KR101442261B1 - 암시야 및 명시야 조명을 위한 현미경 조명장치 및 어댑터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 집광기의 입구 슬릿 (64) 에 초점이 형성되는 광원과 대물렌즈와 집광기가 샘플 (32) 상에 초점을 찾기 위해 조절되도록 상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈 (12) 를 포함하는 암시야 조명 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 본질적으로 구조화된 조명을 사용하여 개선된 조명 시스템을 얻는다. 또한 본 발명은 아이리스가 닫히면 암시야 상만이 생성되고 아이리스가 열리면 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어가 명시야 조명이 생성되도록 대물렌즈가 아이리스 (65) 에 결합 되고 집광기와 정렬되는 시스템과 방법을 포함한다.

Description

암시야 및 명시야 조명을 위한 현미경 조명장치 및 어댑터{MICROSCOPE ILLUMINATION DEVICE AND ADAPTER FOR DARK AND BRIGHT-FIELD ILLUMINATION}

본 발명은 현미경 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 고해상도 광학 현미경의 분야에 관한 것이다.

도 1a 와 도 1b 는 2종류의 빛 조명을 나타낸다. 도 1a 는 명시야 조명(Bright Field illumination) (10) 을 나타낸다. 이 명시야 조명은 (현미경의)대물렌즈 (12) 의 구경이 집광기(condenser)(미도시) 보다 작거나 같을 때 존재한다. 명시야 조명의 주 특징은 모든 빛 (14) 이 대물렌즈에 들어간다는 것이다.

도 1b 는 암시야 조명 (Dark Field illumination) (16) 을 나타낸다. 이 암시야 조명 (16) 은 대물렌즈 (12) 의 구경이 집광 렌즈의 구경보다 작을 때 존재한다. 집광 렌즈에서 나간 직광(direct light)은 암시야 조명 (16)에서 대물렌즈 (12) 에 들어가지 않는다. 그러나 예컨대 집광렌즈의 부정렬은 시스템에서 배경광 또는 노이즈를 발생시킬 수 있는데 이는 명암비(contrast)를 감소시키게 된다. 그러므로 암시야 조명 (16)에서는 조명 시스템의 원형 대칭이 요구된다.

암시야 조명 (16) 은 명시야 조명 (10) 에 비해 몇몇 특유의 이점을 갖는다. 암시야 조명 (16) 은 명시야 조명 (10)보다 훨씬 더 높은 명암비와 더 우수한 빛 효율을 갖는다.

도 1c 는 도 1b 의 암시야 현미경과 관련된 정렬 문제를 나타낸다. 뒤에서 보다 자세히 설명하겠지만 광로 (14) 의 각이 샘플과 적절히 교차하고 조명할 수 있도록 광원 (18), 집광기 (20) 및 액시콘 렌즈 (22) 는 완벽하게 정렬되어야 한다. 도 1b 와 1c 는 도 1a 를 단순화시킨 것인데, 도 1a 와 1b 모두에는 집광기, 액시콘 렌즈 및 광원 (18) 이 나타나 있지 않으나, 도 1a 와 1b 에 도시된 명시야 및 암시야 현미경은 각각 이러한 구성요소들을 포함할 수 있기 때문이다.

암시야 조명 (16) 에는 다양한 조명 방법이 사용된다. 일반적으로 사용되는 2가지 방법은 임계 조명과 코흘러 조명이다. 도 2a 는 임계 조명 (24) 을 나타낸다. 이 시스템은 균일한 밝기의 광원 (18), 다이어프램 (28), 집광기 조리개 (26), 집광기 (20), 슬라이드 (30), 이 슬라이드 (30) 에 결합된 샘플 (32), 및 현미경 래물렌즈 (12) 를 포함한다. 이 조명 방법에서 균일한 밝기의 광원 (18) 은 다이어프램 뒤에 근접하여 배치되며 집광기 (20) 에 의해 현미경 대물렌즈 (12) 의 물체면에 상이 맺히게 된다. 시야 조리개 구경의 크기는 집광기 (20) 에 의한 상이 시야(field)만 덮도록 조절된다. 대물렌즈 (12) 의 물체 랜스에 있는 임의의 쌍의 점에 대한 복합 간섭도는 집광기 조리개 (26) 를 채우는 비간섭 원(incoherent source)에 의한 것과 같으며 더욱이 이는 집광기 (20) 의 수차(aberration)와는 독립적이다. 광원 (18) 은 샘플 (32) 에 초점이 형성된다. 분해능은 물체에 입사하는 빛의 간섭도와 현미경 대물렌즈 (12) 의 특성에만 의존하게 된다. 집광기 (20) 의 수차는 현미경의 분해능에 영향을 주지 않는다.

