KR101462291B1 - 항 ｆｇｆ23 항체 및 그것을 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FGF23에 대한 항체 및 상기 항체를 이용하여 FGF23의 작용을 억제함으로써 예방 또는 치료가 가능한 질환의 예방 또는 치료제 등의 의약 조성물을 제공한다. 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)으로부터 생산되는 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.

항 FGF23 항체, 항 FGF23 항체를 포함하는 의약 조성물, 인간 FGF23에 대한 항체

Description

항 ＦＧＦ23 항체 및 그것을 포함하는 의약 조성물 {ANTI-FGF23 ANTIBODY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 FGF23 항원에 특이적으로 결합하는 항 FGF23 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항 FGF23 항체를 유효 성분으로 하는, FGF23 과잉 생산 또는 다른 원인에서 기인하는 미네랄 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 저인혈증성 구루병ㆍ골연화증 치료제에 관한 것이다.

섬유아세포 증식 인자(Fibroblast growth factor)는 최초로 섬유아세포주 NIH3T3의 증식을 자극하는 물질로서 소의 하수체로부터 정제되었다. 이후, 다양한 조직으로부터 유사한 단백질이 동정되었고, 이들 일군의 물질은 폴리펩티드 패밀리(FGF 패밀리)를 형성하고 있다. 현재까지는, FGF 패밀리에 속하는 것으로서 척추 동물에 있어서 22종의 단백질이 동정되어 있다. 이들 단백질의 생물 활성으로서는, 섬유아세포 증식 활성뿐 아니라 중배엽나 신경외배엽의 증식이나 혈관 신생 작용, 발생 단계에서의 지아(limb bud) 형성 등 다방면에 걸친 작용이 알려져 있다. FGF는 그 유전자의 발현 부위, 발현 시기에 대해서도 다양하고, 발생 단계나 성인에 있어서의 특정 부위에서만 발현된다고 알려진 것도 많다. FGF의 수용체를 코딩하는 유전자로서는 FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4의 적어도 4종이 알려져 있고, 또한 FGFR1, FGFR2, FGFR3에 있어서는 스플라이싱(splicing)의 차이에 의해 세포외 도메인이 다른 수용체 단백질이 각각 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, 헤파린이나 헤파란 황산프로테오글리칸이 FGF나 FGF 수용체와 상호 작용함으로써 작용을 조절하는 것이 알려져 있다. 또한, 구조적 유사성으로 인해 FGF 패밀리에 속하지만, 그의 생물 활성이나 수용체 결합성 등에 대하여 거의 해명되지 않은 것도 많다. 이러한 FGF 패밀리의 특징에 대해서는, 총설로서 통합되어 있다(비특허 문헌 1을 참조).

FGF23(일반적으로 FGF-23으로 표시되는 경우도 있음)은 FGF15와의 상동성을 이용한 데이터 베이스 검색과 PCR법에 의해 최초로 마우스로부터 클로닝되고, 또한 마우스 FGF23의 서열 상동성을 이용하여 인간 FGF23이 클로닝된 단백질이고, 인간의 FGF23은 251 아미노산 잔기의 폴리펩티드로 이루어진다. 또한, 분비 시그널 서열로서 24번째까지의 아미노 말단측 서열이 분비시에 절단되는 것이 예상된다(비특허 문헌 2를 참조). 계속해서 상염색체 우성 저인혈증성 구루병ㆍ골연화증(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalachia: 이하 ADHR이라 함)의 연구에 있어서, ADHR 환자에 있어서의 변이 유전자 영역을 좁히고, 책임 유전자의 동정을 진행시키는 중에, ADHR 환자의 FGF23 유전자에 미스센스 변이가 특징적으로 발견되었다(비특허 문헌 3을 참조). 이 발견에 의해 생체 내에서의 FGF23의 생리적 중요성이 강하게 시사되었다. 한편, FGF23의 생물 활성을 결정지은 것은 저인혈증성 구루병, 골연화증의 하나인 종양성 골연화증의 연구였다. 이 질환에서는, 질환의 책임 종양이 액성 질환 야기 인자를 분비 생산하고, 이 질환 야기 인자의 작용에 의해 저인혈증, 골연화증 등의 병태에 빠지는 것으로 생각되었다.

이 책임 종양이 생산하는 질환 야기 인자의 탐색 결과, 종양에 고발현되는 유전자로서 FGF23이 클로닝되고, 또한 이 인자를 투여함으로써 저인혈증이나 골연화증이 재현되는 것이 개시되었다(비특허 문헌 4 및 특허 문헌 1을 참조). 이 연구에 의해, FGF23이 생체 내의 인이나 칼슘에 관련되는 대사 조절에 관한 것이 개시되고, 생체 내를 순환하여 작용을 발현하는 전신성 인자로서 작용하는 것이 시사되었다. 또한 그 후의 연구에 있어서, 실제로 종양성 골연화증 환자혈 중의 FGF23 농도가 정상인에 비해 높은 값인 것도 개시되었다(비특허 문헌 5 및 6을 참조).

또한, ADHR이나 종양성 골연화증과 임상적 소견에 있어서 유사한 형태를 나타내는 질환으로서 X 염색체 연쇄 저인혈증성 구루병(X-linked hypophosphatemic rickets, 이하 XLH이라 함)이 알려져 있지만, 이 병태에 있어서도 혈 중의 FGF23 농도는 높은 값이 된 것이 개시되었다(비특허 문헌 5 및 6을 참조).

즉, 지금까지 원인 불명이었던 종양성 골연화증, XLH 등에서 관찰되는 비타민 D 저항성 구루병ㆍ골연화증의 분비성 질환 원인 인자가 FGF23이라는 것이 개시되었다. 또한, 섬유 형성 이상(fibrous dysplasia), 맥쿤-알브라이트 증후군(McCune-Albright syndrome), 상염색체 열성 저인혈증성 구루병 등 다른 미네랄 대사성 질환에 있어서도 혈 중의 FGF23 농도의 높은 값과 저인혈증이나 구루병ㆍ골연화증과의 관계가 보고되어 있다(비특허 문헌 7 내지 9를 참조).

이상의 보고에 의해, 생체 내의 FGF23 과잉 상태는 저인혈증이나 그에 따른 구루병ㆍ골연화증 등을 유도하는 것이 개시되었다. 또한 만성 신부전 고인혈증에 있어서도 혈청 FGF23의 이상적으로 높은 값이 보고되어 있고, 과잉의 FGF23이 신부전시의 미네랄 대사성 질환 등의 일부에 관련되어 있을 가능성도 시사되어 있다(비특허 문헌 10 및 11을 참조).

이들 FGF23의 과잉이 원인이 되어 유도되는 질환에 있어서, FGF23 작용의 억제 또는 FGF23의 제거가 질환의 치료 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다. 지금까지 FGF23의 작용을 억제하는 것으로서, 항 FGF23 마우스 모노클로날 항체가 보고되어 있다(특허 문헌 2를 참조). 이 보고에서 사용되고 있는 항 FGF23 마우스 모노클로날 항체 2C3B 및 3C1E는 정상 마우스에 투여하면 내재성 마우스 FGF23의 기능이 저해되고, 신장으로부터의 인 배설이 억제되며, 신장에서의 비타민 D 대사 효소의 발현이 변동됨으로써, 결과적으로 혈청 중의 인 농도 및 1α,25-디히드록시비타민 D(이하 1,25D라 함) 농도를 상승시키는 것이 개시되어 있다. 또한, 혈청 중의 FGF23 농도가 높은 값이고, 또한 저인혈증과 뼈의 신장 장해나 석회화 장해를 나타내는 XLH의 모델 마우스인 Hyp 마우스에의 항 FGF23 마우스 모노클로날 항체의 반복 투여를 행한 결과, Hyp 마우스에 있어서 혈 중 인 농도의 상승이 확인되면서, 뼈의 신장 장해와 석회화 장해가 개선되었다. 이 결과로부터, FGF23 과잉 질환에 대한 약제로서 FGF23 작용 억제 항체의 사용이 적절하다고 생각되었다. 그러나, 이 보고에서 사용된 2C3B나 3C1E 항체는 마우스 유래의 항체이다. 인간 숙주에 의해 외래물로서 인식되는 마우스 항체는 이른바 「인간 항마우스 항체」, 즉, 「HAMA」 응답을 야기하여 심한 부작용을 나타내는 경우가 있다(비특허 문헌 12를 참 조).

이러한 문제를 회피하기 위한 접근법 중 하나로서 키메라 항체가 개발되었다(특허 문헌 3 및 4를 참조). 키메라 항체는 2개 또는 그 이상의 종 유래 항체의 일부(마우스 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 정상 영역 등)를 포함한다. 이러한 키메라 항체의 이점은 원래 마우스 항체의 성질인 항원에의 결합성 등의 특징은 유지하지만, 한편으로 여전히 「인간 항 키메라 항체」, 즉, 「HACA」 응답을 야기한다는 것이다(비특허 문헌 13을 참조).

또한, 치환된 항체의 일부만이 상보성 결정 영역(즉, 「CDR」)인 재조합 항체가 개발되었다(특허 문헌 5 및 6을 참조). CDR 이식 기술을 사용하여 마우스 CDR, 인간 가변부 프레임워크(framework) 및 정상 영역으로 이루어지는 항체(즉, 「인간화 항체」)가 생산되고 있다(비특허 문헌 14를 참조). 이러한 방법을 이용하여 마우스 항체를 인간 항체의 서열로 치환시킴으로써, 2C3B 항체 등의 항 FGF23 마우스 항체를 인간화하는 것이 알려져 있다. 그러나, 인간화한 경우, 항원에의 친화성이 저하되는 등의 가능성이 있다.

또한, XLH 등에서의 저인혈증성 구루병의 현재 치료에 있어서는 비타민 D 제제뿐 아니라 인산을 간헐적으로 경구 투여하는 방법이 주류이지만, 1회당 투여량 및 1 일당 투여 횟수가 많기 때문에 환자에게 많은 부담을 주는 상황인 것도 문제가 되고 있다. 그 때문에, 환자나 그 가족의 부담을 감소시키는 의미에서도, 투여 간격을 연장시킬 수 있도록 하는 지속성이 있는 혈청 인 농도, 혈청 1,25D 농도 상승 작용을 나타내는 저인혈증 치료약이 요망되고 있다.

특허 문헌 1 국제 공개 제WO02/14504호 공보

특허 문헌 2 국제 공개 제WO03/057733호 공보

특허 문헌 3 유럽 특허 출원 공개 제120694호 명세서

특허 문헌 4 유럽 특허 출원 공개 제125023호 명세서

특허 문헌 5 영국 특허 제GB2188638A호 명세서

특허 문헌 6 미국 특허 제5585089호 명세서

비특허 문헌 1 [0rnitz, D. et al., Genome biology, 2: 3005.1-3005.12, 2001]

비특허 문헌 2 [Yamashita, T. et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 277: 494-498, 2000]

비특허 문헌 3 [White, K.E. et al., Nature Genet., 26: 345-348, 2000]

비특허 문헌 4 [Shimada, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98:6500-6505, 2001]

비특허 문헌 5 [Yamazaki, Y. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 87:4957-4960, 2002]

비특허 문헌 6 [Jonsson, K.B., et al., N. Engl. J. Med.,348:1656-1663, 2003]

비특허 문헌 7 [Riminucci, M. et al., J. Clin. Invest., 112:683-692, 2003]

비특허 문헌 8 [Yamamoto, T. et al., J. Bone Miner. Metab., 23:231- 237, 2005]

비특허 문헌 9 [Lorenz-Depiereux, B. et al., Nat. Genet., 38:1248-1250, 2006]

비특허 문헌 10 [Gupta, A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 89:4489-4492, 2004]

비특허 문헌 11 [Larsson, T. et al., Kidney Int., 64:2272-2279, 2003]

비특허 문헌 12 [Van Kroonenbergh, M. J. et al., Nucl. Med. Commun. 9:919-930, 1988]

비특허 문헌 13 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med., 170:2153-2157, 1989]

비특허 문헌 14 [Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327, 1988]

<발명의 개시>

본 발명의 목적은, FGF23에 대한 인간 항체 및 상기 항체를 이용하여 FGF23의 작용을 억제함으로써 예방 또는 치료가 가능한 질환에 대한 부작용이 보다 적은 예방 또는 치료제 등의 의약 조성물을 제공하는 것에 있다.

또한 본 발명의 목적은, 저인혈증 치료약으로서 이용할 수 있는 항 FGF23 항체로서, 기존의 항 FGF23 항체에 비해 단회의 투여로 혈청 인 농도, 혈청 1,25D 농도의 보다 지속적인 상승 작용을 갖는 항체 및 상기 항체를 이용하여 FGF23이 관련된 질환의 예방 또는 치료제 등의 의약 조성물을 제공하는 것에 있다.

현재의 저인혈증성 구루병의 치료 방법으로서는 비타민 D 제제와 함께 인산을 1 일에 수회, 간헐적으로 경구 투여하는 방법이 주류이지만, 1회당 투여량 및 1 일당 투여 횟수가 많기 때문에 환자에게 많은 부담을 주는 상황인 것이 문제가 되고 있다. 본 발명에서 취득된 항 FGF23 인간 모노클로날 항체, C10 항체는 보다 지속적인 혈 중 인 농도 상승 및 1,25D 상승 작용, 즉, 강력한 FGF23 중화 활성을 갖는 것을 나타낸다. 본 연구에서 C10 항체의 단회 투여에 있어서, 혈청 인 농도, 혈청 1,25D 농도의 지속적인 상승 작용이 관찰됨에 따라, 저인혈증 치료약으로서 현재 치료에 비해, C10 항체가 현저한 우위성을 갖는 치료라는 가능성이 시사되었다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는, 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[2] 서열 번호 12의 20번째 Q에서 136번째 S로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 14의 23번째 A에서 128번째 K로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[3] 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하며 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 12의 20번째 Q에서 136번째 S로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 14의 23번째 A에서 128번째 K로 표시되는 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[4] 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)으로부터 생산되는 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[5] 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)이 생산하는 항체가 결합하는 인간 FGF23 상의 에피토프 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.

[6] 상기 [3]의 중쇄 가변 영역이 서열 번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 1, 서열 번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 것인 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[7] 상기 [3]의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 43의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 것인 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[8] 중쇄 가변 영역이 서열 번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열 번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 것이고, 경쇄 가변 영역이 서열 번호 43의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 중 어느 것 또는 모두를 포함하는 것인 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 기능적 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 디술피드 결합 Fv(dsFv), 이량체화 V 영역(다이아바디(diabody)), 단일쇄 Fv(scFv) 및 CDR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드 단편인 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[10] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 그의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 항체의 클래스가 IgG, IgA, IgE 또는 IgM인 인간 FGF23에 대한 항체.

[12] [11]에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 인간 FGF23에 대한 항체.

[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.

[14] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하는, FGF23의 인 대사 및/또는 비타민 D 대사를 조절할 수 있는 의약 조성물.

[15] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하는, 미네랄 대사 이상을 수반하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

[16] [15]에 있어서, 미네랄 대사 이상을 수반하는 질환이 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 섬유 형성 이상, 맥쿤-알브라이트 증후군 및 상염색체 열성 저인혈증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 의약 조성물.

[17] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하는, 골다공증, 구루병, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 이소성 석회화, 골경화증, 파제트병, 부갑상선 기능 항진증, 부갑상선 기능 저하증 및 소양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

[18] 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772).

[19] 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열의 58번째 C에서 408번째 A로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.

[20] 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열의 67번째 G에서 384번째 A로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.

[21] [19] 또는 [20]의 핵산을 포함하는 벡터.

[22] [21]의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

[23] [22]의 숙주 세포를 배양하여 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 FGF23에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편의 제조 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허 출원 2007-34018호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 C10 발현 벡터의 구축 과정을 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 N5KG1_C10_LH에서의 항체 유전자 중쇄의 염기 서열(서열 번호 30) 및 아미노산 서열(서열 번호 31)을 나타낸다. 도면 중, 사각으로 둘러싼 아미노산 서열은 분비 시그널 서열(리더 서열)을 나타낸다.

도 3은 N5KG1_C10_LH에서의 항체 유전자 경쇄의 염기 서열(서열 번호 32) 및 아미노산 서열(서열 번호 33)을 나타낸다. 도면 중, 사각으로 둘러싼 아미노산 서열은 분비 시그널 서열(리더 서열)을 나타낸다.

도 4는 C10 발현 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.

도 5A는 정제한 전장(full length) 인간 FGF23 단백질을 2C3B 항체 또는 C10 항체를 고상 항체로 하고, 3C1E 항체를 검출 항체로 한 샌드위치 ELISA로 검출한 측정 결과를 나타낸 도면이다.

도 5B는 카니쿠이잘(cynomolgus monkey: 필리핀 원숭이) FGF23 발현 세포 상청을 2C3B 항체 또는 C10 항체를 고상 항체로 하고, 3C1E 항체를 검출 항체로 한 샌드위치 ELISA로 검출한 측정 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 매체, 2C3B 항체 또는 C10 항체를 투여한 카니쿠이잘의 혈청 인 농도를 경시적으로 측정한 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 이용하여 동일자의 매체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.05)가 관찰된 측정값에 대해서는, 그래프 상에 *를 부가하였다.

도 7은 매체 투여 5 일째의 카니쿠이잘의 혈청 인 농도를 기준으로 한, 2C3B 항체 또는 C10 항체의 투여 후 5 일째의 카니쿠이잘의 혈청 인 농도의 상승값을 나타낸 그래프이다.

도 8은 매체, 2C3B 항체 또는 C10 항체를 투여한 카니쿠이잘의 혈청 1,25D 농도를 경시적으로 측정한 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 동일자의 매체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.05)가 관찰된 측정값에 대해서는, 그래프 상에 *를 부가하였다.

도 9는 강제 발현시키지 않은 세포의 배양 상청(대조군), 인간 및 카니쿠이잘 FGF23 발현 세포 배양 상청을 C15 항체를 이용하여 웨스턴 블롯법에 의해 검출한 사진이다.

도 10은 pPSs FGF23 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.

도 11은 pUS FGF23 KI 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.

도 12는 약제 내성 유전자(loxp-neo^r)가 타게팅된 대립 유전자(allele) 구조, 인간 FGF23(-SP)+약제 내성 유전자(loxpv-puro^r)가 pUS hFGF23 KI 벡터를 이용하여 타게팅된 대립 유전자 구조, 약제 내성 유전자(loxp-neo^r, loxpv-puro^r)가 제거된 대립 유전자 구조 및 서든(Southern) 해석용 프로브의 위치를 나타낸다. 도면 중에 기재된 용어의 상세한 설명은 이하와 같다.

hFGF23(-SP): 고유 시그널 펩티드 코드 영역을 갖지 않는 인간 FGF23 유전자, Cκ: 마우스 Igκ 유전자 정상 영역, loxpv-puro: loxP 서열의 일부 변이체 서열인 loxPV 서열을 그의 양끝에 갖는 퓨로마이신 내성 유전자, loxp-neo^r: loxP 서열을 그의 양끝에 갖는 네오마이신 내성 유전자, Ck3' 프로브: hFGF23(-SP)+loxpv-puro^r 유전자 도입 및 loxpv-puro^r 유전자 제거 클론 선별용 서든 블롯 해석 프로브, 3' KO-프로브: loxp-neo^r 유전자 도입 및 제거 클론 선별용 서든 블롯 해석 프로브, E: EcoRI 제한 효소 사이트.

