KR101468288B1 - 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 파킨슨 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 파킨슨 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
뇌(brain)와 척수(spinal cord)로 구성된 중추신경계는 감각과 수의적 또는 불수의적인 운동에서부터 사고, 기억, 감정, 언어 등에 이르기까지 인체의 모든 기능을 총괄하는 필수적인 기관이다. 따라서 뇌졸중, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 파킨슨병 등과 같은 퇴행성 뇌신경 질환은 신경회로망의 비가역적인 기능장애를 초래하게 되며 결국에는 해당 인체 기능의 영구적인 손실을 초래하게 된다.
상기 뇌신경계 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달 과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다.
또한, 퇴행성 뇌신경 질환을 유발하는 주요 기전 중 하나로 염증반응이 있다. 뇌의 중추신경계에는 고유의 면역반응과 세균 침입 및 상처에 대한 방어라인을 형성하는 소교세포가 상재한다. 상기 소교세포는 다양한 외인성, 내인성 물질로 인해 활성화될 수 있으며, 활성화된 소신경교세포는 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1 일산화질소, 프로스타글란딘, 초과산화물 등의 물질을 생산, 방출한다. 이러한 물질들의 생성은 단기적으로는 면역반응을 유발하지만, 그 과도한 생산이나 지속적인 생산은 근접한 신경세포들의 사멸을 유도하여 결국 신경퇴행을 유발한다는 것이다. 또 사멸 중인 신경세포가 방출하는 물질들이 소신경교세포의 활성을 다시 유발하게 되므로, 신경퇴행은 지속적인 악순환에 빠지게 된다. 실제로 소신경교세포의 활성이 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등의 다양한 퇴행성 신경질환과 관계가 있음이 보고되었다(Wood PL, et al., 17 Neurol. Res. 242, 1995).
이 중 파킨슨병(Parkinson's disease)은 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환으로 뇌의 흑질(Substantia Nigra pars compacta: SNc)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되는 신경병리학적인 특징을 나타낸다(Calne et al., 1983, Heikkila 1984). 파킨슨병 환자는 대략 60세 이상에서 인구의 약 1% 정도로 추정된다.
파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다. 대부분의 파킨슨병 환자들은 가족력 없이 발병하지만 약 10% 정도가 가족성 파킨슨병으로 나타나고 있다. 그 원인은 아직 구체적으로 밝혀져 있지 않으나, 뇌의 동맥경화증, 일산화탄소 중독, 약물, 부갑상선 기능저하증 등에 의한 대사성, 외상성 뇌염 후유증 등이 관여된다고 알려져 있다. 신경전달물질의 도파민이 감소함으로써 신경전달체계 전체의 균형이 무너지고, 그 결과로서 파킨슨병의 대표적인 증상인 떨림증(tremor), 경직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 자세의 불안정(postural instability) 등의 증상이 나타난다.
파킨슨병의 치료를 위한 약물로서, 엘-도파(l-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이며, 따라서 꾸준하게 지속적인 약물의 복용을 필요로 한다. 이러한 약물들의 장기 투여는 약물 부작용의 문제점을 야기하게 된다. 예를 들어, 항콜린 약제들은 자율신경계 이상이나 정신기능의 이상 등이 나타날 수 있어 고령의 환자들에게 지속적으로 투여하는 것에 한계가 있다. 또한, 엘-도파 제제의 경우 장기간 동안의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리고 손이나 발이 저절로 움직이는 이상운동이 생기는 등의 부작용이 발생하게 된다. 기타, 고주파를 이용한 신경자극술 즉, 고주파 파괴술 또는 심부 뇌자극술 등의 수술치료도 행해지고 있으나, 침습적인 수술을 필요로 하고 또한 많은 비용이 소요되는 문제가 있다.
한편, 두충피(Eucommiae ulmoides Oliv. Bark.)는 두충나무(Eucommiae ulmoides Oliv., Eucommiaceae)의 수피를 지칭하는 생약을 말한다. 두충나무는 낙엽성 교목으로 높이 10 m에 달하며, 잎은 타원형이고 끝이 뾰족하며 고르지 않은 톱니가 있다. 꽃은 4~5월경 엷은 녹색으로 피며 자웅이주로서 수꽃은 적갈색이며 6~10개의 짧은 수술이 있고, 암꽃은 짧은 자루에 1개씩 붙는다(육창수, 원색 한국약용식물도감, 데미서적, 서울, pp. 134, 1989). 우리나라의 중남부에서 재배되나 중국이 원산지이며 중국 남부에서 대량 재배되고 있다. 식용 및 약용으로 수피를 사용하며, 잎은 식용으로 사용가능하다. 두충의 효능은 강장, 요통, 관절통, 관절염, 진정, 이뇨 등이 알려져 있다(김재길, 원색 천연약물대사전, 남산당, 서울, pp. 439, 1984). 두충의 성분에 관한 연구로는 aucubin, harpagide acetate, ajugoside, reptoside, eucommiol, ulmoside, eucommioside I, geniposidic acid, geniposide 및 4-deoxyeucommiol 등의 iridoid 유도체와 medioresinol di-O-β-D-glucopyranoside, olivil di-O-β-glucopyranoside, pinoresinol di-O-β-glucopyranoside, eucommin A, liriodendrin, syringaresinol di-O-β-glucopyranoside 등의 lignin 배당체가 주성분으로 보고(Bianco, A. et al., 1978; Deyama, T. et al., 1986; Gewali, M. et al., 1988; Hattori, M. et al., 1988; Takeshi, D. et al., 1983; Takeshi, D. et al., 1985; Takeshi, D. et al., 1986; Takeshi D. et al., 1987)되어 있으며 활성에 관한 연구보고는 pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranoside의 혈압강하작용(Shi O. et al., 1976), geniposidic acid와 aucubin의 collagen 합성 증진작용 (Yanmei L. et al., 1998), geniposide의 저혈당작용(Toshihiro M. et al., 1996) 및 간보호작용(Chang H. M. et al., World Scientific Publ. Co., Singapore, pp. 221, 1985) 등이 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 파킨슨 질환에 대한 치료 및 예방효과를 갖는 천연물 소재 약품을 개발하고자 노력하던 중, 두충피가 신경세포주 그리고 미세아교세포에서 