KR101457603B1 - 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 조성물, 및 단삼 추출물을, 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역 증강 및 항바이러스용 조성물은 항바이러스 활성 및 면역 증강 효능을 나타내어, 박테리아 및 바이러스 감염성 질환의 예방 및 치료용으로 적용될 수 있고, 면역이 저하되거나 면역이 억제된 환자의 면역력 증강 및 조절을 위한 의약이나 건강기능식품, 및 동물의 항질병 강화를 목적으로 하는 면역증강 및 항바이러스용 사료 등으로 광범위하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 면역 증강 및 항바이러스용 조성물은 독성이나 부작용을 거의 일으키지 않으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

Description

단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스 조성물{IMMUNE ENHANCING AND ANTIVIRAL COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE}

본 발명은 면역 증강 및 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 의약, 건강기능식품 및 사료 조성물 등으로 이용될 수 있는 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

면역은 태어날 때부터 지니고 있는 선천 면역(innate immunity)과 후천적으로 생활하면서 적응되어 얻어지는 획득 면역(acquired immunity)으로 구분될 수 있다. 선천 면역은 일명 '자연 면역'이라고도 하며, 항원에 대해 비특이적으로 반응하고, 특별한 기억작용은 없는 것을 특징으로 한다.

생체내 선천적 방어 면역시스템 중 최근 가장 중요시되는 연구 분야는 인터페론(interferon)에 의해 유도되는 선천성 면역분야이며, 이러한 인터페론 매개 면역의 활성화는 다양한 전염병 병원체에 대한 근본적인 예방 방법이 될 수 있다. 따라서 인터페론 활성화 기전 연구 및 인터페론을 유도시킬 수 있는 면역조절제제의 개발 연구가 활발하다. 또한, 병원체의 감염에 따른 선천 면역의 방어기작의 하나로 면역 인자(염증 사이토카인)가 분비되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어진다. 따라서 적정한 수준의 염증반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있으며, 이를 유도시킬 수 있는 면역증강제제의 개발 연구가 필요하다.

바이러스(virus)란 라틴어로 독성물질을 의미하며, 세균여과지(0.22㎛)를 통과하는 일군의 감염형 병원성 입자를 의미한다. 바이러스는 숙주세포의 종류에 따라 박테리오 파지, 식물 바이러스, 동물 바이러스로 분류하기도 하며, 핵산의 종류에 따라 DNA 바이러스, RNA 바이러스로 분류할 수 있다. 최근 신종플루, AI 및 구제역 등 다양한 바이러스 질병이 사회적으로 큰 문제를 일으켰으며, 이에 따라 바이러스 질병의 효과적인 대책에 대한 고민이 사회적으로 큰 관심을 불러일으키고 있다.

현재 바이러스성 질병을 예방하기 위해서 가장 좋은 방법은 백신접종이다. 그럼에도 불구하고 RNA 바이러스에 의한 질병의 경우, 대체적으로 많은 바이러스 혈청형(아형) 생성 등에 따른 백신의 효율성 문제가 중요하게 제기되고 있다. 이러한 백신의 문제점을 보완해 줄 수 있는 바이러스 예방용 억제제의 개발 및 보급은 중요한 사항이며, 이를 위해 특히 바이러스에 대한 초기 방어시스템인 생체내 선천적 면역시스템을 자극하여 개체 동물의 면역력을 높여주는 예방제제의 발굴 및 개발은 중요한 제제 개발 방법이 될 수 있다.

인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제로는 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)이 있으나, 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스에만 효과적이며, M2 단백질이 없는 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한 아만타딘과 리만타딘은 사용 시 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에 효과적인 항바이러스 제제로 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir)가 개발되었다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여 시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다.

또한, 뉴캐슬병 바이러스에 대한 백신은 크게 생독 백신과 사독 백신으로 구분되는데, 가장 널리 이용되어온 대표적인 뉴캐슬병 생독 백신주인 B1주와 La Sota주(Clone주 포함)는 백신 접종 반응을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 전 세계적으로 사용되고 있는 뉴캐슬병 사독 백신인 다가혼합 사독 오일 백신은 1회 백신 접종으로 3종 이상의 질병이 동시에 예방될 수 있으나, 산란계 농장의 경우 면역력 저하로 인한 뉴캐슬병 발생 피해 사례가 늘어나고 있다.

