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KR101414734B1 - 미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법 - Google Patents

미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법 Download PDF

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KR101414734B1
KR101414734B1 KR1020120109470A KR20120109470A KR101414734B1 KR 101414734 B1 KR101414734 B1 KR 101414734B1 KR 1020120109470 A KR1020120109470 A KR 1020120109470A KR 20120109470 A KR20120109470 A KR 20120109470A KR 101414734 B1 KR101414734 B1 KR 101414734B1
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Abstract

본 발명은 미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 미세조류에서 유용물질을 추출하고 남은 미세조류 잔여물(Spent Microalgae)을 물리적, 효소적 전처리 방법으로 가수분해를 실시하여 얻어진 미세조류 잔여물의 가수분해물을 질소원으로 공급하여 발효시킴으로써 숙신산을 고효율 및 경제적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법{Method for Producing Succinic Acid Using Spent Microalgae as a Nitrogen Source}
본 발명은 미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 미세조류에서 유용물질을 추출하고 남은 미세조류 잔여물(Spent Microalgae)을 물리적, 효소적 전처리 방법으로 가수분해를 실시하여 얻어진 미세조류 잔여물의 가수분해물을 질소원으로 공급하여 발효시킴으로써 숙신산을 고효율 및 경제적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
숙신산 (또는 부탄디산)은 COOH-CH2-CH2-COOH의 반-구조식의, 2개의 카르복실기를 갖는 유기산으로서, 미토콘드리아에서의 크렙스 회로의 대사성 중간체로서 세포 대사에 관여하며, 화장품, 식품 가공, 의약품 및 섬유분야 등 다양한 산업 분야에서 활용 가능한 여러 가지 화합물의 전구체로써 널리 이용되고 있다.
현재 산업적으로 생산되는 숙신산의 대부분은 주로 석유화학적 합성공정에 기초하여 생산되고 있으나 화석연료의 고갈 및 화학공정을 통해 발생하는 온실 가스 및 기타 환경 오염물질로 인한 환경문제 유발 등의 이유로 이러한 석유화학적 공정을 대체하기 위한 생물공학적 생합성 공정에 대한 연구가 진행되고 있다.
이러한 숙신산의 생물공학적 제조방법과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0301960호(1999.04.12 출원)는 낙농 산업에서 나오는 폐기물인 유청을 배양원료로 포함하는 배양배지를 이용하여 숙신산을 생산하는 특허로서, 유청을 배양원료로 이용하기 위해서는 한외여과 또는 가수분해 등의 전처리 과정이 필요하였으나, 상기 방법에서는 전처리 과정을 거치지 않고 바로 배양원료로 이용하였기 때문에 배양 효율이 떨어지며, 질소원으로는 값비싼 효모 추출물을 사용한 결과 경제성 배지를 완전히 달성하지 못하는 문제가 있었다.
또한 대한민국 특허출원 제10-2002-0005200호(2000.06.23 출원)는 목질계 당화액(wood hydrolysate)을 이용한 숙신산의 생물학적 생산방법에 관련된 것으로서, 목질계 당화액은 셀룰로스 분해효소로 처리하여 목재의 셀룰로스를 포도당으로 전환시킨 반응산물로서 전처리 비용이 많이 들어간다는 문제가 있었다.
그 외 맥주 양조장에 사용한 효모 부산물을 이용하여 숙신산을 생산하는 방법에 관한 논문이 있는데, 이는 효모 부산믈을 전처리하는 과정에서 1단계로 자가분해 방법과 2단계 효소 가수분해 방법을 이용하는 방법으로 1단계 자가분해 방법에서의 효율이 많이 떨어지는 문제가 있었다[Min Jiang. et al. / Appl Biochem Biotechnol / 2010년, page: 160:244-254].