6-하이드록시도파민(6-OHDA, 6-hydroxydopamine) 및 LPS(lipopolysaccharide)에 대한 신경염증반응 억제능, 싸이토카인 분비 억제, 세포 보호효과, 미토콘드리아 막전위(MMP, mitochondrial membrane potential) 손상 억제효과, 활성산소종(ROS, reactive oxygen species) 생성 억제효과, 항-자가사멸(anti-apoptosis) 효과 및 JNK (c-Jun N-terminal kinase), PI3K/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase), GSK-3β (glycogen synthase kinase-3 beta), 및 NF-κβ (nuclear factor-kappa β)의 활성화 억제를 통한 신경세포 보호효과를 확인함으로써 파킨슨 질환에 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 '두충'은, 학명 'Eucommia ulmoides'로 일컫어지는 식물로서, 잎의 길이가 5~16cm인 타원형으로 끝이 뾰족하며 가장자리에 날카로운 톱니가 있고, 잎을 찢으면 많은 가는 실을 볼 수 있는 낙엽교목을 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 '두충피'는 상기 두충(Eucommiae ulmoides) 나무의 나무껍질을 말린 약재를 의미한다. 두충피는 판상으로 바깥면은 회색 또는 어두운 회색이며 세포주름이 많고 껍질에 작은 구멍인 피공이 있으며 안쪽면은 평활하고 어두운 갈색을 띠고 있다. 예로부터 한방(漢方)에서는 상기 두충피를 두충 또는 당두충(唐杜沖)이라고 하여, 강장제(强壯劑), 관절염류머티즘 진통제로 사용되고 있으나, 근래에는 잎과 더불어 씨도 사용하고 있기도 하다.
본 발명의 목적상 상기 두충피는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용으로 사용된다.
본 발명에서 두충피는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 '추출물'이란 두충피로부터 분리하여 얻은 물질을 의미하며, 당업계에서 공지된 통상적인 분획 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 메탄올과 같은 C1-C4 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 등의 극성용매, 및 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분리할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 두충피 추출물은 두충피를 음건하여 세절한 뿌리부위를 그 중량의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 30℃ 내지 70℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 2일, 바람직하게는 2 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 초음파 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 극성용매 가용추출물은 비극성 용매 가용성분 추출과정을 거친 수가용성 분획부에 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 부탄올을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 부탄올 가용성 분획부와 수가용성 분획부를 수득할 수 있으며, 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축시켜 용매를 제거하여 각각의 추출물을 얻을 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 두충피 추출물은 수 가용 추출물 또는 부탄올 가용 추출물이다.
구체적인 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 두충피 추출물은, 건조된 두충피 1.0 kg을 70℃ 물에 끓여서 추출한 후 40℃에서 식혀 여과지로 여과한 다음 감압농축하고 동결건조하여 두충피 수 추출물 100g 을 제조하였다(실시예 2).
본 발명에서 사용된 용어 '분획물'이란, 특정 용매를 사용하여 상기 두충피 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 물질을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.
두충피 분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 공지된 통상적인 분획 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 메탄올과 같은 C1-C4 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 등의 극성용매, 및 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
바람직하게 상기 두충피 분획물은 두충피 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 것이며, 보다 바람직하게는 두충피 수 가용 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 분획물이다.
구체적으로, 본 발명의 두충피 분획물은 두충피 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 이를 현탁액 부피의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배에 달하는 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 1회 내지 5회 추출, 분리하여 비극성용매 가용 분획물을 수득할 수 있으며, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다.
구체적인 일실시예에 있어서, 본 발명의 두충피 분획물은, 두충피 수 가용 추출물을 에틸아세테이트에 1시간 동안 3회를 반복하여 추출하고 에틸아세테이트 가용 분획부를 여과, 감압농축하여 두충피 에틸아세테이트 분획물 5 g을 수득하였다(실시예 2).
본 발명의 두충피 추출물 또는 이의 분획물은 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 제조방법에 따른 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 두충피 추출물 또는 이의 분획물에 포함된다.
또한, 인체에 유해한 유기용매로부터의 노출을 방지하기 위하여, 두충피 조추출물에 이온교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)법을 수행할 수 있고, 상기 방법에서, 정지상으로 사용한 충진제는 SP207, HP20SS 또는 HP 20을 사용할 수 있으며, HP 20 충진제를 사용함이 바람직하며, 이동상 용매로는 먼저, 극성이 가장 큰 물을 이동시킨 후, 순차적으로 극성이 낮은 용매로 치환시키는 단계를 수행하는데, 예를 들어 물, 물:메탄올 혼합용매, 메탄올 또는 추가적으로 좀더 비극성 용매인 아세톤 등의 용매로 전환시키는 단계를 통하여 각 전개용매에 따라 유출된 분획물을 수득 가능하다.
