KR101451546B1 - Ｇｍ-ｃｓｆ 수용체에 대한 결합 성분 - Google Patents

Abstract

본 발명은 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFR)의 알파 사슬에 대한 결합 성분, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 천식, 알러지성 반응, 다발성 경화증, 골수성 백혈병, 아테롬성동맥경화증 등의 염증 및 자가면역 질환의 치료에 있어서의 상기 결합 성분의 용도에 관한 것이다.

Description

ＧＭ-ＣＳＦ 수용체에 대한 결합 성분{BINDING MEMBER FOR GM-CSF RECEPTOR}

본 발명은 과립구/대식 세포 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFRα)의 알파 사슬에 대한 결합 성분(binding member), 특히 항-GMCSFRα 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 만성 폐쇄성 폐질환 및 다발성 경화증을 비롯하여 GMCSFRα를 통해 매개되는 염증 질환, 호흡기 질환 및 자가면역 질환의 치료에 있어서의 상기 결합 성분의 용도에 관한 것이다.

GM-CSF는 호중구, 호산구, 대식 세포 및 이들의 전구 세포를 비롯한 광범위한 조혈 세포 유형의 생존, 증식 및/또는 분화를 증강시키는 I형 향염증성 사이토카인이다. GM-CSF 수용체는 헤마토포이에틴(조혈소) 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. 이 수용체는 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 이루어진 이종이량체이다. 상기 알파 서브유닛은 GM-CSF에 대해 매우 특이적인 반면, 상기 베타 서브유닛은 IL3 및 IL5를 비롯한 다른 사이토카인 수용체도 공유하고 있다. 이것은 베타 수용체 서브유닛의 폭넓은 조직 분포로 반영된다. 상기 알파 서브유닛, 즉 GM-CSFRα는 골수 세포 및 비조혈 세포, 예컨대 호중구, 대식 세포, 호산구, 수지상 세포, 내피 세포 및 호흡기 상피 세포에서 주로 발현된다. 전장 GM-CSFRα는, I형 사이토카인 수용체 패밀리에 속하고 22개 아미노산의 신호 펩티드(1∼22번 위치), 298개 아미노산 세포외 도메인(23∼320번 위치), 321∼345번 위치의 경막 도메인 및 55개 아미노산의 짧은 세포내 도메인으로 이루어진 400개 아미노산의 I형 막 당단백질이다. 상기 신호 펩티드는 절단되어 378개 아미노산 단백질로서 성숙형 GM-CSFRα를 제공한다. 인간 GM-CSFRα와 쥐과 GM-CSFRα의 cDNA 클론은 입수가 가능하며, 이들 수용체 서브유닛은 단백질 수준에서 36%의 동일성을 갖는다. GM-CSF는 α 서브유닛 단독에 대해 비교적 낮은 친화도(Kd = 1∼5 nM)로 결합할 수 있으나 β 서브유닛 단독에는 전혀 결합할 수 없다. 그러나, α 서브유닛과 β 서브유닛의 공존은 고친화도의 리간드-수용체 복합체(Kd

100 pM)를 형성한다. GM-CSF 신호 전달은, GM-CSF가 GM-CSFRα 사슬에 먼저 결합한 후 더 큰 서브유닛인 공통의 β 사슬과 교차 결합하여 고친화도 상호작용을 유발하고, 이것이 JAK-STAT 경로를 인산화하는 과정을 통해 일어난다. GMCSF에 대한 GM-CSFR 결합은 참고 문헌 [1]에서 재검토되었다. 이러한 상호작용은 또한 티로신 인산화 및 MAP 키나제 경로의 활성화를 통한 신호 전달을 유도할 수 있다.

병리학적으로, GM-CSF는 염증 질환, 호흡기 질환 및 자가면역 질환을 악화시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 GM-CSFRα에 대한 GM-CSF 결합의 중화는 GM-CSFR을 통해 매개되는 질환 및 병태의 치료를 위한 치료적 접근법이 된다.

Nicola 등의 문헌[2]은 2B7-17-A 또는 "2B7"로 명명되는 인간 GM-CSFRα에 대한 쥐과 항체에 대해 기술하였으며, 상기 항체는 인간 GM-CSFRα에 대해 비교적 높은 친화도를 보유하고 다양한 여러 생물 분석에서 인간 GM-CSF의 생물학적 작용의 강력한 억제제인 것으로 보고되었다. 항체 2B7은 케미콘(Chemicon)으로부터 MAB1037로서 시판되고 있으며, MAB1037에 대한 제품 데이터 시트는 이것이 GM-CSF 생물학적 작용의 강력한 억제제라고 기재하고 있다. 2B7은 WO 94/09149에도 개시되었다.

나이브(naive) scFv 파지 라이브러리, 무작위 돌연변이 유발법 및 적절히 설계된 생화학 및 생물학적 분석을 조합 선택하여 이용함으로써(하기 실험 부분 참조), 본 발명자들은 인간 GM-CSFRα에 결합하고 그 수용체에서 인간 GM-CSF의 작용을 억제하는 매우 강력한 항체 분자를 확인하였다. 본원에 제시된 결과는 본 발명의 항체들이 공지의 항-GM-CSFRα 항체 2B7에 비해 GM-CSFRα의 여러 부위 또는 에피토프에 결합하며 각종 생물학적 분석에서 입증된 바와 같이 놀랍게도 2B7보다 더욱 더 강력하다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 인간 GM-CSFRα에 결합하고 인간 GM-CSF의 GM-CSFRα에 대한 결합을 억제하는 결합 성분에 관한 것이다. 본 발명의 결합 성분은 GM-CSFR의 길항제일 수 있다. 이 결합 성분은 GM-CSFR을 통한 GM-CSF 신호 전달의 경쟁적인 가역적 억제제일 수 있다.

도 1. TF-1 증식 분석법에 의한 2종의 항-GM-CSFRα 항체의 pA₂ 분석. TF-1 세포의 증식은 2종의 최적화된 IgG4, 즉 각각 항체 6(도 1A) 및 항체 1(도 1B)의 농도를 증가시키면서 GM-CSF의 농도를 증가시켜 유도하였다. 그래프 1A 및 그래프 1B에 표시된 데이터를 얻기 위해, ³H 티미딘의 혼입량을 측정하였고 각 항체 농도에서의 GM-CSF의 EC₅₀을 계산하였다. 그 후 그래프 1C 및 그래프 1D에 표시된 데이터를 얻기 위해 용량비를 계산하고 쉴드 회귀(Schild regression)로 분석하여 pA₂ 값을 구하였다.
도 2. 과립구 형상 변화 분석법에 의한 항-GM-CSFRα 항체, 즉 항체 6의 pA₂ 분석. IgG 4 농도를 증가시키면서 GM-CSF의 농도를 증가시켜 인간(그래프 2A 및 2C) 또는 사이노몰거스(2B 및 2D) 과립구를 처리하였다. 과립구 형상 변화는 유세포 분석법을 이용하여 측정하였고, 각 항체 농도에서의 GM-CSF의 EC₅₀을 계산하였다(그래프 2A 및 그래프 2B). 그 후 용량비를 계산하고 쉴드 회귀로 분석하여 pA₂ 값을 구하였다(그래프 2C 및 그래프 2D).
도 3. 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 TF-1 세포 증식을 측정하는 분석에 의한, 2종의 항체, 즉 항체 1 및 항체 6 각각에 대한 길항제 효능. 양성 대조군 IgG4 2B7과 이소타입 대조군 IgG4에 대한 데이터도 제시되어 있다. 데이터는 동일한 실험에서 3중 측정한 값의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 4. 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 인간 과립구 형상 변화를 측정하는 분석에 의한, 2종의 항체, 즉 항체 1 및 항체 6 각각에 대한 길항제 효능. 대조군 IgG4 2B7과 이소타입 대조군 IgG4에 대한 데이터도 제시되어 있다. 데이터는 동일한 실험에서 3중 측정한 값의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 5. 1 nM의 인간 GM-CSF에 의해 자극된 인간 단핵구로부터의 TNFα 방출을 측정하는 분석에 의한, 2종의 항체, 즉 항체 1 및 항체 6 각각에 대한 길항제 효능. 대조군 항체 2B7과 이소타입 대조군 IgG4에 대한 데이터도 제시되어 있다. 데이터는 동일한 실험에서 3중 측정한 값의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 6. 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 인간 과립구 생존력을 측정하는 분석에 의한, 2종의 항체, 즉 IgG4로서의 항체 1 및 항체 6 각각에 대한 길항제 효능. 대조군 항체 2B7과 이소타입 대조군 IgG4에 대한 데이터도 제시되어 있다. 데이터는 동일한 실험에서 3중 측정한 값의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 7. 친화성 성숙 인간 mAb 항체 1 및 항체 6은 GM-CSF에 의해 유도된 인간 조혈 전구체의 분화를 억제하나 어버이 인간 mAb 28G5(항체 3) 또는 공지의 쥐과 항체 2B7은 이를 억제하지 못한다. 분리 반출 샘플로부터 얻은 5×1O⁴개의 해동된 단핵구 세포를 10 ng/ml의 GM-CSF와 표시된 농도의 mAb 존재 하에 반고체 아가 배지에서 배양하였다. 14일째 콜로니 수를 계측하였다. 그래프는 mAb 농도(㎍/ml)에 대한 콜로니 수를 보여준다.
도 8. huGM-CSFR Tg 키메라 마우스에서의 친화성 성숙 mAb의 효능에 관한 용량 반응 분석. Tg 키메라 마우스 5 마리로 구성된 군에 500 ng의 huGM-CSF(또는 PBS)를 4일 동안(D.1∼D.4) 매일 2회 피하 주사하고, 대조군(CAT001) 또는 테스트 mAb(항체 6)를 표시된 농도로 0일째(D.0) 피하 주사하여 처리하였다. 5일째(D.5) 비장 중량을 측정하였다.
도 9. 인간 말초혈 단핵구 내인성 사이토카인 방출 분석에 의한 항체 6의 효능에 관한 용량 반응 분석. 항체 및 IL-6의 존재 또는 부재 하에 1×1O⁶개 세포를 72 시간 동안 배양하고 상청액에 대해 TNFα ELISA를 수행하였다. 데이터는 동일한 실험에서 3중 측정한 값의 평균 억제값±표준 편차를 나타낸다.

본 발명의 항체 및 기타 결합 성분은 GM-CSFRα에 결합하여 이를 중화시키는 데 특히 유효하며, 따라서, 본원에 포함된 실험 부분과 그 밖에 이를 뒷받침하는 기술 문헌을 통해 확인되는 바와 같이, 염증 및 자가면역 질환을 비롯한 GM-CSFRα에 의해 매개되는 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, 본 발명자들은 세포에 기초한 분석을 통해 본 발명의 항체들이 천연 GM-CSF의 그 수용체에 대한 결합에 의해 유도된 사이토카인(예를 들어, IL-6 및 TNFα)의 방출을 억제할 수 있음을 입증하였다. 하기에 더 상세히 설명하는 바와 같이, GM-CSFRα에의 결합을 차단함으로써 GM-CSF 활성을 억제하는 것은 류마티스성 관절염(RA), 천식, 흡연에 기인한 기도 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알러지성 반응, 다발성 경화증(MS), 골수성 백혈병 및 아테롬성동맥경화증과 같은 질환을 치료하기 위한 치료적 접근법이다.

본 발명에 따른 결합 성분은 일반적으로 GM-CSFRα의 세포외 도메인에 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 성분은 성숙형 인간 GM-CSFRα(서열 번호 206)의 226∼230번 위치의 Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln(YLDFQ)(즉 서열 번호 201) 중 하나의 이상의 잔기에 결합한다. 이 결합 성분은 인간 GM-CSFRα의 YLDFQ 서열 중 하나 이상의 잔기에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 이것은 YLDFQ 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개의 잔기에 결합할 수 있다. 따라서, 이 결합 성분은 상기 서열 내의 하나 이상의 잔기를 인식할 수 있으며, 경우에 따라 이것은 GM-CSFRα의 세포외 도메인에 있어서 추가의 측접 잔기 또는 구조적으로 인접한 잔기에도 결합할 수 있다.

결합은 임의의 적당한 방법으로 측정할 수 있으며, 본원의 다른 부분에서 상세히 기재하는 것과 같이, 예를 들어, PEPSCAN에 기초한 효소 결합 면역 분석(ELISA) 등의 펩티드 결합 스캔을 이용할 수 있다. PEPSCAN 시스템스에서 제공하는 유형의 것과 같은 펩티드 결합 스캔에서는, 항원 유래의 짧은 중첩 펩티드를 결합 성분에의 결합에 대해 체계적으로 스크리닝한다. 이 펩티드는 지지체 표면에 공유 결합되어 펩티드 어레이를 형성할 수 있다. 요약하면, 펩티드 결합 스캔(예를 들어, "PEPSCAN")은 결합 성분이 결합하는 펩티드 세트를 (예를 들어, ELISA를 이용하여) 확인하는 단계[이때, 상기 펩티드는 서열 번호 206의 단편(예를 들어, 서열 번호 206의 약 15개의 연속된 잔기의 펩티드)에 해당하는 아미노산 서열을 가짐] 및 상기 펩티드를 정렬하여 상기 결합 성분에 의해 결합된 잔기의 풋프린트(footprint)를 확인하는 단계(이때, 상기 풋프린트는 중첩 펩티드에 공통된 잔기를 포함함)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 펩티드 결합 스캔 또는 PEPSCAN에 의해 확인된 풋프린트는 서열 번호 206의 226∼230번 위치에 해당하는 YLDFQ 중 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 상기 풋프린트는 YLDFQ 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 모든 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 결합 성분은, 예를 들어 본원에 기재된 펩티드 결합 스캔 또는 PEPSCAN법에 의해 확인되는 바와 같이, 서열 번호 206의 226∼230번 위치에 해당하는 YLDFQ 잔기 중 1개 이상, 바람직하게는 모든 잔기를 포함하는 서열 번호 206의 펩티드 단편(예를 들어, 15개 잔기의 펩티드 단편)에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합 성분은 서열 번호 206의 연속된 15개 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 펩티드에 결합할 수 있으며, 이때, 상기 15개 잔기의 서열은 서열 번호 206의 226∼230번 위치의 YLDFQ 중 하나 이상의 잔기를 포함하거나 이와 적어도 부분적으로 중첩된다. 결합을 확인하기 위한 적당한 펩티드 결합 스캔법에 관한 세부 사항은 본원의 다른 부분에 상세히 기재되어 있다. 부위 지정 돌연변이 유발법, 중수소 치환, 질량 분광분석, NMR 및 X선 결정 분석을 비롯한 다른 방법들도 당업계에 잘 알려져 있으며 이 방법들을 이용하여 항체에 결합된 잔기를 확인하고/하거나 펩티드 결합 스캔(예를 들어, PEPSCAN) 결과를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 결합 성분은 바람직하게는 GM-CSFRα를 중화시킨다. 중화란, 예를 들어 GM-CSFRα 매개 반응으로 측정시, GM-CSFRα의 생물학적 활성을 감소 또는 억제하는 것, 예를 들어, GM-CSF의 GM-CSFRα에의 결합, 또는 GM-CSFRα에 의한 신호 전달을 감소 또는 억제하는 것을 의미한다. 생물학적 활성의 감소 또는 억제는 부분적일 수도 있고 완전할 수도 있다. 항체가 GM-CSFRα를 중화시키는 정도를 그 중화 효능(neutralising potency)이라 한다. 효능은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재 또는 인용된 1종 이상의 분석법을 이용하여 확인 또는 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합 성분은 하기 분석법 중 하나 이상에서 중화 활성을 나타낼 수 있다:

ㆍ 생화학적 리간드 결합 분석

ㆍ TF-1 증식 분석

ㆍ 인간 과립구 형상 변화 분석

ㆍ 사이노몰거스 비인간 영장류 과립구 형상 변화 분석

ㆍ 단핵구 TNFα 방출 분석

ㆍ 과립구 생존력 분석

ㆍ 콜로니 형성 분석(혈액 세포 전구체의 시험관내 GM-CSF 매개 분화의 억제)

ㆍ 생체내, 예를 들어 인간 GM-CSFR을 발현하는 형질전환 골수를 보유한 키메라 마우스에서의 GM-CSF 생물 활성의 억제

ㆍ 말초혈 단핵구 사이토카인 방출 분석

효능은 일반적으로 달리 명시하지 않는 한 pM 단위의 IC₅₀ 값으로 표시된다. 기능 분석의 경우, IC₅₀은 생물학적 반응을 그 최대값의 50%만큼 감소시키는 농도에 해당한다. 리간드 결합 연구의 경우, IC₅₀은 수용체 결합을 최대 특이적 결합 수준의 50%만큼 감소시키는 농도에 해당한다. IC₅₀은 최대 생물학적 반응 비율(%)(예를 들어, 증식 분석에서는 ³H 티미딘 혼입량(cpm)으로 측정될 수 있는 세포 증식으로, 형상 변화 분석에서는 형상 변화로, TNFα 방출 분석에서는 TNFα 방출로, 생존력 분석에서는 생존력으로, 콜로니 형성 분석에서는 콜로니 수로, 또는 생물 활성 테스트에서는 인간 GM-CSFR을 발현하는 형질전환 골수를 보유한 키메라 마우스에서의 순환 단핵구의 감소 또는 비장 중량의 증가로 나타냄)을 그래프 작도하거나, 결합 성분 농도의 로그값의 함수로서 특이적 수용체 결합 비율(%)을 그래프 작도하고, 프리즘(Prism)(GraphPad)과 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여 그 데이터에 시그모이드 함수를 피팅하여 IC₅₀ 값을 생성함으로써 계산할 수 있다.

IC₅₀ 값은 복수 측정값의 평균을 나타낼 수 있다. 따라서, 예를 들어, IC₅₀ 값은 3 차례 반복 실험의 결과로부터 얻을 수 있으며, 그 후 평균 IC₅₀ 값을 계산할 수 있다.

TF-1 증식 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 1500 pM 미만이다. 예를 들어, 상기 IC₅₀은 < 300 pM, < 60 pM, < 10 pM, 또는 < 1.5 pM, 예를 들어 약 1.0 pM일 수 있다. 일반적으로, IC₅₀은 0.5 nM 또는 1.0 nM 이상이다. 공지의 쥐과 항체 2B7은 상기 분석에서 IC₅₀이 약 1600 pM이다. 본원에서 이용된 상기 TF-1 증식 분석은 최종 농도 7 pM의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, TF-1 증식 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 TF-1 증식 분석에서 -6, -7, -8, -9, -10, -10.5 또는 -11보다 음의 값이 더 큰 pA₂를 나타낼 수 있다. 예를 들어, pA₂는 약 -10.5 또는 -11일 수 있다. pA₂ 값의 계산 방법과 유의성에 대해서는 하기 분석 방법 및 재료 섹션의 실험 부분에 상세히 기술되어 있다.

인간 과립구 형상 변화 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 100 pM 미만, 예를 들어, 50 pM 미만 또는 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM 또는 10 pM 미만이다. 일반적으로 IC₅₀은 5 pM, 6 pM 또는 7 pM 이상이다. 이와는 달리, 공지의 쥐과 항체 2B7은 이 분석에서 IC₅₀ 측정치가 477 pM로서 효능이 낮다. 본원에서 이용된 인간 과립구 형상 변화 분석은 최종 농도 7 pM의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, 인간 과립구 형상 변화 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 인간 과립구 형상 변화를 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 20 pM 미만, 전형적으로 10 pM, 5 pM 또는 2.5 pM 미만이다. IC₅₀은 0.5 pM, 1 pM 또는 1.5 pM 이상일 수 있다. 공지의 쥐과 항체 2B7은 이 분석으로 테스트시 IC₅₀이 26 pM이었다. 본원에서 이용된 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석은 최종 농도 7 pM의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 사이노몰거스 과립구 형상 변화를 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 인간 및/또는 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 -6, -7, -8, -9, -10, -10.5 또는 -11보다 음의 값이 더 큰 pA₂를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, pA₂는 약 -10 또는 -11이다.

단핵구 TNFα 방출 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 150 pM 미만, 전형적으로 110 pM 미만, 예를 들어 100 pM 미만이다. IC₅₀은 30 pM 또는 40 pM 이상일 수 있다. 본원에서 이용된 단핵구 TNFα 방출 분석은 최종 농도 1 nM의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, 단핵구 TNFα 방출 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 1 nM의 인간 GM-CSF에 의해 자극된 인간 단핵구로부터의 TNFα 방출을 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

과립구 생존력 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 1000 pM 미만, 전형적으로 850 pM 미만이다. IC₅₀은 500 pM, 250 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 미만일 수 있다. IC₅₀은 5 pM 이상일 수 있다. 이 분석에서 공지의 쥐과 항체 2B7은 최대 83 nM의 농도에서 불활성이다. 본원에서 이용된 과립구 생존력 분석은 최종 농도 7 pM의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, 과립구 생존력 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 7 pM의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 인간 과립구 생존력을 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

콜로니 형성 분석의 경우, 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 IC₅₀이 5 ㎍/ml 미만, 2.5 ㎍/ml 미만, 1 ㎍/ml 미만 또는 0.3 ㎍/ml 미만일 수 있다. 바람직하게는 IC₅₀은 0.25 ㎍/ml 이하, 예를 들어 0.1 ㎍/ml 미만이다. IC₅₀은 0.05 ㎍/ml 이상일 수 있다. 이 분석에서 공지의 쥐과 항체 2B7은 최대 10 ㎍/ml(67 nM)의 농도에서 활성이 거의 없었다. 본원에서 이용된 콜로니 형성 분석은 최종 농도 10 ng/ml의 인간 GM-CSF를 이용하여 행하였다. 따라서, 콜로니 형성 분석에서 IC₅₀ 중화 효능은 결합 성분이 10 ng/ml의 인간 GM-CSF에 의해 유도된 콜로니 형성을 억제하는 능력을 나타낸다. 더 상세한 사항에 대해서는 분석 방법 및 재료 섹션을 참조할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은, 인간 GM-CSF로 치료되는 인간 GM-CSFR을 발현하는 형질전환 골수를 보유한 키메라 마우스에서, 비장 중량 증가를 억제하는 용량 의존적 능력 및/또는 순환 단핵구의 GM-CSF 유도 감소를 억제하는 용량 의존적 능력을 나타낼 수 있다. 비장 중량 증가 억제에 대한 IC₅₀은 5 mg/kg 미만, 2.5 mg/kg 미만, 2 mg/kg 미만, 1 mg/kg 미만 또는 0.75 mg/kg 미만일 수 있다. 몇몇 구체예에서 IC₅₀은 0.5 mg/kg 이상일 수 있다.