도 2b 는 코흘러 시스템 (34) 에 적절한 종래기술의 현미경 시스템 내의 코흘러 조명 (34) 방법을 나타낸다. 이 시스템은 광원 (18), 보조 렌즈 (36), 다이어프램 (28), 집광기 조리개 (26), 집광기 (20), 슬라이드 (30), 이 슬라이 (30) 에 결합된 샘플 (32), 및 현미경 대물렌즈 (12) 를 포함한다. 이 방법에서 보조 렌즈 (36) 는 다이어프램 (28) 근처에 배치되며, 집광기 다이어프램 (28) 을 포함하는 집광기 (20) 의 초점면에 광원의 상을 형성하게 된다. 각각의 광원 (18) 점에서 나온 광선은 다음에 집광기 (20)로부터 평행 광선으로 나가게 된다. 광원 (18) 은 집광기 (20) 의 조리개에 초점이 형성된다. 광원의 밝기 분포에 불균일성이 있더라도 시야 조명의 세기가 불균일하게 되지 않는다.

또한 최근에 고해상 광학 현미경은 세포 생물학과 나노과학의 요구로 발전하였다. 형광 현미경에서 상 해상도는 수십 나노미터인 것으로 밝혀졌다. 그러나 투과 및 반사 현미경에서 현대의 공초점 기구에서도 가시광 조명을 사용해도 측방 상 해상도는 180nm를 능가하지 않는 것으로 보고되어 있다.

본 발명은 집광기의 입구 슬릿에 고정되는 광원과 대물렌즈와 집광기가 샘플상에 초점을 찾기 위해 조절되도록 상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈를 포함하는 암시야 조명 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 본질적으로 구조화된 조명을 사용하여 개선된 조명 시스템을 얻는다. 또한 본 발명은 아이리스가 닫히면 암시야 상만이 생성되고 아이리스가 열리면 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어가 명시야 조명이 생기도록 대물렌즈가 아이리스에 결합 되고 집광기와 정렬되는 시스템과 방법을 포함한다.

본 발명의 일 양태에서 샘플을 조명하는 조명 시스템은 집광기의 입구 슬릿에 초점이 형성되는 광원과 상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈를 포함하며 상기 대물렌즈와 집광기는 샘플상에 초점을 찾기 위해 조절된다. 본 시스템은 또한 광원을 집광기의 입구 슬릿에 초점을 형성시키는 수단을 더 포함하며 초점 형성 수단은 시준 렌즈와 광 안내부 및/또는 평면 거울을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서 샘플 조명 방법은 대물렌즈와 집광기를 정렬시키는 단계 및 샘플상에 초점을 찾기 위해 대물렌즈와 집광기를 조절하는 단계를 포함한다. 광원은 고정수단으로 집광기의 입구 슬릿에 초점이 형성되고 초점 형성 수단은 시준 렌즈와 광 안내부 및/또는 평면 거울을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서 혼합 조명을 생성하기 위한 고해상도 시스템은집광기의 환상 입구 슬릿상으로 초점이 형성되는 광원과 상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈를 포함하며 상기 대물렌즈에 결합된 아이리스가 열려 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어갈 수 있다. 대물 렌즈의 전방 렌즈는 대물 렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되고 대물 렌즈는 고 구경 현미경 대물 렌즈이다. 본 시스템은 집광기의 입구 슬릿을 조명하기 위한 어댑터와 집광기의 입구 슬릿을 조명하기 위한 액시콘 렌즈를 더 포함한다. 집광기는 광원의 입구 포트 및 시준 렌즈와 미리 정렬되며 상기 시스템은 광원과 시준 렌즈 사이에 결합되는 광 안내부 및/또는 광원에서 나온 빛을 집광기의 입구 슬릿쪽으로 반사시키는 평면 거울을 더 포함한다. 상기 조명 시스템은 회절 무늬를 발생시키며 좁아진 점퍼짐 함수(PSF)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고해상도 시스템에서 혼합 조명을 생성시키는 방법은 광원을 집광기의 환상 입구에 초점을 형성시키는 단계와 대물렌즈와 집광기를 정렬시키는 단계 및 상기 대물렌즈에 결합된 아이리스를 열어 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어갈 수 있게 하는 단계를 포함한다. 본 방법은 대물 렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 대물렌즈의 전방 렌즈를 조명하는 단계를 더 포함하며 대물 렌즈는 고 구경 현미경 대물 렌즈이다.

본 방법은 어댑터 또는 액시콘 렌즈로 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 단계를 더 포함한다. 본 방법은 집광기를 광원의 입구 포트 및 시준 렌즈와 미리 정렬시키는 단계 광원과 시준 렌즈 사이에 광 안내부를 결합시키는 단계 및 광원에서 나온 빛을 집광기의 입구 슬릿쪽으로 반사시키는 평면 거울을 제공하는 단계를 더 포함한다. 또한 상기 조명 시스템은 회절 무늬를 발생시키고 좁아진 점퍼짐 함수(PSF)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서 암시야 조명을 생성시키기 위한 고해상도 시스템은 집광기의 환상 입구 슬릿상으로 초점이 형성되는 광원과 대물렌즈를 포함하며 상기 대물렌즈는 아이리스에 결합되고 또한 집광기와 정렬되며 아이리스가 닫혀 암시야 상만이 생성된다. 대물렌즈의 전방 렌즈는 대물렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되고 대물렌즈는 고 구경 현미경 대물렌즈이다. 본 시스템은 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 어댑터 및/또는 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 액시콘 렌즈를 더 포함한다. 집광기는 광원의 입구 포트 및 시준 렌즈와 미리 정렬된다.

