KR101452905B1

KR101452905B1 - 암 선택적 영양요구균주

Info

Publication number: KR101452905B1
Application number: KR1020077002293A
Authority: KR
Inventors: 밍 자오; 멩 양
Original assignee: 안티캔서, 인코포레이티드
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2014-10-21
Anticipated expiration: 2025-06-29
Also published as: KR20070030941A; JP2013048630A; JP2008504822A; US8822194B2; CA2572756C; AU2005260697B2; EP1781096A1; WO2006004992A1; EP1781096A4; US20090300779A1; CN101010002A; AU2005260697A1; JP6117511B2; CN101010002B; CA2572756A1; EP1781096B1

Abstract

적어도 1종의 종양에서 발견되는 아미노산 2종 이상에 대한 영양요구성인 세균은 효율적인 항종양 치료제, 표지제 및 감염에 대한 백신이다. 이러한 균주들을 적절한 종양 모델에서 계대시킴으로써 향상된 항종양 효과들을 제공할 수 있다.

이중 영양요구성(double auxotrophic), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 항종양(antitumor), 형광 단백질(fluorescent protein), GFP.

Description

암 선택적 영양요구균주{CANCER SELECTIVE AUXOTROPHS}

관련 출원

[0001] 본 출원은 2004년 6월 29일 미국 가특허출원 제60/584,301호의 우선권주장 출원으로서 상기 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 통합된다.

기술분야

[0002] 본 발명은 영양소로서 적어도 두 개의 아미노산을 필요로 하도록 변형되고, 나아가 종양에 대한 부착성 및 균력(virulence)이 증가된 항종양 세균에 관한 것이다. 실례로서, 아르기닌 및 루신을 필요로 하는 이중의 영양요구성 돌연변이를 포함하는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)은 생체내(in vivo) 무독성이고 종양에서 선택적으로 성장하는 것으로 입증된 바 있다.

[0003] 혐기성 세균이 종양 내에서 선택적으로 성장한다는 것은 잘 알려진 사실이고, 실제로도 환자들로부터 절제된 종양들 내에서 세균들이 대량 발견되었다. 이에 따라, 종양 치료를 위해 세균을 이용하는 것이 제안되었다. 예를 들어, Yazawa, K., 외(外), Breast Canc. Res. and Treat. (2001)66:165-170에서는 비병원성 그람 양성 세균인 비피도박테리움 롱움(Bifidobacterium longum)이 정맥 내로 주사되었을 때 쥐에게서 유도된 유방 종양 내에서 선택적으로 성장된 것으로 입증되었다. Dang, L.H., 외(外), Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98:15155-15160에서는 그 치사 독소가 소진된 클로스트리디움 노비이(Clostridium novyi)의 한 균주가 생쥐 종양의 무혈관 영역에서 발아되어 주변의 생존가능한 암세포들을 파괴하는 포자들을 생산하는 것으로 입증되었다.

[0004] aro 유전자의 파괴에 의한 영양요구성 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)은 억제된 균력을 가진 것으로 나타났고, 그렇기 때문에 Hoiseth, S. K. J., 외(外), Nature (1981) 291 :238-239에 의해 설명된 것처럼 생백신으로서 유용하다. aro 유전자의 파괴는 파라-아미노벤조산(para-aminobenzoic acid)(PABA) 및 2,3-다이하이드록시벤조에이트(2,3-dihydroxybenzoate)(DHB)의 생산을 모두 억제하였다. PABA에 대해서만 영양요구성을 나타내는 살모넬라(Salmonella)와 DHP에 대해서만 영양요구성을 나타내는 살모넬라(Salmonella) 영양요구균주를 만들어낸 초기 연구에서도 균력이 감소하였지만, 이중 영양요구성을 초래하는 aro 유전자를 파괴하자, 사실상 균력이 모두 사라졌다.

이어서 Pawelek, J., 외(外), Cancer Res. (1997) 57:4537-4544는 감소된 병원성을 가진 항종양 치료제로서 pur ^-(아데닌과 비타민 B1을 요구하는) 살모넬라(Salmonella) 돌연변이주를 설명한다. Low, B., 외(外), Nature Biotech. (1999) 17:37-41에서는 msbB 유전자가 파괴된 지질-A-돌연변이 살모넬라(Samonella)를 보고하였는데, 이로 인해 TNFα 유도가 감소되었고 LD₅₀은 10,000배 증가되었다. 정상 조직과 비교해서 종양 축적 비율이 1,000:1을 초과하는 것으로 보고되었다. 이러한 변형된 살모넬라(Salmonella)로 처리된 생쥐의 흑색종의 크기는 미처리 대조군에서의 종양 크기의 6%였다.

[0005] 더욱이, Toso, J. F., 외(外), J. Clin. Oncol. (2002) 20:142-152에서 보고된 것처럼, 약독화된(attenuated) S. 티피무리움(S. typhimurium)이 제1상 임상 시험(Phase I clinical trial)에서 평가되었다. 전이성 흑색종을 가진 24명의 환자들 및 전이성 콩팥세포암종 환자 1명에게, purⅠ 및 msbB 유전자 양쪽의 결실에 의해 약독화된 지질-A-돌연변이 살모넬라 티피무리움(VNP20009) 10⁶ 내지 10⁹cfu/㎡를 정맥일시주입(IV bolus infusion)하였다. purⅠ 돌연변이주는 아데닌의 외부 공급원을 요구하고, msbB 돌연변이주는 지질-A-영역에 말단 미리스틸(myristyl)기가 첨가되는 것을 막는다. VNP20009 균주는 환자에게 안전하게 투여될 수 있고, 최고 관용 투여량에서 종양 집락형성(colonization)이 관찰되었다.

[0006] 종양의 세균치료의 정밀성은 물론 세균 감염의 진행과정을 추적하기 위한 시스템에 의해 높일 수 있다. 그러한 시스템 중 하나가 참조로 본 발명에 포함된 2003년 8월 28일 공개된 미국 특허 공개 2003-0161788에서 설명되어 있다. 이 공개문헌에서 설명되어 있듯이, 형광 단백질로 표지된 대장균(E. coli)과 같은 세균이 감염의 모니터링 및 치료의 평가에 사용된다. 모델 시스템은 물론 실제 치료받은 대상들에 있어서도 표지된 세균 그 자체를 직접적으로 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 원하는 대비를 제공하기 위해 종양 조직에 서로 다른 색의 형광 표지를 제공할 수 있다. 한 구체예에서, A. 빅토리아(A. victoria)의 녹색 형광 단백질(GFP)의 변종을 발현하도록 변형된 S. 티피무리움이 누드 생쥐의 적색 형광 단백질(REP's)로 표지 된 종양 안으로 주입되었다. 또 다른 구체예에서는, REP를 발현하도록 변형된 대장균(E. coli)이 GFP로 표지된 종양을 갖는 누드 생쥐에게 주입되었다. 이들 세균은 그들 자신의 고유의 항종양 효과를 가질 뿐 아니라, IL2 또는 메티오니나제(methioninase)와 같은 치료물질을 생산할 수 있도록 변형될 수도 있는 것으로 확인되었다.

[0007] Yu, Y.A., 외(外), Nat. Biotechnol. (2004) 22:313-320에서는 살아있는 동물 내로 정맥내 주사된 GFP를 발현하는 세균이 고형종양과 유방, 전립샘, 뇌의 종양 및 섬유육종을 포함하는 전이성암에서 복제되는 것으로 나타났다. 종양에서의 성장을 GFP뿐만 아니라 루시퍼라제-촉매 발광(luciferase-catalyzed luminescence)을 이용하여 실시간으로 조영하였다. 대장균(E. coli) 및 세 가지 약독화된 병원체인 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), S. 티피무리움(S. typhimurium) 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)가 종양 내에서 복제되었다.

[0008] 종양에 대한 선택성은 증대되고 독성은 감소됨으로 해서 치료물질 또는 백신으로서 사용될 수 있고 그리고 종양의 진행을 모니터링하고 종양의 치료를 평가하고 최적화하는 가이드 역할을 할 수도 있는 개선된 세균 균주가 요망되고 있다. 본 발명은 그러한 개선된 세균 균주를 제공한다. Zhao, M., 외(外), Proc. Am. Assoc. Cancer Res. (2004) 45:869 (No. 3765)에 의해 발표된 초록에는 본 발명에 따라 만들어진 S. 티피무리움의 효과가 설명되어 있기는 하나, 돌연변이의 특성은 기술되어 있지 않다.

