KR101443218B1 - 코스모트로픽 염을 이용한 고체 지지체에서의 ｒｎａ 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RNA 함유 시료와 1M 이하 코스모트로픽 염 (kosmotropic salt)을 포함하는 산성 pH의 용액을 고체 지지체 상에 접촉시켜, RNA를 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는 RNA의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, RNA 수율이 높으면서도 DNA 오염도가 낮아 효율적으로 RNA를 정제한다. 특히, 본 발명은 200 뉴클레오티드 (nt) 이하의 작은 RNA를 정제하는데 효과적이다.

RNA 정제, 코스모트로픽 염, 고체 지지체

Description

코스모트로픽 염을 이용한 고체 지지체에서의 ＲＮＡ 정제 방법{Method for purifying RNA from biological material on solid support using kosmotropic salt}

본 발명은 코스모트로픽 염을 이용한 RNA 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고체 지지체 상에서 코스모트로픽 염을 이용하여 RNA를 포함하는 생물학적 시료로부터 RNA를 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 사용되고 있는 RNA 분리 방법에는 트리졸 시약을 이용한 분리법과 Qiagen 키트를 이용한 분리법이 있다. 트리졸 시약을 이용한 분리법은 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트의 혼합용액에 세포를 가하여 세포 용해시킨 다음, 클로로포름을 가해 수층과 유기층으로 분리하고(RNA는 수층에, 단백질은 유기층에, DNA는 중간층에 존재), 수층을 모아 이소프로판올 처리하여 RNA를 침전시킨다. Qiagen 키트를 이용한 분리법은 구아니딘 이소티오시아네이트 함유 완충액에 세포를 가하여 세포 용해시킨 다음, 에탄올 처리하고 RNeasy^TM 스핀 칼럼에 주입하여 RNA 결합시키고, 세척/용출 과정을 거쳐 RNA를 수득한다(참조 USP5,234,809).

상기 방법은 페놀, 클로로포름, 카오트로픽 물질 (chaotropic material)인 구아니딘 이소티오시아네이트 등의 유해물질을 사용할 뿐만 아니라, 수득한 RNA에는 오염원으로 DNA가 많은 양으로 얻어진다는 문제를 갖고 있다. 카오트로픽 물질은, 실리카 표면을 탈수화 (dehydration)시켜 핵산이 실리카 표면에 소수성 상호작용에 의하여 결합하도록 하는 것으로 알려져 있다.

미국 공개특허 제2007/0043216호에는 4~10M의 RNA-결합 염(LiCl 등의 RNA-complexing salt)을 포함하는 완충액(pH <4.5 또는 pH>7) 및 고체 지지체를 이용하여 RNA를 정제하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허는 RNA-결합 염의 종류 및 농도, 완충액의 pH 등의 측면에서 본 발명과는 상이하다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 RNA 정제 방법을 연구하던 중, 인체에 무해한 코스모트로픽 염을 사용하여 고체 지지체 상에서 gDNA의 오염을 최소화하면서 RNA를 효과적으로 정제할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 코스모트로픽 염을 이용한 고체 지지체에서의 RNA 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

RNA 함유 시료와 1M 이하 코스모트로픽 염 (kosmotropic salt)을 포함하는 산성 pH의 용액을 고체 지지체 상에 접촉시켜, RNA를 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는 RNA의 정제 방법을 제공한다.

본 발명은 고체 지지체 표면에 코스모트로픽 염 용액을 이용하여 RNA를 결합시키고, 여기에 낮은 농도의 염 용액을 첨가하여 RNA를 용출하는 것이다. 기존의 RNA 분리 기술은 카오트로픽 (chaotropic) 염을 이용하거나, 4~10M LiCl 등의 RNA-결합 염을 포함하는 특정 pH의 용액을 이용하는 것이었다. 본 발명의 방법은 특정 농도, 특정 pH의 코스모트로픽 염 용액을 이용하여, DNA의 오염을 최소화하면서 RNA를 효과적으로 정제할 수 있다. 특히, 본 발명은 200nt 이하의 작은 RNA를 분리하는데 효과적이다. 코스모트로픽 염은 고체 지지체, 예를 들면 실리카 표면을 수화 (hydration)시켜 핵산이 표면에 친수성 상호작용에 의하여 결합하는 것으로 추정된다.

