KR101487824B1 - 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 이온화에너지원 검출용 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이온화에너지원 누출 여부, 누출된 이온화에너지원의 종류 및 그 누출양을 검출 및 판정할 수 있는, 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자 또는 그의 단편 등을 포함하는 이온화에너지원 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 이온화에너지원 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
방사선 및 방사성 동위원소의 농업이용 분야에서는 일찍부터 방사선을 이용한 돌연변이 육종법으로 농작물의 품종개량이 이루어져 왔다. 뿐만 아니라 방사성 동위원소를 이용한 추적자에 의한 비료의 효과 연구, 저선량에 의한 식물에서의 생장, 생육, 성분변화의 촉진, 토양 속의 미량원소가 작물의 생육에 미치는 영향, 중금속의 식물체내 이동 축척에 대한 메커니즘, 미생물을 활용한 새로운 유용 균주의 개발연구 등 많은 분야에 활용되고 있다.
방사선에 의한 인위 돌연변이는 Muller(1927)가 초파리에 방사선을 조사하면 돌연변이율이 높아짐을 발견하면서 시작되었고, Stadler(1928)가 보리와 옥수수에서의 돌연변이 효과가 나타난다는 사실을 밝혀내며 고등식물에서의 돌연변이 연구가 본격적으로 시작되게 되었다(Stadler 1928). 방사선은 일반적으로 χ선과 γ선인 저 LET(Linear Energy Transfer)와 α선, 이온빔, 중성자선과 같은 고 LET로 구분된다(Natio et al 2005). 저 LET와 고 LET에 따라서 식물체에 미치는 영향이 달라지기 때문에 돌연변이를 유도하기 위해서는 맞는 선량과 방법을 선택해야 한다. 방사선에 의해 조사된 식물체는 DNA의 염기 또는 당에 영향을 주거나 DNA와 DNA 또는 DNA와 단백질간의 연결 관계에도 영향을 미치며, DNA 배열의 변화로 결실 또는 삽입 등이 일어나 변이를 유도하는데, 변이의 90% 정도가 결실에 의한 것으로 알려져 있다(Belli et al. 2002; Roldan-Arjona and Ariza 2009). 인위적으로 물리적 돌연변이원 처리에 의해 돌연변이를 유도하는 방법으로는 γ선, X선, 중성자, 양성자 및 자외선 등과 같은 외부 조사용 방사선을 이용하는 것과 방사성 동위원소를 식물체에 흡수시켜 세포 또는 조직 내부에 작용시켜 유전적 변이를 일으키는 내부 방사선 조사 방법이 있다. 그리고 방사선 조사방법에 따라 다선량을 단기간에 조사하는 경우의 급조사(Acute)와 저선량으로 장기간에 걸쳐 조사하는 완조사(Chronic)로 구분한다.
이온화에너지(ionizing Radiation)는 일반적으로 저선량에서는 식물의 생장과 발달에 효과가 있지만 중간 선량부터 식물의 생장에 점차적으로 해를 끼치기 시작하고 고선량에서는 생장 능력과 번식 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 선량에 따른 효과의 차이는 식물마다 차이가 있으며, 종과 나이, 식물 형태와 생리 등에 따라 달라진다(Kovalchuk et al. 2004). 다양한 이온화에너지 중에서 감마선은 가장 일반적으로 사용되는 돌연변이원이며 조사 선량에 따라 차이가 있지만 DNA 염기부분에 random deletion과 표현형에 치명적인 손상을 주는 것으로 알려져 있다. 고 선량의 감마선 조사는 단백질 합성, 호르몬 균형, 잎의 가스 교환과 효소 활성 등을 방해한다. 이온빔은 고 LET로써 높은 돌연변이율을 보이며 다른 돌연변이원보다 damage를 적게 주지만 폭넓은 mutation spectrum을 보여서 선호하는 돌연변이원으로 각광 받고 있다. 우주선은 강한 우주 방사선, 미세 중력, 우주 자기장, 초강력 진공과 같은 다양한 요인들이 상호작용하여 독특한 환경을 만든다. 우주선은 유전자의 발현을 변화시키고 돌연변이율을 증가시키며 염색체 이상, 비정상적인 발달과 같은 다양한 생물학적 영향을 끼치는 것으로 보고되어지고 있다.