[0009] 이하에서 설명된 영양요구균주 A1의 상세한 기술은 참조로 본 발명에 포함된 Zhao, M., 외(外), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102:755-760에 나타나 있다. 이에 관한 간단한 개요는 Nature Biotechnology (2005) 23:189에서 찾아볼 수 있다.

발명의 개시

[0010] 본 발명은 적어도 두 개의 아미노산, 예컨대 아르기닌 및 루신에 대해 영양요구성인, 상기한 목적에 유용한 세균 균주를 제공한다. 이들 이중 영양요구균주는 대상자에게 투여되었을 때 매우 증가된 종양 선택성, 감소된 독성 및 감소된 TNFα의 생산성을 나타낸다.

[0011] 그러므로 한가지 관점에서, 본 발명은 약제학적 조성물로서 만들어진 영양 배지에서 적어도 두 개의 아미노산을 필요로 하도록 변형된 혐기균(anaerobe) 또는 조건 혐기균(facultative anaerobe)과 관련된다. 한가지 구체예로서, 본 발명의 이중 영양요구균주는 형광 단백질을 발현하도록 더욱 변형된다.

[0012] 또 다른 관점에서, 본 발명은 생체 내(in vivo) 생쥐 종양 모델로 계대배양(passage)하여 얻을 수 있는 부착성, 균력 및/또는 침입성이 증가된 앞 단락에서 설명된 것 같은 혐기균들과 관련된다.

[0013] 다른 관점들에서, 본 발명은 본 발명의 이중(또는 이중보다 더 많은) 영양요구균주를 사용하여, 대상에서 종양을 치료하기 위한 방법들과 그들을 이용한 백신에 관한 것이다. 또한 다른 관점들에서, 본 발명은 형광 단백질을 포함하도록 변형된 영양요구균주를, 예를 들어 종양이 있는 대상들에게 투여하였을 때 이들의 거동을 관찰하는 것에 의한 치료 모니터링 방법들과 관련된다. 한가지 구체예에서는, 종양들 자체를 형광 단백질에 의해 표지시킨다.

발명의 실시 태양

[0019] 성장을 위해 적어도 두 종의 아미노산을 요구하는 혐기성 또는 통성 혐기성 세균의 돌연변이주를 표준 돌연변이유발 기술들을 사용하여 만든다. 대장균의 경우에서처럼 그 세균의 게놈 조성(genomic composition)이 알려진 경우에는 예를 들어 유도된 돌연변이 또는 상동 재조합 기술들이 이들 돌연변이들을 특이적으로 만들기 위해 사용될 수 있다. 별법으로서, 방사선 또는 화학적 자극과 같은 비특이적 돌연변이 기술들을 수행한 다음 본 발명 기술분야에서 표준인 선별 과정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 요구되는 아미노산을 모두 포함하는 배지에서 돌연변이를 일으킨 세균을 성장시키고 개개의 콜로니들을 분리한다. 각각의 아미노산 중 하나가 부족한 배지에서 자라지 못한 콜로니들을 골라내서, 적당한 대체 배지의 성장 여부를 측정한다. 배지에 적어도 두 종 이상의 아미노산의 첨가가 요구되는 콜로니들을 선택한다.

[0020] 이중 돌연변이주는 생체 내(in vivo) 종양 모델에서 계대시켜(passaged) 재분리될 경우, 종양 세포들에 대한 부착성 및/또는 침입성 및/또는 균력이 증가된 콜로니들을 만든다는 것 역시 밝혀졌다. 이렇게 더 변형된 세균은 이하에서의 영양요구균주에 대해 설명된 방법들에 있어서 특히 유용하고 무독성이다.

[0021] 이러한 방법으로 변형될 수 있는 적절한 혐기성 세포로는 살모넬라(Salmonella), 클로스트리디움(Clostridium), 에스체리치아(Escherichia), 비브리오(Vibrio), 리스테리아(Listeria), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 편의상 이용가능한 기타의 다양한 균주들을 들 수 있다.

[0022] 몇몇 경우에서는 예를 들어 클로스트리디움처럼, 그 유기체의 독을 제거하기 위한 추가적인 변형이 또한 요구될 수 있다. 본 발명의 영양요구균주는 다양한 측면에서, 예를 들면 종양에 대한 직접적 치료는 물론, 야생형 세균에 의한 감염에 대항하는 백신이나, 종양에 선택적으로 전달되는 치료 단백질을 위한 발현 시스템의 운반체로서, 병의 진행의 모니터링, 프로토콜 자체의 최적화뿐만 아니라 치료 프로토콜 후보들의 평가하는데 유용하다. 본 발명의 세균은 종양에 의해서는 적절하게 공급되지만 숙주에 의해서는 일반적으로 그렇지 않은 적어도 두 개의 아미노산에 의존한다는 특징을 갖는다. 이하의 예증을 위해 사용된 것은 루신 및 아르기닌 양쪽을 필요로 하는 이중 영양요구균주이다; 그러나 다른 조합들도 역시 사용될 수 있으며, 유사하지 않은 아미노산들의 조합들이 바람직하다. 그러므로 히스티딘 및 메티오닌 양쪽, 발린 및 아스파트산 양쪽, 글루탐산 및 세린 양쪽을 필요로 하는 것 등의 돌연변이주 역시 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그 요구되는 두 아미노산은 서로 다른 경로로부터 유래하는 것이 좋다. 따라서 트립토판과 알라닌 또는 글루타민과 라이신 등을 요구하는 조합이 사용될 수 있다. 바람직한 조합은 히스티딘/알라닌; 히스티딘/발린; 히스티딘/루신; 아르기닌/루신; 아르기닌/발린; 아르기닌/이소루신; 라이신/메티오닌; 라이신/발린; 등과 같은 염기성 아미노산과 중성 아미노산의 조합이다. 아래에 묘사된 것은 아르기닌 및 루신 영양요구성 조합이다.

[0023] 이하에서, 이 특별한 영양요구균주는 종양에서의 성장을 위해 매우 선택적이면서 무독성인 것으로 증명된다. 암세포주에 대한 연구들에서 출원인들은 감염 이후에, 다수의 세포내 세균의 축적이 생쥐 MMT 유방암 세포 및 생쥐 Bl 6F10 흑색종 세포의 비특이적인 파괴를 일으킨다는 것을 보여주었다. 이들 이중 영양요구균주는 PC-3 인간 전립샘 종양 세포에서의 세포사멸(apoptosis) 및 세포괴사(necrosis)를 유도하였다. 생체 내(in vivo) 연구 결과 이들 돌연변이주가 PC-3 종양들의 치료와 병에 걸린 생쥐의 생존 시간의 증가에서 성공적이라는 것을 보여주었다.

[0024] 본 발명의 영양요구균주는 종양 조직에서 증식해야만 하기 때문에, 종양에 존재하는 이들의 농도는 아미노산의 요구사항을 만족하여야 한다. 그러므로 세균에 의해 요구되는 아미노산은 세균의 성장을 지지하는데 충분한 농도로 존재하여야 한다. 이들은 적어도 하나의 종양 유형에서 존재해야만 한다. 측정은 종양세포 배양법을 사용하여 시험관내(in vitro)에서 손쉽게 수행할 수 있다. 상기 배양 패널은 국립암협회(National Cancer Institute)와 같은 다양한 출처들로부터 입수할 수 있다. 적어도 하나의 세포 배양에서 세포들이 성장하고 있는 한, 그들은 본 발명의 영역에 포함될 것이다.

[0025] 본 발명의 특별히 유용한 영양요구균주는 치료 대상자 또는 실험 연구 동물에서 종양 성장의 억제능력이 개선되고, 종양을 퇴행시키며 생존 시간을 연장시키는 균주들이다. 이들 균주들은 종양에 대한 강화된 부착력 및/또는 침입성 및/또는 균력을 보여주고, 일반적으로 생체내(in vivo) 종양 모델에서 상기 영양요구균주나 혐기성 또는 통성 혐기성균을 생체내(in vivo) 계대(passage)함으로써 얻을 수 있다. 일반적으로 계대를 위한 종양 모델은 선택된 세균의 증식에 특히 유리한 기관과 관련된 것이다. 예를 들어, S. 티피무리움(S. typhimurium)은 일반적으로 결장(colon)에서 존재하므로, 결장 종양 모델을 사용하는 것이 좋다. 바람직한 특성의 향상이 달성되는 메커니즘은 불명확하지만, 아래의 실시예들에서 상세하게 개설된 것과 같이 대상 세균을 종양 모델 속으로 주입하고, 예를 들면 균질화(homogenizing) 및 상층액의 회수에 의해 종양으로부터 세균을 회수한 다음, 원하는 특성들을 가진 콜로니를 선택함으로써 향상된 특질을 신뢰성 높게 얻을 수 있다.