도 13은 대조군 항체 또는 C10 항체 투여 7 일 전의 혈청 FGF23 농도를 나타낸 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 WT 마우스군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 군에 대해서는, 그래프 상에 ***를 부가하였다.

도 14는 대조군 항체 또는 C10 항체 투여 7 일 전 및 첫회 투여 3 일 후의 혈청 인 농도를 나타낸 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 동일자 내에 스튜던트 t-테스트를 이용하여 WT 마우스군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 군에 대해서는, 그래프 상에 ***를 부가하였다. 또한, 동일자 내에 hFGF23KI 마우스 대조군 항체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 hFGF23KI 마우스 C10 항체 투여군에 대해서는, 그래프 상에 ###를 부가하였다.

도 15는 대조군 항체 또는 C10 항체의 5회째 투여 1 일 후의 혈청 인 농도를 나타낸 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 WT 마우스군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 군에 대해서는, 그래프 상에 ***를 부가하였다. 또한, hFGF23KI 마우스 대조군 항체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 hFGF23KI 마우스 C10 항체 투여군에 대해서는, 그래프 상에 ###를 부가하였다.

도 16은 대조군 항체 또는 C10 항체의 4회째 투여 1 일 후의 악력을 나타낸 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 WT 마우스군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 군에 대해서는, 그래프 상에 ***를 부가하였다. 또한, hFGF23KI 마우스 대조군 항체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 hFGF23KI 마우스 C10 항체 투여군에 대해서는, 그래프 상에 ###를 부가하였다.

도 17은 대조군 항체 또는 C10 항체의 5회째 투여 1 일 후에 해부하여 채취한 마우스의 대퇴골을 빌라누에바-골드너(Villanueva-Goldner)법으로 조직 염색한 상을 나타낸 사진이다.

도 18은 대조군 항체 또는 C10 항체의 5회째 투여 1 일 후에 해부하여 채취한 경골의 건조 중량에 대한 회(ash) 중량의 비율을 나타낸 그래프이다. 측정값은 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 WT 마우스군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 군에 대해서는, 그래프 상에 ***를 부가하였다. 또한, hFGF23KI 마우스 대조군 항체 투여군과 유의차 검정을 행한 결과, 유의한 차(p<0.001)가 관찰된 hFGF23KI 마우스 C10 항체 투여군 에 대해서는, 그래프 상에 ###를 부가하였다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명에서 사용되는 용어의 의미를 분명히 함으로써 본 발명을 상세하게 설명한다.

I. 본 발명의 항체

1. 항 FGF23 항체 및 그의 기능적 단편

본 발명의 항체는 섬유아세포 증식 인자(FGF) 패밀리의 하나인 FGF23에 대한 항체이다.

본 발명에 있어서의 「FGF23에 대한 항체」란, FGF23 또는 그의 일부와 결합하는 항체, FGF23 또는 그의 일부와 반응성을 갖는 항체, 또는 FGF23 또는 그의 일부를 인식하는 항체이다. FGF23에 대한 항체를 항 FGF23 항체라 부르는 경우도 있다. 본 발명에 있어서, 항체란 면역 글로불린을 구성하는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 정상 영역, 및 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 모든 영역이 면역 글로불린을 코딩하는 유전자에서 유래하는 면역 글로불린이다. 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 여기서 FGF23의 일부란, 서열 번호 4로 표시되는 FGF23의 전장 아미노산 서열의 일부 아미노산 서열로서, 연속된 아미노산 서열로 이루어지는 FGF23의 단편 펩티드를 말한다. 바람직하게는 서열 번호 12의 20번째 Q에서 136번째 S로 이루어지는 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 14의 23번째 A에서 128번째 K로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 항체이고, 더욱 바람직하게는 하이브리도마 C10이 생산하는 항체이다. 서열 번호 12는 FGF23에 대한 항체의 중쇄 가 변 영역의 리더 서열을 포함하는 아미노산 서열이고, 서열 번호 12의 20번째 Q에서 136번째 S로 이루어지는 아미노산 서열은 리더 서열 부분을 제외한 성숙체 부분의 아미노산 서열이다. 또한, 서열 번호 14는 FGF23에 대한 항체의 경쇄 가변 영역의 리더 서열을 포함하는 아미노산 서열이고, 서열 번호 14의 23번째 A에서 128번째 K로 이루어지는 아미노산 서열은 리더 서열 부분을 제외한 성숙체 부분의 아미노산 서열이다. 항체의 클래스로서는 면역 글로불린 G(IgG), 동 A(IgA), 동 E(IgE) 및 동 M(IgM)이 이용되지만, 바람직하게는 IgG이다. 또한 IgG의 서브클래스로서는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 이용되지만, 바람직하게는 IgG1, IgG2 및 IgG4이고, 더욱 바람직하게는 IgG1이다.

본원 발명의 항체에는, 신규 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 아미노산 서열을 함유하는 항 FGF23 항체도 포함된다.

항체의 가변 영역 내에는 CDR이 존재하고, 이 부분이 항원 인식의 특이성을 담당하고 있다. 가변 영역의 CDR 이외의 부분은 CDR의 구조를 유지하는 역할을 하고, 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 C 말단측에는 정상 영역이 존재하고, 각각 중쇄 정상 영역(CH), 경쇄 정상 영역(CL)이라 불린다.

중쇄 가변 영역 중에는, 제1 상보성 결정 영역(CDR1), 제2 상보성 결정 영역(CDR2) 및 제3 상보성 결정 영역(CDR3)의 3개 상보성 결정 영역이 존재한다. 중쇄 가변 영역 중의 3개 상보성 결정 영역을 통합하여 중쇄 상보성 결정 영역이라 부른다. 경쇄 가변 영역 중에도 동일하게, 제1 상보성 결정 영역(CDR1), 제2 상보성 결정 영역(CDR2) 및 제3 상보성 결정 영역(CDR3)의 3개 상보성 결정 영역이 존 재한다. 경쇄 가변 영역 중의 3개 상보성 결정 영역을 통합하여 경쇄 상보성 결정 영역이라 부른다. 이들 CDR은 문헌[시퀀시즈ㆍ오브ㆍ프로테인즈ㆍ오브ㆍ이뮤놀로지칼ㆍ인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, (1991)] 등을 이용하여 결정할 수 있다.

본원 발명의 항체로서, 바람직하게는 중쇄 상보성 결정 영역으로서, CDR1이 서열 번호 40, CDR2가 서열 번호 41, CDR3이 서열 번호 42의 적어도 어느 하나 또는 모두를 갖는 것이다. 또한, 경쇄 상보성 결정 영역으로서, CDR1이 서열 번호 43, CDR2가 서열 번호 44, CDR3이 서열 번호 45의 적어도 어느 하나 또는 모두를 갖는 것이다. 보다 바람직하게는 중쇄 상보성 결정 영역으로서, CDR1이 서열 번호 40, CDR2가 서열 번호 41, CDR3이 서열 번호 42를 가지고, 경쇄 상보성 결정 영역으로서, CDR1이 서열 번호 43, CDR2가 서열 번호 44, CDR3이 서열 번호 45를 갖는 FGF23에 결합하는 항체이다.

본 발명의 항체의 CDR 서열은 반드시 한정되지는 않지만, 바람직하게는 서열 번호 40 내지 45로 표시되는 CDR 서열 중, 어느 1개 이상, 바람직하게는 중쇄의 3개, 보다 바람직하게는 6개의 CDR을 함유하는 항체이다. CDR 이외의 아미노산 서열은 특별히 한정되지 않고, CDR 이외의 아미노산 서열이 다른 항체, 특히 다른 종의 항체 유래인, 이른바 CDR 이식 항체가 본 발명의 항체에 포함된다. 이 중, CDR 이외의 아미노산 서열이 인간 유래인 인간화 항체 또는 인간 항체가 바람직하고, 필요에 따라서 FR에 1 내지 수개의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입을 수반할 수도 있다. 인간화 항체 또는 인간 항체의 제조 방법은 공지된 방법 을 사용할 수 있다.

「기능적 단편」이란, 항체의 일부분(부분 단편)으로서, 항체의 항원에의 작용을 하나 이상 유지하는 것, 즉, 항원에의 결합능, 항원에의 반응성 또는 항원의 인식능을 유지한 것을 의미하고, Fv, 디술피드 결합 Fv(dsFv), 단일쇄 Fv(scFv) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다. 구체적으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, 다이아바디, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다(문헌[D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd]).

Fab는, FGF23과 결합하는 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, 중쇄(H쇄)의 아미노 말단측의 약 반과 경쇄(L쇄) 전체가 디술피드 결합으로 결합된 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 FGF23과 결합하는 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab')₂는 IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab가 힌지 영역의 디술피드 결합을 통해 결합된 것보다 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab')₂는 본 발명의 FGF23과 결합하는 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합시켜 제조할 수 있다.

Fab'는 상기 F(ab')₂의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab'는 본 발명의 FGF23에 결합하는 F(ab')₂를 환원제 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 Fab'를 제조할 수 있다.

scFv는 1개의 중쇄 가변 영역(이하, VH라 표기함)과 1개의 경쇄 가변 영역(이하, VL이라 표기함)을 적당한 펩티드 링커(이하, P라 표기함)를 이용하여 연결한 VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 scFv는 본 발명의 FGF23과 결합하는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 scFv를 제조할 수 있다.

다이아바디는 scFv가 이량체화된 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 한쪽이 다른 항원 결합 활성을 갖는 것으로 할 수도 있다.

본 발명의 다이아바디는 본 발명의 FGF23과 결합하는 항체의 VH 및 VL을 코 딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 다이아바디를 제조할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 레이터(Reiter) 등에 의해 개시된 방법(문헌[Protein Engineering, 7:697-704, 1994])에 따라서 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.

본 발명의 dsFv는 본 발명의 FGF23과 결합하는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 dsFv를 제조할 수 있다.

CDR을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수개의 CDR을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다.

본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 FGF23과 결합하는 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, CDR을 포함하는 펩티드를 제조할 수 있다.

또한, CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서 제조할 수도 있다.

또한, 「기능적 단편」은 항체 단편으로서 항원(FGF23)과 결합할 수 있는 단편이다. 바람직하게는 「기능적 단편」이 서열 번호 12의 20번째 Q에서 136번째 S로 이루어지는 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 14의 23번째 A에서 128번째 K로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 FGF23과 결합할 수 있는 단편이다. 바람직하게는 「기능적 단편」이 서열 번호 40 내지 45로 표시되는 CDR의 적어도 하나 또는 모두를 가지고, FGF23과 결합할 수 있는 단편이다. 더욱 바람직하게는 「기능적 단편」이 하이브리도마 C10이 생산하는 항체의 가변 영역 유래의 것이며, FGF23과 결합할 수 있는 단편이다.

본 발명의 항체는 본 발명의 FGF23에 대한 항체 또는 항체의 기능적 단편에 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 단백질 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체 유도체를 포함한다.

본 발명의 항체 유도체는, 본 발명의 FGF23에 대한 항체 또는 항체의 기능적 단편의 H쇄(중쇄) 또는 L쇄(경쇄)의 아미노 말단측 또는 카르복시 말단측, 항체 또는 항체의 기능적 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 또한 항체 또는 항체의 기능적 단편 중의 당쇄 등에 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 단백질 등을 화학적 수법(문헌[항체 공학 입문, 가나미쯔 오사무 저서, 치진 쇼칸, 1994]) 등에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 단백질을 결합시킨 항체 유도체는, 본 발명의 FGF23에 대한 항체 및 항체의 기능적 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고자 하는 단백질을 코딩하는 DNA를 연결시켜 발현용 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

방사성 동위 원소로서는, ¹³¹I, ¹²⁵I 등을 들 수 있고, 예를 들면 클로라민 T법 등에 의해 항체에 결합시킬 수 있다.

저분자 약제로서는, 질소ㆍ머스타드, 시클로포스파미드 등의 알킬화제, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트 등의 대사 길항제, 다우노마이신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 다우노루비신, 독소루비신 등의 항생 물질, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신과 같은 식물 알칼로이드, 타목시펜, 덱사메타손 등의 호르몬제 등의 항암제(문헌[임상 종양학, 일본 임상 종양 연구소 편, 암과 화학 요법사, 1996]); 하이드로코티존, 프레드니존 등의 스테로이드제, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금 티오말레이트, 페니실라민 등의 면역 조절제; 시클로포스파미드, 아자티오프린 등의 면역 억제제; 말레산클로로페닐라민, 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제(문헌[염증과 항염증 요법, 이시야꾸 슈판 가부시끼가이샤, 1982]) 등을 들 수 있다. 이들 저분자 약제와 항체의 결합은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 다우노마이신과 항체를 결합시키는 방법으로서는, 글루타르알데히드를 통해 다우노마이신과 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 수용성 카르보디이미드를 통해 다우노마이신의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다. 이들 저분자 약제를 항체에 결합시킴으로써 저분자 약제가 갖는 기능을 갖는 항체 유도체가 얻어진다.

고분자 약제로서는, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체의 기능적 단편에 결합시킴으로써 (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 각종 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈 중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역 원성의 소실, 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다(문헌[바이오콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐, 1993]). 예를 들면, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다(문헌[바이오콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐, 1993]). PEG화 수식 시약으로서는, 리신의 ε-아미노기 수식제(일본 특허 공개(소) 61-178926호 공보), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실기 수식제(일본 특허 공개(소) 56-23587호 공보), 아르기닌의 구아니디노기 수식제(일본 특허 공개(평) 2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.

단백질과 결합한 항체는 융합 항체로서 얻을 수 있다. 즉, 항체 또는 항체의 기능적 단편을 코딩하는 cDNA에 특정 단백질을 코딩하는 cDNA를 연결시켜, 특정 단백질과 항체와의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 상기 특정 단백질과 결합한 융합 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 FGF23에 대한 항체 또는 항체의 기능적 단편에 대하여, ELISA(문 헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988]; 문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996]) 등의 면역학적 수법에 의해 또는 바이오센서 비아코어(Biacore)로 측정되는 결합 해리 상수(문헌[Journal of Immunological Methods, 145:229-240, 1991]), 및 클로토(klotho) 발현 세포를 이용한 인간 FGF23 자극에 의한 초기 성장 반응 유전자-1(Early growth response gene-1)의 프로모터 활성화에 대한 저해 활성(문헌[Nature, 444:770-774, 2006]) 등을 측정함으로써 인간 FGF23에 대한 결합 활성, 인간 FGF23의 기능을 저해하는 활성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는, 후술하는 바와 같이 인간 항체 유전자좌를 도입하고, 인간 유래 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 얻을 수 있다. 상기 트랜스제닉 동물로서 마우스를 들 수 있고, 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 작출(creation) 방법은, 예를 들면 국제 공개 제WO02/43478호 공보에 기재되어 있다.

본 발명의 항체로서는, 예를 들면 하기 실시예에 기재된, C10 하이브리도마에 의해 생산되는 항체(C10 항체)를 들 수 있다. C10 하이브리도마는 2007년 2월 2 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 주오 다이 6)에 수탁 번호 FERM BP-10772(식별을 위한 표시: C10)로서 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다.

본 발명의 항체 또는 기능적 단편에는, 항체 또는 기능적 단편을 구성하는 중쇄 및/또는 경쇄 각각의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편도 포함된다. 여기서 「1 또는 수개」의 「수개」란, 9개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 더욱 바람직하게는 3개 이하, 특히 바람직하게는 2개이다. 상기한 것과 같은 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입, 부가)은 그 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 부분적으로 개변함으로써 본 발명의 항체 또는 기능적 단편의 아미노산 서열 중에 도입할 수 있다. 이 염기 서열의 부분적 개변은 기지의 부위 특이적 변이 도입법(site specific mutagenesis)을 이용하여 통상법에 의해 도입할 수 있다(문헌[Proc Natl Acad Sci USA., 81:5662-5666, 1984]). 본 발명의 항체는 어떤 면역 글로불린 클래스 및 아이소타입을 갖는 항체도 포함한다.

본 발명의 FGF23에 대한 항체는 하기와 같은 제조 방법에 의해서 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면 FGF23, 그의 일부, 또는 그의 일부와 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 캐리어 물질(예를 들면, 소혈청 알부민 등)과의 결합물을, 필요에 따라서 면역 부활제(프로인트(Freund)의 완전 또는 불완전 어쥬번트 등)와 함께 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스 등의 비인간 포유 동물에게 면역시킨다. FGF23은 천연 FGF23도 재조합형 FGF23도 이용할 수도 있다. 또는, FGF23을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 도입하여, 동물 내에서 FGF23 단백질을 발현시킴으로써 면역 감작을 행할 수도 있다. 모노클로날 항체는 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와, 자기 항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양하고, 면역에 이용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 취득할 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에게 주지된 유전자 공학적 개변(예를 들면, 유럽 특허 EP314161호 공보를 참조한 것)에 의해 다른 서브클래스의 것으로 변환된 것도 포함한다. 즉, 본 발명의 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 이용하고, 유전자 공학적 수법을 이용하여 원래의 서브클래스와는 다른 서브클래스의 항체를 얻을 수 있다.

2. 본 발명의 항체 제조

모노클로날 항체의 제조는 하기의 공정을 포함한다. 즉, (1) 면역원으로서 사용하는 항원 단백질 또는 항원 단백질 발현 벡터의 제조, (2) 항원을 동물체 내에 주입하거나, 또는 항원을 동물체 내에서 발현시킴으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하고, 그의 항체가를 검정하여 비장 등의 적출 시기를 결정하고 나서 항체 생산 세포를 제조하는 공정, (3) 골수종 세포(미엘로마)의 제조, (4) 항체 생산 세포와 골수종과의 세포 융합, (5) 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마군의 선별, (6) 단일 세포 클론으로의 분할(클로닝), (7) 경우에 따라서는 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육, 또한 (8) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 및 그의 인식 특이성의 검정, 또는 표지 시약으로서의 특성 검정 등이다.

이하, 항 FGF23 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정에 따라서 상술하지 만, 상기 항체 제조법은 이것으로 제한되지 않고, 예를 들면 비장세포 이외의 항체 생산 세포 및 골수종을 사용할 수도 있다.

(1) 항원의 정제

항원으로서는, 유전자 재조합 기술을 이용하여 FGF23을 코딩하는 DNA 서열을 바람직한 발현 플라스미드에 조립하고, 대장균이나 동물 세포 등의 숙주 내외에서 생산한 후 정제한 FGF23 단백질을 사용할 수 있다. 인간 FGF23의 단백질의 일차 구조는 공지되어 있기 때문에[GenBank accession No. AAG09917, 서열 번호 4], 당업자에게 주지된 방법에 의해, FGF23의 아미노산 서열로부터 부분 펩티드를 화학 합성하고, 이것을 항원으로서 사용할 수도 있다.

(2) 항체 생산 세포의 제조 공정

(1)에서 얻은 항원과, 프로인트의 완전 또는 불완전 어쥬번트, 또는 칼륨 명반과 같은 보조제를 혼합하여 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물로서는, 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 마우스가 가장 바람직하게 이용되는데, 그와 같은 마우스는 도미즈카 등의 문헌[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 97:722-727, 2000]에 기재되어 있다.

