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KR101454491B1 - 알파5베타1 길항제를 포함하는 조합 치료법 - Google Patents

알파5베타1 길항제를 포함하는 조합 치료법 Download PDF

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KR101454491B1
KR101454491B1 KR1020087025532A KR20087025532A KR101454491B1 KR 101454491 B1 KR101454491 B1 KR 101454491B1 KR 1020087025532 A KR1020087025532 A KR 1020087025532A KR 20087025532 A KR20087025532 A KR 20087025532A KR 101454491 B1 KR101454491 B1 KR 101454491B1
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beta
alpha
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아난 춘타라파이
그렉 폴로우만
마크 테시어-라빈
얀 유
웨일란 예
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제넨테크, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 암을 치료하고, 질환에서의 비정상적인 혈관형성을 억제하는 것을 포함하여 혈관형성 및/또는 혈관 투과성을 억제하기 위한 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 혈관형성 및 혈관 투과성을 촉진하기 위한 VEGFR 작동제 및 알파5베타1 작동제의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 항-알파5베타1 항체, 이를 포함하는 조성물 및 키트, 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
조합 치료법, 혈관 형성, 혈관 투과성, VEGF 길항제, 알파5베타1 길항제, VEGFR 작동제, 알파5베타1 작동제, 항-알파5베타1 항체

Description

알파5베타1 길항제를 포함하는 조합 치료법{COMBINATORIAL THERAPY INVOLVING ALPHA5BETA1 ANTAGONISTS}
본 발명은 암을 치료하고 혈관형성 및/또는 혈관 투과성 (질환에서의 비정상적인 혈관형성 포함)을 억제하기 위한 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 혈관형성 및 혈관 투과성을 촉진하기 위한 VEGFR 작동제 및 알파5베타1 작동제의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항-알파5베타1 항체, 이를 포함하는 조성물 및 키트, 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
병리학적 및 비-병리학적 혈관형성에서의 VEGF-A의 주요 역할은 잘 확립되어 있다. 생체내 모델에서의 VEGF의 투여는 강력한 혈관형성성 응답을 유도한다 ([Plouet, J et al., (1989) EMBO J. 8:3801-3808]; [Leung, D.W., et al., (1989) Science 246:1306-1309]). 단일 VEGF-A 대립유전자의 손실은 마우스에서 배아 치사율을 일으켰다 ([Carmeliet, P., et al., (1996) Nature 380:435-439]; [Ferrara, N et al., (1996) Nature 380:439-442]). 또한 VEGF는 혈관 누출을 유도하는 이의 능력으로 인해 혈관 투과성 인자로 공지되어 있다 ([Senger, D.R. et al., (1995) Science 219:983-985]; [Dvorak, H.F., et al., (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039]). 따라서, VEGF-A는 기타 비-병리학적 혈관형성에 더하 여 발달성, 생식성 및 골 혈관형성에 관여한다.
VEGF-A는 VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (KDR, Flk-1)의 2개의 수용체 티로신 키나제 (RTK)에 결합한다. VEGFR-2는 VEGF-A의 분열촉진성, 혈관형성성 및 투과성-증강 효과의 주요 매체체인 것으로 일반적으로 생각된다. 2004년 2월에, 미국 식품 의약국 (FDA)은 인간화 항-VEGF (혈관 내피 성장 인자)-A 모노클로날 (monoclonal) 항체인 베바시주맵을 5-플루오로우라실 (FU)-기반 화학요법 계획과 조합된 전이성 결장직장암의 치료용으로 허가하였다. 이어서, FDA는 VEGF-A의 아미노산 165개의 이소형을 차단하는 앱타머(aptamer)인 페갑티닙(pegaptinib)을 습식 (신생혈관성) 형태의 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 치료용으로 허가하였다.
이러한 진보에도 불구하고, VEGF 길항제로 치료된 다수의 환자들은 결국 질환으로 쓰러졌다. 따라서, VEGF 길항제 치료법에 더 이상 응답성이지 않거나 단지 부분적으로만 응답성인 질환을 치료하기 위한 신규 약제 및 치료법이 필요하다. 비정상적인 혈관형성에 의해 악화되거나, 야기되거나 또는 초래된 질환 및 암을 치료하기 위한 별법적이고/이거나 더욱 양호한 치료법을 개발하는 것이 또한 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 비정상적인 혈관형성을 앓고 있고/있거나 이상증식을 앓고 있는, 감소된 혈관형성이 이로울 환자를 치료하는 약제 및 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에 따르면, 본 발명은 치료적 유효량의 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 동시에 또는 순차적으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 혈관형성 및/또는 혈관 투과성을 억제하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 치료적 유효량의 알파5베타 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, VEGF 길항제로의 질환에 대한 치료에 응답성이었지만, VEGF 길항제에 부분적으로 응답성이거나 더이상 응답성이지 않은, 질환을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 치료적 유효량의 VEGF 길항제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 단독으로의 또는 화학요법과 조합된 알파5베타 길항제 치료법에 저항성 또는 불응성인 질환을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 신규 항-알파5베타1 항체, 이를 포함하는 키트 및 조성물, 및 이의 제조 또는 사용 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에 따르면, 새로운 항-알파5베타1 항체는 본원에 기술된 7H5 항체 또는 7H12 항체, 또는 이의 인간화 또는 키메라 형태이다. 또다른 특정 실시양태에 따르면, 7H5 항체 또는 7H12 항체, 또는 이의 인간화 또는 키메라 형태는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아바디(diabody), 다중-특이적 항체 및 선형 항체의 형태일 수 있다. 또다른 실시양태에 따르면, 신규 항-알파5베타1 항체는 치료제, 또는 환자 또는 환자 샘플 내의 알파5베타1을 검출하기 위한 형광 염료 또는 기타 마커와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 또다른 구성요소에 접합될 수 있다. 이같은 신규 알파5베타1 항체는 다양한 치료 및 진단 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이같은 항-알파5베타1 항체는 비정상적인 혈관형성, 이상증식, 안구 질환 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이같은 항체는 항체를 환자 또는 환자 샘플 내의 알 파5베타1 단백질에 접촉시키고 알파5베타1 단백질에 결합된 항-알파5베타1 항체를 정성적으로 또는 정량적으로 결정함으로써 환자 또는 환자 샘플 내의 알파5베타1 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다.
또다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 동시에 또는 순차적으로 제공하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 암은 VEGF 길항제 요법에 대해 응답성이다. 또다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 연령-관련 황반 변성을 앓고 있는 환자에서 연령-관련 황반 변성 (AMD) (습식 연령-관련 황반 변성 포함)을 치료하는 방법. 또다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 치료될 대상에게 VEGF 길항제를 먼저 투여한 후 이어서 알파5베타1 길항제로 치료할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 대상을 VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제로 동시에 치료할 수 있다. 또다른 실시양태에 따르면, 대상이 VEGF 길항제 치료에 무응답성일 때까지 대상을 VEGF 길항제로 치료한 후, 대상을 알파5베타1 길항제로 치료한다. 한 특정 실시양태에서, 암이 비-침습성 또는 초기 단계인 경우 대상을 VEGF 길항제로 치료하고, 암이 침습성인 경우 대상을 알파5베타1 길항제로 치료한다. 또다른 실시양태에서, 알파5베타1 길항제로 치료될 대상은 질환을 앓고 있지 않는 대상으로부터의 조직과 비교하여 질환 조직 내의 알파5 베타1 수준이 상승되어 있다. 이러한 예에서, VEGF 길항제로의 치료 후 대상, 예를 들어, 질환 조직에서 알파5베타1을 검출하는 단계가 방법에 추가로 포함될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 침습성 암은 전이된 암이다. 또다른 실시양태에 따르면, 초기 단계 암은 보조 요법 (예를 들어, 화학요법 또는 수술적 제거)에 의해 치료된 암이다.
한 바람직한 실시양태에서, 대상은 비정상적인 혈관형성이 있는 질환을 앓고고 있다. 또다른 실시양태에 따르면, 질환은 암, 면역 질환 또는 안구 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 질환은 고형 종양, 전이성 종양, 연조직 종양, 안구 신생혈관증식이 있는 질환, 비정상적인 혈관형성이 있는 염증성 질환, 대상 내로의 이식 후에 발생하는 질환 및 섬유혈관 조직의 비정상적인 증식이 있는 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 암은 유방암 (전이성 유방암 포함), 자궁경부암, 결장직장암 (전이성 결장직장암 포함), 폐암 (비-소세포 폐암 포함), 비-호지킨 림프종 (NHL), 만성 림프구성 백혈병, 신장세포암, 호르몬 불응성 전립선암을 포함하는 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 연조직암, 위장관 기질 종양, 다형성 교모세포종 및 다발성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 질환은 망막병증, 연령-유도 황반 변성 (예를 들어, 습식 AMD), 당뇨병성 황반 부종, 피부홍조; 건선, 염증성 신장 질환, 용혈성 요독 증후군, 당뇨병성 신장병증 (예를 들어, 증식성 당뇨병성 망막병증), 관절염 (예를 들어, 건선성 관절염, 골관절염, 류머티스 관절염), 염증성 장 질환, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 각막 이식 거부, 각막 신생혈관증식, 각막 이식 신생혈관증식, 크론병, 근시, 안구 신생혈관 질환, 파제트병, 유사천포창, 다발동맥염, 레이저후 방사상 각막절개, 망막 신생혈관증식, 쇼그렌 증후군, 궤양성 결장염, 이식편 거부, 폐 염증, 콩팥 증후군, 부종, 악성종양과 관련된 복수, 뇌졸중, 혈관섬유종 및 신생혈관 녹내장으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 항신생물제, 화학요법제 및 세포독성제로 구성된 군으로부터 선택된 치료제가 대상에게 추가로 투여된다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제로 치료될 대상은 VEGF 길항제 치료 후 재발을 앓고 있거나, 또는 VEGF 길항제 치료에 불응성이 되었다. 또다른 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제 및 VEGF 길항제로 치료될 대상은 전이성 암을 앓고 있거나, 또는 이전에 보조 요법으로 치료되었다. 한 실시양태에서, 후보 환자는 재발되었거나, 이리노테칸과 같은 화학요법제에 저항성이거나 불응성이다. 이같은 질환의 예로는 전이성 결장직장암, 재발된 전이성 결장직장암, 전이성 유방암, 재발된 전이성 유방암, 전이성 HER2+ 유방암, 애주번트(adjuvant) 유방암, 애쥬번트 HER2+ 유방암, 전이성 췌장암, 애쥬번트 결장암, 애쥬번트 비-소세포 폐암, 애쥬번트 직장암, 애쥬번트 비-소세포 폐암, 전이성 비-소세포 폐암, 전이성 난소암, 전이성 신장세포암 및 애쥬번트 신장세포암이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 기술된 질환을 앓고 있는 대상에게 VEGF 길항제로의 질환 치료 후 유지 요법이 투여되고, 이때 유지 요법은 단독으로의 또는 VEGF 길항제와 동시 또는 순차적으로의 알파5베타1 길항제이다.
한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 항체, 면역부착소(immunoadhesin), 펩티바디(peptibody), 소형 분자, 및 엄격한 조건 하에 VEGF를 코딩하는 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 (예를 들어, 리보자임, siRNA 및 앱타머)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 모노클로날 항체이다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 아바스틴(Avastin)® 항체에 의해 인간 VEGF에의 결합으로부터 경쟁적으로 억제될 수 있다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다. 한 특정 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 아바스틴® 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아바디 및 선형 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 및 알파5베타1에 결합하고 알파5베타1 길항제인 이중특이적 항체이다.
한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 항체, 면역부착소, 펩티바디, 소형 분자, 및 엄격한 조건 하에 알파5베타1을 코딩하는 핵산 분자에 혼성화하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 모노클로날 항체이다. 추가적인 실시양태에 따르면, 모노클로날 항체는 M200 또는 F200으로 공지된 항-인간 알파5베타1 항체와 같은 키메라 항체이다. 한 실시양태에 따 르면, 항-알파5베타1 항체는 서열 1의 VH 서열 및 서열 2의 VL 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 서열 3의 서열 및 서열 4의 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 서열 4의 서열 및 서열 5의 서열을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 7H5 항체 또는 7H12 항체에 의해 인간 알파5베타1에의 결합으로부터 경쟁적으로 억제될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다. 한 특정 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 7H5 항체, 7H12 항체, 또는 이의 키메라 또는 인간화 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아바디 및 선형 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 VEGF 및 알파5베타1에 결합하고 VEGF 길항제인 이중특이적 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 길항제는 변경된 이펙터(effector) 기능을 갖는다. 한 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성이 감소되거나 방지되도록 변경된다 (예를 들어, 항체의 Fc 부분을 코딩하는 핵산 서열의 변경에 의해). 또다른 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 인간에서의 반감기가 개선되도록 변경된 것이다 (예를 들어, 항체의 Fc 부분을 코딩하는 핵산 서열의 변경에 의해).
한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제 또는 알파5베타1 길항제는 세포독성제 또는 화학요법제에 접합된다. 또다른 실시양태에 따르면, 세포독성제는 방사성 동위원소 또는 독소이다.
본 발명은 VEGF 길항제, 알파5베타1 길항제 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 VEGF 길항제로 치료된 대상에서 알파5베타1을 검출하는 것에 대한 지침서를 포함하는 제조품을 또한 제공한다.
또한 본 발명은 혈관형성 및 혈관 투과성을 촉진하기 위한 VEGFR 작동제 및 알파5베타1 작동제의 용도, 및 VEGF 작동제 및 알파5베타1 작동제 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. VEGFR 작동제 및 알파5베타1 작동제 조합 치료법은 만성 상처, 급성 상처 및 일반적인 상처의 치료에서와 같은 상처 치유가 예를 들어 포함되는, 증가된 혈관형성 및 혈관 투과성이 이로울 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
도 1은 항-VEGF 항체, B20-4.1로의 HT29 이종이식편 종양의 치료 후의 알파5베타1-발현 기질 세포의 동원 증가를 나타낸다.
도 2는 직접 결합 분석법에서 7H5 및 7H12 항체가 HUVEC 세포에 결합하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 FACS 분석에 의해 7H5 및 7H12 항체가 HUVEC에 결합하지만 RAJI 세포에는 결합하지 않는 것을 나타낸다.
도 4는 정제된 7H5 및 7H12 모노클로날 항체의 존재 하에서의 피브로넥틴에 대한 HUVEC 부착을 나타내는 그래프이다.
도 5는 (A) 전체 세포 카운트에 의한 HUVEC 세포 증식에 대한 7H5 및 7H12의 효과를 나타내는 막대 그래프 및 (B) 또다른 분석법에서 알라마르 블루(Alamar blue) 염색에 의한 HUVEC 세포 증식에 대한 7H5 및 7H12의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 음성 대조군 (IgG)과 비교하여 0h 및 30h의 7H5로의 처치 후의 HUVEC 세포 이동의 사진이다.
도 7은 7H5 및 7H12로의 처치 후 HUVEC 세포 이동을 정량적으로 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은 7H5 및 7H12로의 처치 후 세포자멸사 분석법에서 활성화된 카스파제-3을 발현하는 HUVEC 세포의 백분율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 9는 7H5 및 7H12로의 처치 후 HUVEC 카스파제 3/7 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 토끼 귀 상처 치유 모델에서의 7H12 및/또는 베바시주맵 활성을 나타내는 그래프이다.
도 11은 (A) 처치된 마우스의 군 중앙값 종양 부피를 나타내는 그래프 또는 (B) 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯으로서 유방암 모델에서 항-VEGF 항체 +/- 항-알파5베타1 항체로 처치된 마우스의 결과를 나타낸다. 동물의 종양이 1500 ㎣에 도달하였거나 이를 초과하였을 때 연구에서 동물을 제거하였다.
도 12는 (A) 처치된 마우스의 군 중앙값 종양 부피를 나타내는 그래프 또는 (B) 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타내는 카플란-마이어 플롯으로서 결장암 모델에서 항-VEGF 항체 +/- 항-알파5베타1 항체로 처치된 마우스의 결과를 나타낸다. 동물의 종양이 1500 ㎣에 도달하였거나 이를 초과하였을 때 연구에서 동물을 제거하였다.
도 13은 (A) 처치된 마우스의 군 중앙값 종양 부피를 나타내는 그래프 또는 (B) 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타내는 카플란-마이어 플롯으로서 결장암 모델에서 항-알파5베타1 항체 또는 화학요법제로 처치된 마우스의 결과를 나타낸다. 동물의 종양이 1500 ㎣에 도달하였거나 이를 초과하였을 때 연구에서 동물을 제거하였다.
도 14는 토끼 섬유모세포 세포주인 R9ab 상의 알파5베타1에 대한 125I-7H5 결합의 스캐차드(scatchard) 플롯을 나타낸다.
도 15는 토끼 섬유모세포 세포주인 R9ab 상의 알파5베타1에 대한 125I-7H12 결합의 스캐차드 플롯을 나타낸다.
도 16은 다양한 항-알파5베타1 항체로의 항-인테그린 알파5베타1 IgG 에피토프 지도작성/경쟁적 결합 분석법의 결과를 나타낸다.
