KR101414881B1

KR101414881B1 - 고압 이산화탄소를 이용하여 dha를 농축하는 방법

Info

Publication number: KR101414881B1
Application number: KR1020120130097A
Authority: KR
Inventors: 김종태; 김철진; 김인환; 홍승인; 마나; 김양하; 맹진수
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2014-07-04
Also published as: KR20140065570A

Abstract

본 발명에 의하여 a) DHA를 포함하는 오일을 지방산으로 전환하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 수득한 지방산과 에탄올의 혼합액을 제조하는 단계; c) 상기 혼합액의 초기 수분함량을 0-5중량%로 조정하는 단계; d) 상기 c)단계에서 수득한 혼합액에 효소를 2.5-10중량% 첨가하는 단계; e) 반응기 내에 2.8 내지 13.8 MPa의 압력으로 이산화탄소를 주입하는 단계; f) 교반하면서 2 내지 24시간동안 반응시키는 단계; g) 반응기 내에서 서서히 이산화탄소를 빼면서 압력을 상압으로 내려 반응물을 취하는 단계를 포함하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법이 개시된다.

Description

고압 이산화탄소를 이용하여 DHA를 농축하는 방법{METHOD OF DHA ENRICHMENT USING PRESSURIZED CARBON DIOXIDE}

본 발명은 고압 이산화탄소를 매질로 DHA를 함유한 유지 내 지방산으로부터 효소를 이용하여 DHA를 농축시키는 방법에 관한 것이다.

DHA(docosahexaenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid)와 같은 n-3계의 고도불포화지방산은 체내에서 동맥경화와 같은 순환계 질환을 예방하고 콜레스테롤을 저하시키는 기능성을 가지고 있다. 특히 DHA의 경우 두뇌개발의 기능성을 가지므로 기능성 식품분야에서 큰 관심을 가지고 있다. DHA (docosahexaenoic acid)는 총 탄소수가 22개이며, 4번, 7번, 10번, 13번, 16번, 19번 탄소 위치에 6개의 이중결합을 갖는 지방산으로서 참치를 비롯한 등푸른 생선 및 미세조류에 다량 존재하는 것으로 알려져 있다.

이러한 필수 지방산의 경우 활용도를 높이기 위하여 필요로 하는 지방산을 농축시켜서 많이 사용하며, 농축시키는 방법으로 우레아 복합체를 이용하는 방법이나 증류시키는 방법 등이 많이 사용되어져 왔으나 유기용매의 사용이나 고온에서의 처리 문제로 인하여 효소를 이용한 농축방법이 연구되고 있다. 효소를 이용함으로써 비교적 온도를 낮춰서 반응시킬 수 있으며, 유기용제 등의 사용도 줄일 수 있다. 특히 효소가 가진 선택성에 의한 농축 방법이기 때문에 부산물의 생산을 감소시킬 수 있다.

DHA를 함유한 유지에서 DHA를 농축하기 위해서는 DHA에 대한 특이적인 선택성을 나타내는 효소가 필요하다. Hallodsson 등 (2003)에 따르면 Novozym 435 (Candida antarctica 유래)는 반응에 있어서 DHA에 대하여 특별한 선택성을 나타내지 않는 것으로 보고하였다. 그러나 Haraldsson과 Kristinsson (1998)을 비롯한 다수의 연구에 의하면 Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)와 Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus 유래)의 경우에는 DHA에 대해서만 특별히 선택적으로 반응하지 않는 것으로 보고하였다. 효소를 이용한 방법은 비극성용매에서 반응시켰을 때 효소의 안정성도 높일 수 있고 기질의 균일한 분산으로 반응성을 높일 수 있는 장점을 가진다.

한편, 임계점을 기준으로 임계점 이상의 온도와 압력에서의 이산화탄소는 액체의 성질과 유사한 용해성을 가지면서 기체와 유사한 점성 및 확산성을 나타낸다. 고압의 이산화탄소의 경우 헥산보다 더 비극성용매의 특성을 가지므로 유기용매를 대체할 매질로서 고압 이산화탄소를 이용할 수 있고 상온, 상압에서 기체 상태이므로 매질의 제거가 용이한 장점이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 유기용매를 대체한 매질로 고압 이산화탄소를 사용하고 효소를 촉매로 하여 DHA를 포함하는 지방산과 에탄올을 반응시킴으로써 DHA를 함유하는 지방산에 함유된 DHA를 부산물의 생성 없이 고농도로 농축이 가능한 방법을 제공하고자 한다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 DHA를 포함하는 지방산에 함유된 DHA를 고농도로 농축함에 적합한 최적의 조건을 제공함에 있다.

