KR101422689B1

KR101422689B1 - 콜라겐, 히알루론산 유도체 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제

Info

Publication number: KR101422689B1
Application number: KR1020120075755A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 이영준; 김선미
Original assignee: (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-07-23
Also published as: JP2014520844A; CN103796659A; WO2013009102A3; KR20130009651A; US20140227235A1; WO2013009102A2

Abstract

본 발명은 의료용 복합 생체소재에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 콜라겐 및 히알루론산 유도체를 포함하는 의료용 복합 생체소재에 대한 것이다. 또한, 상기 생체소재 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 이용한 연골세포치료제에 관한 것이다. 이러한, 생체소재는 면역 반응을 야기하지 않고, 내구성이 우수하며, 이러한 생체소재와 줄기세포를 포함한 연골세포치료제는 관절경을 이용한 시술이 가능하여 환자의 고통을 줄여줄 뿐만 아니라 효과적으로 퇴행성 관절염 및 연골 손상을 치료할 수 있다.

Description

콜라겐, 히알루론산 유도체 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제{Cell therapy product for cartilage damage comprising collagen, hyaluronic acid derivative and mammalian umbilical cord-derived stem cells}

본 발명은 콜라겐 및 히알루론산 유도체를 포함하는 생체 소재 및 여기에 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제를 제공하는 것에 관한 것이다.

콜라겐은 인체에서 가장 흔하게 발견하는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이며 전체 단백질의 약 25-35%를 차지한다. 특히 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 한다. 소나 돼지의 피부에서 쉽게 추출할 수 있다. 반면, 콜라겐은 동물에서 유래한 것으로 인체에 적용시 면역 반응에 대한 문제가 남아 있다.

반면, 히알루론산은 콜라겐과 달리 박테리아부터 포유류까지 종간 화학구조의 차이가 없어 항원으로 작용하지 않으므로 콜라겐을 대체하는 필러 물질로 개발되어 사용되고 있다. 히알루론산은 모든 종에서 동일한 구조를 가지므로 콜라겐 필러의 문제점이었던 면역반응이 적다는 장점이 있다.

히알루론산은 체내에서 두 가지 경로로 분해되는데 첫째는 히알루로니다제(hyaluronidase)에 의한 분해이고 둘째는 세포 수용체(cell receptor)에 부착되어 세포내로 탐식되어 리소좀(lysosome)내의 효소에 의하여 분해되는 것이다. 히알루론산의 생분해는 매우 빨라서 0.5일-수 일 내에 모두 분해되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 시간이 지남에 따라 체내에서 분해되어 그 효과를 지속시키는데 제한이 있다.

한편, 연골 조직은, 다른 조직과는 달리, 신경과 혈관이 존재하지 않기 때문에 한번 손상이 되면 스스로 재생이 되지 않는 조직이다. 따라서 전통적인 치료 방법으로 인공관절 수술, 미세천공술(microfracture), 모자이크플래스티 (mosaicplasty) 방법 등의 외과적 수술이 불가피하였다. 그러나 이러한 방법은 완벽한 치료가 될 수 없었으며, 이식한 인공관절의 10년 내외의 내구성과 수술에 의한 2차 감염 등의 문제가 잔존하였다.

최근 조직공학 및 재생의학의 연구가 발전됨에 따라, 사람의 세포를 이용하여 완전한 연골조직으로 재생하기 위한 연골세포치료제가 개발되었다(KR10-2010-0084142A). 종래의 연골세포치료제는 자가연골세포치료로서, 환자 자신의 연골조직을 일부 채취하여 체외에서 약 4주간 대량 배양한다. 환부를 깨끗하게 정리한 다음 환자 경골에서 골막(periosteum)조직을 채취하여 연골부위에 덮어 봉합하고 손상된 연골 부위 공간에 배양한 세포를 현탁된 상태로 이식하였다. 세포가 흘러나오지 못하도록 봉합된 부위에 피브린 글루를 도포하는 자가연골세포치료 방법이다.

그러나 이 방법은 손상된 부위가 클 때 배양된 세포만으로 치료하기 어렵다는 한계가 있으며, 체중에 의해 환부가 눌려 세포가 누출되어 조직재생이 제대로 이루어지지 않는 경우가 발생한다는 단점이 존재한다.