이론에 속박되지 않으면서, 본 발명가들은 증가된 기질 세포 동원이 기타 혈관 성장 인자를 질환 부위로 오게 할 수 있고, 이는 VEGF 길항제 치료법으로 치료된 환자에서 VEGF 활성의 손실을 보상할 수 있음을 제안한다. 항-a5b1 항체로 a5b1-발현 기질 세포를 표적으로 하는 것으로 기질 세포의 감소가 초래됨으로써, 잠재적인 보상성 혈관 성장 인자의 생산이 감소될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 본 발명가들은 내피-세포외 매트릭스 상호작용을 억제하는 것, 특히 알파5베타1 결합 상호작용을 억제하는 것이 VEGF 길항제 치료법으로 인해 혈관을 퇴행시킴으로써 남겨진 세포외 매트릭스 경로를 따라서 혈관형성이 복귀되는 것을 억제함으로써 VEGF 길항제 치료법을 상승시킬 것임을 제안한다. 따라서, 임의의 VEGF 길항제 치료와 동시에 또는 이러한 치료 이후에 알파5베타1 길항제로 치료하는 것은 이러한 VEGF 길항제 치료로부터의 혈관 회복, 및 따라서 신생혈관 성장의 복귀를 억제할 수 있다.
"알파5베타1" 또는 "α5β1" 또는 "a5b1"은 2개의 상이한 단백질 (즉, 서브유닛 알파5 및 베타1)을 포함하는 인테그린이다. 알파5베타1은 피브로넥틴, L1-CAM 및 피브리노겐에 결합하는 것으로 나타났다. 알파5베타1 인테그린은 극후기 활성화(Very Late Activation)-5, VLA-5, 알파5베타1, CD49e/CD29, 피브로넥틴 수용체, FNR 및 GPIc-IIa로 또한 칭해진다. 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1은 인간 알파5베타1이다.
CD49e, 알파5, 인테그린 알파5 서브유닛, VLA-5 알파 서브유닛, GPIc-IIa의 IC 서브유닛 및 FNR 알파 사슬로 또한 공지된 "알파5"에는 별법적인 스플라이싱(splicing)에 의해 생성된 4개의 이소형 (A-D)이 있다. 이들은 세포질 도메인에서 상이하다. 알파5의 인간 이소형에 대한 아미노산 서열을, 예를 들어, Genbank 접속 번호 X07979, U33879, U33882 및 U33880에서 각각 확인할 수 있다.
"베타1"은 CD29, 베타1, 혈소판 GPIIa; VLA-베타 사슬; 베타-1 인테그린 사슬, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 및 VLA5B로 또한 칭해진다. 인간 베타1에 대한 아미노산 서열을, 예를 들어, Genbank 접속 번호 X06256에서 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "VEGF" 또는 "VEGF"는 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989)], 및 [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기술된 바와 같은, 아미노산 165개의 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 아미노산 121개, 189개, 및 206개의 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 이의 천연 발생 대립유전자 형태 및 프로세싱 형태와 함께 지칭한다. 용어 "VEGF"는 비-인간 종 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 또한 지칭한다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF가 인간 VEGF에 대한 hVEGF, 뮤린(murine) VEGF에 대한 mVEGF 등과 같이 용어에 의해 지시된다. 용어 "VEGF"는 아미노산 165개의 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 말단절단 형태의 폴리펩티드를 지칭하도록 또한 사용된다. 임의의 이같은 형태의 VEGF에 대한 언급은, 예를 들어, "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"에 의해 본 출원에서 확인될 수 있다. "말단절단" 천연 VEGF에서의 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에서 지시된 바와 같이 번호가 매겨진다. 예를 들어, 말단절단 천연 VEGF의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 말단절단 천연 VEGF의 결합 친화력은 천연 VEGF에 필적한다. 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF는 인간 VEGF이다.
"VEGF 길항제"는 VEGF 또는 하나 이상의 VEGF 수용체 또는 이들을 코딩하는 핵산에 결합하는 것을 포함하여, VEGF 활성을 중화하거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐지하거나, 감소시키거나 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 바람직하게는, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. VEGF 길항제에는 항-VEGF 항체 및 이의 항원-결합 단편, VEGF 및 VEGF 수용체에 결합하여 리간드-수용체 상호작용을 차단하는 폴리펩티드 (예를 들어, 면역부착소, 펩티바디), 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제 예컨대 VEGFR 티로신 키나제의 소형 분자 억제제, VEGF에 결합하는 앱타머 및 VEGF 또는 VEGF 수용체를 코딩하는 핵산 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산 (예를 들어, RNAi)이 포함된다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 시험관내에서 VEGF에 결합하여 VEGF-유도 내피 세포 증식을 억제한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 비-VEGF 또는 비-VEGF 수용체보다 더 큰 친화력으로 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEG 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 1 uM 내지 1 pM 사이의 Kd로 결합한다. 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 500 nM 내지 1 pM 사이로 결합한다.
바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 폴리펩티드 예컨대 항체, 펩티바디, 면역부착소, 소형 분자 또는 앱타머로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 항-VEGF 항체 예컨대 아바스틴(AVASTIN)® 항체 또는 항-VEGF 수용체 항체 예컨대 항-VEGFR2 또는 항-VEGFR3 항체이다. VEGF 길항제의 또다른 예로는 VEGF-트랩(Trap), 무카젠(Mucagen), PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (소라페닙), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 및 KRN-633이 포함된다.
"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화력 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 수반되는 질환 또는 용태를 표적으로 하거나 방해하는데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체는 일반적으로 기타 VEGF 유사체 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C, 또는 기타 성장 인자 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마(hybridoma) ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 더욱 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 베바시주맵 (BV; 아바스틴®)으로 공지된 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593- 4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 또다른 실시양태에 따르면, 사용될 수 있는 항-VEGF 항체에는 WO 2005/012359에 개시된 항체들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 WO 2005/012359의 도 24, 25, 26, 27 및 29에 개시된 항체 (예를 들어, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 및 B20.4.1) 중 임의의 하나의 증쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 라니비주맵으로 공지된 항-VEGF 항체는 안구 질환 예컨대 당뇨병성 신경병증 및 AMD에 대해 투여되는 VEGF 길항제이다.
"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"로 또한 공지된 항-VEGF 항체 "베바시주맵 (BV)"은 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크(framework) 영역, 및 인간 VEGF가 이의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 보체성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맵의 아미노산 서열의 약 93％ (대부분의 프레임워크 영역 포함)는 인간 IgG1으로부터 유래되고, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맵은 분자량이 약 149,000 달톤이고, 글리코실화된다. 기타 항-VEGF 항체에는 미국 특허 번호 6884879 및 WO 2005/044853에 기술된 항체가 포함된다.
항-VEGF 항체 라니비주맵 또는 루센티스(LUCENTIS)® 항체 또는 rhuFab V2는 친화력이 성숙된 인간화 항-인간 VEGF Fab 단편이다. 라니비주맵은 대장균 발현 벡터에서의 표준 재조합 기술 방법 및 박테리아 발효에 의해 생산된다. 라니비주맵은 글리코실화되지 않고, 분자량이 약 48,000 달톤이다. WO98/45331 및 US20030190317 참조.
"알파5베타1 길항제"는 알파5베타1의 생물학적 활성을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 길항제 분자는 알파5베타1에 특이적으로 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 길항제 분자는 알파5에 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 비-알파5베타1 인테그린과 비교하여 더 큰 친화력으로 알파5베타1에 우선적으로 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 길항제는 폴리펩티드 예컨대 항체, 펩티바디 또는 면역부착소, 알파5베타1이 이의 리간드 (특히, 피브로넥틴)에 결합하는 것을 억제하는 소형 분자 또는 앱타머, 또는 알파5베타1을 코딩하는 핵산 분자에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산 (예를 들어, 알파5 발현을 방해하는 RNAi)로 구성된 군으로부터 선택된다. 알파5베타1의 생물학적 활성은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 효과들 중 임의의 하나, 효과들의 조합 또는 모든 이러한 효과일 수 있다: (1) 피브로넥틴에 결합하는 것, (2) 피브로넥틴 상에서의 세포 이동을 증강시키는 것, (3) 피브로넥틴의 존재 하에 알파5베타1을 포함하는 세포의 생존을 증가시키는 것, (4) 피브로넥틴의 존재 하에 알파5베타1을 포함하는 세포의 증식을 증가시키는 것, 및 (5) 피브로넥틴의 존재 하에 알파5베타1을 포함하는 세포의 튜브 형성을 증가시키는 것.
항-알파5베타1 길항제 항체의 예로는 M200 및 F200 (WO 2004/089988A2), 본원에 기술된 7H5 항체 및 7H12 항체, 및 이의 키메라 항체, 완전 인간 항체 및 인간화 항체가 포함된다. 예를 들어, M200 및 F200 항체는 마우스 항-인간 알파5베타1 항체, IIA1 (Pharmingen, San Diego, Ca)의 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 유래될 수 있다. 알파5베타1 소형 분자 억제제의 예로는 Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) 및 (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-비-2-엔-3-일]카르보닐아미노]프로피온산이 포함된다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 항-5베타1 길항제는 알파5베타1에는 결합하고, 알파V베타3 또는 알파V베타5 또는 알파 V베타1에는 결합하지 않는다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 알파5베타1에 1 uM 내지 1 pM 사이의 Kd로 결합한다. 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 길항제는 알파5에 500 nM 내지 1 pM 사이의 Kd로 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 알파5베타1 항체는 경쟁적 결합 분석법에서 알파5베타1에의 결합에 대해 7H5 항체 또는 7H12 항체와 경쟁할 수 있는 항체이다. 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 항체는 2006년 3월 7일에 알파5베타1 7H5.4.2.8로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7421) 또는 알파5베타1 7H12.5.1.4로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7420)로부터 생산된 항체에 의해 알파5베타1에의 결합으로부터 경쟁적으로 억제될 수 있는 항체이다.
"VEGFR 작동제"는 VEGF 수용체를 활성화시킬 수 있거나 또는 이의 발현을 증가시킬 수 있는 분자를 지칭한다. VEGFR 작동제에는, 예를 들어, VEGFR의 리간드 작동제, VEGF 변이체, 항체 및 활성 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"알파5베타1 작동제"는 알파5베타1을 활성화시킬 수 있거나 또는 이의 발현을 증가시킬 수 있는 분자를 지칭한다. 알파5베타1 작동제에는, 예를 들어, 알파5베타1의 리간드 작동제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
표적 상의 중첩 지역 또는 유사 지역에의 결합을 특징으로 하는 분자, 예컨대 항체는 경쟁적 억제/결합 분석법에 의해 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, HUVEC 또는 알파5베타1을 발현하는 기타 세포가 경쟁적 억제 분석법에서 사용되고, FACS가 2개의 항-알파5베타1 항체의 서로에 대한 결합 장소를 평가하는데 사용된다. 예를 들어, HUVEC 세포를 원뿔형 튜브에서 세정하여 5분 동안 1000 rpm에서 스피닝(spinning)시킬 수 있다. 펠렛을 전형적으로 2회 세정한다. 그후, 세포를 재현탁시키고, 카운팅하고, 사용할 때까지 얼음 상에서 유지시킬 수 있다. 100 ㎕의 1차 항-알파5베타1 항체 (예를 들어, 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 시작)를 웰에 첨가할 수 있다. 이어서, 100 ㎕ (예를 들어, 20 × 105개의 세포)의 세포를 웰 당 첨가하여 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 100 ㎕의 비오틴화 항-알파5베타1 항체 (5 ㎍/㎖ 모액)을 각각의 웰에 첨가하여, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 그후, 세포를 세정하고, 5분 동안 1000 rpm에서 펠렛화시킨다. 상청액을 흡인한다. 2차 항체 R-파이코에리트린(Phycoerythrin) 접합 스트렙타비딘 (Jackson 016-110-084)을 웰에 첨가한다 (1:1000에서 100 ㎕). 이어서, 플레이트를 호일로 싸서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 펠렛을 세정하고 5분 동안 1000 rpm에서 펠렛화할 수 있다. 펠렛을 재현탁시키고, FACS 분석용 마이크로 타이터튜브(titertube)로 옮길 수 있다.
"혈관형성 인자 또는 작용제"는 혈관의 발달을 자극하는, 예를 들어, 혈관형성, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성, 및/또는 혈관생성(vasculogenesis) 등을 촉진하는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관형성 인자에는, 예를 들어, VEGF 및 VEGF 족의 구성원, PlGF, PDGF 족, 섬유모세포 성장 인자 족 (FGF), TIE 리간드 (앤지오포이에틴(Angiopoietin), 에프린, Del-1, 섬유모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴(Follistatin), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF), 인터루킨(Interleukin)-8 (IL-8), 렙틴(Leptin), 미드카인(Midkine), 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀(Pleiotrophin) (PTN), 프로그라눌린(Progranulin), 프로리페린(Proliferin), 전환 성장 인자-알파 (TGF- 알파), 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)/혈관 투과성 인자 (VPF) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이는 상처 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 CTGF 족의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타를 또한 포함할 것이다. 예를 들어, [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 공지된 혈관형성 인자가 열거된 표 1); 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003)] 참조.
한 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 항-VEGF 항체에 대한 "Kd" 또는 "Kd 값"이 표지되지 않은 VEGF의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 VEGF (109)로 평형화시킨 후, 결합된 VEGF를 항-Fab 항체-코팅 플레이트로 포획함으로써 VEGF에 대한 Fab의 용액 결합 친화력을 측정하는 하기의 분석법에 기술된 바와 같이 Fab 버전의 항체 및 VEGF 분자로 수행된 방사성표지 VEGF 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 ([Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 확립하기 위해, 미량역가 플레이트 (Dynex)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 포획용 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 5 ㎍/㎖으로 하룻밤 동안 코팅하고, 이어서 PBS 내의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (약 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단한다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-VEGF (109)를 당해 Fab의 계단 희석물, 예를 들어, Fab-12와 혼합한다 ([Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]). 그 후, 당해 Fab를 하룻밤 동안 인큐베이션한다; 그러나, 평형에 도달되는 것을 확실히 하기 위해 인큐베이션이 65시간 동안 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 포획 플레이트에 옮겨 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 내의 0.1％ 트윈(Tween)-20으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제 (MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(Topcount) 감마 카운터 (Packard) 상에서 카운팅한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 hVEGF (8-109) CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 Kd 또는 Kd 값이 측정된다. 간략하게, 공급자의 지침서에 따라, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 인간 VEGF를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 인간 VEGF의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 키네틱 측정을 위해, Fab의 2배 계단 희석물 (0.78 nM → 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20이 있는 PBS (PBST)에 주입한다. 회합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 피팅(fitting)함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산되었다. 예를 들어, [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881] 참조. 온-속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments)와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같은, 증가하는 농도의 짧은 형태 (8-109)의 인간 VEGF 또는 마우스 VEGF의 존재 하에서의, PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항-VEGF 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 사용하여 온-속도를 측정할 수 있다. 알파5베타1을 표적으로 사용하여 항-알파5베타1 Fab 또는 항체의 Kd를 결정하기 위해 유사한 결합 분석법을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된, 치료될 대상은 포유동물 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 대상은 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험 동물 등일 수 있다. 대상은 암, 면역 질환, 또는 비정상적인 혈관형성이 있는 임의의 기타 질환이 있거나 이러한 위험이 있는 것으로 추측될 수 있거나, 또는 암, 면역 질환, 또는 비정상적인 혈관형성이 있는 임의의 기타 질환으로 진단될 수 있다. 암, 면역 질환, 또는 비정상적인 혈관형성을 나타내는 임의의 기타 질환에 대한 다수의 진단 방법, 및 이러한 질환들의 임상 묘사가 당업계에 공지되어 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 치료될 대상은 인간이다.