본 발명에서 사용하는 효소는 Lipozyme TL IM(Thermomyces lanuginosus 유래)와 Lipozyme RM IM(Rhizomucor miehei 유래)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다. 바람직하게는 Lipozyme RM IM을 사용한다. DHA에 대하여 선택성이 없어서 반응하지 않고 남는 지방산의 형태로 DHA를 농축할 수 있는 가능성은 두 효소 모두에게 있었지만, Lipozyme RM IM이 반응성도 좋으면서 Lipozyme TL IM에 비하여 명확한 선택성을 보여준다(도 2).

본 발명에서 상기 효소를 사용하여 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 적합한 반응온도는 15 내지 35^oC, 더 바람직하게는 25^oC가 적합한 반응온도이다(도 3). 실험결과에 의하면 반응온도가 15℃보다 낮거나 35℃를 초과하면 DHA의 농축율이 낮아진다.

본 발명에서 상기와 같은 조건에서 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 적합한 이산화탄소 압력은 2.8 내지 13.8 MPa, 바람직하게는 8.3 내지 11.0 MPa, 더욱 바람직하게는 8.3 MPa이 적합한 압력이다(도 4). 실험결과에 의하면 이산화탄소의 압력이 2.8MPa 이하이거나 13.8MPa 이상이면 DHA의 농축율이 8.3내지 11.0MPa의 결과에 비하여 낮아진다. 압력에 따라 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량은 크게 차이를 나타내지 않으나, 8.3 MPa보다 낮을 때와 11.0 MPa보다 높을 때는 잔류 지방산 내의 DHA농도가 낮아짐이 실험결과 밝혀졌다.

본 발명에서 상기와 같은 조건에서 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 사용되는 효소량은 총 기질 무게를 기준으로 2.5 내지 15.0중량%, 더 바람직하게는 5.0중량%이 적합한 효소량이다(도 5). 효소량이 5.0중량%보다 낮을 때는 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량은 높아지지만 잔류 지방산 내에 DHA 농도는 낮아졌고, 5.0중량%보다 높은 효소량에서는 잔류 지방산 내에 DHA 농도와 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량이 모두 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기와 같은 조건에서 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 기질 혼합물의 초기 수분함량은 기질 무게를 기준으로 0 내지 5.0중량%, 바람직하게는 0.2 내지 1.0중량%, 더욱 바람직하게는 0.5중량%가 적합한 초기 수분함량이다(도 6). 수분함량이 0중량%일 때는 잔류 지방산 내에 DHA 농도 및 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량이 모두 낮은 결과를 보여주었으며, 초기 수분함량이 1.0중량%보다 높은 경우에는 잔류 지방산 내에 DHA 농도가 급격히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 실험결과에 의하면 수분함량이 5.0중량% 이상인 경우 1.0중량%인 경우보다 잔류 지방산 내의 DHA 농도가 더욱 급격히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기와 같은 조건에서 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 실험결과로 나타내지는 않았지만 DHA를 포함하는 지방산과 에탄올의 몰비율은 1:2-1:8이 적합하였다. 실험결과 DHA를 포함하는 지방산과 에탄올의 몰비율이 상기의 범위를 벗어날 경우 잔류 지방산 내의 DHA농도가 본 발명에서 목표로 하는 회수율보다 현격히 낮아짐을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기와 같은 조건에서 지방산과 에탄올을 혼합하여 에스테르화 반응을 수행하는 경우 16-24시간이 적합하였으며, 가장 좋은 결과는 18시간 이었다(도 7).

실험결과 반응온도 25^oC, 총 기질량을 기준으로 5중량%의 Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)효소량, 0.2중량%의 수분함량 및 8.3 MPa의 이산화탄소 압력에서 DHA를 포함하는 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 혼합하여 에스테르화 반응을 18시간 수행했을 때 원 시료 지방산에서 80중량%의 DHA를 회수하면서 74중량%로 농축된 DHA를 지방산의 형태로 얻을 수 있었다. 이 값은 다른 모든 반응조건을 상기한 바와 같은 본 발명의 조건과 같게 한 상태의 상압에서 최대로 얻어진 DHA의 농도가 65중량%인 것에 비하여 높았다.