마우스 면역시의 면역원 투여법은 피하 주사, 복강 내 주사, 정맥 내 주사, 피부 내 주사, 근육 내 주사, 족척(food pad) 주사 등 어떤 것이어도 좋지만, 복강 내 주사, 족척 주사 또는 정맥 내 주사가 바람직하다.

면역은 1회 또는 적당한 간격으로 복수회 반복하여 행할 수 있다. 그 후, 면역시킨 동물의 혈청 중의 항원에 대한 항체가를 측정하고, 항체가가 충분히 높아 진 동물을 항체 생산 세포의 공급원으로서 이용하면, 이후 조작의 효율을 높일 수 있다. 일반적으로는, 최종 면역 후 3 내지 5 일 후의 동물 유래의 항체 생산 세포를 이후의 세포 융합에 이용하는 것이 바람직하다.

여기서 이용되는 항체가의 측정법으로서는, 방사성 동위 원소 면역 정량법(이하, 「RIA법」이라 함), 고상 효소 면역 정량법(이하, 「ELISA법」이라 함), 형광 항체법, 수동 혈구 응집 반응법 등 각종 공지 기술을 들 수 있지만, 검출 감도, 신속성, 정확성 및 조작 자동화의 가능성 등의 관점에서 RIA법 또는 ELISA법이 보다 바람직하다.

본 발명에 있어서의 항체가 측정은, 예를 들면 ELISA법에 따르면, 이하에 기재하는 것과 같은 절차에 의해 행할 수 있다. 우선, 인간 항체에 대한 항원을 ELISA용 96웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되지 않은 고상 표면을 항원과 무관계한 단백질, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA)으로 덮고, 상기 표면을 세정 후, 일차 항체로서 단계 희석한 시료(예를 들면 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 마우스의 혈청)에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항 FGF23 항체를 결합시킨다. 또한 이차 항체로서 효소 표지된 인간 항체에 대한 항체를 첨가하여 인간 항체에 결합시키고, 세정 후에 이 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써 항체가를 산출한다.

(3) 골수종의 제조 공정

골수종으로서는, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유 동물에서 유래하는 자기 항체 생산능이 없는 세포를 사용할 수 있지만, 일반적으로는 마우스로부터 얻어진 주화 세포, 예를 들면 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종주 P3X63Ag8U.1(P3-U1)(문헌[Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978]), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(문헌[Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6:511-519, 1976]), Sp2/0-Ag14(SP2/O)(문헌[Shulman, M. et al. nature, 276: 269-270, 1978]), P3X63Ag8.653(653)(문헌[Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123:1548-1550, 1979]), P3X63Ag8(X63)(문헌[Horibata, K. And Harris, A. W. Nature, 256: 495-497, 1975]) 등을 이용하는 것이 바람직하다. 이들 세포주는 적당한 배지, 예를 들면 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 겐타마이신 및 소태아 혈청(이하, 소태아 혈청을 「FCS」라 함)을 첨가한 RPMI-1640 배지에 8-아자구아닌을 더 첨가한 배지], 이스코프 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; 이하, 「IMDM」이라 함) 또는 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; 이하, 「DMEM」이라 함)에서 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지(예를 들면, 10 ％ FCS를 포함하는 DMEM 배지)로 계대 배양하고, 융합 당일에 2×10⁷ 이상의 세포수를 확보해둔다.

(4) 세포 융합

항체 생산 세포는 형질 세포 및 그의 전구 세포인 림프구이고, 이것은 개체의 어떤 부위로부터 얻어도 좋고, 일반적으로는 비장, 림프절, 골수, 편도, 말초 혈, 또는 이들을 적절하게 조합한 것 등으로부터 얻을 수 있지만, 비장세포가 가장 일반적으로 이용된다.

최종 면역 후, 소정의 항체가가 얻어진 마우스로부터 항체 생산 세포가 존재하는 부위, 예를 들면 비장을 적출하고, 항체 생산 세포인 비장세포를 제조한다. 이어서, 비장세포와 골수종을 융합시킬 수 있다. 이 비장세포와 공정(3)에서 얻어진 골수종을 융합시키는 수단으로서 현재 가장 일반적으로 행해지고 있는 것은, 세포 독성이 비교적 적으며 융합 조작도 간단한, 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 방법이다. 이 방법은, 예를 들면 이하의 절차로 이루어진다.

비장세포와 골수종을 무혈청 배지(예를 들면, DMEM) 또는 인산 완충 생리 식염액(이하, 「PBS」라 함)으로 잘 세정하고, 비장세포와 골수종의 세포수의 비가 5:1 내지 10:1 정도가 되도록 혼합하여 원심 분리한다. 상청을 제거하고, 침전된 세포군을 잘 풀어준 후, 교반하면서 1 mL의 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜(분자량 1000 내지 4000)을 포함하는 무혈청 배지를 적하한다. 그 후, 10 mL의 무혈청 배지를 천천히 첨가한 후 원심 분리한다. 다시 상청을 버리고, 침전된 세포를 적량의 히포크산틴ㆍ아미노프테린ㆍ티미딘(이하 「HAT」라 함)액 및 인간 인터루킨-6(이하, 「IL-6」이라 함)을 포함하는 정상 배지(이하, 「HAT 배지」이라 함) 중에 현탁시켜 배양용 플레이트(이하, 「플레이트」라 함)의 각 웰에 분주하고, 5 ％ 탄산 가스 존재하에 37 ℃에서 2 주간 정도 배양한다. 도중에 적절하게 HAT 배지를 보충한다.

(5) 하이브리도마군의 선택

상기 골수종 세포가 8-아자구아닌 내성주인 경우, 즉, 히포크산틴ㆍ구아닌ㆍ포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT) 결손주인 경우, 융합되지 않은 상기 골수종 세포, 및 골수종 세포끼리의 융합 세포는 HAT 함유 배지 중에서는 생존할 수 없다. 한편, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포, 또는 항체 생산 세포와 골수종 세포와의 하이브리도마는 생존할 수 있지만, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포에는 수명이 있다. 따라서, HAT 함유 배지 중에서의 배양을 계속함으로써, 항체 생산 세포와 골수종 세포와의 융합 세포인 하이브리도마만이 살아 남고, 결과적으로 하이브리도마를 선택할 수 있다.

콜로니상으로 생육해 온 하이브리도마에 대하여, HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지(이하, 「HT 배지」라 함)로의 배지 교환을 행한다. 이후, 배양 상청의 일부를 채취하고, 예를 들면 ELISA법에 의해 항 FGF23 항체가를 측정한다.

이상, 8-아자구아닌 내성의 세포주를 이용하는 방법을 예시하였지만, 그 밖의 세포주도 하이브리도마의 선택 방법에 따라서 사용할 수 있고, 그 경우에 사용하는 배지 조성도 변화된다.

(6) 클로닝 공정

(2)의 항체가 측정 방법과 동일한 방법으로 항체가를 측정함으로써, 특이적 항체를 생산하는 것이 판명된 하이브리도마를, 다른 플레이트로 옮겨 클로닝을 행한다. 이 클로닝법으로서는, 플레이트의 1웰에 1개의 하이브리도마가 포함되도록 희석하여 배양하는 한계 희석법, 연한천(soft agar) 배지 중에서 배양하여 콜로니를 회수하는 연한천법, 현미경 조작(micromanipulator)에 의해서 1개씩 세포를 취 출하여 배양하는 방법, 셀 소터(sorter)에 의해서 1개의 세포를 분리하는 「소터 클론」 등을 들 수 있지만, 한계 희석법이 간편하여 자주 이용된다.

항체가가 확인된 웰에 대하여, 예를 들면 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 내지 4회 반복하고, 안정적으로 항체가가 확인된 것을 항 FGF23 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.

(7) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 제조

클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지로부터 정상 배지로 바꾸어 배양한다. 대량 배양은 대형 배양병을 이용한 회전 배양, 스피너(spinner) 배양, 또는 중공사 시스템 등을 이용한 배양으로 행해진다. 이 대량 배양에서의 상청을, 겔 여과 등 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 정제함으로써 항 FGF23 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 동 계통의 마우스(예를 들면 BALB/c) 또는 nu/nu 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복강 내에서 상기 하이브리도마를 증식시킴으로써, 항 FGF23 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수(peritoneal fluid)를 얻을 수 있다. 정제의 간편한 방법으로서는, 시판되는 모노클로날 항체 정제 키트(예를 들면, MAbTrap GII 키트; GE 헬스 케어 바이오사이언스사) 등을 이용할 수도 있다.

이렇게 얻어지는 모노클로날 항체는 FGF23에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.

또는 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주(예를 들면 포유류 세포 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산한 재조합형 항체를 제조할 수도 있다(문헌[Delves, P.J., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY], [Shepherd, P. And Dean C., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS], [Goding, J. W., Monoclonal Antibodies]: [Principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS]).

본 발명은, 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 보유하는 항체의 유전자 서열을 포함하는 핵산, 특히 후술하는 본 발명의 하이브리도마가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 핵산도 포함한다. 여기서, 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 또한, 본 발명은 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 핵산으로부터 시그널 서열을 코딩하는 영역을 제외한 성숙체 부분의 핵산도 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산은 상술한 핵산 이외에, 본 발명의 항체의 아미노산 서열 및 상기 항체의 항체 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산에 대응하는 코돈을 갖는 핵산도 포함한다.

하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 제조하기 위해서는, 모노클로날 항체의 L쇄 V 영역, L쇄 C 영역, H쇄 V 영역 및 H쇄 C 영역을 각각 코딩하는 DNA를 PCR법 등에 의해 제조하는 방법이 채용된다. 이 때, 프라이머로서는, 항 FGF23 항체 유전자 또는 아미노산 서열로부터 설계한 올리고 DNA를 사용할 수 있고, 주형으로서는 하이브리도마로부터 제조한 DNA를 사용할 수 있다. 이들 DNA를 1개의 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주에 도입하여 발현시키거나 또는 이들 DNA를 각각 적당한 벡터에 조립하여 공발현시킨다.

벡터로서는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지(phage) 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA로서는, 대장균, 고초균 또는 효모 유래의 플라스미드 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ 파지를 들 수 있다.

형질 전환에 사용하는 숙주로서는, 목적 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 세균(대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포(COS세포, CHO 세포 등), 곤충 세포를 들 수 있다.

숙주에의 유전자의 도입 방법은 공지되어 있고, 임의의 방법(예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기 천공법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등)을 들 수 있다. 또한, 후술하는 동물에게 유전자를 도입하는 방법으로서는, 마이크로인젝션법, ES 세포에 전기 천공이나 리포펙션법을 사용하여 유전자를 도입하는 방법, 핵 이식법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 항 FGF23 항체는 형질 전환체를 배양하여 그 배양물로부터 채취함으로써 얻을 수 있다. 여기서 「배양물」이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 또는 배양 균체 또는 그의 파쇄물, 및 (c) 형질 전환체의 분비물 중 어느 것을 의미하는 것이다. 형질 전환체를 배양하기 위해서는, 사용하는 숙주에 적합한 배지를 이용하여 정치 배양법, 회전 병에 의한 배양법 등이 채용된다.

배양 후, 목적 항체가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄하여 항체를 채취한다. 또한, 목적 항체가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리 정제에 이용되는 각종 크로마토그래피를 이용한 일반적인 생화학적 방법을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용함으로써, 상기 배양물 중에서 목적하는 항체를 단리 정제할 수 있다.

또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여, 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 삽입된 동물 숙주, 예를 들면 트랜스제닉 소, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 양 또는 트랜스제닉 돼지를 제조하고, 그 트랜스제닉 동물로부터 분비되는 밀크 중에서 그 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다(문헌[Wright, G., et al. Bio/Technology 9:830-834, 1991]). 하이브리도마를 시험관 내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 다양한 조건에 따라서 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해서 이용되는 것과 같은 기지의 영양 배지, 또는 기지의 기본 배지로부터 유도 제조되는 모든 영양 배지를 이용하여 실시하는 것이 가능하다.

(8) 모노클로날 항체의 검정

이렇게 얻어진 모노클로날 항체의 아이소타입 및 서브클래스의 결정은 이하와 같이 행할 수 있다. 우선, 동정법으로서는 오크터로니(Ouchterlony)법, ELISA법 또는 RIA법을 들 수 있다. 오크터로니법은 간편하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다. 한편, ELISA법 또는 RIA법을 이용한 경우는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 또한 이차 항체로서 각종 면역 글로불린 아이소타입, 서브클래스에 대응하는 항체를 이용함으로써 모노클 로날 항체의 아이소타입, 서브클래스를 동정하는 것이 가능하다.

또한, 단백질의 정량은 폴린 로우리(Folin/Lowry)법, 및 280 nm에서의 흡광도[1.4(OD280)=면역 글로불린 1 mg/mL]로부터 산출하는 방법 등에 의해 행할 수 있다.

모노클로날 항체의 인식 에피토프의 동정(에피토프 맵핑)은 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 모노클로날 항체가 인식하는 분자의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 그 분자의 다양한 부분 펩티드를 제조하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 바람직한 발현 플라스미드에 조립하고, 대장균 등의 숙주 내외에서 생산하는 방법 등이 있지만, 상기 목적을 위해서는 양자를 조합하여 이용하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 항원 단백질의 카르복시 말단 또는 아미노 말단에서 적당한 길이로 순차로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 후, 이들에 대한 모노클로날 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한다.

그 후, 더욱 미세하게, 그 대응 부분의 올리고펩티드 또는 상기 펩티드의 변이체 등을, 당업자에게 주지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 다양하게 합성하고, 본 발명의 예방 또는 치료제가 유효 성분으로서 함유하는 모노클로날 항체의 이들 펩티드에 대한 결합성을 조사하거나, 또는 상기 모노클로날 항체와 항원과의 결합에 대한 펩티드의 경합 저해 활성을 조사함으로써 에피토프를 한정한다. 다종의 올리고펩티드를 얻기 위한 간편한 방법으로서, 시판되는 키트(예를 들면, SPOTs 키트(제노시스ㆍ바이오테크놀로지즈사), 멀티핀 합성법을 이용한 일련의 멀티핀ㆍ펩티드 합성 키트(카이론사) 등)를 이용할 수도 있다.

(9) 항체 단편의 제조

항체 단편은 상기 (7)에 기재된 항체를 바탕으로 유전자 공학적 수법 또는 단백질 화학적 수법에 의해 제조할 수 있다.

유전자 공학적 수법으로서는, 목적하는 항체 단편을 코딩하는 유전자를 구축하고, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 대장균 등의 적당한 숙주를 이용하여 발현, 정제를 행하는 등의 방법을 들 수 있다.

단백질 화학적 수법으로서는, 펩신, 파파인 등의 단백질 분해 효소를 이용한 부위 특이적 절단, 정제 등의 방법을 들 수 있다.

항체 단편으로서는, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, 다이아바디, dsFv, CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다. 이하에 각각의 항체 단편의 제조 방법을 상술한다.

(i) Fab의 제조

Fab는 단백질 화학적으로는 IgG를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리함으로써 제조할 수 있다. 파파인의 처리 후에는, 원래의 항체가 단백질 A 결합성을 갖는 IgG 서브클래스이면, 단백질 A 칼럼에 통과시킴으로써, IgG 분자나 Fc 단편과 분리하여 균일한 Fab로서 회수할 수 있다(문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995]). 단백질 A 결합성을 갖지 않는 IgG 서브클 래스의 항체의 경우에는, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 Fab는 저염 농도로 용출되는 분획 중에 회수할 수 있다(문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995]). 또한, Fab는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균을 이용하여, 또한 곤충 세포나 동물 세포 등을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 2(7)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 Fab 발현용 벡터에 클로닝하여 Fab 발현 벡터를 제조할 수 있다. Fab 발현용 벡터로서는, Fab용 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pIT106(문헌[Science, 240:1041-1043, 1988]) 등을 들 수 있다. Fab 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체(inclusion body) 또는 페리플라즈마층에 Fab를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해, 활성이 있는 Fab로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는, 배양 상청 중에 활성을 갖는 Fab가 누출된다. 리폴딩 후 또는 배양 상청으로부터는, 항원을 결합시킨 칼럼을 이용함으로써 균일한 Fab를 정제할 수 있다(문헌[Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992]).

(ii) F(ab')₂의 제조

F(ab')₂는 단백질 화학적으로는 IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리함으로써 제조할 수 있다. 펩신 처리 후에는, Fab와 동일한 정제 조작에 의해 균일한 F(ab')₂로서 회수할 수 있다(문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995]). 또한, 하기 (iii)에 기재된 Fab'를 o-PDM이나 비스말레이미드헥산 등과 같은 말레이미드로 처리하여 티오에테르 결합시키는 방법이나, DTNB[5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)]로 처리하여 S-S 결합시키는 방법에 의해서도 제조할 수 있다(문헌[Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996]).

(iii) Fab'의 제조

Fab'는 상기 (ii)에 기재된 F(ab')₂를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, Fab'는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또한 곤충 세포나 동물 세포 등을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 2(7)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 Fab' 발현용 벡터에 클로닝하여 Fab' 발현 벡터를 제조할 수 있다. Fab' 발현용 벡터로서는, Fab'용 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pAK19(문헌[BIO/TECHNOLOGY, 10:163-167, 1992]) 등을 들 수 있다. Fab' 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여 봉입체 또는 페리플라즈마층에 Fab'를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab'로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여 균체 밖으로 회수할 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 단백질 G 칼럼 등을 이용함으로써 균일한 Fab'를 정제할 수 있다(문헌[Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996]).

(iv) scFv의 제조

scFv는 유전자 공학적으로는, 파지 또는 대장균, 또한 곤충 세포나 동물 세포 등을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 2(7)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를, scFv 발현용 벡터에 클로닝하여 scFv 발현 벡터를 제조할 수 있다. scFv 발현용 벡터로서는, scFv의 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pCANTAB5E(GE 헬스 케어 바이오사이언스사), pHFA(Human Antibodies & Hybridomas, 5:48-56, 1994) 등을 들 수 있다. scFv 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여 헬퍼 파지를 감염시킴으로써, 파지 표면에 scFv가 파지 표면 단백질과 융합된 형태로 발현되는 파지를 얻을 수 있다. 또한, scFv 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 또는 페리플라즈마층에 scFv를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해, 활성이 있는 scFv로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여 균체 밖에서 회수할 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 이용함으로써 균일한 scFv를 정제할 수 있다(문헌[Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996]).

(v) 다이아바디의 제조

다이아바디는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또한 곤충 세포나 동물 세포 등을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 2(7)에 기재된 항체의 VH와 VL을 링커가 코딩하는 아미노산 잔기가 8 잔기 이하가 되도록 연결한 DNA를 제조하고, 다이아바디 발현용 벡터에 클로닝하여 다이아바디 발현 벡터를 제조할 수 있다. 다이아바디 발현용 벡터로서는, 다이아바디의 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pCANTAB5E(GE 헬스 케어 바이오사이언스사), pHFA(Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994) 등을 들 수 있다. 다이아바디 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 또는 페리플라즈마층에 다이아바디를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해, 활성이 있는 다이아바디로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파에 의해 균을 파쇄하여 균체 밖에서 회수할 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 이용함으로써 균일한 scFv를 정제할 수 있다(문헌[Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996]).

