KR101447560B1

KR101447560B1 - 인간 ｄｙｒｋ１ａ 유전자 형질전환 초파리를 이용한 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101447560B1
Application number: KR1020120008991A
Authority: KR
Inventors: 유권; 이규선; 김애경
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2014-10-10
Also published as: WO2013115508A1; KR20130087812A

Abstract

본 발명은 인간 다운증후군 유전자 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 DYRK1A의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자 형질전환 초파리, 이의 제조 방법, 및 상기 형질전환 초파리를 이용한 다운증후군 관련 표현형 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 인간 다운증후군 유전자(DYRK1A) 또는 minibrain가 형질전환된 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRK1A 또는 minibrain을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고, 기존의 생쥐 모델과 비교하여 조작이 용이하고, 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을 나타내므로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 ＤＹＲＫ１Ａ 유전자 형질전환 초파리를 이용한 치료제 스크리닝 방법{method for screening agent using transgenic drosophila melanogaster expressing human DYRK1A gene}

본 발명은 인간 다운증후군 유전자 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 DYRK1A의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자 형질전환 초파리, 이의 제조 방법 및 상기 형질전환 초파리를 이용한 다운증후군 관련 표현형을 치료하기 위한 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

다운증후군(Down Syndrome)이란 인간 21번 염색체의 삼배체(trisomy)에 의해 발생하는 염색체 이상 질환으로 정신지체, 학습장애 및 기억감퇴, 알츠하이머 병의 조기 발병, 그리고 두개 안면 장애 등의 증상이 나타난다. 특히, 인간 염색체 21번의 '다운증후군 임계역(Down syndrome critical region, DSCR)'으로 명명된 특정부위에 존재하는 유전자들의 발현량 변화가 다운증후군 발병을 초래하는 것으로 추정된다. 이 가운데 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A)는 신경중추의 발달 및 기능에 중요한 역할을 수행하는 유전자로 다양한 단백질의 인산화에 관여하는 효소이다. 특히, 학습장애와 기억감퇴, 시냅스의 유연성 변화, 비정상적 세포주기 및 알츠하이머성 치매와 유사한 신경병리학적 증세에 관여하는 유전자로 이 단백질이 가진 생화학적, 기능적, 분자생물학적 효과를 이해하는 것은 다운증후군에 관련된 질환의 병인을 규명하고 다운증후군에 관련된 신경 결함 치료제 개발에 필수적이다.

특히, 다운 증후군의 경우, 신생아 700명에 한 명 정도로 발생하는 가장 빈번한 염색체 이상 증후군이다. 인종, 환경, 사회 경제적 차이에 관계없이 일정한 비율로 발생하며 산모의 나이가 35세 이상이 되면 그 발생빈도가 높아지며, 40세 이상의 산모가 출산을 할 경우, 100 명당 1명 출생 빈도를 갖는다. 현대의학으로 이러한 유전적 이상을 예방하는 방법은 존재하지 않으며 단지 출생 전에 유전자 검사를 통하여 태아의 다운증후군 여부를 확인할 수 있을 뿐이다.

다운증후군 환자의 질환 예후로 다음과 같은 공통된 신체적 특징을 가지고 있다. 모든 신체에 증상들이 나타나며 이로 인해 다운증후군 아동의 경우, 뇌기능 저하에 따른 행동 발달지체를 보인다. 환자의 30~40%는 심장판막 이상 같은 선천성 심장질환(congenital heart disease) 병을 가지고 태어나며 면역력 저하에 따른 폐렴 및 백혈병, 장 폐쇄, 장염 등의 빈도도 높은 것으로 나타난다. 의료기술의 발달로 대부분의 증상이 치료 또는 예방이 가능하게 되어 다운증후군의 평균 수명이 50세까지 늘어나고 있는 추세이다. 그러나 현재까지 뇌신경계 기능저하 및 신경퇴행성 증상에 대한 치료제 개발 성과는 전무하며, 인지능력을 향상시킨다는 Piracetam의 효과도 다운증후군 아동에게서는 효과가 나타나지 않는 것으로 확인되었다(Lobaugh, N. J. et al. (2001). "Piracetam therapy does not enhance cognitive functioning in children with down syndrome." Arch Pediatr Adolesc Med 155: 442-448). 따라서 다운증후군 환자의 뇌신경계 이상의 근본적인 원인 기작의 규명을 통해 치료제 개발이 시급한 것으로 사료된다.

이를 위해서 다운증후군의 원인으로 생각되는 인간염색체 21번 전체가 아닌 21번 염색체 내의 주요 유전자에 각각에 대한 분자생물학적 병인학적 연구가 요구되며, 증상에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 부분을 연구한 결과 Down Syndrome Critical Region(DSCR)이라 불리는 4~5 Mb 영역에 위치한 유전자들이 뇌기능저하를 비롯한 여러 증상에 관여할 가능성이 높은 것으로 알려져 이곳에 위치한 유전자에 대한 연구가 요구된다. 다운증후군의 뇌기능저하에 대한 기존 연구를 살펴보면, 2000년 염색체 21번의 염기서열이 해독되어 적어도 225개의 유전자가 존재함을 밝혔다(Hattori, M. et al. (2000). "The DNA sequence of human chromosome 21." Nature 405: 311-319). 특히, 과다 발현에 의해서 뇌기능저하의 원인으로 예상되는 후보 유전자가 시공간적인 발현양상 및 신경계(뇌)에서의 역할 등을 근거로 다수 발굴 되었다(Benavides-Piccione, R. et al. (2004). "On dendrites in Down syndrome and DS murine models: a spiny way to learn." Prog Neurobiol 74: 111-126; Altafaj, X. et al. (2001). "Neurodevelopmental delay, motor abnormalities and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing Dyrk1A (minibrain), a murine model of Down's syndrome." Hum Mol Genet 10: 1915-1923; Epstein, C.J. et al. (1987). "Transgenic mice with increased Cu/Zn-superoxide dismutase activity: animal model of dosage effects in Down syndrome." Proc Natl Acad Sci U S A 84: 8044-8048; Lamb, B.T. et al. (1993). "Introduction and expression of the 400 kilobase amyloid precursor protein gene in transgenic mice." Nat Genet 5: 22-30.; Chrast, R. et al. (2000). "Mice trisomic for a bacterial artificial chromosome with the single-minded 2 gene (Sim2) show phenotypes similar to some of those present in the partial trisomy 16 mouse models of Down syndrome." Hum Mol Genet 9: 1853-1864).