또한, 인간 GM-CSFRα에 대한 결합 성분의 결합 역학 및 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 BIAcore를 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 KD가 5 nM 미만이고, 더 바람직하게는 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 미만이다. 바람직하게는, KD가 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.15 nM 미만이다.

본 발명의 결합 성분은 일반적으로 인간 GM-CSFRα 이외에도 비인간 영장류 GM-CSFRα, 예를 들어, 사이노몰거스 GM-CSFRα에 결합한다. 인간 GM-CSF 수용체와 쥐과 GM-CSF 수용체 간에는 상동성이 작기 때문에(약 36%), 본 발명의 결합 성분은 일반적으로 쥐과 수용체에 결합 또는 교차 반응하지 않는다.

일반적으로 본 발명의 결합 성분은 하기에 더 상세히 설명하는 바와 같이 항체 분자, 예를 들어 완전한 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 인간 항체 분자이다.

본 발명의 결합 성분은 일반적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 성분의 VH 도메인 및 VL 도메인 역시 본 발명의 일부로서 제공된다. 상기 VH 도메인 및 VL 도메인 각각에는 상보성 결정 영역("CDR") 및 골격구조 영역("FR")이 존재한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고 VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자는 전형적으로 VH CDR1, CDR2 및 CDR3과 골격구조를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 이것은 대안적으로 또는 부가적으로 VL CDR1, CDR2 및 CDR3과 골격구조를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수도 있다. VH 또는 VL 도메인 골격구조는 하기 구조와 같이 CDR이 산재된 4개의 골격구조 영역, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

본 발명에 따른 항체 VH 및 VL 도메인, FR 및 CDR의 예는 본원의 일부를 구성하는 첨부된 서열 목록에 제시된 바와 같다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트, HCDR 세트 및 LCDR 세트는 본 발명의 측면 및 구체예를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 측면은 본 발명에 따른 결합 성분의 VH 도메인이다. "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미하고 LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미한다. 달리 명시하지 않는다면, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다. 일반적으로 본 발명의 결합 성분은 단일클론 항체(mAb)이다.

실험 부분에서 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 GM-CSFRα에 결합하는 항체 분자 집합체(panel)를 확인하였다. 본 발명자들은 또한 수용체 결합 및 중화 효능에 특히 중요한 VH 및 VL 도메인의 상보성 결정 영역(CDR) 내의 특정 잔기들을 확인하였다. CDR은 주로 결합 성분의 결합 및 특이성을 결정하는 역할을 담당하기 때문에, 본원의 다른 부분에서 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본원에 정의된 것과 같은 적절한 잔기를 가지는 하나 이상의 CDR이 임의의 적절한 골격구조에, 예를 들어 항체 VH 및/또는 VL 도메인 골격구조, 또는 비항체 단백질 골격에 이용되어 이에 통합될 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트는 골격구조(예를 들어, 인간 골격구조)로 그래프팅되어 항체 분자 또는 여러 항체 분자들을 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 본원에 개시된 CDR 및 인간 생식세포 유전자 분절 서열의 골격구조 영역을 포함할 수 있다. 생식세포화될 수 있는 골격구조 내에 CDR 세트를 갖는 항체가 제공될 수 있으며, 이때 상기 골격구조 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포 골격구조에서의 동등한 위치에 있는 잔기에 부합하도록 변경된다. 따라서, 항체 골격구조 영역은 바람직하게는 생식세포 및/또는 인간의 것이다.

본 발명자들은, 실험 섹션에 기재된 방법에 따라 후보 항체의 어느 잔기가 항원 인식에 중요한지를 조사한 후 생물학적 분석을 통해 어버이 항체 클론보다 5배 이상 더 큰 효능을 나타내는 160개의 클론에 대해 서열 분석을 수행하였다. 그 결과 하기 위치들이 항원 결합에 기여하는 것으로 나타났다: VL 도메인의 카밧(Kabat) 잔기 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 및 96과, VH 도메인의 카밧 잔기 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 및 100B. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 카밧 잔기 중 하나 이상은 1번, 2번 및 4∼20번 항체 클론 중 하나 이상에 있어서 해당 위치에 존재하는 카밧 잔기로서, 그 서열은 첨부된 서열 목록에 개시되어 있다. 여러 구체예에 있어서, 잔기는 항체 3의 해당 위치에 존재하는 잔기와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

본 발명자들의 분석에 의하면 CDR의 4개 잔기 위치가 수용체 결합에 특히 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다: H97, H100B, L90 및 L92(카밧 넘버링). 바람직하게는, VH CDR3의 H97은 S이다. 이 위치의 세린 잔기는 160개 클론 모두에서 관찰되었으며, 따라서 이는 항원 인식에 중요한 잔기임을 나타낸다.

바람직하게는, VH CDR3은 하기 잔기 중 하나 이상을 포함한다:

카밧 잔기 H95에서의 V, N, A 또는 L, 가장 바람직하게는 V;

카밧 잔기 H99에서의 S, F, H, P, T 또는 W, 가장 바람직하게는 S;

카밧 잔기 H100B에서의 A, T, P, S, V 또는 H, 가장 바람직하게는 A 또는 T.

바람직하게는, VH CDR1의 카밧 잔기 H34는 I이다. 바람직하게는, VH CDR2는 카밧 잔기 H54에서 E 및/또는 카밧 잔기 H57에서 I를 포함한다.

결합 성분이 항체 VH 도메인을 포함하는 경우, VH 도메인 골격구조의 카밧 잔기 H17은 바람직하게는 S이다. 카밧 잔기 H94는 바람직하게는 I 또는 그 보존적 치환이다(예를 들어, L, V, A 또는 M). 일반적으로 H94는 I이다.

바람직하게는, VL CDR3은 하기 잔기 중 하나 이상을 포함한다:

카밧 잔기 L90에서의 S, T 또는 M, 가장 바람직하게는 S 또는 T;

카밧 잔기 L92에서의 D, E, Q, S, M 또는 T, 가장 바람직하게는 D 또는 E;

카밧 잔기 L96에서의 A, P, S, T, I, L, M 또는 V, 가장 바람직하게는 S, P, I 또는 V, 특히 S.

VL CDR3의 카밧 잔기 L95A는 바람직하게는 S이다.

바람직하게는, VL CDR1은 하기 잔기 중 하나 이상을 포함한다:

카밧 잔기 27A에서의 S;

카밧 잔기 27B에서의 N;

카밧 잔기 27C에서의 I;

카밧 잔기 32에서의 D.

바람직하게는, VL CDR2는 하기 잔기 중 하나 이상을 포함한다:

카밧 잔기 51에서의 N;

카밧 잔기 52에서의 N;

카밧 잔기 53에서의 K.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 서열 목록에 제시된 항체 1, 2 또는 4∼20 중 어느 하나 또는 어버이 항체 3의 VH 및 VL CDR, 즉 VH CDR1, 2 및/또는 3 및/또는 VL CDR 1, 2 및/또는 3으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 하기 항체 분자 중 어느 하나의 VH CDR3을 포함한다: 항체 1(서열 번호 5); 항체 2(서열 번호 15) ; 항체 3(서열 번호 25); 항체 4(서열 번호 35); 항체 5(서열 번호 45); 항체 6(서열 번호 55); 항체 7(서열 번호 65); 항체 8(서열 번호 75); 항체 9(서열 번호 85); 항체 10(서열 번호 95); 항체 11(서열 번호 105); 항체 12(서열 번호 115); 항체 13(서열 번호 125); 항체 14(서열 번호 135); 항체 15(서열 번호 145); 항체 16(서열 번호 155); 항체 17(서열 번호 165); 항체 18(서열 번호 175); 항체 19(서열 번호 185); 항체 20(서열 번호 195). 바람직하게는, 상기 결합 성분은 서열 번호 3 또는 서열 번호 173의 VH CDR1 및/또는 서열 번호 4의 VH CDR2를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 서열 번호 175의 VH CDR3을 포함하는 결합 성분은 서열 번호 173의 VH CDR1을 포함하나 대안으로 서열 번호 3의 VH CDR1을 포함할 수도 있다.

바람직하게는 상기 결합 성분은 하기 항체 중 하나의 VH CDR 세트를 포함한다: 항체 1(서열 번호 3∼5); 항체 2(서열 번호 13∼15); 항체 3(서열 번호 23∼25); 항체 4(서열 번호 33∼35); 항체 5(서열 번호 43∼45); 항체 6(서열 번호 53∼55); 항체 7(서열 번호 63∼65); 항체 8(서열 번호 73∼75); 항체 9(서열 번호 83∼85); 항체 10(서열 번호 93∼95); 항체 11(서열 번호 103∼105); 항체 12(서열 번호 113∼115); 항체 13(서열 번호 123∼125); 항체 14(서열 번호 133∼135); 항체 15(서열 번호 143∼145); 항체 16(서열 번호 153∼155); 항체 17(서열 번호 163∼165); 항체 18(서열 번호 173∼175); 항체 19(서열 번호 183∼185); 항체 20(서열 번호 193∼195). 경우에 따라, 상기 결합 성분은 또한 상기 항체들 중 하나의 VL CDR 세트를 포함할 수 있으며, 상기 VL CDR은 VH CDR과 동일하거나 상이한 항체로부터 유래된 것일 수 있다. 일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원 결합 부위를 형성하지만, 몇몇 구체예에서는 VH 도메인 또는 VL 도메인이 단독으로 항원 결합에 이용될 수 있다. 경쇄의 범용(promiscuity)은 당업계에 잘 입증되어 있으며, 따라서 VH 도메인 및 VL 도메인이 본원에 개시된 것과 동일한 클론으로부터 유래된 것일 필요는 없다.

결합 성분은 개시된 H 및/또는 L CDR 세트 내에 하나 이상의 치환, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 등 10개 이하의 치환을 갖는 항체 1∼20 중 어느 하나의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 바람직한 치환은 VL 도메인의 카밧 잔기 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 및 96과, VH 도메인의 카밧 잔기 34, 54, 57, 95, 97, 99 및 100B 이외의 카밧 잔기의 치환이다. 이들 위치에서 치환이 이루어진 경우, 그 치환은 바람직하게는 해당 위치에서 바람직한 잔기인 것으로 본원에 언급된 잔기에 대한 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 인간 생식세포 골격구조, 예를 들어 중쇄 VH1 또는 VH3 패밀리 유래의 인간 생식세포 골격구조의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 인간 항체 분자이다. 바람직한 구체예에서, 상기 단리된 인간 항체 분자는 인간 생식세포 골격구조 VH1 DP5 또는 VH3 DP47의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는다. 따라서, 상기 VH 도메인 골격구조 영역은 인간 생식세포 유전자 분절 VH1 DP5 또는 VH3 DP47의 골격구조 영역을 포함할 수 있다. VH FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 251의 서열일 수 있다. VH FR2의 아미노산 서열은 서열 번호 252의 서열일 수 있다. VH FR3의 아미노산 서열은 서열 번호 253의 서열일 수 있다. VH FR4의 아미노산 서열은 서열 번호 254의 서열일 수 있다.

일반적으로, 상기 결합 성분은 또한 인간 생식세포 골격구조에, 예를 들어 경쇄 V람다 1 또는 V람다 6 패밀리 유래의 인간 생식세포 골격구조에, LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 상기 단리된 인간 항체 분자는 인간 생식세포 골격구조 V람다 1 DPL8 또는 V람다 1 DPL3 또는 V람다 6_6a에 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. 따라서, 상기 VL 도메인 골격구조는 인간 생식세포 유전자 분절 V람다 1 DPL8, V람다 1 DPL3 또는 V람다 6_6a의 골격구조 영역을 포함할 수 있다. 상기 VL 도메인 FR4는 인간 생식세포 유전자 분절 JL2의 골격구조 영역을 포함할 수 있다. VL FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 255의 서열일 수 있다. VL FR2의 아미노산 서열은 서열 번호 256의 아미노산 서열일 수 있다. VL FR3의 아미노산 서열은 서열 번호 257의 서열일 수 있다. VL FR4의 아미노산 서열은 서열 번호 258의 서열일 수 있다.

비생식세포계 항체는 생식세포계 항체와 동일한 CDR들을 가지나, 그와 상이한 골격구조들을 갖는다.

본 발명의 결합 성분은 본원에 개시된 임의의 결합 성분, 예를 들어 항체 3 또는 항체 1, 2 또는 4∼20 중 어느 하나와 GM-CSFRα에의 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 따라서 결합 성분은 항체 1, 2 또는 4∼20 중 어느 하나의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 분자와 GM-CSFRα에의 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 결합 성분들 간의 경쟁은 시험관내에서, 예를 들어, 하나 이상의 다른 비태깅 결합 성분 존재 하에 검출될 수 있는 임의의 결합 성분에 리포터 분자를 태깅하여, 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 결합 성분을 확인할 수 있도록 함으로써 용이하게 분석할 수 있다.

경쟁은, 예를 들어 GM-CSFRα의 세포외 도메인 또는 상기 세포외 도메인의 펩티드를 플레이트에 고정화하고 하나 이상의 다른 비태깅 결합 성분과 함께 제1 태깅 결합 성분을 상기 플레이트에 첨가하는 ELISA를 이용하여 측정할 수 있다. 태깅된 결합 성분과 경쟁하는 비태깅 결합 성분의 존재는 태깅된 결합 성분이 방출하는 신호의 감소로서 관찰된다. 유사하게, 결합 성분들 간의 경쟁을 측정하는 데 표면 플라즈몬 공명 분석이 이용될 수 있다.

경쟁을 테스트함에 있어서, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심있는 에피토프 또는 결합 영역을 포함하거나 실질적으로 그것으로 이루어진 펩티드를 이용할 수도 있다. 어느 한쪽 말단에 하나 이상의 아미노산이 부가된 에피토프 또는 표적 서열을 가지는 펩티드가 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 성분은 항원에 대한 이들의 결합이 특정 서열을 가지거나 포함하는 펩티드에 의해 억제될 수 있는 것이다.

펩티드에 결합하는 결합 성분은, 예를 들어 펩티드(들)를 패닝(panning)함으로써 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리할 수 있다.

본 발명은 또한 경쟁 분석에서 항원 수준의 측정을 위해 전술한 결합 성분을 사용하는 용도, 즉 본 발명에 의해 제공되는 결합 성분을 경쟁 분석에 이용함으로써 샘플 중 항원 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 비결합 항원으로부터 결합 항원을 물리적으로 분리할 필요가 없는 경우일 수 있다. 결합시 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 결합 성분에 리포터 분자를 연결하는 것이 가능한 한 방법이다. 리포터 분자는 검출 가능한, 바람직하게는 측정 가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 발생시킬 수 있다. 리포터 분자는 직접 또는 간접적으로, 공유 결합에 의해, 예를 들어 펩티드 결합에 의해 또는 비공유 결합에 의해 연결할 수 있다. 펩티드 결합에 의한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체의 재조합 발현에 의한 것일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 결합 성분을, 예를 들어 바이오센서 시스템에 이용함으로써 항원 수준을 직접적으로 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 제시된 결합 성분의 GM-CSFRα에의 결합을 야기하거나 가능하게 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 결합은, 예를 들어 결합 성분, 또는 결합 성분을 코딩하는 핵산을 투여한 후 생체내에서 이루어질 수 있거나, 또는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블로팅, 면역조직화학법, 면역침전법, 친화성 크로마토그래피 또는 세포에 기초한 분석(예컨대 TF-1 분석)으로 시험관내에서 이루어질 수 있다.

GM-CSFRα에 대한 결합 성분의 결합량은 측정될 수 있다. 정량은 진단 또는 예후 결과를 알고 싶은 테스트 샘플 중의 항원량에 대한 것일 수 있다.

본 발명의 임의의 측면 또는 구체예에 따른 결합 성분 또는 항체 분자를 포함하는 키트 역시 본 발명의 한 측면으로서 제공된다. 본 발명의 키트에서, 결합 성분 또는 항체 분자는, 예를 들어 하기에 추가로 설명하는 바와 같이, 샘플 중에서의 그 반응성을 측정할 수 있도록 표식할 수 있다. 키트의 구성 성분들은 일반적으로 멸균 상태로 밀폐된 바이알 또는 기타 용기에 저장된다. 키트는 진단 분석 또는 항체 분자가 활용될 수 있는 기타 방법에 이용될 수 있다. 키트는 방법, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에 상기 구성 성분들을 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 방법의 수행을 보조하거나 가능하게 하는 보조 물질도 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다.

샘플 중 항체의 반응성은 임의의 적절한 방법으로 측정할 수 있다. 한 가지 예로 방사성 면역분석법(RIA)을 들 수 있다. 방사성 표식 항원을 비표식 항원(테스트 샘플)과 혼합하여 그 항체에 결합하도록 한다. 결합된 항원을 비결합 항원으로부터 물리적으로 분리하여 항체에 결합된 방사성 항원의 양을 측정한다. 테스트 샘플 중에 항원이 많을수록 더 적은 방사성 항원이 항체에 결합하게 된다. 리포터 분자에 결합항원 또는 유사체를 이용하여, 비방사성 항원을 사용한 경쟁적 결합 분석을 이용할 수도 있다. 상기 리포터 분자는 스펙트럼상 분리된 흡수 또는 발광 특성을 갖는 형광 색소, 인광 물질 또는 레이저 염료일 수 있다. 적절한 인광 물질로는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드를 들 수 있다. 적절한 발색 염료로는 디아미노벤지딘을 들 수 있다. 그 밖의 리포터로는 거대 분자 콜로이드 입자 또는 미립물, 예컨대 착색된 자성 또는 상자성의 라텍스 비드와, 직접적 또는 간접적으로, 검출 가능한 신호를 시각적으로 관찰하거나 전자적으로 검출하거나 다른 방식으로 기록할 수 있게 하는 생물학적 또는 화학적 활성 물질을 들 수 있다. 이러한 분자들은, 예를 들어, 발색 또는 색 변화를 야기하거나 전기적 특성에 있어서의 변화를 야기하는 반응을 촉진하는 효소일 수 있다. 이들은 에너지 상태 사이의 전자 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 발광을 일으키도록 분자적으로 여기될 수 있는 상태일 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 이용되는 화학 물질을 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼라인 포스파타제 검출 시스템을 이용할 수 있다.

개별 항체-리포터 접합체에 의해 발생된 신호를 이용하여, 샘플(표준 샘플 및 테스트 샘플) 중 해당 항체 결합에 대한 정량 가능한 절대 또는 상대 데이터를 도출할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 성분, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있으며, 완전히 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있다. 본원에 개시된 뉴클레오티드는 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 문맥상 다른 것을 요하지 않는다면 T가 U로 치환된 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 것과 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어, scFv 또는 IgG1 또는 IgG4를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 전술한 것과 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성체를 제공한다.

또 다른 측면은 본 발명의 핵산으로 형질전환되었거나 이를 포함하는 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는 시험관내의 세포일 수도 있고 배양액 중의 세포일 수도 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내의 세포일 수도 있다. 숙주 세포가 생체내에 존재하면 본 발명의 결합 성분이 "인트라바디(intrabody)" 또는 세포내 항체로서 세포내에서 발현될 수 있다. 인트라바디는 유전자 치료법에 이용될 수 있다.

또 다른 측면은 상기 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용 가능한 기법을 이용하여 행할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적절한 기법으로는 인산칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란법, 전기천공법, 리포솜 매개 형질감염법 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(예를 들어 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우 배큘로바이러스)를 이용한 형질도입법을 들 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스 또는 플라스미드에 기초한 시스템을 이용할 수 있다. 상기 플라스미드 시스템은 에피솜에 유지되거나 숙주 세포 또는 인공 염색체 내로 통합될 수 있다. 통합은 한 곳 또는 여러 곳의 유전자좌에 하나 이상의 카피를 무작위 통합 또는 표적화 통합하여 행할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적절한 기법으로는 박테리오파지를 이용한 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 형질감염을 들 수 있다.

도입에 이어, 예를 들어 유전자 발현 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써 핵산의 발현을 야기 또는 유도할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체)에 통합시킨다. 통합은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시켜 촉진할 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 결합 성분 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 전술한 구성체를 이용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 결합 성분, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 제조 방법 역시 본 발명의 추가 측면을 구성한다. 이 방법은 상기 결합 성분, VH 도메인 및/또는 VL 도메인이 제조될 수 있는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계 및 이를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 상기 결합 성분 또는 항체 도메인의 제조를 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

제조 방법은 생성물의 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을, 하나 이상의 추가 성분(예를 들어, 약학적으로 허용되는 부형제)을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.

다종 다양한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키기 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템과 형질전환 식물 및 동물을 들 수 있다. 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다[3]. 통용되는 바람직한 박테리아 숙주 세포는 이 콜라이(E. coli)이다.

진핵 세포 배양액 중에서의 발현 역시 결합 성분의 제조를 위한 방법으로 선택할 수 있는 것으로서 당업자에게 이용되고 있다[4, 5, 6]. 당업계에서 이종성 폴리펩티드의 발현에 이용되고 있는 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 햄스터 새끼 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 등을 들 수 있다.