또한, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)의 주된 통제 방법은, 질병의 완전 치료가 불가능하기 때문에, 구제역과 마찬가지로 예방 및 차단 방역과 발생 지역 내 감수성 가축의 박멸이 최선의 방법이다.

이러한 상황하에서, 최근 해외 및 국내에서 기존의 항바이러스 제제의 단점을 극복하고자 많은 노력들이 이루어지고 있으며, 그 노력 중의 하나로 국내에서는 생약 추출물 및 식물 추출물을 대상으로 항바이러스 효능에 대한 연구가 활발히 진행중이다.

한편, 단삼(Salvia miltiorrhiza BUNGE)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년초로, 뿌리에 함유된 것으로 알려진 성분은 바이칼린(baicalin) 등의 플라보노이드 성분(flavonoids), 이소탄신온(isotanshione) I, 탄신온(tanshinone) I, 탄신온 IIA, 탄신온 IIB, 크립토탄신온(cryptotanshinone) 등의 수종의 디테르펜 성분(diterpenes), 올레안산(oleanoic acid) 등의 트리테르펜 성분(triterpenes), 로즈마린산(rosmarinic acid) 등의 페닐프로판노이드 성분(phenylpropanoids), 살비아놀산(salvianolic acid), 리소스퍼믹산(lithospermic acid) B 등의 리그난 성분(lignans) 등이 있다. 이중 디테르펜계 성분이 가장 많이 함유되어 있는데 이소탄신온 I, 탄신온 I, 탄신온 IIA, 탄신온 IIB, 크립토탄신온 등은 단삼에만 함유되어 있는 성분이다. 단삼을 이용한 종래기술은 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물, 간섬유화 또는 간경화증 예방 및 치료용 조성물과 같이 간세포 등에 미치는 영향에 대한 기술이 주를 이루고 있다.

이에, 기존의 항바이러스 제제의 단점을 극복하여 독성 및 부작용이 거의 없이 우수한 면역 증강 효과 및 항바이러스 활성을 발휘할 수 있는 단삼 추출물을 이용한 조성물에 대한 요구가 여전히 존재하는 실정이다.

본 발명자들은 단삼의 추출물이 선천 면역의 주요 세포인 대식 세포를 활성화시켜 다양한 RNA 바이러스의 증식을 억제시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 독성 및 부작용이 거의 없어 장기간 안정성을 확보하면서, 각종 바이러스 또는 세균 감염성 질병의 예방 및 치료, 약학 조성물, 건강기능식품 또는 가축 사료 조성물 등에 효과적으로 이용될 수 있는 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스 조성물 및 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 단삼 추출물을, 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강을 제공한다.

본 발명에 따르면 우수한 면역 증강 효능을 발휘하는 단삼 추출물을 이용함으로써 각종 바이러스 및 세균 감염성 질병의 예방 및 치료에 효과적으로 적용될 수 있으며, 면역력 증진에 기여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 조성물은 독성이나 부작용을 거의 일으키지 않으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 박테리아 및 바이러스 감염성 질환의 예방 및 치료용으로 적용될 수 있고, 면역이 저하되거나 면역이 억제된 환자의 면역력 증강 및 조절을 위한 약학 조성물이나 건강기능식품, 및 동물의 항질병 강화를 목적으로 하는 면역증강용 사료 조성물 등으로 광범위하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 단삼 추출물을 면역 증강에 필요한 동물에 투여함으로써 동물의 면역을 효과적으로 안전하게 증강시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 실시예에 따른 단삼 추출물의 세포 독성 실험결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물의 PR8-gfp(Swine influenza virus)에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물의 VSV-gfp(Vesicular stomatitis virus)에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물의 NDV-gfp(Newcastle disease virus)에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물의 농도에 따른 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물에 의한 전염증성 사이토카인 유도 실험결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 단삼 추출물에 의한 인터페론-β 분비 유도 실험결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 in - vivo 동물 실험에 있어서 단삼 추출물에 의한 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험결과를 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다.