(vi) dsFv의 제조

dsFv는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또한 곤충 세포나 동물 세포 등을 이용하여 제조할 수 있다. 우선, 상기 (ii), (iv) 및 (v)에 기재된 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA의 적당한 위치에 변이를 도입하여, 코딩하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 DNA를 제조한다. 제조한 각 DNA를 dsFv 발현용 벡터에 클로닝하여 VH 및 VL의 발현 벡터를 제조할 수 있다. dsFv 발현용 벡터로서는, dsFv용 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pULI9(문헌[Protein Engineering, 7:697-704, 1994]) 등을 들 수 있다. VH 및 VL의 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여 봉입체 또는 페리플라즈마층에 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 또는 페리플라즈마층으로부터 VH 및 VL을 얻고, 혼합하여 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해, 활성이 있는 dsFv로 할 수 있다. 리폴딩 후에는, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해 추가로 정제할 수 있다(문헌[Protein Engineering, 7:697-704, 1994]).

(vii) CDR 펩티드의 제조

CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA를 제조하고, 제조한 DNA를 적당한 발현용 벡터에 클로닝하여 CDR 펩티드 발현 벡터를 제조할 수 있다. 발현용 벡터로서는, CDR 펩티드를 코딩하는 DNA를 조합 발현할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pLEX(인비트로젠(Invitrogen)사), pAX4a+(인비트로젠사) 등을 들 수 있다. 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체 또는 페리플라즈마층에 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 또는 페리플라즈마층으로부터 CDR 펩티드를 얻고, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해 정제할 수 있다(문헌[Protein Engineering, 7:697-704, 1994]).

3. 본 발명의 항체 또는 기능적 단편의 성질

본 발명의 항체 또는 기능적 단편은 하기의 어느 하나의 특성을 갖는다.

(a) FGF23 결합 시험; FGF23 단백질의 서열 번호 4의 25번째로부터 251번째의 아미노산 잔기를 갖는 전장물에 결합한다.

(b) 시험관 내 시험; FGF23의 작용을 검출할 수 있는 것과 같은 분석에서 FGF23의 작용을 억제한다. FGF23의 작용을 시험관 내에서 검출하는 방법의 일례로서는, 클로토 발현 세포를 이용한 인간 FGF23 자극에 의한 초기 성장 반응 유전자-1의 프로모터 활성화(문헌[Nature, 444:770-774, 2006])를 들 수 있다.

(c) 생체 내 시험; 인간에게 투여하였을 때에 내재성 FGF23의 작용을 저해하고, 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도를 상승시킨다. 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도의 상승 정도는 기존 항체인 2C3B 항체(국제 공개 제WO03/057733호 공보에서 개시된 FGF23 단백질에 대한 마우스 모노클로날 항체, 수탁 번호 FERM BP-7838의 하이브리도마가 생산하는 항 FGF23 항체)에 비해 크고, 또한 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도의 상승 기간도 길다. 예를 들면, 카니쿠이잘에 투여한 경우, 상승한 혈청 인 농도의 지속 기간은 2C3B 항체의 약 3배 이상, 바람직하게는 약 5배이고, 상승한 혈청 1,25D 농도의 지속 기간은 2C3B 항체의 약 1.5배 이상, 바람직하게는 약 2.5배이다.

본 발명은 또한 본 발명의 FGF23에 대한 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산도 포함한다. 핵산은 DNA일 수도, RNA일 수도 있다. 본 발명의 핵산은, 바람직하게는 하이브리도마 C10이 생산하는 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이다. 예를 들면, 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열의 58번째 C에서 408번째 A로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 들 수 있다. 또한, 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열의 67번째 G에서 384번째 A로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 들 수 있다.

II. 의약 조성물

본 발명의 인간 항 FGF23 항체 또는 그의 기능적 단편을 함유하는 의약 조성물인 제제 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 제제는 바람직하게는 항체 또는 기능적 단편뿐 아니라 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 캐리어를 포함하고, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 캐리어에는, 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액, 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체는 동결 건조(freeze-dry)시키고, 필요할 때에 상기한 것과 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용할 수도 있다. 투여 경로는 경구 투여 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 투여이다. 투여 형태로서는, 각종 형태로 투여할 수 있고, 이들 형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제(emulsion), 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.

유제 및 시럽제와 같은 액체 제조물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류; 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류; 호마유, 올리브유, 대두유 등의 오일류; p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제; 스트로베리 향료, 페퍼민트 등의 향료류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.

캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제; 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제; 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제; 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제; 지방산 에스테르 등의 계면활성제; 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.

주사제는 물, 자당, 소르비톨, 크실로오스, 트레할로스, 과당 등의 당류; 만니톨, 자일리톨, 소르비톨 등의 당 알코올; 인산 완충액, 시트르산 완충액, 글루탐산 완충액 등의 완충액; 지방산 에스테르 등의 계면활성제 등을 첨가제로서 사용할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제의 경우에는, 통상 단위 투여량 앰플 또는 다투여량 용기의 상태로 제공된다. 사용할 때에 적당한 담체, 예를 들면 발열 물질 비함유의 멸균수에 재용해시키는 분체일 수도 있다. 이들 제형은 통상적으로 이들의 조성물 중에 제제상 일반적으로 사용되는 유화제, 현탁제 등의 첨가제를 함유한다. 주사 수법으로서는, 예를 들면 점적 정맥 내 주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 피부 내 주사 등을 들 수 있다. 또한, 그의 투여량은 투여 대상의 연령, 투여 경로, 투여 횟수에 의해 다르고, 광범위하게 변할 수 있다.

좌제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 제조된다. 또한, 분무제는 본 발명의 항체 또는 항체의 기능적 단편 그 자체를 이용하여 제조할 수도 있고, 또는 수용자(환자)의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않으면서, 상기 항체 또는 항체의 기능적 단편을 미세한 입자로서 분산시키고, 흡수를 용이하게 하기 위한 담체 등을 이용하여 제조된다.

담체로서 구체적으로는 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 상기 항체 또는 항체의 기능적 단편의 성질이나 사용되는 담체의 성질에 따라서 에어로졸, 드라이 파 우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

그 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상적으로 경구 투여로서는, 성인에 대하여 1 일 약 0.01 mg 내지 1000 mg이고, 이들을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여로서는, 1회 약 0.01 mg 내지 1000 mg을 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사에 의해서 투여할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 이들을 포함하는 의약 조성물을 이용한 하기 질환의 예방 또는 치료법도 포함하고, 또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 하기 질환의 예방 또는 치료제의 제조에 사용하는 것도 포함한다.

본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편에 의해 예방ㆍ치료가 가능한 질환은 FGF23의 과잉 작용이 나타나는 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 섬유 형성 이상, 맥쿤-알브라이트 증후군 및 상염색체 열성 저인혈증 등의 미네랄 대사 이상을 수반하는 질환을 들 수 있다. 또한, 이들 질환과 관련된 저인혈증, 골석회화 부전, 골병, 근력 저하, 골격의 변형, 성장 장해, 저 1,25D 혈증 등에 대하여 개선 효과가 기대된다. 또한 FGF23이 생리적 조건하에서 중요한 역할을 하고 있기 때문에, FGF23의 인 대사 조절, 비타민 D 대사 조절을 통한 칼슘 대사 조절 작용을 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편이 제어함으로써 골다공증, 구루병(저인혈증성 구루병, 비타민 D 저항성 구루병을 포함함), 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 이소성 석회화, 골경화증, 파제트병, 부갑상선 기능 항진증, 부갑상선 기능 저하증 및 소양 등의, 미네랄 대사나 비타민 D의 대사 이상에서 기인하는 질환에 대하여 치료적 및 예방적으로 사용할 수 있다. 또한, 신부전에 있어서 혈 중의 FGF23 농도의 상승이 보고되어 있기 때문에, 신장성 골이영양증, 투석 골증, 뇨세관 기능 장해 등으로 대표되는 신부전이나 신부전시 인공 투석에 합병하여 나타나는 질환에 대해서도 치료적 및 예방적으로 사용할 수 있다. 한편, 1,25D는 상술한 칼슘 등의 미네랄 대사뿐 아니라 세포 증식 억제능, 세포 분화 촉진능 등도 보고되어 있기 때문에, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편에 의해 1,25D에 의해서 증식이나 분화 등의 제어를 받는 세포에서 기인하는 질환에 대하여 치료적 및 예방적으로 사용할 수 있다.

또한, 종양성 골연화증에 있어서는 종양이 FGF23을 과잉 생산하여 병태를 야기시키고 있는 것으로 알려져 있지만, 본 항체에 방사성 동위 원소 등의 방사성 물질 또는 저분자 약제 등의 각종 독소 등 치료 시약을 결합시킨 것을 이용함으로써, 본 항체가 FGF23 과잉 생산 종양에 집적되어, 종양의 퇴축(retraction)을 유도하는 것도 생각된다.

III. 제제예

본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제제는, 물 또는 물 이외의 약리학적으로 허용할 수 있는 용액에 용해시킨 무균성 용액 또는 현탁액의 앰플로서 사용된다. 또한, 무균 분말 제제(본 발명의 분자를 동결 건조시키는 것이 바람직함)를 앰플에 충전해두고, 사용시에 약리학적으로 허용할 수 있는 용액으로 희석하여 이용할 수도 있다.

이하, 실시예로써 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 그 실시예에 기재되는 양태로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 재조합체 인간 FGF23 발현 벡터의 제조

(1) 인간 FGF23H 단백질 발현 벡터의 구축

인간 FGF23을 코딩하는 cDNA는 종양성 골연화증의 책임 종양의 인간 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, F1EcoRI 프라이머(서열 번호 1)와 LHisNot 프라이머(서열 번호 2)와 LA-Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 96 ℃에서 1 분간 보온한 후, 96 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 35 사이클의 PCR을 실시함으로써 증폭시켰다. F1EcoRI 프라이머는 인간 FGF23을 코딩하는 염기 서열의 추가의 5'측 상류에 존재하는 서열에 어닐링하고, 그 증폭 단편의 인간 FGF23을 코딩하는 영역의 5'측에 EcoRI 제한 효소 부위를 부가한다. LHisNot 프라이머는 인간 FGF23을 코딩하는 서열의 종지 코돈(stop codon)의 5'측 서열과 어닐링하는 서열과 His6-tag 서열(His-His-His-His-His-His)을 코딩하는 서열에 이어서 종지 코돈과 NotI 제한 효소 서열을 포함한다. 그 결과, 증폭 단편은 인간 FGF23 단백질의 카르복시 말단에 His6-tag 서열을 부가한 것을 코딩하게 되고, 그의 하류에 NotI 제한 효소 부위를 갖는다. 이 증폭 단편을 EcoRI와 NotI로 소화시키고, 동일하게 EcoRI와 NotI로 소화시킨 동물 세포 발현 벡터인 pcDNA3.1Zeo(인비트로젠사)와 연결하였다. 이와 같이 제조한 발현 벡터를 클로닝하여 염기 서열을 결정하여 목적하는 His6-tag 서열이 부가된 인간 FGF23 단백질을 코딩하는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pcDNA/hFGF23H라 칭한다.

F1EcoRI: CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(서열 번호 1)

LHisNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(서열 번호 2)

(2) 인간 FGF23 단백질 발현 벡터의 구축

pcDNA/hFGF23H를 주형으로서 F1EcoRI 프라이머와 LNot 프라이머(서열 번호 3)와 LA-Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분으로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 25 사이클의 PCR을 실시함으로써 증폭시켰다. 반응 종료 후, 인간 FGF23을 코딩하는 단편을 EcoRI와 NotI로 소화시킨 후 정제하였다. 이것을, 동물 세포 발현 벡터인 pEAK8(엣지 바이오시스템(Edge Biosystem)사)에 분자 내 리보좀 엔트리 서열(IRES)과 증강형 녹색 형광 단백질(EGFP)을 연결한 pEAK8/IRES/EGFP 벡터의 EcoRI와 NotI 제한 효소 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 취득한 플라스미드의 염기 서열을 결정하고, 인간 FGF23 단백질을 코딩하는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23이라 칭한다.

LNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(서열 번호 3)

( 실시예 2) 재조합체 인간 FGF23 단백질 및 재조합체 변이 인간 FGF23H 단백질의 발현

(1) pcDNA/hFGF23H를 벡터 중의 암피실린 내성 유전자 내에 있는 FspI 제한 효소 부위에서 절단하여 직쇄화하고, 정제하였다. CHO Ras 클론-1 세포(문헌[Shirahata, S., et al. Biosci Biotech Biochem, 59: 345-347, 1995])와 혼화하 여 진 펄서(Gene Pulser) II(바이오래드(Bio Rad)사)를 이용하여 전기 천공법으로 세포에의 유전자 도입을 행하였다. 이 세포를 10 ％ FCS를 포함하는 MEMα 배양액(깁코(Gibco) BRL사)에서 24 시간 배양한 후, 종지 농도 0.5 mg/ml가 되도록 제오신(Zeocin)(인비트로젠사)을 첨가하여 1 주간 배양하였다. 접착시켜 증식한 세포를 트립신으로 유리시키고, 종지 농도 0.3 mg/ml의 제오신 존재하에서 한계 희석법에 의한 클로닝을 행하여 클론화 세포를 복수개 얻었다. 이들 세포 중에서 인간 FGF23H 단백질을 가장 잘 발현하는 세포를 웨스턴 블로팅으로써 동정하였다. 각 클론화 세포의 배양 상청을 채취하여 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동을 행한 후, PVDF막(밀리포어(Millipore)사)에 단백질을 전사하고, 항 His-tag(카르복시 말단) 항체(인비트로젠사)와 ECL 발광 시스템(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)을 이용하여 약 32 kDa 부근의 FGF-23H 단백질에서 유래하는 시그널을 검출하였다. 그 결과, #20이라 칭하는 클론에 있어서 가장 높은 발현이 확인되고, 이것을 CHO-OST311H라 명명하여 2000년 8월 11 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(닛본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)에 기탁하였다(수탁 번호: FERM BP-7273). 본 명세서에서는, CHO-OST311H를 CHO-hFGF23H라 칭한다.

(2) 인간 FGF23 발현 세포의 취득

pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23 벡터의 CHO Ras 클론-1 세포에의 도입은 막 융합 지질을 이용한 유전자 도입법에 의해 행하였다. CHO Ras 클론-1 세포를 6-웰 플레이트 저면의 약 60 ％를 세포가 덮는 정도로 배양한다. 또한 배양액을 제거하고, 혈 청을 포함하지 않는 MEMα 배양액을 1 ml 첨가한다. 도입하는 벡터 2.5 μg과 10 μl의 트랜스팍탐(Transfectam)(등록 상표)(프로메가사)를 각각 50 μl의 혈청을 포함하지 않는 MEMα 배양액과 혼화하고, 양자를 혼합하여 10 분간 정치한 후, 양자를 혼합하여 미리 준비해 둔 6-웰 플레이트에 첨가하였다. 2 시간 배양한 후, 이 DNA를 포함하는 배양액을 제거하여 10 ％의 FCS를 포함하는 배양액으로 치환하여 철야 배양하였다. 다음날, 종지 농도가 5 μg/ml가 되도록 퓨로마이신(Puromycin)(시그마사)을 첨가하여 약제 내성 세포를 선택하였다. 이와 같이 하여 얻어진 약제 내성 세포는 한계 희석법으로 클론화를 행하였다. 또한 웨스턴 블롯에 의해 목적하는 단백질을 가장 잘 발현하는 세포주를 취득하였다. 이 세포를 CHO-hFGF23이라 칭한다.

(3) 재조합체 인간 FGF23 단백질의 동물 세포에서의 발현과 검출

CHO-hFGF23H의 배양 상청 중의 재조합체를 카르복시 말단의 His6-tag 서열에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 검출하면, 약 32 kDa의 밴드와 약 10 kDa의 밴드가 확인되었다. 이 2개의 밴드를 겔로부터 잘라내고, 아미노 말단측의 아미노산 서열을 결정한 결과, 분자량이 큰 약 32 kDa의 밴드는 서열 번호 4의 25번째로부터의 아미노산 서열이 검출되고, 인간 FGF23 단백질로부터 분비 과정에서 시그널 서열이 제거된 것이라고 생각되었다. 한편, 분자량이 작은 밴드에서는 서열 번호 4의 180번째로부터의 아미노산 서열이 확인되고, 179번째와 180번째 사이의 절단에 의해 생긴 카르복시 말단측 단편인 것으로 판명되었다. 또한, 인간 FGF23의 아미노 말단측을 인식하는 폴리클로날 항체를 이용하여 검출함으로써, 179번째부터 아 미노 말단측의 서열을 갖는다고 생각되는 폴리펩티드(아미노 말단측 단편)의 존재도 확인되었다(국제 공개 제WO02/14504호 공보).

동일하게 His6-tag 서열이 부가되지 않은 CHO-hFGF23의 배양 상청에 있어서도, 179번째와 180번째 아미노산 잔기 사이에서 절단되는 것을 확인하였다(국제 공개 제WO02/14504호 공보). 따라서, 절단되지 않은 활성체라고 생각되는 서열 번호 4의 25번째로부터 251번째 전장 인간 FGF23 단백질(FGF23 전장체라고 부르는 경우가 있음)을, 아미노 말단 또는 카르복시 말단측 단편과 분리하여 정제할 목적으로 이하의 조작을 행하였다.

(4) 재조합체 전장 인간 FGF23 단백질의 정제

CHO-hFGF23의 배양 상청을 기공 크기가 0.2 μm인 멤브레인인 수퍼캡(SuperCap)(등록 상표)(폴 겔만 래보래토리(Pall Gelman Laboratory)사)으로 여과하고, 여과된 용액을 SP-세파로스 FF(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)에 통과시켰다. 칼럼과의 친화성이 약한 물질을 50 mM의 pH 6.7의 인산나트륨 완충액으로 세정, 용출시켰다. 이 분획에 179번째와 180번째 사이에서 절단되어 생긴 카르복시 말단측의 단편이 포함되어 있었다. 칼럼에 의해 유지된 단백질을 0부터 0.7 M까지의 농도 구배의 NaCl로 용출시킨 결과, 약 0.3 M의 NaCl로 용출된 분획에서 전장 인간 FGF23 단백질이 확인되었다. 다음에 금속 친화성 칼럼인 탈론 수퍼플로우(Talon Superflow)(등록 상표)(클론텍(Clontech)사)에 흡착시킨 후, 50 mM의 pH 6.7의 인산나트륨 완충액으로 세정한 후, 이미다졸의 농도를 변화시켜 첨가하여 전장 인간 FGF23 단백질을 용출 정제하였다. 또한, 목적하는 단백질을 포함하는 분 획을 SP 세파로스 FF 칼럼에 흡착, 용출시켜 정제하였다.

인간 FGF23 아미노산 서열(서열 번호 4)

( 실시예 3) 인간 항체 생산 마우스( KM 마우스)의 제조

인간 모노클로날 항체 제조를 위한 완전 인간 항체를 생산하는 마우스는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대하여 호모 접합체의 유전적 배경을 가지지며 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 동시에 유지한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자를 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제조되었다. 계통 A는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대하여 호모 접합체이고, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통이고, 예를 들면 도미즈카 등의 보고(문헌[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 97:722-727, 2000])에 기재되어 있다. 또한, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대하여 호모 접합체이고, 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 유지하는 마우스 계통(트랜스제닉 마우스)이고, 예를 들면 피쉬와일드(Fishwild) 등의 보고(문헌[Nat Biotechnol., 14:845-851, 1996])에 기재되어 있다.