용어 비정상적인 혈관형성은 질환 상태에서 새로운 혈관이 과도하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 의학적 관점에서 혈관형성의 위치, 시기 또는 개시가 요망되지 않음) 성장할 때 발생하거나, 또는 비정상적인 혈관형성이 질환 상태를 야기하도록 발생한다. 과도한, 부적적한 또는 제어되지 않은 혈관형성은 질환 상태의 악화 또는 질환 상태의 원인에 기여하는 새로운 혈관 성장이 있을 때, 예컨대 암, 특히 혈관이 발달된 고형 종양 및 전이성 종양 (결장암, 폐암 (특히 소세포 폐암), 또는 전립선암 포함), 안구 신생혈관증식에 의해 야기되는 질환, 특히 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성인 망막병증 또는 연령-유도 황반 변성, 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 당뇨병성 황반 부종, 병리학적 근시, 폰 힙펠-린도우(von Hippel-Lindau) 질환, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO: Central Retinal Vein Occlusion), 각막 신생혈관증식, 망막 신생혈관증식 및 피부홍조; 건선, 건선성 관절염, 혈관모세포종 예컨대 혈관종; 염증성 신장 질환, 예컨대 사구체신염, 특히 사구체간질증식성 사구체신염, 용혈성 요독 증후군, 당뇨병성 신장병증 또는 고혈압성 신장경화증; 다양한 염증성 질환, 예컨대 관절염, 특히 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 사르코이드증, 동맥성 동맥경화증 및 이식 후 발생하는 질환, 자궁내막증 또는 만성 천식 및 70가지를 초과하는 기타 용태에서 발생한다. 새로운 혈관은 질환 조직에 영양을 공급할 수 있고, 정상 조직을 파괴할 수 있으며, 암의 경우에는, 새로운 혈관은 종양 세포가 순환 내로 탈출하여 다른 기관에 숙박하도록 할 수 있다 (종양 전이). 본 발명은 상기 언급된 질병들이 발달될 위험에 있는 환자들을 치료하는 것을 구현한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 받는 것에 대한 후보인 기타 환자는 섬유혈관 조직의 비정상적인 증식, 주사성 여드름, 후천성 면역 결핍 증후군, 동맥 폐쇄, 아토피성 각막염, 박테리아성 궤양, 베체트(Bechet) 질환, 혈액-보유 종양, 경동맥 폐쇄성 질환, 맥락막 신생혈관증식, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트렌즈 과도착용, 각막 이식 거부, 각막 신생혈관증식, 각막 이식 신생혈관증식, 크론병, 일스(Eales) 질환, 유행성 각막결막염, 진균성 궤양, 단순 헤르페스(Herpes simplex) 감염, 대상 포진 감염, 과다점성 증후군, 카포시(Kaposi) 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임(Lyme) 질환, 가장자리 각질용해증, 무렌(Mooren) 궤양, 나병 이외의 마이코박테리아(Mycobacteria) 감염, 근시, 안구 신생혈관 질환, 시와, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군 (오슬러-웨버-렌두(Osler-Weber-Rendu)), 골관절염, 파제트병, 주변부 포도막염, 유사천포창, 플릭텐증, 다발동맥염, 레이저후 합병증, 원충 감염, 탄력섬유성 거짓황색종, 익상편 건성 각막염, 방사상 각막절개, 망막 신생혈관증식, 미숙아 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 사르코이드, 공막염, 겸상 적혈구성 빈혈, 쇼그렌 증후군, 고형 종양, 스타가르트(Stargart) 질환, 스티븐스 존슨(Steven's Johnson) 질환, 상윤부 각막염, 매독, 전신성 루프스, 테리엔(Terrien) 변연성 각막변성, 톡소플라스마증, 외상, 유잉(Ewing) 육종의 종양, 신경모세포종의 종양, 골육종의 종양, 망막모세포종의 종양, 횡문근육종의 종양, 궤양성 결장염, 정맥 폐쇄, 비타민 A 결핍증 및 베게너(Wegener) 사르코이드증, 당뇨병과 관련된 원치않는 혈관형성, 기생충 질환, 비정상적인 상처 치유, 수술, 손상 또는 외상 후의 비대, 모발 성장 억제, 배란 및 황체 형성 억제, 착상 억제 및 자궁에서의 배아 발달 억제가 있거나 또는 발달될 위험에 있다.
항-혈관형성 요법은 이식편 거부, 폐 염증, 콩팥 증후군, 자간전증, 심낭 삼출, 예컨대 심막염과 관련된 것, 및 흉막 삼출, 원치 않는 혈관 투과성을 특징으로 하는 질환 및 장애, 예를 들어, 뇌 종양과 관련된 부종, 메이그스(Meigs) 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출, 흉막 삼출, 악성종양과 관련된 복수, 심혈관 질환 예컨대 심근경색증 이후의 용태와 관련된 투과성 및 뇌졸중 등의 일반적인 치료에 유용하다.
본 발명에 따른 기타 혈관형성-의존적 질환에는 혈관섬유종 (출혈 경향이 있는 혈관의 비정상적인 혈액), 신생혈관 녹내장 (눈에서의 혈관의 성장), 동정맥 기형 (동맥과 정맥 간의 비정상적인 소통), 불유합 골절 (치유되지 않을 골절), 죽상경화판 (동맥의 경화), 화농성 육아종 (혈관으로 구성된 통상적인 피부 병변), 경피증 (결합 조직 질환의 형태), 혈관종 (혈관으로 구성된 종양), 트라코마 (제3세계에서의 실명의 주요 원인), 혈우병성 관절, 혈관 부착 및 비대성 흉터 (비정상적인 흉터 형성)이 포함된다.
"치료"는 치료용 치료 및 예방용 또는 방지용 수단 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애가 있는 대상, 뿐만 아니라 장애를 방지하려는 대상이 포함된다.
용어 "재발생", "재발" 또는 "재발된"은 질환이 사라진 것으로 임상 평가된 후 암 또는 질환이 돌아오는 것을 지칭한다. 원격 전이 또는 국소적인 재발생의 진단이 재발로 간주될 수 있다.
용어 "불응성" 또는 "저항성"은 치료에 응답하지 않은 암 또는 질환을 지칭한다.
용어 "보조 요법"은 1차 요법, 일반적으로 수술 후에 제공된 치료를 지칭한다. 암 또는 질환에 대한 보조 요법에는 면역 요법, 화학요법, 방사선 요법 또는 호르몬 요법이 포함될 수 있다.
용어 "유지 요법"은 이전 치료의 효과를 유지하는 것을 돕도록 제공되는 계획된 재치료를 지칭한다. 유지 요법은 암을 완화 상태에서 유지하는 것을 돕도록 또는 질환 진행과 상관 없이 특정 요법에 대한 응답을 연장하도록 종종 제공된다.
용어 "침습성 암"은 암이 시작된 조직의 층을 넘어서 정상적인 주변 조직으로 확산된 암을 지칭한다. 침습성 암은 전이성이거나 전이성이 아닐 수 있다.
용어 "비-침습성 암"은 매우 초기의 암 또는 기원 조직을 넘어서 확산되지 않은 암을 지칭한다.
종양학에서의 용어 "무진행 생존"은 암이 성장하지 않는 치료 동안 및 치료 후의 시간의 길이를 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전한 응답 또는 부분적인 응답을 경험한 시간의 양, 뿐만 아니라 환자가 안정적인 질환을 경험한 시간의 양을 포함한다.
종양학에서의 용어 "진행성 질환"은 치료가 시작된 이후 20％를 초과하는 종양 성장을 지칭할 수 있다 - 질량에서의 증가 또는 종양에서의 확산으로 인한 성장.
"장애"는 항체로의 치료가 이로울 임의의 용태이다. 예를 들어, 비정상적인 혈관형성 (과도한, 부적절한 또는 제어되지 않는 혈관형성) 또는 혈관 투과성을 앓고 있거나 또는 이에 대한 예방을 필요로 하는 포유동물. 이는 포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적인 용태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적인 예로는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프구 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 샘, 대식세포, 상피, 기질세포 및 분할강 장애; 및 염증성, 혈관형성성 및 면역학적 장애가 포함된다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 두경부암, 직장암, 결장직장암, 폐암 (소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함), 편평세포 암 (예를 들어 상피 편평세포 암), 전립선 암, 복막의 암, 간세포 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 아교모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 난포막종, 남성배세포종, 간암, 악성 혈액 종양 (비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 및 급성 악성 혈액 종양 포함), 자궁내막 또는 자궁 암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막 암종, 침샘 암종, 외음부 암, 갑상선 암, 식도 암종, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 코인두 암종, 후두 암종, 카포시 육종, 흑색종, 피부 암종, 신경집종, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골원성 육종, 평활근육종, 요로 암종, 갑상선 암종, 윌름(Wilm) 종양, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/소포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소형 림프구성 (SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 확산성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소형 비-분할 세포 NHL; 대형(bulky) 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 및 메이그스 증후군이 포함된다.
본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "항-신생물성 조성물" 또는 "항신생물제"는 1가지 이상의 활성 치료제, 예를 들어, "항암제"를 포함하는 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예로는, 예를 들어, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항-혈관형성 작용제, 세포자멸사성 작용제, 항-튜불린 작용제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예컨대 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (이매티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BAFF, BR3, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/ Apo2, 및 기타 생체활성(bioactive) 및 유기 화학 작용제 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이들의 조합물이 또한 본 발명에서 구현된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 및/또는 생체내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S단계의 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 (S 단계 이외의 장소에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-단계 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔(TAXOL)® 및 토포(topo) II 억제제 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C 또한 S-단계 정지로 넘쳐 흐른다. 추가적인 정보는 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히 제13면에서 발견할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 독소 예컨대 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편을 포함하도록 의도된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 아브락산(ABRAXANE)™ 크레모포르-프리(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 탁소티어(TAXOTERE)® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 젬자르(GEMZAR)® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캠프토사르(Camptosar), CPT-11) (5-FU 및 류코보빈과 조합된 이리노테칸의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 (옥살리플라틴 치료 요법 (FOLFOX) 포함); 세포 증식을 감소시키는, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 EGFR의 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)TM)), 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐제 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소인 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자, 예를 들어, PKC-알파, Raf 및 H-Ras의 발현을 억제하는 것들; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKTN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라마이신 (미국 특허 번호 4,675,187 참조), 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 또한 포함된다.
본 출원에서 사용된 용어 "전구약물"은 어버이 약물에 비해 질환 세포에 덜 세포독성이고, 효소적으로 활성화되거나 더욱 활성인 어버이 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성인 물질 (예를 들어 소형 분자)의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al. "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조. 본 발명의 전구약물로는 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로유리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학요법제들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"단리된"은, 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용되는 경우, 자신이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 전형적으로 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드에는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드가 포함되는데, 이는 폴리펩티드의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 기타 폴리펩티드-코딩 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 회합되는 1가지 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과 상이하다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우, 통상적으로 폴리펩티드를 발현하는 세포 내에 함유된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 포함한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생물 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적절한 제어 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터(operator) 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서(enhancer)를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리(pre)-서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 상 내인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에서 정의된 "엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는 것, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안에 변성제, 예컨대 포름아미드를 사용하는 것, 예를 들어, 42℃에서 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨; 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5× 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하는 용액에서 하룻밤 동안 혼성화시키고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로의 10분 세정에 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고도 엄격성 세정이 이어지는 것에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 소스(source) 코드 (표 1)가 사용자 문서와 함께 미국 저작국(United States Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링(compiling)되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
본원에 기술된 아미노산 서열은 달리 특정되지 않는 한 인접한 아미노산 서열이다.
본원에서 사용된 용어 "면역부착소"는 이종성 단백질 ("부착소")의 결합 특이성이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합된 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종성"인) 원하는 결합 특이성이 있는 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 전형적으로 면역부착소 분자의 부착소 부분은 수용체 또는 리간드 - 예컨대 VEGFR 또는 피브로넥틴 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득할 수 있다. 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 표적에 특이적으로 결합하는 서열의 파지 디스플레이 선별로부터 유래된 서열을 종종 포함하는 펩티바디가 본원에서 면역부착소로 간주될 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 예를 들어, 단일 모노클로날 항체 (작동제, 길항제, 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-항체, 및 항체 단편 (단, 천연 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고/하거나 본 발명의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 나타내는 경우에 한함)을 명확하게 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 항체는 올리고머 형태의 표적 단백질, 예를 들어, 삼량체 형태에 결합한다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 단백질에 특이적으로 결합하고, 이러한 결합은 본 발명의 모노클로날 항체 (예를 들어, 기탁된 본 발명의 항체 등)에 의해 억제될 수 있다. 항체의 "기능성 단편 또는 이의 유사체"라는 구절은 언급되는 항체와 공통적인 정성적 생물학적 성질이 있는 화합물이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 기능성 단편 또는 유사체는 VEGF 또는 알파5베타1에 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 세포 증식을 유도하는 VEGF의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％의 항체를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 서열분석기 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체성(heterotetrameric) 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 칭해지는 추가적인 폴리펩티드와 함께 기본적인 이종사량체 단위 5개로 구성되는 항체이고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하고, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 사슬과 함께 기본적인 4쇄 단위 2-5개를 포함하는 다가의 조립체(assemblage)를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형(isotype)에 따라 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적인 간격의 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VH)이 있고, 여기에 α 및 γ 사슬 각각에 대해서는 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해서는 4개의 CH가 이어진다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VL)이 있고, 여기에 불변 도메인 (CL)이 다른쪽 말단에서 이어진다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 첫번째 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL이 함께 쌍을 이루는 것으로 단일 항원-결합 부위가 형성된다. 상이한 클래스의 항체들의 구조 및 성질에 대해서는, 예를 들어, [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994]의 71면 및 제6장 참조.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 여러 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 부류가 있다: 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서의 비교적 작은 차이를 기초로 서브클래스로 추가로 분류되고, 예를 들어, 인간은 하기의 서브클래스를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편의 서열이 항체들 간에서 크게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 아미노산 약 110개 길이에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 길이가 각각 아미노산 9-12개인 "초가변 영역"으로 칭해지는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리되는 아미노산 15-30개의 프레임워크(framework) 영역 (FR)으로 칭해지는 비교적 불변성인 신축물로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 베타-시트 배열이 채택된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체 의존적 세포형 세포 독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 주변, 및 VH 내의 대략 잔기 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 주변 (한 실시양태에서, H1은 대략 31-35 주변에 있다); [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, VL 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 VH 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 일반적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵생물 동물 또는 식물 세포에서의 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한 "모노클로날 항체"는, 예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)], [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)], 및 하기의 실시예에 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 본 발명의 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서의 당해 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화(primitized)" 항체가 포함된다.
"무손상" 항체는 항원-결합 부위, 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; [Zapata, et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"선형 항체"라는 표현은 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기술된 항체를 일반적으로 지칭한다. 간략하게, 이러한 항체는 한쌍의 직렬 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하고, 이는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1), 및 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH)과 함께 전체적인 L 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이고, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가의 항원-결합 활성을 갖는 디술피드로 연결된 2개의 Fab 단편에 대략 상응하고, 여전히 항원과 가교될 수 있는 단일한 대형 F(ab')2 단편이 산출된다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에 추가적인 몇개의 잔기들이 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인이 사이에 있는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 양쪽 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 또한 이러한 영역은 특정 세포 유형 상에서 발견된 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 지닌 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 영역 가변 도메인이 단단하게 비공유결합적으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 이러한 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로 또한 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관을 위해서는, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrebaeck 1995, 하기 문헌] 참조.
용어 "디아바디"는 V 도메인들이 사슬내 쌍을 이루지 않고 사슬간 쌍을 이루어서, 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위가 있는 단편이 생성되도록 VH과 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)가 있는 sFv 단편 (이전 단락 참조)을 구축함으로써 제조된 소형 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디이바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 2개의 "교차" sFV 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화력 및 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의로 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조.
"종-의존적 항체"는 제1 포유류 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화력이 제2 포유류 종으로부터의 이러한 항원의 유사체에 대한 것보다 강한 항체이다. 일반적으로, 종-의존적 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"하지만 (즉, 결합 친화력 (Kd) 값이 약 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1×10-8 이하, 가장 바람직하게는 약 1×10-10 M 이하이지만), 제2의 비-인간 포유류 종으로부터의 항원의 유사체에 대한 결합 친화력은 인간 항원에 대한 결합 친화력에 비해 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 더 약하다. 종-의존적 항체는 상기 기술된 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 임의의 것일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
이같은 실시양태에서, 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물이 "비-표적" 단백질에 결합하는 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)에 의해 결정 시 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물이 이의 특정한 표적 단백질에 결합하는 것의 약 10％ 미만일 것이다. 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물이 표적 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 이에 "특이적으로 결합한다" 또는 이에 대해 "특이적이다"라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 결합 활성이 없는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어, 과량의 표지되지 않은 표적과의 경쟁에 의해 특이적 결합이 결정될 수 있다. 이러한 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이 지시된다. 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 이에 "특이적으로 결합한다" 또는 이에 대해 "특이적이다"라는 용어는, 예를 들어, 표적에 대한 Kd가 적어도 약 10-4 M, 별법적으로 적어도 약 10-5 M, 별법적으로 적어도 약 10-6 M, 별법적으로 적어도 약 10-7 M, 별법적으로 적어도 약 10-8 M, 별법적으로 적어도 약 10-9 M, 별법적으로 적어도 약 10-10 M, 별법적으로 적어도 약 10-11 M, 별법적으로 적어도 약 10-12 M, 또는 그 이상인 분자에 의해 표시될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 의해 변한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다. "천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. Fc 서열의 예가 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기술되어 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 본원에서 정의된 바와 같은 "아미노산 변형"에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역에는 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환이 있고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환이 있다. 한 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과의 상동성이 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％일 것이다. 또다른 실시양태에 따르면, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％일 것이다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 및 항체 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성" 또는 "상동성"은 서열들을 정렬한 후의 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 임의의 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로 간주된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 소스 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작국 (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 면역부착소 (하기의 정의 참조)와 같은 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)이, 예를 들어, 폴리펩티드의 정제 동안, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합에 의해 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역 있는 폴리펩티드 (항체 포함)를 포함하는 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 폴리펩티드 집단, 또는 K447 잔기가 있는 폴리펩티드와 K447 잔기가 없는 폴리펩티드의 혼합물이 있는 항체 집단을 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 가변 도메인 (대략, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113) 내의 잔기를 지칭할 때 캐벗(Kabat) 번호매김 시스템이 일반적으로 사용된다 (예를 들어, [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 번호매김 시스템" 또는 "EU 지수"은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 일반적으로 사용된다 (예를 들어, 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서 보고된 EU 지수). 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 캐벗 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]의 개관 참조). 이 용어는 동종이형, 예컨대 FcγRIIIA 동종이형인 FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131을 포함한다. FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 개관되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 지칭한다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로불린에 비공유결합적으로 결합된 α-사슬로 구성된다. 신생아 Fc 수용체 FcRn의 다양한 기능이 [Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766]에 개관되어 있다. FcRn은 모체로부터 아이로의 면역글로불린 IgG의 수동 전달 및 혈청 IgG 수준의 조절에서 기능을 한다. FcRn은 세포내에서 및 세포를 가로지르는 무손상 형태의 세포흡수된(pinocytosed) IgG에 결합하고 이를 전달하여, 디폴트(default) 분해 경로로부터 이를 구출하는 샐비지(salvage) 수용체로 작용할 수 있다.
