tris, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 5% skin milk, pH8.0)로 블랏을 1시간 동안 블로킹하였다. 블랏을 10분 간격으로 3회 TBST로 헹군 후 블랏을 실온에서 1시간 혹은 4℃에서 밤새 1차 단일클론항체 용액 (0.2μg/ml-1μg/ml)에서 배양하고, 10분 간격으로 3회 TBST로 세척하였다. 상기 블랏을 HRP-컨쥬게이트된 산양 항-마우스 IgG로 실온에서 1시간동안 처리하고, TBST로 10분 간격으로 3번 세척하였다. 상기 블랏을 화학발광시약(supersignal chemiluminescent substrate, Pierce)과 5분간 배양하고, 카세트에 트랜스퍼하여 1분간 필름 노출시켰는데, 노출 시간은 경우에 따라 달라질 수 있다. 필름을 전개 시약으로 전개하고 고정시약으로 고정하였다.

3-4. 항 cAST 및 항 mAST 항체의 특이성

인간 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 아이소엔자임은 두 개의 다른 유전자에 의해 코딩되지만 이들 두 엔자임의 아미노산 서열은 약 46% 동일성을 가진다. 그래서 항-cAST 항체는 mAST 단백질에 결합할 수 있으며 항-mAST 항체는 cAST에 결합할 수 있다. 항-cAST 및 항-mAST 항체의 교차 반응성을 시험하기 위하여 간접적 ELISA 및 웨스턴블랏을 행하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있으며, 도 2는 항-cAST와 항-mAST 항체의 교차활성 여부를 분석한 결과이다. (A) 간접 ELISA 분석 결과로, 항원, cAST 및 mAST를 각각 ELISA 플레이트에 코팅하였고, 본원에 따른 항-mAST 항체(HCM4)와 항-cAST항체(HCC4)를 1차 항체로 사용하였다: 1: cAST 코팅; 2: mAST 코팅. (B)는 웨스턴블랏 결과로, a: SDS-PAGE; b: 1차 항체 HCC4; c: 1차 항체는 HCM4를 이용한 결과이고, 각 사진에서 1열은 cAST; 2열은 mAST를 나타낸다. 교차활성이 없는 것으로 나타났다.

3-5. 펩티드 맵핑

정제된 재조합 cAST와 mAST를 프로테아제로 분해시킨 후, 웨스턴블랏을 실행했다. 30ml의 재조합 단백질 용액(0.1mg/ml, 0.45% tween20, 0.5% TritonX-100)을 1.5ml의 에펜도르프 튜브에 가하고 0.1μl의 프로테아제(QIAGEN)를 상기 용액에 가하여 피펫으로 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 10분간 배양한 다음 2x 처리 버퍼를 가하여 5분간 가열하였다. 이어, 3μl의 용액을 SDS-PAGE 웰에 로딩하였으며, 웨스턴블랏 방법은 상술한 바와 같다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. cAST에 대응하는 단일클론항체(도 3의 A)의 경우, 단일클론항체는 4개의 그룹으로 확인되었는데, HCC1, HCC2, HCC3, HCC5, HCC6, HCC7 및 HCC9가 한개의 그룹으로 간주되었다. HCC4, HCC8 및 HCC10은 각각 한개의 그룹으로 확인되었다. 따라서 HCC4와 HCC5는 서로 다른 펩타이드 조각으로 인지되는데, 이로서 HCC4 및 HCC5는 서로 다른 에피토프에 결합한다는 것을 증명할 수 있고 샌드위치 쌍으로 사용될 수 있다. mAST에 대응하는 단일클론항체의 경우 (도 3의 B), 단일클론항체는 2개의 그룹으로 확인되었는데, HCM1, HCM3, HCM4, HCM5, HCM6, HCM7, HCM9, 및 HCM10이 같은 면역 염색 패턴을 보여 하나의 그룹을 형성했다. HCM2와 HCM8은 비슷한 펩타이드 조각을 인식하여 하나의 그룹을 형성했다. 이 결과는 HCM4와 HCM8이 서로 다른 그룹에 속한다는 것을 보여주며, 하나의 샌드위치 쌍으로 결합하여 인간 혈청의 mAST를 시험할 수 있다.