이들 유전자들 가운데 DYRK1A의 경우 형질전환 생쥐가 다운증후군에서 보이는 학습과 기억능력 저하를 보이는 주요 유전자의 하나로 알려져 있다(Smith, D.J. et al. (1997). "Functional screening of 2 Mb of human chromosome 21q22.2 in transgenic mice implicates minibrain in learning defects associated with Down syndrome." Nat Genet 16: 28-36; Altafaj, X. et al. (2001). "Neurodevelopmental delay, motor abnormalities and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing Dyrk1A (minibrain), a murine model of Down's syndrome." Hum Mol Genet 10: 1915-1923).

기존의 DYRK1A 형질전환 생쥐는 두 가지의 모델로 제시되었으며, 첫 번째로 DYRK1A를 인접 부위를 포함한 YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 도입하여 제작한 생쥐이며(Smith, D. J. et al. (1997). "Functional screening of 2 Mb of human chromosome 21q22.2 in transgenic mice implicates minibrain in learning defects associated with Down syndrome." Nat Genet 16(1): 28-36), 두 번째는 DYRK1A의 cDNA만 도입된 형질전환 생쥐로 외래의 프로모터(promoter)를 이용하여 발현시킨 모델이다(Altafaj, X. et al. (2001). "Neurodevelopmental delay, motor abnormalities and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing Dyrk1A (minibrain), a murine model of Down's syndrome." Hum Mol Genet 10: 1915-1923). 그러나, 상기 YAC 벡터가 도입된 형질전환 생쥐는, YAC 벡터에 DYRK1A 이외의 다수의 유전자가 포함되어 있어 유전자 특이적인 효과 및 치료제 스크리닝에 타 유전자의 방해현상을 배제할 수 없는 문제점이 있으며, 외래 프로모터를 이용하여 DYRK1A cDNA 발현을 유도하는 형질전환 생쥐에서는 발현양상이 원래의 유전자와 동일하지 못하며, 형질전환 생쥐의 질환 특이적인 표현형이 약하여 약물 스크리닝에 이용하기에는 한계가 있는 것으로 사료된다. 최근 인간의 hDYRK1A의 YAC 벡터를 이용한 형질전환 생쥐가 개발되어 다운증후군 치료제 개발의 스크리닝 모델로 제시가 된바 있다(Ahn, KJ., et al. (2006). "DYRK1A BAC transgenic mice show altered synaptic plasticity with learning and memory defects." Neurobiol Dis. 22(3):463-72). 그러나, 약물 스크리닝에 이용되는 생쥐 모델의 비용 및 시간상의 한계점이 있는 것으로 판단된다.

초파리 모델은 인간의 질병 유전자의 80% 이상이 잘 보존되어 있으며, 이전의 많은 연구결과들도 초파리가 인간의 질병에 대한 증상이 같고, 저렴한 비용으로 대량의 신약 스크리닝이 가능한 장점을 가지고 있어 신약개발에 대한 이용가치가 높음을 보고하고 있다(Giacomotto J et al.(2010) Br J Pharmacol. 160(2):204-16).

특히, 초파리의 minibrain 유전자는 DYRK1A의 초파리 상동 유전자로 신경발달에 관계가 있음이 최초로 보고된 DYRK1A군의 유전자로 배아단계에서부터 성체의 신경계에 다량 발현하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 초파리의 기억과 학습을 담당하는 버섯모양체(mushroom body)를 포함하여 다양한 신경조직에 발현되는 것으로 확인되었다. 또한, minibrain 돌연변이 초파리의 경우 정상 초파리에 비해 뇌조직의 크기가 유의적으로 감소하며, 행동장애를 보이는 것으로 확인되어 초파리의 DYRK1A인 minibrain 유전자가 뇌신경계 기능에 중요한 기능을 보유하는 것을 보고한 바 있다 (Tejedor, F., et al. (1995). "minibrain: a new protein kinase family involved in postembryonic neurogenesis in Drosophila." Neuron 14: 287-301).

이에, 본 발명자들은 다운증후군 증상 조절에 관한 근본적인 치료제 개발을 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 인간 다운증후군 유전자 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 상기 DYRK1A의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리를 제조한 후, 상기 형질전환된 초파리가 신경계 특이적으로 hDYRK1A을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 형질전환된 초파리를 다운증후군 관련 표현형을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 1) 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 이용하여 다운증후군 관련 표현형을 치료하기 위한 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 실험군으로 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 hDYRK1A 유전자 발현 변화를 측정하는 단계; 및

3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRK1A 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 초파리의 수명을 측정하는 단계; 및

3) 무처리 대조군 초파리와 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 운동능력을 측정하는 단계; 및