프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 기타 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 포함하는 적당한 벡터를 선택하거나 구성할 수 있다. 벡터는 경우에 따라 플라스미드, 예를 들어 파지미드일 수도 있고, 바이러스 벡터, 예를 들어 '파지일 수도 있다[7]. 예를 들어, 핵산 구성체의 제조, 돌연변이 유발, 서열 결정, DNA의 세포로의 도입 및 유전자 발현에 있어서의 핵산 조작 및 단백질 분석을 위한 기법 및 프로토콜이 다수 공지되어 있으며, Ausubel 등의 문헌[8]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 성분을 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명에 따른 결합 성분의 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키는 단계 및 상기 라이브러리에서 상기 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 구성원을 선별하는 단계를 포함한다.

상기 라이브러리는 입자 또는 분자 복합체 상에, 예를 들어, 복제 가능한 유전자 패키지, 예컨대 효모, 박테리아 또는 박테리오파지(예를 들어, T7) 입자 상에, 또는 공유, 리보솜 또는 기타 시험관내 디스플레이 시스템 상에 디스플레이될 수 있으며, 각각의 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인과, 또 경우에 따라, 존재한다면 디스플레이된 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 기타 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이되는 결합 성분을 선별한 후, 상기 선별된 결합 성분을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 얻을 수 있다. 이같은 핵산은 상기 선별된 결합 성분을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 얻은 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터 발현시킴으로써 이후에 결합 성분 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 제조하는 데 이용될 수 있다.

상기 선별된 결합 성분의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 단리된 형태로 제공될 수 있으며, 이러한 VH 도메인을 포함하는 결합 성분도 단리된 형태로 제공될 수 있다.

상기 선별된 결합 성분의 항체 VL 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VL 가변 도메인은 단리된 형태로 제공될 수 있으며, 이러한 VL 도메인을 포함하는 결합 성분도 단리된 형태로 제공될 수 있다.

GM-CSFRα에 결합하는 능력과, 또한 GM-CSFRα에의 결합에 대해 항체 1∼20 중 어느 하나와 경쟁하는 능력도 추가로 테스트할 수 있다(예를 들어, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, IgG1 또는 IgG4에서). GM-CSFRα를 중화시키는 능력도 테스트할 수 있다.

아미노산 서열이 본원에 제시된 것과 같은 변이체를 비롯한 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법으로 얻을 수 있으며, GM-CSFRα에 대한 결합 성분에 이용될 수 있다. 구조/특성-활성 관계에 다변량 데이터 분석 기법을 적용함에 있어서 컴퓨터 화학을 먼저 이용한 후[9], 통계적 회귀, 패턴 인식 및 분류 등의 잘 알려진 수학적 기법을 이용하여 항체의 정량적 활성-특성 관계를 도출할 수 있다[10, 11, 12, 13, 14, 15]. 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 구조 및 3차원적 구조의 경험적 및 이론적 모델(예를 들어, 가능성 있는 접촉 잔기의 분석 또는 물리화학적 특성의 계산치)로부터 도출할 수 있으며, 이러한 특성들은 단독으로, 또 조합적으로 고려될 수 있다.

VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체 항원 결합 부위는 6개의 폴리펩티드 루프로 이루어진다[3개는 경쇄 가변 도메인(VL)으로 이루어지고 3개는 중쇄 가변 도메인(VH)으로 이루어짐]. 알고 있는 원자 구조의 항체를 분석하여, 항체 결합 부위의 3차원 구조와 서열 간의 관계를 규명하였다[16, 17]. 이러한 관계는, VH 도메인의 제3 영역을 제외하고는, 결합 부위 루프가 소수의 주쇄 입체형태(conformation)[표준 구조(canonical structure)] 중 하나를 갖는다는 것을 암시한다. 특정 루프에 형성된 표준 구조는 루프와 골격구조 영역 둘 다에서 중요한 부위에서의 특정 잔기의 존재와 그 크기에 의해 결정되는 것으로 확인되었다[16, 17].

서열과 구조 간의 관계에 관한 이러한 연구는, 서열은 알고 있으나 3차원 구조는 모르는 항체에서, CDR 루프의 3차원 구조를 유지하는 데 있어서 중요한 역할을 함으로써 결합을 유지하는 그러한 잔기를 예측하는 데 이용될 수 있다. 이러한 예측은 선두 최적화 실험 결과와 그 예측값을 비교하여 입증할 수 있다. 구조적 접근법에서는 입수가 용이하게 시판되는 임의의 패키지(예컨대 WAM[19])를 이용하여 항체 분자의 모델을 생성할 수 있다[18]. 그 후, Insight II(액셀러리스 인코포레이티드) 또는 Deep View[20]와 같은 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어를 이용하여 CDR 내의 각 위치에 있어서의 가능한 치환을 평가할 수 있다. 그 후 이 정보를, 활성에 최소한의 영향 또는 유익한 영향을 줄 가능성이 있는 치환을 발생시키는 데 이용할 수 있다.

CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합 성분의 아미노산 서열 내에 치환을 발생시키는 데 필요한 기법은 일반적으로 당업계에서 이용되고 있다. 활성에 최소한의 영향 또는 유익한 영향을 줄 것으로 예상되거나 그렇지 않은 치환을 갖는 변이체 서열을 만들어 GM-CSFRα에 결합하고/하거나 이를 중화시키는 능력 및/또는 임의의 다른 원하는 특성에 대해 테스트할 수 있다.

본원에 서열이 구체적으로 개시되지 않은 임의의 VH 도메인 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체도 전술한 바와 같이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어 약 20개 미만의 변경, 약 15개 미만의 변경, 약 10개 미만의 변경 또는 약 5개 미만의 변경, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 변경을 포함할 수 있다. 변경은 하나 이상의 골격구조 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에 일어날 수 있다.

바람직하게는, 변경은 기능을 상실로 이어지지 않아, 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 성분은 바람직하게는 GM-CSFRα에 결합하고/하거나 이를 중화시키는 능력을 유지한다. 더 바람직하게는, 이것은, 예를 들어 본원에 기재된 분석으로 측정시, 변경이 일어나지 않은 결합 성분과 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 유지한다. 가장 바람직하게는, 이와 같이 변경된 아미노산을 포함하는 결합 성분은, 예를 들어 본원에 기재된 분석으로 측정시, 변경이 일어나지 않은 결합 성분에 비해 GM-CSFRα에 결합하거나 이를 중화시키는 능력이 향상되어 있다.

변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연 또는 비표준 아미노산으로 대체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연 또는 비표준 형태로 변형시키거나, 하나 이상의 비천연 또는 비표준 아미노산을 상기 서열로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명 서열에서 바람직한 변경의 수와 위치는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다. 천연 아미노산은 그 표준 단문자 약어로서 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 표시되는 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비표준 아미노산은 폴리펩티드 골격으로 통합되거나 기존 아미노산 잔기의 변형에 의해 생성된 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비표준 아미노산은 천연 또는 비천연일 수 있다. 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등과 같은 몇 가지 천연 비표준 아미노산이 당업계에 공지되어 있다[21]. 그 N-알파 위치에서 유도체화된 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치한다. 일반적으로 본 발명에 있어서 아미노산은 L-아미노산이나, 몇몇 구체예에서는 아미노산이 D-아미노산일 수 있다. 따라서 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변형 또는 대체하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 인산화 형태 역시 알려져 있으며, 본 발명의 아미노산에도 이러한 변형이 이루어질 수 있다.

본 발명 항체 도메인 및 결합 성분의 아미노산 서열은 전술한 것과 같은 비천연 또는 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 비표준 아미노산(예를 들어, D-아미노산)이 합성 과정 중에 아미노산 서열로 통합될 수 있는 반면, 다른 구체예에서는 아미노산 서열이 합성된 후에 "원래의" 표준 아미노산을 변형하거나 대체함으로써 비표준 아미노산이 도입될 수 있다.

비표준 및/또는 비천연 아미노산의 사용은 구조적 다양성과 기능적 다양성을 증가시키며, 따라서 본 발명의 결합 성분에 있어서 원하는 GM-CSFRα 결합 및 중화 특성을 얻을 수 있는 가능성을 증가시킬 수 있다. 또한, L-아미노산을 갖는 폴리펩티드는 동물에게 투여된 후 생체내에서 분해되기 때문에, D-아미노산 및 유사체는 표준 L-아미노산에 비하여 우수한 약동학적 프로필을 갖는 것으로 확인되었다.

전술한 바와 같이, 실질적으로 본원에 제시된 것과 같은 CDR 아미노산 서열은 바람직하게는 인간 항체 가변 도메인 또는 그 상당 부분에서 CDR로서 보유된다. 실질적으로 본원에 제시된 것과 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 바람직한 구체예를 대표하며, 그 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그 상당 부분에서 HCDR3으로서 보유되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열 인간 가변 도메인으로부터 입수 또는 유래될 수 있거나, 또는 공지의 인간 가변 도메인의 공통 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기법을 이용하여 CDR(예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인 레퍼토리(repertory)로 도입할 수 있다.

예를 들어, Marks 등의 문헌(1992)[22]은, 가변 도메인 영역의 5' 말단에 또는 그에 인접하게 위치되는 공통 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 골격구조 영역에 대한 공통 프라이머와 함께 사용되어 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인 레퍼토리의 제조 방법에 관해 기술한다. Marks 등은 또한 이러한 레퍼토리를 특정 항체의 CDR3과 조합하는 방법에 관해서도 기술한다. 유사한 기법을 이용하여, 본 발명의 CDR3 유래 서열을 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 셔플링하고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인을 동계 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 발명의 결합 성분을 제공할 수 있다. 그 후 이 레퍼토리를 WO 92/01047 또는 참고 문헌[12]을 비롯한 다수의 후속 문헌 중 어느 것의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적절한 숙주 시스템에서 디스플레이하여, 적절한 결합 성분을 선별할 수 있다. 레퍼토리는 10⁴개 또는 그 이상, 예를 들어 10⁶∼10⁸개 또는 10¹⁰개의 개별 구성원 중 어느 것으로부터 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템으로는 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 공유 결합(covalent) 디스플레이를 들 수 있다. 유사한 셔플링 또는 조합 기법 역시 Stemmer의 문헌(1994)[24]에 개시되어 있으며, 이 문헌에는 β-락타마제 유전자와 관련한 기법을 기술하나 이 기법은 항체 생성에 이용될 수 있다고 언급하고 있다.

다른 대안은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이가 발생하도록 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이 유발법을 이용하여 본 발명의 CDR 유래 서열을 보유하는 신규 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 이같은 기법은 Gram 등의 문헌(1992)[25]에 기재되어 있으며, 이 문헌에서는 오류 빈발 PCR이 이용되었다. 바람직한 구체예에서, HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 이루어진다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 돌연변이를 유도하는 것이다[26, 27].

본 발명의 또 다른 측면은 GM-CSFRα 항원에 대한 항체 항원 결합 부위를 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원에 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 추가, 결실, 치환 또는 삽입하여 상기 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 경우에 따라, 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계 및 상기 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 테스트하여, 경우에 따라 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는, 바람직하게는 GM-CSFRα 활성을 중화시키는 능력을 갖는, GM-CSFRα 항원에 대한 결합 성분 또는 항체 항원 결합 부위를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법도 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 GM-CSFRα 항원에 대한 결합 성분을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은

(a) 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;

(b) 실질적으로 본원에 제시된 것과 같은 VH CDR3에 대한 아미노산을 코딩하는 공여체 아미노산과 상기 레퍼토리를 조합하여, 상기 공여체 핵산이 상기 레퍼토리의 CDR3 영역으로 삽입되도록 함으로써 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;

(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;

(d) GM-CSFRα에 대한 결합 성분을 선별하는 단계; 및

(e) 상기 결합 성분 또는 이것을 코딩하는 핵산을 회수하는 단계

를 포함한다.

또한, 본 발명의 VL CDR3을, 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법도 이용될 수 있다.

마찬가지로, 하나 이상의 CDR 또는 CDR 3개 전부를 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 그래프팅한 후 GM-CSFRα에 대한 결합 성분 또는 결합 성분들에 대해 스크리닝한다.

바람직한 구체예에서, 하나 이상의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 예를 들어, 항체 1(서열 번호 3∼5); 항체 2(서열 번호 13∼15); 항체 4(서열 번호 33∼35); 항체 5(서열 번호 43∼45); 항체 6(서열 번호 53∼55); 항체 7(서열 번호 63∼65); 항체 8(서열 번호 73∼75); 항체 9(서열 번호 83∼85); 항체 10(서열 번호 93∼95); 항체 11(서열 번호 103∼105); 항체 12(서열 번호 113∼115); 항체 13(서열 번호 123∼125); 항체 14(서열 번호 133∼135); 항체 15(서열 번호 143∼145); 항체 16(서열 번호 153∼155); 항체 17(서열 번호 163∼165); 항체 18(서열 번호 173∼175); 항체 19(서열 번호 183∼185) 또는 항체 20(서열 번호 193∼195); 또는 경우에 따라 항체 3(서열 번호 23∼25)의 HCDR 세트도 이용될 수 있고/있으며, 하나 이상의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 예를 들어, 항체 1(서열 번호 8∼10); 항체 2(서열 번호 18∼20); 항체 4(서열 번호 38∼40); 항체 5(서열 번호 48∼50); 항체 6(서열 번호 58∼60); 항체 7(서열 번호 68∼70); 항체 8(서열 번호 78∼80); 항체 9(서열 번호 88∼90); 항체 10(서열 번호 98∼100); 항체 11(서열 번호 108∼110); 항체 12(서열 번호 118∼120); 항체 13(서열 번호 128∼130); 항체 14(서열 번호 138∼140); 항체 15(서열 번호 148∼150); 항체 16(서열 번호 158∼160); 항체 17(서열 번호 168∼170); 항체 18(서열 번호 178∼180); 항체 19(서열 번호 188∼190) 또는 항체 20(서열 번호 198∼200); 또는 경우에 따라 항체 3(서열 번호 28∼30)의 LCDR 세트도 이용될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 상당 부분은 골격구조 영역과 함께 그 사이에 개재하는 적어도 3개의 CDR 영역을 포함한다. 바람직하게는, 상기 부분은 또한 제1 골격구조 영역과 제4 골격구조 영역 중 어느 하나 또는 양자를 50% 이상 포함하며, 이때 50%는 제1 골격구조 영역의 C-말단 50%와 제4 골격구조 영역의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 상당 부분의 N-말단 또는 C-말단에 있는 추가 잔기는 천연 가변 도메인 영역과 정상적으로는 회합하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 본 발명 결합 성분의 구성에 의해, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하도록 도입된 링커에 의해 코딩되는 N-말단 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 기타 조작 단계로는 본원의 다른 부분에서 더 상세히 설명하는 항체 불변 영역, 기타 가변 도메인(예를 들어, 디아바디 제조의 경우) 또는 검출 가능/기능성 표식을 비롯한 추가 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결시키기 위한 링커의 도입을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에서는 VH 도메인과 VL 도메인의 쌍을 포함하는 결합 성분이 바람직하지만, VH 도메인 서열 또는 VL 도메인 서열 중 어느 하나에 기초한 단일 결합 도메인도 본 발명의 추가 측면을 구성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인도 표적 항원에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 본원의 다른 부분에 기재된 dAb에 대한 설명을 참조할 수 있다.

단일 결합 도메인 중 어느 하나의 경우, 이러한 도메인은 GM-CSFRα에 결합할 수 있는 2 도메인 결합 성분을 형성할 수 있는 상보성 도메인을 스크리닝하는 데 이용될 수 있다. 이것은 WO 92/01047에 개시된 소위 체계적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 이용한 파지 디스플레이 스크리닝법으로 수행할 수 있으며, 이때 H 사슬 또는 L 사슬 클론을 포함하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 사슬(L 또는 H)을 코딩하는 클론의 전체 라이브러리를 감염시키고 생성된 2 사슬 결합 성분을 상기 특허 문헌 및 다른 문헌[22]에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선별한다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 결합 성분 및 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물, 예를 들어 결합 성분과 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 인체 또는 동물체의 치료적 처치 방법을 비롯하여 GM-CSFRα를 억제 또는 중화시키는 방법에 이용될 수 있다.

본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 분자를 포함하는 불균질 제제를 제공한다. 예를 들어, 이러한 제제는 다양한 정도의 글리코실화 및/또는 유도체화 아미노산을 갖는(예컨대, 피로글루탐산 잔기가 형성되도록 N-말단 글루탐산의 고리화가 일어남), 전장 중쇄 및 C-말단 리신이 결여된 중쇄를 갖는 항체의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 측면들은 제공된 결합 성분의 투여를 포함하는 치료 방법, 이 결합 성분을 포함하는 약학 조성물과, 의약의 제조, 예를 들어 상기 결합 성분과 약학적으로 허용되는 부형제를 제제화하는 것을 포함하는 의약 또는 약학 조성물의 제조 방법에 있어서의 상기 결합 성분의 용도를 포함한다.

항-GM-CSFRα 치료는 경구 경로로(예를 들어, 나노바디), 주사에 의해(예를 들어, 피하, 정맥내, 동맥내, 관절내, 복강내 또는 근육내 주사), 흡입에 의해, 낭내 경로를 통해(방광으로의 점적 주입), 또는 국소적으로(예를 들어, 안내, 비내, 직장, 상처내, 피부) 행할 수 있다. 이 치료는 펄스 주입을 통한 투여에 의해, 특히 결합 성분의 양을 줄여가면서 행할 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특성, 질환의 특별한 고려 사항, 또는 효능을 최적화하고 부작용을 최소화하기 위한 요건에 따라 결정할 수 있다. 항-GM-CSFRα 치료는 임상에서의 사용에만 국한되지 않을 것으로 생각된다. 따라서, 무바늘 디바이스를 이용한 피하 주사도 바람직하다.

조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께, 치료하고자 하는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 조합 치료, 특히 항-GM-CSFRα 결합 성분과 1종 이상의 다른 약물의 조합을 이용하여 유의적인 시너지 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 결합 성분은 하기의 것 중 하나 이상과의 조합으로 또는 이에 부가하여 투여될 수 있다: NSAID(예를 들어, cox 억제제, 예컨대 셀레콕시브 및 기타 유사한 cox2 억제제), 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손) 및 질병 조정 항류마티스약(DMARD), 예를 들어 휴미라(아달리무맙), 메토트렉세이트, 아라바, 엔브렐(에타너셉트), 레미케이드(인플릭시맙), 키네레트(아나킨라), 리툭산(리툭시맙), 오렌시아(아바타셉트), 금염, 항말라리아약, 설파살라진, d-페니실라민, 사이클로스포린 A, 디클로페낙, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린.

본 발명에 따르면, 제공되는 조성물을 개체에게 투여할 수 있다. 투여는 바람직하게 "치료적 유효량"으로 이루어지고, 이는 환자에게 혜택을 나타내기에 충분한 것이다. 이러한 혜택은 저어도 하나 이상의 징후의 경감이다. 투여되는 실제량, 투여율 및 투여 시기는 치료할 대상의 중증도 및 성질에 따라 좌우된다. 치료 규정, 예를 들어 투여량의 결정 등은 담당의 및 다른 의사들의 책임하에 있고, 치료하는 질환의 징후 및/또는 진행의 중증도에 따라 좌우될 수 있다. 항체의 적절한 용량은 당분야에서 공지이다[28,29]. 투여되는 의약 유형에 적절하게 [Physician's Desk Reference (2003)] 또는 본 발명에서 나타낸 특정 용량을 사용할 수 있다. 본 발명의 결합 성분의 치료적 유효량 또는 적절한 용량은 동물 모델 내에서의 생체 내 활성 및 시험관 내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 유효한 용량을 인간에게 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 용량은 진단용인지 또는 치료용인지에 따른 항체의 용도, 치료할 부위의 위치 및 크기, 항체의 정확한 성질(예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디 등), 및 항체에 부착된 임의 검출가능 표지 또는 다른 분자의 성질 등을 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우된다. 대표적인 항체 용량은 전신 적용을 위해서는 100 ㎍∼1 g 범위이고, 국소 적용을 위해서는 1 ㎍∼1 ㎎ 범위가 된다. 대체로, 항체는 전체 항체, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 보다 바람직하게는 IgG4이다. 이는 성인 환자의 단독 치료를 위한 용량이며, 어린이 및 유아에 대해서 비례적으로 조정할 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 형태에 대해서도 조정할 수 있다. 담당의의 재량에 따라 치료는 매일, 1주일에 2회, 일주일 또는 한달 간격으로 반복할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 치료는 주기적이고, 투여간 주기는 대략 2주 이상, 바람직하게는 대략 3주 이상, 보다 바람직하게는 약 4주 이상 또는 한달에 약 1회이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 치료는 수술 전, 및/또는 수술 후에 이루어질 수 있고, 보다 바람직하게는 수술 치료의 해부 부위에 직접 도포하거나 투여할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 일반적으로 약학 조성물의 형태로 투여되는데, 이 조성물은 결합 성분 이외에도 하나 이상의 성분을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따르고, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 약학 조성물은 활성 성분 이외에도, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당분야의 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 자세한 성질은 경구, 또는 주입, 예를 들어 정맥 내 등의 투여 경로에 따라 좌우된다. 경구 투여용 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 액상 또는 반고형일 수 있다. 정제는 고형 담체 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액상 약학 조성물은 일반적으로 액상 담체 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유 등을 포함한다. 생리적 염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 정맥 내 주입 또는 통증 부위에서의 주입을 위해서, 활성 성분은 발열원성이 없고 적당한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 수 있다. 당분야에서 이와 관련된 기술에 의해서 예를 들어 등장성 비히클 예컨대 염화나트륨 주입물, 링거 주입액, 젖산화 링거 주입액 등을 이용하여 적절한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 및/또는 다른 첨가제를 필요에 따라 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 분자의 무리화학적 성질 및 전달 경로에 따라서 액상, 반고형 또는 고형으로 제형화될 수 있다. 제형에는 부형제, 부형제의 조합 예를 들어, 당, 아미노산 및 계면 활성제 등이 포함될 수 있다. 액상 제형에는 광범위한 농도의 항체 및 pH로 포함된다. 고형 제형은 동결건조법, 분무 건조법 또는 초임계 기술에 의한 건조법 등을 통해 제조할 수 있다. 항-GM-CSFRα의 제형은 의도하는 전달 경로에 따라 좌우되는데, 예를 들어, 폐 전달을 위한 제형은 흡입 시 폐 깊숙하게 침투하는 것이 보장되는 물리적 성질을 갖는 입자로 구성될 수 있고, 국소 제형은 활성 부위에서 약물이 체류하는 시간을 장기화하는 점성 개질제를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 결합 성분은 빠른 방출로부터 결합 성분을 보호하게되는 담체를 갖도록 제조될 수 있는데, 예컨대 임플란트, 경피 팻치 및 미세캡슐화 전달 시스템 등을 비롯한 서방형 제형으로 제조될 수 있다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언히드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산 등을 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다양한 방법은 당 분야의 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 문헌 [Robinson, 1978][30]을 참조한다.