이러한 문제점을 극복하고 효과적인 생체 재료 및 연골 치료제를 개발하던 중 면역 반응이 적고, 효능이 오래 지속될 수 있는 새로운 생체 재료를 개발하였고, 여기에 줄기세포를 혼합하여 연골치료제로 이용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 더욱이, 가교화 되어 있는 히알루론산 유도체와 콜라겐을 섞은 후 줄기세포를 함께 혼합하여 체외에서 배양할 때, 히알루론산 유도체 및 콜라겐 복합체가 팽윤 및 수축이 일어나지 않는, 즉 부피의 변화가 없는 최적의 혼합 비율을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 10-2010-0084142, 초록 및 청구항 1

본 발명의 목적은 콜라겐 및 히알루론산 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 생체용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜라겐 및 히알루론산 또는 그의 유도체 및 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제를 제공하는 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 양상은 생체 재료 조성물을 제공하는 것이다.

일 구체예로 콜라겐 및 히알루론산 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 콜라겐은 포유류 유래 콜라겐, 바람직하게는, 인간 탯줄 유래 콜라겐일 수 있다. 더욱이, 상기 인간 탯줄 유래 콜라겐은 I형 콜라겐일 수 있다. 상기 포유류 유래 콜라겐은 종래 기술에 따라 포유류의 여러 조직으로부터 얻을 수 있다.

특히, 상기 인간 탯줄 유래 콜라겐은 과산화수소로 처리된 인간 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 인간 탯줄 유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 히알루론산 유도체는 줄기세포를 포함한 세포치료제의 세포전달체로서 사용될 수 있는 생체적합성 및 생분해성이 우수한 히알루론산 또는 그 염의 유도체를 제조하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 경우, 상기 히알루론산 유도체는 마이크로입자(microparticle) 형태일 수 있다.

더욱이, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산 또는 부탄다이올글라 이시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하여 가교화하여 얻을 수 있다. 또한, 이와같이 얻은 의료용 목적의 히알루론산 유도체를 분쇄하여 마이크로미터 크기로 제조하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

히알루론산은 오래 전부터 그 존재가 알려져 있으며, 자연에 널리 존재하는 생친화성(biocompatible) 물질이다. 히알루론산은 세포외기질(extracellular matrix, ECM)에 필수적인 요소인 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로서 단량체인 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)과 D-글루쿠로닉 산(D-glucuronic acid)이 연속적으로 연결된 선형 다당류(linear polysaccharide)이다. 히알루론산은 생체조직의 기본구성 성분으로 세포의 형태형성, 세포분화, 세포 분열에 필수적인 물질이며, 상처를 회복시키는데 도움을 준다. 히알루론산은 에테르 결합을 통해서 수용액상에서 불용성의 겔이면서도 우수한 점탄성과 높은 수분 흡수 능력을 보이고 있어 생체내에서 일정기간 동안 형체를 유지하다 분해되어 체내 흡수된다.

천연 히알루론산은 체내에 주입 시 히알루론산 분해효소(hyaluronidase)에 의해 빨리 분해되기 때문에, 이러한 분해속도를 조절하기 위하여 여러 가지 방법으로 가교시키거나 벤질알콜 등의 화학물질을 이용하여 구조를 변형시킨 히알루론산 유도체를 만들어 사용하여야 한다.

본 발명의 의료용 복합 생체소재에 있어서, 히알루론산 또는 이의 염은 특별히 제한되지 않으며, 1% 내지 50%의 농도로 0.1 N 내지 10 N의 염기성 수용액에 넣고, 이에 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위(repeating unit)를 기준으로 0.01% 내지 200%의 당량비 만큼 가교제를 첨가하며, 바람직하게는 0.1% 당량 내지 50% 당량을 첨가하여 히알루론산 또는 그의 염과 균질한 상태로 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다. 혼합액을 제조하는 시간은 특별히 제한되지 않으며, 1 시간 내지 48 시간이 바람직하다.

상기 둘 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 가교제는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직한 예로서 부탄다이올 다이글라이시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글라콜 다이글라이시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산다이올 다이글라이시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글라이콜 다이글라이시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글라이콜 다이글라이시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리터드라메틸렌글라이콜 다이글라이시딜 에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜 다이글라이시딜 에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜 폴리글라이시딜 에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 다이글리세롤 폴리글라이세롤 에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤 폴리그라이딜 에테르(glycerol polyglycidylether), 트리메틸프로판 폴리글라이시딜 에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨 폴리글라이시딜 에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨 폴리글라이시딜 에테르(sorbitol polyglycidyl ether)와 같은 화합물을 들 수 있다.