본 발명에 있어서, 코스모트로픽 염이란, Hotmeister 시리즈 즉, SO₄ ^{2 -}<HPO₄ ^{2 -} <OH^-<F^-<HCOO^-<CH₃COO^-<Cl^-<Br^-<NO₃ ^-<I^-<SCN^-<ClO₄ ^-에서, SO₄ ^{2 -}, HPO₄ ^{2 -},OH^-, F^-, HCOO^-, CH₃COO^-, Cl^- 과 양이온으로 이루어진 염을 의미하는 것으로 한다. 다만, 상기 양이온으로서 Mg^{2 +}는 제외한다. Mg^{2 +}는 상기한 코스모트로픽 음이온과 결합하는 경우, 예외적으로 코스모트로픽 특성을 가지지 않는다. 상기 양이온은, 바람직하게는, NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Ca^{2 +},및 Ba^{2 +}로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 코스모트로픽 염은 바람직하게는, NaCl, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, NaOAc인 것이다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA의 결합 단계 후에 결합되지 않은 시료를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 RNA를 고체 지지체 상에 결합시킨 후, 상기 지지체에 결합되지 않은 시료를 세척함으로써 RNA를 보다 순수한 형태로 정제할 수 있다. 세척액은 RNA를 고체 지지체에 결합시킬 때 이용하는 용액을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 1M 이하 코스모트로픽 염을 포함하는 1차 세척액으로 1차 세척하고, 중성 완충액으로 2차 세척한다. 세척액은 알코올을 추가로 포함할 수 있다. 상기 알코올에는 탄소수 1 내지 6의 저급알콜이 포함된다.

본 발명의 방법은 물 또는 RNA 용출 완충액을 첨가하여 상기 고체 지지체에 결합된 RNA를 용출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 고체 지지체에 결합된 상태로 RNA를 이용하는 것도 가능하지만, 결합된 RNA의 더욱 효율적인 이용, 예를 들면, 분리된 RNA의 역전사, 증폭 또는 검출을 위해서는 고체 지지체에 결합된 RNA 를 용출하는 것이 요구되는 것이다.

본 발명의 방법에서, 상기 코스모트로픽 염은 설페이트(SO₄ ^{2 -}), 포스페이트(HPO₄ ^{2 -}), 아세테이트(CH₃COO^-), 히드록사이드(OH^-), 클로라이드(Cl^-), 포르메이트(HCOO^-) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 코스모트로픽 염은 Hofmeister 시리즈에 따라, 단백질 결정화를 유도하고, 소수성 입자에 대한 염석(salting-out) 이온으로서 작용하며, 물 구조를 만드는 역할을 한다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA 함유 시료와 코스모트로픽 염을 포함하는 용액의 pH는 산성 pH, 바람직하게는 3~6일 수 있다. 상기 용액의 pH가 상기 범위를 벗어나면 RNA 수율이 적어지거나 DNA의 오염도가 높아지기 때문이다.

본 발명의 방법에서, 상기 코스모트로픽 염의 농도는 1M 이하, 바람직하게는0.3M 내지 0.9M일 수 있다. 상기 코스모트로픽 염의 농도가 상기 범위를 벗어나면, RNA 수율이 적어지거나 DNA의 오염도가 높아지기 때문이다.

본 발명의 방법에서, 상기 고체 지지체는 실리카, 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 금속판 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 고체 지지체는 표면적을 넓히기 위해 글라스나 웨이퍼 같은 평평한 지지체의 경우 기둥(pillar) 형태로 표면을 가공하는 것도 가능하다. 상기 고체 지지체는 평면, 기둥(pillar), 비드, 체(sieve) 구조 등일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA 용출 완충액은 포스페이트(phosphate), 트리 스(Tris), 헤페스(HEPES), 체스(CHES), 보레이트(borate) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 RNA 용출 완충액은 10mM 이하의 염을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA 용출 완충액의 pH는 4~10인 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우 RNA 자체(RNA integrity)에 영향을 줄 수 있고 후속 공정을 저해할 수 있기 때문이다.