본 발명에 따른 고압 이산화탄소에서 리파아제를 이용하여 DHA를 농축시키는 방법은 물리화학적 방법보다 낮은 온도와 유기용매 사용 없이 이루어지며, 고압 이산화탄소의 사용에 의하여 용매 제거 공정을 줄일 수 있으며, 원료에 함유된 DHA 함량 중 80중량%를 회수하면서 74중량%의 고농도 DHA를 함유한 지방산을 얻을 수 있다.

도 1은 고압 이산화탄소 반응장치이고,
도 2는 고압 이산화탄소에서 효소에 따른 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 나타낸 그래프로써, a)는 반응하지 않고 잔류한 지방산 내에 농축된 DHA의 양과 회수된 양을 나타낸 그래프이며, b) 합성된 지방산 에틸에스터 (FAEE)내에 존재하는 DHA 에틸 에스터의 양 (농도)과 지방산 에틸에스터로 전환된 DHA의 양(회수율)을 나타낸 그래프이고,
도 3은 이산화탄소의 온도에 따른 잔류 지방산 내에서의 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 나타낸 그래프이고,
도 4는 이산화탄소의 압력에 따른 잔류 지방산 내에서의 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 나타낸 그래프이며,
도 5는 고압 이산화탄소에서 효소량에 따른 잔류 지방산 내에서의 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 나타낸 그래프이고,
도 6은 고압 이산화탄소에서 수분함량에 따른 잔류 지방산 내에서의 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 나타낸 그래프이며,
도 7은 고압 이산화탄소에서 DHA의 농축율 및 DHA의 회수율을 상온, 상압에서의 DHA 농축율 및 DHA의 회수율과 비교하여 나타낸 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다. 이하 실시예에서는 참치유를 사용하고 있으나, 이는 DHA를 함유하는 모든 오일로서 이해되어야 한다.

실험예 1 ; 참치유로부터 DHA 를 농축하는 방법

a) 참치유로부터 지방산 준비

참치유 100g에 30중량% NaOH 100mL과 95중량% 에탄올 300mL을 넣고 30분 동안 300rpm으로 저어 주면서 환류시켰다. 검화된 시료를 분액 깔때기에 옮기고 증류수 200mL과 염산 120mL을 넣어 흔들어주었다. 층분리가 이루어지면 아래층은 버리고 위층에 헥산 200mL과 증류수 100mL을 넣고 흔들어주어 지방산이 헥산층에 충분히 녹도록 하였다. 지방산이 녹아 있는 헥산층은 증류수 100mL을 넣고 남은 염산이 없도록 3번에 걸쳐 세척하였다. 지방산이 녹아 있는 헥산층의 헥산은 rotary evaporator와 질소 flushing을 이용하여 잔류하는 헥산이 없도록 충분히 날려준 후 냉동 보관하였다.

b) 고압 이산화탄소에서 효소를 이용한 에스테르화 반응

고압 이산화탄소 반응 장치는 도1과 같았다. 50-mL 용량의 반응기(view cell reactor)에 water bath를 연결하여 반응온도를 조절하고 반응기의 반응온도와 고압 펌프 (PREP PUMP, LabAlliance, USA)의 냉각기(-25^oC)는 예열시켰으며, 참치유 지방산과 에탄올의 몰비율을 1:2로 한 기질 혼합물과 효소를 함께 넣고 일정 압력까지 이산화탄소를 주입한 후 저어주면서 18시간 동안 반응시켰다.