[0026] 본 발명의 치료 또는 예방 방법으로부터 이익을 얻는 동물 대상들은 고형종양이 발생할 수 있는 모든 범위의 동물들이나, 전형적으로 어류, 조류 및 포유류와 같은 척추동물이고, 가장 전형적으로는 포유류이다. 인간의 치료가 주목적이기는 하지만 개 및 고양이 같은 반려 동물의 치료에서 그러한 것처럼 돼지, 소, 양 및 염소, 닭, 칠면조 등과 같은 가축의 치료 또한 명백히 유익하다. 본 발명의 방법들은 사용된 형광 단백질에 의해 방출되는 형광의 세기에 기인해서 이들 동물 대상에 대해서도 침습 기술에 의하지 않고도 실시간 관찰을 제공한다.

[0027] 예컨대 쥐, 생쥐 및 토끼 같은 실험 동물의 사용은 질병의 진행과 약의 효능 시험을 위한 모델 시스템으로서 또한 매우 중요하다. 형광 세균을 이용한 본 발명의 그러한 구체예들은 특히 이러한 배경에 있어 유용하다. 한편 치료받은 척추동물에서의 질병의 진행에서도 또한 표지된 세균을 이용할 수 있다.

[0028] 본 발명의 영양요구성 혐기균은 치료와 예방에 유용한 약학 및 수의학적 조성물로 제조될 수도 있다. 이들 조성물들은 추가적인 생리학적으로 허용가능한 부형제(excipient)를 포함한다; 다양한 투여 경로에 적절한 치료제 및 백신을 위한 처방이 예를 들어 Mack Publishing Co., Easton, PA의 Remington's Pharmaceutical Sciences 최신판에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 발명에 참조 포함된다. 그 제형들은 분말, 캡슐, 시럽, 알약, 주사용액 등의 형태로 될 수 있다. 조절 방출형 제형들, 리포좀 제형 및 이식물(implants)들이 사용될 수 있다. 제형 및 투여의 경로의 선택은 각각의 적용에 따른 통상적인 기술범위이다.

[0029] 예를 들어 감염 경과의 모니터링을 위하여 종양을 표지할 경우, 형광 단백질이 표지를 위해 사용된다. 가시적 표지(marker)인 형광 단백질로 세균을 표지하는 것의 장점은 그 결과 고형종양 내에서 그들의 이동과 집락형성(colonization)의 추적이 가능하고 그 결과 이들 세균에 의한 치료제의 국지적인 생산이 조절되고 측정될 수 있다는 점이다.

[0030] 더욱이 형광단백질을 사용하면 형광 세포들의 이동 및 무손상(intact) 동물에서의 단백질의 생산을 관찰하는데 충분한 강도를 얻을 수 있으므로, 이러한 측면의 측정은 물론, 종양 퇴행 및 전이 또는 그로부터의 억제의 경과를 실시간으로 무손상 대상에서 관찰할 수도 있다. 이것은 서로 다른 파장에서 형광을 내는 단백질을 가지고 종양 세포들 그 자체를 표지함으로써 최적화할 수 있다.

[0031] 본 발명의 다양한 측면들에서 사용된 표지는 형광 단백질, 즉 적절한 파장으로 조사될 경우 가시광선을 발하는 단백질이다. 이들 부류 중에서 정액 단백질을 암호화(encoding)하고 있는 천연 유전자, GFP는 생체발광(bioluminescent) 해파리 아쿠오리아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 클론화 되었다(Morin, J., 외(外), J. Cell. Physiol. (1972) 77:313-318). 이 유전자는 입수가 용이하므로 유전자 발현을 위한 표지로서 GFP를 사용할 수 있다. 원래의 GFP 그 자체는 27 kD의 분자량을 가진 283개 아미노산의 단백질이다. 이 유전자는 형광을 내기 위해 그것의 천연 출처로부터 추가적인 단백질들을 필요로 하지도 않고, 또한, 그 천연 출처에서만 이용가능한 기질 또는 보조인자(cofactor) 역시도 필요로 하지 않는다.(Prasher, D. C, 외(外), Gene (1992) 111 :229-233; Yang, F., 외(外), Nature Biotechnol (1996) 14:1252-1256; Cody, C. W., 외(外), Biochemistry (1993) 32:1212-1218.) 본래의 GFP 유전자의 돌연변이는 발현을 증폭시키고 생성물의 여기(excitation)와 형광 발광을 조절하는데 유용하다는 것이 발견되었으며, 적색, 노란색 및 청색을 비롯한 다양한 색깔의 "GFP"가 얻어졌다. GFP-S65T(65번 세린 잔기가 트레오닌으로 치환된 것)은 본 발명의 방법에서 특히 유용하고 490 nm에서 단일 여기(excitation) 피크를 가진다.(Heim, R., 외(外), Nature (1995) 373:663-664); 미국 특허 No. 5,625,048. 다른 돌연변이들은 Delagrade, S., 외(外), Biotechnology (1995) 13:151-154; Cormack, B., 외(外), Gene (1996) 173:33-38 그리고 Cramer, A., 외(外), Nature Biotechnol (1996) 14:315-319에 의해 또한 발표되었다. 추가적인 돌연변이들은 U.S. Patent No. 5,625,048에서 또한 공개되었다.

[0032] 적절한 변형에 의해서, GFP에 의해 방출되는 빛의 스펙트럼은 변경될 수 있다. 따라서, 비록 "GFP"라는 용어가 본 출원에서 종종 사용되지만, 이 분야의 연혁적 관행상 이 정의 내에 포함되는 단백질은 외관이 반드시 녹색일 필요가 없고, 형광 단백질이면 된다. "GFP"의 다양한 형태들은 녹색이 아닌 다른 색들을 내고, 이들 역시 "GFP"의 범위 내에 포함되며 이들은 본 발명의 방법들 및 물질들에 있어서 유용하다. 더욱이, "GFP"의 정의에 들어가는 녹색 형광 단백질은 바다 팬지(sea pensy), 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)와 같은 다른 유기체로부터 분리된다. 적절하고 편리한 형태이면 어느 색깔의 "GFP"이건, 천연형이나 돌연변이형을 막론하고 모두 본 발명에서 유용한 감염체의 변형에 사용될 수 있다.

[0033] 혼동을 피하기 위하여 단순하게 "형광 단백질(fluorescent protein)"이라는 용어도 자주 사용될 것이다; 일반적으로, 이는 레닐라(Renilla) 및 아쿠오리아(Aequorea)와 같은 다양한 유기체들에 의해 생산되는 형광 단백질뿐만 아니라, 다양한 가시적 색들의 형광을 발할 수 있는 천연 형광 단백질들의 변형된 형태도 지칭하는 것이다. 일반적으로, "형광 단백질" 및 "GFP"라는 용어들은 때때로 호환적으로 사용되어 진다; 그러나 때때로 특정의 다른 색이 언급될 수 있다. 그 시스템은 오로지 연상기호 암기법(mnenomic)과 관련 있고, 예를 들면 RFP가 적색 형광 단백질을, YFP가 노란색 형광 단백질을, BFP가 청색 형광 단백질을 지칭하며 기타의 경우도 같다. 이들 단백질에 가해진 특정 변형에 따라, 광범위한 가시광선의 파장이 이들 단백질에 의해 방출될 수 있다.

[0034] 다양한 색상의 형광 단백질들을 이용할 수 있기 때문에, 복수 색상을 이용한 조영을 동시에 실행할 수 있다. 예를 들어 각각 특징적인 형광을 발하는 두 개의 서로 다른 세균 제제 또는 세 개의 서로 다른 세균이 대상에 투여될 수 있고, 또는 하나의 세균을 단일색으로 구조적으로(constitutively) 표지하고, 다른 색은 유전자 산물과의 융합물을 생산하는데 사용할 수 있다. 세균 그 자체를 표지하는데 사용된 색과는 다른 색을 가진 형광 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 생산될 단백질의 유전자 자리에 삽입되거나 또는 생산될 치료용 단백질과의 융합단백질로서 벡터에 삽입될 수 있다.