실시예 4. 단일클론 항체의 cAST 및 mAST 각각에 대한 특이적 결합 확인

4-1. 단일클론항체와의 콜로이드성 골드 컨쥬게이트

0.05M 보렉스-붕산 버퍼(pH9.0)로 콜로이드성 골드 용액의 pH를 9로 조정하였다. 단일클론항체에 대한 콜로이드성 골드 용액의 최적 비율을 결정하였다. 10ml의 콜로이달 골드 용액(pH9.0)을 저어주면서 단일클론항체 용액에 혼합하고 실온에서 15분간 저어주었다. 10% BSA를 첨가하여 BSA의 최종 농도가 총 용량의 1%가 되도록 하고 15분간 계속 저어주었다. 이어 상기 용액을 4℃ 8000rpm으로 30분간 원심분리하고 상등액을 완전히 버린 후 같은 용량의 버퍼(25mM Tris-Cl, 1% BSA, 0.02% NaN₃, 0.2μm 필터로 여과됨)를 가하여 펠렛을 현탁시켰다. 상기 용액을 4℃ 9000rpm에서 30분간 원심분리하고 상등액을 모두 버린 후 같은 용량의 버퍼를 가하여 상기 기재한 과정을 반복하였다. 1ml의 버퍼를 가하여 펠렛을 현탁시켜 4℃ 냉장고에 보관하였다.

4-2. 콜로이달 골드 컨쥬게이트에 의한 재조합 cAST 및 mAST, 혈청 내 cAST 및 mAST에 각각 결합하는 mAB의 결정

50ml의 단일클론항체와의 콜로이달 골드 컨쥬게이트를 6개의 1.5ml 에펜도르프 튜브에 가하고, 50ml의 여러 농도의 재조합 cAST 용액 또는 PBS로 희석한 혈청을 상기 6개 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 태핑하여 섞어주고 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 튜브를 9000rpm 30분간 원심분리하고 상등액을 완전히 제거하였다. 상기 펠렛을 PBS로 현탁시켜 9000rpm 30분간 원심분리하였다. 상기 펠렛에 200μl의 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 기질을 첨가하여 희석하고 상기 용액을 15ml 튜브에 옮겨 37℃ 인큐베이터에서 1시간동안 배양하였다. 200μl의 발색 시약을 상기 반응 용액에 첨가하여 색을 발현시키고 실온에서 20분간 정치하였다. 이어, 2ml의 0.4N NaOH를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 자외선 분광광도계를 이용하여 OD 값을 측정하였다. 재조합 mAST 및 혈청 내 마스트 (Mast)에도 동일한 실험과정을 수행하였다.

4-3. 인간 혈청 내 AST 아이소엔자임의 활성 측정

본 연구에 사용된 혈청 샘플은 고지동의 (informed consent)하에 한림대학교 병원의 만성바이러스성 간염(CVH), 간경변(LC) 및 간암 (HCC) 환자와 정상 대조군으로부터 얻었다. 상기 혈청은 병원에서 얻은 후 -70℃에 보관하였다. 혈청 내 cAST 및 mAST의 활성을 시험하기 위해 면역침전을 수행하였다. 50μl의 단백질 G 세파로스 비드(Sigma)를 포함하는 두 개의 튜브를 10μl의 cAST 항체(1mg/ml) 또는 mAST 항체(1mg/ml)와 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거하기 위해 원심분리를 행하고 펠렛을 1X PBS로 세척한 후 다시 원심분리하였다. 위의 단계를 두 번 반복하였다. 두 개의 컨쥬게이트된 G-Ab 복합체를 4℃ 1시간 동안 밀크(1X PBS 중 5% 밀크)로 블로킹하여, 상기 단계와 동일하게 세척하였다. 두 개의 복합체를 200μl의 혈청과 함께 4℃에서 12시간동안 흔들어 주면서 배양하였다. 상기에 기재한 바와 같이, 원심분리 후 상등액을 사용하여 활성을 시험하였다.

4-4. 웨스턴블랏에 의한 혈청내 AST 아이소엔자임에 결합하는 단일클론항체의 판정

단일클론항체가 혈청 내 AST 아이소엔자임을 인지하는지 판정하기 위하여, 또한 별개로 정상인과 간 질환 환자의 혈청 샘플 내 AST 아이소엔자임의 양을 비교하기 위하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

4-5. 면역형광마이크로스코피

본 실시예에서는 cAST 단백질을 생산할 수 있는 간암세포주인 HepG2 세포주가 사용되었다. 이를 7.0% CO₂ 공급하에 페트리디쉬 내에서 10% FBS를 함유하는 완전 DMEM에서 배양하였다. 계대 배양 또는 세포의 수확을 위해 배지를 제거하고 10ml의 PBS를 가하여 세포를 세척하였다. 3ml의 0.05% 트립신-EDTA(1X, Invitrogen)를 상기 페트리 디쉬에 첨가하고 세포를 37℃ 3분간 처리한 후 대부분의 세포가 바닥에서 떨어져 나올 때까지 부드럽게 흔들어 주었다. 상기 세포를 1500 rpm에서 1분간 원심분리하여 모았다. 상등액을 완전히 버린 후 세포를 10ml 완전 DMEM에 현탁시켜 새 페트리 디쉬에 옮겼다.