마이크로어레이 분석은 게놈 연구의 결과로 만들어진 주요 기술로써 원하는 유전자 선발에 폭넓게 사용되고 있다. 마이크로어레이 기술은 유리판 위에 집적되어 있는 모든 유전자를 대상으로 하여 유전자 활동차이를 한 번의 실험으로 조사할 수 있는 대용량 유전자 활동 분석 시스템이다. 특히 Affymetrix GenChip은 oligonucleotide를 유리판에 직접 합성하는 형태로 해당 유전자 probe들을 고밀도로 집적해 놓은 방법으로 일종의 생화학적 반도체 칩이라 할 수 있다.
벼는 우리나라는 물론 전 세계 인구의 반 이상이 주식으로 하는 중요한 식량 작물이다. 벼는 n=12 염색체인 이배체 식물로 게놈의 크기가 280-430mb 로 비교적 작아 유전체 연구에 용이하다(Arumuganathan and Earle 1991). 또한 유전체의 구성이 다른 작물과 높은 상동성을 보이며, 염색체 상의 유전자 배열이 유사하여 단자엽 식물의 모델로 많은 연구에 이용되고 있다(Agrqwal and Rakwal 2006; Jwa et al. 2006; Kim et al. 2004).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식물 유전체 발현에 대한 생물정보학과 생명공학 기술을 이용하여, 이온화에너지원의 누출 여부, 누출된 이온화에너지원의 종류 및 그 누출양을 정확하고 빠르게 탐지할 수 있는 유전자 키트 또는 유전자 칩의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 이온화에너지원에 따라 그 발현이 특이적으로 변화하는 단자엽 식물군 유전자를 성공적으로 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 이온화에너지원에 따른 단자엽 모델식물 특이반응 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 이온화에너지원 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자를 사용하여, 이온화에너지원 누출 여부, 누출된 이온화에너지원의 종류 및 그 누출양을 정확하게 판정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 (i) 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, 또는 (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적이거나 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열로부터 선택되는 적어도 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
여기서, 상기 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자란 DNA-결합 단백질WRKY(DNA-binding WRKY), 징크핑거 RanBP2-형 단백질(Zinc finger, RanBP2-type), 글리코시드 가수분해효소 18족 촉매 도메인(Glycoside hydrolase, family 18, catalytic domain), 알라닌 탈수소효소/PNT C-말단(Alanine dehydrogenase/PNT, C-terminal), 옥소글루타레이트/철-의존성 옥시게나제(Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase), 세린-트레오닌/타이로신-단백질 키나아제(Serine-threonine/tyrosine-protein kinase), Hly-III 연관 단백질(Hly-III related), 플라스토시아닌-유사 단백질(Plastocyanin-like), 엑소스토신-유사 단백질(Exostosin-like), ThiJ/PfpI 단백질(ThiJ/PfpI), 펩티다제 C1A 파파인 C-말단(Peptidase C1A, papain C-terminal), 유비퀴틴(Ubiquitin), 글루타민 신테타제 촉매 도메인(Glutamine synthetase, catalytic domain), 햄 페록시다제(Haem peroxidase, plant/fungal/bacterial), 알루미늄 내성 말레이트 운반 단백질(Malate transporter, aliminium tolerance), ABC 트랜스포터-유사 단백질(ABC transporter-like), 키네신 모터 도메인(Kinesin, motor domain) 및 사이클릭 뉴클레오타이드-결합 단백질(Cyclic nucleotide-binding)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자이거나, 또는 진뱅크 접근번호(GenBank Accession