상기 혼합액을 반응시킨 후, 생리식염수로 세척하여 미 반응물을 제거하고 분쇄기를 이용하여 마이크로 크기로 분쇄 후 생리식염수로 세척을 수행한다. 세척된 생성물을 분쇄하여 입자 크기를 조절하고, 0.5~10%, 바람직학는 1~3%가 되도록 농도를 조절한다. 그후, 100 ℃이상, 바람직하게는 121 ℃ 이상에서 가압멸균하여 최종적으로 생체에 적용할 수 있는 히알루론산 유도체 제조함으로써 본 발명의 의료용 복합 생체소재 조성물로 사용할 수 있다.

상기 가교화 되어 있는 히알루론산 유도체는 그물망 구조를 가지고 있어 하이드로젤 타입으로 주변의 물분자와 만나게 되면 팽윤(swelling)이 되어 그 부피가 커진다. 반면, 젤타입의 콜라겐은 히알루론산과는 반대로 수축(shrinking)이 되어 부피가 작아진다. 그러나, 본 발명에서 개발한 방법에 의하면 히알루론산 또는 히알루론산 유도체가 콜라겐과 특정 비율로 혼합시 이러한 조성물과 줄기세포를 함께 혼합하여 체외에서 배양할 때 팽윤 및 수축이 일어나지 않는다.

상기 히알루론산 유도체와 포유류의 탯줄 유래 콜라겐의 조합 비율은 1:10 내지 10:1 일 수 있으며, 1:5 내지 5:1 일 수 있으며, 바람직하게는 1:1 내지 1:3일 수 있다. 또한, 상기 포유류의 탯줄 유래 줄기세포는 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹¹ cells/ml 일 수 있으며, 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ cells/ml 일 수 있으며, 바람직하게는 1.0×10⁶ 내지 1×10⁷ cells/ml의 농도로 히알루론산 유도체와 포유류의 탯줄 유래 콜라겐 젤과 혼합될 수 있다.

본 발명의 의료용 복합 생체소재를 인체 내부로 이식하면, 주변 인체 조직의 세포가 상기 의료용 복합 생체소재 내부로 이동한다. 이렇게 이동한 세포가 세포외기질을 분비하고, 따라서 상기 의료용 복합 생체소재 성분이 분해되더라도, 상기 세포외기질로 인하여 원하는 효과가 지속된다는 점에서 종래 기술로부터 전혀 예측할 수 없는 결과를 보여 준다.

또 다른 양상은 줄기세포, 콜라겐 및 히알루론산 또는 그의 유도체를 포함하는 연골세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 연골세포치료제에 있어서, 상기 줄기세포는 포유류 유래일 수 있다. 상기 포유류의 탯줄 유래 줄기세포는 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 포유류의 탯줄 유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에서 연속적으로 계대배양을 수행하여 제조될 수 있다. 이때, 상기 줄기세포 배양배지는 혈청을 포함하지 않는 것일 수 있다.

또한, 상기 포유류의 탯줄 유래 줄기세포는 (i) 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄 유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 혈액이 제거되고 세절된 포유류의 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양 후 줄기세포 분리 효소를 함유하는 배지로 처리하여 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는, 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스 (mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

또한, 상기 포유류의 탯줄 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 있어서, 상기 (ii) 단계의 줄기세포 분리 효소는 콜라게나제일 수 있고, 바람직하게는, I형 콜라게나제이며, 상기 (ii) 단계에서 상기 I형 콜라게나제가 180 U/ml 내지 220 U/ml 포함되며, 2시간 내지 6시간 동안 처리될 수 있다. 또한, 상기 (ii) 단계는 상기 (i) 단계 개시 후 1일 내지 10일 후에 수행될 수 있다.

또한, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 탯줄 유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 또는 폴리-D-라이신(poly-D-lysin) 일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 더욱이, 상기 포유류의 탯줄 유래 줄기세포는 인간 탯줄 유래 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 연골세포치료제에 있어서, 상기 콜라겐은 포유류의 탯줄에서 수득되는 것일 수 있다. 상기 콜라겐은 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 상기 포유류의 탯줄 유래 콜라겐은 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 연골세포치료제에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는 줄기세포를 포함한 세포치료제의 세포전달체로서 사용될 수 있는 생체적합성 및 생분해성이 우수한 히알루론산 또는 그 염의 유도체를 제조하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 경우, 상기 히알루론산 유도체는 마이크로입자(microparticle) 형태일 수 있다.