본 발명의 방법에서, 상기 고체 지지체에 대한 RNA의 결합 또는 용출 단계는 정지(static) 또는 유동(fluidic) 상태에서 수행될 수 있다. RNA와 상기 고체 지지체를 정지 상태에서 접촉시키는 것도 가능하지만, 유동 상태에서 접촉시키는 것도 가능하다. 즉, RNA을 포함하는 용액을 유동 제어 시스템에서 유동시키면서 고체 지지체와 RNA를 접촉시키는 것이다. 유동 제어 시스템에서, 고체 지지체는 평면 형태도 가능하지만, 핵산과 고체 지지체의 접촉 기회를 증가시켜 더 많은 핵산을 결합하기 위해 수 많은 기둥(pillar) 구조를 가질 수도 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA를 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 소변(urine), 타액(saliva), 접안렌즈액, 뇌척수액, 우유, 복수액(ascite fluid), 활액(synovial fluid), 복막강액, 양수, 조직, 발효 브로쓰, 세포 배양액, 핵산 증폭반응 산물, 핵산 합성 산물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 RNA를 포함하는 시료는 포유동물, 식물, 박테리아, 또는 효모 유래일 수 있다. 상기 시료는 단일 세포 형태 또는 조직 형태일 수 있으며, 세포 또는 조직은 시험관 내 배양물 유래일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 고체 지지체로부터 RNA의 용출 후에 용출된 RNA 를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용출된 RNA는 전기영동, 염기서열 결정 등에 의해 검출할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 고체 지지체로부터 RNA의 용출 후에 용출된 RNA를 역전사 및 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용출된 RNA이 미량이어서 직접 검출이 불가능한 경우에는 PCR 방법 등을 이용하여 용출된 RNA를 증폭함으로써 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 RNA의 증폭 단계는 RNA 용출 완충액의 제거 없이 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고체 지지체와 마이크로채널을 통해 연통되며, 고체 지지체에 코스모트로픽 염을 공급하는 코스모트로픽 염 용액 저장부; 및

고체 지지체를 포함하는, RNA 정제 장치를 제공한다.

본 발명의 RNA 정제 장치는 본질적으로 코스모트로픽 염 용액 저장부 및 고체 지지체로 이루어진다. 코스모트로픽 염 용액 저장부는 고체 지지체에 코스모트로픽 염을 공급하는 파트로서, 고체 지지체와 마이크로채널을 통해 연통되어 있다. 분리하고자 하는 RNA가 포함된 시료를 상기 장치에 도입하면, 코스모트로픽 염 용액 저장부에서 코스모트로픽 염을 고체 지지체에 공급하고, 거기에서 RNA를 포함하는 시료와 코스모트로픽 염이 혼합되고, RNA가 고체 지지체에 결합된다. 결합된 RNA를 용출하기 위해, 본 발명의 RNA 정제 장치는 고체 지지체와 마이크로채널을 통해 연통되며, 고체 지지체에 RNA 용출 완충액을 공급하는 RNA 용출 완충액 저장부를 추가로 구비할 수 있다.

본 발명의 장치에서, 상기 고체 지지체는 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 금속판 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 고체 지지체는 표면적을 넓히기 위해 글라스나 웨이퍼 같은 평평한 지지체의 경우 기둥(pillar) 형태로 표면을 가공하는 것도 가능하다.