실험예 2: 분석방법

반응물 중 30 mg을 클로로포름에 녹인 후 TLC plate (silica gel 60 F₂₅₄, Merck, Germany)에 loading하였고, 전개용매 petroleum ether: diethyl ether: acetic acid (100:40:1, by vol)으로 전개시켰다. 전개된 TLC plate에서 0.2중량% (w/v) 2,7-dichlorofluorescein을 뿌려 확인된 지방산 부분과 지방산 에틸 에스터 부분을 각각 분취하고 내부 표준물질 (undecanoic acid, C11:0) 2mg을 넣고 메틸에스터화시켜 가스 크로마토그래피 분석시료를 만들었다. 가스 크로마토그래피 분석을 위하여 가스 크로마토그래프 (varian cp-3800, varian Inc., Walnut Creek, CA, USA)에 컬럼은 SP^TM-2560 (100 m ■ 0.25 mm, 0.2 μm film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 장착하고 이동상으로는 헬륨을 1.0 mL/min 으로 흘려주었다. 컬럼 오븐의 온도는 100^oC에서 4분 정치시켰다가 3^oC/min의 속도로 240^oC까지 승온시키고 240^oC에서 17분 정치시키는 것으로 조절하였다. 시료 주입부의 온도는 225^oC로 하고 split ratio는 50:1이 되도록 하며, 불꽃 이온화 검출기의 온도는 285^oC로 하였다. 내부 표준물질의 피크면적을 기준으로한 각 피크면적의 비를 이용하여 잔류 지방산 내의 DHA 농도 및 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량을 계산한다.

<계산식1>

<계산식2>

비교예 1

참치유에 내부 표준물질 (undecanoic acid, C11:0) 2mg을 넣고 메틸에스터화시켜 가스 크로마토그래피 방법으로 분석하였다. 가스 크로마토그래피 분석을 위하여 가스 크로마토그래프 (varian cp-3800, varian Inc., Walnut Creek, CA, USA)에 컬럼은 SP^TM-2560 (100 m ■ 0.25 mm, 0.2 μm film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 장착하고 이동상으로는 헬륨을 1.0 mL/min 으로 흘려주었다. 컬럼 오븐의 온도는 100^oC에서 4분 정치시켰다가 3^oC/min의 속도로 240^oC까지 승온시키고 240^oC에서 17분 정치시키는 것으로 조절하였다. 시료 주입부의 온도는 225^oC로 하고 split ratio는 50:1이 되도록 하며, 불꽃 이온화 검출기의 온도는 285^oC로 하였다. 내부 표준물질의 피크면적을 기준으로한 각 피크면적의 비를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다.

본 연구에서 사용한 원료인 참치유의 지방산 조성을 표 1에 나타내었고 참치유에 포함되어 있는 DHA (C22:6) 함량은 20.9 wt중량%이었다.

지방산	비교예 1
C14:0	3.8 ㅁ 0.0
C16:0	17.9 ㅁ 0.5
C16:1	4.9 ㅁ 0.0
C18:0	3.9 ㅁ 0.1
C18:1(n-9)	15.1 ㅁ 0.6
C18:1(n-7)	4.8 ㅁ 0.2
C18:2(n-6)	4.5 ㅁ 0.1
C20:0	0.5 ㅁ 0.2
C18:3(n-6)	0.4 ㅁ 0.1
C20:1	6.4 ㅁ 1.4
C18:3(n-3)	0.2 ㅁ 0.1
C20:2	1.2 ㅁ 0.2
C20:3(n-6)	0.2 ㅁ 0.1
C20:4(n-6)	2.0 ㅁ 0.2
C20:5(EPA)	11.3 ㅁ 0.1
C22:5(DPA)	2.1 ㅁ 0.0
C22:6(DHA)	20.9 ㅁ 0.5

비교예 2. 효소에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18 g으로 하고 수분함량 0.2중량%와 35^oC의 조건에서 8.3 MPa의 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, 효소에 대한 영향을 확인하기 위하여 실험한 효소는 Novozym 435 (Candida antarctica 유래)이며, 효소의 양은 총 기질 무게를 기준으로 5중량%를 넣어 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 2). 본 실험에서는 Novozym 435를 사용하였을 때, 잔류 지방산 (FA) 내에서나(도2-a) 합성된 지방산 에틸 에스터 (FAEE) 내에서의(도2-b) DHA 농도에서 유의적인 차이를 보이지 않았다.

실시예 1. 효소에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18g으로 하고 수분함량 0.2중량%와 35^oC의 조건에서 8.3 MPa의 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, 효소에 대한 영향을 확인하기 위하여 실험한 효소는 Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)과 Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus 유래)이며, 효소의 양은 총 기질 무게를 기준으로 5중량%를 넣어 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 2).