본 발명의 또 다른 양태에서 혼합 조명을 생성하기 위한 고해상도 시스템은 집광기의 환상 입구 슬릿상으로 초점이 형성되는 광원과 대물렌즈를 포함하며 상기 대물렌즈는 아이리스에 결합되고 또한 집광기와 정렬되며 아이리스가 열려 빛이 대물렌즈안으로 직접 들어갈 수 있을 때 실질적으로 명시야 조명이 생성되고 아이리스가 닫힐 때는 암시야 조명만 생기게 된다. 대물렌즈의 전방 렌즈는 대물렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되고 대물렌즈는 고 구경 현미경 대물렌즈이다. 상기 시스템은 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 어댑터및/또는 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 액시콘 렌즈를 더 포함하며 집광기는 광원의 입구 포트 및 시준 렌즈와 미리 정렬된다.

도 1a 는 종래기술의 명시야 조명 시스템의 블럭선도이다.

도 1b 는 종래기술의 암시야 조명 시스템의 블럭선도이다.

도 1c 는 종래기술의 암시야 조명 시스템의 블럭선도이다.

도 2a 는 종래기술의 임계 조명 시스템의 도식도이다.

도 2b 는 종래기술의 코흘러 조명 시스템의 도식도이다.

도 3 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 암시야 어댑터의 도식도이다.

도 4 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스템의 블럭선도이다.

도 5 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스템의 블럭선도이다.

도 6a 와 도 6b 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 환상을 갖는 조명 시스템 과 아이리스 집광기를 갖는 대물렌즈를 보여주는 도식도이다.

도 7a 는 NA=1.4 를 갖는 50nm 반경의 불투명 디스크를 갖는 카디오이드 집광기의 상과 세기를 나타낸다.

도 7b 는 NA=1.4 를 갖는 50nm 반경의 불투명 디스크를 갖는 명시야 집광기의 상과 세기를 나타낸다.

도 7c 는 NA=1.1 를 갖는 50nm 반경의 불투명 디스크를 갖는 카디오이드 집광기의 상과 세기를 나타낸다.

도 7d 는 NA=0.7 를 갖는 50nm 반경의 불투명 디스크를 갖는 카디오이드 집광기의 상과 세기를 나타낸다.

본 발명은 광원, 광 안내부, 어댑터 또는 액시콘(axicon) 렌즈에 결합될 수 있는 시준(collimation) 시스템, 거울 및 집광기를 포함하는 조명 시스템을 포함한다. 이 조명 시스템은 거의 완벽한 광학 정렬을 가질 수 있다. 본 시스템은 높은 빛 효율과 함께 완벽한 원형 대칭성을 제공한다. 선택적인 어댑터와 선택적인 액시콘 렌즈는 빛을 절약하고 또한 이용가능한 모든 빛을 집광기의 슬릿 안으로 보낸다. 이 집광기는 구면 수차를 방지할 수 있다. 광학 어댑터 및/또는 선택적인 액시콘 렌즈는 빛이 집광기의 입구 슬릿을 통해 환상으로 들어갈 수 있게 해준다.

본 발명의 조명 시스템의 특징은 코흘러 조명의 주 원리와 임계 조명의 주 특성에 있다. 코흘러 조명은 시스템에서 광학적 설계에 의해 미리 설정되고 고정되며 따라서 광원을 집광기의 입구 슬릿에 초점을 형성시킨다. 본 조명 시스템은 집광기에서 나온 빛을 샘플에 초점을 형성시키기 위해 조절될 수 있고(위 또는 아래로), 임계 조명의 주 특성 중의 하나를 특징으로 한다. 따라서 코흘러 조명은 초기에 고정되며 다음에 본 발명의 조명 시스템이 조명 지점의 적절한 위치와 크기를 찾기 위해 위 또는 아래로 조절될 수 있고 이는 임계 조명의 주 특징이다.

상기 조명 시스템의 전술한 특징은 현재의 표준 암시야, 형광 현미경 및 TIRF 현미경으로는 얻을 수 없는 증가된 명암비 및 해상도를 제공한다. TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경은 단면 조명(single sided illumination)만 제공한다. 본 발명의 조명 시스템은 360°대칭의 원형 조명을 제공한다.

본 시스템은 살아 있는 세포 및 일어나고 있는 세포 과정을 보여줄 수 있다. 조명 공간이 작기 때문에 스캐닝 없이 3차원 섹셔닝(sectioning)이 가능하다. 형광의 선택적인 여기(excitation)는 초점외 빛을 제거할 수 있고 종래의 형광 현미경에 존재하는 광표백을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 조명 시스템은 종래의 에피 형광 시스템에 비해 4배 이상 우수한 빛효율 및 더 높은 투과 효율을 갖는다. 따라서 더 작은 점 크기로도 샘플의 명암비가 증가되고 표백이 감소하게 된다.