더욱이, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산 또는 부탄다이올 글라이시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하여 가교화하고 의료용 목적의 히알루론산 유도체를 분쇄하여 마이크로 미터 크기로 제조하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 연골세포치료제에 있어서, 히알루론산 또는 이의 염은 특별히 제한되지 않으며, 1% 내지 50%의 농도로 0.1 N 내지 10 N의 염기성 수용액에 넣고, 이에 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위(repeating unit)를 기준으로 0.01% 내지 200%의 당량비 만큼 가교제를 첨가하며, 바람직하게는 20.1% 당량 내지 50% 당량을 첨가하여 히알루론산 또는 그의 염과 균질한 상태로 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다. 혼합액을 제조하는 시간은 특별히 제한되지 않으며, 1 시간 내지 48 시간이 바람직하다.

상기 혼합액을 반응시킨 후, 생리식염수로 세척하여 미 반응물을 제거하고 분쇄기를 이용하여 마이크로 크기로 분쇄 후 생리식염수로 세척을 수행한다. 세척된 생성물을 분쇄하여 입자 크기를 조절하고, 1~3%가 되도록 농도를 조절한 후, 100 ℃이상, 바람직하게는 121 ℃ 이상에서 가압멸균하여 최종적으로 생체에 적용할 수 있는 히알루론산 유도체 제조함으로써 본 발명의 연골세포치료제 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 연골세포치료제에 있어서, 상기 히알루론산 유도체와 상기 콜라겐의 조합 비율은 1:10 내지 10:1 일 수 있으며, 1:5 내지 5:1 일 수 있으며, 바람직하게는 1:1 내지 1:3일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹¹ cells/ml 일 수 있으며, 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ cells/ml 일 수 있으며, 바람직하게는 1.0×10⁶ 내지 1.0×10⁸ cells/ml의 농도로 히알루론산 유도체와 콜라겐 젤과 혼합될 수 있다.

본 발명의 연골세포치료제는 하이드로젤 형태의 제형을 갖는 것이 바람직하다. 이로써 연골 손상 부위로 용이하게 주입할 수 있다. 또한, 상기 연골세포치료제를 포함하는 연골치료용 주사제용 조성물의 형태로 이용될 수 있다.

용어 "주사제용 조성물 또는 주사제용 세포치료제"란 조직의 결함을 치료하기 위해 줄기세포를 함유하여 비경구투여, 즉 주사의 형태로 결함부위 또는 그 인접부위에 주사되어, 결함을 교정할 수 있는 약학조성물을 의미한다.

그 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황(含硫)환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.

현탁제의 예로는, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.

용액보조제로는, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리소르베이트 80,니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 메크로골, 피마자유지방산에틸에스테르 등을 들 수 있다.안정화제로는, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 들 수 있다.

등장화제로는, 예를 들어 D-만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다.

보존제로는, 예를 들어 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.

흡착방지제로는, 예를 들어 인간혈청알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥사이드프로필렌옥사이드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.

함황환원제로는, 예를 들어 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥토산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소원자수 1~7 의티오알칸산 등의 술푸히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.

산화방지제로는, 예를 들어 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.

본 발명에 따른 주사제품은 환자의 체질 및 결함의 종류에 따라 당 업계에 통상적으로 알려진 분량을 취하여 충전된 주사의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제품은 치료하고자 하는 결함에 인접한 부위 또는 결함부위에 주사되어 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 연골치료용 주사제용 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 손상된 연골을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 주사제용 조성물은 환자의 연골 손상 부위에 직접 주입될 수 있으며, 손상된 연골 손상 부근에 주입될 수도 있다. 특히, 손상된 연골 부위의 외과적 수술없이 관절경을 이용하여 시술할 수 있다.

본 발명의 의료용 복합 생체소재는 인간의 피부 조직과 유사한 조성, 즉 인간 콜라겐과 히알루론산 유도체를 포함함으로써, 인간 세포에 대한 친화도가 매우 우수하다. 또한, 외과적 수술 없이, 관절경을 이용하여 간단히 시술할 수 있고, 손상된 연골 조직 부위에 주입식으로 용이하게 이식할 수 있으며, 젤화가 된 후에 고정되게 된다.