이에 상술한 바와 같은 환경적 문제를 유발하는 화학공정을 효과적으로 대체하여, 경제적이면서 높은 효율로 숙신산을 생산할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명은 물리적, 효소적 전처리 공정을 거친 미세조류 잔여물(Spent microalgae)을 질소원으로 사용하여 경제적이면서 높은 효율로 숙신산을 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들이 연구한 결과, 기존의 배양공정에서 이용되어 온 고가의 효모추출물 대신에, 다량의 질소원을 포함하는 미세조류 잔여물을 사용하여 숙신산을 생산할 수 있는 회분식 배양공정을 개발하였으며, 이에 따라 기존의 효모추출물을 질소원으로 사용하는 배양법에 비해 원가를 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라 고효율로 숙신산을 생산할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명의 바람직한 일 구현예는 미세조류의 추출 잔여물을 질소원으로 포함하는 발효배지에서 숙신산 발효 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 숙신산 생산방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 명세서에서 질소원(nitrogen source)이란 미생물의 생장에 있어서 단백질, 퓨린(purine), 피리미딘(pyrimidine) 및 다당류 키틴(chitin) 등의 합성에 필수적인 질소원자를 포함하는 유기 또는 무기물을 의미한다.
현재 사용되는 질소원의 대표적인 예로서 효모 추출물을 들 수 있는데 이러한 고가의 효모 추출물은 높은 제조단가로 인해 상용화 공정에서 사용이 곤란하므로 효모 추출물을 효과적으로 대체할 수 있는 값싼 질소원이 필요하다. 본 발명자들의 실험 결과, 미세조류에서 유용물질을 추출하고 남은 미세조류의 추출 잔여물에 대해 최적의 전처리 공정을 수행하여 얻어진 가수분해물을 질소원으로 사용할 경우 원료비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 발효시 생성되는 부산물을 효과적으로 억제하여 부산물 대비 숙신산의 생성량 비율을 높일 수 있게 됨으로써 숙신산을 경제적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).
미세조류의 추출 잔여물이란 미세조류에서 DHA 등의 유용한 물질들을 추출하고 남은 바이오 매스를 의미한다.
이러한 미세조류의 추출 잔여물은 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 얻어질 수 있으나, 바람직하게는 미세조류를 원심분리하여 회수하는 단계; 및 상기 회수된 미세조류에서 유용성분을 추출하는 단계; 및 상기 유용성분이 추출된 미세조류의 추출 잔여물을 회수하는 단계를 포함하여 얻어질 수 있다.
상기 원심분리는 고속에서 진행할수록 보다 많은 양의 회수가 이루어질 수 있으나, 경제성 대비 효과를 고려하여 바람직하게는 5000 내지 8000 rpm의 속도로 5 내지 10분간 수행함으로써 미세조류가 충분히 회수되도록 할 수 있다.
유용물질의 추출 방법에는 초임계 추출법과 용매 추출법 등이 있으나, 바람직하게는 미세조류 잔여물의 획득이 보다 효과적으로 이루어질 수 있는 초임계추출법을 사용하여 이루어질 수 있다. 초임계 추출은 특별히 제한되지 않고 당분야에서 널리 사용되는 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예컨대 CO2 기체를 사용하여 압력 450bar, 온도 45℃ 조건에서 수행할 수 있다.
이처럼 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 숙신산 생산방법은 유용성분이 추출된 후 폐기되는 잔여물을 배양원료로 사용함으로써 원가를 크게 절감할 수 있으며, 폐기물을 감소시킬 수 있어 환경적 측면에서도 매우 유용한 효과가 있다.
미세조류는 예컨대, 오란티오키트리움 속 (Aurantiochytrium sp.), 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.), 클로렐라 속 (Chlorella sp.), 스피룰리나 속 (Spirulina sp.), 듀날리엘라 속 (Dunaliella sp.), 난노크로롭시스 속 (Nannochloropsis sp.), 보트리오코커스 속 (Botryococcus sp.), 트라우스토키트리움 속 (Thraustochytrium sp.), 자포노키트리움 속 (Japonochytrium sp.), 울케니아 속 (UIkenia sp.), 크립테코디니움 속 (Crypthecodinium sp.), 할리프토로스 속 (Haliphthoros sp.), 클라미도모나스 속 (Chlamydomonas sp.) 및 포르피리디움 속 (Porphyridium sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 바람직하게는 세포 내 질소원을 많이 함유하며 성장이 잘 이루어지는 것을 사용할 수 있다.