Number) BT084636, AK069960, AK067654, AK102058, Os01g0100300, AK361773, AK109672, AK063677, AK058809, AK071631, AK060453, AK104386, AK070393, EU957122, AK108547, AK062765, AK287607, AY518317, AK287608, AK068267, AK058750, AK103501, AK107431, AK121050, AK071010, AK064583, AK119632, AK111637, AK334279, AK120618, AK071882, AK099586, AK099560, AK059414, AK110747, EU963629, AF403129, AK062280, AK105697, AK105697, AK120907, AK106810, AK065384, CT835499, AK065589, AK109732, AK242481, AK059965, AK068090, AK059965, AK065615, AK066134, AK109732, AK066570, AK104313, AK071383, AK065466, AK252948, AK071531, AK121834, AK103839, AK070485, AK101230, AK067581, AK065414, AK099499, AK099499, BT083668, AK065018, AK242194, AK069955, AK104082, AK104429, AK119786, CT835895, AK099977, AK099977, AK067134, AK065011, AK100196, CT835895, AK070878, AK068323, AK071199, AK243460, AK070706, AK073998, AK065011, AK242370, AK073119, AK361653, CT836008, AK071366, AK100243, AK107854, AK111712, AK100248, AK068035, AK098993, AK111990, AK287495, AK071882, AK065697, AK105511, AK071882, AK120720, 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AK071383, AK065945, AK107633, AK107633, L27209, AK105378, AK062460, AK241230, AK059759, AK062832, AK242220 및 AK242220로 구성되는 군으로부터 선택되는 것에 의하여 표시되는 유전자인 것을 특징으로 한다.
상기 유전자들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 비롯한 사이트는 http:/www.gramene.org나 http://rapdb.dna.affrc.go.jp 모두에서 검색이 가능하다.
이온화에너지는 다른 스트레스와 마찬가지로 그 종류 및 정도(선량)에 따라 식물 유전체 발현에 있어 다양한 영향을 미치며 식물체의 유전자는 복잡한 네트워크를 형성하며 특이적으로 발현하게 된다. 위에서 인코딩하고 있는 단백질 명칭과 진뱅크 접근번호(GenBank Accession Number)로 특정한 상기 유전자들은 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지의 종류 및 선량에 특이적으로 반응하여 그 발현양이 유의적으로 변화하는 단자엽 모델 식물군의 이온화에너지원 특이반응 유전자들로서, 이들의 발현양을 이용하면 이온화에너지의 누출여부, 누출된 이온화에너지의 종류 및 그 누출양을 정확하게 탐지할 수 있다.
따라서, 본원발명의 이온화에너지원 검출용 조성물은 상기 이온화에너지원 특이적 유전자의 발현을 검출할 수 있는 제제, 즉 (i) 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, 또는 (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적이거나 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 이온화에너지원은 감마선, 이온빔 또는 우주선으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드의 단편은 20 내지 100 mer 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 바람직하게는 60 mer 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드의 단편은 서열목록 제1서열 내지 제464서열로부터 선택되는 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다. 여기서, 서열목록 제1서열 내지 제464서열은 본원발명의 이온화에너지원 특이적 유전자에 대하여, 실시예에서 60 mer 크기의 단편으로 직접 제작한 총 464개에 달하는 60 mer 올리고뉴클레오타이드 서열을 그 순서에 따라 서열목록 제1서열 내지 제464서열로 명명한 것이다.