WO00/42072 (Presta) 및 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 간행물의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인" ("C1" 또는 "H1" 도메인으로 또한 지칭됨)은 일반적으로 대략 아미노산 118에서 대략 아미노산 215까지에 이른다 (EU 번호매김 시스템).
"힌지 영역"은 인간 IgG1의 Glu216에서 Pro230까지 이르는 것으로 일반적으로 정의된다 ([Burton, Molec. Immunol. 22:16l-206 (1985)]). 기타 IgG 이소타입의 힌지 영역은, 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 시스테인 잔기와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓음으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 힌지 영역에 대해 바로 C-말단인 잔기들, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239의 신축물로서 보통 정의된다. 이전의 보고서에서, FcR 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 기인하였다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("C2" 또는 "H2" 도메인으로 또한 지칭됨)은 통상적으로 대략 아미노산 231에서 대략 아미노산 340까지에 이른다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍 형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는 것을 도울 수 있는 것으로 추측되었다. [Burton, Molec. Immunol. 22:16l-206 (1985)].
"CH3 도메인" ("C2" 또는 "H3" 도메인으로 또한 지칭됨)은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기들의 신축물을 포함한다 (즉, 항체 서열의 대략 아미노산 잔기 341에서 C-말단까지, 전형적으로는 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 지닌다. 대표적인 "이펙터 기능"에는 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이같은 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 일반적으로 필요로 하고, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 다양한 분석법을 이용하여 평가될 수 있다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. 2개의 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 함께 C1q는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는, 예를 들어, Quidel (San Diego, CA)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 또다른 분자에 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합 도메인은 Fc 영역과 결합하는 것을 담당하는 이의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, 이의 알파 사슬)의 일부를 포함할 수 있다. 한 유용한 결합 도메인은 FcR 알파 사슬의 세포외 도메인이다.
FcR 결합 친화력 또는 ADCC 활성이 "변경된" 변이체 IgG Fc가 있는 항체 또는 펩티바디는 어버이 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 증강되거나 저하된 FcR 결합 활성 (FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 하나 이상의 FcR과 어버이 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc보다 더 높은 친화력 (예를 들어, 더 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)으로 결합한다. 일부 실시양태에 따르면, 어버이 폴리펩티드와 비교하여 결합에서의 개선은 약 3배, 바람직하게는 약 5배, 10배, 25배, 50배, 60배, 100배, 150배, 200배, 500배까지, 또는 약 25％ 내지 1000％의 결합에서의 개선일 수 있다. FcR에 대한 "감소된 결합성을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 FcR과 어버이 폴리펩티드보다 더 낮은 친화력 (예를 들어, 더 높은 겉보기 Kd 또는 더 높은 IC50 값)으로 결합한다. 어버이 폴리펩티드와 비교하여 결합에서의 감소는 결합에서의 약 40％ 이상의 감소일 수 있다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 IgG가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이어서 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고, 이같은 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 하기의 실시예에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기술된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
야생형 IgG Fc가 있는 폴리펩티드 또는 어버이 폴리펩티드보다 더 효과적으로 인간 이펙터 세포의 존재하에 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 매개하거나 "증가된 ADCC를 나타내는" 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 분석법에서 변이체 Fc 영역이 있는 폴리펩티드와 야생형 Fc 영역이 있는 폴리펩티드 (또는 어버이 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 시험관 내에서 또는 생체내에서 ADCC를 매개하는데 있어서 실질적으로 더 효과적인 것이다. 일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석법을 사용하여 이같은 변이체가 확인되지만, ADCC 활성을 예를 들어 동물 모델 등에서 결정하는 기타 분석법 또는 방법이 구현된다. 한 실시양태에서, 바람직한 변이체는 ADCC를 매개하는데 있어서 야생형 Fc (또는 어버이 폴리펩티드)보다 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25배 내지 약 50배 더 효과적이다.
"보체-의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적합한 서브클래스의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 한 실시양태에 따르면, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되고, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 이의 천연 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있을 뿐만 아니라 (예를 들어, [Ghetie 1997], [Hinton 2004] 참조), 하기의 실시예에 기술되어 있다. 생체 내에서의 인간 FcRn에 대한 결합, 및 인간 FcRn에 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 예를 들어, 인간 FcRn를 발현하는 형질감염된 인간 세포주 또는 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석할 수 있다. 한 실시양태에서, 특히, 변이체 IgG Fc가 있는 본 발명의 항-알파5베타1 항체가 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 100배, 적어도 125배, 적어도 150배만큼 야생형 IgG Fc가 있는 폴리펩티드에 비해 증가된 인간 FcRn에 대한 결합 친화력을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 인간 FcRn에 대한 결합 친화력이 약 170배 증가된다.
FcRn에 대한 결합 친화력에 대해, 한 실시양태에서 폴리펩티드의 EC50 또는 겉보기 Kd (pH 6.0)는 1 μM 미만, 더욱 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하이다. 한 실시양태에서, FcγRIII (F158; 즉, 저-친화력 이소형)에 대한 증가된 결합 친화력에 대해, EC50 또는 겉보기 Kd는 10 nM 이하이고, FcγRIII (V158; 고-친화력 이소형)에 대해서는, EC50 또는 겉보기 Kd가 3 nM 이하이다. 또다른 실시양태에 따르면, 대조군 항체 (예를 들어, 헤르셉틴(Herceptin)® 항체)와 비교하여 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 감소는 테스트 항체 및 대조군 항체 결합 곡선의 중간점에서의 흡광도 값의 비율 (예를 들어, A450 nm (항체)/A450 nm (대조군 항체))가 40％ 이하이면 대조군 항체에 비해 유의한 것으로 간주될 수 있다. 또다른 실시양태에 따르면, 대조군 항체 (헤르셉틴® 항체)와 비교하여 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 증가는 테스트 항체 및 대조군 항체 결합 곡선의 중간점에서의 흡광도 값의 비율 (예: A450 nm (항체)/A450 nm (대조군 항체))가 125％ 이상이면 대조군 항체에 비해 유의한 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 실시예 16 참조.
"어버이 폴리펩티드" 또는 "어버이 항체"는 이로부터 변이체 폴리펩티드 또는 항체가 유발되고 이에 대항하여 변이체 폴리펩티드 또는 항체가 비교되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체이다. 전형적으로, 어버이 폴리펩티드 또는 어버이 항체는 하나 이상의 본원에 개시된 Fc 영역 변형이 없고, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 변이체와 비교하여 이펙터 기능이 상이하다. 어버이 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 선재성(pre-existing) 아미노산 서열 변형 (예컨대 부가, 결실 및/또는 치환)이 있는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 파지 디스플레이로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용된 "라이브러리"는 다수의 항체 또는 항체 단편 서열, 또는 이러한 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하고, 이때 서열들은 본 발명의 방법에 따라 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에서 상이하다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드가 파지, 예를 들어 필라멘트형 파지 입자의 표면 상에 코트 단백질의 적어도 일부분에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다. 파지 디스플레이의 활용은 무작위화된 단백질 변이체들의 대형 라이브러리가 표적 항원에 높은 친화력으로 결합하는 서열들에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 의존한다. 파지 상의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적인 결합 성질이 있는 것에 대해 수백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법이 필라멘트형 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII에 대한 융합을 통해 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하는데 사용되었다. [Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992)], 및 이에 인용된 참고문헌. 1가 파지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리가 유전자 III 또는 이의 일부분에 융합되고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재 하에 낮은 수준으로 발현되어, 파지 입자가 융합 단백질의 1개의 카피를 디스플레이하거나 융합 단백질을 디스플레이하지 않는다. 결합(avidity) 효과가 다가 파지에 비해 감소되어, 분류는 고유의 리간드 친화력을 기초로 하고, DNA 조작을 단순하게 하는 파지미드 벡터가 사용된다. [Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991]).
"파지미드"는 박테리아 복제 기원, 예를 들어, Co1E1, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피가 있는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 필라멘트형 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지가 포함되는 임의의 공지된 박테리오파지 상에서 사용될 수 있다. 플라스미드는 항생제 저항성에 대한 선택성 마커를 또한 일반적으로 함유할 것이다. 이러한 벡터 내로 클로닝되는 DNA의 절편이 플라스미드로 증식될 수 있다. 이러한 벡터가 있는 세포에 파지 입자의 생산에 필요한 모든 유전자가 제공되면, 플라스미드의 복제 방식이 회전원 복제로 바뀌어서, 플라스미드 DNA의 한 가닥의 카피들이 생성되고 파지 입자가 패키징된다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는 이종성 폴리펩티드가 파지 입자의 표면에 디스플레이되도록 유전자 융합물로서 이종성 폴리펩티드 유전자에 연결된 파지 코트 단백질 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 파지미드를 포함한다.
용어 "파지 벡터"는 이종성 유전자를 함유하고 복제될 수 있는 박테리오파지의 이중 가닥 복제 형태를 의미한다. 파지 벡터에는 파지가 복제되고 파지 입자가 형성되도록 하는 파지 복제 기원이 있다. 파지는 바람직하게는 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13, f1, fd, PB 파지 또는 이의 유도체, 또는 람다형 파지, 예컨대 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 등, 또는 이의 유도체이다.
펩티바디, 면역부착소, 항체 및 짧은 펩티드와 같은 폴리펩티드의 공유결합 변형이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 공유결합 변형의 한 유형은 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제로의 유도체화가, 예를 들어, 폴리펩티드를 항체의 정제 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시키거나, 또는 역으로 사용하기에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제에는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)가 포함되는 동종이관능성(homobifunctional) 이미도에스테르, 이관능성 말레이미드 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제가 포함된다.
기타 변형으로는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화 ([T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화가 포함된다.
기타 변형에는 마이탄신 및 마이탄시노이드, 칼리키아마이신 및 기타 세포독성제와 같은 독소에 대한 길항제의 접합이 포함된다.
폴리펩티드의 또다른 유형의 공유결합 변형은 폴리펩티드를, 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로, 다양한 비-단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는, 유리하다면, 또다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열 (예를 들어, 면역부착소 또는 펩티바디)에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 또한 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 키메라 분자는 폴리펩티드와 폴리펩티드를 다양한 조직에의 전달, 더욱 특히 혈뇌 장벽을 가로지르는 전달에 표적화하는 단백질 도입 도메인의 융합물을 포함하고, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 TAT 단백질의 단백질 도입 도메인이 사용된다 ([Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72]).
또다른 실시양태에서, 이같은 키메라 분자는 폴리펩티드와 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드의 융합물을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 놓인다. 이같은 에피토프 태그가 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재를 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하여 친화성 정제에 의해 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있도록 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체가 당업계에 주지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; 인플루엔자 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 ([Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E1O, G4, B7 및 9E10 항체 ([Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 ([Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])가 포함된다. 기타 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 ([Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 ([Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); α-튜불린 에피토프 펩티드 ([Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 ([Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])가 포함된다.
별법적인 실시양태에서, 키메라 분자는 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합물을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 (예를 들어, "면역부착소")에 대해서, 이같은 융합물은 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 Ig 융합물은 Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 영역 대신에 대략 인간의 잔기 94-243, 잔기 33-53 또는 잔기 33-52를 포함하거나 이들만을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합물은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합물의 생산을 위해서는, 미국 특허 번호 5,428,130 (1995년 6월 27일 허여)를 또한 참조.
본 발명은 재발 종양 성장 또는 재발 암 세포 성장을 억제하거나 방지하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 암은 암 세포의 수가 유의하게 감소되지 않았거나 증가되었거나, 또는 종양 크기가 유의하게 감소되지 않았거나 증가되었거나, 또는 암 세포의 수 또는 크기에서 추가적으로 감소되지 못한 재발 종양 성장 또는 재발 암 세포 성장이다. 암 세포가 재발 종양 성장 또는 재발 암 세포 성장인지를 결정하는 것은 암 세포에 대한 치료의 유효성을 평가하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 항-VEGF 치료에 저항성인 종양은 재발 종양 성장의 예이다.
본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 달성하는데 충분한 양이다. "유효량"은 경험적으로, 그리고 언급된 목적과 관련된 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 포유류 (환자로 또한 알려짐)에서의 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 길항제의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고/있거나; 주변 기관 내로의 암세포 침윤을 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고/있거나; 암과 관련된 증상들 중 1가지 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 성장을 방지할 수 있고/있거나 기존의 암 세포를 사멸시킬 수 있다는 점에서, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료적 유효량은 성장 억제성 양이다. 또다른 실시양태에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장하는 양이다. 또다른 실시양태에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선시키는 양이다.
상처 치유의 경우에, 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 대상에서의 상처 치유를 가속화시키거나 개선시키는데 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 치료 용량은 환자에 대한 치료 효과를 나타내는 용량이고, 효과미달(sub-therapeutic) 용량은 치료된 환자에 대한 치료 효과를 나타내지 않는 용량이다.