계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어진, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ 경쇄가 동시에 검출되는 개체(문헌[Ishida & Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000])를, 이하의 면역 실험에 이용하였다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스는 계약을 체결함으로써 기린 파마 가부시끼가이샤로부터 입수 가능하다.

(실시예 4) 인간 FGF23에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조

(1) 인간 FGF23에 대한 인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 취득

본 실시예에 있어서의 모노클로날 항체의 제조는, 문헌[단클론 항체 실험 조작 입문(안도 타미오 등 저자, 고단샤 발행 1991)] 등에 기재되는 것과 같은 일반적 방법에 따라서 제조하였다. 면역원으로서는, 실시예 2에서 제조한 전장 인간 FGF23 단백질을 이용하였다. 피면역 동물은 실시예 3에서 제조한 인간 면역 글로불린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 이용하였다.

우선 FGF23에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조를 목적으로 하여, 인간 항체 생산 마우스에, 실시예 2에서 제조한 정제 전장 인간 FGF23 단백질을 복강 내에 RIBI 어쥬번트(코릭사사)와 혼합하여 마우스당 20 μg을 첫회 면역시켰다. 첫회 면역과 동일하게 정제 FGF23과 RIBI 어쥬번트를 2 주간 간격으로 면역하여 총 3회 면역시켰다. 5 개체의 마우스에 면역시키고, 3회째 면역 후에 채혈하여, 혈청 중의 FGF23에 대한 인간 IgG 항체의 존재를 후술하는 효소 표지 면역 흡착 분석(ELISA)법에 의해서 확인하였다. 국제 공개 제WO03/057733호 공보에서 개시한 FGF23 단백질에 대한 마우스 모노클로날 항체 3C1E 항체(수탁 번호 FERM BP-7839의 하이브리도마가 생산하는 항 FGF23 항체)를 이용하여 고상화한 FGF23을 이용한 ELISA에서 가장 높은 값을 나타낸 혈청의 마우스를 선택하고, 이하에 서술하는 비장의 취득 3 일 전에, 전장 인간 FGF23 단백질 20 μg/마우스 개체를 꼬리 정맥 투여하였다.

면역된 마우스로부터 비장을 외과적으로 취득하여, 350 mg/mL 탄산수소나트륨, 50 단위/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM 배지(인비트로젠사(이하 「무혈청 DMEM 배지」라 함) 10 mL 중에 넣고, 메쉬(셀스트레이너: 팔콘사) 상에서 주걱(spatula)을 이용하여 으깨었다. 메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심 분리하여 세포를 침전시킨 후, 이 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세정하고 나서, 무혈청 DMEM 배지에 현탁시켜 세포수를 측정하였다. 한편, 10 ％ FCS(시그마사)를 포함하는 DMEM 배지(인비트로젠사)(이하, 「혈청 함유 DMEM 배지」라 함)로써, 37 ℃, 5 ％ 탄산 가스 존재하에서 세포 농도가 1×10⁶ 세포/ml를 넘지 않도록 배양한 골수종 세포 SP2/0(ATCC No.CRL-1581)을 동일하게 무혈청 DMEM 배지로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁시켜 세포수를 측정하였다. 회수한 비장 세포의 현탁액과 마우스 골수종 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하여 원심 분리 후, 상청을 완전히 제거하였다. 이 펠릿에, 융합제로서 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거 만하임사) 1 ml를, 피펫 끝으로 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37 ℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1 ml를 2회로 나누어 천천히 첨가하고, 추가로 7 mL의 무혈청 DMEM 배지를 첨가하였다. 원심 분리 후, 상청을 제거하여 얻어진 융합 세포를, 이하에 기재하는 한계 희석법에 의한 스크리닝에 사용하였다. 하이브리도마의 선택은 10 ％ FCS, IL-6(10 ng/mL)(또는 10 ％ 하이브리도마 클로닝 팩터(이하 「HCF」라 함: 바이오베이스사)) 및 히포크산틴(H), 아미노프테린(A), 티미딘(T)(이하, 「HAT」라 함: 시그마사)을 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양함으로써 행하였다. 또한, HT(시그마사), 10 ％ FCS, 10 ％ HCF를 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 한계 희석법에 의해 싱글 클론을 얻었다. 배양은 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트(벡톤-디킨슨사) 중에서 행하였다. 항 FGF23 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선택(스크리닝) 및 각각의 하이브리도마가 생산하는 인간 모노클로날 항체의 특징 부여는 후술하는 효소 표지 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 행하였다. 그 결과, 인간 면역 글로불린 γ쇄(hIgγ) 및 인간 면역 글로불린 경쇄 κ를 가지면서, 인간 FGF23에 특이적인 반응성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수개의 하이브리도마를 얻었다. 얻어진 다수개의 하이브리도마로부터, FGF23 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 특히 2개의 클론(C10 및 C15)을 얻었다. 또한, 본 실시예를 포함하여 이하의 어느 실시예 중에서는, 각각의 본 발명의 항 FGF23 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론은 기호를 이용하여 명명하였다. 또한, 상기 기호의 전후에 「항체」를 붙인 것은, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 상기 하이브리도마로부터 단리된 항체 유전자(전장 또는 가변 영역)를 유지하는 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 항체를 의미한다. 또한 문맥상 분명한 범위에서, 하이브리 도마 클론의 명칭이 항체의 명칭을 나타내는 경우가 있다. 하이브리도마 클론 C10은 2007년 2월 2일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(닛본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)에 수탁 번호 FERM BP-10772(식별을 위한 표시: C10)로서 기탁되어 있다.

(2) 하이브리도마 상청으로부터 C10 및 C15 항체의 정제

실시예 4(1)에서 얻어진 C10 및 C15 하이브리도마는 소 인슐린(5 μg/ml, 인비트로젠사), 인간 트랜스페린(5 μg/ml, 인비트로젠사), 에탄올아민(0.01 mM, 시그마사), 아셀레늄산나트륨(2.5×10^-5 mM, 시그마사), 1 ％ Low IgG 소태아 혈청(하이클론사) 함유 eRDF 배지(교쿠토 세이야꾸사)에서 순화시켰다. 플라스크에서 배양하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청을 단백질 G 페스트 플로우 겔(Fast Flow gel)(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)을 이용하고, 흡착 완충액으로서 PBS(-), 용출 완충액으로서 0.1 M 글리신 완충액(pH 2.8)을 이용하여 어피니티 정제하였다. 용출 분획은 1 M Tris(pH 9.0)를 첨가하여 pH 7.2 부근으로 조정하였다. 제조된 항체 용액은 세파덱스(Sephadex) G25 탈염 칼럼(NAP 칼럼; GE 헬스 케어 바이오사이언스사)을 이용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 μm의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사)로 여과 멸균하여 정제 C10 및 C15 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1.4 OD로서 1 mg/ml를 산출하였다.

( 실시예 5) C10 항체를 코딩하는 항체 유전자의 취득과 서열의 결정

(1) C10 항체의 cDNA 합성

C10 하이브리도마에서 발현되는 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 항체의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 취득하기 위해서, 인간 항체 중쇄 및 경쇄 각각의 정상 영역에 특이적인 프라이머를 이용한 5' RACE(5'-cDAN 말단 신속 증폭 기술(5' rapid amplification of cDNA ends))법에 의한 클로닝을 행하였다. 구체적으로는 BD 스마트 레이스(SMART RACE) cDNA 증폭 키트(벡톤ㆍ디킨슨ㆍ바이오사이언스ㆍ클론텍사)를 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서 실시하였다.

cDNA 합성의 재료로서는, C10 하이브리도마에 RNA 추출용 시약인 이소젠(ISOGEN)(닛본 진사)을 첨가하여, 취급 설명서에 따라서 토탈 RNA 15 μg을 정제하였다. 정제한 토탈 RNA로부터 각 약 1 μg을 주형으로서 이용하여, 제1 가닥 cDNA를 제조하였다. RNA 이외의 시약 및 효소류는 BD 스마트 레이스 cDNA 증폭 키트 부속의 것을 사용하였다.

제1 가닥 cDNA의 합성은

토탈 RNA 1 μg/3 μl

5' CDS 1 μl

스마트 올리고(SMART Oligo) 1 μl

상기 조성의 반응액을 70 ℃에서 2 분간 인큐베이팅한 후,

5×완충액 2 μl

DTT 1 μl

dNTP 믹스 1 μl

파워 스크립트 리버스 트랜스크립타제(PowerScript Reverse Transcriptase) 1 μl

를 첨가하여 42 ℃에서 1.5 시간 인큐베이팅하였다.

또한, 50 μl의 트리신-EDTA 완충액을 첨가한 후, 72 ℃에서 7 분간 인큐베이팅하여 제1 가닥 cDNA를 취득하였다.

(2) PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭과 염기 서열의 확인

(2)-1; PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭

C10 항체를 코딩하는 유전자의 cDNA를 증폭시키기 위해서, 인간 항체 특이적 서열을 갖는 3' 프라이머(구체적인 서열은 후술함)와 BD 스마트 레이스 cDNA 증폭 키트에서 합성된 cDNA의 5' 말단에 부가되는 서열에 특이적으로 혼성화하는 5' 프라이머 (유니버셜 프라이머(Universal primer) A 믹스)를 PCR용 프라이머 세트로서, 또한 PCR용 효소로서 KOD-플러스-DNA 폴리머라제(도요보사)를 이용하여, 하기 반응액을 제조하여 PCR에 사용하였다.

살균 H₂O 28 μl

제1 가닥 cDNA 2.5 μl

KOD-플러스-완충액(10X) 5 μl

dNTP 믹스(2 mM) 5 μl

MgSO₄(25 mM) 2 μl

KOD-플러스-(1 단위/ μl) 1 μl

유니버셜 프라이머 A 믹스(UPM)(10X) 5 μl

유전자 특이적 프라이머(GSP)(10 μm) 1.5 μl

총 부피 50 μl

중쇄 유전자의 증폭 반응에는, 스마트 레이스 cDNA 증폭 키트 부속의 UPM 프라이머와 IgG1p 프라이머(서열 번호 5)를 이용하고, 다른 한편, 경쇄 유전자의 증폭에는 UPM 프라이머와 hk-2(서열 번호 6) 프라이머의 각 세트를 사용하였다.

IgG1p: TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG(서열 번호 5)

hk-2: GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC(서열 번호 6)

또한 반응 온도 조건은 다음과 같다.

94 ℃/30 초간, 72 ℃/3 분간의 사이클을 5회 반복,

94 ℃/30 초간, 70 ℃/30 초간, 72 ℃/3 분간의 사이클을 5회 반복,

94 ℃/30 초간, 68 ℃/30 초간, 72 ℃/3 분간의 사이클을 25회 반복하였다.

또한, 이 반응액 2 μl에 트리신-EDTA 완충액 98 μl를 첨가하여 희석한 것 5 μl를 주형으로 하고, 제2(네스트) PCR을 실시하였다. PCR 반응 용액의 조성을 다음에 나타내었다.

살균 H₂O 30 μl

제1 PCR 반응액(50배 희석) 5 μl

KOD-플러스-완충액(10X) 5 μl

dNTP 믹스(2 mM) 5 μl

MgSO₄(25 mM) 2 μl

KOD-플러스-(1 단위/ μl) 1 μl

네스팅된 유니버셜 프라이머(Nested Universal primer)A(NUP; 10 μm) 1 μl

유전자 특이적 프라이머(GSP)(10 μm) 1 μl

총 부피 50 μl

상기 반응의 프라이머 세트로서, 중쇄 유전자 증폭용의 경우에는, NUP 프라이머(스마트 레이스 cDNA 증폭 키트 부속; 벡톤ㆍ디킨슨ㆍ바이오사이언스ㆍ클론텍사)와 hh2 프라이머(서열 번호 7)를 사용하고, 또한 경쇄 유전자 증폭의 경우에는, NUP 프라이머와 hk-5 프라이머(서열 번호 8)를 이용하였다. 반응 온도 조건으로서는, 94 ℃의 초기 온도에서 1 분간 후, 94 ℃/5 초간, 68 ℃/10 초 및 72 ℃/3 분간의 사이클을 20회 반복, 마지막으로 72 ℃/7 분간의 가열을 행하였다.

hh2: GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC(서열 번호 7)

hk-5: AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC(서열 번호 8)

(2)-2; 항체 유전자의 염기 서열 결정

증폭된 중쇄 PCR 단편(이하 HV[C]라 기재: H쇄의 5' 비번역 영역-리더 서열, 가변 영역(HV) 및 정상 영역의 일부([C])로 구성됨), 및 경쇄의 PCR 증폭 단편(이하 LV[C]라 기재: L쇄의 5' 비번역 영역-리더 서열, 가변 영역(LV) 및 정상 영역의 일부([C])로 구성됨)은, 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 회수하여, 멤브레인을 이용하는 DNA 정제 키트인 QIA퀵 겔 추출 키트(퀴아겐사 제조)로 정제하였다. 정제한 HV[C] 증폭 단편 또는 LV[C] 증폭 단편은 각각 제로 블런트(Zero Blunt) TOPO PCR 클로닝 키트(Cloning Kit)(인비트로젠사 제조)의 PCR 4 블런트-TOPO 벡터에 서브클로닝을 행하고, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대하여 인서트 DNA의 염기 서열을 해석하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해 프라이머로서 M13-20FW(서열 번호 9) 및 M13RV(서열 번호 10)를 이용하였다.

M13-20FW: GTAAAACGAC GGCCAGTG(서열 번호 9)

M13RV: CAGGAAACAGCTATGAC(서열 번호 10)

C10 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 염기 서열, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.

<C10 중쇄 핵산 서열>(ATG 개시 코돈으로부터 가변 영역 카르복시 말단 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열까지)(서열 번호 11)

<C10 중쇄 아미노산 서열>(리더 서열 및 가변 영역까지)(서열 번호 12)

(하선으로 나타내는 아미노산 잔기는 분비 시그널이 되는 리더 서열을 나타 냄)

<C10 경쇄 핵산 서열>(ATG 개시 코돈으로부터 가변 영역 카르복시 말단 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열까지)(서열 번호 13)

<C10 경쇄 아미노산 서열>(리더 서열 및 가변 영역까지)(서열 번호 14)

(하선으로 나타내는 아미노산 잔기는 분비 시그널이 되는 리더 서열을 나타냄)

또한, PCR 4 블런트-TOPO 벡터에 서브클로닝한 C10 항체의 유전자 서열에는, 인간 항체 서열의 정상 영역도 일부 클로닝되기 때문에, 그 영역에 대해서도 DNA 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 카밧(Kabat) 등에 의한 EU 인덱스에 의해 나타내어지는 중쇄 정상 영역의 118번째로부터 191번째의 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 확인할 수 있고, 그 영역에서 인간 IgG1의 아미노산 서열과 완전히 일치하여, C10 항체의 서브클래스는 IgG1인 것으로 판명되었다. 또한 동일한 방법을 이용하여, C15 항체를 코딩하는 항체 유전자의 취득과 서열의 결정도 행하였다.

(실시예 6) 재조합 C10 항체 발현 벡터의 구축

C10 항체 발현 벡터의 제조(도 1에 공정도를 나타냄)

취득한 C10 항체의 LV[C]쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로서, 말단에 연결을 위한 제한 효소 부위(5' 말단 BglII, 3' 말단 BsiWI)를 부가하도록 디자인한 프라이머, C10_L5_Bgl(서열 번호 15) 및 C10_L3_Bsi(서열 번호 16)를 이용하여, C10 항체의 LV(경쇄의 리더 서열+가변 영역)의 DNA를 KOD-플러스-DNA 폴리머라제에 의한 PCR로 증폭시켰다. 반응 온도 조건으로서는, 94 ℃의 초기 온도에서 1 분간 가열 후, 94 ℃/5 초간과 68 ℃/45 초간의 사이클을 35회 반복하고, 마지막으로 72 ℃/7 분간의 가열을 행하였다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 BglII와 BsiWI 로 소화시켜, 아가로스 겔 전기 영동으로 약 400 bp의 DNA를 회수하여 정제하였다. 다른 한편, 벡터인 N5KG1-Val Lark 벡터(IDEC 파마슈티칼스(Pharmaceuticals), N5KG1(미국 특허 제6001358호)의 개변 벡터)에 대해서는 동일하게 제한 효소 BglII, BsiWI 처리를 순차로 행한 후, 탈인산화 처리로서 알칼리 포스파타제(대장균 C75)(다까라 슈조사) 처리한 후에, 아가로스 겔 전기 영동과 DNA 정제 키트로 약 9 kb보다 약간 작은 DNA를 회수하였다. 이들 2개의 단편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 라이게이션하고, 대장균 DH10B에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 인서트 DNA를 포함하는 형질 전환체의 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 염기 서열을 해석하고, N5KG1-Val Lark에 C10 항체의 LV가 N5KG1-Val Lark의 인간 항체 경쇄 정상 영역을 코딩하는 5' 상류에 골조를 갖추어(in-frame)에 삽입된 플라스미드 DNA, N5KG1_C10_Lv를 취득하였다. 이어서, LV가 삽입된 플라스미드 벡터(N5KG1_C10_Lv)에 C10 항체의 HV(중쇄의 리더 서열+가변 영역)의 삽입을 행하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터에 서브클로닝한 C10 항체의 HV[C]를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로서, 말단에 연결을 위한 제한 효소 부위(5' 말단 SalI, 3' 말단 NheI)를 부가하도록 디자인한 프라이머, C10_H5_Sal(서열 번호 17) 및 C10_H3_Nhe(서열 번호 18)를 이용하여 HV를 PCR로 증폭시켰다. 반응 온도 조건으로서는, 94 ℃의 초기 온도에서 1 분간의 가열 후, 94 ℃/5 초간과 68 ℃/45 초간의 사이클을 35회 반복하고, 마지막으로 72 ℃/7 분간의 가열을 행하였다. 정제한 HV의 증폭 DNA 단편을 PCR4Blunt-TOPO 벡터에 서브클로닝을 행하여, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대하여 인서트 DNA의 염기 서열을 해석하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해서 프라이 머로서, 상기 M13-20FW 및 M13RV를 이용하였다. 서브클론에 대하여 삽입 부분의 DNA 염기 서열 해석을 행하여, 주형으로 한 HV와 차이가 없고, 또한 프라이머 부분도 디자인 그대로의 서열을 갖는 플라스미드 DNA(TOPO_C10_Hv)를 선택하였다. 그 DNA를 제한 효소 SalI와 NheI로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 약 420 bp의 DNA를 회수하여 정제하고, 동일하게 제한 효소 처리(SalI와 NheI)와 탈인산화 처리한 N5KG1_C10_Lv의 DNA(약 9 kb)에 T4 DNA 리가제를 이용하여 라이게이션한 후, 대장균 DH10B에 도입하여 얻어진 형질 전환체로부터 목적하는 플라스미드 DNA를 선택하였다. 이렇게 해서 얻어진 항체 발현 플라스미드 DNA, N5KG1_C10_LH(클론 #1)의 대량 정제를 행하여, L쇄 전체 영역과 H쇄 전체 영역 및 그 삽입 부위 주변의 DNA 염기 서열에 클로닝 공정에서의 변이가 없는 것을 확인(도 2 및 도 3)하였다. DNA 염기 서열의 확인에는, 또한 서열 번호 19 내지 25의 각 프라이머를 사용하였다. 완성된 C10 항체 발현 벡터의 간단한 맵을 도 4에 나타내었다. 또한 동일한 방법을 이용하여 재조합 C15 항체 발현 벡터의 구축을 행하였다.