미세조류의 추출 잔여물은 바람직하게는 물리적 전처리 방법 및 효소적 전처리 방법을 병행하여 얻어진 가수분해물 형태로 발효배지에 포함될 수 있다.
바람직하게는 상기 미세조류의 추출 잔여물은 (1) 미세조류의 추출 잔여물을 초음파 처리하여 세포를 파쇄하는 단계; 및 (2) 상기 세포 파쇄된 미세조류의 추출 잔여물을 효소 가수분해하는 단계를 포함하는 전처리 공정을 거쳐 얻어진 미세조류 추출 잔여물의 가수분해물일 수 있다.
(1) 단계의 초음파 공정은 바람직하게는 초음파 파쇄기를 사용하여 15 내지 30 kHz 및 110 내지 150W로 1 내지 3 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.
상기 초음파 파쇄법 외에도 압착법, 구슬 분쇄법 등 기타 미세조류의 파쇄가 가능한 방법을 사용할 수 있음은 물론이나, 세포의 파쇄 효율을 고려할 때 최대한의 세포를 파쇄함으로써 질소원을 보다 다량으로 획득할 수 있는 초음파 파쇄법이 특히 바람직하다.
(2) 단계의 효소적 전처리 공정(가수분해 공정)은 단백질 가수분해 효소를 사용하여 55 내지 60℃에서 24 내지 30시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 공정은 150 내지 200rpm으로 교반하면서 이루어질 수 있다. 또한 바람직하게는 가수분해 활성을 보다 높일 수 있도록 단백질 가수분해 효소의 활성이 높은 pH 범위, 즉 pH 7.0 내지 8.0의 조건하에 이루어질 수 있다.
상기 단백질 가수분해 효소로는 바람직하게는 아미노산 N 말단기를 선택적으로 절단하는 세린 프로테아제(serine protease) 계열로 사용함으로써 질소원을 보다 효율적으로 얻을 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 등의 바실러스 속(Bacillus sp.) 균이 분비하는 프로테아제(Protease) 또는 알칼라제(Alcalase)를 사용할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 효소는 세포 파쇄된 미세조류 추출 잔여물의 건조 중량 대비 1.0 내지 4.0g/kg의 용량으로 사용할 수 있다.
숙신산 발효 미생물로는 숙신산을 생산할 수 있는 혐기성 미생물이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있으나, 바람직하게는 루멘박테리아, 대장균, 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 자이모모나스 속(Zymomonas sp.), 및 숙시니비브리오 속(Succinivibrio sp.), 루미노코커스 속(Ruminococcus sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
루멘박테리아는 악티노바실루스 속(Actinobacillus sp.)(예컨대 악티노바실루스 숙시노겐스 (Actinobacillus succinogenes) 등), 맨하이미아 속 (Mannheimia sp.)(예컨대 맨하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens) 등), 및 언에어로바이오스피리륨 속 (Anaerobiospirillum sp.)(예컨대 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens) 등) 등일 수 있으며, 사카로마이세스 속 균은 예컨대 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae) 등일 수 있고, 코리네박테리움 속 균은 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등일 수 있고, 브레비박테리움 속 균은 예컨대 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)일 수 있다. 또한 자이모모나스 속 균은 예컨대 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등일 수 있고, 숙시니비브리오 속 균은 예컨대 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스(Succinivibrio dextrinosolvens) 등일 수 있으며, 루미노코커스 속 균은 예컨대 루미노코커스 플라비파시엔스(Ruminococcus flavefaciens) 등일 수 있다.
바람직하게는 상기 숙신산 발효 미생물은 악티노바실루스 속 (Actinobacillus sp.), 맨하이미아 속 (Mannheimia sp.), 및 언에어로바이오스피리륨 속 (Anaerobiospirillum sp.)으로 구성된 군에서 선택된 루멘박테리아일 수 있으며, 보다 바람직하게는 악티노바실루스 속, 가장 바람직하게는 악티노바실루스 숙시노겐스 (Actinobacillus succinogenes)를 사용할 수 있다. 상기 악티노바실루스 숙시노겐스는 대장균 또는 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센스 등의 여타 미생물과는 달리 삼투압을 잘 견디므로 고농도의 포도당 및 숙신산을 견딜 수 있는 특징을 가지고 있으며, 이에 따라 고농도의 기질 및 산물의 생산이 가능하므로 분리 및 정제에 드는 비용을 감소시킬 수 있으므로 산업화에 특히 유리하다.