본 발명의 조명 시스템은 바람직하게 자기 포함적이고 휴대가 가능하다. 이 시스템은 표준 광투과 현미경에도 쉽게 설치될 수 있다. 본 장치는 배치, 중심 맞춤 및 초점 형성(focusing)이 쉽고 또한 숙련된 작업자에 의한 정렬과 조작이 필요 없다.

본 발명의 조명 시스템은 의학, 생의학 산업, 제약 산업, 혈액학, 법의학, 식품산업, 군사 및 다른 분야에 사용될 수 있다.

도 5 는 본 발명의 조명 시스템 (40) 의 일 실시형태를 나타낸다. 도 5 에서 광원 (18) 에서 나온 빛은 광 안내부 (60) 를 지나 하나 이상의 시준 렌즈 (58) 에 전달된다. 그리고 나서 상기 빛은 선택적인 평면 거울 (62) 에서 반사되어 암시야 집광기 (20) 의 입구 슬릿 또는 조리개 (26) 에 초점이 형성된다. 집광기 (20) 는 빛을 샘플 (32) 에 보내 초점을 형성시킨다. 도 5 에서 보는 바와 같이 빛은 하나 이상의 입구 슬릿 또는 조리개 (26) 를 지나 집광기 (20) 에 들어가게 된다. 시스템 (40) 의 렌즈들 중 하나를 조절하여 들어오는 빛을 슬릿 (26) 의 내부 가장자리 또는 슬릿 (26) 의 외부 가장자리 쪽으로 보낼 수 있다. 빛을 슬릿 (6) 의 내부 가장자리 쪽으로 가게 하면 해상도가 낮아지게 되나 빛의 세기는 더 커지게 된다. 빛을 슬릿 (26) 의 외부 가장자리 쪽으로 가게 하면 해상도가 높게 되나 빛의 세기는 더 낮아지게 된다.

도 4 는 본 발명의 조명 시스템 (40) 의 대안적인 실시형태를 나타낸다. 도 4 에서 어댑터 (42) 가 광 안내부 (60) 와 집광기 (20) 사이에 결합 되어 있다. 이 어댑터 (42) 는 더 양호한 빛 효율을 제공하고 집광기 (20) 와 함께 사용될 수 있어 어댑터는 암시야 집광기의 공동부 내에 끼워 맞춤 될 수 있는 크기와 형태로 되어 있으며 이에 의해 광원 (18) 과 집광기 (20) 사이의 피팅(fitting)을 제공된다. 상기한 바와 같이 어댑터 (42) 는 액시콘 렌즈 (미도시) 로 대체될 수 있다.

도 3 은 조명 시스템 (40) 에 사용되는 어댑터를 나타낸다. 이 어댑터는 외부 스페이서 (spacer: 48), 내부 스페이서 (50), 광섬유 (52), 제 1 단부 (44) 근 처에 있는 평행 광선 (54), 및 제 2 단부 (46) 근처에 있는 원통형 광선 (56) 을 포함한다. 중심 축선은 사용중인 집광기와 현미경의 배향에 일반적으로 평행한 방향으로 어댑터 (42) 를 통해 연장되어 있다.

조명의 질을 증가시켜 암시야 현미경에서 샘플이 보이는 명확성을 개선하는 것 외에도 이 어댑터 (42) 는 광원에서 요구되는 전력을 80∼87% 만큼 줄일 수 있다. 또한 어댑터 (42) 는 기존의 암시야 현미경에서도 쉽게 이용될 수 있다.

본 발명의 조명 시스템은 120nm 보다 낮은 해상도와 50nm 아래의 검출도를 달성할 수 있다.

종래의 광학 현미경의 해상도는 빛의 파동성으로 제한되며 통상적으로 레일리 기준으로 정해진다. 이는 일반적으로 회절 한계 해상도 (∼240nm의 한계)라고 한다. 본 발명의 조명 시스템 (40) 에서는 조명 시스템의 해상도가 회절 한계를 훨씬 넘어 확장되게 하는 비회절 한계 광학 효과와 개선된 점퍼짐 함수(point spread function)가 얻어진다.

이들 광학 효과 중 일부는 정지 소멸파, 플라스몬(plasmon) 공명 및 형광을 포함한다. 상기 시스템 (40) 의 높은 기하학적 개구수(numerical aperture)는 TIRF 와 유사하게 정지 소멸파의 발생을 위한 이상적인 조건을 준다. 또한 샘플의 전도성에 따라 국소 표면 플라스몬 공명 (LSPR) 이 발생하게 되는데 이는 탄소 나노튜브 및 다른 나노 물질의 관찰을 가능케 하며 또한 공간 해상도의 손실 없이 우수한 명암비를 제공한다. 광자(photon)는 또한 입자처럼 거동하기 때문에 매우 작은 물체에 의해서도 진로방향이 바뀌거나 산란될 수 있다. 그러므로 매우 작은 물체(예 컨대 바이러스 입자)도 시스템 (40) 의 높은 명암비로 인해 그 시스템을 사용해 쉽게 괸찰할 수 있다.