[0035] 이와 같이 다양한 색상들을 이용할 수 있다는 것은 본 발명에서 특히 유리하다. 예컨대, 종양 자체를 한가지 색상의 형광 단백질로 표지시키고, 투여되는 세균은 다른 색상의 구조적 또는 세포내 단백질로 표지시킴으로써 그 세균의 위치를 더욱 잘 확인할 수 있으며, 그 세균의 단백질 산물을 제3의 색상으로 표지함으로써 이 단백질의 생산 정도를 모니터할 수 있다. 그러므로 살아있는 동물에서의 전신 관찰을 이용하면, 투여된 세균의 위치의 결정, 그 세균에 의한 치료 단백질의 생산 수준의 모니터링 및 종양에 대한 효과의 모니터링을 모두 동시에 할 수 있다.

[0036] 본 발명에 사용되는 형광 단백질은 살아있는 동물에서의 위의 현상들에 대한 실시간 관찰을 제공할 수 있을 만한 충분한 강도가 있다. 이는 선행기술에서 설명되는 세균 전달과 관련한 "맹목적인(blind)" 접근법을 크게 진보시키는 것이다. 동물은 살아있기 때문에, 이러한 관찰들의 지시결과에 따라, 그 효율을 증가시키기 위한 치료 프로토콜을 유리하게 조절할 수 있다.

[0037] 종양의 표지가 요구되는 경우, 종양 세포에서 형광 단백질을 발생시키는 것이 미국 특허 6,251,384 및 6,235,968에서 본 출원인들에 의해서 설명되었으며, 이들 모두 참조로 본 명세서에 포함되어 있다. 간단히 말하면, 형광 단백질 발현을 위해서, 바이러스 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 이미 고형종양을 가진 대상에게 투여할 수 있다. 대안으로 발현 벡터는 고형 종양들의 경우에는 종양 속으로 주입될 수도 있다. 모델 시스템들은 종양을 면역손상된 또는 유전적 동계의(syngeneic) 동물로 이식하는 것에 의해 얻어질 수 있으며, 여기서 상기 종양은 형광 단백질을 위한 발현 시스템을 포함하도록 변형된 세포들로부터 생산되었던 것이다. 종양 그 자체를 표지하는 다양한 방법들이 설명되어 있다.

[0038] 세균을 표지하는 것에 관해서, 형광 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 서열을 세균의 그 내인성(endogenous) 조절서열 하의 적절한 자리에 위치시키는 게놈의 변형과 같은 직접적인 변형에 의해 세균 안으로 도입될 수 있고, 또는 적절한 발현벡터를 사용하여 도입될 수도 있다. 선택되는 세균은 고형 종양에서 생존하여 선택적으로 (전적으로 특이적으로 선택적인 것은 아닐비장도) 증식함으로써, 심지어 그 세균이 전신 투여되는 경우 조차도, 그 숙주 동물의 종양 부위를 제외한 나머지 신체 부위에서는 살지 않는 그러한 세균인 것이 좋다. 바람직하게는, 이러한 세균 배양체가 소형 콜로니로 집중되는 것이 아니라, 종양 덩어리 내로 확산되는 것이 좋다.

[0039] 본 발명은 제자리(in situ) 직접 관찰에 의해 가장 바람직한 세균 숙주를 결정하는 간단한 방법을 제공한다. 그래서 선택된 균주는 게놈 속으로의 삽입에 의해 또는 발현벡터의 제공에 의해 표지되고 동물에 투여된다. 종양에서의 증식의 패턴은 다른 조직들에서와는 대조적으로 직접적으로 관찰될 수 있고, 원하는 패턴을 가진 균주가 선택된다. 종양내에서 증식할 수 있는 광범위한 후보들이 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 클로스트리디움(Clostridium), 락토바실리(Lactobacilli), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 등을 포함하여 당 기술분야에 알려져 있다. 이들 시스템의 발현을 위한 적절한 조절 서열은 또한 당 기술분야에 지금까지 잘 알려져 있으며, 내인성(endogenous) 조절 서열들이 사용될 수도 있다.

[0040] 많은 경우에 있어서, 독성 효과를 나타내는 어떠한 능력도 무력화하도록 세균을 변형하는 것이 더욱 요구된다. 이는 절대 혐기균의 경우에 있어서 더욱 빈번하게 있다. 만약 세균이 독소를 분비한다면, 독소를 생산하는 유전자들의 결실 또는 불활성화가 요구될 수 있다; 만약 세균이 원치않는 부작용을 야기하는 물질들을 생산한다면, 이들 물질들을 암호화하는 유전자들이 불활성화되거나 제거될 수 있다. 만약 표지가 사용되는 경우에는, 세균은 구조(constitutive) 프로모터의 조절하에서 세포 성장 및 생식을 나타내는 일정한 특성으로서 형광 단백질을 발현하도록 변형될 수도 있고 또는 암호화 서열이 내인성 서열을 치환함으로써 특히 원하는 위치에서 게놈 안으로 위치시킬 수도 있다.

[0041] 그 자신의 고유의 항종양 작용이 발휘되는 것에 더하여, 세균은 또한 IL2 또는 메티오니나제(methioninase)와 같은 치료물질을 생산하도록 변형되어질 수 있다. 하나의 구체예에서 치료 단백질은 임의로 형광 단백질과 융합된 단백질로서 생성된다. 만약 그 종양 및/또는 세균이 표지된 경우에는, 그 융합물에서의 형광 단백질의 색은 다른 두 경우들 중에서 선택된 색과는 서로 다른 색이어야만 한다. 형광 단백질들을 가진 융합 구조물은 위에서 설명한 것과 같은 마커(marker)들로 잘 알려져 있다. 치료 단백질을 위한 발현 시스템은 단독으로 또는 형광 단백질과의 융합체로서 벡터에 또는 세균의 게놈 내에 위치될 수 있으며 조절 서열은 구조적인 것일 수 있고 또는 많은 경우에 있어서 유도성(inducible)이며 원래 자리(in situ)의 인자들 또는 외부적으로 공급되는 전사 인자들 둘 중 어느 하나에 의존하는 것일 수 있다.

[0042] 치료 단백질의 바람직한 특정예는 메티오니나제(methioninase)이다. 이것은 여기 참조에 포함된 PCT 공개 WO 00/29589에서 공개된 것과 같이 세포 내부로 공급되었을 경우 또는 여기 참조에 포함된 미국 특허 5,690,929 및 WO 94/11535에서 설명된 것 같이 약제로서 공급되는 경우에 항종양 작용을 발휘한다. 메티오니나제(methioninase)의 재조합 생성물도 또한 이들 문서에서 공개되어 있다.

[0043] 종양에 대한 고유의 효과에 더하여, 치료 단백질 효소는 또한 전구약물로부터 독성 물질을 방출시키기 위해서도 사용할 수 있다. 예를 들어, Miki, K., 외(外), Cancer Research (2001) 61:6805-6810에서는 메틸 셀레놀(methyl selenol)의 독성을 이용한 작업을 설명한다. 이 화합물은 메티오니나제(methioninase)의 작용에 의해서 셀레노메티오닌(selenomethionine)으로부터 생성될 수 있다. 이 논문은 재조합으로 생성된 메티오니나제에 의해 셀레노메티오닌으로부터 메틸 셀레놀이 생산되고, 메틸 셀레놀이 이 효소의 발현 시스템에 의해 형질전환된 암세포를 죽인다는 실험들을 설명하고 있다. 셀레노메티오닌이 존재하는 경우의 메티오니나제의 재조합 생산물은 따라서 암의 치료법으로서 사용될 수 있다.

[0044] 단지 예증을 위해서 제공된 본 발명의 하나의 구체예에서, B. 롱움(B. longum) 또는 C. 노비이(C. novyi)와 같은 세균이 어떠한 독소도 생산하지 못하도록 변형된다. 무독화된 세균은 형광 단백질에 융합된 메티오니나제의 발현 시스템을 포함하도록 변형된다. 더욱이 만약 원한다면, 그 세균은 세균 그 자체를 표지하기 위한 형광 단백질의 발현 시스템을 포함하도록 변형된다. 만약 메티오니나제 유전자가 구조적으로 발현된다면, 메티오니나제 그 자체의 생산이 세균의 존재의 신호를 알리게 되는 것이기 때문에, 이것은 불필요할 수도 있다. 그래서 이와 같이 변형된 세균을, 융합 단백질에서 사용된 것과는 다른 색의 형광으로 표지된, 인간 MDA-MB-435 유방암 세포들로부터 형성된 종양과 같은 종양을 가진 실험 모델 대상에 투여한다. 또는 종양이 생래적인(indigenous) 것이고 위에서 언급한 미국 특허 6,251,384 및 6,235,968에서 설명한 바와 같이 바이러스성 발현 벡터를 사용하여 표지한 것이 있다.