숙신산 발효 미생물의 배양은 바람직하게는 혐기성 조건하에 회분식 또는 연속식으로 이루어질 수 있으며, 회분식으로 배양할 경우 바람직하게는 pH 6.0 내지 7.0, 및 38 내지 40 ℃에서 60 내지 70 시간 동안 이루어지는 것일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 배양은 150 내지 200 rpm의 속도로 이루어질 수 있다.
pH 조절은 산화마그네슘, 수산화마그네슘 및 탄산마그네슘 등의 마그네슘 화합물; 산화칼슘, 수산화칼슘 및 탄산칼슘 등의 칼슘 화합물; 수산화칼륨 및 탄산칼륨 등의 칼륨 화합물; 수산화암모늄 및 탄산암모늄 등의 암모늄 화합물; 또는 수산화나트륨 및 탄산나트륨 등의 나트륨 화합물을 발효 배지에 첨가하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 80 g/L의 탄산마그네슘(MgCO3)을 배지에 주입함으로써 pH 조절(pH 6.0 이상 유지) 및 탄산 공급이 이루어질 수 있다.
바람직하게는 상기 숙신산 발효 미생물은 발효 배지의 5 내지 10 %(v/v)로 접종하여 배양할 수 있다. 미생물 접종량이 예컨대 대략 3% 미만으로 너무 적게 접종 될 경우에는 유사(pseudo lag phage)지연기가 존재하여 접종 미생물이 본배양 배지에서 자라지 않고 그냥 생장을 멈출 수 있으므로 5~10 % 사이 정도로 접종해주는 것이 바람직하다.
발효 배지의 질소원을 제외한 기타 성분으로는 혐기성 미생물을 배양하기에 적합한 것이라면 특별히 제한되지 않고 당분야에 널리 사용되는 물질들을 사용할 수 있으며, 탄소원으로서는 바람직하게는 포도당을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 숙신산 생산에 충분하도록 70 내지 90g/L의 양으로 배지에 포함할 수 있다.
숙신산의 발효는 숙신산 외에도 부산물로써 초산, 및 개미산 등의 다른 유기산들을 함께 생성하게 된다. 따라서 이와 같은 부산물의 함량이 줄어들수록 숙신산 생산 효율이 더욱 높아질 수 있다. 본 발명자들의 실험결과 질소원인 미세조류 잔여물의 가수분해물의 농도가 증가할수록 숙신산의 생산 농도 또한 증가하며, 반면 발효 부산물인 개미산의 농도는 효과적으로 억제되어 부산물 대비 숙신산 생산 농도 비율이 높아지는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
이처럼 숙신산의 생산 효율을 높이기 위해, 바람직하게는 상기 숙신산 발효를 위한 발효 배지는 질소원으로 사용되는 미세조류의 추출 잔여물을 배지 리터당 15 내지 60g으로 포함할 수 있다. 미세조류 추출 잔여물의 함량이 상기 범위에 미달할 경우 질소원 함량이 적어 숙신산 생산량이 감소하여 바람직하지 않으며, 상기 범위를 초과할 경우 숙신산 생산량은 증가시킬 수 있으나 경제성이 떨어지는 문제가 있다.
즉, 상기 발효 미생물을 배양하기 위한 배지의 조성은 바람직하게는 70 ~ 90g/L 포도당(탄소원), 15 ~ 60g/L 미세조류 추출 잔여물(질소원), 9.6g/L의 NaH2PO4·2H2O, 10.0g/L의 NaHCO3, 15.5g/L의 K2HPO4이 될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 숙신산 생산 방법은, 바람직하게는 상기 숙신산 발효 미생물의 배양 단계 이후에 상기 배양물로부터 숙신산을 수득하는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 숙신산의 수득은 당분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라 경제적으로 숙신산을 생산하는 동시에, 부산물인 개미산의 생성을 억제할 수 있어 매우 효율적인 숙신산 생산 방법이 제공된다.