본 발명의 장치에서, 코스모트로픽 염 용액 저장부에 저장되어 마이크로채널을 통해 고체 지지체로 공급되는 상기 코스모트로픽 염은 설페이트(SO₄ ^{2 -}), 포스페이트(HPO₄ ^{2 -}), 아세테이트(CH₃COO^-), 히드록사이드(OH^-), 클로라이드(Cl^-), 포르메이트(HCOO^-) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 장치에서, 상기 고체 지지체로부터 RNA의 용출 후에 용출된 RNA를역전사, 증폭 또는 검출할 수 있는 역전사 수행부, 핵산 증폭부 또는 검출부를 추가로 구비할 수 있다. 핵산 증폭부는 용출된 핵산이 미량이어서 직접 검출이 불가능한 경우에는 PCR 기기 등을 이용하여 용출된 핵산을 증폭할 수 있다. RNA 검출부는 용출된 RNA의 존재 여부를 알아보기 위해, 전기영동 장치, 염기 서열 결정기 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 RNA 정제 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 제공한다. 본 발명의 RNA 정제 장치는 각 기능적 구성요소를 공지된 마이크로플루이딕스 기술 및 MEMS 디바이스를 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip)으로 구현하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 더 나아가서는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)으로 구현될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 1M 이하의 코스모트로픽 염을 함유하는 산성 pH 용액을 사용하여 RNA를 정제하는 경우에, RNA 정제 효율이 현저하므로, 본 발명의 방법은 RNA의 정제에 효율적으로 이용될 수 있다. 특히, 본 발명은 200nt 이하의 작은 RNA를 정제하는데 효과적이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코스모트로픽 염 아세테이트를 이용한 RNA 정제 수율

Qiagen 키트(RNeasy^TM Protect Bacteria Mini Kit)에서 제공하는 프로토콜에 따라, 리소자임과 프로테이나제 K를 대장균에 처리하여 대장균 용해물(lysate)를 제조하였다.

대장균 용해물 200 μL(1 x 10⁸　~ 7.5 x 10⁸　세포수의 대장균 용해물)와 소디움 아세테이트(NaOAc) 1 mL을 혼합하여, 혼합용액에서의 최종 코스모트로픽 염 (NaOAc 기준) 0.1M 농도, pH는 빙초산을 사용하여 pH 4가 되도록 하였다. 상기 혼 합용액 650 μL를 Qiagen 키트의 칼럼(Qiagen RNeasy^TM Mini spin column, 실리카젤 멤브레인 컬럼)에 넣은 뒤 8000g에서 15초간 원심분리하였다. 3 mM NaCl를 포함하는 1 mM NaOAc 700 μL로 칼럼을 세척한 다음, 80% 에탄올을 포함하는 25 mM 트리스 완충액(pH 7)을 가하여 8000g에서 2분간 원심분리하였다. 칼럼을 새로운 1.5-mL 에펜도르프튜브로 옮긴 뒤, DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물 50 μL를 가하여 8000g에서 1분 원심분리하여 RNA를 용출하였다. Lab chip^TM Agilent사, USA)을 사용하여 RNA 용출액(eluate)에 존재하는 RNA양을 결정하였다(참조 도 1a). 상기에서 코스모트로픽 염의 농도는 0.3M, 0.6M, 1M, 3M로 달리하면서 실험하였다. 각 도면에서, 대조군은 Qiagen 키트에서 제공하는 프로토콜에 따라 RNA를 분리한 결과를 나타낸다.

RNA 용출액(eluate)에 잔존하는 DNA 오염 양은 PCR로 정량하였다(로슈의 LightCycler^TM FastStart DNA Master SYBR Green I kit 이용). PCR에 이용된 정방향 프라이머 (5'-YCC AKA CTC CTA CGG GAG GC-3': 서열번호 1) 및 역방향 프라이머 (5'-GTA TTA CCG CRR CTG CTG GCA C-3': 서열번호 2) 쌍은 대장균의 16S RNA에 해당하는 gDNA 부위를 증폭한다.　　PCR 증폭은 35 사이클(95℃에서 10분 동안 예비변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 13초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 신장)동안 수행하였다. 그 결과는 도 1b에 나타내었다.

또한, 수득한 RNA 총량 대비 gDNA 양의 중량 백분율은 하기 표1과 같다.

표 1.

대조군	0.1M NaOAc	0.3M NaOAc	0.6M NaOAc	1M NaOAc	3M NaOAc
3.79%	0.10%	0.03%	0.02%	0.53%	3.58%

실시예 2: 코스모트로픽 염 설페이트를 이용한 RNA 정제 수율

코스모트로픽 염 설페이트를 제공하기 위하여, 0.3M Na₂SO₄, 0.6M Na₂SO₄, 1M Na₂SO₄, 0.3M (NH₄)₂SO₄, 0.6M (NH₄)₂SO₄, 1M (NH₄)₂SO₄를 사용한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 이러한 염을 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼, pH 4.0에 용해시켜 결합 용액 (binding solution)을 제조하였다.