3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 운동능력을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동능력 저하 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 인간 다운증후군 유전자(DYRK1A) 또는 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRK1A을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고, 기존의 생쥐모델과 비교하여 조작이 용이하고, 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을 나타내므로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 발현 벡터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 minibrain E 발현 벡터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 minibrain H 발현 벡터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다.
도 4는 hDYRK1A 및 minibrain 형질전환 초파리의 유전자 과발현 효과 확인한 도이다:
Elav - Gal4: 대조군 초파리;
Elav>hDYRK1A: 인간다운증후군 hDYRK1A 형질전환 초파리;
Elav>minibrain: 초파리 minibrain 형질전환 초파리; 및
Elav>minibrain -H: 초파리 minibrain-H 형질전환 초파리.
도 5는 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인한 도이다:
ElvaGS>hDYRK1A-RU: hDYRK1A 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리;
ElvaGS>hDYRK1A+RU: hDYRK1A 유전자 과발현 초파리;
ElvaGS>mnb-RU: minibrain 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리; 및
ElvaGS>mnb+RU: minibrain 유전자 과발현 초파리;
도 6은 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화를 확인한 도이다:
ElvaGS>hDYRK1A-RU: hDYRK1A 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리;
ElvaGS>hDYRK1A+RU: hDYRK1A 유전자 과발현 초파리;
ElvaGS>mnb-RU: minibrain 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리; 및
ElvaGS>mnb+RU: minibrain 유전자 과발현 초파리;
도 7은 minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달양상을 분석한 도이다:
Elva>syt-GFP: 대조군 초파리;및
Elva>syt-GFP;minibrain: minibrain 유전자 형질전환 초파리.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

또한, 본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 DYRK1A 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 minibrain 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 벡터는 인간 DYRK1A 유전자 또는 minibrain 유전자를 포함하는 것이 바람직하나, DYRK 유전자의 서브타입(subtype)인 DYRK1B, DYRK2 또는 DYRK4 유전자를 포함할 수도 있다.

상기 단계 2)의 벡터는 UAS 벡터인 것이 바람직하고, 인간 DYRK1A 또는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS 벡터는 P-인자 매개 생식세포 형질전환방법(P-element-mediated germ line transformation)을 이용하여 초파리에 도입되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 초파리는 노랑초파리(drosophila melanogaster)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 다운증후군 발병 유전자로 알려진 인간 DYRK1A 유전자 또는 이의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자를 포함하는 형질전환 초파리를 제조하기 위하여, DYRK1A 및 minibrain 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조한 다음, P-인자 매개 생식세포 형질전환(P-element-mediated germ line transformation)을 통해 UAS-hDYRK1A와 UAS-minibrain 발현 벡터로 형질전환된 초파리를 제조하였다(도 1 내지 도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 hDYRK1A 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 hDYRK1A 유전자(도 4A 참조) 및 minibrain 유전자(도 4b 참조)가 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동능력 변화를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 6 참조).

아울러, 본 발명자들은 minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달을 측정하기 위하여, GFP 형광물질을 이용하여 측정한 결과, minibrain 유전자가 과발현된 경우, 다양한 신경 발생 이상이 확인되어 인간 다운증후군의 뇌신경계 이상과 minibrain 유전자 과발현에 의한 신경계 이상이 연관이 있음을 확인하였다(도 7 참조).

따라서, 본 발명의 다운증후군 유전자(DYRK1A 또는 minibrain)가 형질전환된 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRK1A 또는 minibrain을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고, 기존의 생쥐모델과 비교하여 조작이 용이하고, 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을 나타내므로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은,

1) 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및

3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현 변화는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 hDYRK1A 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 hDYRK1A 유전자(도 4A 참조) 및 minibrain 유전자(도 4b 참조)가 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명은,

3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다(도 5 참조).

아울러, 본 발명은,

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동능력 변화를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 6 참조).

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 초파리 준비 및 사육

초파리는 25℃를 유지한 상태에서 사육하였고, 대조군으로 사용한 Elav-Gal4 및 Elav-GeneSwitch-Gal4 형질전환 초파리는 Lee, ks., et al 등이 발표한 내용에 기재되어 있다(Lee, KS., et al., (2009), J. Biol. Chem 284(43):29454-61). 또한, UAS-hDYRK1A와 UAS-minibrain 형질전환 초파리는 하기 <실시예 2>에 기재한 방법에 따라 제작하여 사용하였다.

< 실시예 2> UAS - hDYRK1A 및 UAS - minibrain 형질전환 초파리의 제조

<2-1> DYRK1A 발현 벡터의 클로닝

인간의 다운증후군 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 유전자를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여 pENTR223.1 vector (Invitrogen, 미국)에 인간의 DYRK1A 유전자(Genebank number: BC156309; 서열번호 1)가 들어있는 cDNA clone(Openbiosystem, 미국)을 구입한 후, 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용하여 하기와 같은 방법으로 클로닝을 수행하였다.

구체적으로, pENTR223.1-DYRK1A 벡터 150 ng과 UAS 벡터 150 ng을 섞어 TE 버퍼(buffer)로 8㎕까지 채운 후, LR Clonase II 효소(Invitrogen, 미국)를 2㎕ 넣어 25℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 UAS-DYRK1A 벡터를 제작하였다(도 1).

<2-2> minibrain E 발현 벡터의 클로닝

DYRK1A 유전자의 초파리 상동 유전자인 Drosophila minibrain E를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여, mnb E(Genebank number:NM_167581.2; 서열번호 2) 염기서열을 토대로 하기와 같이 클로닝을 수행하였다.

구체적으로, 먼저 초파리로부터 easy-BLUE RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, 한국)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, 전체 RNA 3 ㎍과 Oligo-dT 1 ㎕(Invitrogen, 미국)에 증류수를 13 ㎕까지 채운 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국)을 이용하여 반응시켰다. 그런 다음, 65℃에서 5분, 4℃에서 2분, 50℃에서 60 분, 70℃에서 15 분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 1 ㎕을 주형으로 하여, mnb E (N-term)의 분리를 위해 서열번호 4(5'-CCATGTATAGATTAGAGGATACGAATAG-3') 및 서열번호 5(5'-ACCGCCTGTTTCCACTCCGAGGATG-3')의 프라이머 쌍과 mnb E (C-term)의 분리를 위하여 서열번호 6(5'-AGTATCTGCTCGACCAGGCGCACAAG-3') 및 서열번호 7(5'-GTGGAGGCGTTGGTTGGCGGTGCAAT-3')의 프라이머 쌍을 각각 PCR mastermix(iNtRON Biotechnology, 한국)를 이용하여 95℃에서 5 분 동안 변성해 주고, 95℃ 30 초, 58℃ 30 초, 72℃ 1 분 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후, 72℃에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 냉각의 순서로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 DNA 단편을 pGEMEasy vector system(Promega, 미국)을 이용하여 각각 pGEMEasy-mnb E(N-term)과 pGEMEasy-mnb E(C-term) 벡터를 제작하였다. mnb E의 full-length ORF를 가지는 벡터 제작을 위하여 1281bp 위치에 존재하는 HindIII 제한효소를 이용하였다. pGEMEasy-mnb E (N-term)을 HindIII 제한효소로 잘라 준비하고, pGEMEasy-mnb E(C-term)을 HindIII와 SpeI(Roche, 미국)으로 잘라 mnb E(C- term) 부분을 준비하였다. 각각 준비된 단편들은 DNA ligase(Bioneer, 한국)를 이용하여 연결함으로써 pGEMEasy-mnb E(full-length) 벡터를 제작하였다.