멸균된 커버슬립(12mm circle1, Fisherbrand)을 24웰 조직 배양 플레이트에 올려놓았다. HepG2 세포를 상기 플레이트에 접종하여 약 70% 컨플루언시까지 배양하였다. 이어 배지를 제거한 후 세포를 PBS로 세 번(매번 5분간) 세척한 후, 실온에서 15분 동안 PBS중의 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 세포를 PBS로 세번(매회 5분간) 세척한 후 5분간 차가운 메탄올(-20℃)을 처리하였다. 블로킹 버퍼(PBS 중 3% BSA, 0.1% Triton X-100)로 세포를 블로킹하고 실온에서 1시간 두었다. 커버슬립을 PBS로 세 번 (매회 5분) 세척하였다. 1차 항체를 블로킹 버퍼로 희석하고 웰에 첨가한 후 실온에서 1.5시간 또는 4℃에서 밤새 두었다. 커버슬립을 위에 기술한 방법과 같이 세척하였다. 블로킹 버퍼로 희석된 형광물질-컨쥬게이트된 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 암소 실온에서 1시간 배양한 후 상기와 같이 세척하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 0.1ug/ml)를 웰에 가하고, 2분간 둔 후 상기와 같이 세척하였다. 커버슬립을 형광 마운팅 배지(DAKO)와 함께 슬라이드의 위에 올려놓고 암소에서 실온에서 1시간 배양하였다. 형광 분포는 형광 마이크로스코피 (Carl Zeiss, EL-Einsatz, Germany)로 분석하였다.

4-6. 웨스턴블랏에 의한 hepG2 세포 내 AST 아이소엔자임의 위치 결정

hepG2 세포는 상기와 같이 조직 배양 페트리 디쉬에서 2일 동안 배양하여 수확하였다. 200μl의 PBS를 펠렛에 첨가하고 호모지나이저로 세포막을 파괴하였다. 전체 세포 융해물은 두 부분으로 나누어 하나는 전체 융해물로 이용하고 다른 하나는 15000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액은 새 튜브에 옮기고, 펠렛을 같은 용량의 PBS로 재현탁하였다. 이 세 가지 샘플, 즉, 전체 융해물, 상등액 및 펠렛은 웨스턴블랏으로 분석하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. cAST는 세포질에서, mAST는 펠렛부분에서 발현되는 것을 알 수 있으며, 세포염색에서는 세포질에 존재하고 있었다.

실시예 5. 인간 간 조직에서의 cAST의 분포

인간 간 조직에 cAST 위치 분포를 알아보기 위하여 면역조직화학을 수행하였다. 파라핀에 침지된 인간 간 조직 슬라이드(Superbiochip co.ltd, Korea)를 구입하였다. 우선, 탈파라핀화 및 수화를 행한 후, 슬라이드를 크실렌에 집어넣은 뒤 후드 내에서 5분간 흔들어주었고, 새 크실렌에 옮겨 5분간 흔들어주었다. 슬라이드를 100%, 90%, 80% 및 70% 에탄올 내에서 각 2분씩 수화한 후 수돗물에 10분간 침지하였다. 37℃ 수조 내에서 미리 덥혀진 펩신 용액을 조직 슬라이드 위에 3분간 가하고 TBST로 다섯 번 헹궈주었다. 퍼옥시다아제-블로킹 용액을 슬라이드 위에 가하고 10분 배양 후 TBST로 다섯 번 헹궈주었다. 블로킹 혈청을 가하여 10분간 배양하고 TBST로 다섯 번 헹궈주었다. PBS로 희석된 1차 항체를 상기 슬라이드 위에 가하여 실온에서 2시간 혹은 4℃에서 밤새 배양한 후 TBST로 다섯 번 헹궈주었다. 비오틴이 컨쥬게이트된 2차 항체를 가하여 10분간 배양하고 TBST로 다섯 번 헹궈주었다. 아비딘-HRP 용액을 가하여 10분간 배양하고 TBST로 5회 헹궈주었다. DAB 용액을 가하여 30-60초 방치하고 수돗물에 담궈 반응을 중지시켰다. 상기 슬라이드를 헤마토실린에 1분간 담그고 흔들어 주면서 배양한 후 10분간 수돗물로 세척하고 HCl 용액(70% 에탄올 1L 내 1ml의 원 HCl)에 1초 담궜다 즉시 빼낸 다음, 수돗물로 10분 세척하고, 그 후 암모니아에 2분 담군 후 방치하면서 흔들어 주었다. 상기 슬라이드를 80%, 90% 및 100% 에탄올에서 각 2분간 탈수화하였다. 크실렌으로 2회 소제한 다음 2분간 흔들어주면서 배양하였다. 티슈로 과도한 크실렌을 제거하고 마운팅 배지(abcam)를 조직(tissue) 위에 놓고 커버글라스를 조직 위에 놓았다. 마지막으로, 현미경(Sony, Japan)으로 관찰하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다.