또한 본 발명의 두충피 추출물 또는 이의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 열풍 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 두충피 추출물 또는 이의 분획물은 신경세포주 및 미세아교세포에서 6-하이드록시도파민(6-OHDA, 6-hydroxydopamine) 그리고 LPS (lipopolysaccharide)에 대한 세포 보호효과, 신경염증반응 억제효과, 손상된 미토콘드리아 막전위(MMP, mitochondrial membrane potential) 회복 효과, 활성산소종 생성 저해효과 및 항-자가사멸(anti-apoptosis)효과를 통한 신경세포 보호효과가 있으므로 파킨슨 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '파킨슨' 질환은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하며 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은 상기 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 파킨슨 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
구체적인 일 실험예에서, 본 발명에 따른 두충피 분획물을 SH-SY5Y 신경세포주에 처리한 결과, 6-OHDA로 감소한 세포 생존률을 증가시키고(도 1), 활성산소종의 생성을 억제하며(도 4), 미토콘드리아 막 전위 손상을 억제하는 것(도 5)을 확인하였다.
또한, 구체적인 다른 실험예에서, 본 발명에 따른 두충피 분획물을 SH-SY5Y 신경세포주에 전처리하고 신경세포 손상을 유도한 결과, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cytochrome c, caspase-3, caspase-9, PARP와 같은 세포사멸 관련 단백질의 발현수준 정상화를 통한 항-자가사멸 효과 및 JNK, (PI3K)/Akt, 및 GSK-3β, 및 NF-B의 활성화 억제를 통한 신경세포 보호효과를 나타내는 것(도 6 내지 9)을 확인하였다.
또한, 구체적인 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 두충피 분획물을 BV-2 미세아교세포주에 처리한 후, NO 생성량, 프로스타글란딘 및 신경염증반응 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, LPS에 의해 현저하게 증가된 NO 생성량, 프로스타글란딘(PGE2), iNOS, COX-2의 신경염증 인자들을 억제, 감소시킴으로써 효과적으로 신경염증 반응을 억제하는 것을 확인하였다(도 10 내지 12). 특히, 두충피 수 가용 추출물과 비교하여 두충피 에틸아세테이트 분획물은 동일한 용량 100 ㎍/㎖에서 NO 발생량을 현저하게 감소시켜, 신경염증 반응을 동반하는 퇴행성 뇌신경 질환, 특히 파킨슨 질환에 유용하게 사용될 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에게 투여하여 파킨슨 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '개체'란, 파킨슨 질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 두충피 추출물 또는 이의 분획물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 0.001 내지 50 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 두충피 추출물, 이의 분획물, 파킨슨 질환의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어, '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
본 발명에 따른 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물은 신경세포주 그리고 미세아교세포주에서 6-하이드록시도파민(6-OHDA, 6-hydroxydopamine) 및 LPS(lipopolysaccharide)에 대한 신경염증반응 억제효과, 세포 보호효과, 손상된 미토콘드리아 막전위(MMP, mitochondrial membrane potential) 회복 효과, 활성산소종 생성 저해효과 및 항-자가사멸(anti-apoptosis)효과를 통한 신경세포 보호효과가 있으므로 파킨슨 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 SH-SY5Y 신경세포주에서 두충피의 수 가용 추출물 및 두충피 에틸아세테이트 분획물의 세포생존률 비교 시험 결과를 나타낸 그래프이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, ECDW: 두충피 수 가용 추출물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 LDH 분비(세포독성) 시험 결과를 나타낸 그래프이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포사멸 염색시험 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 ROS 소거 활성을 측정한 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 미토콘드리아 막 전위(MMP) 손상 억제 효과를 측정한 형광시험 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 6 내지 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포사멸 단백질 억제효과를 시험한 웨스턴 블롯 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른 NF-κβ 단백질의 핵내 이동 억제 효과를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 시험결과((a),(b)) 및 면역형광법 시험결과(c)를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따른 BV-2 미세포아교세포주에서 두충피의 수 가용추출물 및 두충피 에틸아세테이트 분획물의 세포생존률 및 아질산염 (nitride) 분비억제 비교 시험 결과를 나타낸 그래프이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, ECDW: 두충피 수 가 가용 추출물, LPS: lipopolysaccharide).
도 11은 본 발명의 일 실험예에 따른 프로스타글란딘(PGE2, prostaglandin E2) 분비억제 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, LPS: lipopolysaccharide).
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른 신경염증반응 단백질 및 mRNA 억제효과를 시험한 웨스턴 블롯 그리고 RT-PCR 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, LPS: lipopolysaccharide).
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 LDH 분비(세포독성) 시험 결과를 나타낸 그래프이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포사멸 염색시험 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 ROS 소거 활성을 측정한 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 미토콘드리아 막 전위(MMP) 손상 억제 효과를 측정한 형광시험 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 6 내지 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포사멸 단백질 억제효과를 시험한 웨스턴 블롯 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른 NF-κβ 단백질의 핵내 이동 억제 효과를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 시험결과((a),(b)) 및 면역형광법 시험결과(c)를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine).