또한, mnb E(full-length)를 가지는 형질전환초파리를 만들기 위하여 하기와 같은 방법으로 UAS-mnb E(full-length)를 제작하였다.

구체적으로, pGEMEasy-mnb E(full-length) 벡터와 UAS 벡터를 제한효소 EcoRI(Roche, 미국)으로 잘라 mnb E(full-length) 단편과 선형화된 UAS 벡터를 DNA ligase(Bioneer, 한국)를 사용하여 UAS-mnb E(full-length) 벡터를 제작하였다(도 2).

<2-3> minibrain H 발현 벡터의 클로닝

DYRK1A 유전자의 초파리 상동 유전자인 Drosophila minibrain H를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여, mnb H(Genebank number: NM_170659.2; 서열번호 3) 염기서열을 바탕으로 클로닝을 수행하였다. mnb H (N-term) 분리를 위하여 상기 초파리 cDNA 1 ㎕을 주형으로 하여, 서열번호 8(5'-GCGATTCCGATTGCCAGTGATATGT-3') 및 서열번호 9(5'-ACCGCCTGTTTCCACTCCGAGGATG-3') 프라이머 쌍을 PCR mastermix(iNtRON Biotechnology, 한국)를 이용하여 95℃에서 5 분 동안 변성해 주고, 95℃ 30 초, 58℃ 30 초, 72℃ 1 분 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후, 72℃에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 냉각의 순서로 PCR을 수행하였다. 이 PCR 단편을 pGEMEasy vector system(Promega, 미국)을 사용하여 pGEMEasy-mnb H(N-term) 벡터를 제작하였다. mnb H의 C-term 부분은 mnb E(C-term)과 같은 염기서열로 이루어져 있으므로 mnb H(C-term) 을 분리하는 대신 mnb E(C-term) 을 사용하였다. mnb H(full-length)는 mnb H의 1717bp 부분에 존재하는 HindIII 제한효소를 이용하여 하기와 같이 제작하였다. pGEMEasy-mnb H (N-term)을 HindIII 제한효소로 잘라 준비하고, pGEMEasy-mnb E (C-term)을 HindIII와 SpeI (Roche, 미국)으로 잘라 mnb E (C-term)부분을 준비한 후, 각각의 단편들을 DNA ligase (Bioneer, 한국)를 이용하여 pGEMEasy-mnb H (full-length) 벡터를 제작하였다.

또한, mnb H (full-length)를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여 pGEMEasy-mnb H(full-length) 벡터와 UAS 벡터를 제한효소 EcoRI (Roche, 미국)으로 잘라 mnb H(full-length) 단편과 선형화된 UAS 벡터를 DNA ligase (Bioneer, 한국)를 이용하여 연결함으로써 UAS-mnb H (full-length) 벡터를 제작하였다(도 3).

<2-4> hDYRK1A 및 minibrain 발현 벡터의 초파리 형질 전환

상기 실시예 <2-2> 및 <2-3>에서 제조된 hDYRK1A 및 minibrain 발현 벡터를 초파리에 형질전환하기 위하여, 공지의 방법인 P-인자 매개 생식세포 형질전환(P-element-mediated germ line transformation)을 통해 UAS-hDYRK1A와 UAS-minibrain 발현 벡터로 형질전환된 초파리를 수득하였다[Rubin GM et al .(1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. 357 Science 218: 348-353].

<2-5> hDYRK1A 및 minibrain 형질전환 초파리의 유전자 과발현 효과 확인

상기 실시예 <2-4>에서 제조된 hDYRK1A 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 초파리의 Gal4/UAS 시스템을 이용하여 신경계 특이적인 Elav-Gal4에 각각 UAS-hDYRK1A 형질전환 초파리와 UAS-minibrain 형질전환 초파리를 교배한 후 얻어진 Elav>hDYRK1A, Elav>minibrain과 대조군인 Elav-Gal4 초파리의 머리를 분리하여 cDNA를 합성한 후 hDYRK1A 프라이머 및 minibrain 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로, cDNA의 합성은 easy-BLUE RNA extraction kit를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 ㎍과 Oligo-dT 1 ㎕(Invitrogen, 미국)에 증류수를 13 ㎕까지 채운 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국)에 넣어 반응시켰다. 65℃에서 5분, 4℃에서 2분, 50℃에서 60 분, 70℃에서 15 분, 4℃에서 5 분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 1 ㎕을 주형으로 하여, 서열번호 10(5'-TGATTGCACCAACAGGTCCAGA-3')과 서열번호 11(5'-TTCTCCCAATTCAACCGCTCA-3')의 hDYRK1A 프라이머 쌍 및 서열번호 12(5'-CGTGACTTCAATTGGATAAATAGCT-3')와 서열번호 13(5'-GCTGAAATTGACCCTCAGGTCC-3') minibrain 프라이머 쌍 및 PCR Premix(Bioneer, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 5 분 동안 변성해 주고, 95℃ 30 초, 60℃ 30 초, 72℃ 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후, 72℃에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 냉각의 순서로 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, hDYRK1A 유전자(도 4A) 및 minibrain 유전자(도 4b)는 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4).