"만성 상처"는 치유되지 않는 상처를 지칭한다. 예를 들어, [Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994)] 참조. 만성 상처에는, 예를 들어, 동맥 궤양, 당뇨병성 궤양, 압력 궤양, 정맥성 궤양 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 급성 상처가 만성 상처로 발달될 수 있다. 급성 상처에는 열 손상, 외상, 수술, 광범위한 피부암의 적출, 심재성 진균 및 박테리아 감염, 혈관염, 경피증, 천포창, 독성 표피 괴사용해 등에 의해 예를 들어 야기되는 상처가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com (2001년 10월 24일 공개)] 참조. "일반적인 상처"는 일반적인 상처 치유 복구가 진행되는 상처를 지칭한다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제성 양"은 시험관내에서 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 목적의 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제성 양"은 경험적으로, 그리고 공지된 방법 또는 본원에서 제공된 예에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "세포독성 양"은 시험관내에서 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포의 파괴를 야기할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 목적의 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "세포독성 양"은 경험적으로, 그리고 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서의 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직 또는 이의 공동-분리물 또는 발현물로부터 발생하고 이에 대해 지시되는 질환 또는 장애, 또는 이로부터 초래되는 용태이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 관절염 (류머티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 만성 류머티스 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 유년 발병형 류머티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과증식성 피부 질환, 건선 예컨대 판상 건선, 물방울 건선, 농포성 건선, 및 손톱의 건선, 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염 및 아토피성 피부염이 포함되는 피부염, x-연관 고 IgM 증후군, 만성 자가면역성 두드러기가 포함되는 두드러기 예컨대 만성 특발성 두드러기, 다발근염/피부근염, 유년형 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (전신성 경피증 포함), 경화증 예컨대 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS) 예컨대 척수-시각(spino-optical) MS, 원발성 진행성 MS 및 재발-완화형 MS, 진행성 전신성 경화증, 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 파종성 경화증, 및 운동실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 결장염 예컨대 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 전층 결장염, 및 자가면역성 염증성 장 질환), 괴저 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이 포함되는 호흡 곤란 증후군, 수막염, 포도막 전체 또는 일부분의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역성 혈액 장애, 류머티스 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개 질환 예컨대 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염 예컨대 라스무센(Rasmussen) 뇌염 및 변연계 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염, 또는 자가면역성 포도막염, 콩팥 증후군을 수반한 및 수반하지 않는 사구체신염 (GN) 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염 예컨대 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신장병증), 특발성 막성 GN, 막성 증식성 GN (MPGN) (제I형 및 제II형 포함), 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 용태, 알레르기성 반응, 알레르기성 또는 아토피성 습진이 포함되는 습진, 천식 예컨대 기관지성 천식, 및 자가면역성 천식, T 세포 침윤 및 만성 염증성 응답이 수반되는 용태, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 예컨대 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신, 원판상, 탈모증 포함), 소아 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM)이 포함되는 유년 발병형 (제I형) 진성 당뇨병, 성인 발병형 진성 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역성 당뇨병, 특발성 요붕증, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 응답, 결핵, 사르코이드증, 림프종모양 육아종증이 포함되는 육아종증, 베게너 육아종증, 과립구결핍증, 혈관염 (대혈관 혈관염 (류머티스성 다발근육통증 및 거대 세포(타카야스(Takayasu) 관절염 포함), 중혈관 혈관염 (가와사키(Kawasaki) 병 및 결절성 다발동맥염 포함), 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사성, 피부 또는 과민성 혈관염, 전신성 괴사성 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예컨대 추르크-스트라우스 (Churg-Strauss) 혈관염 또는 증후군 (CSS) 포함)이 포함되는 혈관병증, 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 재생불량성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판(Diamond Blackfan) 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈 (AIHA)이 포함되는 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 애디슨(Addison) 질환, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출이 수반되는 질환, CNS 염증성 장애, 다발성 기관 손상 증후군 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 2차적인 것, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트(Bechet) 또는 베세트(Behcet) 질환, 캐슬맨(Castleman) 증후군, 굿패스처(Goodpasture) 증후군, 레이노(Raynaud) 증후군, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 유사천포창 예컨대 수포성 유사천포창 및 피부 유사천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유사천포창 천포창, 및 홍반성 천포창 포함), 자가면역성 다발내분비병증, 라이터(Reiter) 질환 또는 증후군, 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 만성 신경병증 예컨대 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈전성 혈소판감소성 자색반 (TTP), 및 자가면역 또는 면역-매개 저혈소판증 예컨대 특발성 혈소판감소성 자색반 (ITP) (급성 또는 만성 ITP 포함)이 포함되는 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발달되는 바와 같음), 자가면역성 고환염 및 난소염이 포함되는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선 기능저하증, 부갑상선 기능저하증, 갑상선염 예컨대 자가면역성 갑상선염, 하시모토(Hashimoto) 질환, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염이 포함되는 자가면역성 내분비계 질환, 자가면역성 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능저하증, 그레이브(Grave) 질환, 다분비선 증후군 예컨대 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 신경학적 부신생물성 증후군 예컨대 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군이 포함되는 부신생물성 증후군, 근육 강직 증후군, 뇌척수염 예컨대 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근육긴장증, 안간대 또는 안간대 간대성근경련 증후군 (OMS), 및 감각성 신경병증, 쉬한(Sheehan) 증후군, 자가면역성 간염, 만성 간염, 루포이드 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 림프구성 간질성 폐렴, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 베르거(Berger) 질환 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선형 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변, 폐경화증, 자가면역성 장병증 증후군, 복부 질환, 복강 질환, 비열대성 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭(Lou Gehrig) 질환), 관상 동맥 질환, 자가면역성 내이 질환 (AIED), 또는 자가면역성 난청, 안간대 간대성근경련 증후군 (OMS), 다발연골염 예컨대 불응성 또는 재발된 다발연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 미확정의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 부신생물성 증후군, 채널병증 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비계 눈병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역성 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비계 기능부전, 슈미트(Schmidt) 증후군, 부신염, 위선 위축, 초로성 치매, 말이집탈락 질환 예컨대 자가면역성 말이집탈락 질환, 당뇨병성 신장병증, 드레슬러(Dressler) 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 손발가락 경화증 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성의 자가면역성 불임, 혼합형 결합 조직 질환, 샤가스(Chagas) 질환, 류머티스성 열, 재발성 유산, 농부의 폐, 다형 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱(Cushing) 증후군, 조류 사육자의 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트(Alport) 증후군, 폐포염 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 키파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터(Sampter) 증후군, 캐이플란(Caplan) 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 확산성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만(Shulman) 증후군, 펠티(Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염 예컨대 만성 섬모체염, 헤테로크로닉(heterochronic) 섬모체염, 홍채섬모체염, 또는 푹스(Fuch's) 섬모체염, 헤노흐-쉔라인(Henoch-Schonlein) 자반병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머 질환, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반(Evan) 증후군, 자가면역성 생식선 기능부전, 시덴햄(Sydenham) 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수 매독, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통증, 내분비계 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건성 각막결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 콩팥 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가족성 및 허혈성 재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 무정자형성, 자가면역성 용혈, 뵈크(Boeck) 질환, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌(Dupuytren) 구축, 수정체과민증성 안구내염, 알레르기성 장염, 나성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 열병성 류마티스, 해먼-리치(Hamman-Rich) 질환, 감각신경성 난청, 발작성 헤모글로불린혈증, 생식선 기능저하증, 국소성 회장염, 백혈구감소증, 전염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저 농피증, 쿼베인(Quervain) 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항-정자 항체로 인한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바르 바이러스-관련 질환, 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 건선성 질환 예컨대 리슈만편모충증, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤이 수반되는 용태, 백혈구-부착 결핍, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 응답, 백혈구 누출이 수반되는 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역성 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역성 위축성 위염, 교감성 안염, 류머티스성 질환, 혼합형 결합 조직 질환, 콩팥 증후군, 췌도염, 다내분비선 기능부전, 말초 신경병증, 제I형 자가면역성 다분비선 증후군, 성인-발병형 특발성 부갑상선 기능저하증 (AOIH), 전체 탈모증, 확장형 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 콩팥 증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 전두, 상악 또는 접형 부비동염, 호산구-관련 장애 예컨대 호산구증, 폐 침윤 호산구증, 호산구증-근육통 증후군, 로플러(Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증, 기관지폐성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 함유하는 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절병증, 다내분비선 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤(Bruton) 증후군, 영아의 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 실조성 모세혈관확장증, 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 질환, 류머티즘, 신경학적 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 응답에서의 감소, 혈관성 기능이상, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관계 허혈, 통각과민, 뇌 허혈, 및 혈관화가 동반되는 질환, 알레르기성 과민증 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 기타 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분이 있는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증성 장애, 과립구 수혈-관련 증후군, 사이토카인-유도 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 대동맥 장애, 동맥내 과다형성, 소화궤양, 판막염, 및 자궁내막증이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
암 치료는, 예를 들어, 종양 퇴화, 종양 중량 또는 크기 축소, 진행까지의 시간, 생존 기간, 무진행 생존, 전체적인 응답 속도, 응답 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 항-혈관형성성 작용제는 종양 혈관구조를 표적으로 하고, 반드시 신생물성 세포 자체를 표적으로 하지는 않기 때문에, 독특한 부류의 항암 약물을 나타내고, 따라서 약물에 대한 임상 응답의 독특한 대책 및 정의를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 2차원 분석에서 50％를 초과하는 종양 축소가 응답을 선언하는 표준 컷-오프(cut-off)이다. 그러나, 본 발명의 알파5베타1 길항제 및 VEGF 길항제는 1차 종양의 축소 없이 전이성 확산의 억제를 야기할 수 있거나, 또는 단순히 종양정지성(tumouristatic) 효과를 발취할 수 있다. 따라서, 혈관형성의 혈장 또는 소변 마커의 측정 및 방사선학적 영상화를 통한 응답의 측정을 예를 들어 포함하는, 치료법의 효능을 결정하는 접근법을 사용할 수 있다.
치료될 적응증, 및 당업자에게 친숙할 투약과 관련된 인자에 따라, 본 발명의 항체는 독성 및 부작용을 최소화하면서 이러한 적응증의 치료에 효능이 있는 투여량으로 투여될 것이다. 암, 자가면역 질환 또는 면역결핍 질환의 치료를 위해, 치료적으로 효과적인 투여량은, 예를 들어, 50 ㎎/용량 내지 2.5 g/㎡ 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 투여되는 투여량은 약 250 ㎎/㎡ 내지 400 ㎎/㎡ 또는 500 ㎎/㎡이다. 또다른 실시양태에서, 투여량은 약 250-375 ㎎/㎡이다. 또다른 실시양태에서, 투여량 범위는 275-375 ㎎/㎡이다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)에 대한 치료는 추가적인 시력 상실 속도에서의 감소 또는 추가적인 시력 상실의 방지에 의해 평가될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. AMD 치료법에 대해, 생체내 효능을, 예를 들어, 하기의 것들 중 하나 이상에 의해 측정할 수 있다: 기준선에서 원하는 시간까지의 최대 교정 시력 (BCVA)에서의 평균 변화를 평가하는 것, 기준선과 비교하여 원하는 시간에 시력에서 15개 미만의 문자를 잃은 대상의 비율을 평가하는 것, 기준선과 비교하여 원하는 시간에 시력에서 15개 이상의 문자를 얻은 대상의 비율을 평가하는 것, 원하는 시점에 스넬렌(Snellen) 시력이 20/2000 이하인 대상의 비율을 평가하는 것, NEI 시기능 질문서(Visual Functioning Questionnaire)를 평가하는 것, 원하는 시간에 CNV의 크기 및 CNV의 누출량을 평가하는 것 (플루오레세인 혈관 조영술에 의해 평가) 등.
용어 "검출"은 물질의 존재 또는 부재를 결정하는 것 또는 물질의 양을 정량하는 것을 포함하도록 의도된다. 따라서 이 용어는 정성정 및 정량적 결정을 위한 본 발명의 물질, 조성물 및 방법의 용도를 지칭한다. 일반적으로, 검출에 사용된 특정 기술은 본 발명에 실행에 결정적이지 않다.
예를 들어, 본 발명에 따른 "검출"은 알파5 유전자 산물, mRNA 분자, 또는 알파5 폴리펩티드의 존재 또는 부재; 알파5 폴리펩티드의 수준 또는 표적에 결합된 양에서의 변화; 알파5 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성에서의 변화를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "검출"은 야생형 알파5 수준 (예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드 수준)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 대조군과 비교하여 10％ 내지 90％ 사이의 임의의 값, 또는 30％ 내지 60％ 사이의 임의의 값, 또는 100％ 초과의 변화 (증가 또는 감소)를 정량하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 2배 내지 10배 사이 사이의 임의의 값 (경계 포함), 또는 그 이상, 예를 들어, 100배의 변화를 정량하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 단어 "표지"는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
신규 항-알파5베타1 항체
인간 알파5베타1에 결합할 수 있고 항-알파5베타1 항체가 인간 알파5베타1에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있는 신규 항체가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에 따르면, 항-알파5베타1 항체는 2006년 3월 7일에 ATCC에 알파5/베타1 7H5.4.2.8로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7421) 및 알파5/베타1 7H12.5.1.4로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7420)로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 2006년 3월 7일에 ATCC에 알파5/베타1 7H5.4.2.8로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7421) 및 알파5/베타1 7H12.5.1.4로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7420)로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 2006년 3월 7일에 ATCC에 알파5/베타1 7H5.4.2.8로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7421)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 2006년 3월 7일에 ATCC에 알파5/베타1 7H12.5.1.4로 기탁된 하이브리도마 (ATCC 번호 PTA-7420)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인 서열을 포함한다. 기탁된 하이브리도마의 항체의 인간 또는 키메라 형태가 또한 구현된다.
한 실시양태에 따르면, 항체는 인간 알파5베타1에 500 nM 내지 1 pM 사이의 Kd로 결합한다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 알파V베타3 또는 알파V베타5 또는 알파V베타1에 결합하지 않는다. 또다른 실시양태에 따르면, 항체는 인간 IgG, 예를 들어, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 Fc 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, Fc 서열은 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합에 종종 관련되는 항체 의존적 세포형 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능이 결여되도록 변경되거나 또다른 방식으로 변화되었다. 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는 Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이의 다수의 예가 존재한다. 예를 들어, WO00/42072 (Presta) 및 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 간행물들의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아바디 및 선형 항체의 형태일 수 있다. 또한, 항체는 알파5베타1에 결합하고 알파5베타1 길항제이지만, 또한 하나 이상의 다른 표적 (예를 들어, VEGF)에 결합하여 이의 기능을 억제하는 다중-특이적 항체일 수 있다. 항체는 치료제 (예를 들어, 세포독성제, 방사성 동위원소 및 화학요법제), 또는 영상화에 의해 환자 샘플 또는 생체 내의 알파5베타1을 검출하기 위한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 염료 및 효소)에 접합될 수 있다.
항-알파5베타1 항체를 코딩하는 핵산 분자, 가변 도메인 중 하나 또는 양쪽 모두를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 이 핵산 분자를 포함하는 세포가 또한 구현된다. 이러한 항체는 본원에 기술된 치료법에서, 그리고 환자 샘플 (예를 들어, FACS, 면역조직화학 (IHC), ELISA 분석법) 또는 환자 내의 알파5베타1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
신규 조합물
VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 포함하는, 질환을 앓고 있는 대상에서 혈관형성 및/또는 혈관 투과성을 억제하기 위한 신규 조합물. VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제는 동시 또는 순차적 치료 사이클에서 투여될 수 있다. 이같은 조합 치료는 비정상적인 혈관형성 및/또는 혈관 투과성이 있고 항-혈관형성 치료법이 이로울 질환들을 포함하는 질환을 치료하는데 유용하다. 이같은 질환에는 암, 안구 질환, 및 자가면역 질환이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 별법적으로, 대상이 VEGF 길항제로 치료되고, 순차적으로 알파5베타1 길항제가 투여될 수 있고, 예를 들어, 대상이 VEGF 길항제 치료에 무응답성일 때까지 VEGF 길항제로 치료한 후, 대상을 알파5베타1 길항제로 치료한다. 한 실시양태에 따르면, 대상은 암이 비-침습성일 때 VEGF 길항제로 치료된 후, 암이 침습성일 때 알파5베타1 길항제로 치료된다. 질환이 없는 환자 또는 대조군과 비교하여, 자연적으로 또는 VEGF 길항제 치료법에 응답하여 알파5베타1 수준이 상승된 일부 환자가 이러한 조합 치료에 특히 응답성일 수 있다. 치료제 (예를 들어, 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제)를 추가로 포함하는 조합물이 구현된다. 예를 들어, 화학요법 (예를 들어, 이리노테칸) 및 알파5베타1 길항제로 치료될, 또는 화학요법 및 알파5베타1 길항제로 치료된 환자에게 VEGF 길항제 치료법이 이로울 수 있다. 별법적으로, 화학요법 및 VEGF 길항제로 치료된 환자에게 알파5베타1 길항제 치료법이 이로울 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 아바스틴® 항체이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 항-알파5베타1 항체는 본원에 기술된 항-알파5베타1 항체이다. VEGF 길항제, 알파5베타1 길항제 및, 임의로, 화학요법제를 포함하는 키트가 구현된다.
제약 제형
본 발명에 따라 사용된 항체의 치료용 제형은, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관용으로 제조된다 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 산화방지제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루노닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 대표적인 항체 제형이 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된 WO98/56418에 기술되어 있다. 피하 투여를 위해 채택된 동결건조 제형이 WO97/04801에 기술되어 있다. 이같은 동결건조 제형은 적절한 희석제로 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제형이 본원에서 치료될 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요한 경우 2가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 또는 면역억제제 (예를 들어 T 세포 상에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예를 들어, LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이같은 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 길항제의 양, 질환 또는 장애 또는 치료 유형, 및 기타 상기 논의된 인자에 따라 좌우된다. 이들은 본원에서 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99 ％로 일반적으로 사용된다.
활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
제조품 및 키트
본 발명의 또다른 실시양태는 종양, 눈 질환 또는 자가면역 질환 및 관련 용태의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 용태의 치료에 효과적인 조성물을 보유하며, 무균성 접근 포트(port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 1가지 이상의 활성 작용제는 본 발명의 VEGF 길항제 또는 알파5베타1 길항제 또는 VEGF 작동제 또는 알파5베타1 작동제이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 용태를 치료하는데 사용된다는 것을 가리킨다. 표지 또는 포장 삽입물은 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기술된 조합 치료법을 포함하는 제조품 및 키트가 또한 구현된다.
포장 삽입물은 치료용 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하고, 이러한 지침서는 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 이같은 치료용 제품의 사용에 관련된 경고에 관한 정보를 함유한다. 한 실시양태에서, 포장 삽입물은 조성물이 비-호지킨 림프종을 치료하는데 사용된다는 것을 가리킨다.
추가적으로, 제조품은 제약상 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
제조품과 임의로 조합된, 다양한 목적, 예를 들어, 환자 내의 알파5베타1 및/또는 VEGF의 단리 또는 검출에 유용한 키트가 또한 제공된다. 알파5베타1의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-알파5베타1 항체를 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 알파5베타1 및/또는 VEGF를 검출 및 정량하기 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품과 같이, 키트는 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 예를 들어, 용기는 하나 이상의 본 발명의 항-알파5베타1 항체를 보유한다. 희석제 및 버퍼, 대조군 항체를 예를 들어 함유하는 추가적인 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명서, 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단 용도를 위한 지침서를 제공할 수 있다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체를, 예를 들어, 하이브리도마 방법, 예컨대 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 것을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 만들 수 있거, 또는 본원에서 실시예 섹션에 기술된 방법에 의해 생산할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터, 또는 기타 적합한 숙주 동물이 전형적으로 면역제로 면역화되어, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구가 도출된다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
전형적으로 면역제는 폴리펩티드 또는 당해 단백질의 융합 단백질 또는 단백질을 포함하는 조성물을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원하는 경우 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유류 공급원을 원하는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구가 불멸화 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포가 형성된다. [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]. 일반적으로 불멸화 세포주는 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에서 하이브리도마 세포가 배양될 수 있다. 예를 들어, 어버이 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 ("HAT 배지"), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 더욱 바람직한 불멸화 세포주는 뮤린 골수종 세포주이고, 이는 예를 들어 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California)> 및 <American Type Culture Collection (Manassas, Virginia)>으로부터 수득할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다. [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63].