C10_L5_Bgl: AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT(서열 번호 15)

C10_L3_Bsi: AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC(서열 번호 16)

C10_H5_Sal: AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC(서열 번호 17)

C10_H3_Nhe: AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC(서열 번호 18)

hh-4: GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG(서열 번호 19)

hh-1: CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC(서열 번호 20)

CMVH903F: GACACCCTCATGATCTCCCGGACC(서열 번호 21)

CMVHR1303: TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT(서열 번호 22)

SEQU4618: TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC(서열 번호 23)

hk-1: TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC(서열 번호 24)

SEQU1783: GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA(서열 번호 25)

(실시예 7) 재조합 C10 항체의 제조

구축한 C10 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 C10 항체 발현 세포를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포에는, 디히드로폴레이트 환원 효소(DHFR) 결손의 CHO DG44 세포(이하 CHO 세포라 표기, IDEC 파마슈티칼스사)를 무혈청 배지인 EX-CELL 325-PF 배지(2 mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 히포크산틴 및 티미딘(HT) 서플리먼트(1:100)(인비트로젠사)를 함유. JRH사)에 순화된 세포주를 이용하였다. 숙주 세포에의 벡터 도입은 전기 천공에 의해 실시하였다. 전기 천공은 C10 항체 발현 벡터 약 2 μg을 제한 효소 AscI로 선상화하고, 바이오래드 전기 천공기를 이용하여 350 V, 500 μF의 조건에서 4×10⁶개의 CHO 세포에 유전자를 도입하여 96웰 배양 플레이트에 파종하였다. 벡터의 도입 처리 후, G418을 첨가하여 배양을 계속하였다. 콜로니를 확인한 후, 항체 발현주를 선별하였다. 선택한 CHO 세포주를 EX-CELL325-PF 배지(2 mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 히포크산틴 및 티미딘(HT) 서플리먼트(1:100)(인비트로젠사)를 함유)로 5 ％ CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양 상청을 맵셀렉트(Mabselect) 단백질 A 칼럼(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)에 흡착 후, PBS로 세정하고, 20 mM 시트르산-Na, 50 mM NaCl(pH 3.4) 완충액으로 용출시켰다. 용출액은 50 mM pH 7.0의 인산-Na으로 중화시켰다. 이온 교환수로 약 1.5배로 희석하여 전도도를 4.0 ms/cm 이하로 제조하였다. 다음에, Q-세파로스(히트랩(Hitrap) Q HP, GE 헬스 케어 바이오사이언스사)와 SP-세파로스(히트랩 SP FF, GE 헬스 케어 바이오사이언스사)를 연결한 칼럼에, 샘플을 차징하여 흡착시키고, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 세정 후, PBS(-)로 용출시켰다. 제조된 항체 용액은 공경 0.22 μm의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사)로 여과 멸균하였다. 정제된 C10 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/ml를 1.4 OD로서 산출하였다. 또한, 동일한 방법으로 재조합 C15 항체의 제조를 행하였다.

( 실시예 8) 카니쿠이잘 FGF23 단백질 발현 벡터의 구축

카니쿠이잘 FGF23 단백질 발현 벡터의 구축

카니쿠이잘의 EDTA 첨가 정맥혈에 PBS(-)로 현탁시킨 5 ％ 덱스트란(Dextran) T-2000(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)을 2:1의 비율로 혼화하고, 적혈구를 침전시킨 후에 상청을 림프구 분리액(Ficoll-Paque)(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)에 중층하고, 원심 분리함으로써 림프구 분획을 얻었다. 얻어진 림프구를 이소젠-LS(닛본 진사)에 현탁시켜, 첨부된 프로토콜에 따라서 카니쿠이잘 림프구 총 RNA를 얻었다. 이 카니쿠이잘 림프구 총 RNA로부터 제1 가닥 cDNA 합성 키트(인비트로젠사)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 카니쿠이잘 림프구 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 카니쿠이잘 FGF23을 코딩하는 cDNA는 카니쿠이잘 림프구 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 원숭이FGF23FW 프라이머(서열 번호 26)와 원 숭이FGF23RV 프라이머(서열 번호 27)와 KOD 플러스 DNA 폴리머라제(도요보사)를 이용하여 94 ℃에서 5 분간 보온한 후, 94 ℃에서 20 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 50 초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 45 사이클의 PCR을 실시함으로써 증폭시켰다. 원숭이FGF23FW 프라이머는 인간 FGF23을 코딩하는 염기 서열의 5'측 상류에 존재하는 서열에 어닐링하고, 그 증폭 단편의 FGF23을 코딩하는 영역의 5'측에 EcoRI 제한 효소 부위를 부가한다. 원숭이FGF23RV 프라이머는 인간 FGF23을 코딩하는 서열의 종지 코돈을 포함하는 서열에 어닐링하는 서열과 NotI 제한 효소 서열을 포함한다. 이 증폭 단편을 EcoRI와 NotI로 소화시키고, 발현 벡터인 pEAK8(엣지 바이오시스템사)에 분자 내 리보좀 엔트리 서열(IRES)과 증강형 녹색 형광 단백질(EGFP)을 연결한 pEAK8/IRES/EGFP 벡터의 EcoRI와 NotI 제한 효소 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 취득한 플라스미드의 염기 서열을 결정하고, 카니쿠이잘 FGF23 단백질을 코딩하는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pEAK8/IRES/EGFP/원숭이FGF23이라 칭한다. 또한, 본 실시예에 의해서 얻어진 카니쿠이잘 FGF23의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 서열 번호 28 및 29에 각각 기재한다.

원숭이FGF23FW: CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT(서열 번호 26)

원숭이FGF23RV: ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC(서열 번호 27)

카니쿠이잘 FGF23 핵산 서열(서열 번호 28)

카니쿠이잘 FGF23 아미노산 서열(서열 번호 29)

(2) 카니쿠이잘 FGF23 발현 세포 상청의 제조

pEAK8/IRES/EGFP/원숭이FGF23을 PEAK 래피드(rapid) 세포(엣지 바이오시스템사)에 인산칼슘법에 의해 일과성으로 도입하고, 그의 발현 배양 상청을 얻었다.

(실시예 9) 카니쿠이잘 FGF23에의 C10 항체의 결합성 검증

C10 항체가 인간 FGF23뿐 아니라 카니쿠이잘 FGF23에 동일하게 결합하는 것을 샌드위치 ELISA를 이용한 이하의 방법으로 조사하였다. 실시예 4에서 제조한 C10 항체, 2C3B 항체 및 인간 IgG1 대조군 항체를 50 mM NaHCO₃의 용액에서 5 μ g/ml의 농도로 희석하여, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(막시소프(Maxisorp)(등록 상표), 넌크(Nunc)사)의 각 웰에 첨가하고, 4 ℃에서 12 시간 인큐베이팅하여 C10 항체, 2C3B 항체 및 대조군으로서 인간 IgG1 대조군 항체를 마이크로플레이트에 흡착시켰다. 다음에 이 용액을 제거하고, 각 웰에 블록킹 시약(수퍼블록크(SuperBlock)(등록 상표) 블록킹 완충액, 피어스(PIERCE)사)을 첨가하여 실온에서 30 분간 인큐베이팅한 후, 각 웰을 0.1 ％의 트윈(Tween)20을 함유하는 트리스 완충 식염수(T-TBS)으로 2회 세정하였다. 이와 같이 항 FGF23 항체를 코팅한 마이크로플레이트의 각 웰에, 실시예 2에서 정제한 전장 인간 FGF23 단백질 또는 실시예 8에서 제조한 카니쿠이잘 FGF23 발현 세포 상청을 적당한 농도로 희석하여 각 웰에 첨가하고, 고상화 항체와 2 시간 반응시킨 후, 각 웰을, 0.1 ％의 트윈20을 함유하는 트리스 완충 식염수(T-TBS)으로 2회 세정하였다. 이어서, 각 웰에 비오틴 표지한 3 μg/mL의 3C1E 항체를 실온하에서 1.5 시간 인큐베이팅하여, 고상화 항체에 결합한 인간 또는 카니쿠이잘 FGF23에 비오틴 표지한 3C1E 항체를 결합시켰다. T-TBS로 세정 후, 5000배로 희석한 허스래디시 페록시다제 표지 스트렙트아비딘(DAKO사)을 1 시간 반응시킨 후, T-TBS로 3회 세정하였다. 다음에 테트라메틸벤지딘(DAKO사)을 포함하는 기질 완충액을 각 웰에 첨가하고, 실온하에서 30 분간 인큐베이팅하였다. 이어서, 0.5 M 황산을 각 웰에 첨가하고, 반응을 중지시켰다. 기준 파장을 570 nm로 하여 파장 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(MTP-300, 코로나 덴끼사)로 측정하였다. 인간 전장 FGF23 단백질 및 카니쿠이잘 FGF23 발현 배양 상청을 동일하게 공비 3배로 희석하였을 때의 반응성을 비교하 였다. 이 때의 결과를 도 5A 및 B에 나타내었다. 도 5A의 결과로부터 분명한 바와 같이, C10 항체 또는 2C3B 항체를 고상화하였을 때, 인간 전장 FGF23 단백질에의 반응성은 동일한 정도였다. 이 조건에서, 카니쿠이잘 FGF23 발현 배양 상청의 희석 계열에 대한 반응성에 대하여, C10 항체와 2C3B 항체에 큰 차이는 관찰되지 않았다(도 5B). 즉, C10 항체는 2C3B 항체와 동일하게 인간 및 카니쿠이잘 FGF23과 결합성을 갖는 것이 증명되었다.

( 실시예 10) C10 항체와 2 C3B 항체의 정상 카니쿠이잘의 혈 중 인 농도 및 혈 중 1α, 25- 디히드록시비타민 D 농도에 대한 작용의 비교

FGF23은 마우스에 있어서 신장으로부터 인을 배설하여 혈청 인 농도를 감소시키고, 또한 신장에 있어서의 비타민 D 활성화 효소를 저해하여 혈 중 1α,25-디히드록시비타민 D 농도(이하 1,25D라 함)를 감소시키는 작용을 갖는다(국제 공개 제WO02/14504호 공보). 2C3B 항체 등 FGF23에 대하여 억제 작용, 즉, 중화 활성을 갖도록 하는 항체를 정상 마우스에 투여하면, 내재성 FGF23의 작용이 억제되어, 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도가 상승하는 것이 개시되어 있다(국제 공개 제WO03/057733호 공보). 따라서 FGF23에 대한 중화 활성을 갖는 항체는 FGF23에서 유래하는 종양성 골연화증, XLH 등을 포함하는 인간의 질환에 있어서 치료 효과를 갖는 것이 강하게 시사된다. 따라서, 본 연구에 있어서 취득된 인간 항체인 C10 항체의 생체 내에서의 FGF23 중화 활성을 검토하였다. 특히, 인간에서의 약리 효과를 기대하기 때문에 설치류 등에 비하여, 진화상 인간에 가까운 동물종인 원숭이의 내재성 FGF23의 기능을 억제하고, 그의 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도의 상 승을 지표로 하여 중화 활성능을 측정하였다. C10 항체의 비교 대조로서, 마우스 항체인 2C3B 항체를 이용하여 실험을 행하였다.

C10 항체와 2C3B 항체의 혈청 인 농도 상승 작용을, 무처치의 정상 카니쿠이잘을 이용하여 이하의 방법으로 비교하였다. C10 항체는 실시예 4에서 제조한 것을 이용하였다. 실험 동물에는, 체중 2 내지 4 kg의 2 내지 3세 암컷 카니쿠이잘을 매체 투여군, 2C3B 항체 투여군은 군당 3 마리씩, C10 항체를 투여한 군은 4 마리 사용하였다. C10 항체 및 2C3B 항체는 각각 PBS(-)로 3 mg/mL의 농도로 제조하고, 투여액으로 하였다. 음성 대조에는, 매체인 PBS(-)를 이용하였다. C10 항체 및 2C3B 항체는 각각 3 mg/kg이 되도록 1 mL/kg의 용량으로 상완 요측피 정맥(brachial cephalic vein) 으로부터 1 mL/분의 유속으로 단회 투여하였다. 혈청 인 농도는 L 타입 와코 무기인(와코 준야꾸 고교사) 시약을 이용하여 히타치 자동 분석 장치 7180(히타치 세이사꾸쇼사)로 측정하였다. 혈청 1,25D 농도는 1,25(OH)₂D RIA 키트「TFB」(이뮤노다이아그노스틱 시스템즈(Immunodiagnostic Systems)사)를 이용하여 측정하였다. 측정은 항체 투여 후, 0.5, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49 일째에 각각 행하였다. 데이터는 평균값+/-표준 오차로 나타내었다. 각 항체 투여 후의 경시적 채혈에 의한 혈청 인 농도의 10 일째까지의 추이를 도 6에 나타내었다. PBS(-) 투여군에서는, 혈청 인 농도는 시험 기간 동안 거의 일정한 농도이었던 것에 대하여, C10 항체 투여군 및 2C3B 항체 투여군에서는, 투여 전 및 PBS(-) 투여군과 비교하여 분명한 혈청 인 농도의 상승이 확인 되었다. C10 항체 투여군 및 2C3B 항체 투여군 모두, 가장 높은 혈청 인 농도가 확인된 시기는 모두 항체 투여 후 5 일째이고, 이 때의 혈청 인 농도는 PBS(-) 투여군, 2C3B 항체 투여군 및 C10 항체 투여군에서 각각 5.28 mg/dl, 8.10 mg/dl, 9.59 mg/dl이었다. 이 항체 투여 후 5 일째의 2C3B 항체 투여군과 C10 항체 투여군의 혈청 인 농도에 대하여 동 시기의 PBS(-) 투여군의 혈청 인 농도로부터의 상승값을 비교하면, 2C3B 투여군의 혈청 인 농도가 2.82 mg/dl인 것에 대하여, C10 항체 투여군에서는 4.31 mg/dl이고, C10 항체는 2C3B 항체에 비해 약 1.5배 이상 혈청 인 농도를 높게 유도하였다(도 7). 이와 같이, C10 항체 투여군의 혈청 인 농도 상승 작용은, 2C3B 항체 투여군에 비교하여, 현저히 높았다. 또한, 2C3B 항체 투여군의 혈청 인 농도는 투여 후 10 일째에 PBS(-)의 혈청 인 농도와 동등한 값이 되었지만, C10 항체 투여군의 혈청 인 농도(8.76 mg/dl)는 여전히 2C3B 항체 투여군의 최고가(8.10 mg/dl)보다 높은 값을 유지하고 있었다(도 6). 또한, C10 항체에 의한 혈청 인 농도의 상승 지속 기간은 2C3B 항체에 의한 것보다 훨씬 길고, PBS(-) 투여군과의 유의차를 갖는 상승 기간이 2C3B에서 7 일간이었던 것에 대하여, C10 항체에서는 놀랍게도 35 일간으로 지속 기간이 약 5배나 길어졌다. 동일하게, 항체 투여 후의 1,25D 농도에 대해서도, 2C3B 항체에 비교하여 C10 항체는 현저한 상승 및 그 지속 기간의 연장을 나타내었다(도 8). 이 결과는, 기존의 FGF23 중화 항체인 2C3B 항체와 비교하여, 카니쿠이잘에 있어서 C10 항체는 보다 강력한 혈청 인 농도 상승 및 혈청 1,25D 상승 작용을 갖는, 즉, 강력한 FGF23 중화 활성을 갖는 것을 나타내었다. 현재, XLH 등에 있어서의 저인혈증성 구루병의 현재 치료에 있어서는 하루에 복수회의 인이나 비타민 D 제제의 대량 투여를 행하여, 간신히 정상 영역의 인 농도로 유지하는 치료가 행해지고 있다. 번번한 복용 순응도도 나쁘다고 하는 보고도 있다. 본 연구에서의 C10 항체의 단회 투여에 있어서, 혈청 인 농도, 혈청 1,25D 농도의 지속적인 상승 작용이 관찰된 것은, 저인혈증 치료약으로서 현재 치료에 비해, C10 항체가 현저한 우위성을 갖는 치료라는 가능성이 시사되었다.

(실시예 11) C15 항체의 인간 및 카니쿠이잘 FGF23에의 반응성 확인

실시예 1에서 제조한 pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23 또는 실시예 8에서 제조한 pEAK8/IRES/EGFP/원숭이FGF23을 PEAK 래피드 세포(엣지 바이오시스템사)에 인산칼슘법에 의해 일과성으로 유전자를 도입하였다. 도입으로부터 3 일째에 각 배양 상청을 회수하고, 일차 항체로서 실시예 13에서 제조한 C15 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 행하였다(도 9). 그 결과, C15는 카니쿠이잘 FGF23도 인간 FGF23과 동일하게 결합하는 것이 개시되었다.

(실시예 12) C10 항체와 C15 항체의 정상 카니쿠이잘의 혈 중 인 농도 및 혈 중 1α, 25 디히드록시비타민 D 농도에 대한 작용의 비교

실시예 11에 의해서 C15 항체가 C10 항체와 동일하게, 인간 및 카니쿠이잘 FGF23 재조합 단백에 대하여 결합 활성을 갖는 것을 개시되었다. 따라서, C10 항체 및 C15 항체에 대하여, 정상 카니쿠이잘에 투여하여, 생체 내에서의 FGF23 중화 활성을 비교하였다. 카니쿠이잘 내재성 FGF23에 대한 중화 활성의 평가는 혈청 인 농도 상승을 지표로서 실시하였다. C10 항체 또는 C15 항체는 실시예 7에서 제조 한 것을 이용하였다. 실험 동물은, 2 내지 3세, 체중 2 내지 3 kg의 정상 카니쿠이잘을 사용하여 1군당 수컷 2 마리, 암컷 1 마리의 총 3 마리로 하였다. 희석 매체에는 PBS(-)를 사용하고, C10 항체는 1 mg/mL 및 3 mg/mL, C15 항체는 3 mg/mL의 농도가 되도록 제조하였다. C10 항체는 투여량이 1 mg/kg 및 3 mg/kg이 되도록, 또한 C15 항체는 3 mg/kg이 되도록, 1 mL/kg의 용량으로 복재(saphenous) 정맥으로부터 약 1 mL/분의 유속으로 단회 투여하였다. 혈청 인 농도는 L 타입 와코 무기인(와코 준야꾸 고교사) 시약을 이용하여 히타치 자동 분석 장치 7180(히타치 세이사꾸쇼사)로 측정하였다. 채혈은 항체 투여 전 및 투여 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28 일 후에 실시하고, 모든 채혈 포인트에 대하여 혈청 인 농도의 측정을 행하였다. C10 항체 1 mg/kg군, C10 항체 3 mg/kg군 및 C15 항체 3 mg/kg군의 항체 투여 전의 혈청 인 농도는 각각 5.37, 5.70 및 5.58 mg/dL이고, 군간의 차는 없었다. 투여 후, 모든 카니쿠이잘에서 혈청 인 농도의 상승이 확인되고, C10 항체뿐 아니라 C15 항체도 카니쿠이잘 내재성 FGF23에 대하여 중화 활성을 갖는 것이 개시되었다. C10 항체 1 mg/kg군, C10 항체 3 mg/kg군 및 C15 항체 3 mg/kg군 각각의 혈청 인 농도는 투여 3 일 후에 9.03, 9.10 및 8.64 mg/dL였다. 이 때, C10 항체 1 mg/kg군 및 C15 항체 3 mg/kg군의 혈청 인 농도는 최고가를 나타내었다. 한편, C10 항체 3 mg/kg군의 혈청 인 농도는 더욱 상승하여 투여 5 일 후에 최대값을 나타내고, 그 값은 9.75 mg/dL였다. 투여 전후의 혈청 인 농도의 최대 상승폭은 C10 항체 1 mg/kg군, C10 항체 3 mg/kg군 및 C15 항체 3 mg/kg군에서 각각 3.67, 4.65 및 3.06 mg/dL가 되었다. 이 결과로부터, 3 mg/kg의 동 용량에 있어서는, C10 항 체가 C15 항체에 비하여, 혈청 인 농도 상승 작용이 강한 것으로 나타났을 뿐 아니라, 놀랍게도 1 mg/kg 용량의 C10 항체는 3 mg/kg의 C15 항체보다 혈 중 인 농도를 상승시켰다. 다음에, 투여 전과 비교하여 혈청 인 농도가 상승한 기간을 비교하였다. 그 결과, C10 항체 1 mg/kg군, C10 항체 3 mg/kg군 및 C15 항체 3 mg/kg군에서 각각 14, 28 및 7 일간이 되었다. 이 결과로부터, 3 mg/kg의 동 용량에 있어서는, C10 항체가 C15 항체에 비하여, 혈청 인 농도 상승 작용을 지속하는 것이 나타났을 뿐 아니라, 놀랍게도 1 mg/kg 의 용량의 C10 항체는 3 mg/kg의 C15 항체보다 혈 중 인 농도를 장기간에 걸쳐 높은 값으로 유지하였다. 이상의 결과로부터, C10 항체는 C10 항체와 동시에 취득한 C15 항체에 비교하여 카니쿠이잘에 있어서의 혈청 인 농도 상승 작용 및 혈청 인 상승 지속 작용이 강한 것이 분명해졌다. 즉, C10 항체는 C15 항체에 비하여 카니쿠이잘 FGF23에 대한 중화 활성이 현저히 강한 것이 분명해졌다.