최근에 고해상도 광학 현미경은 세포 생물학과 나노과학의 요구로 발전하였다. 형광 현미경에서 수십 나노미터의 상 해상도가 나타난 것으로 밝혀졌다. 그러나 현대의 공초점 기구에서도 가시광 조명을 사용하는 투과 및 반사 현미경에서 측방 상 해상도가 180nm를 능가하지 않는 것으로 보고되어 있다.

90 nm 해상도

본 발명의 시스템 (40) 은 고 구경 카디오이드 환상 집광기 (20) (이하, 환상 A-집광기라고 한다)를 사용하여 얻어진 상에서 90nm 해상도를 갖는다. 도 6a 와 도 6b 를 참조하면 본 시스템은 많이 경사진 중공의 빛 원추체를 생성시킨다. 아이리스 (iris: 65) 를 갖는 고 구경 현미경 대물렌즈 (12) 와 결합하여 본 시스템은 두개의 다른 조명 방식을 제공한다. 아이리스 (65) 가 닫혀 직광이 샘플 (32) 을 통과한 후 대물렌즈 (12)(도 6a)에 들어가지 못하면 굴절, 산란 또는 회절된 빛만 대물렌즈 (12) 에 들어가게 된다(도 6a). 아이리스 (65) 가 열려 빛이 대물렌즈 (12) 에 직접 들어가면 대물렌즈 (12) 의 전방 렌즈는 대물렌즈 (12) 에 들어가는 빛의 빈 원추체에 의해 생긴 환상의 빛으로 조명된다(도 6b). 이 경우 암시야 조명과 경사 중공 원추체 명시야 조명이 결합된 혼합 조명이 얻어진다. 카디오이드 집광기 (20) 는 조명 시스템의 일체적인 부분이며 따라서 이 시스템은 시준 렌즈 및 집광기의 환상 입구 슬릿에 광원의 초점을 형성시키는 제 1 표면 거울을 포함한다. 조명 시스템의 일 부분으로서 집광기는 미리 정렬되고 따라서 추가적인 정렬은 불필요하다.

보통의 명시야 집광기(이하, 원형 C-집광기라고 한다)를 대체하여 상기 조명 시스템을 Olympus BX51 현미경에 배치한다. 이 조명 시스템은 액체 광 안내부에 의해 광원에 연결된다. 이 작업에 사용되는 대물렌즈는 라이카(Leica)에서 만든 무한 보정 대물렌즈 HCX PL APO 100x/1.40-0.70, 오일, 아이리스이다. 상은 자체 제작한 중간 줌렌즈인 40x 릴레이 렌즈로 확대되어 펠티어-냉각식 카메라와 디멘젼 8200 델 컴퓨터에 의해 캡쳐된다. 현미경은 진동 절연대 상에 배치된다. 올핌푸스 명시야 집광기를 갖는 조명 시스템을 재배치하고 EXFO120 광원을 올림푸스 X-Cite 120 어댑터로 후방 현미경 광포트에 연결하여 명시야 상을 얻었다. 모든 상은 리챠드슨 시험 슬라이드를 사용해 만들어졌다.

이미지화를 위해 선택된 고배율의 기하학적 패턴은 200nm 중심 간격에서 100nm 폭을 갖는 일련의 선들을 게공하는 수직 격자 어레이, 250nm∼50nm 범위의 수직/수평 해상도 바 세트, 및 4㎛∼60nm 범위의 솔리드 원을 포함한다. 라챠드슨 슬라이드의 패턴은 JEOL 7000F 전계 방출 스캐닝 전자 현미경으로 시험되었다. 스케일은 NIST 트레이서블 마스터 시스템으로 보정되었다. 시험 슬라이드상의 원의 실제 직경을 구하였고 회절 패턴을 이미지화하고 분석하는데 이들 원을 사용하였다.

향상된 분해능을 이해하기 위해, C-조명 시스템과 A-조명 시스템(C-원형, A-환상)의 경우 모두에 대한 광학 상 결과의 회절 이론에 대해 설명한다. 간단히 하기 위해, 상이 평가하기 쉬운 컴팩트 적분으로 주어질 때 반경 r=50nm 인 불투명 디스크가 축대칭인 경우에 대해 계산을 하도록 한다. 또한, 물체의 크기는 사용되는 빛의 파장 λ _o =546nm 에 비해 작기 때문에 완전한 간섭성의 조명 조건이 보장된다. 실험으로, 현미경 대물렌즈의 개구수 (N) 가 0.7∼1.4 로 상이한 경우에 대해 50nm 반경 디스크의 상(유리 리챠드슨 슬라이드상의 크롬막 원)을 측정하였다. 이론이 실험과 잘 일치하여 해상도가 개선되는 메카니즘을 명확히 보여준다.