[0045] 세균세포가 사용되는 경우에는, 그 세포들을 종양에 직접 주입한다; 포자가 사용되는 경우에는, 정맥내주사를 사용할 수도 있다. 포자의 직접적인 종양내 주사 또한 가능하다. 세균의 정맥주사(IV injection) 또한 가능하다. 적절하게 변형된 세균을 실용적인 방법으로 대상에게 투여한다. 실험적인 종양 모델의 경우, 모델을 제공하기 위해서는 치료대상이 종양을 가진 면역손상(immunocompromised) 또는 유전적 동계(syngeneic)중의 어느 하나여야 할 수 있지만, 세균 그 자체를 투여하는 경우에는 대상자가 면역손상될 것을 요구하지 않는다. 그러므로, 생래적인 종양을 가진 대상의 경우에 있어서는 면역억제는 불필요하다. 변형되지 않은 면역 시스템을 가진 동물에서는 종양에서의 감염이 쉽게 일어난다. 그러나 면역손상된 대상들은 종양이 인공적으로 도입된 상태에서 증상의 진전을 연구하는데 있어 또한 유용할 수 있다.

[0046] 하나의 구체예에서, 메티오니나제의 생산에 대한 표지는 적색 형광(RFP)을 방출하는데, 이것은 청색 형광(BFP)을 방출하는 세균의 특징과 녹색 형광(GFP)을 방출하는 종양의 특징이다.

[0047] 더욱이 만약 원한다면, 셀레노메티오닌을 종양 안으로 주입하거나 또는 전신적으로 공급한다. 메티오니나제의 생산 그 자체로 및/또는 세균의 존재 그 자체로 종양에 대해 독성이다. 방출된 메틸 셀레놀은 그 세균이 존재하는 바로 그 지역에서뿐만 아니라 살아있는 종양 조직으로까지 광범위하게 확산된다. 이러한 치료법의 경과를 RFP, GFP 및 BFP의 동시적인 조영에 의해 직접 모니터링할 수 있다.

[0048] 대상의 전신에 대한 형광 광학 종양 영상화(FOTI)는 모델 시스템에서 또는 생래적 종양을 가진 치료대상에서 실시간 관찰 및 감염 진행의 지속적인 모니터링과 그리고 프로토콜의 평가를 외부에서 가능하게 한다. 치료중인 대상자에 대해 FOTI를 이용할 수 있다면, 적용된 치료 프로토콜을 변형하는 것이 좋을지 또는 변형하지 않는 것이 좋을지에 대하여 지속적으로 알려주는 것이 가능하다. 모델 시스템은 치료의 독창적인 고안에 있어서 유용하다. 외부의(FOTI) 영상화와 더불어, 비침습성 내시경 방법 또한 사용될 수 있다.

[0049] 모델로서 사용하기에 적당한 대상들은 바람직하게는 포유류 대상들이고, 가장 바람직하게는 토끼, 쥐, 생쥐 등의 편리한 실험 동물들이다. 인간에 더 가까운 유사한 대상을 위해서, 영장류 또한 사용될 수 있다. 적절한 대상은 무엇이든 사용될 수 있으며, 그 선택은 주로 편의성 및 궁극적으로 관심이 있는 시스템과의 유사성에 의해 좌우된다.

[0050] 아래의 실시예들은 예증을 위해 제공되는 것이며, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[0014] 도 1은 PC-3 인간 전립샘 종양 세포에서 S. 티피무리움(S. typhimurium) Al 돌연변이주의 그 성장 단계의 함수로서 균력의 의존성을 보여주는 그래프이다.

[0015] 도 2는 종양을 포함하지 않은 누드 생쥐에서 야생형과 돌연변이주 A1의 독성을 비교하는 그래프이다.

[0016] 도 3은 BALB/c 마우스에 있어서 A1 돌연변이주에 의한 세균 감염과 야생형에 의한 세균 감염에 의한 TNFα 유도를 비교한 것이다.

[0017] 도 4는 정맥주사(IV injection) 후의 누드 생쥐의 PC-3 전립샘암의 성장에 대한 돌연변이주 A1의 효과를 나타내는 그래프이다.

[0018] 도 5는 A1 돌연변이주의 주입에 의한 PC-3 종양 모델에서의 증가한 생존 가능성을 보여주는 그래프이다.

일반적인 방법

[0051] 세균-숙주 상호작용의 형광 이중-색 영상화를 위해서, 수은등 50W 전원을 장착한 Leica 형광 스테레오 현미경 모델 LZ 12를 사용하였다. GFP 및 RFP 형광을 동시에 시각화하기 위해, 여기(excitation)는 D425/60 대역 투과 필터(band pass filter), 470 DCXR 이색 거울(dichroic mirror)을 통해서 만들었고, 방출된 형광은 장파장 투과 필터(long pass filter) GG475(Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 통해 수집하였다. 거시이미지화는 라이트 박스(Lightools Research, Encinitas, CA)에서 수행하였다. GFP 및 RFP 종양 양쪽 모두의 형광 여기는 동물 발광을 위해 슬릿 광섬유를 사용한 간섭 필터(interference filter) 440+/-20 nm를 통해서 만들었다. 형광을 520 nm 장파장 투과 필터를 통해 관찰하였다. 현미경 및 라이트 박스로부터의 영상은 Hamamatsu C5810 3-chip cool color CCR 카메라(Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ)로 포착하였다. 수은등 100-W 전원을 장착한 Olympus BH 2-RFCA 형광 현미경을 사용하였다.

동시에 GFP 및 RFP 형광 양쪽 모두를 시각화하기 위해, 여기 광은 D425/60 대역 투과 필터, 470 DCXR 이색 거울을 통해서 만들었다. 방출된 형광 빛은 장파장 투과 필터 GG475(Chroma Technology)를 통해 수집하였다. 1,024/724 픽셀의 고해상도 영상은 Hamamatsu C5810 three-chip cooled color CCR 카메라(Hamamatsu Photonics)에 의해 포착하였고, 바로 IBM PC에 저장하였다. 영상들을 IMAGE PRO PLUS 4.0 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 명암대비와 밝기를 조절하였고 분석하였다.

[0052] 처리 그룹들 중에서의 차이점들은 Statistica (Statsoft, Inc., Tulsa, OK)를 사용한 변량분석(ANOVA)을 사용하여 조사하였다. 로그순위 검정법(log rank test)을 포함한 카플란-메이어 분석(Kaplan-Meier analysis)을 생존을 결정하기 위해 사용하였다. p < 0.05는 통계학적으로 중요한 것으로 고려하였다.

실시예 1

살모넬라 티피무리움 Al (S. typhimurium Al )의 제조

[0053] S. 티피무리움(ATCC 14028)(Stratagene, San Diego, CA) 단일 클론을 LB 한천 배지로부터 선택하여, 액체 LB 배지 5 ml에서 300 rpm으로 진탕 하면서 37℃로 밤샘 배양하였다. 그 밤샘 배양체를 LB 배지로 1:10 희석하였고, 37℃에서 배양하였다. 배양된 세균을 OD₆₀₀에서 각각의 시간 포인트에서 측정하였다.

[0054] 중간-대수 증식기(mid-log phase)에, 세포들을 4℃에서 채취하였다. 빙냉(ice-cold) 글리세롤(10% V/V)로 3회 세척하였고 원래의 배양 부피의 대략 1/100의 빙냉 글리세롤(10% V/V)에서 재현탁시켰다. 40 ㎕ 중 2.0 x 10⁸ 개의 세포들을 pGFP(Clontech) 벡터 2 ㎕와 혼합하고, 제조사의 설명에 따라 Gene Pulser apparatus(Bio-Rad Labs)로 전기천공(electroporation)을 하기 전에 얼음 위에 5 분 동안 놓았다: 전기천공법은 1,000 Ω 병렬 저항에서의 펄스 제어기를 포함하여 세팅되어 1.8 kv에서 수행하였다. 전기 펄스를 한 후 즉시 SOC 배지 1 ㎖를 첨가하였고, 세포 부유액을 17x100 mm 폴리프로필렌 튜브 안으로 옮기고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포들을 LB 한천배지에 도포하고 37℃에서 밤샘 배양을 하였다. GFP를 발현하는 성공적인 클론들을 S. 티피무리움-GFP로 칭하였다.