본 발명은 선천 면역의 주요 세포인 대식 세포를 활성화시켜 다양한 RNA 바이러스의 증식을 억제시킬 수 있는 단삼 추출물을 이용함으로써 면역 증강 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 이용되는 단삼 추출물은 일반적으로 천연물 추출에 사용되는 다양한 용매를 이용한 추출에 의하여 형성될 수 있으며, 예를 들어, 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.

일 실시예에서, 단삼 추출물은, 증류수를 첨가하는 단계; 60~130℃, 바람직하게는 약 105℃의 온도에서 30~240분 동안, 바람직하게는 약 150분 동안 열수 추출하는 단계; 및 여과하는 단계를 거쳐 형성될 수 있다.

단삼 추출물은 각종 바이러스, 예를 들면 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 등에 대하여 우수한 항바이러스 활성을 나타내고, 면역 인자 유도능을 강하게 나타내며, 개체의 선천 면역을 증가시켜 인플루엔자 바이러스의 감염 및 증식을 억제하는 효과를 발휘한다.

또한, 단삼 추출물은 세포 독성이나 부작용을 거의 나타내지 않으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는 이와 같은 효능을 발휘하는 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물, 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품 또는 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물 등에 적용할 수 있다.

본 발명의 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다.

약학 조성물의 제제화 방법은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특히 제한되지 않는다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 일반적으로 약 5~500㎎/㎏, 바람직하게는 약 100~250㎎/㎏을 1일 1~3회 투여할 수 있다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물의 제제화 방법, 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

특히, 본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 독성이나 부작용을 거의 갖지 않는 단삼 추출물을 유효성분으로 함유하므로, 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 유효 성분으로 단삼 추출물 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물은 암, 특히 전립선, 결장, 폐, 유방, 난소, 두경부, 외음부, 방광 및 뇌암, 신경교종뿐 아니라 비전염성 만성 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 바이러스 및 세균 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 자가면역 질병의 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품은 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다.

면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품 중의 단삼 추출물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 건강기능식품 전체 중량에 대하여 0.01~30 중량%의 범위일 수 있다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 단삼 추출물을 포함하는 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물에 관한 것이다.

면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물 중의 단삼 추출물의 함량은 급여 가축의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 사료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~95중량%, 바람직하게는 0.1~80중량%의 비율일 수 있다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물은 기술분야에 공지된 사료 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어, 각종 사료 원료 또는 배합사료와 본 발명의 단삼 추출물을 혼합한 후, 추가적인 가공 공정, 예를 들어 펠렛 형태로의 성형 또는 과립 등의 형태로의 절단 단계 등을 더 수행함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물의 구성성분, 조성, 제조방법, 급여방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 단삼 추출물을, 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강에 관한 것이다.

본 발명의 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강에 있어서, 단삼 추출물의 투여량, 투여경로, 투여시기 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

이와 같이 본 발명에 있어서는 대식 세포를 활성화시켜 다양한 RNA 바이러스의 증식을 억제하고, 독성이나 부작용이 거의 없는 단삼 추출물을 약학 조성물, 건강기능식품 또는 사료 조성물 등에 이용함으로써, 면역 증강 및 조절, 동물의 항질병 강화 효과를 발휘할 수 있으며, 나아가 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 약재의 선정

(1) 약재의 수집

상한론, 금궤요략, 방약합편 등에 기재된 처방 및 그 처방에 포함된 단미제 등을 대상으로 항균 활성 및 면역 증강 효능이 있다고 보고된 약재들을 수집하여 실험에 사용하였다.

(2) 생약 추출물의 제조

선발된 생약 추출물은 10배수의 증류수를 첨가하여 105℃에서 150분간 열수 추출하고, 0.45㎛로 1차 여과한 후, 0.22㎛로 최종 여과하여 침전물을 제거하였다. 이어서, pH를 7.0으로 조정하여 1.5㎖ Ep-튜브에 1㎖씩 분주하고 -20℃에서 저장하여 모든 실험에 사용하였다.

2. 마우스 대식세포주를 이용한 단삼 추출물의 세포 독성

: 단삼 추출물의 세포 독성을 확인하기 위하여 안전성 실험을 하기와 같이 수행하였다.