간섭성 광학 시스템으로 형성된 상에서 빛의 진폭 U ₁ (x ₁ , y ₁ )은 물체면의 입력 U ₀ (x ₀ , y ₀ ) 와 점퍼짐 함수(PSF)P(x,y) 의 컨벌루션(convolution)으로 표시될 수 있다.

(1)

먼저 물체의 투명한 부분을 기하학적으로 통과하는 광속이 입구 퓨필(pupil)에 도달할 때 명시야 방식을 고려한다. C-집광기는 모든 퓨필을 채우는 개구수 N=1.4 를 갖는 빛 원추체를 형성한다. A-집광기의 경우, 1.2∼1.4 의 N 을 갖는 중공 빛 원추체는 입구 퓨필의 대응하는 주변 링만 조명한다(도 6b). 예컨대 개구수 N=1.4 이고 반경 a 의 퓨필에서 조명된 링의 내경 및 외경은 εa 와 a 이고 여기서 ε=1.2/1.4=0.86이다 (N=1.2 보다 작은 입구 구경은 암시야 방식에 대응하고 이후에 별도로 고려하겠다). 도함수를 제외하면 식 (1)에서 불투명 스크린에서 원형 구멍의 상은 다음과 같은 식으로 된다.

(2)

여기서 ρ₁ 은 상면(image plane)에서의 반경이고 J ₀ (x) 와 J ₁ (x) 는 베셀 함수이며 κ₀=2π/λ₀이고 여기서 λ₀은 진공 중 빛의 파장이다. 이 결과는 ε=0 (C-집광기)에 대해 Martin 에 의해 유도되었고 여기서 명시야 모드(0<ε≤1)에서 A-집광기에 대해 일반화된다. 예상한바 대로 점형 구멍(r→0)의 경우 식 (2) 는 환상(εa≤ρ≤a)의 입구 퓨필에 대해서는 알려진 PSF 함수로 된다. 입구 구경이 무한대로 증가하면(a→∞) 회절 무늬(fringe)가 사라지고 상은 단순히 밝은 원으로 된다. 그러나 일반적인 경우 식 (2) 의 적분을 위한 명확한 공식은 없지만 상용 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다. 마지막으로 Babibet의 원리를 사용하여 불투명 원형 디스크의 상은 다음과 같은 식으로 된다.

U _d (ρ ₁ )=U- U ₁ (ρ ₁ ) (3)

여기서 U 는 물체가 없는 경우의 진폭으로 이 경우에는 디스크(r=50nm)의 작은 각도 크기 때문에 일정하다. 실험에서 세기는 I _d (ρ ₁ )=｜U _d (ρ ₁ )｜² 으로 측정된다.

다음, 암시야 방식(도 6a) 을 고려해 본다. A-집광기 (20) 의 경우 이 암시야 방식은 아이리스 (65) 다이어프램이 입구 구경을 N＜1.2 로 줄일 때 일어난다. 크롬 디스크에 의해 산란 되는 빛의 파장을 설명하기 위해 도체구가 회절에 관한 Mie 의 이론을 따른다고 생각한다. 구의 반경 r＜λ₀ 인 경우 산란의 극 다이어그램 은 강하게 이방성을 보이며 최대값은 입사 광선을 따르는 방향에서 다음과 같이 나타난다.

u₀(ζ)=cos^mζ (4)

m 이 커질 때 빛은 앞 방향 ζ=0 주의에 초점이 형성된다.

입구 구경에서 결과적인 빛 분포는 아래의 식으로 표현된다.

(5)

PSF 에 대한 일반적인 공식을 사용하면 암시야 방식에 대해 아래와 같은 식을 쓸 수 있다.

(6)

마지막으로, 식 (1) 에 식 (6) 을 대입하면, 암시야에서 상은 아래의 식으로 나타난다.

(7)

여기서, 간단히 하기 위해 벡터 ρ 는 점 (x,y) 을 나타낸다.

도 7a 와 7b 는 50nm 반경의 불투명 디스크의 상과 세기를 점철한 것이다. 여기서 NA=1.4 는 도 7a 에서 카디오이드 집광기를 사용하여 도 7b 에서는 올림푸 스 명시야 집광기를 사용하여 얻은 것이다. 도 7c 는 NA=1.1 을 갖는 카디오이드 집광기의 상과 세기를 점철한 것이고 도 7d 는 NA=0.7 을 갖는 카디오이드 집광기의 상과 세기를 점철한 것이다. 도 7a 와 7b는 C-집광기 와 A-집광기 모두에 대해 이론과 실험이 잘 일치함을 보여준다. 특히 A-집광기에 있어서 이론은 제 1 회절링의 위치와 높이뿐만 아니라 중심 최소 형상도 정확하게 설명할 수 있다(도 7a). 피팅은 m=6일 때 식 (5)에서 미지의 파라미터만 정해준다.