본 발명에 따른 결합 성분은 인간 또는 동물 신체의 치료 또는 진단 방법, 예컨대 본 발명의 결합 성분의 유효량을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 인간 환자에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법(예방법 포함할 수 있음)에서 사용할 수 있다. 본 발명에 따라서 치료가능한 병태에는 GM-CSFRα가 기능하는 임의 병태를 포함한다. 공개된 기술 문헌에는 하기에 요약한 바와 같이, 몇몇 질환 및 병태에서의 GM-CSF의 기능이 기재되어 있다. GM-CSF가 GM-CSFRα에 특이적으로 결합하기 때문에, GM-CSF의 병리적 및/또는 징후적 영향은 GM-CSFRα에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하여 대항할 수 있다. 따라서, 실시예 부분에서 기술된 항체 분자에 대해 제시된 약물학적인 생체 내 및 시험관 내 데이타 이외에도, 공개된 입증 결과는 본 발명의 결합 성분을 예를 들어 류마티스성 관절염, 천식, 알러지성 반응, 다발성 경화증, 골수성 백혈병 및 아테롬성 동맥 경화증 등의 자가면역 및/또는 염증성 병태를 치료하는데 사용할 수 있다는 것을 시사하고 있다. 이러한 병태들에 대해 공개된 입증 결과들을 하기에 요약하였다.

천식 및 알러지성 반응

기관지 천식은 기도 과반응성, 점액 과생성, 섬유증 및 IgE 수준 상승 등을 특징으로 하는 폐의 일반적인 지속성 염증 질병이다. 기도 과반응성(AHR)은 비특이적 자극에 대한 기도의 과도한 협착증이다. AHR 및 점액 과생성은 둘다 천식 발병(악화)의 특징인 단호흡을 야기하고 이러한 질환과 관련된 사망률(영국에서 년간 대략 2000명 사망)의 원인이되는 다양한 기도 폐색의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있다.

최근 연구는 천식에서 GM-CSF 및 이의 수용체가 단백질 및 mRNA 수준에서 둘다 상향 조절된다는 것을 증명하였다. 또한, 발현 수준은 질환 중증도와 상호관련이 있었다. 비천식 개체와 비교시 천식 환자 유래의 기관지폐포 세척(BAL)액, BAL 세포, 타액, 기관지 상피 세포 및 항원 자극된 주변 혈관 단핵구 세포에서 GM-CSF의 생성이 증가된 것으로 측정되었다[31, 32]. 또한, 알러지원 공격 이후 GM-CSF의 기도 발현 수준은 조직 호산구 증가증의 정도 및 후기 천식성 반응의 중증도와 상호관련있는 것으로 나타났다[33]. 이후 연구는 GM-CSFR 발현의 상향 조절을 진성 또는 비아토피성 천식과 관련지었는데, 발현 수준이 폐 기능 결과와 상호 관련이 있었다[34]. 난백 알부빈 감작 및 공격의 마우스 모델에서, 난백 알부민 공격전에 비강내 투여를 통해서 염소 다클론 항체로 GM-SCF의 활성을 중화시켜서 기도 과반응성을 방지하고 기도로 호산구의 침투 및 점액 분비를 둘다 감소시켰다[35]. 유사하게, 디젤 배출 입자의 비강내 투여를 통해 촉발시킨 알러지성 호흡기 질환의 마우스 모델에서, 염소 다클론 항체의 비강내 투여를 통한 GM-CSF의 중화를 통해 메타콜린 정도로 기도 과반응성이 방지되고, BAL 호산구 계측수가 줄었으며 또한 기도 상피 상에서 점액 생성 배상 세포의 발현을 감소시켰다[36].

알러지성 반응에서 GM-CSF의 역할은 유도성 내성의 쥣과 동물 모델에서 더욱 연구되었다. 사전 감작없이 분무된 난백 알부민의 반복적인 1일 용량에 노출된 마우스는 난백 알부민에 대한 내성이 발현되고 기도의 호산구성 염증을 유도하는데 실패하였다. 아데노바이러스 구성체를 통한 GM-CSF의 폐 발현은 이들 동물의 반응을 변화시켰고 BAL로의 호산구 유입, 표현형적으로 알러지성인 조직 구조의 생성 및 연관된 배상 세포 과형성이 촉진되었다. 이러한 전형적인 Th2 반응의 생성은 혈청 IL-4 및 IL-5의 혈청 및 BAL 농도 증가를 통해 더욱 증명되었다. MHC II KO 마우스를 이용한 이러한 모델의 추가 연구는 GM-CSF가 기도 내에서 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 조정하여 난백 알부민에 대한 T 세포 매개성 반응을 촉진하는 것을 시사한다[37]. 중요한 것은, Th2 반응의 강력한 활성 인자로서 GM-CSF의 활성은 또한 IL-13 및/또는 IL-4가 결여된 마우스에서 증명되었으며, 이는 GM-CSF의 활성 중화가 이들 사이토카인의 활성과는 구별되는 대체적인 치료 경로를 제시하는 것임을 시사한다.

두드러기쑥에 대한 반복적인 비강 내 노출을 통해서 항원에 대한 재노출시 Th2 형 감작 및 중간 정도의 기도 염증을 일으키는 다른 쥣과 동물 모델에서 유사한 관찰 결과가 확인되었다. 두드러기쑥과 함께 항-GM-CSF 항체의 투여는, 아마도 내재성 CM-CSF를 억제하여서 Th2 관련 사이토카인 생성을 감소시켰다. 대조적으로, 재조합 GM-CSF의 다수 공동투여를 통해서 또는 GM-CSF 형질전환유전자를 보유하는 아데노바이러스 벡터의 단일 전달을 통해서, GM-CSF가 농축된 기도 미세환경으로 두드러기쑥을 전달하여 상당히 강화된 호산구성 기도 염증 및 두드러기쑥 특이적인 Th2 기억 반응이 일어났다.

류마티스성 관절염(RA)

RA는 산업화된 사회의 인구 약 1%가 앓고있는 만성 염증성 및 파괴성 관절 질환이다. RA는 관절 활액 내 염증, 관절막의 염증 및 과형성과, 일반적으로 상당한 장애를 일으키는 주변 뼈 및 연골 조직의 진행성 파괴를 특징으로 한다.

RA의 원인은 아직 알려지지 않았는데, RA 진행에서 GM-CSF의 역할에 대한 증거 자료가 상당량 존재한다. RA는 T 세포 매개성, 항원 특이적 과정을 통해서 개시되고 유발되는 것으로 여겨진다. 간략하게, 민감한 숙주에 미확인 항원의 존재로 T 세포 반응이 개시되고 이를 통해서 T 세포 사이토카인이 생성되며 그 결과 호중구, 마크로파지 및 B 세포를 포함하는 염증 세포가 보충된다.

수많은 프로염증성 및 항염증성 사이토카인이 류마티스성 관절에서 생성된다. 또한, 질환의 진행, 재활성화 및 침묵화는 관절 내 사이토카인 생성의 활발한 변화를 통해서 매개된다. 구체적으로, TNF-α 및 IL-1은 RA의 병인에서 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨지며 이들 두 프로염증성 사이토카인의 활성을 억제하여 질환을 살피기 위한, 보다 신규한 다양한 치료법이 개발되었거나, 개발중이다.

설치류 모델에서의 최근 연구는 RA의 발병 및 진행에서 GM-CSF의 중심적이고 필수적인 역할을 시사하였다. 외래의 재조합 GM-CSF의 투여는 RA 콜라겐 유발된 관절염(CIA)[39] 및 단관절염 모델[40]의 상이한 두 마우스 모델에서 병상을 증가시켰다. 또한, 이는 GM-CSF 넉아웃(GM-CSF^-/-) 마우스가 CIA 발병에 내성을 가지며 관절 활액에서 발견되는 IL-1 및 종양 괴사 인자(TNFα)의 수준이 야생형 마우스에 비하여 감소되었다는 것으로 증명하였다[41,42]. 유사하게, GM-CSF^-/- 마우스에서, 메틸화된 소의 혈청 알부민 및 IL-1을 관절내 주입하여 단관절염을 유발시킨 결과 야생형 마우스에 비하여 질환의 중증도가 감소하였다[43].

또한, 쥣과 동물 항-GM-CSF mAb의 투여로 CIA 및 단관절염 모델에서 질환의 중증도가 상당히 경감되었다. CIA 모델에서, mAb 치료는 만성적인 질환의 진행, 조직 병변 및 상당히 저하된 관절 IL-1 및 TNFα 수준을 치료하는데 효과적이다. 또한, 관절염 발병전에 mAb 치료는 CIA 질환의 중증도를 감소시켰다[44,43].

인간 조직 유래의 관절염성 관절 활액 및 막 생검 샘플 중에 존재하는 사이토카인 및 수용체의 수준을 다수의 실험으로 분석하였다. 골다공증이 있는 14명의 환자 및 13명의 건강한 지원자 및 27명의 RA 환자에서 순환하는 단핵구 세포에 대해 PE-표지된 GM-CSF를 이용하여 GM-CSF 수준을 분석하였다[45]. 이 실험에서, 건강한 대조군(20%) 및 골다공성에 대한 조사가 진행되는 환자(25%)에 비하여 RA 환자(53%)에서 두배 정도 많은 수용체 양성 세포가 검출되었음을 증명하였으며, 이는 단핵구가 국지적으로 생성된 GM-CSF에 대한 반응을 프라이밍시킨다는 것을 시사한다. SF 세포의 발생 부위 하이브리드화를 이용하여 RA 환자 유래의 사이토카인 유전자 발현[46]으로 GM-CSF, IL-1, TNF-α 및 IL-6의 수준이 상승했다는 것이 확인되었다. 또한, 정상 지원자 유래의 단리 및 배양한 섬유아세포 유래 활액 세포는 IL-1α, IL-1β, TNF-α 및 TNF-β에 대한 반응으로 GM-CSF의 단백질 수준이 상승됨이 확인되었다[47]. RA 환자에서 GM-CSF의 혈청 수준의 정량화[48]는 단백질 수준이 대조군(174 pg/mL, n=43)에 비하여 중증 RA 환자(366 pg/mL, n=26) 및 중간 정도 RA 환자(376 pg/mL, n=58)에서 증가되었음을 보여주었고, 또한, GM-CSF가 RA를 갖는 환자(1300 pg/mL)의 SF에서 상당히 증가하였음을 보여주었다.

이전에, 호중구 감소증에 대한 치료를 받는 환자에 재조합 GM-CSF를 투여하여 RA가 악화되는 것이 관찰되었었다[49]. 유사한 관잘 결과가 펠티 증후군을 갖는 환자에게 재조합 GM-CSF를 처리한 경우에도 관찰되었다[50].

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 완전하게 가역적이지 않은 기류 제한으로 특징되는 질환 상태로서 정의된다. 만성 기류 제한은 일반적으로 진행성이며 또한 독성 입자 또는 가스에 대한 폐의 비정상적인 염증 반응과 관련된다. 이러한 기류 제한은 경미한 기도 질환(폐쇄성 세기관지염) 및 유조직 파괴(기종)의 혼합에 의해 야기되는데, 이의 상대적 기여도는 사람에 따라 다양하다. COPD의 최종적인 특징적 징후는 기침, 타액 생성 및 격심한 활동시 호흡곤란 등이다. COPD는 주요한 공공 보건 문제이고 US에서 만성적인 질병률 및 사망률을 야기하는 주요한 4번째 요인이다. 현재 이 질환은 원래 천식용으로 개발되었던 약물 예컨대 β 작용자를 비롯한 기관지 확장제 없이 또는 이와 함께 경구 또는 흡입형 코르티코스테로이드로 치료된다. 그러나, 이들 약물 중 어떠한 것도 COPD의 진행을 늦추는 것으로 나타나지 않았다[51]. 예를 들어, 천식에서 호산구성 염증을 두드러지게 억제하는 코르티코스테로이드는 주로 호중구 매개되는 COPD에서 나타나는 염증에 대해서는 어떠한 영향도 없는 것으로 나타났다[52]. 따라서, 이 질환의 병리생리학의 근간이 되는 염증 과정을 특이적으로 표적화하는 COPD를 위한 신규 치료법의 개발에 대한 요구가 존재한다. 호중구 및 마크로파지 기능에서의 이의 역할을 통해서, GM-CSF는 COPD의 발병에서 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 정량적 PCR을 이용한 실험에서, 연령 매치된 COPD 타액 대 비폐쇄성 흡연자 타액 GMCSF의 카피수가 상당하게 증가한 것으로 나타났다[53]. 또한, 담배 흡연에 의해 유발된 폐 염증의 설치류 모델에서, 흡연 노출전 2일, 4시간 및 1시간 전에 GM-CSF에 대한 항체를 비강내 처리한 동물은 공격 후 5일에 이소타입 대조군 항체와 비교시 BAL 유래의 호중구, 마크로파지 및 MMP-9의 수준이 상당하게 감소하는 것이 확인되었다[54]. 이러한 실험은 또한 여러 COPD 중증도의 환자들에서 얻은 유도 타액에서 GM-CSF 수준을 확인한 본 발명자들의 관찰 결과에 의해서도 뒷받침된다. 이들 실험에서, 본 발명자들은 질환 중증도와 무관하게 치료한 COPD 환자의 대략 40%의 타액에서 GM-CSF가 상승하였고, GMCSF 수준이 일부 경우에서는 500 pg/mL에 도달함을 보여주었다. GMCSF는 비흡연 및 흡연 매치된 대조군 환자에서는 상승하는 것으로 나타나지 않았다. 이러한 데이타는 GM-CSF가 흡연에 의해 유발된 기도 염증 및 COPD에서 핵심 매개 인자 중 하나라는 것을 시사한다.

다발성 경화증(MS)

GM-CSF는 자가면역 질환 다발성 경화증에 관여한다. 인간 다발성 경화증을 유도시킨 모델인 설치류에 미엘린 핍지교세포 당단백질(MOG) 항원을 투여하여 MS 유사 마비를 일으킬 수 있는 예컨대 중추신경계 염증 및 탈수초화 등의 다수의 MS 표현형이 확인되었다. GM-CSF 무효화 마우스에서 MOG는 EAE 표현형을 유발시킬 수 없었다[55]. 또한, 이들 마우스에서 MOG 항원에 대한 T 세포 증식이 감소하였고 Th1 사이토카인 IL-6 및 IFN-γ의 생성이 감소된 것으로 나타났다. 항원 공격과 동시에 GM-CSF 중화 항체를 투여하여 처리 후 10일 동안 질환 발병이 방지되었고 병변이 감소되는 것으로 증명되었다. 질환 발병 이후에 투여하면 마우스는 처리 20일 이내에 완전하게 회복되었다[55].

백혈병

GM-CSF는 골수성 백혈병, 소아형 만성 골수성 백혈병(JCML)에도 관여한다. 이 병태는 주로 4세 이하의 환자에게 영향을 주는 척수증식성 질병이다. 시험관 내 JCML 주변 혈관 과립구 마크로파지 전구인자(CFU-GM)는 낮은 세포 밀도에서 자발적인 증식을 보였는데, 이 관찰 결과는 다른 골수성 증식 질병에서는 이전에 기술된 것이 아니다. 또한, 이들 배양물에서 단핵구의 고갈은 이러한 증식을 없앴다. 이어, 이러한 자발적인 증식은 단핵구 유도된 사이토카인 MG-CSF에 대한 JCML 전구인자의 과민성을 통해서 매개되는 것으로 확인되었다[56, 57, 58, 59, 60, 61]. JCML 환자에서 GM-CSF의 수준 상승 또는 과생성보다는, JCML 전구 인자의 과민성은 탈조절된 GM-CSF 유도 Ras 신호 전달 경로를 통해서인 것으로 나타났다[62]. 결합 시험 및 기능 분석 양자에서 GM-CSF의 작용을 길항하는 GM-CSF 유사체(E21R)를 이용한 최근 연구는 GM-CSF의 작용을 억제하여 JCML의 중증으로 연합된 면역결핍/자연발증 당뇨병(SCID/NOD) 마우스 이종이식 모델에서 JCML 세포 적재량을 줄일 수 있다는 것을 보여준다[63]. 접합시에 E21R의 예방적인 전신 투약으로 골수 내 JCML 전구인자 확립을 방지하고 접합 4주 후 E21R 투약으로 JCML의 경감과 세포 적재량 감소가 유도되었다. 또한, 정상 인간 골수 및 JCML 골수를 함께 접합한 SCID/NOD 마우스에 E21R을 투여하여 JCML 적재량이 감소하였지만 정상 골수 세포는 영향을 받지 않은채로 남았다.

아테롬성 동맥경화증

허혈성 심장 질환은 전세계적으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 최근 수년간, 동맥벽에 염증성 세포의 축적이 지질 축적과 동반하여 일어나며, 염증이 아테롬성 동맥경화증의 발병에서 중요한 역할을 한다는 개념이 증가하였다. 동맥벽에 체류하면 염증 세포, 예컨대 단핵구 및 마크로파지 등은 국지적 염증 반응에 참여하여 영구 존재한다. 이들 마크로파지는 또한 다양한 지단백질에 대한 스캐빈저 수용체를 발현하여서 세포가 '거품 세포'로 분화하는데 기여한다. 이들 병변의 고전적인 특징인 지질 코어의 발전에 기여하는 것이 이들 '거품 세포'의 사멸이다. 이들 아테롬성 동맥경화증 플라크 내에서 염증이 계속됨에 따라서, 이러한 활성화된 염증 세포는 플라크의 섬유화 및 평활근 세포(SMC) 증식을 촉진하는 피브로겐 매개 인자 및 성장 인자를 방출한다. 섬유화를 촉진시키는 것 이외에도, 이들 세포는 또한 섬유성 플라크를 약화시키는데 기여하는 단백질 가수분해 효소, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 등을 방출하여서 이들이 파괴되도록 야기한다. 플라크는 파괴되면 세포 찌꺼기 및 응고 인자, 예컨대 조직 인자 등을 혈관으로 방출하여 응고 캐스캐이드 및 혈전 진행을 촉진시킨다. 결과적으로 동맥 혈전은 심근 허혈 또는 경색을 일으킬 수 있다.

최근, GM-CSF는 아테롬성 동맥경화증의 질환 진행의 다양한 측면에 관여하였다. 콜레스테롤 공급 토끼의 아테롬성 동맥경화증 병변에서, GM-CSF는 마크로파지와 함께 위치하고 내피 세포 및 SMC보다 그 정도가 덜한 것으로 확인되었다[64]. 또한, GM-CSF 발현은 마크로파지 축적 부위 및 중막 SMC 및 내피 세포 내에 인간 아테롬성 동맥경화성 혈관에서 증가하는 것으로 확인되었다[65]. 이러한 GM-CSF 수준의 증가는 부분적으로, 아테롬성 동맥경화증 병변의 형성 및 발병 동안 단핵구/마크로파지 및 내피 세포의 직접적인 세포 대 세포 접촉에 의한 것이다[66]. 아테롬성 병변의 또다른 핵심 성분은 '거품 세포'인데, 이는 표면 상의 스캐빈저 수용체를 통해서 산화된 저밀도 지단백질(LDL)을 흡수하는 마크로파지이다. 시험관내에서, 이러한 Ox-LDL의 흡수는 마크로파지가 GM-CSF 의존적 기전을 통해서 증식되도록 더욱 촉진할 수 있다[67].

아테롬성 동맥 경화증이 만성 염증 과정이므로, 항염증제 예컨대 글루코코르티코이드 등을 실험하였다. 항염증성 글루코코르티코이드인 덱사메타손은 다양한 실험 동물 모델에서 아테롬성 동맥경화증의 발병을 억제하였다[68,69,70,71]. 이의 효능은 SMC 이동[72] 및 증식[73]의 억제, 및 순환하는 단핵구 및 백혈구의 주화성 감소[74]에 기여한다. 최근 연구는 ox-LDL이 마우스 복막 마크로파지로부터 GM-CSF 방출을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다[75]. 또한, 덱사메타손을 후속 처리하면, 이 GM-CSF 방출이 용량 의존적으로 억제되었으며, 이는 덱사메타손의 항염증 효과는 ox-LDL 유도된 GM-CSF 생성을 억제하여 매개된다는 것을 의미한다. GM-CSF가 아테롬성 동맥경화증에서 중심 역할을 하기 때문에, 글루코코르티코이드의 대체물은 이러한 징후에서 GM-CSF 활성을 억제할 수 있다.

용어

본 발명에서 사용하는 "및/또는"은 특정한 특징 또는 성분 중 하나를 다른 것과 함께이거나 없는 특별한 개시로서 위해 사용한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 여기서 각각을 개별적으로 설명한 바와 같이, 각각 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B의 특별한 개시로서 사용한다.