실시예 6. 혈청 내 AST 아이소엔자임 양의 결정

6-1. 단일클론항체의 바이오틴화 단일클론항체를 비오틴으로 표지하기 위해서, 10μg 의 비오틴 (EZ-Link^TMNHS- LC-LC-biotin, Pierce)과 250μg의 단일클론항체를 500μL PBS에 녹였다. 혼합물은 얼음 상에 4시간 둔 뒤 매 30분마다 볼텍싱하였다. 상기 혼합물을 4℃에서 PBS로 투석하였다.

6-2. 샌드위치 ELISA

혈청 내 cAST를 판정하기 위해서, 샌드위치 ELISA를 사용하였다. PBS로 희석한 50μl 의 단일클론항체 (2μg/ml)를 EIA 플레이트에 적용하고, 상기 플레이트를 37℃에서 2시간, 혹은 4℃에서 밤새 둔 다음, PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 버퍼를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 둔 다음 PBST로 3회 세척하였다. 50μl의 재조합 cAST 용액 또는 전체 혈청을 웰에 가하고 37℃에서 1시간 둔 다음 PBST로 3회 세척하였다. 희석 버퍼로 희석된 50μl의 비오틴-컨쥬게이트 단일클론항체 용액(2μg/ml)을 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 둔 다음 PBST로 3회 세척하였다. 50μl의 아비딘-HRP 용액을 가하고 37℃에서 1시간 둔 다음 PBST로 3회 세척하였다. 50μl의 기질인 TMB를 사용하여 색을 발현하고 15분간 둔 후 중지 용액을 같은 용량 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기(파장: 450nm)로 OD값을 측정하였다.

실시예 7. 면역분석법을 이용한 혈청의 cAST 및 mAST 의 측정

7-1. 면역분석법을 이용한 cAST 및 mAST의 표준 커브 및 성능 테스트

혈청 샘플 내의 cAST와 mAST의 양을 측정하기 위해, 샌드위치 ELISA 시스템으로 재조합 단백질 cAST 혹은 mAST의 0 내지 400μg/l의 여러 다른 농도를 지닌 교정커브를 얻었다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. 총(whole) AST 효소 활성이 10 IU/L인 건강한 정상 혈청을 PBS로 5배로 희석시켜, 기지 농도의 cAST 또는 mAST와 섞어, 교정용 표준 혈청으로 사용하였다. 교정 커브에서, 450nm에서의 OB값은 재조합 cAST 혹은 mAST 농도의 x축에 대응하는 y축에 표시되었다. 신뢰할만한 계수의 상관관계(r: 0.999 및 0.998)가 두 계수 사이에서 관찰되었고, 좋은 선형성(linearity)이 전체 측정 범위에 걸쳐 나타났다(도 7A, B). 각각 농도에서 세 독립적인 실험의 변형 계수(CVs)는 < 10% 이다. 샌드위치 ELISA 시스템의 분석 성능을 추정하기 위해 부정확 및 복구 실험을 수행하였다. cAST 분석 시스템의 경우, 일내(within-day) 및 일차(between-day) 부정확은 각각 2.54-7.15%(3개의 샘플이 사용되었고, 10번 반복해서 분석됨) 및 3.92-8.34%(3개의 샘플 및 5일간 연속적으로 분석됨)이며, 분석 복구는 93.1-101.3%였다. mAST 분석 시스템의 경우, 일내 및 일차 부정확은 각각 2.95-8.38%(3개의 샘플, 10번 반복해서 분석됨)및 6.52~9.08%(3개의 샘플 및 5일간 연속적으로 분석됨)이며, 분석 복구는 94.0-103.3%이다. 이러한 결과는 항체를 이용한 농도 또는 양의 분석이 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다는 것을 보여준다.