[0055] S. 티피무리움-GFP를 LB 배지 10 ㎖에서 중간-대수 증식기까지 키웠다. 신선하게 준비된 나이트로소-구아니딘(nitroso-guanidine)(멸균수에서 1 mg/ml)을 pH 6.0에서 TRIS-말레산 버퍼 1 ㎖당 최종농도 100 ㎍이 되도록 첨가하였다. 상기 배양체를 37℃에서 진탕 없이 30분 동안 배양하고나서 원심분리하고 영양 육즙 배지(nutrient broth medium)의 동일한 부피에서 재현탁하였다. 세포들을 다시 원심분리하였고 영양 육즙 배지에서 재현탁하였다.

[0056] 독립적인 돌연변이들이 요구되었기 때문에, 그 배양체를 여러 개의 계대배양체로 나누었다. 콜로니들이 대략 직경 3 mm에 도달된 후에, 그들을 최소 한천 배지와 영양 한천 배지에서 평판복제배양(replica-plated) 하였다. 콜로니들이 자란 후, 최소 한천 배지에서는 자라지 않지만 영양 한천 배지에서 자란 것을 영양요구균주의 후보로서 분리하였다.

[0057] 동정된 영양요구성 콜로니들을 멸균된 이쑤시개를 가지고 분리하고, 신선한 영양 한천 평판 배지 위에 0.6 cm 폭의 패치에 스트리킹하여 37℃에서 자라도록 두었다. 그 결과 콜로니들을 영양요구균주의 요구성분을 확인하기 위한 특정 아미노산들을 포함하는 영양보충된 M56 최소 한천 평판 배지(supplemented M56 minimal medium agar plates)에서 평판복제배양하였다.

[0058] 이러한 분석으로 A1으로 명명된 하나의 클론이 Leu 및 Arg 이중 영양요구성으로 확인되었다. 그 결과는 표 1에 나타나 있다.

다양한 조합의 아미노산으로 영양보충된 최소 배지에서의 S. 티피무리움 A1의 성장
보충된 아미노산	A1 영양요구성 돌연변이의 성장
Leu	아니오
Arg	아니오
모든 아미노산	예
Leu를 제외한 모든 아미노산	아니오
Arg를 제외한 모든 아미노산	아니오
Leu 및 Arg	예
모든 보충물은 최종 농도가 20 ㎍/㎖였다.

[0059] 성장을 위해, S. 티피무리움 A1 단일 클론을 LB 한천 평판 배지에서 선택하여, 액체 LB 배지 5 ㎖에서, 300 rpm으로 진탕하면서, 37℃에서 밤샘 배양하였다. 그 밤샘 배양체를 LB 배지로 1:10 희석하였고, 37℃에서 배양하였다. 배양된 세균을 OD₆₀₀에서 각각의 시간 포인트에서 측정하였다.

실시예 2

시험관내 ( in vitro ) 세균성 침입과 종양 세포주의 세포내 복제

[0060] 종양 세포들을 24-웰 조직 배양 판에서 대략 10⁴ 세포/웰 밀도까지 성장시켰다. 세균들을 위에서 설명한 LB 육즙 배지에서 중간-대수 증식기, 늦은-대수 증식기 및 정지기까지(OD₆₀₀=0.3 0.6, 1.2, 2.0) 성장시켰다. 세균들을 세포 배양 배지에서 희석시켰고 종양 세포들(1 x 10⁵/㎖)에 첨가하고 37℃의 배양기에 넣었다. 1 시간 후에, 세포들을 헹구고 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate)(20 ㎍/㎖)를 포함한 배지에서 배양시켜 내부세균은 놓아두고 외부세균을 사멸시켰다. 세포 내부의 세균들을 형광 현미경하에서 서로 다른 시점(time point)에 관찰하였다.

[0061] 종양 세포에서 S. 티피무리움-GFP의 균력은 세균 성장 상태에 따라 영향을 받는다: 중간-대수 증식기에서의 세균은 가장 적은 균력이고 늦은-대수 증식기 및 정지기에서 그들의 침입성을 되찾는다. 늦은-대수 증식기의 세균은 PC-3 종양 세포를 죽이는데 있어서 가장 강한 균력을 가진다. 감염 후 24 시간에서의 이러한 결과들은 도 1에서 나타내었다.

[0062] A1 영양요구균주는 또한 시험관내(in vitro)에서 인간 PC-3 전립샘암 및 생쥐 유방종양(MMT) 세포에 침투하여 세포 내부에서 복제되었고 결국 세포사멸(apoptosis)을 유도하였다. 종양 세포와 세균 사이의 상호작용은 실시예 3에서 설명한 것과 같이 만들어진, RFP-발현 종양 세포 안에서 성장하는 GFP-발현 S. 티피무리움-Al을 가진 이중 색 형광에 의해 시각화된다.

[0063] 좀 더 상세하게, 양쪽 모두 RFP로 표지된 PC-3 인간 전립샘 종양 세포 및 MMT 생쥐 종양 세포를 24-웰 조직 배양 평판 배지에서 대략 10⁴ cells/well의 밀도까지 성장시켰다. 세균은 LB 배지에서 키웠고 늦은-대수 증식기에 채취하였다. 그리고 나서 세포 배양 배지에서 희석시키고 종양 세포에 첨가하였다(1 x 10⁵ CFU/well). 37℃에서 1시간의 배양 후, 그 세포들을 헹구었고 내부의 세균은 아니고 외부의 세균을 죽이기 위해 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate)(20 ㎍/㎖)를 포함한 배지에서 배양했다. 세균과 종양 세포 사이의 상호작용을 형광 현미경 배율(40Ox)하에서 서로 다른 여러 시점에 관찰하였다.

실시예 3

생체 내( in vivo ) 종양 모델의 제조

[0064] 레트로바이러스성 형질도입(retroviral transduction)에 의해 종양을 RFP로 표지하고, 10 Al 바이러스 외피를 발현하는 NIH3T3-유도 패키징 세포주(NIH3T3-derived packaging cell line)인 종양 PT67은 CLONTECH Laboratories, Inc.으로부터 구입하였다. PT67 세포를 10% 열-불활성된 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)(Gemini Bio-products, Calabasas, CA)이 보충된 DME(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)에서 배양하였다. 벡터 제조를 위해 70% 포화상태로 자란(70% confluence) 패키징 세포(PT67)를 DOTAP(TM) 시약(Boehringer Mannheim) 및 포화량의 NCX₂-DsRed-2-RFP 플라스미드의 침전 혼합물과 함께 18시간 동안 배양시켰다. CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)로부터 구입한 숙주 pLNCX₂ 벡터는 진핵세포에서 항생물질에 의한 선택을 위해서 네오마이신(neomycin) 내성 유전자를 포함한다. RFP 유전자(DsRed2, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)를 pLNCX₂ 벡터 내의 Egl I 자리가 아니고 Egl II 자리에 삽입하였다. 새로운 배지로 보충하였고 세포를 진핵형질전환(transfection) 후 48시간에 형광 현미경으로 조사하였다. 선별을 위해서, 단계적으로 증가하는(Life Technologies, Grand Island, NY) 500 ㎍/㎖ - 2000 ㎍/㎖의 G418의 존재하에서 세포를 7일 동안 배양하였다.

[0065] 인간 전립샘암 세포주 PC-3 및 생쥐 유방 종양 MMT060562를 10% 소태아혈청(FBS)(Gemini Bio-products, Calabasas, CA)을 포함하는 RPMI(GIBCO)에서 배양하였다. 발현벡터의 진핵형질전환(transfection)을 위해서 거의 포화상태로 자란(near-confluent) 세포를 LipofectAMINE^TMplus(GIBCO)와 포화량의 RFP-발현 pLNCX₂-DsRed-2-RFP와의 침전혼합물과 함께 6시간 동안 배양한 후 신선한 배지로 보충하였다. 세포를 트립신/EDTA으로 진핵형질전환(transfection) 후 48시간에 채취하였고, G418 200 ㎍/㎖을 포함한 선택 배지에 1:15의 비율로 계대배양하였다. 안정되게 통합된 플라스미드를 가진 세포를 G418 200 ㎍/㎖을 포함한 배지에서 일시적으로 형질전환된 세포의 성장에 의해 선택하였다. 클론들을 트립신/EDTA에 의해 클로닝 실린더(Bel-Art Products, Pequannock, NJ)로 분리 및 증폭시키고, 선택제(selective agent) 없이 전통적 배양 방법을 사용하여 이동시켰다.