도 2a는 Na₂SO₄ 사용한 경우의 RNA 수율, 도 2b는 DNA 오염 정도를 나타낸다.

도 3a는 (NH₄)₂SO₄ 사용한 경우의 RNA 수율, 도 3b는 DNA 오염 정도를 나타낸다.

하기 표 2는 Na₂SO₄ 사용시 수득한 RNA 총량 대비 gDNA 양의 중량 백분율, 표 3은 (NH₄)₂SO₄ 사용시 수득한 RNA 총량 대비 gDNA 양의 중량 백분율을 각각 나타낸다.

표 2.

대조군	0.3M Na2SO4	0.6M Na2SO4	1M Na2SO4
5.20%	0.02%	0.01%	0.04%

표 3.

대조군	0.3M (NH4)2SO4	0.6M (NH4)2SO4	1M (NH4)2SO4
4.37%	0.04%	0.05%	0.39%

실시예 3: 코스모트로픽 염 클로라이드를 이용한 RNA 정제 수율

코스모트로픽 염 클로라이드를 제공하기 위하여, 0.3M NaCl, 0.6M NaCl, 1M NaCl, 2.5M NaCl를 사용한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실험하였다.

도 4a는 RNA 수율, 도 4b는 DNA 오염 정도를 나타낸다.

하기 표 4는 수득한 RNA 총량 대비 gDNA 양의 중량 백분율을 나타낸다.

표 4.

대조군	0.3M NaCl	0.6M NaCl	1M NaCl	2.5M NaCl
4.050%	0.07%	0.005%	2.292%	0.942%

도 5a는 상술한 코스모트로픽 염 아세테이트, 설페이트, 클로라이드를 사용한 경우의 RNA 수율 데이터를 하나의 그래프로 표현한 것이고, 도 5b는 DNA 오염 정도를 하나의 그래프로 표현한 것이다.

대체적으로 0.3M ~ 1M 이하의 코스모트로픽 염 용액에서 RNA 수율이 높으면서도 DNA 오염도가 가장 낮음을 알 수 있었다.

실시예 4: pH 에 따른 RNA 정제 수율

0.6M (NH₄)₂SO₄를 사용하고 대장균 용해물과의 혼합용액의 pH를 달리하면서 실험한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 이 경우, 산성 pH는 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼를 사용하여 조정하였고, pH 7.4 및 pH 8.8은 0.1M Tris-HCl를 사용하여 조정하였다.

도 6a는 pH에 따른 RNA 수율, 도 6b는 pH에 따른 DNA 오염 정도를 나타낸다.

하기 표 5는 수득한 RNA 총량 대비 gDNA 양의 중량 백분율을 나타낸다.

표 5.

pH 3	pH 4	pH 5.2	pH 7.4	pH 8.8
0.05%	0.05%	0.06%	0.57%	0.50%

상기 도 6a 및 도 6b, 표 5에서 보듯이, pH 3~6에서 RNA 수율이 높으면서도 DNA 오염도가 가장 낮음을 알 수 있었다.

따라서, 인체에 무해한 코스모트로픽 염을 사용하여 종래 방법(Qiagen 방법)보다 RNA 수율은 동등하나 gDNA 오염도를 수백 배 이상 감소시킴을 알 수 있었다.

실시예 5: 200 nt 이하 RNA 정제

0.6M Na₂SO₄를 사용하여 실험한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 분리한 RNA를 RNA 6000 Nano kit(Agilent사, USA)을 이용하여 측정하였다.

도 7a는 대조군의 RNA 분리 결과를 나타내고, 도 7b는 본 발명에 따른 RNA 분리 결과를 나타낸다. 도 7a 및 7b에서, 1.5kb 근처의 피크는 16S rRNA, 2.9kb 근처의 피크는 23S rRNA를 각각 나타낸다. 도 7a 및 7b에서 보듯이, 본 발명에 따른 RNA 분리 결과는 200nt 이하의 작은 RNA들이 얻어지는 것을 알 수 있었다.