GM-CSFRα및 GM-CSF

GM-CSFRα는 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자를 위한 수용체의 알파 사슬이다. 인간 GM-CSFRα의 전체 길이 서열은 수탁 번호 S06945(gi:106355)[76]로서 기탁되었고 여기서는 서열 번호 202로 나타내었다. 인간 GM-CSFRα의 성숙한 형태, 즉 절단된 단일 펩티드는 서열 번호 206으로 나타내었다. 본문에서 달리 정의하지 않으면, GM-CSFRα에 대해 인용하는 것은 인간 또는 인간이외의 영장류(예를 들어, 사이노멀거스) GM-CSFRα, 보통은 인간을 의미한다. GM-CSFRα는 천연 발생 GM-CSFRα 또는 재조합 GM-CSFRα일 수 있다.

인간 GM-CSF 수용체 α의 298 아미노산 세포외 도메인은 서열 번호 205의 아미노산 서열을 갖는다.

본문에서 달리 언급하지 않으면, GM-CSF에 대해 인용하는 것은 인간 또는 인간외 영장류(예를 들어, 사이노멀거스) GM-CSF, 보통 인간을 의미한다.

GM-CSF는 보통 성숙한 GM-CSF 수용체 알파 사슬(서열 번호 206)의 세포외 도메인(서열 번호 205)에 결합한다. 본 발명에서 기술한 바와 같이, 이러한 결합은 본 발명의 결합 성분을 통해 억제된다.

GM-CSFRα의 천연 발생 스플라이싱 변이체가 동정되었다. 이는 예를 들어, 참고문헌 [77 및 78]을 참조한다. 세포외 도메인은 이들 스프라이싱 변이체에서 고도로 보존되어 있다. 본 발명의 결합 성분은 GM-CSFRα의 하나 이상의 스플라이싱 변이체에 결합하거나 결합하지 않고, GM-CSFRα의 하나 이상의 스플라이싱 변이체에 대한 GM-CSF 결합을 억제하거나 억제하지 않는다.

결합 성분

여기서 상호 결합하는 한쌍의 분자 성분을 기술한다. 결합쌍의 성분은 천연적으로 유도되거나 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성 생성할 수 있다. 분자쌍의 한 성분은 그 표면에 부분 또는 공동을 가지는데, 이는 분자쌍의 다른 성분의 특정 공간 및 극성 배향에 결합하며, 따라서 상보적인 공동을 갖는다. 결합쌍 유형의 예는 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질 등이다. 본 발명은 항원-항체형 반응에 관한 것이다.

결합 성분은 보통 항원 결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합 성분은 항원 분자 또는 항원 결합 부위를 갖는 비항원 단백질일 수 있다. 항원 결합 부위는 비항체 단백질 스캐폴드 예컨대 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등에 CDR 배열을 통해서[80,81,82], 또는 목적 표적에 결합성을 부여하도록 단백질 스캐폴드 내 루프의 아미노산 잔기를 돌연변이화하거나 무작위화하여서 제공할 수 있다. 단백질 내 신규 결합 부위를 유전자 조작하기 위한 스캐폴드가 구체적으로 보고되어 있다[82]. 항체 모방체에 대한 단백질 스캐폴드는 WO/0034784에 개시되어 있는데, 여기서 발명자들은 하나 이상의 무작위화 루프를 갖는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 기술하고 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어, HCDR 세트를 융합하기위한 적절한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의 도메인 성분에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 인간이외의 단백질일 수 있다.

비항체 단백질 스캐폴드의 장점은 하나 이상의 일부 항체 분자에 비하여 보다 작고/작거나 조작이 보다 용이하게 스캐폴드 분자내에 항원 결합 부위를 제공할 수 있는 것이다. 결합 성분의 소형 크기는 유용한 생리적 특성 예컨대 세포로 유입되거나, 조직 깊숙하게 침투가허나 또는 다른 구조내 표적에 도달하거나 또는 표적 항원의 단백질 공동 내 결합하는 등의 능력을 부여할 수 있다.

비항원 단백질 스캐폴드의 항원 결합 부위의 이용에 대해서는 참고문헌 [79]를 참조한다. 대체로 루프 또는 루프들의 아미노산 서열이 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이화되어서 표적 항원에 결합하기 위한 항원 결합 부위를 생성시킨 하나 이상의 가변 루프, 및 안정한 골격구조를 갖는 단백질이다. 이러한 단백질에는 S.aureus 유래 단백질 A, 트렌스페린, 테트라넥틴, 피브로텍틴(예를 들어, 제10 피브로텍틴 III형 도메인) 및 리포칼린의 IgG 결합 도메인을 포함한다. 다른 접근법으로는 합성 "마이크로바디"(Selecore GmbH)가 포함되는데, 이는 분자내 이황화 결합을 갖는 소형 단백질인 시클로티드를 기반으로 한다.

항체 서열 및/또는 항원 결합 부위이외에도, 본 발명에 따른 결합 성분은 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 다른 아미노산, 예를 들어 폴딩 도메인, 또는 항원에 결합하는 능력이외에 다른 기능적 특성을 분자에 부여하기 위한 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 검출가능한 표지를 보유하거나, 또는 독소 또는 표적 부분 또는 효소에 접합될 수 있다(예를 들어, 펩티드 결합 또는 링커를 통해서 접합됨). 예를 들어, 결합 성분은 항원 결합 부위뿐만 아니라 촉매 부위(예를 들어, 효소 도메인 내에)를 포함할 수 있으며, 여기서 항원 결합 부위는 항원에 결합하여서 촉매 부위를 항원에 대해 표적화한다. 촉매 부위는 항원의 생물학적 기능을, 예를 들어 절단하여 억제할 수 있다.

언급한 바와 같이, 예컨대 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등의 스캐폴드가 CDR을 보유할 수 있지만[80,81,82], 본 발명의 CDR 세트 또는 CDR를 보유하기 위한 구조는 일반적으로 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 존재하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 실질적인 부분이게 된다. 면역그로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat 외, 1987][98]을 참조하여 결정할 수 있고, 이의 최신판은 인터넷 http://immuno.bme.nwu.edu에서 입수가능하고 또는 임의 서치 엔진을 이용하여 "Kabat"을 검색하여 입수할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 항체 불변 영역 또는 이의 일부, 바람직하게는 인간 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C 말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬, 바람직하게 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착할 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기반으로 하는 결합 성분은 이의 C 말단에서 임의 이소타입, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 이소타입 하위부류, 구체적으로 IgG1, IgG2 및 IgG4에서 유래하는 면역글로불린 중쇄의 전체 또는 일부(예를 들어, CH1 도메인)에 결합할 수 있다. IgG1, IgG2 또는 IgG4가 바람직하다. IgG4는 상보적으로 결합하지 않고 효과 인자 기능을 생성하기 않기 때문에 바람직하다. 이러한 특성을 갖고 가변 영역을 안정화시키는 임의 합성 또는 다른 불변 영역도 본 발명의 구체예에서 사용하기에 바람직하다.

본 발명의 결합 성분은 검출가능한 표지 또는 기능성 표지로 표지화될 수 있다. 검출가능한 표지는 방사선 동위원소 예를 들어 항체 영상화 분야에서 공지된 통상의 화학법을 이용하여 본 발명의 항체에 부착시킬 수 있는 ¹³¹I 또는 ⁹⁹Tc를 포함한다. 표지는 또한 홀스래디시 퍼록시다제 등의 효소 표지를 포함한다. 표지는 또한 특수 동족 검출가능 부분, 예를 들어, 표지화된 아비딘 등에 결합하여 검출할 수 있는 바이오틴 등의 화학 부분을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체 분자의 결합 성분은 결합 성분 및 표지를 포함하는 접합체 형태일 수 있으며, 선택적으로 펩티드 등의 링커를 통해 연결될 수 있다. 결합 성분은 예를 들어 효소(예컨대, 퍼록시다제, 알칼리 포스파타제) 또는 이에 제한되지 않으며, 예를 들어, 바이오틴, 형광색소, 녹색 형광 단백질을 포함하는 형광 표지에 접합될 수 있다. 또한, 표지는 독소 부분 예컨대 슈도모나스 외독소(PE 또는 이의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아 독소(이의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 보툴리늄 독소 A 내지 F, 리신 또는 이의 세포독성 단편, 아브린 또는 이의 세포독성 단편, 사포린 또는 이의 세포독성 단편, 미국자리공 항바이러스 독소 또는 이의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 이의 세포독성 단편의 군에서 선택된 독소 부분을 포함할 수 있다. 결합 성분이 항체 분자를 포함하는 경우, 표지화된 결합 성분은 면역접합체라고도 한다.

항체 분자

여기서는 천연적으로 또는 부분 또는 전체 합성 생산된 면역글로불린을 기술한다. 여기서 사용하는 용어는 또한 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편은 예컨대 Fab, F(ab')₂, Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; 및 디아바디이다.

단일클론 및 다른 항체를 사용하는 것도 가능하고 원래 항체의 특이성을 유지하는 키메라 분자 또는 다른 항체를 생성하기 위한 재조합 DNA 기법의 방법들을 사용하는 것도 가능하다. 이러한 방법들은항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 골격구조 영역이 더해진 불변 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 후속 문헌의 대부분을 참조한다. 하이브리도마 또는 항체를 생산하는 다른 세포에 대해서 생산된 항체의 표적 결합을 변경하거나 변경하지 않는 유전적 돌연변이 또는 다른 변화를 가할 수 있다.

항체를 다양한 방법으로 변형할 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 항체 항원-결합 부위를 갖는 임의 결합 성분 또는 물질을 포괄하여 포함한다. 따라서, 이 용어는 천연적으로 또는 전체 또는 일부 합성되건 상관없이 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의 폴리펩티드를 포함하고, 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 다른 폴리펩티드에 융합된 항체 항원-결합 부위 또는 이의 동등물을 포함하는 키메라 분자도 포함한다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 그리고 많은 후속 문헌에 기술되어 있다.

항체 조작 분야에서 이용가능한 추가적인 방법을 통해서 인간 및 인간화 항체를 단리하는 것이 가능하다. 인간 및 인간화 항체는 본 발명의 바람직한 구체예이고, 임의 적절한 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 인간 하이브리도마를 만들 수 있다[83]. 파지 디스플레이, 결합 성분을 생성하기 위한 다른 확립된 방법은 구체적으로 여러 공개문헌 예컨대 문헌 [83] 및 WO92/01047(이하 추가로 기술함) 등에 구체적으로 기술되어 있다. 마우스 면역 시스템의 완전한 다른 성분은 남겨두고 인간 항체 유전자로 마우스 항체 유전자를 불활성화 및 기능적으로 치환시킨 형질전환 마우스를 이용하여 인간 항체를 분리할 수 있다[84]. 인간화 항체는 당분야에 공지된 방법, 예컨대 WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 및 WO93/17105에 개시된 방법들을 이용하여 생산할 수 있다. 또한, WO2004/006955는 예를 들어, 비인간 항체의 가변 영역의 CDR 서열에 대한 표준 CDR 구조형을 생식세포 항체 유전자 절편 등의 인간 항체 서열 라이브러리 유래의 상응하는 CDR에 대한 표준 CDR 구조형과 비교하여 인간 항체 유전자로부터 가변 영역 골격구조 서열을 선택한 것을 기준으로, 항체를 인간화하는 방법에 대해 기술하고 있다. 비인간 CDR에 대해서 유사한 표준 CDR 구조형을 갖는 인간 항체 가변 영역은 인간 골격구조 서열을 선택하기 위한 인간 항체 서열성분의 서브셋을 형성한다. 서브셋 성분은 인간 및 비인간 CDR 서열간의 아미노산 유사성을 통해 추가로 정렬시킨다. WO2004/006955의 방법에서, 상위 인간 서열을 선택하여 선택된 서브셋 성분 인간 골격구조를 이용하여 인간 CDR 대응물로 인간 CDR 서열을 기능적 치환시킨 키메라 항체를 제작하기 위한 골격구조 서열을 제공하여, 비인간 및 인간 항체간의 골격구조 서열을 비교할 필요없이 높은 친화성 및 낮은 면역원성의 인간화 항체를 제공한다. 이 방법에 따라 만든 키메라 항체도 개시되어 있다.

합성 항체 분자는 적절한 발현 벡터 내에서 합성 및 어셈블리된 올리고뉴클레오티드를 통해 생성된 유전자로부터 발현시켜 생성시킬 수 있다[85,86].

전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있음이 확인되었다. 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편[87,88,89]; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')₂ 단편, 두개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) 단일 사슬 Fv 분자(scFv)로서, 여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 항원 결합 부위를 형성하기 위해 두 도메인을 연합시킬 수 있는 펩티드 링커를 통해 연결되어 있는 분자[90,91]; (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합으로 제작된 다가 또는 다중특이적 단편, "디아바디"(WO94/13804; [92]) 등이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 브릿지를 도입하여 안정화시킬 수 있다[93]. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디도 제조할 수 있다[94].

dAb(도메인 항체)는 항체의 소형 단량체 항원-결합 단편으로서, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역이다[89]. VH dAb는 카멜리드(예를 들어, camel, llama)에서 천연적으로 발생하는 것이고 표적 항원으로 카멜리드를 면역화시키고, 항원-특이적 B 세포를 단리하여, 개별 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝하여 생산할 수 있다. 이들의 작은 크기, 양호한 가용성 및 온도 안정성은 이들을 특히 생리적으로 유용하게 하며 선택성 및 친화성 성숙화에 적합하게 한다. 본 발명의 결합 성분은 본 발명에서 나타낸 바와 실질적으로 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하거나 또는 본 발명에서 나타낸 바와 실질적으로 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다. "나타낸 바와 실질적으로 같은"은 본 발명의 관련 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 본 발명에서 서열을 나타낸 특정 영역과 동일하거나 고도로 유사하다는 의미이다. "고도로 유사하다"는 것은 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4 예컨대 1 내지 3, 또는 1 또는 2, 또는 3 또는 4의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다는 것을 고려하는 것이다.

이중특이적 항체를 사용하는 경우에서, 이들은 통상의 이중특이적 항체로서, 다양한 방법으로 제조할 수 있고[95], 예를 들어, 화학적으로 제조하거나 하이브리드 하이브리도마에서 제조할 수 있으며, 또는 상기 언급한 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 이중특이적 항체의 예에는 상이한 특이성을 갖는 두 항체의 결합 도메인을 사용할 수 있고 짧은 가용성 펩티드를 통해 직접 연결할 수 있는 BiTE™ 방법의 것들이 포함된다. 이는 짧은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 두 항체를 조합한다. 디아바디 및 scFv는 가변 도메인만을 이용하여, 강력하게 항-이디오타입 반응의 영향을 감소시켜, Fc 영역 없이 제작할 수 있다.

이중특이적 전체 항체와는 대조적으로 이중특이적 디아바디는 또한 이들을 E.coli에서 용이하게 제작 및 발현시킬 수 있기 때문에 특이 유용하다. 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 다른 폴리펩티드 예컨대 항체 단편)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 이용하여 용이하게 선별할 수 있다. 예를 들어, GM-CSFRα에 대해서, 디아바디의 한쪽 암을 일정하게 유지시키고자 하면, 다른 암은 다양화ㅅ시키고 적절한 표적 결합의 항체를 선별하는 라이브러리를 제조할 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 knob-into-holes 조작법[96]을 통해 제조할 수 있다.

항원-결합 부위

여기서는 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 상보적인 분자의 일부를 기술한다. 항체 분자에서, 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 상보적인 항체의 일부를 포함하는 것을 항체 항원-결합 부위라고한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있는데, 이러한 부분을 에피토프라고 한다. 항체 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.

카밧 넘버링

본원의 항체 서열의 잔기는 일반적으로 카밧 등의 문헌(1971)[97]에 정의된 바와 같은 카밧 넘버링을 이용하여 명명하였다. 이와 관련하여 문헌[98, 99]도 참조할 수 있다.

단리된

이 용어는 본 발명의 결합 성분, 또는 상기 결합 성분을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따라 존재하는 그 상태를 나타낸다. 단리된 성분 및 단리된 핵산은, 이들과 천연 환경에서 또는 이들이 제조된 환경에서(예를 들어 세포 배양액에서)[이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 수행되는 재조합 DNA 기법에 의한 것일 때) 함께 존재하는 다른 폴리펩티드 또는 핵산과 같은, 이들이 자연적으로 함께 회합하는 물질이 없거나 실질적으로 없는 것이다. 결합 성분 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제제화될 수 있으나, 실용상의 목적으로 분리될 수도 있다 - 예를 들어 상기 성분들은 일반적으로, 면역분석에 사용하기 위한 미량적정 플레이트를 코팅하는 데 젤라틴 또는 기타 담체가 사용되었다면 이들과 혼합되거나, 진단 또는 치료에 사용될 경우 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합된다. 결합 성분은 자연적으로 또는 이종성 진핵 세포[예를 들어, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503)]의 시스템에서 글리코실화되거나 또는 (예를 들어, 원핵 세포에서의 발현에 의해 제조되는 경우) 비글리코실화될 수 있다.

실험 부분

배경

인간 항체 단편은 섬질의 박테리오파지의 표면에 디스플레이된 레퍼토리로부터 시험관 내 선택될 수 있다. 이 과정은 파지 디스플레이로서 알려져 있고, 인간 항체 단편을 유도하는 수단을 제공한다. 상기 과정은 인간 항인간 특이성을 분리하는 데 사용될 수 있고, 특이적 친화도 특성의 항체를 유도하기 위해 맞춰질 수 있다.

짧은 펩티드 링커에 의해 함께 연결된 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인으로만 이루어진 항체 단편은 항원 결합을 결정하는 데 필요한 모든 정보를 함유한다. 그러한 단편은 단일 사슬 Fv(scFv)로서 알려져 있다. 파지 표면에 표시할 때, scFv는 정확하게 접히고 항원에 결합하는 것으로 보여진다. 인간 scFv의 거대한 레퍼토리는 이 방식으로 구성되고, 드러그 후보자로서의 개발을 위해 분리될 수 있는 것으로부터 공급원을 제공한다. 그 다음 후보자 scFv는 치료상 적용을 위한 완전한 IgG(전형적으로 인간 IgG) 분자로서 재설정된다.

개요

인간 GM-CSFRα에 결합된 파지의 개체수를 풍부하게 하기 위해, 인간 비장 림프구로부터 유래된 scFv 파지 디스플레이 라이브러리 상에서 선택을 수행하였다. 선택된 특성을 가지는 scFv 항체를 분리하고 이들 scFv를 IgG₄로 전환시켰다. 다양한 분석을 이용하여, 항체 패널을 분리하고, 최적화하고 생식세포화하여 치료상 항체에 대한 적당한 특이성을 가진 IgG4를 산출하였다.

서열 목록에서 그 서열을 항체 1, 2 및 4∼20으로서 나타낸 19개의 항체 클론은 어버이 항체로부터 유래되었다. 상기 어버이는 서열 목록에서 항체 3으로 나타내고, 또한 본원에서 28G5로 언급된다. 19개의 클론은 실험 부분에서 기재된 바와 같이 다양한 생물학적 분석에서 특히 우수한 특성을 나타내는 것으로서 선택되었고, 항체 번호 1, 2 및 4∼20으로 표시되었다.

생물학적 정량은 류마티스성 관절염과 같은 질환의 염증성 특징을 반영하도록 디자인되었다. 예를 들어, 작용 부위로의 그들의 채용에 필수적인 호중성 백혈구의 형상 변화, 단핵구에 의한 전염증성 인자의 방출 및 특정 신호에 반응하는 염증성 세포 유형의 생존 증가. 상기 항체는 이러한 분석에서 강력한 중화 활성을 나타낸다.

이용한 분석 방법의 자세한 프로토콜은 하기 "분석 재료 및 방법"이라는 제목의 부분에서 제공한다.

항체 리드 분리

거대한 단일 사슬 FV(scFv) 인간 항체 라이브러리를 선택에 사용하였다. 이것은 20명의 건강한 기증자로부터 얻은 비장 림프구로부터 유도하여, 파지미드 벡터로 클로닝하였다. GM-CSFRα를 인지하는 ScFv를 HEK293T 세포에서 정제 태그된 가용성인 수용체의 세포외 도메인의 과발현으로부터 유래된 정제된 GMCSF-Rα에 대한 일련의 반복된 선택 주기로 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리한 ScFv를 분리하였다. 이는 Vaughan 외[102]에서 기재된 바와 같이 반드시 달성되었다. 요컨대, 파지 라이브러리로의 비오틴화된 수용체의 노출에 이어, 결합한 파지를 가진 단백질을 스트렙타비딘 코팅된 자석 비드 상에 포획하였다. 미결합한 파지는 세척해버렸다. 그 다음 결합한 파지를 Vaughan 외에 의해 기술된 바와 같이 구조하고, 상기 선택 과정을 반복하였다. 항원 농도를 감소시키는 데 3개 라운드의 선택을 수행하였다. 선택 라운드의 산출로부터 얻은 대표적인 부분의 scFv를 DNA 서열 분석하였다.

상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 이러한 초기 선택에 이어, 정제한 GM-CSFRα 세포외 도메인에 대한 GM-CSF의 결합을 저해할 수 있는 scFv 항체를 발현하는 파지를 확인하기 위해 디자인된 리간드 결합 분석에서 유일한 scFv 패널을 확인하였다. 리간드 결합 분석에서 이들 scFv의 중화 효능은 0.65∼3.3 nM 범위이다.

생화학적 리간드 결합 분석에서 활성적이었던 항체는, GM-CSF로 자극받은 TF-1 세포의 증식을 저해하는 항체의 능력을 분석함으로써 중화 효능을 측정하는 TF-1 증식 분석에서 생물학적 활성에 대해 평가된다. TF-1은 적백혈병을 앓는 환자로부터 성립된 인간의 전골수성 세포주이다. 이 세포주는 생존 및 증식에 있어서 인자 의존적이고, 인간 GM-CSF에서 일상적으로 유지된다. GM-CSF 의존성 증식의 저해는 새롭게 합성된 분열 세포의 DNA로의 적정된 티미딘의 혼합 감소를 측정함으로써 결정되었다. 모든 scFv는 이 분석에서 IC50 값이 약 180∼1200 nM 범위인 측정가능한 효능을 가졌다.