(1) 세포 독성 실험방법

1) 마우스 대식세포주인 Raw 264.7을 배양하여 실험에 사용하였다.

2) 12-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기에서 제조된 단삼 추출물(pH 조정)을 각각 0.3%, 0.5%, 1% 및 2%의 농도로 첨가하여 처리하였다.

3) 음성 대조군(Negative control)은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였다.

4) 22~24시간 후 0.4% 트립판 블루(Tryphan Blue)로 염색하여 세포 사멸을 확인하였다.

(2) 세포 독성 실험결과

도 1에 세포 독성 실험 결과를 단삼 추출물의 농도별 세포 생존율로 나타낸다. 도 1로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단삼 추출물은 2% 이상의 농도에서도 Raw cell에 대해 세포 독성을 나타내지 않았다.

3. 마우스 대식세포주를 이용한 단삼 추출물의 항바이러스 활성 실험

: 다양한 RNA 바이러스, 즉 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)에 대한 단삼 추출물의 항바이러스 활성 실험을 하기와 같이 수행하였다.

(1) 항바이러스 활성 실험 방법

1) 마우스 대식세포주인 Raw 264.7을 키워 실험에 사용하였다(8 × 10⁵ cell/well)

2) 12-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기에서 제조된 단삼 추출물(pH 조정)을 1%의 농도로 첨가하여 처리하였다.

3) 음성 대조군은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군(Positive control)은 Mouse IFN-B(500 units/㎖)를 처리하였다.

4) 단삼 처리 12시간 후, PR8-gfp(MOI:0.5), VSV-gfp(MOI:0.5), NDV-gfp(MOI:0.5)를 각각 접종하였다.

5) 접종하고 2시간 후 접종액을 제거하고, PBS로 3회 세척하고, 8~10시간 후 바이러스 감염 정도를 측정하였다.

(2) 항바이러스 활성 실험결과

1) PR8-gfp(swine influenza virus) 실험결과

도 2에 PR8-gfp에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다. 도 2(a)는 감염 12시간 후의 GFP(green fluorescent protein) 형광이미지를 나타내고, 도 2(b)는 GFP 흡수도(absorbance)를 나타내며, 도 2(c)는 세포 생존율을 나타낸다(NC: 음성 대조군, PR8-gfp: 바이러스 감염군, 단삼: 단삼 추출물 처리군).

도 2로부터, 단삼 추출물로 전처리한 결과 인플루엔자 바이러스 감염율이 현저하게 떨어졌으며, 세포 생존율도 바이러스 감염군에 비해 상승한 것을 확인할 수 있다.

2) VSV-gfp(Vesicular stomatitis virus) 실험결과

도 3에 VSV-gfp에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다. 도 3(a)는 감염 12시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 3(b)는 감염 24시간 후의 바이러스 역가(viral titer) 그래프를 나타내며, 도 3(c)는 감염 24시간 후의 GFP 흡수도를 나타내고, 도 3(d)는 감염 24시간 후의 세포 생존율을 나타낸다(PC: 양성 대조군, VSV-gfp: 바이러스 감염군, 단삼: 단삼 추출물 처리군).

도 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단삼 추출물로 전처리한 결과 수포성 구내염 바이러스 감염율이 현저하게 떨어졌으며, 바이러스 역가도 감소하였고, 세포 생존율도 바이러스 감염군에 비해 상승하였다.

3) NDV-gfp(newcastle disease virus) 실험결과

도 4에 NDV-gfp에 대한 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸다. 도 4(a)는 감염 12시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 4(b)는 감염 24시간 후의 GFP 흡수도를 나타내며, 도 4(c)는 감염 24시간 후의 세포 생존율을 나타낸다(NC: 음성 대조군, NDV-gfp: 바이러스 감염군, 단삼: 단삼 추출물 처리군).

도 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단삼 추출물로 전처리한 결과 뉴캐슬병 바이러스 감염율이 현저하게 떨어졌으며, 세포 생존율도 바이러스 감염군에 비해 상승하였다.