본원발명의 다른 관점은 상기 이온화에너지원 검출용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 이온화에너지원 검출용 키트는 이온화에너지원에 따른 특이 반응 유전자나 그의 단편 또는 그의 상보적이거나 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열과, 이온화에너지원 피폭이 의심되는 대상체 식물로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 이온화에너지 피폭 여부, 즉 이온화에너지가 누출되었는지 여부를 판정하는 원리를 이용한다. 상기 이온화에너지원에 따른 특이반응 유전자 등과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅 등을 이용할 수 있다. 즉 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상체 시료로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 써던블로팅(Southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blooting) 등으로 이를 검출함으로써 대상체에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 또는 저발현된 상태인지 조사하면 상기 대상체가 이온화에너지에 피폭되었는지 여부뿐만 아니라, 피폭된 이온화에너지원의 종류 및 그 피폭양까지 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 한다. 상기 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화되어 있다. 본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA 또는 RNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 이온화에너지원 검출용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 이온화에너지원 검출용 키트는 유전자 증폭 키트이다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 개시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 또 다른 관점은 이온화에너지원 피폭이 의심되는 단자엽 식물로부터 뉴클레오타이드 시료를 취득하는 단계; 및 상기 시료를 상술한 이온화에너지원 검출용 키트에 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 이온화에너지원 피폭이 의심되는 단자엽 식물로부터 상기 이온화에너지원 특이적 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및 상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 대조군 식물에서의 발현양과 비교하는 단계를 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 이온화에너지원 누출 여부 및 누출양을 함께 판정할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이온화에너지원 누출 여부 판정 방법에서, 시험 대상체인 단자엽식물은 이온화에너지가 누출된 것으로 의심되는 지역에서 자라고 있는 것 중에서 이온화에너지원에 피폭된 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개체를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이온화에너지원 검출용 조성물 및 키트는, 생육 중인 단자엽 식물군의 이온화에너지원 특이적 유전자의 발현양의 비교를 통해, 이온화에너지에의 피폭여부, 피폭된 이온화에너지의 종류와 양을 판정하는데 활용할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 키트는 후쿠시마 원전 사고 등과 같은 방사성 물질 누출 지역, 간접적 안전성 검지를 위한 원전 및 방폐장 주변 단자엽 식물의 유전체 영향 검지에 간접적 활용이 가능하고, 이온화 에너지 반응 식물 유전체 연구에 직접적 활용이 가능한 특성을 갖는다.
도 1은 마이크로어레이 수행방법을 도시한 것이다.
도 2는 464개의 이온화에너지원 특이반응 유전자 발현과 각각의 이온화에너지원(감마선, 이온빔, 우주선)과 상관관계를 나타낸 히트 맵이다.
도 3은 본 발명의 전체적인 연구흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 464개의 이온화에너지원 특이반응 유전자 발현과 각각의 이온화에너지원(감마선, 이온빔, 우주선)과 상관관계를 나타낸 히트 맵이다.
도 3은 본 발명의 전체적인 연구흐름도를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 식물 준비
본 발명은 일품벼(Oryza sativa L. cv. Il-pum-byeo)를 대조군으로 하고, 이온빔 조사는 일본 다카시키 연구소 이온빔 조사시설을 사용하여 이온빔 40Gy(IB)를 조사하여 사용하였고, 우주선은 중국의(CR) 무인우주선인 “Shijian-8"에서 15일 동안 우주 환경에 노출된 벼 종자를 사용하였으며 감마선은 한국 원자력 첨단방사선 연구소의 저준위 감마선 조사시설에서 감마선 200Gy(GA, 60C)를 벼 종자에 조사한 후 실험에 사용하였다. 마이크로어레이 분석을 위해 조사된 벼 종자는 표면 살균 후 1/2MS 배지에 치상하고 2주 동안 무균 배양하였다.
2. 마이크로어레이
2주 동안 무균 배양한 식물체에서 RNA를 추출하여 마이크로어레이 분석을 위한 시료로 사용하였다. 마이크로어레이는 Affymetrix GeneChip Rice Genome Array를 사용하여 도 1에 표시된 것과 같은 순서의 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 구체적으로 마이크로어레이를 세척한 후, Genechip 어레이 스캐너 3000 7G (Affymetrix)를 사용하여 스캔하여 이미지를 생성시키고, Affymetrix Command Console 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 발현 데이터를 추출하고, 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 두 그룹 간에 다르게 발현하는 유전자를 결정하기 위하여 MASS 발현 값에 대하여 짝지은 t-테스트를 수행하고 p-값이 0.05 미만인 유전자를 추출하였다. 각 비교에서 MASS 탐지 콜이 50% 이상 프레즌트 콜로 판정된 프로브만을 이용하였다.