[0066] 6주 된 수컷 Nu/nu 생쥐를 종양 모델과 감염 연구에 사용하였다. 일반적으로, 위에 설명한 것처럼 RFP로 표지한 종양 세포들(2 x 10⁶)을 피하주사하고, 이런 방법으로 얻어진 RFP로 표지한 종양을 동소에 투여하였다. 모든 동물연구는 보증번호 A3873-1의 실험실 동물의 관리와 사용을 위한 국립 보건 협회(National Institutes of Health)(NIH) 가이드에 따라 수행되었다.

실시예 4

생체 내( in vivo )에서의 A1의 거동

[0067] A1 영양요구균주를 LB 배지에서 밤샘 배양한 후 LB 배지에서 1:10으로 희석하였고, 늦은-대수 증식기에 채취하였으며 PBS로 세척 후 PBS로 희석하였다. 상기 Al 영양요구균주를 두 개의 주입 위치에 각각 50 ㎕ 씩 총 100 ㎕ 및 종양당 10⁹ cfu로, 실시예 3의 RFP 표지 종양의 중앙 부위에 직접 형광의 안내하에서 직접적으로 주입하거나 RFP 같은자리(orthotopic) 종양을 갖는(10⁷ cfu/PBS 100 ㎕) 누드 생쥐의 꼬리 정맥 속으로 주사하거나 또는 RFP 같은자리(orthotopic) 종양을 갖는(10⁷ cfu/PBS 100 ㎕) 누드 생쥐의 복막에 주사하였다.

[0068] 마취에 의해 동물들을 희생시켰다. 조직 시료를 폐, 간, 비장, 신장, 심장 및 종양으로부터 얻었다. 일반 조직 및 종양을 절개하였고, 시료의 무게를 달고 평판 배양으로 감염 세균을 측정하기 위해 준비하였다. 생물분포 연구를 위해, 종양 및 일반 생쥐 조직들을 접종한 후, 채취, 균질화, 영양 배지에서 평판 배양하여 세균 콜로니들의 수를 세는 방법으로 상기 조직들의 cfu를 여러 시점에 측정하였다. 또한 조직들을 표준 동결절편, 헤마톡실린 염색 및 Low, B., 외(外), Nature Biotech. (1999) 17:37-41에 따른 에오신 조직병리학적 분석을 위해 준비하였다.

[0069] 하나의 실험에서, 6-8주 된 NCR 누드 생쥐의 오른쪽 중간 쪽의 피하에(s.c.) 22-게이지 바늘을 사용하여 2 x 10⁶개의 RFP 표지한 PC-3 인간 전립샘 종양 세포를 이식하였다. A1 배양체를 늦은-대수 증식기에 채취하고 PBS로 세척 후 PBS로 희석하였고 종양의 중심 부위에 두 개의 주입 위치를 이용해서 종양당 각각 50 ㎕ 씩 총 100 ㎕ 및 10⁹ cfu로 직접 주사하였다. 상기 종양은 26일에 걸쳐 퇴행하였다.

[0070] 또 다른 실험에서, 정맥투여(IV administration)를 이용해서 6-8주 된 NCR 누드 생쥐에게 6-8주 된 NCR 누드 생쥐의 오른쪽 중간 쪽의 피하에(s.c.) 22-게이지 바늘을 사용하여 2 x 10⁶개의 RFP 표지한 PC-3 인간 전립샘 종양 세포를 이식하였다. Al 영양요구균주를 LB 배지에서 밤샘배양 한 후 LB 배지에서 1:10으로 희석하고, 늦은-대수 증식기에 채취한 다음 PBS로 세척 후 PBS로 희석하고 꼬리 정맥으로 주사하였다(10⁷ cfu/PBS 100㎕). 생물분포 연구에서, 종양 및 일반 생쥐 조직의 cfu를 상기 조직들을 채취, 균질화, 영양 배지에서의 평판 배양을 하는 방법으로 꼬리 정맥 주사 후 5일 및 10일에 측정하였다.

[0071]

종양:간 세균 비율은 주사 후 4일까지는 표 2에서처럼 500:1부터 2000:1 사이에 분포하였다.

S. 티피무리움 A1의 종양 및 간에서의 분포
접종 후 경과 시간	CFU/g 조직
접종 후 경과 시간	종양	간	종양:간
5 일	2.5 x 10⁹	1 x 10⁵	2500:1
10일	2 x 10¹⁰	0

[0072] A1은 PC-3 종양에서 선택적으로 성장하였고, 꼬리 정맥 주사 후 및 종양내 주사 후 종양의 성장을 억제하였다. 종양내 주사 후, 종양은 숙주에 명백한 유해효과 없이 20일째까지 완전히 퇴행하였다.

[0073] Al은 위에 설명된 PC-3의 경우와 같이 피하에 이식된 RFP 표지된 MARY-X 유방 종양에서 성장하였다. 성장은 GFP 발현에 의한 시각화에서처럼 시간에 따라 점진적이었다.

실시예 5

A1 및 친(親)주(parental strain )의 상대적 독성

[0074] A1 및 야생형 S. 티피무리움 친주를 종양을 가지지 않은 동물에게 투여하였다. 상기 동물은 A1 주사 후에 생존하였고, 친주가 주사된 후에 죽었다.

[0075] 야생형 및 A1 균주를 LB 배지에서 밤샘 배양한 후 LB 배지에서 1:10으로 희석하였고 늦은-대수 증식기에 채취하였고 PBS로 세척 후 PBS로 희석하고 꼬리 정맥으로 직접 주사하였다(10⁷ cfu/PBS 100㎕). 주사 후 경과 시간에 따른 생쥐의 생존률을 결정하였다. n=20 마리. 도 2에 결과를 나타내었다. 보다시피, 야생형을 주사한 모든 생쥐가 삼일 후에 죽은 반면 A1은 실질적으로 무독성이다.

[0076] 더욱이, 생쥐에 주사되었을 때, A1은 야생형 S. 티피무리움 친주에 비해서 훨씬 더 적은 TNF-α 유도를 보여주었다. S. 티피무리움 Al 및 야생형은 LB 배지에서 밤샘 배양한 후 LB 배지에서 1:10으로 희석하였고, 늦은-대수 증식기에서 채취하였고 PBS로 세척 후 PBS로 희석하였다. 음성 대조군으로서 PBS를 포함한 것과 함께, 1 x 10⁶ cfu를 암컷 BALB/c 생쥐(8 주령, n=10 마리) 꼬리 정맥으로 직접 주사하였다. 1.5 시간 후, 혈청을 수집하였고 원심분리를 하여 세포 내용물을 제거하였다. TNF-α를 Biosource International Cytoscreen ELISA 키트로 분석하였고, 결과는 Tecan Sunrise microplate 판독기로 측정하였다. 도 3이 상기 결과를 보여준다. 보다시피 TNF-α 생산은 야생형과 비교하여 A1 돌연변이주를 접종하였을 때 크게 감소하였다.

[0077] S. 티피무리움 Al은 10일째까지는 간에서 없어졌다; 15일째까지는 비장에서 없어졌다; 4일째까지는 신장에서는 없어졌다.

실시예 6

A1의 치료효과

[0078] 6-8주령의 NCR 누드 생쥐의 오른쪽 중간 부위에 2x10⁶ RFP 표지된 PC-3 인간 전립샘 종양 세포를 22-게이지 바늘을 사용하여 피하(s.c.) 이식하였다. A1 돌연변이주를 LB 배지에서 밤샘 배양한 후 LB 배지에서 1:10으로 희석하였고, 늦은-대수 증식기에 채취하였고 PBS로 세척 후 PBS로 희석하고 꼬리 정맥으로 직접 주사하였다(10⁷ cfu/PBS 100㎕). 감염 후 각각의 시점의 형광 영상으로부터 종양의 크기를 측정하였다. n=10 마리의 평균. 도 4에서 결과를 보여준다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 종양이 25일의 기간에 걸쳐 현저히 성장한 반면, A1으로 처리는 종양의 성장을 억제하는 결과를 가져왔다.

[0079] 부가적으로, 도 5에서 보인 것과 같이 이러한 모델에서 생존시간이 증가되었다. 도 5에 나타난 것처럼, A1 세균을 0일 및 12일째에 주사하였다; 대조군의 30일 후의 생존율이 단지 40%인 것과 달리, A1을 주사한 생쥐의 30일 후의 생존율은 80% 이다.