< 실험예 1> hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과 확인

hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템 및 유도성 유전자 발현(inducible gene expression) 시스템인 유전자 스위치(GeneSwitch)를 이용하여 성체의 신경계 특이적으로 hDYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현을 유도하기 위해 ElavGeneSwitch-Gal4(ElavGS-Gal4)와 UAS-hDYRK1A를 교배하여 알을 받은 후 번데기에서 깨어난 2일 이내의 형질전환 초파리 성체 100마리를 이용하여 초파리 수명을 측정하였다. 수명 측정은 유전자 스위치(GeneSwitch)를 활성화시키는 RU486이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 대조군 배지를 이용하였으며 3일 단위로 배양기 내에 사체를 개수하여 수명 측정을 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 유전자 발현을 유도하지 않은 대조군 (ElavGS>hDYRK1A-RU, Maxiam lifespan=57, Midian Lifespan=34)에 비해서 hDYRK1A 유전자 과발현(ElavGS>hDYRK1A+RU, Maxiam lifespan=45, Midian Lifespan=22)에 의해 유의적으로 수명이 단축되는 것을 확인하였다(도 5A). 또한, minibrain 과발현 (ElavGS>minibrain+RU, Maxiam lifespan=36, Midian Lifespan=19)에 의해서도 유의적으로 수명이 단축되는 것으로 확인되어(도 5B), 초파리에서 hDYRK1A 및 minibrain의 과발현에 의해서 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다.

< 실험예 2> hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화 확인

hDYRK1 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템 및 유도성 유전자 발현(inducible gene expression) 시스템인 유전자 스위치(GeneSwitch)를 이용하여 성체의 신경계 특이적으로 hDYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현을 유도하기 위해 ElavGeneSwitch-Gal4 (ElavGS-Gal4)와 UAS-hDYRK1A를 교배하여 알을 받은 후 번데기에서 깨어난 2일 이내의 형질전환 초파리 성체를 유전자 스위치(GeneSwitch)를 활성화시키는 RU486이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 대조군 배지를 이용하여 30일까지 배양한 후 30일이 된 성체를 이용하여 입구가 막힌 10ml 피펫에 초파리를 1마리씩 위치시킨 후 단위시간(30초) 내의 초파리의 이동거리를 측정하여 hDYRK1A 및 minibrain의 과발현에 따른 운동 능력 (locomotion activity) 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 hDYRK1A 및 minibrain 과발현에 따라 노화에 따른 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 6).

< 실험예 3> minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달 분석

minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달을 분석하기 위하여, 초파리의 Gal4/UAS 시스템을 이용하여 신경계 특이적으로 형광단백질이 발현되는 driver인 Elav-Gal4;UAS-GFP를 이용하여 UAS-minibrain 형질전환 초파리를 교배한 후 얻어진 Elav>GFP:minibrain과 대조군인 Elav>GFP 초파리의 배아를 24시간 동안 수집한 후 난각을 탈각시킨 후 고정액에 고정하여 GFP 발현을 통해 신경계 발달 양상을 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 정상형(Elav>sytGFP)의 초파리의 중추신경계(Central nerve system)와 부신경계(peripheral nerve system)의 발달 및 신경계 망구조 형성이 잘 이루어진 반면(도 7A), minibrain 과발현의 경우, 시엽(Optic lobe) 및 복식경색(ventral nerve cord)의 발달 이상(도 7B 및 도 7C), 중추-부신경계간 신경망 형성 이상(도 7D) 등 다양한 신경 발생 이상이 확인되어 인간 다운증후군의 뇌신경계 이상과 minibrain 과발현에 의한 신경계 발생이상의 표현형이 연관이 있음을 확인하였다(도 7).