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따른 BV-2 미세포아교세포주에서 두충피의 수 가용추출물 및 두충피 에틸아세테이트 분획물의 세포생존률 및 아질산염 (nitride) 분비억제 비교 시험 결과를 나타낸 그래프이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, ECDW: 두충피 수 가 가용 추출물, LPS: lipopolysaccharide).
도 11은 본 발명의 일 실험예에 따른 프로스타글란딘(PGE2, prostaglandin E2) 분비억제 결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, LPS: lipopolysaccharide).
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른 신경염증반응 단백질 및 mRNA 억제효과를 시험한 웨스턴 블롯 그리고 RT-PCR 시험결과를 나타낸 그림이다(ECET: 두충피 에틸아세테이트 분획물, LPS: lipopolysaccharide).
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 약물 및 시약
2,7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO), Hoechst 33258, 6-hydroxydopamine hydrochloride (6-OHDA), lipopolysaccharide, propidium iodide, phosphoric acid, poly-D-lysine, rhodamine 123, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride), sulphanilamide, Tween-20, 및 anti-β-actin 항체는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)의 것을 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)는 Hyclone (Logan, UT, USA)사의 것을 사용하였다. Fetal bovine serum (FBS), 0.25% trypsin-EDTA 및 penicillin/streptomycin mixture는 GIBCO-BRL (Grand Island, NA, USA)사의 것을 사용하였다. Rabbit anti-Bax, rabbit anti-Bcl-2, rabbit anti-Bcl-xL, rabbit anti-caspase-3, rabbit anti-caspase-9, rabbit anti-PARP, rabbit anti-phospho-Akt (Ser473), rabbit anti-phospho-GSK-3a/β(Ser21/9), rabbit anti-GSK-3a/ββ(D75D3), rabbit anti-phospho-JNK (Thr183/Tyr185), anti-rabbit horseradish peroxidase-linked IgG 항체들은 Cell Signaling (Boston, MA, USA)사의 것을 사용하였다. Rabbit anti-cytochrome c, rabbit anti-COX-2, rabbit anti-JNK, and rabbit anti-NF-B p65 항체들은 Epitomics (Burlingame, CA, USA)사의 것을 사용하였다. Rabbit anti-Akt 그리고 rabbit anti-iNOS 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)사의 것을 사용하였다. TRIZOL, cDNA 합성 kit, Alexa Fluor 488 -conjugated goat anti-rabbit IgG 항체는 Invitrogen (MolecularProbes,OR,USA)사의 것을 사용하였다. PGE2 ELISA kit (Cayman, MI, USA)것을 사용하였다. 두충피는 경동시장 (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
실시예 2: 두충피 추출물 및 분획물의 제조
경북안동에서 생장하여 6월에 채취한 두충피(Eucommiae Ulmoides Oliv. Bark.)를 경동시장 (Seoul, Korea)에서 건조된 것을 구입하여 사용하였다. 건조된 두충피를 완전히 건조시킨 후 분쇄하여 두충피 1 ㎏을 70℃의 물에 끊여서 추출한 후, 40℃에서 식혀 이를 여과지(Whatman사, 미국)로 여과한 다음 이를 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축하였다. 동결 건조하여 두충피 수 가용 추출물을 100g 수득하였다.
수득된 두충피 상기 수 가용 추출물은 다시 에틸아세테이트에 1시간 동안 3회를 반복하여 분획하였으며, 수득한 두충피 에틸아세테이트 분획물은 총 5g으로 -20℃에서 보관하여 사용하였다.
실험예 1: SH-SY5Y 신경세포주 및 BV-2 미세아교세포주의 준비
인간신경아세포종 SH-SY5Y 및 BV-2 미세아교세포주들은는 10% FBS (fetal bovine serum) 및 항생물질(Gibco-BRL, USA)이 함유된 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)(Hyclone, Thermo, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기를 37℃ 온도로 유지했고, 95% 공기와 5% CO2가 혼합된 기체를 계속 공급하여 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포는 6-웰 플레이트 혹은 96-웰 플레이트에 각각 1×106 및 2.5×104 세포/웰로 실험 24시간 전에 배양하였다. 6-OHDA 그리고 LPS의 농도는 세포 생존률 및 시험들을 반수억제농도(IC50, inhibition concentration 50) 값을 평가한 후 200 μM 그리고 100 ng/ml로 결정하였다. 두충피 분획물은 50% 에탄올에 녹였으며 50% 에탄올의 최종농도 0.1% 이하로 사용하였다.
실험예 2: 두충피 수 가용 추출물 및 분획물의 세포생존 효과 비교실험
세포 생존률을 측정하기 위해 MTT 환원 어세이를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트에 MTT 용액을 최종농도 0.5 ㎎/㎖가 되도록 각 웰에 넣었다. 배양기에서 2시간 동안 반응시키고 배지와 MTT 용액을 제거한 후 DMSO를 넣어 교반하였다. 완전히 용해되었을 때 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 540 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 세포 생존률을 계산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
세포 생존률(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
그 결과, 도 1의 (a) 및 (b)에 나타나듯이, 두충피 수 가용추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여도 신경세포주의 세포생존률에 유의적인 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 1의 (c) 및 (d)에 나타나듯이, 6-OHDA를 처리할 경우 약 50% 정도의 세포생존률 감소하였고, 이 때 두충피 분획물 각각 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 의 농도로 전처리하면, 각각 74%, 79%, 및 82% 이상의 유의적인 세포 생존률을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05 및 p<0.01). 다만, 두충피 수 가용 추출물은 두충피 분획물과 동일한 농도에서 유의적인 세포 생존률을 나타내지는 않았으며, 특히 농도 100 ㎍/㎖에서는 40% 이하의 생존률을 나타내는 것을 확인하였다. 이로써, 두충피 수 가용 추출물과는 달리 두충피 분획문이, 보다 현저한 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 3: 두충피 분획물의 LDH 분비 측정(세포독성) 실험
LDH 분비 측정(세포독성) 실험을 수행하기 위해 LDH 세포독성 어세이 키트를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트의 배지를 50 ㎕씩 취하여 새로운 96-웰 플레이트에 분주하고, 반응시약을 50 ㎕ 넣은 뒤, 빛에 노출되지 않게 하였다. 배양기에서 30분 동안 반응시키고 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 490 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 LDH 분비량를 계산하였다.