7-2. 간 질환 환자와 건강한 사람의 혈청 cAST 및 mAST 분석 (1)

인간의 간이 손상되면, 손상된 간 세포에서 순환되는 혈액쪽으로 cAST와 mAST가 방출될 것이다. 혈청에서 단일클론항체가 cAST와 mAST가 결합된다는 것을 증명하기 위해 웨스턴블랏을 수행하였고, 결과는 도 5에 나타내었다. 대조군으로 사용했던 건강한 혈청에는 예상 사이트에 밴드가 존재하지 않았지만, 간 환자의 혈청에서 명확한 밴드를 확인할 수 있다 (도 5A 및 B). 이 실험에서, 같은 양의 대조 혈청과 간 환자의 혈청을 분석에 사용하였다. 이러한 결과는 혈액에 존재하는 cAST 및 mAST 의 양의 측정을 통한 간질환의 진단이 가능하다는 것을 나타낸다.

7-3. 간 질환 환자와 건강한 사람의 혈청 cAST 및 mAST 분석 (2)

건강한 사람과 서로 다른 간 질환을 가진 환자들의 혈청 샘플을 모으고 난 후, 혈청 AST의 양 및 효소 활성을 샌드위치 면역분석법 및 히타치 747 자동 분석기로 각각 순차로 측정하였다. 모든 혈청 샘플은 측정하기 직전에 PBS로 5배 희석됐다. 표 2에 나타난 바와 같이, 건강한 대조군(N=25), CVH(N=24), LC(n=21), 및 HCC(N=22)의 cAST 양의 평균(SD)은 각각 40.5(38.6), 228.9(165.6), 255.3(154.8) 및 327.6(137.9)μg/l이다. 건강한 대조군 (N=25), CVH(N=24), LC(N=21) 및 HCC(N=22)의 mAST 질량 평균(SD)은 각각 10.1(6.1), 11.9(12.8), 9.7(15.9) 및 10.4(8.7)μg/l이다.

즉 건강한 검체의 cAST 양의 평균은 40.5 ± 38.6㎍/l인 반면, CVH, LC 및 HCC의 경우 각각 228.9±165.6㎍/l, 255.3±154.8㎍/l, 및 327.6±137.9㎍/l 이었다. 건강한 검체의 mAST 양의 평균은 10.1 ± 6.1㎍/l인 반면, CVH, LC 및 HCC의 경우 각각 11.9± 12.8㎍/l, 9.7 ± 15.9㎍/l, 10.4 ±8.7㎍/l이었다. 이러한 결과는 혈액에 존재하는 cAST 및 mAST 의 양의 측정을 통한 간질환의 진단이 가능하다는 것을 나타낸다.

[표 2]

^a 결과는 연속변수에 대한 평균 (표준편차)로 나타낸다.

7-3. 혈청 cAST에 대한 ROC 플롯 분석

효소 활성 측정 방법 및 본원에 따른 양을 측정하는 분석 방법의 성능을 비교하기 위해 ROC 분석을 수행하였으며, cAST 는 혈청 총 AST의 89-90%를 차지하고 있으므로 결과에 큰 영향을 미치지 않을 것이라 예상하여, cAST의 활성을 측정하였다.

결과는 표 3 및 도 8에 기재되어 있다. ROC 커브 분석 결과에 나타난 바와 같이, AUC의 통계적 분석에 의하면 모든 환자들에서 또는 서로 다른 질환을 가진 다른 환자 그룹에서, AST 효소활성과 cAST 양의 수치를 하나의 ROC 커브에서 함께 분석했을 때, 혈청 cAST의 분석에 있어, 두 종류 분석 방법에는 차이가 있는 것으로 나타났다. 두 종류 분석 방법에 대한 최적의 컷오프 값은 ROC 커브에 근거하여 결정된다. 효소 분석방법에 대한 컷오프 값은 상이한 환자 그룹에서 서로 비슷하였으며, 양에 근거한 분석에 있어 컷오프 값에서 HCC 그룹(108.8μg/l)을 제외한 모든 그룹에서 큰 변화가 없었다. 컷오프 값 결정에서, 효소 활성 및 양의 특이성이 동일할 때, 양의 민감성은 항상 효소 활성보다 높으며, 특히 HCC환자 그룹에서 민감성 및 특이성 모두 큰 차이를 보여주었다. 양분석 및 효소활성법의 민감성은 0.955와 0.864였고, 양분석 및 효소활성법의 특이성은 각각 0.96과 0.92이었다. 이러한 결과는 cAST 및/또는 mAST 양의 측정이 효소활성의 측정보다 간질환의 판별에 있어 우수하다는 것을 나타낸다.