본 발명의 연골세포치료제는 하이드로젤 형태이지만, 종래의 히알루론산만을 이용하는 지지체보다 분해되는 속도가 느리기 때문에 연골이 재생되는 동안 외부의 물리적, 기계적 영향에도 그 형태를 유지할 수 있고, 우수한 치료 효과가 장기간 지속되므로, 우수한 연골세포치료제로서 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 탯줄 유래 줄기세포의 증식능을 보여준다. 상기 줄기세포들의 경우 25회의 계대배양이 가능하였고, 약 20회의 계대배양에 걸쳐 60회의 세포분열을 하였다.
도 2는 실시예 2의 탯줄 유래 줄기세포에 있어서, 배아줄기세포의 마커가 RNA 수준에서 발현됨을 보여 주는 결과이다.
도 3은 실시예 3의 탯줄 유래 줄기세포의 계대배양에 따른 중간엽줄기세포 마커를 분석한 결과이다. 도 3에 나타나 있듯이, 중간엽줄기세포의 특성인 CD29, CD73, CD105, CD166 등이 계대배양 20회까지 유지됨을 확인할 수 있고, 25번째 계대배양부터는 줄기세포의 마커를 상실하였다.
이때, x축은 강도(intensity)이며, Y축은 세포갯수(카운트)이다. x축 및 y축의 변화로 위에 기재되어 있는 CD 마커를 식별할 수 있다.
도 4는 실시예 4의 탯줄 유래 줄기세포의 분화능(연골, 뼈 및 지방으로의 분화)을 보여 주는 그림이다.
도 5는 실시예 5 및 실시예 7에서 제조한 매트릭스에 있어서, 콜라겐과 히알루론산 유도체의 비율에 따른 형태 유지를 관찰한 결과이다.
도 6 및 도 7은 실시예 7에서 제조한 매트릭스에 탯줄 유래 줄기세포를 혼합하여 배양했을 때, 매트릭스 내에서의 세포 증식 및 생존률을 나타낸다. 대조군인 콜라겐으로만 이루어진 지지체보다 히알루론산 유도체와 탯줄 유래 콜라겐을 혼합한 실험군에서 증식력과 생존률이 보다 높게 유지되는 것을 보여 준다.
도 8은 실시예 8에 따른 탯줄 유래 줄기세포의 생체내 분화(마우스 피하)를 보여 준다.
도 9는 실시예 8에 따른 따른 탯줄 유래 줄기세포의 생체내 분화(마우스 피하)를 다양한 염색법을 통하여 보여 준다.
도 10 및 도 11은 토끼 무릎 관절연골에 연골하골 부위까지 손상을 준 후 아무 처리하지 않은 것(non-treatment)과 지지체만 넣어준 것(대조군) 및 탯줄 유래 줄기세포와 지지체를 혼합한 것(실험군)을 이식하고 8주 후 및 16주 후에 관찰한 결과로서 실험군에서 연골이 완벽하게 재생된 결과를 보여준다.
도 12는 실시예 9에 따른 따른 탯줄 유래 줄기세포와 지지체 혼합물의 손상된 연골 재생효과(토끼 관절)를 H&E 염색법을 통하여 보여 준다.
도 13은 실시예 9에 따른 따른 탯줄 유래 줄기세포와 지지체 혼합물의 손상된 연골 재생효과(토끼 관절)를 II형 콜라겐 염색법을 통하여 보여 준다.

이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 내용을 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 본 발명의 권리 범위를 실시예의 범위로 제한 해석하고자 의도하는 것은 아니다.

<실시예 1> 탯줄 줄기세포의 분리 및 증식능 분석

본 연구에 사용된 탯줄은 정상 산모의 분만 후 버려지는 탯줄을 산모의 동의하에 채취 사용하였다. 채취 후 24시간 내에 실험에 사용하였다.

탯줄 외부의 혈액을 Ca²⁺과 Mg²⁺이 포함되지 않은 DPBS로 제거한 조직의 외부 양막을 벗기고 동맥 2개를 제거한 후, 1 mm³ 크기로 자른 다음 100 U/mL의 페니실린(penicillin), 0.1 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 탯줄 추출물 0.2 μg/mL이 포함된 α-MEM(minimum essential medium)에 넣고 7일 동안 배양 후 바닥에 부착된 세포가 보이기 시작하면 500 U/ml의 I형 콜라게나제(collagenase type Ι)가 포함된 α-MEM을 4시간 처리하여 세포를 분리하였다. 그 후 100 U/mL의 페니실린, 0.1 μg/mL의 스트렙토마이신, 탯줄 추출물 0.2 μg/mL이 포함된 α-MEM에 배양접시 1 cm² 당 2×10³ 의 세포를 탯줄 유래 콜라겐이 코팅된 배양용기에 접종하여 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다. 1주에 3번 배양액을 교체하였으며, 배양용기의 70%에서 80% 정도로 세포가 자라면 0.125%의 트립신(trypsin)과 1 mM의 EDTA를 3분간 처리하여 세포를 떼어낸 후, 배양접시 1 cm² 당 2×10³ 의 세포를 넣어 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<실시예 2> RT-PCR를 통한 배아줄기세포 마커 확인