4. 단삼 추출물의 농도에 따른 항바이러스 활성 실험

: 단삼 추출물의 농도에 따른 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

(1) 항바이러스 활성 실험방법

1) 마우스 대식세포주인 Raw 264.7을 키워 실험에 사용하였다(8 × 10⁵ cell/well)

2) 12-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기에서 제조된 단삼 추출물(pH 조정)을 각각 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1% 및 2%의 농도로 첨가하여 처리하였다.

3) 음성 대조군은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군은 Mouse IFN-B(500 units/ml)를 처리하였다.

4) 단삼 처리 12시간 후 PR8-gfp(swine influenza virus)를 MOI 0.5 수준으로 접종하였다.

5) 접종 후 2시간 후 접종액을 제거하고, PBS로 3회 세척하고, 8~10시간 후 바이러스 감염 정도를 측정하였다.

(2) 항바이러스 활성 실험결과

도 5에 단삼 추출물의 농도에 따른 항바이러스 활성을 GFP 형광이미지로 나타낸다. 도 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단삼 추출물은 농도 의존적으로 양성 대조군과 유사한 정도의 항바이러스 활성을 나타내었다.

5. 마우스 대식세포주를 이용한 단삼의 전염증성 사이토카인 유도( pro -inflammatory Cytokine Induction ) 실험

: 단삼 추출물의 면역인자 유도효과를 확인하기 위하기 하기와 같이 실험을 수행하였다.

(1) 전염증성 사이토카인 유도 실험방법

1) 마우스 대식세포주인 Raw 264.7을 키워 실험에 사용하였다(8 × 10⁵ cell/well)

2) 6-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기에서 제조된 단삼 추출물(pH 조정)을 1% 농도로 첨가하여 처리하였다.

3) 음성 대조군은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군은 리포폴리사카라이드(LPS) 분말(100ng/㎖)을 처리하였다.

4) 처리 후, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간의 결과물에 대하여 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 값을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

(2) 전염증성 사이토카인 유도 실험결과

도 6에 단삼 추출물에 의한 전염증성 사이토카인 유도 실험결과를 나타낸다(NC: 음성 대조군, LPS: 양성 대조군, 단삼: 단삼 추출물 처리군). TNF-α는 면역 및 염증반응의 매개물질로 대식세포주를 활성화시키며 다양한 사이토카인 분비를 유도하는 물질로 B-세포를 증식시키고, IL-12는 T-세포 분화를 촉진시키는 등 세포성 면역반응에 영향을 미치는 중요한 사이토카인이며, IL-6는 B-세포를 활성화시켜 항체생산을 증가시켜 항원특이적 면역반응을 촉진하는 중요한 사이토카인이다.

도 6으로부터, 단삼 추출물에 의하여 Raw cell로부터 전염증성 사이토카인 유도능이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

6. 마우스 대식세포주를 이용한 단삼의 인터페론-β 분비 유도 실험

: 단삼 추출물의 면역인자 유도효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

(1) 인터페론-β 분비 유도( Interferon -β secretion Induction ) 실험방법

1) 마우스 대식세포주인 Raw 264.7을 키워 실험에 사용하였다(8 × 10⁵ cell/well)

2) 6-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기에서 제조된 단삼 추출물(pH 조정)을 1% 농도로 첨가하여 처리하였다.

3) 음성 대조군은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군은 리포폴리사카라이드(LPS) 분말(100ng/㎖)을 처리하였다.

4) 처리 후 12시간, 24시간의 결과물에 대하여 인터페론-β의 값을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

(2) 인터페론-β 분비 유도 실험결과

도 7에 단삼 추출물에 의한 인터페론-β 분비 유도 실험결과를 나타낸다(NC: 음성 대조군, LPS: 양성 대조군, 단삼: 단삼 추출물 처리군). 인터페론-β는 바이러스, 암세포 등의 외부 물질에 반응하여 분비되는 사이토카인으로, 세포내 항암 및 항바이러스 작용을 일으켜 면역반응을 유도하는 물질이다.

도 7로부터, 단삼 추출물에 의하여 Raw cell로부터 인터페론-β 유도능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.