[표 3]

표 3에서 각 수치에 대한 p 값은 <0.001이다.

실시예 8. 통계 분석

캘리브레이션 커브 방정식 및 상관계수(r)는 마이크로소프트 엑셀 프로그램을 이용하여 얻었다. ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브 분석은 Medcalc version 6.12 software program (Medcalc, Mariaekerke, Belgium)을 이용하여 수행하였다. 평균 간의 통계 차이는 스튜던트 t-테스트 및 본페로니 조정을 거치는 ANOVA를 이용하여 계산하였다. 환자와 대조군 사이의 상관관계를 평가하기 위하여, 피어슨 상관계수 및 최소 자승방법의 선형회귀를 사용하였다. P 값 <0.05 또는 <0.001이면 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다. 간 질환을 가지는 다른 환자 군을 구별하기 위한, 면역분석 및 혈청 ALT의 효소 활성 분석의 진단 정확성을 비교 평가하기 위하여 진짜 양성도(민감도) 및 거짓 양성도(1-특이도)를 플롯팅함으로써 ROC 커브를 만들어, 컷오프 값과 커브 아래의 면적(Area Under Curve, AUC)을 계산하는데 사용하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

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Claims

생물학적 시료 중 바이오마커로서 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 및 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST) 중 하나 이상 각 마커의 검출시약을 포함하는 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청인, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 검출시약은 상기 각 바이오 마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약인, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 각 바이오 마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약인, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 각 바이오마커의 정량적 또는 정성적 검출용 시약은 상기 각 바이오마커를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 수용체, 펩티도모방체(peptidomimetics), 리간드 또는 보조인자인 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 5 항에 있어서,
상기 항체는 기탁번호 KCTC 12483BP; KCTC 12484BP ; 및 KCTC 12485BP 로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 모노클로날 항체인, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 키트는 ELISA 분석용, 면역크로마토그래피 분석용, 또는 마이크로어레이 분석용, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 간 질환은 간염, 간경변 또는 간암인, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링용 키트.
대상체의 생물학적 시료로부터 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (mAST) 중 하나 이상의 바이오마커의 단백질 양 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계; 상기 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 상기 바이오마커의 단백질 양에 변화가 있거나, 또는 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간질환으로 판정하는 단계를 포함하는, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링에 필요한 정보 제공 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 각 마커의 단백질 양 또는 이의 존재여부를 검출은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이 방식으로 실시되는, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링에 필요한 정보 제공 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 간 질환은 급성 또는 만성 간염, 간경변 또는 간암, 간질환 진단, 예후 또는 모니터링에 필요한 정보 제공 방법.
세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST) 또는 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)의 항체를 제공하는 단계; 및
상기 항-cAST 또는 항-mAST 항체 중 하나 이상의 항체를 대상체의 혈액 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 혈액 시료에 존재하는, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 방법은 샌드위치 방식의 효소매개면역분석법 (ELISA)인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 항-cAST 항체는 표 1에 HCC 1 내지 10으로 기재된 어느 하나의 항체이고, 상기 항-mAST 항체는 표 1에 기재된 HCM 1 내지 HCM 10 중 어느 하나의 항체인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 항-cAST 항체는 HCC4 또는 HCC5이고, 상기 항-mAST 단일클론 항체는 HCM4 또는 HCM8인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 항체는 기탁번호 KCTC 12483BP ; KCTC 12484BP ; 또는 KCTC 12485BP 로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 항체인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 대상체의 혈액 시료가 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 방법은 급성 또는 만성 간염, 간경변 또는 간암의 진단, 예후 또는 모니터링에 사용되는 것인, cAST 또는 mAST 중 하나 이상을 정량적으로 측정하는 방법.
세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(cAST)를 특이적으로 인식하는 기탁번호 KCTC 12483BP; 또는 KCTC 12484BP로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 모노클로날 항체.
미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(mAST)를 특이적으로 인식하는 기탁번호 KCTC 12485BP로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 모노클로날 항체.