LDH 분비(%) = (배지 내 LDH 분비 O.D. / 배지 내 총 LDH 분비 O.D.)×100
그 결과, 도 2에 나타나듯이 정상대조군(Control)은 10% 이하의 LDH 분비를 나타냈으며, 6-OHDA 처리에 의한 LDH 분비는 163% 이상의 LDH 분비를 나타냈고, 두충피 분획물 각각의 25, 50, 그리고 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 123%, 99%, 그리고 76% 정도의 LDH 분비를 나타냈다(p<0.01 및 p<0.001).
실험예
4:
두충피
분획물의
세포사멸 염색법 실험
세포사멸을 측정하기 위해 Hoechst 33258 그리고 propidium iodide 형광을 표지시켜 형광현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 정성 실험을 실시하였다. 실험을 수행하기 위해 6-웰 플레이트에 커버글라스를 poly-D-lysine으로 24시간 동안 코팅을 한 후, SH-SY5Y 신경세포주를 5×105 개수를 분주시킨 뒤, 6-OHDA를 6시간 반응시켜 세포사멸을 유도하였다. PBS로 2회 세척해준 뒤, 4% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정을 시켰으며, PBS로 3회 반복해서 세척해준 후, 각각의 형광을 15분동안 암실 조건에서 반응시켰고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타나듯이 정상대조군은 Hoechst 33258 그리고 propidium iodide 형광 표지의 강도가 정성적으로 약한 반면에, 6-OHDA 처리된 세포는 형광 표지의 강도가 정성적으로 강하게 나타났다. 그러나, 두충피 추출물 25, 50, 그리고 100 ㎍/㎖를 처리한 경우 형광 표지의 강도가 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
5:
두충피
분획물의
ROS
생성 억제 효과 실험
ROS 소거 활성 측정하기 위해 DCFH-DA 형광을 표지시켜 형광량계(fluorescence meter)를 이용하여 정량 실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분 동안 전처리를 한 뒤, 6-OHDA를 1시간 반응시켜 ROS를 유도시킨 후 DCFH-DA 10mM의 용량을 10 ㎕ 넣어 30분간 반응시켰다. 이때 DCFH-DA는 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. DCFH-DA 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400 g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 이를 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 1 ㎖의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 취한 후, 새로운 96-웰 플레이트에 분주한 뒤, 여기파장 488 nm 그리고 방출파장 515 nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정된 값을 다음 수학식에 대입하여 ROS 생성을 계산하였다.
ROS 생성(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
그 결과, 도 4의 (a)에 나타나듯이 정상 대조군은 약 100% 정도의 ROS 생성을 나타냈으며, 6-OHDA 처리에 의한 ROS 생성은 210% 이상으로 ROS 생성이 증가하였다. 이때 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖를 처리할 경우, 유의적으로 각각 140% 그리고 99% 이하로 ROS 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(p<0.001).
또한, 도 4의 (b)에 나타나듯이 정상대조군은 DCFH-DA 형광 표지의 강도가 정성적으로 약한 반면에, 6-OHDA 처리된 세포는 형광 표지의 강도가 정성적으로 강하게 나타났다. 두충피 분획물을 함께 처리한 경우, 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 형광 표지의 강도가 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다.
실험예
6:
두충피
분획물의
미토콘드리아 막 전위(
MMP
) 손상 억제 효과 실험
MMP 손상 억제 효과를 측정하기 위해 로다민-123 형광을 표지시켜 형광량계를 이용하여 정량실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분간 전처리를 한 뒤, 6-OHDA를 30분간 반응시켜 MMP손상을 유도시킨 후 rhodamine-123 최종농도 10 μM를 10 ㎕ 넣어준 뒤, 30분간 반응시켰다. 이때 rhodamine-123은 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. rhodamine-123 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400 g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 0.5 ㎖의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 취한 뒤 새로운 96-웰 플레이트에 분주하였으며, 여기파장 480 nm 및 방출파장 530 nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 식에 대입하여 ΔΨm 값을 산출하였다.
MMP 생성(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
그 결과, 도 5의 (a)에 나타나듯이 정상대조군은 96% 이하의 MMP을 나타냈으며, 6-OHDA 처리에 의한 MMP는 36% 이하의 MMP를 나타내어 미토콘드리아 막이 현저히 손상된 것을 확인하였다. 이때, 두충피 분획물 각각 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 58% 그리고 83% 이상의 MMP를 나타내어 손상된 미토콘드리아 막 전위를 효과적으로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5의 (b)에 나타나듯이 정상대조군은 rhodamine-123 형광 표지의 강도가 정성적으로 강한 반면에, 6-OHDA 처리된 세포는 형광 표지의 강도가 정성적으로 현저하게 줄어들었다. 한편, 두충피 분획물을 50 및 100 ㎍/㎖ 처리한 경우 형광 표지의 강도가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.