마이크로어레이 분석 결과, 대조구에 비해 각각의 세 가지 이온화에너지원(감마선, 이온빔, 우주선)에서 2배 이상 fold change가 높은 DEG(differentially expressed gene)들을 1차로 선발하였는데, 발현양이 통계적으로 유의성있게 변화하는 유전자의 개수는 약 2,300여개를 상회하였다. 이를 기초로 리스트를 작성한 후 GeneChip probe를 제작하였으며, 제작된 GeneChip probe를 가지고 이온화에너지원에서 특이 반응하는 유전자들의 발현을 재검정하였다. 여기에서는 1차 선발과 같이 대조구와 비교해서 1.5배 이상 fold change를 보이는 DEG들을 2차로 선발하여 최종 464개의 이온화에너지 특이반응 유전자를 선별해 내기에 이르렀다.
3. 히트 맵 작성 및 이온화에너지 특이반응 유전자 GeneChip의 제작을 위한 60 mer 올리고뉴클레오타이드의 제작
마이크로어레이를 통하여 밝혀낸 최종 464개의 이온화에너지원 특이반응 유전자 발현과 각각의 이온화에너지원(감마선, 이온빔, 우주선)과 상관관계를 바르게 산정하기 위하여, 통계적 소프트웨어 라이브러리(http://www.r-project.org) 기능을 사용하여 히트 맵(heat map)을 작성하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, 최종적으로 밝혀낸 464개의 이온화에너지원 특이반응 유전자를 검출할 수 있는 프로브로서, 각각의 유전자의 60 mer 올리고뉴클레오타이드를 잉크젯 프린팅 기법을 사용하여 제조하였으며, 이렇게 제조한 60 mer 단편을 이용하여 이온화에너지 검출용 유전자 GeneChip을 제작하였다.
4. 실험결과
마이크로어레이 분석결과 얻어진 총 464개의 이온화에너지 특이반응 유전자 및 이로부터 제작한 60 mer 올리고뉴클레오타이드의 구체적인 서열은 하기의 표에 기재된 바와 같다. 하기의 표에서, 각각의 유전자 명칭이 의미하는 바는 다음과 같다.
OsIRCU: IR common Up gene(3종 이온화에너지원 모두에 대해 상향조절됨),
OsIRCD: IR common Down gene(3종 이온화에너지원 모두에 대해 하향조절됨),
OsGAU: Only GA Up gene(감마선에 대해서만 상향조절됨),
OsGAD: Only GA Down gene(감마선에 대해서만 하향조절됨),
OsIBU: Only IB Up gene(이온빔에 대해서만 상향조절됨),
OsIBD: Only IB Down gene(이온빔에 대해서만 하향조절됨),
OsCRU: Only CR Up gene(우주선에 대해서만 상향조절됨),
OsCRD: Only CR Down gene(우주선에 대해서만 하향조절됨),
OsGAIBU: GA and IB Up gene(감마선 및 이온빔에 대하여 상향조절됨)
OsGAIBD: GA and IB Down gene(감마선 및 이온빔에 대하여 하향조절됨)
OsGACRU: GA and CR Up gene(감마선 및 우주선에 대하여 상향조절됨)
OsGACRD: GA and CR Down gene(감마선 및 우주선에 대하여 하향조절됨)
OsIBCRU: IB and CR Up gene(이온빔 및 우주선에 대하여 상향조절됨).
OsIBCRD: IB and CR Down gene(이온빔 및 우주선에 대하여 하향조절됨).
예컨대, OsCRD001은 오직 우주선에 대해서만 반응하여, 그 발현이 통계적으로 유의하게 하향조절된 유전자 1번을 의미하며, 하기 표에서 IB -0.5, GA -0.34, CR -1.95라는 숫자는 각 이온화에너지원에 노출된 실험군이 대조군과 비교하여 유전자의 발현 정도가 대조군의 -0.5배, -0.34배 및 -1.95배였다는 것을 나타낸다.
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상기 표에 기재된 유전자들의 60 mer 단편, 즉 OsCRD001로부터 시작하여 OsIRCU0011까지 이르는 총 464개의 60 mer 올리고뉴클레오타이드 서열을, 순서대로 서열목록 제1서열 내지 제464서열로 명명하고 그 서열목록을 전자파일로 첨부하였다.