7. 마우스에서의 단삼 추출물에 의한 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험

(1) 실험방법

1) 4-5주령의 Female Balb/c 마우스를 대조군(5마리)과 단삼 추출물 투여군(5마리)으로 각각 그룹을 나눈다.

2) 단삼 투여군(5마리)의 경우 5일 동안 단삼 추출물을 약 300㎕씩 매일 경구로 투여하고, 치사량의 PR8 바이러스(10LD₅₀)를 대조군과 단삼 추출물 투여군의 비강으로 투여하여 공격 접종을 한 후, 단삼 추출물 투여군의 경우 바이러스 공격 이후에도 단삼 추출물을 약 300㎕씩 매일 경구로 5일 동안 투여하였다.

2일마다 마우스의 체중을 측정하였고, 마우스가 치사되기까지 마우스의 생존실험을 수행하였다.

(2) 실험결과

도 8에 단삼 추출물에 의한 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험결과로, 마우스의 체중 변화(a) 및 생존율(b)을 나타낸다. 도 8에서와 같이, 바이러스 공격 후 대조군 마우스들이 7일 이내에 모두 치사된 것에 반해, 단삼 추출물을 투여한 그룹의 마우스 중에서는 1마리만이 치사되었고, 체중변화 역시 회복됨을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 단삼 추출물 내에 존재하는 면역증강성분이 마우스의 선천 면역을 증가시켜 인플루엔자 바이러스의 감염 및 증식을 억제한 것으로 고려된다.

8. 제조예

(1) 주사제

상기 1.에서 제조된 단삼 추출물: 100 ㎎

소듐 메타비설파이트: 3.0 ㎎

메틸파라벤: 0.8 ㎎

프로필파라벤: 0.1 ㎎

주사용 멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖가 되도록 제조하여, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

(2) 정제

상기 1.에서 제조된 단삼 추출물: 200 ㎎

감자 전분: 100 ㎎

락토오스: 100 ㎎

콜로이드성 규산: 16 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 타정하고 정제를 제조하였다.

(3) 캡슐제

상기 1.에서 제조된 단삼 추출물: 100 ㎎

유당: 50 ㎎

전분: 50 ㎎

탈크: 2 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 캡슐 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

(4) 환제

상기 1.에서 제조된 단삼 추출물: 120 ㎎

옥수수 전분: 100 ㎎

멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법에 따라 적절한 크기를 갖는 구형으로 제환하여 환제를 제조하였다.

(5) 건강 기능 식품

1) 건강 음료

올리고당(2%), 액상과당(0.5%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%) 등의 음료 재료에 상기 1.에서 제조된 단삼 추출물을 적량 혼합하여, 살균함으로써 음료를 제조하였다.

2) 기능성 식품

상기 1.에서 제조된 단삼 추출물을 각종 비타민 및 미네랄 함유 기능성 식품에 적량 혼합하여 단삼 추출물이 함유된 기능성 식품을 제조하였다.

(6) 사료 조성물

동물용 배합 사료에 상기 1.에서 제조된 단삼 추출물을 적량 혼합하여, 사료 조성물을 제조한 후, 펠렛화 및 과립화하였다.

상기 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

Claims (13)

1. 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성된 단삼 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 함유하며, 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 및 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 감염에 의한 질병의 치료 또는 예방에 이용되며, 대식 세포를 활성화시키고 면역 인자를 유도하여, 면역 증강 효과 및 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 발휘하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는
   면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물.
   
3. 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성된 단삼 추출물을 유효성분으로 함유하고, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 함유하며, 대식 세포를 활성화시키고 면역 인자를 유도하여, 면역 증강 효과 및 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 발휘하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는
   면역 증강 및 항바이러스용 건강기능식품.
   
5. 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성된 단삼 추출물을 유효성분으로 함유하고, 대식 세포를 활성화시키고 면역 인자를 유도하여, 면역 증강 효과 및 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 발휘하는 것을 특징으로 하는 면역 증강 및 항바이러스용 사료 조성물.
   
6. 제1항의 면역 증강 및 항바이러스용 약학 조성물을, 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하며, 면역 증강 효과 및 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 발휘하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역 증강 및 항바이러스 활성 증강 방법.
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