그후, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 폴리펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 평가할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 이같은 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화력을, 예를 들어, [Munson and Pollard, Anal. Biochem.. 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. [Goding, 상기 문헌]. 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법적으로, 하이브리도마 세포가 포유동물에서 복수로서 생체내 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기술된 것에 의해 또한 제조될 수 있다. 통상적인 방법 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 쉽게 단리하여 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 또한, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., 상기 문헌]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 DNA가 변형될 수 있다. 이같은 비-면역글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 키메라 2가 항체가 생성될 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄 가교를 방지하도록 중쇄가 일반적으로 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 말단절단된다. 별법적으로, 관련된 시스테인 잔기가 또다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되어 가교를 방지한다.
시험관내 방법이 1가 항체를 제조하는데 또한 적절하다. 단편, 특히 Fab 단편이 생산되도록 항체를 소화시키는 것을 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
인간 및 인간화 항체
항체는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 인간화 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 전형적으로 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열(subsequence))이다. 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)를 포함한다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 수입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 바람직하게는 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].
비-인간 항체를 인간화시키는 일부 방법이 당업계 및 하기 실시예에 기술되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 한 실시양태에 따르면, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, Winter 및 공동 연구자의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시,내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852 참조. 별법적으로, 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 마우스, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 인간 항체가 제조될 수 있다. 접종 시, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 면에서 인간에서 보이는 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016, 및 과학 간행물 [Marks et al., Bio/Technology. 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature. 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature. 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여, 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술의 한 실시양태에 따르면, 항체 V 도메인 서열이 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로, 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 기술된 바와 같이, 또는 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 예를 들어 개관된 바와 같이 수행될 수 있다. V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체가 단리될 수 있다. 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 또한 참조.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 또한 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간 항체가 또한 생산될 수 있다. [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol.. 227: 381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol.. 222: 581 (1991)]. [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991)]의 기술이 인간 모노클로날 항체의 제조에 또한 이용가능하다.
다중-특이적 항체
다중-특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성이 있는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다 (예를 들어, 이중특이적 항체는 2개 이상의 항원에 대한 결합 특이성이 있다). 예를 들어, 결합 특성들 중 하나는 알파5베타1 항체에 대한 것일 수 있고, 다른 하나는 임의의 기타 항원에 대한 것일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 기타 항원은 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 예를 들어, 세포-표면 단백질은 천연 킬러 (NK) 세포 수용체일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 알파5베타1에 결합할 수 있고, VEGF에 결합할 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법의 예가 기술되었다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 중쇄는 특이성이 상이하다. [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(assortment)로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제가 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변-도메인 서열에 융합될 수 있다. 바람직하게는 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공동-형질감염시킨다. 이중특이적 항체의 생성을 위한 추가적인 상세한 내용에 대해서, 예를 들어, [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)] 참조.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생산하였다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조.
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
이종접합체 항체
이종접합체 항체는 공유결합으로 연결된 2개의 항체로 구성된다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해서 (미국 특허 번호 4,676,980), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해서 제안되었다. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. 가교결합제가 수반되는 것들을 포함하여 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 항체를 제조할 수 있는 것으로 구현된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및 미국 특허 번호4,676,980에 예를 들어 개시된 것들이 포함된다.
이펙터 기능 조작
암 치료에서의 항체의 유효성이 예를 들어 증강되도록, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력이 개선되고/되거나 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)가 증가될 수 있다. [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조. [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 이종이관능성 가교제를 사용하여 항-종양 활성이 증강된 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을 갖고, 이에 의해 보체용해 및 ADCC 능력이 증강될 수 있는 항체를 조작할 수 있다. [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조.
Fc 영역 서열에서의 돌연변이 또는 변경이 이루어져 FcR 결합 (예를 들어, Fc감마R, FcRn)이 개선될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 천연 IgG 또는 어버이 항체와 비교하여 ADCC, CDC 및 개선된 FcRn 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 1가지 이상의 변경된 이펙터 기능이 있다. 여러 유용한 특정 돌연변이가, 예를 들어, [Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604]; [Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490]; 및 WO 공보 WO00/42072에 기술되어 있다
한 실시양태에 따르면, Fc 수용체 돌연변이는 Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 치환이고, 이때 Fc 영역 내의 잔기의 번호매김은 EU 번호매김 시스템을 따른다.
면역접합체
본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 또한 관련된다.
이같은 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 상기에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조.
또다른 실시양태에서, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 결합되지 않은 접합체를 혈액순환으로부터 소거제를 사용하여 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비-표적화에서 사용하기 위해 항체가 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다.
면역리포솜
본원에 개시된 항체는 면역리포솜으로 또한 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기술된 바와 같이 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 규정된 세공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경의 리포솜이 산출된다. 디술피드 상호교환 반응을 통해 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 본 발명의 항체의 Fab' 단편이 리포솜에 접합될 수 있다. 임의로 화학요법제 (예컨대 독소루비신)가 리포솜 내에 함유될 수 있다. [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조.
항체 및 폴리펩티드의 제약 조성물
본원에서 확인된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 뿐만 아니라 상기 논의된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 또다른 분자를 상기 및 하기에 열거된 바와 같은 다양한 장애의 치료를 위해 제약 조성물의 형태로 투여할 수 있다.
리포펙틴 또는 리포솜을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 또는 조성물을 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력이 유지된 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이같은 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조.
본원의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요한 경우 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 이의 기능을 증강시키는 작용제, 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 길항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 데포™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있는 한편, 특정 히드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체 내에서 장기간 동안 유지될 때, 37℃의 수분에 노출된 결과로 항체가 변성되거나 응집하여, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화가 초래될 수 있다. 수반되는 메커니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
진단 용도 및 영상화
폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 표지된 항체, 및 이의 유도체 및 유사체를 본 발명의 폴리펩티드의 발현, 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 및/또는 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 항체를 대상 내로 주입하는 것을 수반하는 진단 분석법 또는 영상화 분석법에서 사용될 수 있다. 본 발명은 (a) 하나 이상의 본 발명의 항체를 사용하여 개체의 세포 (예를 들어, 조직) 또는 체액 내의 폴리펩티드의 발현을 분석하는 단계 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준 발현 수준과 비교하여 분석된 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소가 비정상적인 발현을 가리키는 단계를 포함하는, VEGF 또는 알파5베타1 폴리펩티드의 비정상적인 발현의 검출을 제공한다.
본 발명의 항체는 당업자에 공지된 전통적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 단백질 수준을 분석하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)]; [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하는데 유용한, 또다른 항체를 기초로 하는 방법에는 면역분석법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 방사성 면역분석법 (RIA)이 포함된다. 적절한 항체 분석법 표지는 당업계에 공지되어 있고, 효소 표지, 예컨대 글루코스 산화효소; 방사성 동위원소, 예컨대 요오드 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중 수소 (3H), 인듐 (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc, 99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 크세논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; 루미놀; 및 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 및 바이오틴을 포함한다.
당업계에 공지된 기술을 적용하여 본 발명의 항체를 표지시킬 수 있다. 이같은 기술에는 이관능성 접합제의 사용이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; 및 5,808,003 참조; 이들 각각의 내용은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다).
동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서의 VEGF 및/또는 알파5베타1의 발현 또는 비정상적인 발현과 관련된 질환 또는 장애의 진단은 포유동물 내의 알파5베타1 및/또는 VEGF 분자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, VEGF 길항제를 투여한 후, (a) 포유동물에게 유효량의 표지된 항-알파5베타1 항체를 투여 (예를 들어, 피하, 경피 또는 복강내 투여)하는 단계; (b) 투여 후, 표지된 분자가 대상 내의 알파5베타1 분자가 발현된 부위에 우선적으로 농축되도록 하는 시간 간격 (및 결합되지 않은 표지된 분자가 배경 수준으로 소거되도록 하는 시간 간격) 동안 기다리는 단계; (c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상 내의 표지된 분자를 검출하여, 배경 수준을 초과하는 표지된 분자의 검출은 대상에게 알파5베타1의 발현 또는 비정상적인 발현된 관련된 특정 질환 또는 장애가 있다는 것을 가리키는 단계가 진단에 포함된다. 배경 수준은 검출된 표지된 분자의 양을 특정 시스템에 대해 기존에 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
한 특정 실시양태에 따르면, 알파5베타1 폴리펩티드 발현 또는 과발현이 세포의 표면에 존재하는 알파5베타1의 수준을 평가함 (예를 들어, 항-알파5베타1 항체를 사용하는 면역조직화학 분석법을 통해)으로써 VEGF 길항제 치료제를 투여한 후 진단 또는 예후 분석법에서 결정된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 세포 내의 알파5베타1 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을, 예를 들어, 알파5베타1-코딩 핵산 또는 이의 보체에 상응하는 핵산-기재 프로브를 사용하는 형광 계내 혼성화 (FISH; WO98/45479 (1998년 10월 공개) 참조), 서던(Southern) 블롯팅, 노던(Northern) 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (RT-PCR)을 통해 측정할 수 있다. 항체-기재 분석법을 예를 들어 사용하여, 혈청과 같은 생물학적 액체 내의 박리된(shed) 항원을 측정함으로써 알파5베타1 과발현을 또한 연구할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,933,294 (1990년 6월 12일 허여); WO91/05264 (1991년 4월 18일 공개); 미국 특허 5,401,638 (1995년 3월 28일 허여); 및 [Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)]를 또한 참조). 상기 분석법 이외에, 다양한 생체내 분석법이 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 포유동물의 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 노출시킬 수 있고, 포유동물 내의 세포에 대한 항체의 결합을, 예를 들어, 방사성에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 이전에 노출된 포유동물로부터 취해진 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.
미국 특허 가출원 번호 60/784,704 (2006년 3월 21일 출원), 미국 특허 가출원 번호 60/785,330 (2006년 3월 22일 출원); 및 미국 특허 가출원 번호 60/871,743 (2006년 12월 22일 출원)을 특히 포함하여, 본원에서 언급된 모든 간행물 (특허 및 특허 출원 포함)은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
하기의 DNA 서열이 하기에 기술된 바와 같이 <American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA)>에 부다페스트 조약 하에 기탁되었다:
물질 기탁 번호 기탁일
알파5/베타1 7H5.4.2.8
알파5/베타1 7H12.5.1.4		 PTA-7421
PTA-7420		 2006년 3월 7일
2006년 3월 7일
본원에서의 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규정 (부다페스트 조약)의 조항 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생육성 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조건 하에, 그리고 Genentech, Inc.와 ATCC 간의 협약을 조건으로 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 상기 협약은 관련된 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시 (어느쪽이든 더 빠른 것), 기탁물의 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 일반인이 입수할 수 있는 것을 보장하고, 35 U.S.C. 122 및 이에 따른 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 C.F.R. 1.14 포함)에 따라 자격이 있는 것으로 미국 특허상표청장에 의해 결정된 이가 자손을 입수할 수 있는 것을 보장한다.
본 출원의 특허권자는 기탁된 물질의 배양물이 적절한 조건 하에 배양되었을 때 사망하거나, 손실되거나 파괴되면, 물질이 공고시에 즉시 동일한 또다른 것으로 대체될 것이라는 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수가능성은 임의의 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 발명을 실행하는 자격증으로 해석되지 않아야 한다.
실시예에서 언급된 시판되는 시약은 달리 지시되지 않는 한 제조업자의 지침서에 따라 사용되었다. 하기의 실시예에서, 그리고 명세서 전반에 걸쳐 ATCC 접속 번호에 의해 확인되는 세포의 공급원은 <American Type Culture Collection (Manassas, VA)>이다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 절차, 예컨대 상기 및 하기의 교재에 기술된 것들을 사용한다: [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)]; [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988)]; [Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984)]; [Freshney, Animal Cell Culture. 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology. 1991].
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 의미하고 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
상기 기술된 설명은 당업자가 본 발명을 실행할 수 있도록 하는데 충분한 것으로 여겨진다. 하기의 실시예들은 설명의 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 오히려, 본원에서 제시되고 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다향한 변형이 상기의 기술로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구항의 범주 내에 속한다.
실시예 1 - 항-VEGF 치료법 후의 알파5베타1-발현 기질 세포의 동원
무흉선 마우스에서 항-VEGF 항체 B20-4.1 단일치료법으로 처치된 HT-29 인간 결장직장 암종 이종이식편의 단면을 항-알파5베타1 발현에 대해 염색하였다. B20-4.1 단일치료법으로, 이러한 연구에서 대조군 항체 (항-돼지풀(rag weed) 항체)로 처리된 대조군과 비교하여, 활성이 거의 없거나 없는 것에 상응하는 종점까지의 시간 (TTE) 중앙값이 산출되었다. 종양을 58일의 기간 동안 매주 2번 측정하였다. 종양이 1000 ㎣의 종점 부피에 도달했을 때 또는 제58일에 (어느쪽이든 빠른 쪽), 동물을 안락사시키고, 각각의 마우스에 대해 TTE를 계산하였다. 처치된 마우스 대 대조군 마우스의 TTE 중앙값 증가 백분율로 정의되는, 종양 성장 지연 백분율 (％TGD)로부터 처치 결과가 결정되었고, 이때 차이는 로그순위(Logrank) 분석법을 사용하여 0.01 ≤ P ≤ 0.05에서 유의하고, P < 0.01에서 고도로 유의한 것으로 간주 되었다. 대조군의 TTE 중앙값은 20.6일이었다. B20-4.1 단일치료법으로의 치료로 20.1일의 TTE 중앙값이 산출되었고, 이는 활성이 없는 것에 상응하였다.
도 1은 항-알파5베타1 항체로 염색된 종양 단면을 나타낸다. 항-VEGF 치료 후 증가된 기질 세포 동원이 관찰되었다. 이러한 기질 세포는 인테그린 a5b1 (밝은 녹색 염색)에 대해 양성이다.
실시예 2 - 항-알파5베타1 항체
마우스에 정제된 인간 알파5베타1 (Chemicon CC 1027)을 주사하였다. 항-알파5베타1 항체를 발현하는 형질세포종 세포를 단리하여, 하이브리도마 세포주 내로 형질전환시켰다. 7H5.4.2.8 및 7H12.5.1.4로 명명된 2개의 하이브리도마 세포주를 ATCC에 기탁하였다. 상기 참조. 7H5.4.2.8 하이브리도마로부터 생산된 항체는 mIgG2a 카파 항체 (본원에서 "7H5 항체"로 또한 지칭됨)이다. 7H12.5.1.4 하이브리도마로부터 생산된 항체는 mIgG2b 카파 항체 (본원에서 "7H12 항체"로 또한 지칭됨)이다.
실시예 3 - HUVEC 직접 결합 분석법
성장 중인 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 함유하는 조직 배양물을 PBS로 2회 세정하였다. 3-4 ㎖의 5 mM EDTA/PBS 용액으로 세포를 배양 플라스크로부터 분리하였다. 신선한 배양 배지를 세포에 첨가하고 혼합하였다. 세포를 원심분리하고, 세정 완충제 (50 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH7.5)로 1회 세정하였다. 384웰 플레이트 (각각 카탈로그 #L11XB-1 또는 #L11XB-2, Meso Scale Diagnostics, LLC) 상의 25,000개의 세포/웰 또는 4,000개의 세포/웰에서 96-웰 MSD 고결합 플레 이트 상에 25 ㎕/웰로 파종될 수 있도록 세포 농도를 조정하였다. 세포를 1시간 동안 실온에서 플레이트 상에 인큐베이션하여, 포획되도록 하였다. 웰을 차단하기 위해, 25 ㎕ of의 스톡(stock) 완충제 (TBS (50 mM 트리스, 150 mM NaCl) + 1 mM CaCl2/1 mM MgCl2, pH7.5 내의 30％ 소 태아 혈청 (FBS))를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다.
항-알파5베타1 항체를 분석 완충제 (TBS & 1 mM CaCl2/1 mM MgCl2, pH7.2 + 2-4％ FBS)로 계단 희석하여, 항체 농도가 다양하도록 하였다. 웰을 세정 완충제로 2회 세정한 후, 블롯팅(blotting) 건조시켰다. 25 ㎕의 항체 용액을 웰에 첨가한 후, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 TBS로 3회 세정하였다.
25 ㎕의 0.5 ㎍/㎖ xmuFc-술포-태그 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 얼음 상에서 45분 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다. xmuFc-술포-태그는 염소-항-뮤린 IgG이다: R23-AC-5, MSD-SA-태그: R32-21-AD-5, 얼음 상에서 45분 내지 1시간 동안. 웰을 TBS로 3회 세정하였다. 150 ㎕의 2× 판독 완충제를 각각의 웰에 첨가하였다 (4× MSD 판독 완충제, dH2O로 2×로 희석, 카탈로그 #R92TD-1 (계면활성제 없음)). 결과적인 전기화학발광 (ECL) 신호가 포토다이오드에 의해 측정되었고, MSD 판독기 (디폴트 6000 프로토콜)를 사용하여 상대적인 빛으로 정량된다. 도 2는 HUVEC 직접 결합 분석법의 결과를 나타낸다. 7H5 항체의 EC50은 0.22 nM였다. 7H12 항체의 EC50은 0.38 nM였다.