유명한 레일리 기준의 관점에서 도 7a 와 도 7b 에서 R=0.61(λ ₀ /N)=238nm 을 예측하는 결과를 고려해 보는 것이 흥미롭다. 알려져 있듯이 R 은 등방적으로 비추는 점광원과 원형 입구 개구에 대한 Airy 패턴에서 어두운 제 1 링의 반경이다. 실험에 의하면 C-집광기의 경우 상기 반경은 260nm(도 7b)이고 예상한 바와 같이 상으로 나타난 디스크의 유한한 크기 r=50nm 때문에 R=238nm보다 약간 크다. 현저하게도 A-집광기의 경우 관찰된 반경 165nm(도 7a) 는 R 보다 (238/165)=1.44 배 작다. 정말 이는 놀라운 것은 아니지만 명시야 방식에서 A-집광기가 입구 퓨필의 주변 링만 조명하기 때문에 입구 개구가 환상일 때 알려져 있는 바와 같이 회절 패턴에서 중심점이 좁게 되는 것과 일치한다. 유사 하지만 보다 작은 협소화가 도 7c 와 도 7d 의 암시야 상에서 관찰되는데 여기서 어두운 부분의 측정 반경은 N=1.1 에서 270nm 이고(도 7c), N=0.7에서 420nm 이며(도 7d), 레일리 기준 값보다 1.1 배와 1.15 배 작다. 이 또한 입구 퓨필에서의 산란광의 환상 분포로 인한 것이다. 임의의 진폭 퓨필 필터에 대한 우리의 수학적 해석(나타내지 않음)으로 PSF 협소화 에 대한 상한을 x₁/x₀=3.83/2.40=1.6 배로 규정한다. 여기서 x₀ 및 x₁ 은 베셀 함수 J ₀ (x) 와 J ₁ (x) 의 첫번째 양의 루트이다.

명시야에서 환상 A-집광기의 실제적인 해상도는 λ₀/5 보다 양호하다. 이해상도는 사용된 개구수 N=1.4 에 대해 레일리 기준 R=λ₀/2.3 의 2.2 배를 능가한다. 발표된 이론에 따르면 향상된 상 해상도는 두가지 이유로 설명된다. 먼저 환상 A-집광기의 경우 PSF는 더 협소해진다. 둘째 A-집광기의 경우 PSF의 회절 무늬는 강하고 (도 7a), 위상이 π 만큼 변하게 된다. 여기서 식 (1) 에서 물체 형상을 갖는 PSF 컨벌루션은 상에지를 덜 흐리게 하는데 이 효과는 간섭성 조명에 대해서는 나타난다.

이제 이론과 실험을 비교해 보겠다. 명시야에서 식 (2) 중의 모든 값들이 알려져 있고 상기 텍스트에 열거되어 있기 때문에 계산에는 어떠한 피팅 파라미터도 포함되지 않는다.

결론적으로 λ₀ /5 또는 90nm 보다 우수한 해상도가 카디오이드 환상 집광기 (20) (도 6) 를 갖는 자체 제작된 조명 시스템만을 사용하여 수정된 표준 연구용 투과 광학 현미경을 사용한 이미지화에서 증명되었다. 이러한 분해능은 어떠한 상 후처리도 하지 않고 시각적인 관찰 또는 CCD 카메라 기록으로 얻어진다. 보고된 데이타 외에도 살아 있는 세포의 실시간 이미지화에서 높은 해상도가 관찰된다. 향상된 해상도는 이미지화 시스템의 고전적인 회절 이론에 완전히 따르며 고 구경 간섭 성 환상 조명에서 얻어지는 것으로 나타났다.

본 발명의 구성과 작용 원리에 대한 이해를 위해 본 발명을 상세한 설명을 포함한 특정 실시형태를 가지고 설명하였다. 전술한 특정 실시형태와 이의 상세 내용은 본 명세서에 딸린 청구범위를 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고 전술한 실시형태에서 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (40)

1. 집광기의 입구 슬릿에서 초점(focal point)이 형성되는 광원과,

   상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈를 포함하며,

   상기 대물렌즈와 집광기는 샘플상에 초점을 찾기 위해 수직 방향으로 조절되는 조명 시스템.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 광원이 상기 집광기의 입구 슬릿에 초점이 형성되도록 하는 초점 형성 수단을 더 포함하는, 조명 시스템.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 초점 형성 수단은 시준 렌즈와 광 안내부를 포함하는 조명 시스템.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 초점 형성 수단은 평면 거울을 포함하는 조명 시스템.
5. 집광기의 입구 슬릿에 광원의 초점을 형성시키는 단계와,

   대물렌즈와 집광기를 정렬시키는 단계, 및

   샘플상에 초점을 찾기 위해 대물렌즈와 집광기를 수직 방향으로 조절하는 단계를 포함하는 샘플 조명 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 광원은 고정수단으로 집광기의 입구 슬릿에 고정되는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 고정수단은 시준 렌즈와 광 안내부를 포함하는 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 고정수단은 평면 거울을 포함하는 방법.
9. 집광기의 환상 입구 슬릿에 초점이 형성되는 광원과,