가장 강력한 scFv 클론을 인간 감마 4 중쇄 일정 도메인 및 인간 람다 경쇄 일정 도메인을 가진 인간 IgG4 항체 분자로서 재설정하였다. 약간 변형시킨 Persic 외[100]에 기재된 바와 같이 완전한 IgG4 항체로서 항체의 발현을 허용하기 위해 가장 강력한 scFv 클론에 대해 벡터를 구성하였다. oriP 단편을 상기 벡터에 포함시켜 HEK-EBNA 293 세포와의 사용을 촉진시키고 에피솜 복제를 허용하였다. VH 가변 도메인을 발현 벡터 pEU8.1(+)의 인간 감마 4 일정 도메인 및 분비 리더 서열 사이의 폴리링커로 클로닝하였다. VL 가변 도메인을 발현 벡터 pEU4.1(-)의 인간 람다 일정 도메인 및 분비 리더 서열 사이의 폴리링커로 클로닝하였다. HEK-EBNA 293 세포를 중쇄 및 경쇄를 발현하는 구조물로 공감염시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 조건화한 배지로부터 완전한 항체를 정제하였다. 정제된 항체 조제물을 멸균 여과하고, 평가 이전에 인산염 완충된 염수(PBS) 중에 4℃에서 저장하였다. BCA법(Pierce)을 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하였다.

재설정된 IgG를 TF-1 증식 분석에서 알려진 쥣과동물 항체 2B7과 비교하였다. IgG4는 이 분석에서 IC50 값이 6∼약 1600 nM인 활성을 유지하거나 또는 얻었다.

염증성 질환에 있어서, 호중성 백혈구의 형상 변화는 작용 부위로의 채용에 필수적이다. 인간 과립구 형상 변화 분석은 형광물질 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 이 생물학적 반응을 모방하고 GM-CSF로의 그들의 노출을 수반하는 혈액으로부터 분리된 과립구의 형상 변화를 측정하도록 디자인하였다. GM-CSF로의 호중성 백혈구의 형상 변화 반응을 저해하는 항GM-CSFRα IgG4 항체의 능력을 평가하였고, 선택된 클론의 IC50 값은 약 15∼350 nM 범위였다. 대표적인 항체 28G5는 사이노몰거스 GMCSF-R을 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 약 5 nM의 IC50으로 중화하였다. 알려진 쥣과동물 항체 2B7은 또한 사이노몰거스 수용체에 대한 GM-CSF 결합으로부터 기인한 생물학적 반응을 중화시킬 수 있다.

그 다음 BIAcore를 이용하여 계산된 K_D 값이 32∼377 nM 범위인 항체의 수용체 결합 친화도를 측정하였다.

최적화

28G5의 효능을 향상시키려는 노력으로 최적화 프로그램을 개시하였다. V_H 또는 V_L CDR3의 무작위 돌연변이가 수행되는 항체의 라이브러리를 산출하였다. 전체 CDR을 포함하기 위해 각각의 CDR3을 6개 아미노산의 2개 블럭으로 무작위화하여, 라이브러리 H1(6개 aa VH CDR3의 N 말단 블럭), H2(VH CDR3 중 6개 aa의 C 말단 블럭), L1(VL CDR3 중 6개 aa의 N 말단 블럭) 및 L2(VL CDR3 중 6개 aa의 C 말단 블럭)를 산출하였다. 얻어진 라이브러리는 인간 GM-CSFRα로의 결합을 위해 반복된 선택 주기를 거쳤다. 그 다음, 이 선택 과정으로부터 분리된 클론을 돌연변이한 중쇄 CDR3 및 돌연변이한 경쇄 CDR3 둘 다와 함께 scFv를 함유하는 혼합 파지 라이브러리를 구성하는 데 사용하였다. 이들 라이브러리는 또한 동일한 선택 과정을 거쳤다.

최적화 과정의 각각의 단계에 있어서, GM-CSF 수용체에 대한 28G5 IgG4의 결합을 저해할 수 있는 scFv를 28G5 및 수용체와의 에피토르 경쟁 분석을 이용하여 확인하였고, 그 다음 하기 기술한 바와 같은 TF-1 증식 분석에서 평가하였다.

28G5의 중쇄 CDR3 서열의 무작위 돌연변이에 이어, scFv 패널을 TF-1 분석에서 측정가능한 중화 효능으로 확인하였다. VH CDR3의 3' 말단을 무작위화할 때 대부분의 효능이 향상되었다.

28G5의 경쇄 CDR3 서열의 무작위 돌연변이에 이어, 한 패널의 scFv를 TF-1 분석에서 측정가능한 중화 효능으로 확인하였다. V_L CDR3의 3' 말단을 무작위화할 때 모든 효능 향상이 얻어졌다.

중쇄 및 경쇄 CDR3 무작위 돌연변이 라이브러리의 혼합에 이어, TF-1 증식 분석에 있어서 어버이 scFv 28G5에 비해 향상된 효능을 가진 scFv 패널을 확인하였다. 어버이 28G5에 비해 >60000배인 효능 향상을 가진 ScFv를 분리하였다. 상기 라이브러리의 모든 혼합은 향상된 scFv, 즉 H1/L1, H1/L2, H2/L1, H2/L2를 초래하였다. 이것은 어떠한 향상된 scFv가 L1 라이브러리로부터 분리되지 않기 때문에 특히 관심의 대상이다.

28G5의 최적화 동안 확인된 19개 scFv의 패널을 전술한 방법으로 재설정하고 IgG4로서 발현시켰다. 상기 패널은 항체 클론 1, 2 및 4∼20으로 구성되었다. 이 패널에서 가장 강력한 클론 중 몇몇을 혼합된 H 및 L CDR3 돌연변이화 라이브러리로부터 얻었다. 이 패널에서 IgG4 항체를 TF-1 증식 분석에서 그들의 활성에 대해 평가하고 알려진 쥣과동물 항체 2B7과 비교하였다. 모든 최적화한 IgG4는 이 분석에 있어서 2B7보다 더 강력하였다. 이 경우에 2B7은 계산된 IC50이 약 1.6 nM이고, 반면에 상기 클론은 IC50 값이 약 1 pm∼약 1100 pM 범위로 계산되었다. 데이터는 표 1에 나타내고, 하기와 같이 요약된다:

IC50 <1500 pM 항체 1, 2 및 4∼20

IC50 <300 pM 항체 1, 2, 4∼12 및 14∼20

IC50 <60 pM 항체 1, 2, 4∼6, 8∼11, 14 및 16∼20

IC50 <10 pM 항체 1, 5, 6, 11 및 20.

도 3은 TF-1 증식 분석에 있어서 알려진 항체 2B7과 비교한 본 발명의 2가지 대표적인 항체, 항체 1 및 항체 6의 길항제 효능을 도해한다.

BIAcore 2000 시스템(파마시아 바이오센서)은 재조합 정제 태그된 GM-CSF 수용체 세포외 도메인을 가진 리드 최적화한 IgG4 중 몇몇 상호작용의 역학적 변수들을 평가하는 데 사용하였다. 상기 항체의 친화도는 더 향상되어, 계산된 K_D 값은 0.127 nM∼약 5 nM 범위이다. 데이터는 표 2에 나타낸다. 온 속도(on-rates) 및 오프 속도(off rates) 둘 다에서 향상되었다. GM-CSFR α의 가용성 세포외 도메인에 대한 IgG4의 친화도 및 TF-1 분석에 있어서 그들의 성능 사이의 상관관계는 0.85(p<0.0001)의 피어슨 상관계수로 매우 우수하였다. 비교에 의해, 2B7의 KD를 개별적으로 계산하였고, 약 7 nM로 나타내었다.

28G5의 최적화 동안 확인된 IgG4 항체를 인간 과립구 형상 변화 분석에서 평가하고, 알려진 쥣과동물 항체 2B7과 비교하였다. 이 분석에서 평가된 모든 항체(항체 1, 2, 5, 6, 9∼11, 16 및 20)는 IC50이 7.8∼90 pM 범위로 매우 강력하였다. 이들 중, 항체 1, 2, 5, 6, 9, 16 및 20은 IC50이 50 pM 미만이고, 항체 1, 2, 6, 16 및 20은 IC50이 25 pM 미만이었다. 우리의 항체는 2B7보다 더 강력하고, IC50이 477 pM이었다. 데이터를 표 3에 나타낸다. 도 4는 인간 과립구 형상 변화 분석에 있어서 알려진 항체 2B7과 비교한 본 발명의 2개의 대표적인 항체, 항체 1 및 항체 6의 길항제 효능을 도해한다.

28G5의 최적화 동안 확인된 IgG4 항체를 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 평가하였다. 모든 상기 항체는 사이노몰거스 수용체뿐 아니라 인간 수용체에서 GM-CSF의 활성을 중화할 수 있고, 모든 상기 항체는 2B7보다 더 강력했다. 2B7는 IC50이 26 pM인 한편, 상기 패널로부터 얻은 대표적인 항체(항체 6, 항체 1 및 항체 2)는 IC50 값이 각각 1.73, 2.03 및 3.2 pM이었다.

28G5의 최적화 동안 확인된 한 패널의 IgG4는 단핵구 TNFα 방출 분석에서 그들의 중화 효능에 대해 평가하였다. 이 분석은 그것들을 GM-CSF로 처리하는 경우 인간 단핵구로부터 전염증성 인자 TNFα의 방출을 저해하는 능력을 테스트한다. 항체 1, 2, 5, 6, 9 및 10을 테스트하니, 모두가 이 분석에서 활성이 있고, 그의 수용체(약 43∼139 범위의 IC50)에서 GM-CSF의 작용을 완전히 중화할 수 있는 한편, 333 nM 농도의 2B7은 GM-CSF 유발된 TNFα 방출의 단지 50% 저해를 달성할 수 있고, 이는 이 항체가 이 분석에서 단지 부분적인 저해제임을 가리킨다. 도 5는 단핵구 TNFα 방출 분석에서 알려진 항체 2B7과 비교한 본 발명의 2개의 대표적인 항체의 길항제 효능을 도해한다. 데이터는 표 4에 나타내고 하기와 같이 요약된다:

<150 pM 항체 번호 1, 2, 5, 6, 9 & 10

<110 pM 항체 번호 1, 2, 5, 6 & 9

<100 pM 항체 번호 1, 5, 6 & 9

염증성 질환의 특질은 특정 신호에 반응한 염증성 세포 유형의 생존 증가이다. 과립구는 GM-CSF의 존재 시 더 긴 시간 생존할 수 있고, 그래서 이 반응을 저해하는 28G5의 최적화 동안 분리된 IgG4 항체의 작용은 과립구 생존 분석에서 평가된다. 리드 최적화로부터 얻은 모든 항GM-CSFRα는 이 분석에서 활성적이고, 대표적인 중화 효능(IC50)은 7.0∼843.7 pM 범위이다. 이것은 최대 83 nM 농도까지 완전히 비활성인 알려진 쥣과동물 항체 2B7과 반대이다. 도 6은 과립구 생존 분석에서 알려진 항체 2B7과 비교한 본 발명의 2개의 대표적인 항체, 항체 1 및 항체 6의 길항제 효능을 도해한다.

도 3∼6에서 도해한 바와 같이, 이들 데이터는 우리의 항체가 알려진 쥣과동물 항체 2B7과 비교하여 유의적으로 다른 특성을 가짐을 가리킨다. 예를 들어, 본 발명의 대표적인 항체는 과립구 생존 및 TF-1 증식 분석 각각에서 7 pM GM-CSF로 자극된 TF-1 증식 및 과립구 생존을 저해하는 반면, 2B7은 과립구 생존을 저해하지는 않으나 TF-1 증식을 저해하지 않았다(비록 우리의 항체보다 더 적은 범위이지만). 상기 데이터는 본 발명의 결합 성분이 더 높은 친화도를 가지며 알려진 항GM-CSFRα 항체와 비교하여 GM-CSF-R을 통해 조정된 다양한 생물학적 효과를 저해하는 능력이 향상되었음을 가리킨다.

28G5 및 그 유도체의 유도된 아미노산 서열은 VBASE 데이터베이스에서 알려진 인간 생식세포 서열 및 서열 유사성에 의해 확인한 가장 가까운 생식세포로 정렬하였다. 28G5 및 그 유도체의 VH 도메인에 대한 가장 가까운 생식세포를 VH1 DP5로서 확인하였다. 28G5 VH는 골격구조 영역 내에서 VH 1-24(DP5) 생식세포로부터 14개 변화를 가진다. 상기 VL 도메인에 대한 가장 가까운 생식세포는 V람다1 VL 1-e(DPL8)이고, 골격구조 영역 내에서 생식세포로부터 단지 5가지 변화를 가진다. 28G5 및 그 유도체의 골격구조 영역은 부위 지정 돌연변이에 의해 생식세포로 돌아가서 고유의 인간 항체에 동일하게 일치하였다. 하나의 아미노산을 제외한 모두는 항체 효능에서 단지 최근 변화만을 가진 생식세포로 전환될 수 있었다. 중쇄 94번 위치(카밧 넘버링 이용, 카밧 외. 1971)의 아미노산 이소루신은 활성의 완전한 손실 없이 생식세포 트레오닌으로 변화될 수 없다. 그러므로, 생식세포로부터의 이 단일 변화는 항체 골격구조 영역에서 유지되었다.

항GM-CSFRα 항체 중 두 가지, 항체 6 및 항체 1의 완전한 pA₂ 분석을 TF-1 증식 분석에서 수행하였다. 상기 데이터는 이들 항체가 이 시스템에서 계산된 pA₂ 값이 각각 -11.3±0.2 및 -11.0±0.2인 매우 강력한 길항제임을 확증한다(도 1).

항GM-CSFRα 항체 중 하나, 항체 6의 완전한 pA₂ 분석을 인간 및 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 수행하였다. 상기 데이터는 이 항체가 이 시스템에서 계산된 pA₂ 값이 인간 및 사이노몰거스 분석에서 각각 -10.58 및 -10.78인 매우 강력한 길항제임을 확증한다(도 2).

GM-CSF는 반고체 한천 배지 분석에서 조혈 원종 세포가 과립구 및 대식 세포 콜로니로 분화되도록 조종한다. 그러므로, 친화도 성숙한 항체 6 및 항체 1, mAb 어버이 항체 3(28G5) 및 음성 대조군(CAT001)을, 말초 혈액으로부터 유도된 원종 세포를 사용하여 이 GM-CSF 특이적 활성을 중화하는 그들의 능력에 대해 콜로니 형성 분석에서 평가하였다. 도 7에 나타낸 데이터는 친화도 성숙한 대표적인 mAb 둘 다가 인간 GM-CSF에 의해 조정된 시험관 내 조혈 콜로니 형성의 강력한 저해제임을 논증한다.

대략적인 IC₅₀ 값은 친화도 성숙한 mAb에 대해 0.08 ㎍/ml(항체 6) 및 0.25 ㎍/ml(항체 1)이었다. 흥미롭게도 알려진 쥣과동물 항체 2B7은 이 분석에서 임의의 저해 활성이 최대 66 nM 농도인 경우 거의 가지지 않는 것으로 보였다.

대조군 실험에서 친화도 성숙한 mAb는 SCF + IL-3 + G-CSF의 조합물에 의해 조정된 콜로니 형성에 예상처럼 영향을 미치지는 않았고, 사이토카인의 부재 시, 콜로니 형성은 무시할 정도였다(<4 콜로니/배양).

huGM-CSFRα 특이적 mAb 길항제 활성의 생체 내 분석에 있어서, 인간 GM-CSFR의 α 및 β 사슬 둘 다를 발현하는 유전자 도입(Tg) 마우스로부터 얻은 골수를 야생형 마우스로 이식하는 것은, 유전자 도입 huGM-CSFR 발현을 골수 유래된 조혈 세포에 국한하고 따라서 내인성 수용체의 발현 프로파일을 더 근접하게 닮도록 하는 키메라 동물을 산출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 Tg 키메라 마우스의 경우에, huGM-CSF의 투여는 비장 중량 증가 및 순환 혈액 단핵구의 주변화를 초래한다. 친화도 성숙한 항체 6 및 음성 대조군 mAb, CAT001은 이러한 GM-CSF 조정된 생체 내 반응들을 중화하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 용량 의존적 분석을 위해, 6개 그룹의 5마리 Tg 키메라 마우스를 4일(1∼4일)간 매일 2회 huGM-CSF 500 ng씩 s.c 처리하고, 7번째 대조군의 5마리 동물에는 PBS만을 넣었다. huGM-CSF 처리한 동물의 6개 그룹 중 4개 그룹에는 테스트 mAb(항체 6)를 16 mg/kg, 5.3 mg/kg, 1.78 mg/kg 또는 0.59 mg/kg씩 D.0로 넣고, 한편 huGM-CSF 처리한 동물의 5번째 그룹에는 대조군 CAT001을 16 mg/kg D.0로 넣었다. 도 8에 나타낸 결과들은, 대조군 PBS에 비해 huGM-CSF를 사용한 처리가 비장 중량의 유의적 증가 및 순환 혈액 단핵구의 감소를 유도한다는 것을 논증한다. 예상한 바와 같이, 16 mg/kg의 대조군 CAT001을 사용한 처리는 비장 중량의 증가 또는 혈액 단핵구의 감소에 아무런 효과도 가지지 않았다. 테스트 mAb 항체 6을 사용한 처리에 따른 명확한 용량 의존적 효과가 있었던 것과 달리, 16 mg/kg에서 이 항체가 비장 중량의 증가를 폐지한 것과 같이, 여전히 명백하지만 그 효과는 0.59 mg/kg의 mAb에서 크게 감소하였다. IC₅₀은 대략 0.59 mg/kg∼1.78 mg/kg로 보일 것이다. GM-CSF 유도된 순환 단핵구의 감소에 대해 유사한 결과가 관찰되었다 ― 테스트 mAb 항체 6을 사용한 처리는 16 mg/kg에서 감소를 폐지하였지만, 0.59 mg/kg에서 mAb는 이 반응에 단지 미미한 영향을 미쳤다. 이들 데이터는 항GM-CSFRα 항체가 생체 내에서 인간 GM-CSFRα의 길항제임을 보여준다.

이들 항GM-CSFRα 항체의 항염증성 특성을 추가 조사하기 위해, 항체 6을 말초 혈액 단핵구 사이토카인 방출 분석에서 평가하였다. 이 분석에 있어서, TNFα 및 IL-6은 제공자에 따라 내생적으로 방출될 수 있다. 이 분석에 있어서, GM-CSF는 또한 외인적으로 첨가되기 보다는 내생적으로 생성되고, 그러므로 이 분석에서 관찰된 결과들은 그 수용체에 대한 고유의 내인성 GM-CSF 결합의 생물학적 효과의 저해를 나타낸다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 항체 6의 투여에 따라, 둘 다의 이러한 사이토카인은 용량 의존적으로 저해되었다. 이러한 데이터는 이들 항체가 고유의 GM-CSF의 활성을 저해하고 GM-CSF 신호화를 저해함으로써 그것이 IL-6 및 TNFα와 같은 주요 전염증성 사이토카인을 저해할 수 있으며, 그 둘 다는 류마티스 관절염과 같은 다수의 염증성 징후와 연루되는 것을 가리킨다.

게다가, 항체 6을 사용한 이 결과를 기초로, 항체 1∼20 각각이 또한 이 분석에서 저해를 논증할 것인가 예상할 수 있는데, 이는 항체 1∼20 모두는 GM-CSFRα의 동일한 영역에 결합하는 것으로 여겨지기 때문이다.

항원 인지에 중요한 잔기의 지도 제작 및 서열 분석

리간드 결합에 대해 정상적으로 보존되는 위치 및 여전히 리간드 결합 활성을 보유하는 항체가 가변하는 위치를 확인하기 위해서, 생식세포 항체 6 scFv 서열 중 위치에서 잔기의 변이성을 측정하였다.

항원 결합에 기여하는 위치는 VL 도메인 중 카밧 잔기 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 및 96 및 VH 도메인 중 카밧 잔기 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 및 100B로 보인다.

항원 결합에 중요한 것으로 보이는 7개 위치: H95, H97, H99, H100B, L90, L92 및 L96을 확인하였다. 그 다음, 28G5 항체 최적화 과정 동안 분리된 160개 변이체의 서열 중 이들 위치에 있는 잔기들을 분석하였고, 이들 모두는 TF-1 증식 분석에서 최소 5배의 효능 향상을 나타내었다.

하기 표 5의 데이터는 이들 위치 각각 및 L95A에서 관찰된 상이한 아미노산(가능한 20개 중에서)을 요약한다. 위치가 28G5 및/또는 항체 6에 존재하는 아미노산에 강하게 보존되는 경우, 이는 그러한 아미노산이 항원에 결합하는 데 중요하다는 좋은 증거이다. 예를 들어, 다음의 위치들에서 잔기는 강하게 보존된다: H97, H100B, L90, L92.