실시예 4 - 항-알파5베타1 항체 FACS 분석법
7H12 또는 7H5 항체를 RAJI 세포 (알파5베타1 mRNA를 발현하지 않는 세포주) 또는 HUVEC 세포 (높은 수준의 알파5베타1 mRNA를 발현하는 세포주)와 함께 100 ㎕로 인큐베이션하였다. 결합된 세포를 형광 접합된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 도 3은 FACS 분석을 통해 7H12 및 7H5가 HUVEC 세포에 결합하고 RAJI 세포에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 토끼 윤활막세포 (HIG-82) 또는 붉은털 원숭이 세포 (CL-160 마카카 물라타(macaca mulatta) 섬유모세포 또는 CRL-1780 망막 내피 세포)로 동일한 기술을 사용하여, 본 발명가들은 7H12 및 7H5가 토끼 및 원숭이 세포에 결합하는 것을 관찰하였다.
실시예 5 - 항-알파5-베타1 항체의 존재 하에서의 피브로넥틴에 대한 세포 부착
피브로넥틴 (Sigma F1141 (소) 또는 Roche 1080938 (인간))을 탄산나트륨 완충제에서 1 ㎍/㎖으로 희석하였다. 100 ㎕의 피브로넥틴 용액을 NUNC 맥시솝(maxisorp) 96웰 플레이트의 웰마다 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 동안 결합되도록 방치하였다 (NUNC 96웰 편평 바닥 이뮤노(Immuno) 플레이트, MaxiSorp N/Ster 439454 (VWR 62409-002)). 그후, 웰을 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세정하고, 1％ BSA (Sigma A9418)로 30분 이상 동안 차단하였다. 그후, 플레이트를 PBS로 3회 세정하였다. 20,000개의 HUVEC 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 1.4 mM MgCl2 및 1.4 mM CaCl2를 함유하는 성장 배지에서 다양한 농도의 7H5 또는 7H12와 함께 인큐베이션하였다. 그후, 인큐베이션 혼합물을 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 억제 항체가 첨가되지 않은 경우 동일한 성장 배지 내의 약 20,000개의 세포를 각각의 대조군 웰에 첨가하였다.
플레이트를 5분 동안 140g에서 스피닝시켜, 세포와 기판의 접촉을 동조시켰 다. 세포를 CO2 인큐베이터에서 다양한 길이의 시간 (0분 내지 120분) 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간의 길이는 각각의 세포주에 대해 달랐다. 그후, 플레이트를 PBS에서 3회 세정하였다. 모든 액체를 웰로부터 제거하고, 웰을 -80℃에서 동결시켰다. 그후, 플레이트를 실온에서 해동하였다. 사이퀀트(CyQuant) 완충제 (Molecular Probes CyQuant C7026)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. OD 판독값을 측정하였다. 도 4는 7H5 항체의 IC50이 0.85 ㎍/㎖ (3.44nM)이었고 7H12 항체의 IC50이 0.7 ㎍/㎖ (4.38 nM)이었음을 나타낸다.
실시예 6 - HUVEC 세포를 사용한 증식 분석법
96웰 플레이트를 피브로넥틴 (1 ㎍/㎖)으로 하룻밤 동안 코팅하였다. 그후, 플레이트를 PBS로 세정하였다. 3000-5000개의 내피 세포 (EC)를 96개의 웰마다 첨가하고, 웰에 완전히 부착되도록 하였다. 항-알파5 항체를 첨가하였다 (이소타입 대조군 포함). 3개의 웰을 각각의 조건에 대해 사용하였다. 그후, 세포를 항체와 함께 1-24시간 동안 인큐베이션하였다. 항-인테그린 알파5베타1 항체를 여러 농도 (예를 들어, 0 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 120 ㎍/㎖)에서 테스트하였다.
그후, 세포를 2 ㎕의 BrdU 스톡 용액 (PBS 내 25 ㎎/㎖)과 함께 1 ㎖ 조직 배양 배지 (EGM2 + 모든 보충물 (Clonetics, 카탈로그 # CC-4176)) 내로 인큐베이션함으로써 세포를 BrdU로 표지하였다. 이러한 인큐베이션 후, 세포를 4％ PFA로 고정하고, 1N HCl로 20분 동안 처리하고, PBS로 여러번 세정한 후, 10％ 염소 혈청 (PBS + 0.2％ 트리톤(Triton))에서 1-2시간 동안 차단하였다. 그후, 세포를 PBS + 0.2％ 트리톤 및 5％ 염소 혈청 내에서 BrdU에 대한 모노클로날 항체 (BD 카탈로그 # 347580 1:40)로 염색하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 PBS로 3회 세정하고, 알렉사(Alexa)-594-접합 항-토끼 (1:800) 2차 항체와 함께 4시간 동안 실온에서 암실에서 인큐베이션하였다. 웰을 다시 세정하고, DAPI (PBS 내 1:10,000)와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. PBS로의 최종 세정 후, 5×로 DAPI 염색의 사진을 찍음으로써 전체 세포수/웰을 카운팅하였다. 동일한 필드에서 BrdU에 대해 양성인 세포들을 적색 필터를 사용하여 사진촬영하였다. 증식은 필드 내의 BrdU에 대해 양성인 세포의 백분율로 평가된다. 그후, 결과를 엑셀(Excel)을 사용하여 분석하였다. 도 5a는 5000개의 출발 세포수 후 32시의 HUVEC 전체 세포 카운트를 나타낸다. 도 5b는 항체 농도 20 ㎍/㎖에서 24시의 HUVEC 전체 세포 카운트를 나타낸다.
실시예 7 - 이동 분석법 프로토콜
HUVEC 세포를 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴이 코팅된 24웰 플레이트 상에서 EGM2 + 모든 보충물 (Clonetics, 카탈로그 # CC-4176)에서 전면성장까지 성장시켰다. 그후, 각각의 웰의 중앙의 세포를 2 ㎕ 피펫 팁으로 자국을 내고, 자국내기에 의해 제거된 세포를 세정하였다. 대조군 항체, 7H5, 또는 7H12가 있는 세포 배양 배지를 상이한 웰에 첨가하였다. 모든 테스트된 항체는 20 ㎍/㎖로 사용되었다. 그후, 세포를 1일 내지 2일 동안 성장시켰다. 상처난 면적을 모니터링하였다. 도 6은 0시 및 30시의 ECM-2 내의 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 + 20 ㎍/㎖ 항-알파5 항체 (7H5) 상에서의 HUVEC 이동의 사진을 나타낸다. 도 7은 7H5 또는 7H12 항체로 처리된 세포에 대한 30시의 이동 ％의 그래프이다.
실시예 8 - HUVEC 활성화-카스파제-3 면역염색 세포자멸사 분석법
96웰 플레이트를 피브로넥틴 (1 ㎍/㎖)으로 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 세정하였다. 그후, 3000-5000개의 HUVEC 세포를 96개의 웰마다 플레이팅하고, 하룻밤 동안 완전 배지 (EBM-2 배지 (Cambrex CC-3156) + EGM-2 싱글쿼츠(SingleQuots) (Cambrex CC-4176))에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 2H-11 마우스 내피 세포가 세포자멸사 분석법에 사용되면, 배지는 50/50 배지 + 10％ FBS이다.
다음날, 한 셋트의 웰을 무혈청 배지로 바꿔서 4-6시간 동안 인큐베이션하여, 세포를 결핍시키고, 이들이 비-증식 단계에 있도록 하였다. 다른 셋트의 세포는 완전 배지에서 유지되었고, 활발하게 증식되는 세포를 나타냈다. 4-6시간 후, 항체를 첨가하였다 (이소타입 대조군 포함). 일반적으로, 3개의 웰이 각각의 조건에 대해 사용된다. 그후, 세포를 항체와 함께 1-48시간 동안 인큐베이션하였다. 항-인테그린 알파5베타1 항체는 하기의 농도에서 일반적으로 테스트되었다: 0 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖ 및 120 ㎍/㎖.
이러한 인큐베이션 후, 세포를 4％ PFA로 고정하고, 10％ 염소 혈청 (PBS + 0.2％ 트리톤)으로 1-2시간 동안 차단한 후, 활성화 형태의 카스파제 3을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체 (예를 들어, BioVision으로부터의 토끼 항-활성 카스파제-3 항체; PBS + 0.2％ 트리톤 및 5％ 염소 혈청 내에서 1:50 희석됨)로 염색하 였다. 항-카스파제 3 항체 및 고정된 세포를 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 PBS로 3회 세정하고, 알렉사-594-접합 항-토끼 (1:800) 2차 항체와 함께 4시간 동안 실온에서 암실에서 인큐베이션하였다. 웰을 다시 세정하고, DAPI (PBS 내의 1:10,000)와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. PBS로의 최종 세정 후, 5×로 DAPI 염색의 사진을 찍음으로써 전체 세포수/웰을 카운팅하였다. 동일한 필드에서 활성화된 카스파제3에 대해 양성인 세포들을 적색 필터를 사용하여 사진촬영하였다. 활성화된 카스파제-3에 대해 양성인 세포의 백분율로서 세포자멸사가 평가되었다. 그후, 결과를 엑셀을 사용하여 분석하였다. 도 8은 7H5 및 7H12가 활발하게 세포자멸사를 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 9 - HUVEC 카스파제-3/7 활성 비색 분석법
7H5 및 7H12 항체를 사용하여 카스파제 3/7 활성 분석법을 수행하였다 (Promega의 아포-원(Apo-One) 카스파제-3/7 분석법; 표준 96웰 분석법 지침서에 대해 <Technical Bulletin No. 295> 참조).
일반적으로, 96웰 플레이트를 피브로넥틴 (1 ㎍/㎖)으로 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 세정하였다. 그후, 3000-5000개의 HUVEC 세포를 96개의 웰마다 플레이팅하고, 하룻밤 동안 완전 배지 (EBM-2 배지 (Cambrex CC-3156) + EGM-2 싱글쿼츠 (Cambrex CC-4176))에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 2H-11 마우스 내피 세포가 세포자멸사 분석법에 사용되면, 배지는 50/50 배지 + 10％ FBS이다.
다음날, 한 셋트의 웰을 무혈청 배지로 바꿔서 4-6시간 동안 인큐베이션하여, 세포를 결핍시키고, 이들이 비-증식 단계에 있도록 하였다. 다른 셋트의 세포 는 완전 배지에서 유지되었고, 활발하게 증식되는 세포를 나타냈다. 4-6시간 후, 항체를 첨가하였다 (이소타입 대조군 포함). 일반적으로, 3개의 웰이 각각의 조건에 대해 사용된다. 그후, 세포를 항체와 함께 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 항-인테그린 알파5베타1 항체는 하기의 농도에서 일반적으로 테스트되었다: 0 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖ 및 120 ㎍/㎖.
이러한 인큐베이션 후, 100 ㎕의 아포-원 카스파제3/7 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트 진탕기를 사용하여 300 rpm에서 30초 동안 플레이트를 부드럽게 혼합하였다. 그 후, 플레이트를 실온에서 1 내지 8시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트 판독기를 사용하였다. 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출에서의 각각의 웰의 형광을 측정하였다.
카스파제 3/7 기질의 절단으로부터 생성된 형광 신호 (RLU)가 세포자멸사를 가리켰다. 도 9는 7H5 및 7H12가 세포자멸사를 활발하게 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 튜브 형성 분석법
항-알파5베타1 항체를 튜브 형성을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. 하기는 HUVEC 발아를 기초로 하는 튜브 형성 분석법 및 [Nakatsu et al. (2003) Microvascular Research 66 (2003) 102-112]에 기술된 튜브 형성 분석법의 예이다.
일반적으로, HUVEC 세포를 데트란이 코팅된 사이토덱스(Cytodex) 3 마이크로캐리어 (Amersham Pharmacia Biogech, Piscataway, NJ)와 1 ㎖의 EGF-2 배지에서 비드 당 400개의 HUVEC의 농도로 혼합하였다. 세포가 있는 비드를 37℃ 및 5％ CO2에서 4시간 동안 20분마다 부드럽게 진탕하였다. 인큐베이션 후, 세포가 있는 비드를 25-cm2 조직 배양 플라스크 (BD Biosciences, Bedford, MA)로 옮겨서, 37℃ 및 5％ CO2에서 12-16시간 동안 5 ㎖의 EGM-2에서 방치하였다. 다음날, 세포가 있는 비드를 1 ㎖의 EGM-2로 3회 세정하고, 200개의 세포-코팅 비드/㎖의 농도로 2.5 ㎎/㎖의 피브리노겐 (Sigma, St. Louis, MO)에 재현탁시켰다. 500 ㎕의 피브리노겐/비드 용액을 24웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 내의 0.625 유닛의 트롬빈 (Sigma)에 첨가하였다. 피브리노겐/비드 용액을 5분 동안 실온에서, 이어서 37℃ 및 5％ CO2에서 20분 동안 응고시켰다. 1 ㎖의 EGM-2 (2％ FBS 함유)를 각각의 웰에 첨가하여, 피브린 응고물과 30분 동안 37℃ 및 5％ CO2에서 평형화시켰다. 배지를 웰로부터 제거하고, 1 ㎖의 새로운 배지로 교체하였다. 대략적으로, 20000개의 피부 섬유모세포 세포 (Detroit 551, ATCC, Rockville, MD)가 응고물의 최상부 상에 플레이팅되었다. 배지를 하루 걸러 교환하였다. 비드 분석법을 7일 동안 모니터링하였다.
HUVEC-코팅 비드를 500 ㎕의 항-알파5베타1 항체 (7H5 및 7H12)가 젤의 최상부에 있거나 없는 피브린 젤에서 2-3일 동안 배양한 후, 다차원 축이 장착된 니콘 이클립스(Nicon Eclipse) TE300으로 옮기고, 37℃ 및 5％CO2에서 72h동안 유지시켰다. 사용될 최종 항체 농도를 피브린 젤 부피를 고려하여 계산하였다; 즉, 최종 항체 농도 = 전체 항체 중량 / 배지 부피 + 피브린 젤 부피. 영상을 메타모르프(Metamorph) 소프트웨어를 사용하여 20분 마다 여러 비드로부터 포착하였다. 시험관내에서의 혈관의 정량을 비드의 고해상도 영상 (예를 들어, 4× 대물렌즈가 있 는 IX70 올림푸스(Olympus) 현미경)을 사용하여 달성하였다. 비드 당 발아물의 수를 대조군 (미처리)과 비교하여 결정하였고, 이때 발아물은 비드의 직경과 동일한 길이의 혈관으로 정의된다. 발아물 길이는 임의의 단위에 의해 측정하였다.
실시예 11 - 이종이식편/동종이식편 종양 모델에서의 조합 연구
알파5베타1 길항제 치료법 및 VEGF 길항제 치료법의 동시 및 순차적 투여를 이종이식편/동종이식편 종양 모델에서 평가하였다. 바람직하게는, 모델에서 VEGF 길항제 단일치료법에 대한 응답이 거의 없거나, 없었다. 하기는 사용될 수 있는 모델의 예이다: (a) 무흉선 누드 마우스 내의 Fo5 동종이식편 (mmtv-Her2 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 유방 종양) ([Finkle, D., et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:2499-2511]); (b) 무흉선 누드 마우스 내의 HT29 이종이식편 (인간 결장직장암 라인); 및 (c) RIP-TbAg (Tg 모델에서의 췌장 종양). 전형적으로 치료법을 복강내, 피하 또는 정맥내 투여하였다. 예를 들어, 항-VEGF 항체를 10 ㎎/kg으로 1주일에 한번 또는 5 ㎎/kg으로 1주일에 2번 투여하였다. 알파5베타1 길항제, 예컨대 항체의 투여량은 이의 친화력 및 활성을 기초로 추정하였다. 한 실험에서, VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 동시 스케쥴로 5-6일 동안 투여하였다. 별법적으로 또는 추가적으로, VEGF 길항제 및 알파5베타1 길항제를 순차적으로 투여하였다 (예를 들어, 3주 동안의 항-VEGF 항체에 이어서, 항-알파5베타1 항체를 3주 동안 투약함).
치료 효능을, 특히, 종양 진행, 종양 관류, 종양 혈관 밀도, 형태학 및/또는 생존을 기초로 평가하였따. 종양 진행은, 예를 들어, 종양 부피 및/또는 종양 중 량에 의해 측정하였다. FITC-렉틴 관류, 뿐만 아니라 혈관 마커 염색을 사용하여, 신생물성 진행에 부수적인 혈관 변화를 평가하였다.
실시예 12 - MDA-MB231 인간 유방 종양 모델
HRLN 암컷 누드 마우스에게 5×106 개의 MDA-MB231 인간 유방암 세포를 옆구리에 피하 주사하였다. (HRLN은 계통명이다). 종양을 80-120 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 성장시켰다. 그후, 종양이 있는 마우스를 4개의 군으로 나누고, 평균 종양 부피/군이 100 ㎣일 때 치료를 시작하였다.