<110> Korea Atomic Energy Research Institute
<120> Composition or Kit for Detecting Ionizing Energy Comprising Differentially Expressed Gene Corresponding to Ionizing Radiation or Fragment thereof
<130> lD120912001
<160> 464
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- 서열목록 제34서열, 제41서열, 제67서열, 제78 내지 89서열, 제94서열, 제100서열, 제113서열, 제178서열, 제179서열, 제202 내지 213서열, 제220서열, 제221서열, 제223서열, 제245 내지 247서열, 제429 내지 437서열, 제440서열, 제450서열, 제454 내지 459서열 및 제461 내지 464서열의 60 mer 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 키트.
- 제6항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트인 것인 이온화에너지원 검출용 키트.
- 제6항의 키트를 사용하여 이온화에너지원 피폭이 의심되는 단자엽 식물로부터 이온화에너지원 특이적 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및
상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 동일한 단자엽 식물에서의 발현양과 비교하는 단계를 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법,
(여기서, 상기 이온화에너지원 특이적 유전자란
DNA-결합 단백질WRKY(DNA-binding WRKY), 징크핑거 RanBP2-형 단백질(Zinc finger, RanBP2-type), 글리코시드 가수분해효소 18족 촉매 도메인(Glycoside hydrolase, family 18, catalytic domain), 알라닌 탈수소효소/PNT C-말단(Alanine dehydrogenase/PNT, C-terminal), 옥소글루타레이트/철-의존성 옥시게나제(Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase), 세린-트레오닌/타이로신-단백질 키나아제(Serine-threonine/tyrosine-protein kinase), Hly-III 연관 단백질(Hly-III related), 플라스토시아닌-유사 단백질(Plastocyanin-like), 엑소스토신-유사 단백질(Exostosin-like), ThiJ/PfpI 단백질(ThiJ/PfpI), 펩티다제 C1A 파파인 C-말단(Peptidase C1A, papain C-terminal), 유비퀴틴(Ubiquitin), 글루타민 신테타제 촉매 도메인(Glutamine synthetase, catalytic domain), 햄 페록시다제(Haem peroxidase, plant/fungal/bacterial), 알루미늄 내성 말레이트 운반 단백질(Malate transporter, aliminium tolerance), ABC 트랜스포터-유사 단백질(ABC transporter-like), 키네신 모터 도메인(Kinesin, motor domain) 및 사이클릭 뉴클레오타이드-결합 단백질(Cyclic nucleotide-binding)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자이거나, 또는
진뱅크 접근번호(GenBank Accession Number) BT084636, AK069960, AK067654, AK102058, Os01g0100300, AK361773, AK109672, AK063677, AK058809, AK071631, AK060453, AK104386, AK070393, EU957122, AK108547, AK062765, AK287607, AY518317, AK287608, AK068267, AK058750, AK103501, AK107431, AK121050, AK071010, AK064583, AK119632, AK111637, AK334279, AK120618, AK071882, AK099586, AK099560, AK059414, AK110747, EU963629, AF403129, AK062280, AK105697, AK105697, AK120907, AK106810, AK065384, CT835499, AK065589, AK109732, AK242481, AK059965, AK068090, AK059965, AK065615, AK066134, AK109732, AK066570, AK104313, AK071383, AK065466, AK252948, AK071531, AK121834, AK103839, AK070485, AK101230, AK067581, AK065414, AK099499, AK099499, BT083668, AK065018, AK242194, AK069955, AK104082, AK104429, AK119786, CT835895, AK099977, AK099977, AK067134, AK065011, AK100196, CT835895, AK070878, AK068323, AK071199, AK243460, AK070706, AK073998, AK065011, AK242370, AK073119, AK361653, CT836008, AK071366, AK100243, AK107854, AK111712, AK100248, AK068035, AK098993, AK111990, AK287495, AK071882, AK065697, AK105511, AK071882, AK120720, AK065177, CT835416, AK108444, AK109390, AK063973, AK068597, AK063712, CT835416, AK287991, AK241976, AK062287, AK288034, AK106274, AK105789, AK241935, AK240784, AK100