실험예
7:
두충피
분획물의
세포사멸 단백질 억제 효과 실험
신경세포주에서 두충피 분획물의 세포사멸 관련된 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분 동안 전처리를 한 뒤, 6-OHDA로 처리한 뒤, 1시간 또는 6시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 1시간 또는 6시간 뒤, 각각의 농도로 처리된 웰의 상층액을 수집하여 원심분리기를 이용하여 400 g, 3분간 침전시키고, 세포는 차가운 PBS로 세척한 뒤, Tper 용해 버퍼(Thermo, USA) 100 ㎕를 첨가하여 30분간 용해시켰다. 용해물들은 원심분리기를 이용하여, 10000 g, 4℃로 15분간 원심분리시켰으며, 원심분리 후 상층액은 실험을 위한 샘플로서 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질은 BCA 정량분석 키트(Thermo, USA)를 이용하여 정량분석하였으며, 8% 내지 12%의 SDS 겔로 용출한 후 PVDF 막에 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하기 위해, ECL (enhanced chmilumenescence)로 형광발색시켜 확인하는데, 먼저 5% 탈지분유로 막을 1시간 동안 반응시키며, 일차항체인 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Cytochrome c, caspase-3, caspase-9, PARP, phosphorylation JNK, phosphorylation Akt, phosphorylation GSK-3β및 β-actin으로 4℃에서 밤새 표지시켰으며, TTBS로 5회 세척한 다음 이차항체인 HRP (horseradish peroxidase)-conjugated anti-rabbit 그리고 anti-mouse 항체를 상온에서 1시간 동안 표지시켰다. 표지 후 10분간 TTBS를 이용하여 5회 세척하였고, 세척된 막은 ECL를 이용하여, x-ray 필름을 이용하여 발색시켰으며, 농도는 정량분석법에 따라 정량분석프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석하였고 그 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다.
그 결과, 도 6의 (a)에 나타나듯이, Bcl-2 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 Bcl-2 단백질 발현은 53% 이하의 현저한 단백질 발현 감소를 나타냈고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 65%, 70%, 및 95% 이상의 Bcl-2 단백질 발현의 증가를 나타냈다 (p<0.05 그리고 p<0.001).
또한, 도 6의 (b)에 나타나듯이, Bcl-xL 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 Bcl-xL 단백질 발현은 58% 이하의 현저한 단백질 발현 감소를 나타냈으며 (p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 65%, 81%, 및 95% 이상의 Bcl-xL 단백질 발현의 증가를 나타냈다(p<0.05, p<0.01 그리고 p<0.001).
또한, 도 6의 (c)에 나타나듯이, Bax 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 Bax 단백질 발현은 369% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 272% 및 234% 이상의 Bax 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.001).
또한, 도 6의 (d)에 나타나듯이, Cytochrome C 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 Cytochrome C 단백질 발현은 157% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.01), 두충피 분획물 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 119% 이상의 Cytochrome C 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.05).
또한, 도 7의 (a)에 나타나듯이, Cleaved caspase-9 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 cleaved caspase-9 단백질 발현은 247% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 138% 그리고 102% 이상의 cleaved caspase-9 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.001).
또한, 도 7의 (b)에 나타나듯이, Cleaved caspase-3 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 cleaved caspase-3 단백질 발현은 534% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 149% 그리고 105% 이상의 cleaved caspase-3 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.001).
또한, 도 7의 (c)에 나타나듯이, Cleaved PARP 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 Cleaved PARP 단백질 발현은 1034% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 826% 그리고 609% 이상의 Cleaved PARP 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.01 그리고 p<0.001).
또한, 도 8의 (a)에 나타나듯이, p-JNK 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 p-JNK 단백질 발현은 544% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 447%, 389%, 그리고 228% 이상의 p-JNK 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.001).
또한, 도 8의 (b)에 나타나듯이, p-Akt 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 p-Akt 단백질 발현은 297% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 258%, 228%, 그리고 104% 이상의 p-Akt 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.001).
또한, 도 8의 (c)에 나타나듯이, p-GSK-3β 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 p-GSK-3β 단백질 발현은 851% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 757% 그리고 499% 이상의 p-GSK-3β 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.05 그리고 p<0.001).
실험예
8:
두충피
분획물의
NF
-κβ 단백질의
핵내
이동 억제 실험-1
신경세포주에서 두충피 분획물의 NF-κβ 단백질 발현의 동정실험을 위해서 핵과 세포기질을 NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents for cultured cells (Pierce, Rockford, IL, USA) 시약을 이용하여 분리 후 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분 동안 전처리를 한 뒤, 6-OHDA로 처리한 뒤, 1시간 또는 6시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 단백질 발현의 동정실험은 실험예 7과 동일하게 수행하였다.
그 결과 도 9의 (a)에 나타나듯이 NF-κβ 세포기질의 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 나타내었다. 6-OHDA 처리에 의한 NF-κβ 세포기질의 단백질 발현은 54% 이하의 현저한 단백질 발현 감소를 나타내었고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 70%, 83%, 및 84% 이상의 NF-κβ 세포기질의 단백질 발현의 증가를 나타냈다 (p<0.001).