(실시예 13) 인간 FGF23 DNA 단편(시그널 서열 없음)의 제조

KOD-플러스-DNA 폴리머라제(도요보사)를 이용하여 첨부 문서에 따라서 반응액을 제조하고, 50 μl 반응액 중에 FGF23(-SP) FW 프라이머(서열 번호 34)와 FGF23(-SP) RV 프라이머(서열 번호 35)를 각 15 pmol, 주형으로서 인간 FGF23-cDNA(개시 코돈으로부터 종지 코돈을 포함하는 756 bp 서열 번호 36)를 첨가하여 94 ℃ 3 분 보온한 후, 98 ℃ 15 초, 63℃ 15 초 및 68 ℃ 2 분 30 초를 1 사이클로 하여 30 사이클 증폭시키고, 72 ℃ 3 분 보온하였다. 얻어진 684 bp의 증폭 단편을 0.8 ％ 겔로 분리 회수하였다. 회수된 겔로부터 QIA퀵 겔 추출 키트(퀴아겐 사)를 이용하여 첨부 문서에 따라서 증폭 단편을 회수하였다. 회수된 PCR 증폭 단편을 FseI(뉴ㆍ잉글랜드ㆍ바이오랩ㆍ재팬사)로 효소 소화시키고, QIA퀵 PCR 정제 키트(퀴아겐사)를 이용하여 첨부 문서에 따라서 효소 처리 단편을 회수하였다. 그 결과, 인간 FGF23의 시그널 서열을 포함하지 않는 성숙(mature)체 부분에 상응하는 부분 DNA 단편을 얻었다.

FGF23(-SP) FW: TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG(서열 번호 34)

FGF23(-SP) RV: TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG(서열 번호 35, FseI 사이트 포함함)

인간 FGF23 염기 서열(시그널 서열 부분을 하선, 전장체로부터 시그널 서열 부분을 제외한 성숙체 부분을 포위선으로 나타낸다.)(서열 번호 36)

서열 번호 36을 기준으로 한 인간 FGF23 아미노산 서열(시그널 서열 부분을 하선, 전장체로부터 시그널 서열 부분을 제외한 성숙체 부분을 포위선으로 나타낸다.)(서열 번호 37)

(실시예 14) pPSs FGF23 벡터의 구축

국제 공개 제WO2006/78072 공보의 실시예 1-8에 기재된 pPSs5.5를 SfoI 및 FseI로 소화시킨 후, 대장균 유래 알칼리 포스파타제를 이용하여 말단 탈인산화한 것에, 실시예 13에서 제조한 인간 FGF23을 포함하는 DNA 단편을 삽입한 후, DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 DNA를 제조하고, 연결 부분의 염기 서열을 확인하여 pPSs FGF23 벡터(도 10)를 취득하였다.

(실시예 15) pUS FGF23 KI 벡터의 구축

국제 공개 제WO 2006/78072호 공보의 실시예 43-1에서 제조된 pCk loxPVΔP를 SalI 및 FseI로 효소 소화시킨 후, 대장균 C75 유래 알칼리 포스파타제를 이용하여 말단 탈인산화한 것에, 상기 실시예 14의 pPSs FGF23 벡터를 SalI 및 FseI로 효소 소화시키고, 0.8 ％ 아가로스 겔로부터 분리 회수된 약 1.5 kb의 단편을 삽입한 후, 그것을 대장균 XL10-골드 울트라컴피턴트 셀즈(Gold Ultracompetent Cells)(스트라타진(STRATAGENE)사)에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 DNA를 제조하고, 연결 부분의 염기 서열을 확인하여 pUS FGF23 KI 벡터(도 11)를 취득하였다.

이하에 pUS FGF23 KI 벡터 인간 FGF23 발현 유닛의 개시 코돈으로부터 종지 코돈까지의 폴리뉴클레오티드 서열(FGF23 시그널 서열)을, 인트론 영역을 포함한 마우스 Igκ 시그널 서열[서열 번호 38의 하선 부분]로 치환하고, 그의 하류에 FGF23 성숙체 서열을 포함하는 985 bp, 서열 번호 38), 및 상기 cDNA가 코딩하는 아미노산 서열(247 아미노산, 하선 부분은 마우스 Igκ 시그널 서열을 나타내는 서열 번호 39)을 나타낸다. 인트론 영역을 포함한 마우스 Igκ 시그널 서열 정보는 유전자 은행으로부터 취득한 MUSIGKVR1(등록 번호 K 02159)을 바탕으로, 그 상류의 게놈 서열을 UCSC 마우스 게놈 데이터 베이스로부터 취득하였다.

서열 번호 38:

서열 번호 39:

(실시예 16) 전기 천공용 pUS FGF23 KI 벡터의 제조

pUS FGF23 KI 벡터 60 μg을, 스페르미딘 첨가(1 mM pH 7.0 시그마 알드리치 재팬사) 완충액(로슈ㆍ다이아그노스틱스사, 제한 효소용 H 완충액)을 이용하고, NotI(다카라 바이오사)를 이용하여 37 ℃에서 5 시간 소화시키고, 페놀/클로로포름 추출 후, 2.5배 용량의 100 ％ 에탄올 및 0.1배 용량의 3 M 아세트산나트륨을 첨가하여 -20 ℃에서 16 시간 보존하였다. NotI로 단일쇄화된 벡터를 원심 분리하여 회수 후, 70 ％ 에탄올을 첨가하여 멸균하였다. 클린 벤치 내에서 70 ％ 에탄올을 제거하고, 1 시간 풍건시켰다. 0.5 μg/μl의 DNA 용액이 되도록 HBS 용액을 첨가하고, 1 시간 실온에서 보존하여 전기 천공용 pUS FGF23 KI 벡터의 제조를 행하였다.

(실시예 17) pUS FGF23 KI 벡터와 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포주를 이용한 PL FGF23 마우스 ES 세포주의 취득

인간 FGF23-cDNA는 상동 재조합에 의해 면역 글로불린 κ 경쇄 유전자 하류에 삽입된 PL FGF23 마우스 ES 세포주 취득을 위해, 실시예 16에서 나타내어진 방법에 따라서, 제한 효소 NotI로 선상화된 pUS FGF23 KI 벡터를, 확립되어 있는 방법(문헌[아이자와 신이찌, 바이오메뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 요도샤, 1995])에 따라서 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포에 도입하였다. 국제 공개 제WO 2006/78072호 공보의 실시예 10에 기재된 방법으로 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포가 취득되었다.

RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포의 배양법은 기재된 방법(문헌[아이자 와 신이찌, 상기])에 따라서, 영양 세포는 미토마이신 C(시그마 알드리치 재팬사) 처리한 G418 내성 초대 배양 세포(인비트로젠사로부터 구입)를 이용하였다. 우선, 증식시킨 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포를 트립신 처리하고, 3×10⁷개/ml가 되도록 HBS에 현탁시키고 나서, 0.5 ml의 세포 현탁액을 10 μg의 벡터 DNA와 혼화하고, 유전자 펄서 큐벳(전극 거리: 0.4 cm, 바이오래드 래보래토리즈사)에서 전기 천공을 행하였다(용량: 960 μF, 전압: 250 V, 실온). 전기 천공한 세포를 10 ml의 ES 배지(문헌[아이자와 신이찌, 상기])에 현탁시켜, 미리 피더(feeder) 세포를 파종한 100 mm 조직 배양용 플라스틱 샬레(팔콘, 벡톤ㆍ디킨슨사) 1장에 파종하였다. 36 시간 후에 0.8 μg/ml의 퓨로마이신(시그마 알드리치 재팬사)을 포함하는 ES 배지와 치환하였다. 7 일 후에 생성된 콜로니를 픽업하고, 각각을 24웰 플레이트에서 컨플루언트가 될 때까지 증식시키고, 그의 2/3을 0.2 ml의 보존용 배지(FBS+10 ％ DMSO, 시그마 알드리치 재팬사)에 현탁시켜 -80 ℃에서 보존하였다. 나머지 1/3은 12웰 젤라틴 코팅 플레이트에 파종하고, 2 일간 배양하여 10⁶ 내지 10⁷개의 세포로부터 게놈 DNA를 퓨어진(Puregene) DNA 분리 키트(퀴아겐사)에 의해 제조하였다. 이들 퓨로마이신 내성 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포 게놈 DNA를 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하였다. 계속해서 서든 블롯을 행하여, WO 00/10383호 공보(실시예 48 참조)에 기재된 발명에서 사용된 Ig 경쇄 Jκ-Cκ 게놈 DNA의 3' 말단의 DNA 단편(XhoI 내지 EcoRI, 약 1.4 kb, WO 00/10383호 공보 도 5) Ck 3' 프로브를 프로브 로서 상동 재조합체를 검출하였다. 야생형 RS 엘리멘트ㆍ타겟팅ㆍ마우스 ES 세포에서는 EcoRI 소화에 의해 1개의 밴드(15.1 kb)가 검출되었다. 상동 재조합체에 있어서는, 이 밴드에 부가적으로 그의 하부에 새로운 밴드(12.8 kb)가 생성되는 것이 예상되지만(도 12), 퓨로마이신 내성주에 있어서 이 새로운 밴드가 확인되었다. 즉, 이들 클론은 한쪽 알렐의 면역 글로불린 κ쇄 유전자 하류에 인간 FGF23-cDNA가 삽입된 것이다.

(실시예 18) PL FGF23 마우스 ES 세포주로부터 약제 내성 유전자를 제거한 US FGF23 마우스 ES 세포주의 취득

PL FGF23 마우스 ES 세포주로부터 2종의 약제 내성 유전자(Puro^r, Neo^r)를 제거한 US FGF23 유전자 도입 ES 세포주 취득을 위해, pCAGGS-Cre 벡터(문헌[Sunaga 등, Mol Reprod Dev., 46:109-113, 1997])를 확립되어 있는 방법(문헌[아이자와 신이찌, 바이오메뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 요도샤, 1995])에 따라서 PL FGF23 마우스 ES 세포에 도입하였다.

PL FGF23 마우스 ES 세포의 배양법은 기재된 방법(문헌[아이자와 신이찌, 상기])에 따라서, 영양 세포는 미토마이신 C(시그마 알드리치 재팬사) 처리한 G418 내성 초대 배양 세포(인비트로젠사로부터 구입)를 이용하였다. 우선, 증식시킨 PL FGF23 마우스 ES 세포를 트립신 처리하고, 3×10⁷개/ml가 되도록 HBS에 현탁시키고 나서, 0.5 ml의 세포 현탁액을 10 μg의 벡터 DNA와 혼화하고, 유전자 펄서 큐벳(전극 거리: 0.4 cm, 바이오래드 래보래토리즈사)에서 전기 천공을 행하였다(용량: 960 μF, 전압: 250 V, 실온). 전기 천공한 세포를 10 ml의 ES 배지(문헌[아이자와 신이찌, 상기])에 현탁시키고, 그로부터 2.5 ml 분량을, 미리 피더 세포를 파종한 60 mm 조직 배양용 플라스틱 샬레(팔콘, 벡톤ㆍ디킨슨사) 1장에 파종하였다. 30 시간 후에 ES 세포 1000개를 미리 피더 세포를 파종한 100 mm 조직 배양용 플라스틱 샬레(팔콘, 벡톤ㆍ디킨슨사) 1장에 파종하였다. 6 일 후에 생긴 콜로니를 픽업하여, 각각을 24웰 플레이트에서 컨플루언트가 될 때까지 증식시키고, 그의 2/3를 0.2 ml의 보존용 배지(FBS+10 ％ DMSO, 시그마 알드리치 재팬사)에 현탁시켜 -80 ℃에서 보존하였다. 나머지 1/3은 12웰 젤라틴 코팅 플레이트에 파종하고, 2 일간 배양하여 10⁶ 내지 10⁷개의 세포로부터 게놈 DNA를 퓨어진 DNA 분리 키트(퀴아겐사)에 의해 제조하였다. 이들 마우스 ES 세포 게놈 DNA를 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하였다. 계속해서 서든 블롯을 행하여, WO 00/10383호 공보(실시예 48참조)에 기재된 발명에서 사용된, Ig 경쇄 Jκ-Cκ 게놈 DNA의 3' 말단의 DNA 단편(XhoI 내지 EcoRI, 약 1.4 kb, WO 00/10383호 공보 도 5) Ck 3' 프로브를 프로브로 하여 loxPV 서열 사이에 끼워진 Puro^r 유전자만이 제거된 ES 세포주를 검출하였다. Puro^r 유전자를 유지한 ES 세포에서는 EcoRI 소화에 의해, 2개의 밴드(15.1 kb와 12.8 kb)가 검출되고, Puro^r 유전자만이 제거된 ES 세포주에서는 EcoRI 소화에 의해 2개의 밴드(15.1 kb와 10.9 kb)가 검출되었다(도 12). 또한, 상기와 동일한 조작으로 얻어진 서든 블롯막을 이용하여, 국제 공개 제WO 2006/78072호 공보의 실시예 9에서 나타내어진 방법에 의해 제조된 3' KO-프로브를 프로브로 하여 loxP 서열 사이에 끼워진 Neo^r 유전자만이 제거된 ES 세포주를 검출하였다. Neo^r 유전자를 유지한 ES 세포에서는 EcoRI 소화에 의해, 2개의 밴드(7.4 K와 5.7 K)가 검출되고, Neo^r 유전자만이 제거된 ES 세포주에서는 EcoRI 소화에 의해, 2개의 밴드(5.7 K와 4.6 K)가 검출되었다(도 12). 이들 결과로부터, PL FGF23 마우스 ES 세포주로부터 2종의 약제 내성 유전자(Puro^r, Neo^r)가 동시에 제거된 ES 세포주(US FGF23 마우스 ES 세포주)가 얻어졌다.

(실시예 19) US FGF23 마우스 ES 세포주 및 B 림프구 결손 마우스 계통 유래 숙주 배아를 이용한 US FGF23 KI 키메라 마우스의 제조

면역 글로불린 μ쇄 유전자 녹아웃(knock out) 호모 접합체에 있어서는, 기능적인 B 림프구가 결손되고, 항체가 생산되지 않는다(문헌[Kitamura 등, Nature, 350:423-426, 1991]). 청정한 환경에서 사육한 상기 호모 접합체의 자웅 개체의 교배에 의해 얻어지는 배아를 본 실시예에서 행하는 키메라 마우스 제조시의 숙주로서 이용하였다. 이 경우, 키메라 마우스에 있어서 기능적인 B 림프구는, 대부분이 주입한 ES 세포에서 유래한다. 본 실시예에서는 도미즈카 등의 보고(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000])에 기재된 면역 글로불린 μ쇄 유전자 녹아웃 마우스에 대하여 MCH(ICR)(닛본 구레아사) 계통으로의 역교배(back cross)를 3회 이상 행한 개체를 숙주 배아 제조용으로서 이용하였다.

상기 실시예 18에서 얻어지고, 면역 글로불린 κ쇄 유전자 하류에 인간 FGF23-cDNA가 삽입되어 있는 것이 확인된 US FGF23 마우스 ES 세포주를 동결 스톡으로부터 개시하고, 이들을, 상기 면역 글로불린 μ쇄 녹아웃 마우스 호모 접합체의 자웅 마우스의 교배에 의해 얻어진 8 세포기 배아에, 각각 배아 1개당 8 내지 10개 주입하였다. ES 배지(문헌[아이자와 신이찌, 바이오메뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 요도샤, 1995])에서 밤새 배양하여 배아 반포까지 발생시킨 후, 가임신 처리 후 2.5 일의 가부모 MCH(ICR) 마우스(닛본 구레아사)의 자궁에, 한쪽 자궁당 각각 약 10개의 인젝션 배아를 이식하였다. 실시예 18의 US FGF23 마우스 ES 세포주를 이용하여 제조된 인젝션 배아를 이식한 결과, 자손 키메라 마우스가 탄생하였다. 키메라 개체는, 털색에 있어서 숙주 배아 유래의 백색 중에 ES 세포 유래의 야생색(진한 갈색)이 확인되는지 어떤지에 의해서 판정된다. 탄생한 자손 키메라 마우스 중 털색에 분명히 야생색 부분이 있는, 즉, ES 세포의 공헌이 확인되는 개체가 얻어졌다. 이들 결과로부터, 면역 글로불린 κ쇄 유전자 하류에 인간 FGF23-cDNA가 삽입되어 있는 US FGF23 마우스 ES 세포주는 키메라 형성능을 유지하고 있는, 즉, 마우스 개체의 정상 조직으로 분화되는 능력을 유지하고 있는 것이 개시되었다. 또한, 실시예 21에서 후술하는 바와 같이, US FGF23 KI 키메라 마우스는 혈 중 FGF23 농도가 높은 값이고, 저인혈증성 구루병 양상의 소견을 나타내는 병태 모델 동물로서 사용하는 것이 가능하였다.

(실시예 20) 대조군 키메라 마우스의 제조

국제 공개 제WO 2006/78072호 공보의 실시예 11에 기재된 방법에 따라서 제조된 인간 FGF23-cDNA를 포함하는 기능 유전자가 삽입되지 않은 키메라 마우스는 후술하는 실시예 21의 US FGF23 KI 키메라 마우스에의 C10 항체 투여 실험에 있어서, 대조군 키메라 마우스 개체(WT 마우스)로서 이용되었다.