412, AK288034, AK107849, AK102322, AK099108, AK066834, AK104053, AK374593, AK110783, AK288124, AK111974, AK243288, AK067694, AK288124, CT835247, AK110810, AK072113, AK065026, AK062447, AK066260, AK105902, AK071118, AK062298, BT068927, AK072113, AK105810, AK107775, AK072113, AK064292, Os02g075465, AK120132, AK071274, AK242242, AK062298, AK068727, AK064764, AK110633, Os05g037420, AK105810, CT835015, AK240902, AK058853, AK069082, AK070135, AK072692, AK059872, AK063475, AK119494, AK356501, AK241644, AK064292, X05662, X05662, AK064478, AK242298, AK059618, AK243623, AK059338, EU972110, AK248985, AK063672, AK121863, AK064707, AK059781, AY466109, AK061298, AK108983, AK107671, AK070416, AK105201, AK106424, AK107865, AK063151, AB297928, AK100910, AK119689, AK063729, AK073466, AK104981, AK243280, AK070469, AK108499, AK071055, AK360624, AK243280, AK062428, AK065631, AK243276, AK120042, AK242268, AY647254, AK107674, AK111073, AK108797, AK062579, AK060061, AK062579, AK108824, AK062579, AK106319, AK110796, AK107988, CT835470, AK101049, AK243106, AK106563, AK110545, AK101081, AY647254, AK105205, AK107988, AK121870, AK064552, CT828063, AK121719, AK105205, AK071372, AK248720, AK104741, AK060110, AK099507, AF099376, BT054858, CT836047, AK243500, AK058439, AK119367, AK061288, AK071260, AK061204, AK099021, AK101440, AK062579, AK063270, AK062840, AK112086, AK102027, CT835966, AK061288, AK071260, EU945787, AK073088, AK070948, AK069728, AK070981, CT836220, AK105293, AK100163, AK241652, AK119824, AK063136, AK062617, AK099964, AK242508, AK073398, AK071470, AK109943, AK243653, AK103618, AK241239, AK062840, AK102139, AK063869, AK102139, AK063869, AK358826, AK063682, AK063270, AK100272, AK287981, AK072692, AK099659, AK241570, AK287981, AK099659, AK107839, AK070682, AK099659, AK120677, AK072789, AK105709, AK062109, AK065615, AK072914, AK360937, AK119434, CT836467, AK059179, AK287508, AK068061, AK062109, AK063491, BT084282, AK120191, AK068042, BT084282, AK065544, AK066643, AK070682, AF014469, AK062814, AK241359, AK066552, AK287981, AK242473, CT836192, AK065938, AK062109, AK059205, AK241587, AK071531, AK241407, AK069515, AK066894, AK243431, AK243560, AK107174, AK063698, AK102146, AK073133, AK069582, AK110974, AK063251, AK119500, AK318524, AK067744, AK063900, AK121967, AK072958, AK061280, AK070056, AK061280, AK366630, CT836407, AK063251, AK110449, AK360624, AK063683, AK111414, AK060486, AK106068, AK240898, AK071408, AK111765, AK100124, AK062477, AK242231, AK106990, AK061042, AK099339, AK104020, AK105798, AK241202, AK108718, FP098799, CT837962, AK241770, AK111440, AK105239, AK110892, AK249370, AK105578, AK105578, AK108716, AK110925, Os03g032290, AK243650, AK062984, AK105222, AK067543, AK288017, AK062280, AK358545, DQ244334, AK108198, AK108007, AK071383, Z34270, AK108425, AK071383, AK065945, AK107633, AK107633, L27209, AK105378, AK062460, AK241230, AK059759, AK062832, AK242220 및 AK242220로 구성되는 군으로부터 선택되는 것에 의하여 표시되는 유전자이다).
- 제8항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것인 방법.
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