또한, 도 9의 (b)에 나타나듯이 NF-κβ 핵의 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 6-OHDA 처리에 의한 NF-κβ 세포기질의 단백질 발현은 199% 이하의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈으며(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 그리고 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 172%, 154%, 및 134% 이상의 NF-κβ 핵의 단백질 발현의 감소를 나타냈다(p<0.05, p<0.01, 그리고 p<0.001).
실험예
9:
두충피
분획물의
NF
-κβ 단백질의
핵내
이동 억제 실험-2
신경세포주에서 두충피 분획물의 NF-κβ 단백질 발현의 정성실험을 위해 면역형광법(immunocytochemistry) 실험을 수행하였다. NF-κβ 단백질의 핵내 이동을 관찰하기 위해 NF-κβ 1차항체를 24시간동안 4에서 표지시킨 후, Alexa Fluor 488 -conjugated goat anti-rabbit IgG 2차항체로 표지시켜 타겟 단백질의 정성적 변화를 관찰하였으며, 핵은 Hoechst 33258 (5 ㎍/㎖)를 형광을 표지시켜 형광현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 정성 실험을 실시하였다. 실험을 수행하기 위해 6-웰 플레이트에 커버글라스를 poly-D-lysine으로 24시간 동안 코딩을 한 뒤, SH-SY5Y 신경세포주를 5×105 개수를 분주시킨 뒤, 6-OHDA를 6시간 반응시켜 세포사멸을 유도하였다. PBS로 2회 세척해준 뒤, 4% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정을 시켰으며, PBS로 3회 반복해서 세척해준 후, 각각의 형광을 15분동안 암실 조건에서 반응시켰다.
그 결과, 도 9의 (c)에 나타나듯이 정상대조군은 NF-B 항체에 Alexa Fluor 488 -conjugated goat anti-rabbit IgG 2차항체 형광 표지의 강도가 세포기질내에 정성적으로 다량 존재하는 반면에, 6-OHDA 처리된 세포는 형광 표지가 정성적으로 핵내에 다량으로 강하게 나타났다. 이때 두충피 분획물 50 및 100 ㎍/㎖을 처리한 경우 형광 표지의 강도가 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
실험예
10:
두충피
수 가용 추출물 및
분획물의
세포생존 및 아질산염 억제효과 비교실험
세포 생존률을 측정하기 위해 MTT 환원 어세이를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트에 MTT 용액을 최종농도 0.5 ㎎/㎖가 되도록 각 웰에 넣었다. 배양기에서 2시간 동안 반응시키고 배지와 MTT 용액을 제거한 후 DMSO를 넣어 교반하였다. 완전히 용해되었을 때 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 540 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 세포 생존률을 계산하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
세포 생존률(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
그 결과, 도 10의 (a) 및 (b)에 나타나듯이, 두충피 수 가용추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여도 신경세포주의 세포생존률에 유의적인 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 10의 (c) 및 (d)에 나타나듯이 LPS를 처리할 경우 약 39 μM 정도로 아질산염이 증가하였고 이 때, 두충피 분획물 각각 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 전처리하면, 각각 79%, 그리고 82% 이상으로 유의성 있게 아질산염이 감소하는 것을 확인하였다(p<0.001). 다만 두충피 수 가용 추출물의 경우, 두충피 분획물과 동일한 저농도에서 아질산염 생성 저해효과가 거의 없었으며, 고농도에서도 두충피 분획물과 비교할 때 유의적이고 현저한 아질산염 억제 효과는 나타내지는 않는 것을 확인하였다.
실험예
11:
두충피
분획물의
프로스타글란딘(
PGE
2
) 억제효과 실험
미세아교세포주에서 두충피 분획물의 PGE2 생성의 억제실험을 위해서 ELISA 실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분 동안 전처리를 한 뒤, LPS로 처리한 뒤, 24시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 24시간 뒤, 각각의 농도로 처리된 웰의 상층액을 수집하여 원심분리기를 이용하여 400 g, 3분간 침전시키고, PGE2 ELISA kit를 사용하여 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 490 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 standard curve의 정량 그래프를 이용하여 PGE2 생성을 계산하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타나듯이, LPS를 처리할 경우 약 565 pg/ml 정도의 PGE2 생성의 증가가 나타났다. 이 때, 두충피 분획물 각각 2.5, 5, 10, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 처리하면, 각각 525, 525, 471, 428, 329, 그리고 164 pg/ml의 유의적인 PGE2 생성 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다(p<0.05, p<0.01, 그리고 p<0.001).