방법

친화도 성숙된 생식세포 항체 6 scFv를 코딩하는 DNA 서열을 반드시 ref. [101]에 기재된 바와 같이 리보솜 디스플레이 판에 보존하였다. 무작위 점 돌연변이를 함유하는 변이체 574D04 서열의 라이브러리를 생성하기 위해, 제조자의 프로토콜(BD Bioscience) 중 높은 돌연변이 조건(1,000 bp당 7.2 돌연변이)을 사용하여 에러나기 쉬운 PCR을 항체 6 서열에 대해 수행하였다. 이 라이브러리를 리보솜 상에서 발현하고 정제 태그된 GM-CSFRα로 배양하여 결합이 일어나도록 했다. 태그된 GM-CSFRα에 결합할 수 있는 변이체를 단백질 G(Dynal)로 코팅된 상자성 비드를 이용하여 획득하고 제거하였다. 개체군에 남아있는 미결합된 변이체를 ref. [102]에 기재되고 항체 6 scFv에 결합하는 것으로 알려진 거대한 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 이미 유도된 4개의 비오틴화 항유전자형 항체의 풀에 첨가하였다. 비오틴화 항유전자형 항체에 의해 결합된 변이체를 스트렙타비딘 비드를 사용하여 획득하는 한편 미결합된 변이체를 세척해버렸다. 이 과정을 리보솜 디스플레이 선택의 2개의 추가 라운드에 대해 반복하였고, ref. [101]의 일반적인 방법론을 따랐다.

선택 산출물로부터 얻은 대표적인 부분의 변이체를 파지미드 벡터로 클론하고, ELISA에 의한 테스트를 위해 문헌[Edwards BM 외 (2003) Journal of Molecular Biology Vol 334:103]에 기재된 동일한 방법을 이용하여 상기 scFv 변이체를 파지에서 발현하였다. 정제 태그된 GM-CSFRα에 대한 결합을 나타내지 않았던 이러한 변이체를 선택에서 사용했던 4개의 항유전자형 항체로 된 풀에 대한 결합을 테스트하였다. 항유전자형 결합 분석에 있어서, 상기 항체 6 scFv와 동등하거나 또는 더 큰 결합을 논증하는 변이체를 서열화하고, 이 서열을 분석하여 돌연변이의 빈도가 높은 위치를 찾았다.

변이체의 개체군의 평균 돌연변이 비율은 V_H 사슬의 경우 486 서열 및 V_L 사슬의 경우 451 서열을 사용하여 V_H 또는 V_L 사슬당 3.05 아미노산임을 알아냈다. 그것들을 돌연변이 온점에 대해 분석하고, scFv를 따라 그들의 위치에 관한 돌연변이의 빈도를 도표로 작성하였다. 상기 분석은 V_H 및 V_L 당 1 이상의 CDR 돌연변이 및 V_H 및 V_L 당 4 미만의 돌연변이를 가진 그런 클론에 중점을 두었다. 123 V_H 및 148 V_L 서열의 이 패널로부터, 돌연변이성 빈도가 5% 이상인 것으로서 온점을 정의하였다.

항체 6의 V_HCDR3 및 V_LCDR3 내 7개 위치를 리보솜 디스플레이 음성적 선택 방법을 이용하여 항원 결합에 중요한 추정 위치로서 밝게 표시하였다. 그 다음 28G5 항체 최적화 과정 동안 분리된 160개의 서열 변이체에서 분석을 수행하였고, 전체 V_HCDR3 및 V_LCDR3 서열을 무작위화하고 더 높은 친화도에 대해 선택하였다. 모든 서열(항체 6을 포함)은 TF-1 증식 분석에서 효능이 최소 5배의 효능 향상을 나타내었던 28G5의 변이체이다.

선형 에피토프의 결정

PEPSCAN 방법을 이용하여 항체 6 및 알려진 항체 2B7을 2442 펩티드에 대하여 스크린하였고, 각각은 GM-CSFR-α의 세포외 부분으로부터 짧은 영역의 아미노산 서열을 나타내었다. 모든 펩티드에 대항하는 각각의 항체에 대한 결합 신호는 평균의 배경 신호를 산출하기 위해 평균화하고, 각각의 펩티드에 대하여 신호/배경 비를 계산하였다. 항체 6 및 2B7 둘 다에 있어서, 4 이상의 신호/배경 비를 특이적인 양성 신호로서 계수하였다. 특이적인, 양성 신호를 주는 펩티드의 서열을 보존된 결합 모티프에 대해 분석하여, 항체 6은 성숙 인간 GM-CSFRα의 잔기 226∼230에 해당하는 YLDFQ 모티프에 우선적으로 결합하고, 2B7 항체는 성숙 인간 GM-CSFRα의 잔기 278∼281에 해당하는 DVRI 모티프에 우선적으로 결합하는 것을 알았다. 성숙 수용체에 대한 아미노산 서열 수는 서열 번호 206에 제시된다.

PEPSCAN 방법 (펩티드-결합 스캔)

GMCSF로부터 유도된 서열을 가지는, 겹치는 대부분 15량체 합성 펩티드를 합성하고, 전술한 바와 같이 신용카드 크기의 판형 미니-PEPSCAN 카드(3 ㎕ 웰을 가진 455웰 플레이트)를 사용하여 스크린하였다[103]. 각각의 펩티드에 대한 항체의 결합을 PEPSCAN계 효소 결합 면역 측정법(ELISA)에서 시험하였다. 공유적으로 결합한 펩티드를 함유하는 455웰 신용카드 크기의 판형 폴리프로필렌 카드는 시료(예를 들어 5% 말 혈청(v/v) 및 5% 난백 알부민(w/v))를 함유하는 PBS 용액 중 1/1000 희석된 항체 또는 혈청 10 ㎍/ml) 및 1% Tween80을 사용하여 배양하거나, 또는 PBS 용액 중 온화한 블로킹의 경우 4% 말 혈청(v/v) 및 1% Tween80을 사용하여 배양하였다(4℃, 밤새). 세척 후, 상기 펩티드는 항-항체 퍼옥시다제(희석 1/1000, 예를 들어 래빗-항-마우스 퍼옥시다제, Dako)를 사용하여 배양하였고(1시간, 25℃), 이어서 세척 후 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 2 ㎕/ml 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 색깔 현상을 측정하였다. CCD-카메라 및 화상 형성 시스템을 사용하여 ELISA의 색깔 현상을 정량화하였다. 상기 장치는 CCD-카메라 및 55 mm 렌즈(Sony CCD Video Camara XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8 lens), 카메라 어댑터(Sony Camara adaptor DC-77RR) 및 화상 형성 소프트웨어 패키지 옵티마, 버전 6.5(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.)로 구성된다. 옵티마는 펜티엄 컴퓨터 시스템으로 구동된다.

분석 재료 및 방법

생화학적 리간드 결합 분석

정제된 scFv 조제물을 W001/66754[104]의 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 정제된 scFv 조제물의 단백질 농도는 BCA 방법[105]을 이용하여 측정하였다. Fluoronunc^TM 96 웰 마이크로적정 플레이트를 PBS 중 2.5 ㎍/ml로 희석한 50 ㎕/웰의 항인간 IgG4로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 300 ㎕/웰의 PBS 중 3% BSA를 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹 전에 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20의 300 ㎕/웰을 사용하여 3회 세척하였다. 플레이트는 300 ㎕/웰의 PBS/0.1% Tween-20을 사용하여 다시 3회 세척하고, 그 다음 1% BSA/PBS 중 62.5 ng/ml로 희석한 인간 GM-CSFRα 50 ㎕를 각각의 웰에 넣고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 전술한 바와 같이 3회 세척 후, 25 ㎕의 시료 물질을 각각의 웰에 넣고, 1% BSA/PBS 중 2 nM로 희석한 비오틴화 GM-CSF 25 ㎕를 넣었다. 전체 결합을 정의하기 위해, 완충제는 단지 시료 물질로서 사용하였다. 비특이적 결합을 정의하기 위해, 1% BSA 중 100 nM로 희석한 표지안한 GM-CSF를 시료 물질로서 사용하였다. 전술한 바와 같이 3회 세척하기 전에 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. DELFIA^TM 분석 완충액 중 100 ng/ml로 희석한 유로퓸 표지된 스트렙타비딘(퍼킨엘머) 50 ㎕를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣고, DELFIA^TM 세척 완충액을 사용하여 7회 세척하기 전에 실온에서 30∼60분간 배양하였다. 50 ㎕/웰의 DELFIA^TM 강화 용액을 플레이트에 넣고, 상기 시료를 플레이트 판독기 상에서 615 nm에서 읽었다.

TF-1 증식 분석

R&D 시스템에서 얻어 일상적으로 RPMI 1640, 10% FBS, 1 mM 나트륨 피루베이트 및 4 ng/ml GM-CSF에서 유지한 TF-1 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 5% FBS, 1 mM 나트륨 피루베이트)에서 3회 세척하고, 분석 배지를 재현탁시키고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 7∼24시간 동안 배양하여 굶겼다. 그 다음 세포를 분석 배지에서 1x10⁵/ml로 재현탁시키고, 100 ㎕를 96 웰 평평한 바닥의 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 넣었다. 분석 배지에서 희석하기 전에 저장 시료를 멸균 여과하여 테스트 시료를 제조하였다. 그 다음, 50 ㎕의 테스트 물질을 세포의 각각의 웰에 넣고, 이것들을 5% CO₂ 하에 37℃에서 45∼60분간 배양하였다. 그 다음 분석 배지(또는 몇몇 배치의 GM-CSF에 대해서는 0.4 ng/ml)에서 EC₈₀ 값으로 희석한 GM-CSF 50 ㎕를 각각의 웰에 넣고, 상기 플레이트를 축축한 챔버에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이는 7 pM GM-CSF의 최종 농도를 나타낸다. 세포의 증식을 측정하기 위해, 분석 배지에서 5.0 μCi/ml로 희석한 ³H-티미딘 20 ㎕를 플레이트의 각각의 웰에 넣고, 상기 플레이트를 5% CO₂ 하에 4시간±30분 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 플레이트 채취기를 사용하여 96 웰 GF/C Unifilter^TM 플레이트 상에 채취하고 세척하였다. 여과 플레이트의 각각의 웰에 50 ㎕ MicroScint 20^TM을 넣은 후, 상기 플레이트를 밀봉하고 TopCount 플레이트 판독기로 계수하였다.

인간 과립구 형상 변화 분석

인간 연막(수혈 서비스에서 얻은 인간 혈액 팩)을 동일한 부피의 0.9% NaCl 중 3% 덱스트란 T-500을 혼합하였다. 그 다음 상기 혼합물을 경계면이 형성될 때까지 수직 위치로 배양하였다. 상위 층을 채취하고, histopaque 1.077 밀도 구배의 꼭대기에 층상화하고, 그 다음 400 g로 40분 동안 원심분리하고 깨어짐없이 멈추게 하였다. 이 구배의 상위 층들은 과립구 펠릿을 남기고 제거하였다. 펠릿에 임의로 남아있는 적혈 세포를 20 ml의 얼음 냉수에 30초 동안 세포를 재현탁시켜 용해하고, 얼음 냉수 1.8% 염화나트륨을 즉시 첨가하였다. 그 다음 세포를 1200 rpm으로 재팰릿화하고, 분석 배지(RPMI1640, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 25 mM HEPES)에서 1x10⁶/ml로 재현탁시켰다. 그 다음 세포 100 ㎕를 96 웰 평평한 바닥의 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 넣었다. 저장 시료를 멸균 여과하고 분석 배지에서 적당히 희석하여 테스트 시료를 제조하였다.

리드 분리를 위해, 그 다음 50 ㎕ 테스트 시료를 세포에 넣고, 상기 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 45∼60분 동안 배양하였다. 이는 7 pM GM-CSF의 최종 농도를 나타낸다. 이에 이어, 분석 배지에서 0.4 ng/ml로 희석한 GM-CSF 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 축축한 챔버에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 4시간 배양하였다.

리드 최적화를 위해, 분석 배지에서 희석한 여과된 IgG4를 분석 배지 중 0.4 ng/ml에서 동일한 부피의 GM-CSF와 혼합하였다. 이는 7 pM GM-CSF의 최종 농도를 나타낸다. 그 다음 항체/GM-CSF 혼합물 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이에 이어, 축축한 챔버에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 3시간 배양하였다.

차가운 포름알데히드를 넣어 최종 농도를 1.25%로 하고, 세포를 4℃에서 밤새 고정하였다. 웰당 2000∼5000건을 유세포 분류기에 의해 분석하였다. 그 다음, 각각의 시료에 대한 전방 산란(FSC)의 기하 평균을 CellQuest를 이용하여 유도하였다. 기하 평균을 계산할 때, 불규칙적인 개체수(예컨대, 죽은 세포/잔해)를 배제하기 위해 세포를 제어하였다.

사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석

GM-CSF를 사용한 자극에 따른 사이노몰거스 과립구의 형상 변화를 측정하는 분석에서 항체를 평가하였다. 사이노몰거스 전혈로부터 과립구를 정제하고, 인간 과립구 형상 변화 분석에 대해 기술한 바와 같이 반드시 분석을 수행하였다.

바이오센서 분석을 이용한 결합 친화도 데이터

BIAcore 2000 시스템(Pharmacia 바이오센서)은 재조합 수용체를 가지고 scFvs 및 IgG4 사이의 상호작용의 역학적 변수들을 평가하는 데 사용하였다. 상기 바이오센서는 덱스트란 메트릭스에 공유적으로 부착된 리간드 분자와 분석용 분자의 상호작용으로부터 기인한 표면 농도의 변화를 연구하는 데 표면 플라즈몬 공명의 광학 효과를 이용한다. 전형적으로 유리 용액 중 분석 종들은 짝지은 리간드를 통과시키고, 임의의 결합은 로컬 SPR 신호의 증가로서 검출한다. 이에 이어, 분석 종들의 해리가 SPR 신호의 감소로 보이는 동안 세척 기간으로 하고, 그 후에 임의의 남아있는 분석물질을 리간드로부터 벗기고, 그 과정을 몇가지 상이한 분석물 농도로 반복하였다. 일련의 대조구는 대개 결합된 리간드의 역학적 프로파일 또는 절대적인 결합 용적 둘 다가 유의적으로 변화하지 않음을 보장하기 위한 실험 동안 사용한다. 전형적으로, 독점적인 생리식염수(hepes buffer saline)(HBS-EP)를 분석용 시료 및 해리 상 용매의 주요 희석제로서 사용한다. 실험 데이터는 시간에 따른 공명 단위(SPR 신호에 직접적으로 상응하는)로 기록한다. 상기 공명 단위는 결합한 분석물질의 크기 및 양에 직접 비례한다. 그 다음, 해리 상(해리 속도 단위 s^-1) 및 결합 상(결합 속도 단위 M^-1 s^-1)에 일정한 속도를 부여하는 데 BIAevaluation 소프트웨어 패키지를 이용할 수 있다. 그 다음 이들 수치들로 하여금 결합 및 해리 친화도 상수를 계산한다.

IgG4의 친화도를 IgG4가 아민 단백질 A 표면에 비공유적으로 포획된 단일 분석을 이용해 평가하였다. 그 다음, 100∼6.25 nM의 재조합 정제 태그된 GM-CSF 수용체 세포외 도메인의 일련의 희석물을 연속적으로 IgG4를 통과시켰다. 상기 수용체의 몰 농도는 상기 농도(Bradford)를 사용하여 계산하고, 비 후기 생성변화 변형된 성숙 폴리펩티드 질량(39.7 kDa)을 예측하였다. 2개의 구별된 세트의 데이터 중 각각을 동일한 판형에서 분석하였다. 참고 세포 수집된 데이터는 동시의 전체적인 결합 및 해리 속도에 대한 1:1 랭뮤어 모델 세트를 이용하여 전체적으로 세팅된 Rmax 값으로 조정하였다. 포획된 양이 전체 실험 동안 안정하게 유지되는 것을 보장하기 위해 각각의 주기 동안 포획된 IgG4의 농도를 평가하였다. 또한, 기준선 이동에 대한 보정이 요구되는 지를 결정하기 위해 IgG4의 해리 속도를 평가하였다. 하지만, 두 가지 단백질 A 상호작용이 충분히 재생산가능하고 안정함을 증명하였다. 상기 데이터의 타당성은 각각 <2 및 >100이어야 하는 계산된 chi2 및 T 값(변수 값/오프셋)에 의해 억제되었다.

정제 태그된 GM-CSFRα 세포외 도메인의 생성:

인간 GM-CSF 수용체 α 세포외 도메인(서열 번호 205, 성숙 GM-CSF R의 아미노산 1∼298을 나타냄)을 코딩하는 서열을 쥣과동물 IL-3 신호 서열과 혼합하고 N-말단 정제 태그를 혼합한 pEFBOS 발현 벡터[106]를 재조합 N-말단 태그된 GM-CSF 수용체의 세포외 도메인(ECD) 폴리펩티드를 제조하는 데 사용하였다. 상기 태그된 ECD 폴리펩티드를 표준 절차를 이용하여 pEFBOS 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다. 또한, 이 폴리펩티드를 정제한 GM-CSFRα 세포외 도메인으로서, 또는 GM-CSFRα 가용성 세포외 도메인으로서 언급할 수 있다.

임의의 적절한 정제 태그, 예컨대 Flag 펩티드(DYKDDDE - 서열 번호 204), Fc, 비오틴 또는 his 태그를 사용할 수 있다. 임의의 적당한 기법을 이용하여 정제를 수행할 수 있는데, 예를 들어 Flag 태그된 ECD 폴리펩티드(서열 번호 203)를 M2 친화도 크로마토그래피 칼럼 상에서 정제하고 FLAG 펩티드를 사용하여 용리시킬 수 있다.

단핵구 TNFα 방출 분석

단핵구(단핵구 분리 키트 - Miltenyi Biotec - 130-053-301)의 정제:

인간 연막(수혈 서비스에서 얻은 인간 혈액 팩)을 histopaque 1.077 밀도 구배(Sigma, Cat No. 1077-1)의 꼭대기에 층상화하고, 세포를 400xg에서 40분간 원심분리하였다. 원심분리를 멈췄을 때 깨짐이 없었다. 그 다음 PBMC 세포를 경계면으로부터 채취하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 남아있는 적혈 세포를 20 ml의 얼음 냉수에 15초 동안 재현탁시키고 즉시 얼음 냉수 1.8% NaCl을 첨가하여 용해시키기 전에 10분간 300xg에서 펠릿화하였다. 그 다음 세포를 5분간 1200 rpm에서 펠릿화하고, 600 ㎕의 MACS 완충액(PBS, 2 mM EDTA)에서 재현탁시켰다. 키트를 사용하여 제공된 200 ㎕의 Fc 블로킹 시약을 세포에 첨가하고, 200 ml의 합텐-항체 혼합물(또한 키트를 사용하여 제공)을 넣고 혼합하기 전에 혼합하였다. 그 다음 세포를 4℃에서 15분간 배양한 후, 50 ml의 MACS 완충액으로 2회 세척하였다. 상기 세포 펠릿을 600 ㎕의 MACS 완충액에 재현탁시킨 후, 200 ㎕의 Fc 블로킹 시약을 첨가 및 혼합하고 200 ㎕의 MACS 항합텐 미세비드를 첨가 및 혼합하였다. 상기 세포를 4℃에서 45분간 배양하고 50 ml의 MACS 완충액으로 세척하고 500 ㎕의 MACS 완충액에 재현탁시켰다. 단일 칼럼(Miltenyi Biotec 130-042-401)을 3 ml의 MACS 완충액을 통해 세척함으로써 제조하고, 세포 현탁액을 상기 칼럼에 적용하였다. 유출물을 단핵구가 풍부한 분획으로서 수집하였다. 상기 칼럼을 2x3 ml MACS 완충액으로 세척하고, 그 유출물을 수집하였다. 표준 유세포 분류기 방법을 이용하여 항CD14-PE로 염색함으로써 단핵구 순도를 체크하였다. 최종적으로 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 10% FCS, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신)에서 4 x 10⁶/ml로 재현탁시켰다.

단핵구의 자극:

Costar 96 웰 평평한 바닥의 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 50 ㎕의 세포를 첨가하였다. 25 ㎕의 150 ㎍/ml rhIFNg(R&D systyems)를 모든 웰에 넣었다. 분석 배지에서 희석한 여과된 IgG4를 분석 배지에서 56 ng/ml(4 nM)로 동일한 부피의 GM-CSF와 혼합하였다. 이는 1 nM GM-CSF의 최종 농도를 나타낸다. 그 다음 75 ㎕의 항체/GM-CSF 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 대조군은 단지 GM-CSF를 가지거나 또는 GM-CSF가 없고 항체가 없는 웰이었다. 플레이트를 축축한 챔버에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 그 다음 상청액을 채집하여 ELISA에 의해 TNF-α 농도를 테스트 하였다.

TNFα ELISA(R&D Systems ELISA Development System DY210):

Fluoronunc 면역흡착 ELISA 플레이트를 실온에서 PBS 중 4 ㎍/ml에서 100 ml의 포획 항체로 코팅하였다. 그 다음 플레이트를 PBS/0.1% Tween으로 3회 세척하고, PBS 중 3% Marvel 300 ㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 상기 플레이트를 PBS/0.1% Tween으로 3회 세척하였다. 상기 분석 플레이트로부터 얻은 100 ㎕의 상청액을 ELISA 플레이트로 옮기고, 분석 배지에서 희석한 TNF-α의 적정을 대조구 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한 후, PBS/0.1% Tween으로 4∼5회 세척하였다. 1% Marvel/PBS 중 300 ng/ml로 희석한 100 ㎕의 검출 항체를 플레이트의 각각의 웰에 넣고, 상기 플레이트를 실온에서 추가 2시간 동안 배양한 후, PBS/0.1% Tween으로 4∼5회 세척하였다. 스트렙타비딘-유로퓸(PerkinElmer 1244-360)을 DELFIA 분석 완충액(PerkinElmer 4002-0010)에서 1:1000으로 희석하고, 100 ㎕/웰을 첨가한 후 실온에서 45분간 배양하였다. 그 다음 플레이트를 DELFIA 세척 완충액에서 7회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 강화 용액(PerkinElmer 4001-0010)을 첨가하고 플레이트 판독기 상의 615 nm에서 판독하였다.