<110> korea research institute of bioscience & biotechnology <120> method for screening agent using transgenic drosophila melanogaster expressing human DYRK1A gene <130> 11p-10-73 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtacaaaaaa gcagaagggc cgtcaaggcc caccatgcat acaggaggag agacttcagc 60 atgcaaacct tcatctgttc ggcttgcacc gtcattttca ttccatgctg ctggccttca 120 gatggctgga cagatgcccc attcacatca gtacagtgac cgtcgccagc caaacataag 180 tgaccaacag gtttctgcct tatcatattc tgaccagatt cagcaacctc taactaacca 240 ggtgatgcct gatattgtca tgttacagag gcggatgccc caaaccttcc gtgacccagc 300 aactgctccc ctgagaaaac tttctgttga cttgatcaaa acatacaagc atattaatga 360 ggtttactat gcaaaaaaga agcgaagaca ccaacagggc cagggagacg attctagtca 420 taagaaggaa cggaaggttt acaatgatgg ttatgatgat gataactatg attatattgt 480 aaaaaacgga gaaaagtgga tggatcgtta cgaaattgac tccttgatag gcaaaggttc 540 ctttggacag gttgtaaagg catatgatcg tgtggagcaa gaatgggttg ccattaaaat 600 aataaagaac aagaaggctt ttctgaatca agcacagata gaagtgcgac ttcttgagct 660 catgaacaaa catgacactg aaatgaaata ctacatagtg catttgaaac gccactttat 720 gtttcgaaac catctctgtt tagtttttga aatgctgtcc tacaacctct atgacttgct 780 gagaaacacc aatttccgag gggtctcttt gaacctaaca cgaaagtttg cgcaacagat 840 gtgcactgca ctgcttttcc ttgcgactcc agaacttagt atcattcact gtgatctaaa 900 acctgaaaat atccttcttt gtaaccccaa acgcagtgca atcaagatag ttgactttgg 960 cagttcttgt cagttggggc agaggatata ccagtatatt cagagtcgct tttatcggtc 1020 tccagaggtg ctactgggaa tgccttatga ccttgccatt gatatgtggt ccctcgggtg 1080 tattttggtt gaaatgcaca ctggagaacc tctgttcagt ggtgccaatg aggtagatca 1140 gatgaataaa atagtggaag ttctgggtat tccacctgct catattcttg accaagcacc 1200 aaaagcaaga aagttctttg agaagttgcc agatggcact tggaacttaa agaagaccaa 1260 agatggaaaa cgggagtaca aaccaccagg aacccgtaaa cttcataaca ttcttggagt 1320 ggaaacagga ggacctggtg ggcgacgtgc tggggagtca ggtcatacgg tcgctgacta 1380 cttgaagttc aaagacctca ttttaaggat gcttgattat gaccccaaaa ctcgaattca 1440 accttattat gctctgcagc acagtttctt caagaaaaca gctgatgaag gtacaaatac 1500 aagtaatagt gtatctacaa gccccgccat ggagcagtct cagtcttcgg gcaccacctc 1560 cagtacatcg tcaagctcag gtggctcatc ggggacaagc aacagtggga gagcccggtc 1620 ggatccgacg caccagcatc ggcacagtgg tgggcacttc acagctgccg tgcaggccat 1680 ggactgcgag acacacagtc cccaggtgcg tcagcaattt cctgctcctc ttggttggtc 1740 aggcactgaa gctcctacac aggtcactgt tgaaactcat cctgttcaag aaacaacctt 1800 tcatgtagcc cctcaacaga atgcattgca tcatcaccat ggtaacagtt cccatcacca 1860 tcaccaccac caccaccatc accaccacca tggacaacaa gccttgggta accggaccag 1920 gccaagggtc tacaattctc caacgaatag ctcctctacc caagattcta tggaggttgg 1980 ccacagtcac cactccatga catccctgtc ttcctcaacg acttcttcct cgacatcttc 2040 ctcctctact ggtaaccaag gcaatcaggc ctaccagaat cgcccagtgg ctgctaatac 2100 cttggacttt ggacagaatg gagctatgga cgttaatttg accgtctact ccaatccccg 2160 ccaagagact ggcatagctg gacatccaac ataccaattt tctgctaata caggtcctgc 2220 acattacatg actgaaggac atctgacaat gaggcaaggg gctgatagag aagagtcccc 2280 catgacagga gtttgtgtgc aacagagtcc tgtagctagc tcgtcaggcc tcatgggccc 2340 agctttcttg tac 2353 <210> 2 <211> 5504 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 2 atcatcgcga gtggctaacc cagctctgaa agggaagcaa gacacctaaa agcagcaaca 60 aaatgcgcag cgcggaaaca caggcggcgt gttaaataaa ataataatat atagtcggtg 120 cagctggccg tgtgtggccg ctggaaaaac gggaaaagcg tttacacagt gctttttatt 180 tagcattttc tccgtttcgc ccgtgtctgt gtatgcgtgt gttgcgtgcg tgagtgtgcg 240 tgtttttttt tcctcatttg gtgtgtgctt tttttttgta cattgcggag acgcgctctt 300 ttttgtggca gacgggcgga aaagatgaaa aaccgcagag agagcgtcga aaattgatgg 360 gaaaatgtat aaagtttgtt aattgatcgt tttcgaaatg aaagcataga aaaaggagca 420 gcaacggcgg cagcagcaac aacaacaaca acgagtaacg aaaaacggca aaattttttt 480 gtttgcctcg tatcgcattt tctcactctc tctctctccc gctgcgtgtg tgtgtgagtg 540 tgtgtgtgcg cgtcacatat cgacgtccct ctcttgccac cgacaacaac aacaaataca 600 aaacgaagga aggaaagaaa aaggggaata acgtgaaaca tgtttttctg tggcaacagc 660 aacaacataa gcggcagctg caactatcgg cagcaacaac aacagcagta tcataaaaca 720 tgtgtggaat aatcgcagcg aattgaacaa agcccaaagc 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ccaggcacag 2460 atcgaggtca agttgctcga gatgatgaac cgggcggatg ccgaaaacaa atactacatc 2520 gttaagctca agcggcactt catgtggcgc aaccacctgt gcctggtgtt cgagctgctc 2580 tcatacaacc tgtacgacct gctgcggaac accaacttcc ggggcgtttc gctgaacctc 2640 acgcgcaagt tcgcccagca gctgtgcacc gcactgctct tcctcagcac ccccgaactg 2700 aacataattc actgtgattt gaagcccgag aacatcctgc tctgcaaccc gaagcgctcg 2760 gcgatcaaga tcgttgactt tggcagctcc tgccagttgg gacagcggat ctaccactac 2820 atccagtcgc gcttctaccg ctcgccggag gtgctgcttg gcatccagta tgacctggcc 2880 atcgatatgt ggtcactggg ctgcatcttg gtcgagatgc acaccggcga gccgctcttc 2940 tccggctgca acgaggtgga ccagatgaac aagatcgtcg aggtgctggg catgccgccc 3000 aagtatctgc tcgaccaggc gcacaagacc cgcaagttct tcgacaagat cgtcgccgat 3060 ggctcctatg tgctgaagaa gaatcagaac ggcaggaagt acaagccgcc aggatcccgc 3120 aagcttcacg acatcctcgg agtggaaaca ggcggtccag ggggcaggcg tctcgatgag 3180 ccgggccact ccgtctcgga ctatctgaag ttcaaggatc tgatcctgcg catgctcgac 3240 tttgacccca agacacgggt cacgccctac tatgccctgc agcacaactt 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cgattcgagt 4140 gtgattagcg cctcggcggc gggcggtggc cagggcggcg gcaatcccgg ccagaatccg 4200 gttacgccgt cagctgccgc ctttctcttc ccatctcagc ccgccggaac gctctatggc 4260 acggcgctcg gttcgctgag cgacctgcca ctgccgatgc cactgcccat gtccgtgccc 4320 ctgcaactgc cgccctcgtc gtcgtcgtcc gtctcctcgg gatcagcatc ggttggatcc 4380 ggaggagtgg gtgtcggcgt ggttggccaa aggcggcaca tcaccggacc cgccgcgcag 4440 gtgggcatct ctcaaagtgt cggcagtggc agcagcggct cggccaccgg agccagcagc 4500 agcgatgcct cctcgtcgtc acccatggtg ggcgtttgtg ttcaacagaa tcctgtagtt 4560 atacattagc ataaactgga agcaagcaaa gaacgttgga tgctcgctta aaacactact 4620 tttcacgccc tttgccgctc tctgctgcta tttattgcac cgccaaccaa cgcctccacc 4680 cgcccacaaa ccaaggaacc acaaattcac caacgcagca gcaccatagt tggtcggtaa 4740 tcgggggtct tgtccacacg tttttccaat tttacatacc atgtacgatg tacttcgatg 4800 tacatatact actaattttg acgaataatt gttaatattt tcatctgcgc ttttgtaaga 4860 tcttaagtga agaaaatttc tgttctatgt agacaatttt aaatgaaaat tcttttaatt 4920 agcgattgtg acaacgtgac ttcaattgga taaatagcga agatcatttt gttttgtttg 4980 agtggtaata gtcacacttt cagcttttcc tgaaaagaag ctgagattct tggttcattg 5040 taagacaaga cgcccgatga agatcactgc aacacagaca catgtccaaa ataaaaatac 5100 attaacatta actagctgaa attgaccctc aggtcccacg aaacacacga aaactcactc 5160 acctgcggtt cttactgatt agtcacttcg agctctcacc gccgcgccca cagcaccggc 5220 cacgccccca gtcgcccggg