실험예
12:
두충피
분획물의
iNOS
그리고
COX
-2 단백질 및
mRNA
발현 억제 실험
미세아교세포주에서 두충피 분획물의 신경염증 관련된 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 두충피 분획물을 30분 동안 전처리를 한 뒤, LPS로 처리한 뒤, 6시간 또는 24시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 6시간 또는 24시간 뒤, 각각의 농도로 처리된 웰의 상층액을 수집하여 원심분리기를 이용하여 400 g, 3분간 침전시키고, 세포는 차가운 PBS로 세척한 뒤, Tper 용해 버퍼(Thermo, USA) 100 ㎕를 첨가하여 30분간 용해시켰다. 용해물들은 원심분리기를 이용하여, 10000 g, 4℃로 15분간 원심분리시켰으며, 원심분리 후 상층액은 실험을 위한 샘플로서 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질은 BCA 정량분석 키트(Thermo, USA)를 이용하여 정량분석하였으며, 8% 내지 12%의 SDS 겔로 용출한 후 PVDF 막에 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하기 위해, ECL (enhanced chmilumenescence)로 형광발색시켜 확인하는데, 먼저 5% 탈지분유로 막을 1시간 동안 반응시키며, 일차항체인 iNOS, COX-2 및 β-actin으로 4℃에서 밤새 표지시켰으며, TTBS로 5회 세척한 다음 이차항체인 HRP (horseradish peroxidase)-conjugated anti-rabbit 그리고 anti-mouse 항체를 상온에서 1시간 동안 표지시켰다. 표지 후 10분간 TTBS를 이용하여 5회 세척하였고, 세척된 막은 ECL를 이용하여, x-ray 필름을 이용하여 발색시켰으며, 농도는 정량분석법에 따라 정량분석프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다. 또한 mRNA의 발현을 확인하기 위해 TRIZOL (Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였으며, cDNA 합성 kit(Invitrogen)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR은 iNOS, COX-2 및 β-actin의 프라이머를 사용하였고, 프라이머 서열을 하기 표에 나타내었다.
| 유전자 | 정방향프라이머 | 역방향프라이머 | RT-PCR 산물크기 (bp) |
| iNOS | 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3’ | 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3’ | 497 |
| COX-2 | 5'-TTGAAGACCAGGAGTACAGC-3’ | 5'-GGTACAGTTCCATGACATCG-3’ | 324 |
| β-actin | 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’ | 5'-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3’ | 222 |
＆
그 결과, 도 12의 (a)에 나타나듯이, iNOS 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, LPS 처리에 의한 iNOS 단백질은 431% 이상의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 372%, 303%, 및 258% 이상의 iNOS 단백질 발현의 감소를 나타냈다 (p<0.01 그리고 p<0.001).
도 12의 (b)에 나타나듯이, COX-2 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, LPS 처리에 의한 COX-2 단백질은 161% 이상의 현저한 단백질 발현 증가를 나타냈고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 145%, 113%, 및 106% 이상의 COX-2 단백질 발현의 감소를 나타냈다 (p<0.01 그리고 p<0.001).
도 12의 (c)에 나타나듯이, iNOS mRNA 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, LPS 처리에 의한 iNOS mRNA는 296% 이상의 현저한 mRNA 발현 증가를 나타냈고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 174%, 136%, 및 105% 이상의 iNOS mRNA 발현의 감소를 나타냈다 (p<0.01).
도 12의 (d)에 나타나듯이, COX-2 mRNA 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, LPS 처리에 의한 COX-2 mRNA는 258% 이상의 현저한 mRNA 발현 증가를 나타냈고(p<0.001), 두충피 분획물 각각의 25, 50, 및 100 ㎍/㎖의 용량에서 유의적으로 각각 248%, 193%, 및 104% 이상의 COX-2 mRNA 발현의 감소를 나타냈다 (p<0.001).
[통계처리]
모든 실험 결과는 ANOVA (two 그리고 one way anlysis of variance)를 이용하여 통계처리하였고, 유의성이 검증될 경우 Newman-keul 및 Dunnett를 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of
Parkinson's disease comprising Eucommiae ulmoides extract or
fraction thereof
<130> PA121181/KR
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS forward primer
<400> 1
cccttccgaa gtttctggca gcagc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS reverse primer
<400> 2
ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 forward primer
<400> 3
ttgaagacca ggagtacagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 reverse primer
<400> 4
ggtacagttc catgacatcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin forward primer
<400> 5
agccatgtac gtagccatcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin reverse primer
<400> 6
gctgtggtgg tgaagctgta 20
Claims (8)
- 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1-C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분획물은 물, C1-C4 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 분획한 것인 약학적 조성물.
- 두충피(Eucommiae ulmoides) 수 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 두충피(Eucommiae ulmoides) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제5항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1-C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 건강기능식품.
- 제5항에 있어서, 상기 분획물은 물, C1-C4 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 분획한 것인 건강기능식품.
- 두충피(Eucommiae ulmoides) 수 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020130022329A KR101468288B1 (ko) | 2013-02-28 | 2013-02-28 | 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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|---|---|---|---|
| KR1020130022329A KR101468288B1 (ko) | 2013-02-28 | 2013-02-28 | 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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|---|---|
| KR20140107992A KR20140107992A (ko) | 2014-09-05 |
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ID=51755397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130022329A KR101468288B1 (ko) | 2013-02-28 | 2013-02-28 | 두충피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101468288B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230110891A (ko) * | 2022-01-17 | 2023-07-25 | 경상국립대학교산학협력단 | 두충 잎 분획물을 포함하는 미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100043669A (ko) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | 주식회사 유니베라 | 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물 |
| KR20110002237A (ko) * | 2009-07-01 | 2011-01-07 | 박현미 | 두충 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2013
- 2013-02-28 KR KR1020130022329A patent/KR101468288B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100043669A (ko) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | 주식회사 유니베라 | 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물 |
| KR20110002237A (ko) * | 2009-07-01 | 2011-01-07 | 박현미 | 두충 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| G. C. Yen et al. Journal of agricultural and food chemistry. 2000, 48(8), 3431-3436 * |
| 백남인 등. 한국농화학회지. 1999, 42(2), 166-169 * |
| 백남인 등. 한국농화학회지. 1999, 42(2), 166-169* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20140107992A (ko) | 2014-09-05 |
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