본 실험에서는 Lipozyme TL IM과 Lipozyme RM IM의 경우 잔류 지방산 내에서 DHA의 농도(도2-a)가 지방산 에틸 에스터 내에서의 DHA 농도(도2-b)에 비하여 높은 것으로 나타났다. 따라서 Lipozyme TL IM과 Lipozyme RM IM은 DHA에 대하여 특이적으로 반응성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 잔류 지방산으로 회수되는 DHA량을 확인하였을 때 Lipozyme RM IM이 다른 효소들에 비하여 높은 것으로 나타났다.

따라서, Lipozyme RM IM을 이용하였을 때 잔류 지방산 내에 DHA 농축을 위한 최대 효율을 나타내었다.

실시예 2. 반응온도에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18 g으로 하고 수분함량 0.2중량%의 조건에서 8.3 MPa의 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)을 총 기질 무게를 기준으로 5중량% 넣고, 온도 조건은 15와 25, 35^oC에서 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 3).

본 실험에서 사용된 압력조건 8.3MPa에서 15^oC는 이산화탄소를 액체 상태로 유지시켰고, 25^oC는 액체와 초임계의 중간 상태인 아임계 상태를 만들어 주었으며, 35^oC에서는 초임계 이산화탄소를 만들어 주었다. 그러나 이산화탄소의 이러한 상태 변화에도 불구하고 잔류 지방산 내의 DHA농도나 회수되는 DHA량에서 큰 차이를 보여주지 않았으나 25^oC의 아임계 상태에서 가장 높은 74중량% 값을 나타내었다.

따라서, 15 내지 35^oC의 온도 조건이 잔류 지방산 내에 DHA 농축을 위하여 적합하나, 더 적합하게는 25^oC인 것으로 나타났다.

실시예 3. 이산화탄소 압력에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18 g으로 하고 수분함량 0.2중량%와 25^oC의 조건에서 2.8, 5.5, 8.3, 11.0, 13.8MPa의 다양한 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)을 총 기질 무게를 기준으로 5중량% 넣고 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 4).

본 실험에서 사용된 온도 조건 25^oC에서 이산화탄소의 압력에 따라 2.8 MPa은 기체 상태의 이산화탄소가 되고, 5.5MPa의 경우 기체와 액체의 경계가 되며, 8.3MPa의 경우에는 아임계 상태의 이산화탄소가 된다. 2.8에서 5.5MPa까지 이산화탄소의 압력이 증가하면 잔류 지방산 내의 DHA 농도는 큰 차이를 보이지 않지만 5.5에서 8.3MPa까지 증가하는 압력의 경우에는 DHA 농도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 8.3에서 11.0MPa까지 증가하였을 때는 DHA농도가 큰 차이가 없었고, 11.0에서 13.8MPa까지는 DHA농도가 감소하였다. 지방산으로 회수된 DHA의 양은 실험된 모든 압력 조건에서 큰 차이를 보이지 않았다.

따라서, 8.3 내지 11.0MPa의 이산화탄소 압력 조건이 잔류 지방산 내에 DHA 농축을 위하여 적합하나, 더 적합하게는 8.3MPa인 것으로 나타났다.

실시예 4. 효소량에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18 g으로 하고 수분함량 0.2중량%와 25^oC의 조건에서 8.3MPa의 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)은 총 기질 무게를 기준으로 2.5, 5, 10, 15중량%의 다양한 양을 넣고 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 5).

본 실험에서 사용된 Lipozyme RM IM의 양을 2.5에서 5중량%로 증가시켰을 때, 잔류 지방산 내의 DHA 농도는 증가되었으나 10중량% 이상의 효소량 증가에서는 더 이상 증가되지 않았고, 15중량%의 효소량으로는 오히려 감소하였다. 잔류 지방산으로 회수된 DHA의 양은 2.5에서 5중량%까지 증가하였을 때는 92에서 82중량%로 감소하였으나 5에서 10중량%까지 효소량이 증가하였을 때는 회수되는 DHA의 양이 30중량%까지 감소되고 10에서 15중량%까지의 효소량 범위에서는 회수되는 DHA량에 큰 차이가 없었다.

따라서, Lipozyme RM IM의 사용량은 총 기질량을 기준으로 5중량%로 하였을 때 잔류 지방산 내에 DHA의 농축을 위하여 적합한 것으로 나타났다.