atcggggagg ggatgccgtg tgggcgcctt gatggattcg 5280 gcagagttta tttttttaca cgctagaacc tatttttttt tttggtctaa ttataatgtt 5340 taactttatg cagtaaccgt aacgacatac ttttacttta tataaacgaa tcaaaattaa 5400 actttattta attgttaatt taaattatgt aattttattc gacgagaaat cgctagtaat 5460 atagaaagca aacaaatatg cttaatttaa gcaaaactca aaaa 5504 <210> 3 <211> 4228 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 3 aacagaccgc gcttcataca gccagatcca aatggatctt aaattactta aataaactat 60 ataaaaataa acgaaataag catatcattt tgattgaaaa aaggaagcgg ttagtgcaaa 120 gtgcgttcgc gattccgatt gcgattccga ttgccagtga tatgtcgacg gccctggttt 180 attggcagtc aatgaatggc ggcgatccgg ttgacaaggc caccgcggat tgggcgccat 240 tcgtggttgg tgcagcagct ggtggcagct tcagtagcag catcatcacc agcagcagca 300 gcagcttgaa ccaccatccg cacaacggcc accacaatca ccatcatccg cctcattaca 360 tcaattattt ggcgcaaatt ggctgccagc atcgtgtcag aaattggcca acaaatggca 420 atcaggatca ggcggatgac gacgacgctg gccatcagat catctctaaa ttcctgccca 480 aaagtgcctg ggacacggtg ctgttggatg tgaagcggga tgtagatgaa gatggagata 540 gagatagaga tcgggtcgat ggcaatgtgc tgatggttca gggatcgtca tcatcatcat 600 cgagaatgaa ggcggaacgg gcactctatt atactatgtc cgcttatggg tccagcggcg 660 gcagcgtcga cgcagcgcag ggcagcggaa gcgggggcgg aagacagcgc cacgccccac 720 tctacgggcg attcgtcgac gcagaggatc tgcctgccac gcaccgggat gtcatgcacc 780 atcactctag tccctcgtct tcgtcggagg tgcgcgccat gcaggcccgg attcccaacc 840 actttcggga gcccgcctcg ggacctttgc gcaagctgag tgtcgatctg ataaagacct 900 acaagcacat caacgaggtt tactatgcga aaaagaaacg tcgtgcccag cagacgcaag 960 gagacgacga ctcatctaac aaaaaggagc gaaaacttta taacgacggc tacgacgacg 1020 ataatcacga ctatataatc aagaatggcg aaaagttttt ggatcgctac gagatcgact 1080 ctctgatcgg caaaggcagt tttggccagg tggtgaaggc ttacgaccac gaggagcagt 1140 gccacgtggc gatcaagata attaagaata agaaaccgtt cctaaaccag gcacagatcg 1200 aggtcaagtt gctcgagatg atgaaccggg cggatgccga aaacaaatac tacatcgtta 1260 agctcaagcg gcacttcatg tggcgcaacc acctgtgcct ggtgttcgag ctgctctcat 1320 acaacctgta cgacctgctg cggaacacca acttccgggg cgtttcgctg aacctcacgc 1380 gcaagttcgc ccagcagctg tgcaccgcac tgctcttcct cagcaccccc gaactgaaca 1440 taattcactg tgatttgaag cccgagaaca tcctgctctg caacccgaag cgctcggcga 1500 tcaagatcgt tgactttggc agctcctgcc agttgggaca gcggatctac cactacatcc 1560 agtcgcgctt ctaccgctcg ccggaggtgc tgcttggcat ccagtatgac ctggccatcg 1620 atatgtggtc actgggctgc atcttggtcg agatgcacac cggcgagccg ctcttctccg 1680 gctgcaacga ggtggaccag atgaacaaga tcgtcgaggt gctgggcatg ccgcccaagt 1740 atctgctcga ccaggcgcac aagacccgca agttcttcga caagatcgtc gccgatggct 1800 cctatgtgct gaagaagaat cagaacggca ggaagtacaa gccgccagga tcccgcaagc 1860 ttcacgacat cctcggagtg gaaacaggcg gtccaggggg caggcgtctc gatgagccgg 1920 gccactccgt ctcggactat ctgaagttca aggatctgat cctgcgcatg ctcgactttg 1980 accccaagac acgggtcacg ccctactatg ccctgcagca caacttcttc aagcgcacgg 2040 cagacgaggc aaccaatacg agcggcgcgg gcgccacagc gaatgcagga gccggtggct 2100 ccggttccag cggagcagga ggctccagcg gcggaggcgt cggcggtggc ctcggagcga 2160 gcaacagcag tagcggtgcg gtctcctcat ccagtgcagc ggctccaacg gcggcgacag 2220 cagcggccac ggccgcagga tcctccggtt cgggttcaag tgtcggcggg ggatcctccg 2280 cagcgcagca acagcaggcg atgccgctgc cattgccgct tcccttgccg ttgccaccac 2340 tcgcgggtcc tggcggtgcg tcagatggcc aatgtcacgg cctgcttatg cattcggtgg 2400 cagccaacgc gatgaacaac ttctccgctc tgagcctgca gtccaacgcc catccgccgc 2460 catcgctggc caatagccat cacagcacca acagcctggg cagcctgaat cacatcagtc 2520 ccggcagcac cggctgccac aacaacaaca gcaacagcag caacaacaac acacgccaca 2580 gtcgtctgta cggcagcaac atggtgaaca tggtgggcca ccacaacagc ggcagcagca 2640 acaaccacaa cagcatcagc tatccgcacg ccatggaatg tgatccgccg cagatgccgc 2700 caccgccgcc aaacggacac ggcaggatgc gggtgccagc gataatgcaa ctgcaaccga 2760 acagctatgc gcccaattcg gtgccctatt acggcaacat gtcgtcctcg tcggtggctg 2820 cggcggcggc agcggcagca gctgctgcct cgcacctaat gatgaccgat tcgagtgtga 2880 ttagcgcctc ggcggcgggc ggtggccagg gcggcggcaa tcccggccag aatccggtta 2940 cgccgtcagc tgccgccttt ctcttcccat ctcagcccgc cggaacgctc tatggcacgg 3000 cgctcggttc gctgagcgac ctgccactgc cgatgccact gcccatgtcc gtgcccctgc 3060 aactgccgcc ctcgtcgtcg tcgtccgtct cctcgggatc agcatcggtt ggatccggag 3120 gagtgggtgt cggcgtggtt ggccaaaggc ggcacatcac cggacccgcc gcgcaggtgg 3180 gcatctctca aagtgtcggc agtggcagca gcggctcggc caccggagcc agcagcagcg 3240 atgcctcctc gtcgtcaccc atggtgggcg tttgtgttca acagaatcct gtagttatac 3300 attagcataa actggaagca agcaaagaac gttggatgct cgcttaaaac actacttttc 3360 acgccctttg ccgctctctg ctgctattta ttgcaccgcc aaccaacgcc tccacccgcc 3420 cacaaaccaa ggaaccacaa attcaccaac gcagcagcac catagttggt cggtaatcgg 3480 gggtcttgtc cacacgtttt tccaatttta cataccatgt acgatgtact tcgatgtaca 3540 tatactacta attttgacga ataattgtta atattttcat ctgcgctttt gtaagatctt 3600 aagtgaagaa aatttctgtt ctatgtagac aattttaaat gaaaattctt ttaattagcg 3660 attgtgacaa cgtgacttca attggataaa tagcgaagat cattttgttt tgtttgagtg 3720 gtaatagtca cactttcagc ttttcctgaa aagaagctga gattcttggt tcattgtaag 3780 acaagacgcc cgatgaagat cactgcaaca cagacacatg tccaaaataa aaatacatta 3840 acattaacta gctgaaattg accctcaggt cccacgaaac acacgaaaac tcactcacct 3900 gcggttctta ctgattagtc acttcgagct ctcaccgccg cgcccacagc accggccacg 3960 cccccagtcg cccgggatcg gggaggggat gccgtgtggg cgccttgatg gattcggcag 4020 agtttatttt tttacacgct agaacctatt tttttttttg gtctaattat aatgtttaac 4080 tttatgcagt aaccgtaacg acatactttt actttatata aacgaatcaa aattaaactt 4140 tatttaattg ttaatttaaa ttatgtaatt ttattcgacg agaaatcgct agtaatatag 4200 aaagcaaaca aatatgctta atttaagc 4228 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer for mnb E <400> 4 ccatgtatag attagaggat acgaatag 28 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mnb E <400> 5 accgcctgtt tccactccga ggatg 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer for mnb E <400> 6 agtatctgct cgaccaggcg cacaag 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mnb E <400> 7 gtggaggcgt tggttggcgg tgcaat 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer for mnb H <400> 8 gcgattccga ttgccagtga tatgt 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mnb H <400> 9 accgcctgtt tccactccga ggatg 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer for hDYRK1A <400> 10 tgattgcacc aacaggtcca ga 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hDYRK1A <400> 11 ttctcccaat tcaaccgctc a 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer for minibrain <400> 12 cgtgacttca attggataaa tagct 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for minibrain <400> 13 gctgaaattg accctcaggt cc 22