   상기 집광기와 정렬되는 대물렌즈를 포함하며,

   상기 대물렌즈에 결합된 아이리스가 열려 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어갈 수 있는,

   혼합 조명을 생성하기 위한 고해상도 조명 시스템.
10. 제 9 항에 있어서, 대물 렌즈의 전방 렌즈는 대물 렌즈에 들어가는 광의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되는, 조명 시스템.
11. 제 9 항에 있어서, 대물 렌즈는 고 구경 현미경 대물 렌즈인 시스템.
12. 제 9 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하기 위한 어댑터를 더 포함하는 시스템.
13. 제 9 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하기 위한 액시콘 렌즈를 더 포함하는 시스템.
14. 제 9 항에 있어서, 상기 광원과 집광기 간에 배치된 시준 렌즈를 더 포함하는, 시스템.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 광원과 상기 시준 렌즈 사이에 결합되는 광 안내부를 더 포함하는, 시스템.
16. 제 15 항에 있어서, 광원에서 나온 빛을 집광기의 입구 슬릿쪽으로 반사시키는 평면 거울을 더 포함하는 시스템.
17. 제 9 항에 있어서, 조명 시스템은 회절 무늬를 발생시키는 시스템.
18. 제 9 항에 있어서, 조명 시스템은 좁아진 점퍼짐 함수(PSF)를 제공하는 시스템.
19. 광원을 집광기의 환상 입구에 초점을 형성시키는 단계와,

    대물렌즈와 집광기를 정렬시키는 단계, 및

    상기 대물렌즈에 결합된 아이리스를 열어, 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어갈 수 있게 하는 단계를 포함하는,

    고해상도 조명 시스템에서 혼합 조명을 생성시키는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 대물 렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 대물렌즈의 전방 렌즈를 조명하는 단계를 더 포함하는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 대물 렌즈는 고 구경 현미경 대물 렌즈인 방법.
22. 제 20 항에 있어서, 어댑터로 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 단계를 더 포함하는 방법.
23. 제 20 항에 있어서, 액시콘 렌즈로 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 단계를 더 포함하는 방법.
24. 제 19 항에 있어서, 상기 집광기와 광원 간에 시준 렌즈를 배치하는 단계를 더 포함하는, 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 광원과 시준 렌즈 사이에 광 안내부를 결합시키는 단계를 더 포함하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 광원에서 나온 빛을 집광기의 입구 슬릿쪽으로 반사시키는 평면 거울을 제공하는 단계를 더 포함하는 방법.
27. 제 19 항에 있어서, 조명 시스템은 회절 무늬를 발생시키는 방법.
28. 제 19 항에 있어서, 조명 시스템은 좁아진 점퍼짐 함수(PSF)를 제공하는 방법.
29. 집광기의 환상 입구 슬릿에서 초점이 형성되는 광원과,

    대물렌즈를 포함하며,

    상기 대물렌즈는 아이리스에 결합되고 또한 집광기와 정렬되며,

    아이리스가 닫혀 암시야 상만이 생성되는,

    암시야 조명을 생성시키기 위한 고해상도 시스템.
30. 제 29 항에 있어서, 대물렌즈의 전방 렌즈는 대물렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되는 시스템.
31. 제 29 항에 있어서, 대물렌즈는 고 구경 현미경 대물렌즈인 시스템.
32. 제 29 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 어댑터를 더 포함하는 시스템.
33. 제 29 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 액시콘 렌즈를 더 포함하는 시스템.
34. 제 29 항에 있어서, 상기 광원과 집광기 간에 배치된 시준 렌즈를 더 포함하는 시스템.
35. 집광기의 환상 입구 슬릿에서 초점이 형성되는 광원과,

    대물렌즈를 포함하며,

    상기 대물렌즈는 아이리스에 결합되고 또한 집광기와 정렬되며,

    아이리스가 열려 빛이 대물렌즈 안으로 직접 들어갈 수 있을 때, 실질적으로 명시야 조명이 생성되고, 아이리스가 닫힐 때는 암시야 조명만 생기는,

    혼합 조명을 생성하기 위한 고해상도 시스템.
36. 제 35 항에 있어서, 대물렌즈의 전방 렌즈는 대물렌즈에 들어가는 빛의 빈 원추체로 생성된 환상 빛으로 조명되는 시스템.
37. 제 35 항에 있어서, 대물렌즈는 고 구경 현미경 대물렌즈인 시스템.
38. 제 35 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 어댑터를 더 포함하는 시스템.
39. 제 35 항에 있어서, 집광기의 입구 슬릿을 조명하는 액시콘 렌즈를 더 포함하는 시스템.
40. 제 35 항에 있어서, 상기 광원과 집광기 간에 배치된 시준 렌즈를 더 포함하는 시스템.

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