실시예 7

항종양 특성의 증가 - 균주 A2

[0080] 실시예 1에서 설명한 것처럼 GFP로 표지된 A1 세균을 HT-29 인간 결장 종양을 가진 누드 생쥐의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 감염 후 3일에, 종양 조직을 제거하고, 균질화하고, PBS로 희석하였다. 분리 후, 종양 조직으로부터의 상청액(supernatant)을 LB 한천 평판 배지에서 37℃ 밤샘 배양하였다. 개개의 콜로니들을 배양하고 가장 밝은 녹색 형광을 나타내는 상기 콜로니를 뽑아 5 ml LB 배지에서 배양하였다. A2라 명명된 그 결정된 균주는 Arg 및 Leu에 대한 영양요구성이 남아있었다.

[0081] A2의 종양 세포에 대한 부착성을 시험하기 위해, RFP-표지된, HT-29 인간 유방암 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트에서 대략 10⁴ 세포/웰 밀도까지 배양하였다. A2 분리 균주를 LB 액체배지에서 늦은-대수 증식기까지 배양하였고, 세포 배양 배지에서 희석하였으며 종양 세포에 첨가하여 37℃ 배양기에 두었다. 60분 후, 세포를 1-2 ml PBS로 5번 헹구었다. 0.1% Triton X-100 0.2 ml으로 10분 동안 배양함에 의해 부착성 세균이 방출되었다. 그 다음에 LB 액체배지(0.8 ml)를 첨가하고 피펫을 사용하여 각각의 샘플을 격렬하게 혼합하였다. 부착성 세균의 LB 한천 배지에서의 cfu를 알기 위해 평반배양에 의해 정량하였다.

[0082] 상기 정량 분석은 HT-29 종양 세포에 부착된 A2 영양요구균주의 양이 A1 영양요구성균주의 수에 비해 약 6배 더 높다 라는 것을 보여주었다.

[0083] 침입성을 측정하기 위해, 헹궈진 세포를 내부가 아닌 외부의 세균을 죽이기 위한 젠타마이신 설페이트(20 ㎍/㎖)를 포함한 배지에서 배양하였다. 젠타마이신으로 12시간 배양을 한 후, 세포를 PBS로 1회 세척하였고 생존가능한 세포 내부 세균을 형광 현미경으로 평가하였다.

[0084] A2 분리주는 HT-29 종양 세포에 들어가서 성장하는 능력이 더 크다. 종양 세포의 약 20%가 A1 세균에 의해 침입되었으나, 종양 세포의 약 80%가 A2 세균에 의해 침입되었다.

[0085] 균력(virulence)을 시험하기 위해, 이중-색 표지된 PC-3 인간 전립샘 종양 세포를 24-웰 조직 배양 평판 배지에서 대략 10⁴ 세포/웰 밀도까지 배양하였다. 위에서 설명한 것처럼 세균을 LB 액체 배지에서 늦은-대수 증식기까지 배양하였다. 세균을 세포 배양 배지에서 희석하고(1 x 10⁶), 종양 세포에 첨가하여 37℃ 배양기에 두었다. 30분 후, 세포를 헹구고 내부가 아니라 외부의 세균을 죽이기 위해 젠타마이신 설페이트(20 ㎍/㎖)를 포함한 배지에서 배양하였다. 서로 다른 시점에 형광 현미경하에서 균력을 관찰하였다.

[0086] A2 세균은 PC-3 종양 세포에 강한 균력을 보여서 감염 후 1시간부터 죽기 시작하였다. 감염 후 3시간에는 95%의 세포가 세포사멸 또는 세포괴사에 의해 완전히 죽었다. A1 세균을 사용한 이전의 연구에서, 세포의 죽음은 단지 약 12시간 후부터 일어나기 시작하였다.

[0087] 그러므로, HT-29 결장 종양 생쥐 모델에서 계대된 A1 S. 티피무리움 영양요구균주는 생리학적 또는 유전적 변화들을 거쳐, 이는 증가된 부착성, 침입성 및 균력(virulence)을 포함하는 증가된 항종양 특성들이라는 결과를 가져왔다. 그러나 PC-3 및 Mary-X 종양 모델에서의 계대에 의해 A1 균주를 변화시키려는 시도들은 상기 변화된 특성들을 보여주는 균주라는 결과로 이르지 아니하였다.

실시예 8

생체내(in vivo)에서 A2의 거동

[0088] GFP 표지된 A2 세균을 PC-3 종양 모델 누드 생쥐의 꼬리 정맥에 10⁷ cfu/PBS 100 ㎕로 주사하였다. 상기 종양 모델은 실시예 4에서와 같이 제조된다.

[0089] PC-3 모델의 경우, 처리된 모든 생쥐들은 A2 세균의 주사 후에 종양의 손상을 보여주었고 5마리 중 2마리에서는 20일 후 종양이 없어졌다. 이들의 생존기간은 건강한 생쥐의 생존기간과 비슷하였다.

[0090] 주사된 생쥐로부터 감염된 PC-3 종양의 파라핀 절편은 A2가 종양에 침입하였고 손상을 주었다는 것을 보여주었다. 위에서 설명한 것처럼, 단지 A1의 종양내 주사만이 완전한 종양의 제거를 가져왔었다.

[0091] 유사한 결과들이 RFP로 표지된 Mary-X 인간 유방 종양 세포를 사용한 모델에서 얻어졌다. 5마리의 처리된 동물 모두에서 종양의 파괴와 종양의 퇴행을 보여주었다. 상기 5마리의 처리된 동물 중 3마리에서, 종양이 완전히 제거되었고 숙주에 대해서 명백한 유해한 효과는 없었다.

[0092] A2 세균의 분포를 위에서 설명한 현미경(microscopic) 기술을 사용하여 평가하자 종양에서 넓게 분포하는 것으로 나타났다. A2는 숙주에게 독성이 나타나지 않았다. 간 및 비장과 같은 정상 조직은 표지된 A2에 의해 주사 후에 감염되었다. 그러나 A2는 시간이 지나면서 정상 조직으로부터 완전히 사라졌다.

Claims

아르기닌 및 류신에 대해서만 영양요구성인 살모넬라 티피무리움 돌연변이를 포함하는 배양체(culture)로서,

상기 살모넬라 티피무리움 돌연변이는

야생형(wildtype) 살모넬라 티피무리움을 무작위 변이(random mutation)에 노출하고,

노출된 살모넬라 티피무리움을 포함하는 개별 콜로니들에 아미노산 요구 테스트를 하고,

테스트 결과 아르기닌 및 류신에 대해서만 영양요구성인 돌연변이들을 생체 내(in vivo) 동물 종양 모델에서 계대(passage)하고,

상기 동물 종양 모델의 종양 조직으로부터 돌연변이 콜로니들을 회수함으로써 제조되는 배양체.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 살모넬라 티피무리움 돌연변이는 치료 단백질을 생산하도록 추가로 변형된 것인 배양체.
제1항에 있어서, 상기 살모넬라 티피무리움 돌연변이는 형광 단백질을 생산하도록 추가로 변형된 것인 배양체.
제1항 또는 제4항에 기재된 살모넬라 티피무리움 돌연변이를 활성성분으로서 포함하는 감염에 대해 척추동물을 면역화시키는 의약 또는 수의학 조성물.
제1항 또는 제4항에 기재된 살모넬라 티피무리움 돌연변이를 활성성분으로서 포함하는 척추동물의 종양 치료용 의약 또는 수의학 조성물.
항종양 프로토콜의 평가 방법으로서,

상기 방법은 제5항의 살모넬라 티피무리움 돌연변이가 투여된 인간을 제외한 척추동물 종양 모델을 제공하는 단계(여기서 상기 모델의 종양은 상기 살모넬라 티피무리움 돌연변이의 색상과는 상이한 색상의 형광 단백질을 생산하는 것이다);

1종 이상의 시험 모델을 상기 프로토콜로 처리하는 단계;

상기 시험 모델에서의 종양 성장을 관찰하는 단계;

1종 이상의 대조군 모델에서의 종양 성장을 관찰하는 단계; 및

상기 시험 모델과 미처리 대조군 모델에서의 종양 성장을 비교하는 단계를 포함하는 것인 항종양 프로토콜의 평가 방법.
1개 이상의 종양을 포함하는 인간을 제외한 척추동물 대상의 치료 효과를 모니터하기 위한 방법으로서, 상기 종양은 제5항의 살모넬라 티피무리움 돌연변이에 의해 형광을 방출하도록 변형된 것이고, 상기 방법은 상기 종양으로부터의 형광 방출 및 모든 전이(metastases)를 시간의 함수로서 관찰하는 것을 포함하는 것인 모니터 방법.
제9항에 있어서, 상기 종양 모델은 상기 살모넬라 티피무리움 돌연변이와는 상이한 색상의 형광 단백질을 생산하는 것인 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제