종양 부피를 연구 동안 일주일에 2번 측정하였다. 종양 부피 측정은 표준 캘리퍼 측정 방법을 사용하여 수행하였다. Genentech에서 10E7로 공지된 햄스터 항-마우스 인테그린 알파5 mab가 생성되었다. 종양이 1.5 g일 때 또는 60일이 경과했을 때 (어느쪽이든 빠른 쪽), 실험의 종점에 도달하였다. 일부 경우에 응답자를 더 길게 추적할 수 있다. 종점에 도달했을 때 동물들을 안락사시켰다.
처치의 상세사항이 하기에 기술된다:
(1) 대조군: 항-돼지풀 대조군 mab 주사 (10 ㎎/kg, 복강내 (ip), 1주일에 한번)
(2) 항-VEGF 단일 작용제 군: 항-VEGF mab B20.4.1 주사 (10 ㎎/kg, ip, 1주일에 한번)
(3) 조합군: B20.41. (10 ㎎/kg, ip, 1주일에 한번) + 햄스터 항-마우스 인테그린 알파5 mab 10E7 (10 ㎎/kg, ip, 1주일에 두번)
(4) 항-인테그린 알파5 단일 작용제 군: 햄스터 항-마우스 인테그린 알파5 mab 10E7 주사 (10 ㎎/kg, ip, 1주일에 두번)
Figure 112008072540516-pct00001
Figure 112008072540516-pct00002
Figure 112008072540516-pct00003
Figure 112008072540516-pct00004
이러한 예비 데이터는 항-알파5 + 항-VEGF 조합 활성의 초기 사인을 나타낸다.
연구 종점 후, 각각의 군에 대한 평균 종양 부피를 계산하였다 (도 11A). 카플란-마이어 플롯이 또한 구축되어, 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타냈다 (도 11B). 데이터는 항-인테그린 α5β1 항체가 유방암 모델에서 항-VEGF의 효능을 증강시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 13 - 토끼 귀 상처 치유 모델에서의 7H12 및 베바시주맵
뉴질랜드 화이트 토끼를 칭량하고, 이소플루오란으로 마취시켰다. 각각의 토끼에서, 양쪽 귓바퀴의 내부 표면으로부터, 그리고 가장자리를 따라 털을 깎았다. 임의의 남은 털을 탈모 로션으로 수술 부위로부터 제거하였다. 베타딘을 문지른 후, 알콜로 헹궈서 수술 부위를 깨끗하게 하였다. 무균 기술을 사용하여, 원형 8 ㎜ 펀치 생검 기기를 사용하여 각각의 귀의 귀 연골 깊이까지 1개의 상처가 생기게 하였다. 골막 기자 및 날카로운 가위로 기저 연골막을 제거하였다. 옵사이트(Opsite)® 접착 밴드(adhesive bandage)를 각각의 상처 위에 놓고, 토끼가 마취로부터 회복되도록 하였다. 옵사이트® 드레싱을 매일 제거하고, 상처를 검사하고, 국소적으로 처치를 적용하고, 새로운 드레싱을 적용하였다. 제0일 (수술 직후), 제7일, 제10일, 제14일 및 제18일에 상처 직경을 측정함으로써 상처 간격을 계산하였다.
처치 군은 하기와 같았다:
30 ㎕ 내의 베바시주맵 (항-VEGF 항체) 100 ㎍을 각각의 상처에 매일 (n=4)
30 ㎕ 내의 7H12 (항-알파5베타1 항체) 100 ㎍을 각각의 상처에 매일 (n=4)
15 ㎕ 내의 베바시주맵 100 ㎍ + 15 ㎕ 내의 7H12 100 ㎍을 각각의 상처에 매 (n=4)
30 ㎕ 내의 트라스투주맵 (항-HER2 항체) 100 ㎍을 각각의 상처에 매일 (n=3)
데이터는 항-VEGF 및 항-알파5베타1 조합 치료법이 단일 작용제 단독에 비해 이러한 혈관형성 모델에서 두드러진 효과가 있다는 것을 나타낸다 (도 10).
실시예 14- 결장암에서의 항-알파5베타1 및 항-VEGF 조합 치료법
HRLN 암컷 nu/nu 마우스에게 1 ㎣ HT29 종양 단편 (결장 종양)을 옆구리에 피하 주사하였다. 치료법으로의 처치 전에 80-120 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 종양을 성장시켰다. 종양이 있는 마우스를 4개의 군으로 나누었다:
Figure 112008072540516-pct00005
종양 부피 측정을 1주일에 두번 표준 캘리퍼 측정 방법을 사용하여 수행하였다. Genentech에서 10E7로 공지된 햄스터 항-마우스 인테그린 알파5 mab가 생성되었다. 대조군 IgG는 항-돼지풀 모노클로날 항체였다. 체중을 2일에 걸쳐 5회 측정한 후, 연구 종점까지 1주일에 2번 (biwk) 측정하였다. 종양 부피 1 g일 때 또는 90일에 (어느쪽이든 빠른 쪽), 실험의 종점에 도달하였다. 일부 응답자는 더 길게 추적하였다. 종점에 도달했을 때 동물들을 안락사시켰다. 투약 부피는 10 ㎖/㎏ (0.200 ㎖/20 g 마우스)였고, 이러한 부피를 체중에 대해 조정하였다. 완전 퇴행 (CR)을 나타내는 동물에 대해, 종양 이식 부위에서의 조직을 종점에 수집하여, 추후의 연구를 위해 포르물린에 이어서 70％ EtOH 내에 보존하였다. 동결되는 모든 샘플들을 냉동틀(cryomold) 내에 놓고, 호일로 싸서, 액체 질소 상에서 스냅(snap) 동결시켰다.
연구 종점 후, 각각의 군에 대한 평균 종양 부피를 계산하였다 (도 12A). 카플란-마이어 플롯이 또한 구축되어, 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타낸다 (도 12B). 데이터는 항-인테그린 α5β1 항체가 걸장암 모델에서 항-VEGF의 효능을 증강시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 15 - 결장암에서의 항-알파5베타1 + 화학요법
HRLN 암컷 nu/nu 마우스에게 5×106개의 HCT116 종양 세포 (결장 종양 세포)를 옆구리에 피하 주사하였다. 치료법으로의 처치 전에 80-120 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 종양을 성장시켰다. 종양이 있는 마우스를 4개의 군으로 나누었다:
Figure 112008072540516-pct00006
종양 부피 측정을 1주일에 두번 표준 캘리퍼 측정 방법을 사용하여 수행하였다. Genentech에서 10E7로 공지된 햄스터 항-마우스 인테그린 알파5 mab가 생성되었다. 체중을 2일에 걸쳐 5회 측정한 후, 연구 종점까지 1주일에 2번 (biwk) 측정하였다. 실험 종점은 종양 부피가 1.5 g일 때 또는 60일이었다 (어느쪽이든 빠른 쪽). 일부 응답자는 더 길게 추적하였다. 종점에 도달했을 때 동물들을 안락사시켰다. 투약 부피는 10 ㎖/㎏ (0.200 ㎖/20 g 마우스)였고, 이러한 부피를 체중에 대해 조정하였다. 10E7을 이리노테칸 투여 30분 전에 투여하였다. 완전 퇴행 (CR)을 나타내는 동물에 대해, 종양 이식 부위에서의 조직을 종점에 수집하여, 추후의 연구를 위해 포르물린에 이어서 70％ EtOH 내에 보존하였다. 동결되는 모든 샘플들을 냉동틀 내에 놓고, 호일로 싸서, 액체 질소 상에서 스냅 동결시켰다.
연구 종점 후, 각각의 군에 대한 평균 종양 부피를 계산하였다 (도 13A). 카플란-마이어 플롯이 또한 구축되어, 연구에서 남아 있는 동물의 백분율을 시간의 함수로 나타낸다 (도 13B). 데이터는 항-인테그린 알파5베타1 항체가 걸장암 모델 에서 화학요법제 (이리노테칸)의 효능 또는 활성을 증강시키지 않지또한 화학요법제의 활성을 저지하지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰은 항-알파5베타1 치료법이 일반적으로 항-혈관형성, 특히 종양학적 환경에서의 항-혈관형성에서 상당히 유용할 수 있기 전에 혈관 손상이 발생하여야 한다는 본 발명가들의 신념과 일치한다. 이같은 혈관 손상은 VEGF 길항제, 예컨대 아바스틴(AVASTIN)® 항체에 의해 야기될 수 있다. 이러한 모델에서의 화학요법제는 혼자서는 상당한 혈관 손상을 야기하지 않았다. VEGF 길항제가 존재하여 혈관 손상을 야기하도록, 모든 이러한 작용제 (VEGF 길항제/알파5베타1 길항제/화학요법제)를 동시에 또는 순차적으로 사용하는 것을 구현할 수 있다.
실시예 16 - 알파5베타1 스캐차드 플롯
항-알파5베타1 항체를 아이오도젠(Iodogen) 방법을 사용하여 요오드화시키고, 방사성표지된 항체를 유리 125I-Na로부터 젤 여과에 의해 PD-10 컬럼을 사용하여 정제하였다. 토끼 섬유모세포 세포주인 R9ab 세포 (ATCC에서 구입, No.CCL-193)를 약 50,000개의 세포/웰로 24웰 플레이트에 파종하고, 48시간 동안 5％ CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 결합 완충제 (2％ FBS 및 50 mM HEPES를 함유하는 50:50 DMEM/F12 배지, pH7.2)로 3회 세정한 후, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세정된 세포를 삼중으로 분석된 13 농도에 대해 결합 완충제 내의 0.5 uM로부터 계단 희석된 하향 농도의 표지되지 않은 항-알파5베타1 모노클로날 항체를 함유하는 약 50 pM의 125I-항-알파5베타1 모노클로날 항체와 함께 4시 간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 결합 완충제로 3회 세정한 후, 200 ㎕의 SDS 용해 완충제 (1％SDS, 8M 요소, 100 mM 글리신, pH 3.0)으로 가용화시켰다. 세포 용해물을 왈락 위자드(Wallac Wizard) 1470 감마 카운터에서 카운팅하였다. Munson 및 Robard의 곡선 피팅(fitting) 알고리즘 ([Munson, P. and Robard, D. (1980) Anal. Biochem. 107: 220-239])을 사용하여 항체의 결합 친화력 및 결합 부위의 농도를 결정하는 Genentech의 프로그램 뉴리간드(NewLigand)를 사용하여 결합 데이터를 평가하였다. 도 14 및 15는 이러한 결합 분석법에서 각각 7H5 항체의 Kd가 0.10 nM이고, 7H12 항체의 Kd는 0.30 nM임을 나타낸다.
실시예 17 - 항-인테그린 알파5베타1 IgG 에피토프 지도작성/경쟁적 억제 분석법
항-인테그린 α5β1 IgG의 3배 계단 희석물을 PBST 완충제 (PBS 및 0.5％ (w/v) BSA 및 0.05％ (v/v) 트윈(Tween)20) 내의 인간 인테그린 α5β1 항원 (1 ㎍/㎖; R&D)이 코팅된 96-웰 넝크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 플레이트와 함께 1-2시간 동안 실온에서 1차로 인큐베이션한 후, 최대하 결합 신호 (50-70％)에 의해 최초로 결정된 비오틴화 h7H5.v1 hIgG1 (Genentech, Inc.에 의해 생성된 7H5의 항체 변이체) 0.3 nM을 15분 동안 첨가하였다. 그후, 플레이트를 PBT 완충제 (PBS 및 0.05％ (v/v) 트윈20)으로 5회 세정하였다. 결합된 비오틴화 h7H5.v1 MgG1을 PBST 완충제에 1:2500 희석된 스트렙타비딘 양고추냉이 과산화효소 접합체 (Pierce)로 검출하고, 약 5분 동안 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) 기질로 발색시키고, 1.0 M H3PO4로 켄칭(quenching)하고, 분광광 도법으로 450 nm에서 판독하였다. 곡선을 4-파라메터 비-선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (Kaleidagraph, Synergy Software)으로 피팅하였다.
도 16은 결합된 h7H5.v1이 상향 농도의 콜드 m7H5에 의해 경쟁되었음을 나타낸다. 실제로, m7H5 경쟁 곡선은 h7H5.v1 경쟁 곡선과 거의 동일하였다 (데이터는 제시되지 않음). 콜드 m7H12 또한 알파5베타1에의 결합에 대해 비오틴-h7H5.v1과 경쟁하였고,이는 h7H5.v1 및 m7H12가 결합하는 알파5베타1 상의 에피토프가 중첩된다는 것을 가리킨다. 반면에, 대조군 항체는 결합된 h7H5.v1과 경쟁하지 않았다.
<110> Genentech, Inc. <120> COMBINATORIAL THERAPIES <130> P2320R1 <150> US 60/784,704 <151> 2006-03-21 <150> US 60/785,330 <151> 2006-03-22 <150> US 60/871,743 <151> 2006-12-22 <160> 5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr 20 25 30 Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn 50 55 60 Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys 65 70 75 Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser 80 85 90 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr 95 100 105 Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 110 115 120 Thr Val Ser Ser <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro 35 40 45 Asn Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 65 70 75 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 80 85 90 Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr 20 25 30 Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn 50 55 60 Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys 65 70 75 Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser 80 85 90 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr 95 100 105 Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 110 115 120 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 125 130 135 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 165 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 170 175 180 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 185 190 195 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 200 205 210 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 215 220 225 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 350 355 360 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 440 445 450 Lys <210> 4 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro 35 40 45 Asn Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 65 70 75 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 80 85 90 Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 110 115 120 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 125 130 135 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 140 145 150 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 155 160 165 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 170 175 180 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 185 190 195 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 200 205 210 Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 5 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr 20 25 30 Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn 50 55 60 Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys 65 70 75 Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser 80 85 90 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr 95 100 105 Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 110 115 120 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 125 130 135 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 165 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 170 175 180 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 185 190 195 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 200 205 210 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 215 220 225 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 230

Claims (60)

  1. 인간 인테그린 알파5베타1에 결합할 수 있는 항체로서, 2006년 3월 7일에 ATCC에 ATCC 번호 PTA-7420로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항-인테그린 알파5베타1 항체의 6개의 초가변 영역에 대응되는 6개의 초가변 영역을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 및 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함하는 항-인테그린 알파5베타1 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 2006년 3월 7일에 ATCC에 ATCC 번호 PTA-7420로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 2006년 3월 7일에 ATCC에 ATCC 번호 PTA-7420로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인 서열을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 2006년 3월 7일에 ATCC에 ATCC 번호 PTA-7420로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항-인테그린 알파5베타1 항체의 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 인테그린 알파5베타1에 500 nM 내지 1 pM 사이의 Kd로 결합하는 항체.
  6. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG의 Fc 서열을 포함하는 항체.
  7. 삭제
  8. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 Fc 서열을 포함하는 항체.
  9. 제6항에 있어서, 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 이펙터(effector) 기능이 결여된 Fc 서열을 포함하는 항체.
  10. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중-특이적 항체인 항체.
  11. 삭제
  12. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제에 접합된 항체.
  13. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표지에 접합된 항체.
  14. 삭제
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 (VH) 도메인 또는 경쇄 가변 (VL) 도메인 또는 VH 및 VL 도메인 모두를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  16. 삭제
  17. 제15항의 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터.
  18. 제15항의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 2006년 3월 7일에 ATCC에 ATCC 번호 PTA-7420로 기탁된 하이브리도마인 세포.
  20. 제18항의 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 환자로부터의 샘플에 접촉시키고, 인테그린 알파5베타1 단백질에 결합된 항-인테그린 알파5베타1 항체를 검출함으로써 상기 샘플 내의 인테그린 알파5베타1 단백질을 검출하는 방법.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 대상에서 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 억제하기 위한 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 질환이 종양, 면역 질환 또는 안구 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  24. 삭제
  25. VEGF 길항제 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 대상에서 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 억제하기 위한 제약 조성물.
  26. 삭제
  27. VEGF 길항제 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 대상에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  28. VEGF 길항제 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 대상에서 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 안구 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  29. VEGF 길항제 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 대상에서 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 자가면역 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  30. 제25항에 있어서, VEGF 길항제가 베바시주맵에 의해 인간 VEGF에의 결합이 경쟁적으로 억제될 수 있는 것인 제약 조성물.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제25항에 있어서, VEGF 길항제가 베바시주맵인 제약 조성물.
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  39. 제25항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합된 것인 제약 조성물.
  40. 제25항에 있어서, VEGF 길항제가 항체인 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 항-VEGF 항체가 인간화 또는 인간 항체인 제약 조성물.
  42. 삭제
  43. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체; 및
    VEGF 길항제로 치료된 대상에서 인테그린 알파5베타1을 검출하기 위한 지침서를 포함하는, VEGF 길항제로 치료된 대상에서 인테그린 알파5베타1을 검출하기 위한 키트.
  44. 제22항에 있어서, 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제약 조성물.
  45. 제25항에 있어서, 비정상적인 혈관형성, 혈관 투과성, 또는 모두를 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제약 조성물.
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