Claims

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS-DYRK1A 벡터 또는 UAS-minibrain 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 상기 단계 1)의 벡터가 형질전환되지 않은 대조군 초파리에 비해 수명 단축, 운동 능력 감소, 또는 신경 발달 이상을 나타내는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 벡터는 P-인자 매개 생식세포 형질전환방법(P-element-mediated germ line transformation)을 이용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법.

삭제

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS-DYRK1A 벡터 또는 UAS-minibrain 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시켜 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제조하는 단계;
3) 실험군으로 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 피검물질이 처리된 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에서 hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
5) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 4)의 hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 단계 4)의 hDYRK1A 또는 minibrain 유전자 발현변화는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물 스크리닝 방법.

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS-DYRK1A 벡터 또는 UAS-minibrain 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시켜 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제조하는 단계;
3) 실험군으로 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 피검물질이 처리된 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에서 초파리의 수명을 측정하는 단계; 및
5) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 4)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법.

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 인간 DYRK1A(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS-DYRK1A 벡터 또는 UAS-minibrain 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시켜 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제조하는 단계;
3) 실험군으로 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 피검물질이 처리된 상기 단계 2)의 형질전환 초파리에서 운동능력을 측정하는 단계; 및
5) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 4)에서 측정한 초파리의 운동능력을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동능력 저하 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법.