세포 펠렛(pellet)을 Ca²⁺과 Mg²⁺이 포함되지 않은 DPBS를 이용하여 세척하고 1 ml의 세포용해 완충액(lysis buffer)(iNtRON Biotechnology)를 첨가한 다음 제조회사 사용설명서에 따라 전 RNA(total RNA)를 분리하였다. 1 μg의 RNA는 cDNA 합성 키트(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 반응 완충액(reaction buffer), 1 mM의 dNTP 혼합액(mixture), 0.5 μg/μL의 oligo(dT)15, 20 U의 RNA분해효소 저해제(RNase inhibitor), 20 U의 AMV 역전사효소(reverse transcriptase)가 혼합된 20 μL 반응 용액에서 역전사시켰다. 상기 반응은 42℃에서 60분간 진행되었다. 얻어진 RT 산물(cDNAs)을 2X PCR 마스터 믹스 용액 키트(Master mix solution kit)(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 1×의 Taq 완충액, 0.25 U의 Taq 중합효소 (polymerase), 10 pM의 센스(sense)와 안티센스(antisense) 유전자-특이적 프라이머(gene-specific primers)가 혼합된 10 μL 반응 용액으로 PCR을 수행하였다. 증폭은 총 32 싸이클을 수행하였으며 각 싸이클은 94℃에서 30초 간의 변성(denaturation) 과정, 30초간의 어닐링(annealing) 과정, 72℃에서 30초간의 신장 (extension) 과정으로 구성되었다. 반응 종결 후 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 (agarose gel)에 충전(loading)하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하고 자외선을 이용하여 DNA의 영상을 얻었다.

프라이머 염기서열 정보

유전자(gene)		프라이머 서열(5'-3')		온도(℃)
OCT 4	Sense	agaaggagtggtccgagtg	서열번호 1	60
OCT 4	Antisense	agagtggtgacggagacagg	서열번호 2	60
Nanog	Sense	atacctcagcctccagcaga	서열번호 3	59
Nanog	Antisense	cctgattgrrccaggattgg	서열번호 4	59
KLF4	Sense	accctgggtcttgaggaagt	서열번호 5	59
KLF4	Antisense	tgccttgagatgggaactct	서열번호 6	59
Sox2	Sense	gatgcacaactcggagatcag	서열번호 7	60
Sox2	Antisense	gccgttcatgtaggtctgcga	서열번호 8	60
GAPDH	Sense	gaaggtgaaggtcggagtca	서열번호 9	60
GAPDH	Antisense	ggaggcattgctgatgatct	서열번호 10	60

<실시예 3> FACS 분석을 통한 중간엽줄기세포 마커의 발현 분석

분리된 세포의 특성을 분석하기 위해 유세포 분석법을 수행하였다. 유세포 분석을 위해 세포들을 PBS를 사용하여 세척 후 트립신-EDTA를 처리하여 단일 세포군으로 만든 뒤, 2% FBS와 1 mM EDTA가 함유된 PBS로 세척한다. 그 후 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate (FITC)) 또는 피코에리트린(phycoerythrin (PE))이 결합된 줄기세포 마커를 처리하고 아이스에서 20분간 반응시킨 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 통해 분석하였다.

<실시예 4> 탯줄 줄기세포의 분화능 확인

<4-1> 지방세포로의 분화 유도

1 cm² 당 2×10³ 개의 탯줄 유래 줄기세포를 24-웰 플레이트에 넣고 3일간 배양한 후 DMEM에 10%의 FBS와 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 μM의 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 0.05 mg/L의 인간 인슐린 (human insulin), 200 μM의 인도메타신(indomethacin)이 포함된 분화 배양액으로 교체하였다. 그리고 1주에 3번 배양액을 교체하였다. 3주 배양 후 오일 레드 O(Oil Red O) 염색을 시행하여 지질이 축적된 지방세포의 존재 여부를 관찰하였다.

<4-2> 골세포로의 분화 유도

1 cm² 당 2×10³ 의 탯줄 유래 줄기세포를 24-웰 플레이트에 넣고 3일간 배양한 후 DMEM에 10%의 FBS와 0.1 μM의 덱사메타손, 100 mM의 β-글리세롤 포스페이트(β-glycerol phosphate), 50 μM의 아스코르브산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate)가 포함된 분화 배양액으로 교체하였다. 그리고 1주에 3번 배양액을 교체하였다. 3주 배양 후 ALP 염색을 수행한 후 분화 여부를 관찰하였다.