200nt 이하 피크를 좀더 정밀하게 측정하기 위하여, Agilent Small RNA kit을 사용하였다. 도 8a는 대조군의 RNA 분리 결과를 나타내고, 도 8b는 본 발명에 따른 RNA 분리 결과를 나타낸다.

도 1a는 CH₃COONa 사용한 경우의 RNA 수율을 나타낸다.

도 1b는 CH₃COONa 사용한 경우의 DNA 오염 정도를 나타낸다.

도 2a는 Na₂SO₄ 사용한 경우의 RNA 수율을 나타낸다.

도 2b는 Na₂SO₄ 사용한 경우의 DNA 오염 정도를 나타낸다.

도 3a는 (NH₄)₂SO₄ 사용한 경우의 RNA 수율을 나타낸다.

도 3b는 (NH₄)₂SO₄ 사용한 경우의 DNA 오염 정도를 나타낸다.

도 4a는 NaCl 사용한 경우의 RNA 수율을 나타낸다.

도 4b는 NaCl 사용한 경우의 오염 정도를 나타낸다.

도 5a는 상술한 코스모트로픽 염 아세테이트, 설페이트, 클로라이드를 사용한 경우의 RNA 수율 데이터를 하나의 그래프로 표현한 것이다.

도 5b는 상술한 코스모트로픽 염 아세테이트, 설페이트, 클로라이드를 사용한 경우의 DNA 오염 정도를 하나의 그래프로 표현한 것이다.

도 6a는 pH에 따른 RNA 수율을 나타낸다.

도 6b는 pH에 따른 DNA 오염 정도를 나타낸다.

도 7a는 대조군에서 분리한 RNA를 RNA 6000 나노 키트로 분석한 결과를 나타낸다.

도 7b는 본 발명에 따라 분리한 RNA를 RNA 6000 나노 키트로 분석한 결과를 나타낸다.

도 8a는 대조군에서 분리한 RNA를 Agilent Small RNA 키트로 분석한 결과를 나타낸다.

도 8b는 본 발명에 따라 분리한 RNA를 Agilent Small RNA 키트로 분석한 결과를 나타낸다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Method for purifying RNA from biological material on solid support using kosmotropic anion <130> PN075103 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 yccakactcc tacgggaggc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtattaccgc rrctgctggc ac 22

Claims (12)

1. RNA 함유 시료와 코스모트로픽 염 (kosmotropic salt)을 1M 이하의 농도로 포함하는 산성 pH의 용액을 고체 지지체 상에 접촉시켜, RNA를 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는 RNA의 정제 방법으로서,

   RNA를 상기 고체 지지체에 결합시킨 후, 코스모트로픽 염 (kosmotropic salt)을 1M 이하의 농도로 포함하는 산성 pH의 용액으로 1차 세척하는 단계를 더 포함하고, 상기 방법은 200 뉴클레오티드 이하의 작은 RNA(small RNA)를 선택적으로 정제하기 위한 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 코스모트로픽 염은 설페이트(SO₄ ^{2 -}), 포스페이트(HPO₄ ^2-), 아세테이트(CH₃COO^-), 히드록사이드(OH^-), 클로라이드(Cl^-) 및 포르메이트(HCOO^-)로 구성된 군으로부터 선택되는 음이온의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 농도는 0.3M 내지 0.9M인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 산성 pH는 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 1차 세척액으로 1차 세척한 후, 중성 완충액으로 2차 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 1차 세척액 또는 2차 세척에 사용되는 중성 완충액은 알코올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 물 또는 RNA 용출 완충액을 첨가하여 상기 고체 지지체에 결합된 RNA를 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리카, 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 평면, 기둥(pillar), 비드, 및 체(sieve) 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 RNA 용출 완충액은 10mM 이하의 염(salt)을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 RNA 용출 완충액의 pH는 4 내지 10인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제

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