실시예 5. 초기 수분함량에 따른 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축

참치유 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 총 기질의 양을 18 g으로 하고 25^oC의 조건에서 8.3MPa의 이산화탄소의 압력으로 18시간 동안 반응시켰으며, Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)는 총 기질 무게를 기준으로 5중량%의 양을 넣고 0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 3, 5중량%의 다양한 수분함량에서 에스테르화 반응을 수행하였다 (도 6).

본 실험에서 수분함량이 0일 때, 잔류 지방산 내에 DHA 농도와 회수되는 DHA량이 매우 낮았다. 그러나 0.2중량%에서 DHA농도는 74중량%로 증가되었고, 회수되는 DHA는 80중량%이었다. 수분함량이 0일 때, 에스테르화 반응이 잘 일어나서 잔류되는 DHA양이 적은 것으로 예상된다. 0.2중량%에서 1중량% 수분함량에서 DHA 농도는 차이가 없으나 0.2중량%의 수분함량에서 가장 많은 양의 DHA가 회수되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 1에서 5중량%까지 수분함량이 증가하면서 DHA의 회수량은 차이가 없으나 DHA 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 수분함량이 0.2중량%일 때 잔류 지방산 내에 DHA의 농축을 위하여 가장 적합한 것으로 나타났다.

실시예 6. 고압 이산화탄소에서 참치유로부터 DHA 농축과 상압에서의 반응 결과의 비교

참치유 지방산과 에탄올의 몰비율을 1:2로 배합하여 25^oC에서 이산화탄소 압력 8.3MPa, 5중량% Lipozyme RM IM, 0.2중량% 수분함량 조건으로 고압 이산화탄소에서 DHA를 농축하였고, 이 결과를 상압에서의 결과와 비교하기 위하여 상압에서 동일한 몰비율, 동일한 반응온도, 효소 및 효소량과 수분함량에서 실험하였다 (도 7).

잔류 지방산 내 DHA 농도는 고압 이산화탄소에서의 반응과 상압에서의 반응 모두 반응 4시간까지는 증가되었으나 상압에서의 DHA 농도 증가가 더 빠르게 일어났다. 그러나 상압에서의 DHA 농도는 반응 4시간부터 65중량%로 더 이상 증가하지 않았다. 반면 고압 이산화탄소에서의 반응결과는 반응 18시간에 74중량%까지 증가하였다. 잔류 지방산으로 회수되는 DHA양은 반응시간의 증가와 함께 고압 이산화탄소에서보다 상압에서 더욱 급격한 감소를 보여주었다.

따라서 고압 이산화탄소에서의 DHA 농축이 상압에서보다 효율적임을 확인하였다.

Claims

DHA (docosahexaenoic acid)를 농축함에 있어서,
a) DHA를 포함하는 오일을 지방산으로 전환하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 수득한 지방산과 에탄올의 혼합액을 제조하는 단계;
c) 상기 혼합액의 초기 수분함량을 0-5중량%로 조정하는 단계;
d) 상기 c)단계에서 수득한 혼합액에 Lipozyme RM IM 및 Lipozyme TL IM으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 효소를 2.5-10중량% 첨가하는 단계;
e) 반응기 내에 2.8 내지 13.8MPa의 압력으로 이산화탄소를 주입하는 단계;
f) 교반하면서 2 내지 24시간동안 반응시키는 단계;
g) 반응기 내에서 서서히 이산화탄소를 빼면서 압력을 상압으로 내려 반응물을 취하는 단계를 포함하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항에 있어서,
DHA를 포함하는 오일은 참치유임을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
효소는 Lipozyme RM IM과 Lipozyme TL IM으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
반응온도는 15-35℃임을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
이산화탄소 압력은 8.3-11.0MPa을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
초기 수분함량은 총 기질 중량대비 0.2-1중량%임을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
반응시간은 16-24시간을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.
DHA (docosahexaenoic acid)를 농축함에 있어서,
실험결과 반응온도 25^oC, 총 기질량을 기준으로 5중량%의 Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)효소량, 0.2중량%의 수분함량 및 8.3 MPa의 이산화탄소 압력에서 DHA를 포함하는 지방산과 에탄올을 1:2의 몰비율로 혼합하여 에스테르화 반응을 18시간 동안 반응을 수행하여 참치유 지방산에서 고농도의 DHA를 회수하면서 상압보다 높은 수율로 농축된 DHA를 지방산의 형태로 수득함을 특징으로하는 DHA가 농축된 지방산을 얻는 방법.