(실시예 21) US FGF23 KI 키메라 마우스를 이용한 C10 항체의 병태 개선 효과의 검증

실시예 10 및 12에 있어서, C10 항체가 2C3B 항체나 C15 항체에 비해 현저히 정상 카니쿠이잘의 내재성 FGF23의 작용을 억제하고, 그의 혈청 인 농도 및 혈청 1,25D 농도를 상승시키는 것을 나타내었다. 인간 FGF23에 대한 중화 활성을 갖는 항체는, FGF23 과잉에서 유래하는 종양성 골연화증, XLH 등을 포함하는 저인혈증성 구루병ㆍ골연화증 등의 인간 질환에 있어서 치료 효과를 갖는 것이 강하게 시사된다. 본 연구에 있어서 취득된 C10 항체에 의한 인간 FGF23 과잉에서 유래하는 병태의 개선 효과에 대하여 검토하기 위해서, 실시예 19에서 제조한 US FGF23 KI 키메라 마우스(이하 hFGF23KI 마우스)를 이용하여 실험을 행하였다. 병태 동물로서 hFGF23 KI 마우스를 12 마리, 그의 비교 대상으로서 동 주령의 정상 대조군 마우스(WT 마우스, 실시예 20에서 제조) 6 마리를 실험에 사용하였다. 7 주령의 시점에서, hFGF23 KI 마우스의 혈청을 채혈하여 FGF23(FGF-23 ELISA KIT, 카이노스사) 및 인의 혈청 농도를 각각 측정하였다. WT 마우스에 비해, hFGF23 KI 마우스에 있어서는 현저히 혈청 FGF23 농도가 상승한 것이 나타났다(WT 마우스; n=6, 163 pg/mL hFGF23KI 마우스; n=12, 1467 pg/mL). 이 결과로부터, hFGF23 KI 마우스에의 인간 FGF23 유전자 도입은 정확하게 행해지고, 또한 hFGF23 KI 마우스혈 중에 외래성 인간 FGF23이 과잉으로 존재하는 것이 개시되었다. 또한, WT 마우스에 비 해, hFGF23 KI 마우스에 있어서는 혈청 인 농도가 현저히 저하된 것이 나타나고(WT 마우스; n=6, 5.82 mg/dL hFGF23KI 마우스; n=12, 2.62 mg/dL), hFGF23 KI 마우스에 있어서는 과잉의 인간 FGF23 작용에 의해, 저인혈증이 유도되는 것이 개시되었다. 이 때, hFGF23 KI 마우스 12 마리를 FGF23 농도가 균등해지도록, 각각 C10 항체 또는 대조군 IgG1 투여군의 6 마리씩 2군으로 나누었다(도 13). 다음에, 8 주령부터, C10 항체 또는 아이소타입 대조군용 정제 인간 IgG1(대조군 항체)을 30 mg/kg의 용량으로 정맥 내에 주 1회의 빈도로 5회 반복 투여하였다. 첫회 투여 전 및 투여 3 일 후에 마우스로부터 채혈하여 혈청을 취득하였다. 사지 악력의 측정은 4회째 투여의 24 시간 후에 사이토식 마우스용 악력 측정 장치(GRIP STRENGTH METER, MK-380S 무로마치 기까이)를 이용하여 실시하였다. 사지 악력의 평가는, 마우스를 측정용 그리드(망)에 포획하고, 꼬리를 손으로 수평으로 끌어당기고, 동물이 끌리는 힘에 더이상 견디지 못하고 그리드를 떨어져나가기까지의 최대 힘(악력)을 지표로 실시하였다. 골 평가에 대해서는, 5회째 투여의 24 시간 후에 마취하에서 심채혈에 의해 도살 후, 대퇴골 및 경골을 채취하고, 70 ％ 에탄올로 고정시켰다. 혈청 인 농도는 첫회 투여 전, 첫회 투여의 3 일 후 및 5회째 투여의 24 시간 후의 혈청을 이용하여 측정하였다. 대퇴골은 비탈회(undecalcified) 수지 포매 후에 빌라누에바-골드너 염색하여 조직학적 평가를 실시하였다. 경골은 회화(ashing process)에 의해 미네랄 함량을 측정하였다.

그 결과, hFGF23KI 마우스의 대조군 항체 투여군에서는 혈청 인 농도는 군 나눔시 및 도살시 모두, WT 마우스의 대조군 항체 투여군에 비해 유의하게 낮은 값 을 나타내고, 지속적인 저인혈증 상태인 것이 확인되었다(도 14). 한편, hFGF23KI 마우스에게 C10 항체를 투여한 군에서는 혈청 인 농도는 3 일 후에 WT 마우스의 대조군 항체 투여군과 동일한 레벨까지 상승하는 것이 확인되었다(도 14). 또한, C10 항체의 5회째 투여 후의 혈청 인 농도도 WT 마우스의 대조군 항체 투여군과 동일한 레벨이고, 5회의 투여 후에도 C10 항체 투여에 의한 혈청 인 상승 작용이 유지되는 것으로 나타났다(도 15).

저인혈증 환자의 증례로서, 골격근의 근력 저하가 임상적으로 보고되어 있다(문헌[Baker and Worthley, Crit Care Resusc., 4:307-315, 2000]). 본 시험에 있어서도, hFGF23KI 마우스는 유의한 저인혈증을 나타내고 있기 때문에, 근력 저하가 예상되었다. 따라서, 근력 저하의 지표로서 상술한 방법으로 사지 악력을 측정하여 각 군 사이에서 비교하였다. 그 결과, hFGF23KI 마우스의 대조군 항체 투여군의 악력은 WT 마우스의 대조군 항체 투여군에 비해 유의하게 낮은 값을 나타내고, 이 병태 모델 마우스에 있어서도 근력 저하가 관찰되었다(도 16). 이에 대하여, hFGF23KI 마우스의 C10 항체 투여군에서는 악력의 유의한 개선 효과도 확인되었다(도 16).

다음에, 대퇴골의 경조직 표본을 빌라누에바-골드너법으로 조직 염색하여 관찰하면, 대조군 항체를 투여한 WT 마우스에 비해 대조군 항체를 투여한 hFGF23KI 마우스에는 다량의 유골(도 17에서 적색으로 표시됨)이 확인되기 때문에 석회화 장해가 야기되는 것이 시사되었다. 이것은 구루병의 특징적인 증상으로서 널리 알려져 있다. 이에 대하여, C10 항체를 투여한 hFGF23KI 마우스에서는, 유골이 감소된 것이 확인되고, 유골이 석회화골(도 17에서 녹색으로 표시됨)로 치환된 것이 예상되었다. 이 결과로부터, FGF23 과잉에 의해 유도된 뼈의 석회화 장해를 C10 항체가 개선하는 것이 시사되었다. 따라서, 경골을 회화하여 미네랄 함량을 측정하고, 각 군 사이에서 비교하였다. hFGF23KI 마우스의 대조군 항체 투여군의 경골의 미네랄 함량은 WT 마우스의 대조군 항체 투여군에 비해 유의하게 저하되었다(도 18). 이에 대하여, hFGF23KI 마우스의 C10 투여군에서는 미네랄 함량이 개선된 것이 확인되었다(도 18). 이상의 결과로부터, hFGF23KI 마우스에 있어서, C10 항체 투여는 생체 내에서 과잉으로 작용하는 인간 FGF23 작용을 중화시켜, 저인혈증, 근력 저하, 골석회화 장해 등의 저인혈증성 구루병의 각종 증상을 개선하는 것이 확인되었다. 즉, C10 항체는, FGF23이 관여하는 인간의 각종 질환의 효과적인 치료약이 되는 것이 개시되었다.

본 발명의 FGF23에 대한 항체인 C10 항체는 공지된 FGF23에 대한 항체에 비해, 생체 내에서의 혈청 인 농도를 지속적으로 상승시키는 활성 및/또는 혈청 1,25D 농도를 지속적으로 상승시키는 활성이 높고, FGF23의 과잉 작용이 원인이 될 수 있는 질환, 또는 FGF23의 작용을 조절함으로써 병태의 개선이 예상되는 질환의 예방 및 치료제로서 현저한 효과로 사용할 수 있다.

서열 목록 프리텍스트

서열 번호 1 내지 3, 5 내지 27, 30 내지 33, 40 내지 45 합성

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> KIRIN PHARMA KABUSHIKI KAISHA <120> Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same <130> PH-3490-PCT <150> JP 2007-34018 <151> 2007-02-14 <160> 45 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 ccggaattca gccactcaga gcagggcacg 30 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 ataagaatgc ggccgctcaa tggtgatggt gatgatggat gaacttggcg aa 52 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 ataagaatgc ggccgctcag atgaacttgg cgaa 34 <210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val 1 5 10 15 Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 50 55 60 Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala 65 70 75 80 Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg 165 170 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln 195 200 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 250 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 gttgaagctct ttgtgacggg cgagc 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 gctggagggc acggtcacca cgc 23 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 gtaaaacgac ggccagtg 18 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 caggaaacag ctatgac 17 <210> 11 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag ctccaggtgc tcactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccaac cactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggaataatc aaccctatta gtggtagcac aagtaacgca 240 cagaagttcc agggcagagt caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agtctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agatattgtg 360 gatgcttttg atttctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca 408 <210> 12 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn His Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ile Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Val Asp Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 13 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 agatgtgcca tccagttgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagcagtg ctttagtctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gctcctgatc tatgatgcct ccagtttgga aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt caacagttta atgattactt cactttcggc 360 cctgggacca aagtggatat caaa 384 <210> 14 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Asp Tyr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtccccgc t 41 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 agagagagag cgtacgtttg atatccactt tggtcccagg gc 42 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggagggt cttc 44 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 agagagagag gctagctgaa gagacggtga ccattgtccc 40 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 30 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 21 gacaccctca tgatctcccg gacc 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 22 tgttctccgg ctgcccattg ctct 24 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 23 tctatataag cagagctggg tacgtcc 27 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 tggctgcacc atctgtcttc atcttc 26 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 25 ggtacgtgaa ccgtcagatc gcctgga 27 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 26 cggaattcca ccatgttggg ggcccgcctc aggct 35 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 atttgcggcc gctagatgaa cttggcgaag gggc 34 <210> 28 <211> 756 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 28 atgttggggg cccgcctcag gctctgggtc tgtgccttgt gcagcgtctg cagcatgagc 60 gtcatcagag cctatcccaa tgcctcccca ttgctcggct ccagctgggg tggcctgatc 120 cacctgtaca cagccacagc caggaacagc taccacctgc agatccacaa gaatggccac 180 gtggatggcg caccccatca gaccatctac agtgccctga tgatcagatc agaggatgct 240 ggctttgtgg tgattacagg tgtgatgagc agaagatacc tctgcatgga tttcggaggc 300 aacatttttg gatcacacta tttcaacccg gagaactgca ggttccgaca ctggacgctg 360 gagaacggct acgacgtcta ccactctcct cagcatcact ttctggtcag tctgggccgg 420 gcgaagaggg ccttcctgcc aggcatgaac ccacccccct actcccagtt cctgtcccgg 480 aggaacgaga tccccctcat ccacttcaac acccccagac cacggcggca cacccggagc 540 gccgaggacg actcggagcg ggaccccctg aacgtgctga agccccgggc ccggatgacc 600 ccggccccgg cctcctgctc acaggagctc ccgagcgccg aggacaacag cccggtggcc 660 agcgacccgt taggggtggt caggggcggt cgggtgaaca cgcacgctgg gggaacgggc 720 ccggaagcct gccgcccctt cgccaagttc atctag 756 <210> 29 <211> 251 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 29 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val 1 5 10 15 Cys Ser Met Ser Val Ile Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 50 55 60 Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala 65 70 75 80 Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 Asp Phe Gly Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asn Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Arg Phe Arg His Trp Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 Ser Pro Gln His His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Arg Pro Arg Arg 165 170 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln 195 200 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Val Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 250 <210> 30 <211> 1417 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 gtcgaccacc atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag ctccaggtgc 60 tcactcccag gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt 120 gaaggtttcc tgcaaggcat ctggatacac cttcaccaac cactatatgc actgggtgcg 180 acaggcccct ggacaagggc ttgagtggat gggaataatc aaccctatta gtggtagcac 240 aagtaacgca cagaagttcc agggcagagt caccatgacc agggacacgt ccacgagcac 300 agtctacatg gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt attgtgcgag 360 agatattgtg gatgcttttg atttctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttcagc 420 tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg 480 cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg 540 gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg 600 actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 660 catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa 720 atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc 780 gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 840 ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 900 cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 960 cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 1020 gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 1080 agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct 1140 gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc 1200 cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1260 ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca 1320 gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca 1380 gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg aggatcc 1417 <210> 31 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn His Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ile Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Val Asp Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 32 <211> 724 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 32 agatctctca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggggcttct gctgctctgg 60 ctcccaggtg ccagatgtgc catccagttg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 120 gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg gcaagtcagg gcattagcag tgctttagtc 180 tggtatcagc agaaaccagg gaaagctcct aagctcctga tctatgatgc ctccagtttg 240 gaaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagcc tgcagcctga agattttgca acttattact gtcaacagtt taatgattac 360 ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 720 attc 724 <210> 33 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 33 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Asp Tyr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 tatcccaatg cctccccact gctcggctcc agctg 35 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ttggccggcc ctagatgaac ttggcgaagg ggcggcagcc ttccg 45 <210> 36 <211> 756 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 atgttggggg cccgcctcag gctctgggtc tgtgccttgt gcagcgtctg cagcatgagc 60 gtcctcagag cctatcccaa tgcctcccca ctgctcggct ccagctgggg tggcctgatc 120 cacctgtaca cagccacagc caggaacagc taccacctgc agatccacaa gaatggccat 180 gtggatggcg caccccatca gaccatctac agtgccctga tgatcagatc agaggatgct 240 ggctttgtgg tgattacagg tgtgatgagc agaagatacc tctgcatgga tttcagaggc 300 aacatttttg gatcacacta tttcgacccg gagaactgca ggttccaaca ccagacgctg 360 gaaaacgggt acgacgtcta ccactctcct cagtatcact tcctggtcag tctgggccgg 420 gcgaagagag ccttcctgcc aggcatgaac ccacccccgt actcccagtt cctgtcccgg 480 aggaacgaga tccccctaat tcacttcaac acccccatac cacggcggca cacccggagc 540 gccgaggacg actcggagcg ggaccccctg aacgtgctga agccccgggc ccggatgacc 600 ccggccccgg cctcctgttc acaggagctc ccgagcgccg aggacaacag cccgatggcc 660 agtgacccat taggggtggt caggggcggt cgagtgaaca cgcacgctgg gggaacgggc 720 ccggaaggct gccgcccctt cgccaagttc atctag 756 <210> 37 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val 1 5 10 15 Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 50 55 60 Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala 65 70 75 80 Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg 165 170 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln 195 200 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 250 <210> 38 <211> 985 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg tgagagtgca 60 gagaagtgtt ggatgcaacc tctgtggcca ttatgatact ccatgcctct ctgttcttga 120 tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc ccagtcccct gaattttcca 180 ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta aataaaaagg tcctctgctg 240 tgaaggcttt tatacatata taacaataat ctttgtgttt atcattccag gttccactgg 300 ctatcccaat gcctccccac tgctcggctc cagctggggt ggcctgatcc acctgtacac 360 agccacagcc aggaacagct accacctgca gatccacaag aatggccatg tggatggcgc 420 accccatcag accatctaca gtgccctgat gatcagatca gaggatgctg gctttgtggt 480 gattacaggt gtgatgagca gaagatacct ctgcatggat ttcagaggca acatttttgg 540 atcacactat ttcgacccgg agaactgcag gttccaacac cagacgctgg aaaacgggta 600 cgacgtctac cactctcctc agtatcactt cctggtcagt ctgggccggg cgaagagagc 660 cttcctgcca ggcatgaacc cacccccgta ctcccagttc ctgtcccgga ggaacgagat 720 ccccctaatt cacttcaaca cccccatacc acggcggcac acccggagcg ccgaggacga 780 ctcggagcgg gaccccctga acgtgctgaa gccccgggcc cggatgaccc cggccccggc 840 ctcctgttca caggagctcc cgagcgccga ggacaacagc ccgatggcca gtgacccatt 900 aggggtggtc aggggcggtc gagtgaacac gcacgctggg ggaacgggcc cggaaggctg 960 ccgccccttc gccaagttca tctag 985 <210> 39 <211> 247 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp 20 25 30 Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His 35 40 45 Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr 50 55 60 Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val 65 70 75 80 Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly 85 90 95 Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln 100 105 110 His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr 115 120 125 His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly 130 135 140 Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu Ile 145 150 155 160 Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg Ser 165 170 175 Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg 180 185 190 Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser 195 200 205 Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg 210 215 220 Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys 225 230 235 240 Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 Asn His Tyr Met His 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 41 Ile Ile Asn Pro Ile Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 42 Asp Ile Val Asp Ala Phe Asp Phe 1 5 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 43 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Val 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 44 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 45 Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Phe Thr 1 5

Claims (20)

1. 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
2. 서열 번호 12의 20번째 아미노산에서부터 136번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 14의 23번째 아미노산에서부터 128번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
3. 중쇄 CDR(complementarity determining region; 상보성 결정 영역)로서, 서열 번호 40으로 표시되는 CDR1, 서열 번호 41로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 42로 표시되는 CDR3을 포함하고, 경쇄 CDR로서, 서열 번호 43으로 표시되는 CDR1, 서열 번호 44로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 45로 표시되는 CDR3을 포함하는, 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
4. 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)으로부터 생산되는 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 클래스가 IgG, IgA, IgE 및 IgM으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
6. 제5항에 있어서, IgG 항체의 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
7. 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772).
8. 하이브리도마 C10(수탁 번호 FERM BP-10772)이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 항체의 서브클래스가 IgG1인 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
9. 서열 번호 12의 20번째 아미노산에서부터 136번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 14의 23번째 아미노산에서부터 128번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 서브클래스가 IgG1인 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
10. 중쇄 CDR로서, 서열 번호 40으로 표시되는 CDR1, 서열 번호 41로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 42로 표시되는 CDR3을 포함하고, 경쇄 CDR로서, 서열 번호 43으로 표시되는 CDR1, 서열 번호 44로 표시되는 CDR2, 및 서열 번호 45로 표시되는 CDR3을 포함하며, 서브클래스가 IgG1인 인간 FGF23에 대한 단리된 항체.
11. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 인간 FGF23에 대한 단리된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 종양성 골연화증, ADHR(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalachia; 상염색체 우성 저인혈증성 구루병·골연화증), XLH (X-linked hypophosphatemic rickets; X 염색체연쇄 저인혈증성 구루병), 섬유 형성 이상, 맥쿤-알브라이트 증후군, 상염색체 열성 저인혈증, 골다공증 및 구루병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 치료용 의약 조성물.
12. 제5항에 기재된 인간 FGF23에 대한 단리된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 섬유 형성 이상, 맥쿤-알브라이트 증후군, 상염색체 열성 저인혈증, 골다공증 및 구루병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 치료용 의약 조성물.
13. 제6항에 기재된 인간 FGF23에 대한 단리된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 섬유 형성 이상, 맥쿤-알브라이트 증후군, 상염색체 열성 저인혈증, 골다공증 및 구루병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 치료용 의약 조성물.
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