<4-3> 연골세포로의 분화유도

1 cm² 당 2×10³ 의 탯줄 유래 줄기세포를 콜라겐 젤과 혼합하여 배양 접시에 100 μl씩 접종한 후 37℃ 인큐베이터에서 10분간 정치하여 콜라겐이 젤화된 후, DMEM에 0.1 μM의 덱사메타손, 50 μg/mL의 아스코르브산-2-포스페이트, 100 μg/mL의 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 10 ng/mL의 전환성장인자-β3(transforming growth factor-β3), 50 mg/mL의 ITS 플러스 프리믹스(ITS plus premix)(각 6.25 μg/mL의 인슐린, 트랜스페린(transferrin), 셀렌산(selenious acid)이 포함된 분화 배양액을 첨가하여 배양하였다. 그리고 1주에 3번 배양액을 교체하되, 전체 부피의 절반만 새로운 배지로 교환해 주었다. 3주 배양 후 II형 콜라겐(collagen type II) 염색을 시행하여 분화 여부를 관찰하였다.

<실시예 5> 히알루론산 유도체 제조

0.25 N NaOH 용액에 히알루론산 나트륨을 100 mg/ml 농도로 용해시켰다. 상기 용액에 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)를 첨가하였다. 30℃에서 36시간 반응시킨 후, 생리식염수로 세척하여 미반응물을 제거하였다. 세척된 생성물을 분쇄하여 입자 크기를 조절하고, 20 mg/ml이 되도록 농도를 조절하여, 히알루론산 유도체를 제조하였다.

<실시예 6> 인간 탯줄 유래 휴먼 콜라겐 제조

동결된 탯줄을 상온에서 해동시켰다. 탯줄을 1~2 cm 길이로 절단한 후, 정제수로 세척하였다. 70% 에탄올 용액을 처리한 후, 4 에서 24시간 반응시켰다. 정제수로 세척한 후, 3% H₂O₂ 용액을 처리하고 4 에서 12~24시간 마그네틱 바를 이용하여 교반 하였다. 정제수로 2회 이상 세척하고 0.5 M 아세트산 용액을 넣어 블렌더(blender)와 균질기(homogenizer)를 사용하여 조직을 분쇄하였다. 펩신을 처리하고 4 ℃에서 24시간 반응시켰다. 10,000 rpm, 4 ℃에서 30분 동안 원심분리 하였다.

원심분리 후, NaOH를 사용하여 수거한 상층액의 pH를 7로 맞추어 펩신 효소의 활성을 제거하였다. pH를 조정한 용액에 NaCl을 처리하고 NaCl이 다 녹을 때까지 교반 후, 4℃에서 콜라겐이 염석이 되어 침전이 되도록 12~24시간 정치하였다. 10,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 후, 염석이 된 콜라겐 펠렛(pellet)을 분리하여 한외여과 장치(ultrafiltration system)로 탈염 및 농축하였다. 최종적으로 여과방법으로 제균하고 동결 건조하여 보관하였다. 제조된 콜라겐 용액을 하이드록시프로린(hydroxyprolin) 분석법으로 정량하였고 SDS-PAGE를 통하여 순도를 확인하였다.

<실시예 7> 복합 하이드로젤 제조 및 생체외(in vitro) 3차원 배양

2%(w/v) 히알루론산 유도체와 제조된 2%(w/v) 콜라겐의 최적의 혼합비율을 정하기 위하여 다양한 조건의 부피비로 두 물질과 줄기세포를 혼합한 후 세포 배양액 내에서 부피의 변화를 확인하였다(도 5). 복합 하이드로젤의 부피가 배양시간이 지나도 변하지 않은 비율을 선정한 후 최종 복합 하이드로젤을 제조하였다.

두 물질의 최적 비율로 선정된 하이드로젤을 제조한 후 0.05 N NaOH 용액에 NaHCO₃와 HEPES를 넣어 만든 완충용액과 세포를 혼합하여 배양 용기에 20~40 μl씩 분주하였다. 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기에 20분간 넣고 세포가 포함된 매트릭스가 불투명해진 것을 확인 한 후 배지를 넣어 배양하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.