과립구 생존 분석

호중구 활성화 분석(형상 변화 분석)에 대해 기술한 바와 같이 인간 연막으로부터 얻은 세포를 분석 배지(RPMI-1640 Glutamax, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)에서 세척하고 분석 배지에서 1x10⁶/ml로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포를 Costar 96 웰 평평한 바닥의 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 항체의 여과된 저장물을 분석 배지에서 희석하고, 0.4 ng/ml로 동일한 부피의 GM-CSF와 혼합하였다. 이는 7 pM GM-CSF의 최종 농도를 나타낸다. 대조구 웰은 배지만 함유하거나 또는 GM-CSF만 함유하였다. 그 다음 100 ㎕의 테스트 시료/GM-CSF 혼합물을 플레이트 상의 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 축축한 챔버에서 37℃/5% CO₂에서 68시간 동안 배양하였다. 20 ㎕의 AlamarBlue를 각각의 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 축축한 챔버에서 37℃/5% CO₂에서 추가 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 플레이트 판독기 상의 560 nm 및 590 nm에서 판독하였다.

TF-1 증식 분석 및 인간과 사이노몰거스 과립구 형상 변화 분석에서 항GM-CSFRα 항체의 pA ₂ 분석

경쟁적인 길항제의 친화도를 정량화하기 위한 주된 약물학적 도구는 쉴드 분석이다. 이 접근법을 이용하여, 기능적 분석에서 상기 길항제 친화도를 평가하는 시스템 의존적 수단이 결정될 수 있다. 상기 방법은 상기 길항제 농도 및 그 친화도가 효현제 반응의 길항 작용을 결정한다는 개념을 기초로 한다. 상기 길항 작용은 정량화될 수 있고 상기 길항제의 농도는 공지되어 있기 때문에, 상기 길항제의 친화도를 결정할 수 있다. 이 길항 작용은 길항제의 존재 또는 부재 시에 측정된 동등활성의 효현제의 농도의 비(용량 비(DR)라고 함)를 측정함으로써 정량화된다.

용량 비는 결합 성분의 부재 시 효현제(전형적으로 GM-CSF)의 EC50 대 단일 농도의 결합 성분의 존재 시 상기 효현제의 EC50의 비를 구함으로써 계산할 수 있다. 그 다음, log[결합 성분]에 대한 직선 회귀에서 log(DR-1)로서 표현한 용량 비를 사용하여 쉴드 회귀를 산출할 수 있다. 따라서, 모든 농도의 결합 성분에 대해 상응하는 DR 값이 존재할 것이고; 이것들은 log[결합 성분]에 대한 log(DR-1)의 회귀로서 도표화하였다. 상기 길항 작용이 경쟁적인 경우, 평형식이 하기와 같은 쉴드 평형식에 따라 log(DR-1)과 log[결합 성분] 사이의 직선 상관관계가 존재할 것이다.

Log(DR-1) = log [A] - log K_A

이러한 환경하에서, 세로 좌표에 대한 0의 값은 log[a] = log K_A인 x축의 절편을 줄 것이다. 그러므로 log(DR-1) = 0을 산출하는 결합 성분의 농도는 결합 성분-수용체 착물의 평형 해리 상수인 log K_A와 같을 것이다. 이는 수용체를 함유하는 모든 세포 세스템에 대해 정확해야하는 결합 성분 친화도의 시스템 독립적인 정량화이다.

상기 K_A 값은 대수 그래프로부터 얻어지기 때문에, 그것들은 정상적으로 분포된 로그이다. 이 특정 농도의 음성 대수는 경험적으로 pA2, 효현제 용량 반응 곡선의 2배 이동을 산출하는 길항제의 농도로서 언급된다. 상기 길항제 효능은 하기 평형식으로부터 용량 비에 대한 단일 값을 산출하는 단일 농도의 길항제로부터 pA2를 계산함으로써 정량화될 수 있다.

pA₂ = log (DR-1)-log[a]

[a] = 최초의 최대하 반응을 도출하기 위해 효현제의 농도를 두 배로 하는 것이 필요한 길항제의 몰 농도.

DR = 상기 용량 비는 상기 길항제의 존재 및 부재 시에 측정한 효현제의 동등활성 농도의 비를 측정함으로써 정량화된다.

pA₂는 용량 의존적 분석 데이터로부터 계산될 수 있다.

콜로니 형성 분석에서 혈액 세포 원종의 시험관 내 GM-CSF 조정된 분화를 저해

조혈 원종 세포가 풍부한 말초 혈액 단핵구를 그들의 표준 임상 처리의 부분으로서 원종 세포 동원 및 성분 채집술을 겪은 기증자로부터 얻었다. 사용 전에, 시료를 비동일시하고 세포를 저온 보존하였다. 5x10⁴ 단핵구를 10 ng/ml의 최종 농도에서 인간 GM-CSF의 존재하에 반고체 한천 배지[107]에서 배양하였다. 테스트 친화도 성숙한 인간 mAbs 및 알려진 쥣과동물 항체 2B7을 10, 5, 1, 0.5, 0.1 또는 0.05 ㎍/ml의 최종 농도로 한천 배지 배양에 첨가하였다. 어버이 인간 mAb 28G5 및 동형 조화된 음성 대조군 인간 mAb, CAT001을 10 ㎍/ml의 단일 농도에서 평가하였다. 조절 목적으로, mAb는 또한 SCF, IL-3 및 G-CSF의 조합물로 자극된 블럭 콜로니 형성에 대한 그들의 능력(Croker 외, 2004) 및 사이토카인의 부재 시 콜로니 형성에 대한 그들의 영향을 평가하였다. 콜로니 형성(>40 세포의 응집체)은 공기중에 10% C0₂로 37℃에서 14일간 항온처리한 후 평가하였다. 콜로니를 글루타르알데히드로 고정하고, 35X 확대로 해부 현미경을 이용하여 계수하였다.

인간 GM-CSFRαβ 유전자 도입 마우스 중 생체 내 GM-CSF 생물학적 활성의 저해

I형 MHC 프로모터의 조절 하에 인간 GM-CSFR의 α 및 β 사슬 둘 다를 발현하는 유전자 도입(Tg) 마우스를 발생시키고, huGM-CSF의 투여에 대한 생체 내 비장 및 혈액 세포 반응을 기재하고 있다[108]. huGM-CSFRα 특이적 mAb 길항제 활성의 생체 내 분석에 있어서, Tg 마우스로부터 야생형 마우스로의 골수 이식은, 유전자 도입 huGM-CSFRαβ 발현이 골수 유래된 조혈 세포에 국한되어 내인성 수용체의 발현 프로파일과 더욱 밀접하게 닮도록 하는 키메라 동물을 발생시키는 데 이용될 수 있다. 이들 huGM-CSFRαβ Tg 키메라 마우스에 있어서, huGM-CSF의 투여는 비장 중량 증가 및 순환 혈액 단핵구의 주변화를 일으킨다.

Tg 키메라 마우스의 발생:

기증자 Tg 마우스로부터 대퇴골 및 경골을 제거하고, 골수를 멸균 PBS + 3% 우태아 혈청(FCS)을 사용하여 흘려보냈다. 그 다음, 상기 골수 플러그를 23G 니들을 통해 빼내어 단일 세포 현탁액을 얻고, 그 후 세포를 차가운 PBS + 3% FCS를 사용하여 한번 세척하고, 스테인레스 강철 메쉬를 통해 통과시켰다. 그 다음 적색 세포를 0.168 M 염화암모늄 완충액 중에 용해에 의해 제거하고, 그 후에 세포를 인산염 완충 염수(PBS) + 3% FCS를 사용하여 2회 더 세척한 후 다시 스테인레스 강철 메쉬를 통과시켰다. 죽은 세포 및 세포 잔해물을 추가 제거하기 위해, 상기 현탁액을 FCS 완충물을 통해 원심분리하였다. 생존 가능한 세포를 펠릿에서 회수하고, PBS를 사용하여 한번 세척하고, 2.5 x 10⁷/ml에서 PBS 중에 현탁시켰다. 5∼8주령 수령자 C57/BL6 마우스를 각각 3시간 550 Rad를 2회 투여하여 치명적으로 방사선 조사하였다. 수령자 마우스에 0.2 ml의 세포 현탁액(즉, 5 x 10⁶ 세포/마우스)을 정맥주사(i.v) 하고, 이어서 그들의 식수에 0.02 M 네오마이신을 넣고 뚜껑있는 상자에서 3주 동안 지내게 하였다. huGMCSFRα 및 β 사슬에 특이적인 mAb를 사용한 말초 혈액의 FACS 분석에 의해 6주 후에 재구성을 평가하였다.

Tg 키메라 마우스의 GM-CSF 처리 및 후속 분석:

Tg 키메라 마우스를 피하(s.c) 경로를 통해 500 ng의 huGM-CSF로 매일 2회 4일 동안 처리하였다. 항체 길항제 활성의 분석을 위해, 5마리 마우스로 된 군에 GM-CSF 처리 개시 1일 전에 복강내(i.p) 경로를 통해 선택된 투여량의 mAb(하기 참조)를 투여하였다. 5일째에, ADVIA Hematology System(Bayer Diagnostics)을 이용하여 순환하는 백혈구 개체군, 특히 혈액 단핵구의 분석을 위해, 0.2 ml의 혈액을 샘플링하였다. 그 다음 동물을 희생시켜 중량 측정을 위해 비장을 제거하였다.

인간 말초 혈액 단핵구로부터 내인성 발현된 인간 TNFα 및 IL-6의 저해

인간 연막(수혈 서비스로부터 얻은 인간 혈액 팩)을 histopaque 1.077 밀도 구배(Sigma, Cat No. 1077-1)의 꼭대기에 층상화하고, 세포를 400xg로 40분간 원심분리하였다. 원심분리를 멈췄을 때 깨어짐이 없었다. 그 다음 PBMC 세포를 경계면으로부터 채집하였다. 세포를 PBS에서 세척하고, 10분간 300xg에서 펠릿화한 후, 남아있는 적색 혈액 세포를 20 ml의 얼음 냉수에서 15초 동안 재현탁시킴으로써 용해시킨 다음 바로 얼음 냉수 1.6% NaCl을 첨가하였다. 그 다음 세포를 1200 rpm에서 5분간 펠릿화하고, 10% FBS/RPMI 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 10 ml 중에 현탁시켰다. 그 다음 세포를 5 x 10⁶/ml로 희석하였다. 웰당 110 ㎕의 세포(5.5 x 10⁵/웰)를 분배하고, 세포를 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 정치시켰다. 다음의 시약들을 단일 최종 농도 조절제로서 첨가하였다; PHA (5 ㎍/ml), LPS (25 ㎍/ml), GM-CSF (10 ng/ml) 및 아이소타입 대조군(50 ㎍/ml). 50 ㎍/ml의 최종 출발 농도에 5배 희석 시리즈로 항체 6을 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 72시간 항온처리하였다. 72시간 후 상청액을 채집하고, 다음과 같은 R&D ELISA 키트(hTNF-α R&D Duoset ELISA development system DY210 and hIL-6 R&D Duoset ELISA development system DY206)를 사용하여 TNFα 및 IL-6의 농도를 계산하였다. 제조업자의 추천에 따라 ELISA를 수행하였다.

28G5의 최적화로부터 분리된 IgG4 비생식세포 항체에 의한 GM-CSF 유도된 TF-1 세포 증식의 저해. 증가하는 IgG4 항체의 농도 존재하에 단일 농도의 GM-CSF로 TF-1 세포의 증식을 유도하였다. 적정한 티미딘의 혼입을 측정하고, 상기 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다. 데이터는 n≥3임을 나타낸다. SEM(평균의 표준 오차)을 나타낸다.

IgG4	IC50±SEM (pM)
2B7	1575±490.5
항체 1	5.3±0.33
항체 2	15.0±4.71
항체 4	48.0±8.33
항체 5	9.3±5.39
항체 6	0.97±0.033
항체 7	93.8±24.6
항체 8	34.5±2.63
항체 9	40.8±7.15
항체 10	55.3±3.73
항체 11	9.0±1.0
항체 12	246.3±19.8
항체 13	1106.0±174.9
항체 14	16.3±4.9
항체 15	163.8±7.3
항체 16	12.8±3.3
항체 17	14.3±2.8
항체 18	13.3±3.4
항체 19	23.8±4.3
항체 20	9.8±2.8

28G5의 최적화 동안 분리된 항GM-CSFRα IgG4 비생식세포 항체의 역학적 분석. IgG4 항체를 단백질-A 코팅된 칩의 표면에 고정시키고, 정제 태그된 GM-CSF Rα ECD 희석물을 IgG4 상에 통과시켰다. 질량 수송을 고려한 랭뮤어 1:1 동시 k_a k_d를 이용하여 데이터를 끼워맞췄다.

IgG4	KD (nM)
항체 1	0.264
항체 2	0.376
항체 4	4.07
항체 5	0.847
항체 6	0.139
항체 7	3.93
항체 8	0.552
항체 10	1.50
항체 12	3.02
항체 14	0.502
항체 15	1.03
항체 16	1.14
항체 17	0.193
항체 19	0.388
항체 20	0.127

항체 9 및 11에 대한 데이터는 2상(biphasic)이었다.

28G5의 최적화 동안 분리된 IgG4 비생식세포 항체에 의한 GM-CSF 유도된 인간 과립구 형상 변화의 저해. 인간 과립구를 증가하는 농도의 IgG4 항체 존재하에 단일 농도의 GM-CSF로 처리하였다. 상기 과립구의 형상 변화를 유세포 분류기를 이용하여 측정하였고, 상기 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다.

IgG4	IC50±SD (pM)
2B7	477±491
항체 1	12.6±8.0
항체 2	20.7±11.0
항체 5	30.0
항체 6	13.3±11.8
항체 9	44.0
항체 10	62.0
항체 11	90.0
항체 16	16.0
항체 20	7.8

단핵구로부터 얻은 GM-CSF 유도된 TNFα 방출의 저해. 인간 단핵구를 증가하는 농도의 IgG4 비생식세포 항체 존재하에 단일 농도의 GM-CSF로 처리하였다. TNFα의 방출을 ELISA에 의해 측정하고, 상기 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다.

IgG4	IC50±SD (pM)
항체 1	78.8±54.6
항체 2	103.3±63.1
항체 5	67.0
항체 6	43.0±19.7
항체 9	74.0
항체 10	139.0

서열 목록에 대한 해석법

첨부된 서열 목록에 있어서는, 어버이 클론 및 최적화 패널로부터 얻은 19개 클론을 포함하는, 20개의 항체 클론에 대한 핵산 및 아미노산("PRT") 서열이 제시된다. 항체는 Ab1∼Ab20으로 번호를 매긴다. 상기 어버이 클론은 서열 번호 21∼30 및 서열 번호 211∼212로 표현된 항체 3이다.

하기의 목록은 제시된 분자의 서열을 보여주는 서열 번호로 확인된다:

(nt = 뉴클레오티드 서열; aa = 아미노산 서열

항체 1∼20의 VL 도메인 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186 및 196의 3' 말단에 나타낸 gcg 코돈을 포함하지 않는다. 이에 따라, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187 및 197 각각에서 C-말단 Ala 잔기(잔기 113)를 포함하지 않는다. 상기 Ala113 잔기 및 상응하는 gcg 코돈은 항체 1∼20에서 발현되지 않는다. 생식세포 유전자 분절, 특히 JL2와 기재된 서열의 비교는 Ala 잔기 및 상응하는 gcg 코돈이 VL 도메인의 일부를 형성하지 않음을 가리킨다.

112번 위치의 Gly 잔기는 발현된 scFv 및 IgG 서열에 존재하였다. 하지만, 이 잔기는 VL 도메인의 골격구조 4 영역, 예컨대 JL2를 형성하는 인간 생식세포 j 분절 서열에 존재하지 않는다. 상기 Gly 잔기는 상기 VL 도메인의 일부로 간주되지 않는다.

IgG의 경쇄를 발현시키기 위해, VL 도메인을 코딩하는 제1 엑손, CL 도메인을 코딩하는 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손을 구분하는 인트론을 포함하는, 상기 항체 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되었다. 정상적인 환경하에, 상기 인트론은 세포의 mRNA 과정 기기에 의해 절단되고, 제1 엑손의 3' 말단을 제2 엑손의 5' 말단에 결합시킨다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA가 RNA로서 발현될 때, 제1 및 제2 엑손은 함께 절단되었다. 절단된 RNA의 번역은 상기 VL 도메인 및 상기 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성한다. 절단 후, 112번 위치의 Gly은 상기 VL 도메인 골격구조 4 서열의 마지막 염기(g) 및 상기 CL 도메인의 처음 2개 염기(gt)에 의해 코딩된다.

항체 1∼20의 VL 도메인 서열은 전술한 서열 번호 186∼246이다. VL 도메인 뉴클레오티드 서열 말단은 최종 코돈으로서 cta를 가지며, Leu은 상응하는 VL 도메인 아미노산 서열에서 최종 아미노산 잔기이다.

항체 6의 비생식세포 VH 및 VL 도메인 서열은 서열 번호 51, 52, 56, 57, 216 및 217에 나타낸 생식세포 VH 및 VL 도메인 서열 외에도, 서열 번호 247∼250에서 나타낸다.

참고 문헌

본 명세서 어디에서든 언급된 모든 문헌들은 참고로서 본원에 포함된다.

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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Ile Ala Tyr Arg Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 3 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 4 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 5 Val Gly Ser Phe Ser Gly Ile Ala Tyr Arg Pro 5 10 <210> 6 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 6 cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg 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<220> <223> Ab1 <400> 8 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 9 His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab1 <400> 10 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Ile Ser Thr Ile 5 10 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 11 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gccccgccct gcgcccctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 13 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 14 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 15 Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro 5 10 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 16 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcc 339 <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 17 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 Ala <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 18 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 19 His Asn Asn Lys Arg Pro Ser 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <400> 20 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val 5 10 <210> 21 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 21 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 23 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 24 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 25 Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 26 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <400> 26 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc 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Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab4 <400> 33 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab4 <400> 34 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab4 <400> 35 Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr 5 10 <210> 36 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ab4 <400> 36 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg 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cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300 tctttcagtg gccccgtgta cggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab7 <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo 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caggccctgg ggcaaaggga caatggtcac catctcgagt 360 <210> 92 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab10 <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Ile Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab10 <400> 93 Glu Leu Ser Ile His 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab10 <400> 94 Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab10 <400> 95 Val 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cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagga caggatgacg 300 gagttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339 <210> 137 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab14 <400> 137 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Glu 85 90 95 Asp Arg Met Thr Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 Ala <210> 138 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab14 <400> 138 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser 5 10 <210> 139 <211> 7 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cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtt gattagcgcc 300 gccttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339 <210> 147 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab15 <400> 147 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Leu Ile Ser Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 Ala <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab15 <400> 148 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab15 <400> 149 His Asn 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Non Germlined <400> 247 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120 cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240 ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300 tctttcagtc cgctaacgtt gggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 248 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 Non Germlined <400> 248 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser 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5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 256 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <400> 256 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 5 10 15 <210> 257 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <400> 257 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 5 10 15 Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <400> 258 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 5 10

Claims (12)

1. 단리된 항체 분자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 흡연에 의해 유발된 기도 염증을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 항체 분자는 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하고, 상기 항체 VH 도메인은 중쇄 상보성 결정 영역(CDRs) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 VL 도메인은 경쇄 CDRs LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 CDRs의 아미노산 서열은
   HCDR1은 서열 번호 53;
   HCDR2는 서열 번호 54;
   HCDR3은 서열 번호 55;
   LCDR1은 서열 번호 58;
   LCDR2은 서열 번호 59; 및
   LCDR3은 서열 번호 60인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 분자는 인간 또는 인간화 항체 분자인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체 분자는 서열 번호 52의 항체 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체 분자는 서열 번호 218의 항체 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 항체 분자가 IgG4인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 52의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 218의 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG4 항체 분자인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 치료가 상기 조성물을 NSAIDs, 코르티코스테로이드 및 질병 조정 항류마티스약(DMARDs) 중 하나 이상과의 조합으로 또는 이에 부가하여 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 치료가 상기 조성물을 콕스(cox) 억제제, 프레드니손, 휴미라(Humira)(아달리무맙), 메토트렉세이트, 아라바(Arava), 엔브렐(Enbrel)(에타너셉트), 레미케이드(Remicade)(인플릭시맙), 키네레트(Kineret)(아나킨라), 리툭산(Rituxan)(리툭시맙), 오렌시아(Orencia)(아바타셉트), 금염, 항말라리아약, 설파살라진, d-페니실라민, 사이클로스포린 A, 디클로페낙, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린 중 하나 이상과의 조합으로 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 치료가 상기 조성물을 메토트렉세이트와의 조합으로 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
10. 항체 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 그 후 항체 분자를 정제하는 것을 포함하는 항체 분자의 제조 방법으로서, 상기 항체 분자는, GM-CSFRα의 세포외 도메인에의 결합에 대해, 서열 번호 52의 VH 도메인과 서열 번호 218의 VL 도메인을 갖는 항체 분자와 경쟁하는 것인 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 분자가 표면 플라즈몬 공명 분석에서 5 nM 미만의 친화도(K_D)로 인간 GM-CSFRα의 세포외 도메인에 결합하는 것인 제조 방법.
12. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 어버이 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해, 어버이 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계로서,
    상기 어버이 VH CDR1은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 어버이 VH CDR2는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 어버이 VH CDR3은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖는 것인 단계;
    이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여, 하나 이상의 VH/VL 조합을 제공하는 단계로서,
    상기 하나 이상의 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 어버이 VL 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 제공되며;
    상기 어버이 VL CDR1은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 어버이 VL CDR2는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 어버이 VL CDR3은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 것인 단계; 및
    인간 GM-CSFRα에 대한 항체 분자를 확인하기 위해 상기 VH/VL 조합 또는 조합들을 테스트하는 단계
    를 포함하는, 인간 GM-CSFRα에 대한 항체 분자의 제조 방법.

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