<실시예 8> 생체내(In vivo) 분화능 (마우스 모델)

실험용 마우스(BALB/c-nu Slc)는 암컷으로서 생 후 5주 된 것으로 실험을 진행하였다. 각 실험군에 10 ng의 TGF-β3를 첨가하여 100 μl 피하 주사 후, 4주 후에 샘플을 채취하였다. 샘플을 4% 중성 완충 포르말린(Neutral buffered formalin)으로 고정 후 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin (H&E)), 알시안 블루(Alcian blue), 사프라닌-O (Safranin-O) 염색과 II형 콜라겐(type II collagen) 면역 염색을 통하여 연골화 정도를 관찰하였다.

<실시예 9> 생체내 효력시험 (토끼 관절 모델)

실험용 토끼(New Zealand white rabbit)는 암컷으로서 무게가 3~3.5 kg가 된 것으로 실험을 진행하였다. 토끼를 마취한 후 무릎을 절개하고 무릎뼈 연골부위에 반경 2.5 mm로 연골하골 부위까지 손상을 준 후 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 군과 지지체만을 처리해 주었다. 실험군으로는 탯줄줄기세포와 지지체를 함께 이식하고 실험을 진행하였다. 8주, 16주 후에 샘플을 채취하였고, 4% 중성 완충 포르말린으로 고정 후 헤마톡실린 및 에오신 염색, II형 콜라겐 면역염색을 통해 연골재생의 효력을 확인하였다.

<110> chabio&diostech <120> Cell Therapy Product for Cartilage Damage Comprising Collagen, Hyaluronic Acid Derivative and Mammalian Umbilical Cord-Derived Stem Cells <130> PN097348 <150> KR 2011/0069551 <151> 2011-07-13 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for OCT 4 <400> 1 agaaggagtg gtccgagtg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for OCT 4 <400> 2 agagtggtga cggagacagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Nanog <400> 3 atacctcagc ctccagcaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Nanog <400> 4 cctgattgrr ccaggattgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KLF4 <400> 5 accctgggtc ttgaggaagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for KLF4 <400> 6 tgccttgaga tgggaactct 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Sox2 <400> 7 gatgcacaac tcggagatca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Sox2 <400> 8 gccgttcatg taggtctgcg a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 9 gaaggtgaag gtcggagtca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 10 ggaggcattg ctgatgatct 20

Claims

포유류 유래 I형 콜라겐 및 히알루론산을 부탄다이올 디글라이시딜에테르(BDDE)를 이용하여 가교화한 히알루론산 유도체를 3:1의 질량비로 혼합한 것을 포함하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 포유류 유래 I형 콜라겐은 인간 탯줄 유래 콜라겐인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은
히알루론산과 부탄다이올 디글라이시딜에테르를 혼합하여 히알루론산 유도체를 제조하는 단계; 및
상기 히알루론산 유도체와 I형 콜라겐을 혼합하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조된 것인 조성물.
삭제
제1항의 조성물을 포함하는 의료용 복합 생체소재.
줄기세포, I형 콜라겐 및 히알루론산을 부탄다이올 디글라이시딜에테르(BDDE)를 이용하여 가교화한 히알루론산 유도체를 포함하는 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 포유류 유래의 줄기세포인 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 포유류 유래의 줄기세포는 탯줄 유래 줄기세포인 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 I형 콜라겐은 포유류의 탯줄에서 수득한 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 포유류의 탯줄 추출물을 포함한 줄기세포 배양배지를 이용하여, 세포 부착 단백질로 코팅된 용기에서 배양하여 제조된 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 줄기세포 배양배지는 혈청을 포함하지 않는 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 탯줄 유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 폴리-D-라이신(poly-Dlysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체와 상기 I형 콜라겐의 조합 비율은 1:2 내지 1:3의 질량비인 것임을 특징으로 하는 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체와 상기 I형 콜라겐의 조합 비율은 1:3의 질량비인 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는 1% 내지 3%인 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 I형 콜라겐은 1% 내지 3%인 것인 손상된 연골 치료용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄 유래 줄기세포는 1.0×10⁶ 내지 1×10⁸ cells/ml의 농도로 히알루론산 유도체와 포유류의 탯줄 유래 I형 콜라겐 젤과 혼합되는 것임을 특징으로 하는 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 연골 치료용 조성물은 하이드로젤 형태인 것임을 특징으로 하는 손상된 연골 치료용 조성물.
제7항의 손상된 연골 치료용 조성물을 포함하는 연골 치료용 주사제용 조성물.
제20항의 연골치료용 주사제용 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 손상된 연골을 치료하는 방법.