본 발명에 의하면, 값비싼 효모추출물 대신에 미세조류 배양을 통하여 생산하는 바이오디젤 및 건강기능성 물질 등 여러 유용물질들을 추출하고 남은 미세조류 부산물을 숙신산 배양의 질소원으로 이용할 수 있어, 생산 공정상 원가절감에도 기여할 수가 있어 보다 경제적으로 숙신산 생산이 가능하다. 본 발명은 이러한 미세조류 잔여물을 이용하여 현재 화학공정으로 생산되고 있는 숙신산을 생물학적 방법으로 생산할 수 있기 때문에, 더욱 그 가치가 높다고 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 미세조류를 질소원으로 이용하여 전처리를 거쳐 숙신산을 생산하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 4에 따라 질소원 종류별 숙신산 생산 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 5에 따라 미세조류 가수분해 생성물 60g/L의 농도에서 배양시간에 따른 숙신산 및 기타 부산물의 생산량 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다((◆)는 숙신산; (■)는 초산; 및 (▲)는 개미산의 농도를 나타냄).
이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미세조류의 배양, 수확, 오일 추출 및 미세조류 잔여물 회수
질소원으로 사용할 미세조류는 오란티오키트리움 속 SR21 균주 (Aurantiochytrium limacinum SR21, ATCC MYA-1381)를 사용하였다. 구체적으로 상기 균주를 배양한 후(배지 조성: 50 g/L 포도당, 10 g/L 콘 스팁 솔리드(Corn steep solid), 20 g/L 씨솔트(Sea salt); 배양 조건: pH 5.0, 온도 25 ℃, Aeration 0.5 vvm, Agitation 350 rpm) 원심분리(5000rpm, 10분)하여 바이오매스를 수확하였다. 그 이후 미세조류 바이오매스에 포함되어 있는 건강기능성 물질인 디에이치에이(DHA)를 초임계유체추출법(그린텍21)(추출 압력 : 450bar, 추출 온도 : 45℃, 추출 시간 2시간 20분)으로 추출하고 남은 미세조류 잔여물을 회수하여 후속 전처리 과정에 사용하였다.
실시예 2: 미세조류 잔여물( Spent microalgae )의 전처리 1
상기 실시예 1에서 얻어진, 미세조류에서 유용물질을 추출하고 남은 미세조류 잔여물(Spent Microalgae)에 대해 일차적으로 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 우선 5~20% (v/v) 미세조류 잔여물(건조중량 1.5~6g; 실시예 4에서는 1.5g 사용, 실시예 5에서는 미세조류 각각 1.5, 2, 4, 6g 사용함)에 멸균수를 30mL을 넣어 충분하게 섞어주었다. 이후 초음파 파쇄기(기기명: Ultrasonic Processor, 제조사: 제이오텍)로 20 kHz, 130 W 조건에서 1시간 이상 초음파 처리를 하여 미세조류 세포를 파쇄하였다.
실시예 3: 미세조류 잔여물( Spent microalgae )의 전처리 2
상기 실시예 2에서 초음파 처리를 통해 세포 파쇄된 미세조류 잔여물에 대해 이후 이차적으로 효소 전처리를 병행하여 가수분해를 실시하였다. 단백질 가수분해 효소로는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 얻어진 프로테아제(시그마 제품)(상품명: Sigma / Protease from Bacillus licheniformis)를 이용하였으며, 미세조류 건조중량 대비 4.0 g/kg 용량으로 효소를 넣어주며 반응온도 60 ℃에서, 24 시간 동안 200rpm으로 교반하며 반응 시켰다. 미세조류 현탁액의 pH는 효소 반응 전 5M NaOH 로 pH 8.0으로 조절하였다. 최종 전처리 과정을 마친 가수분해 생성물을 고압멸균기(기기명: Autoclave AC14, 제조사: 제이오텍)에서 121℃, 15분 동안 멸균 과정을 거친 후, 숙신산 제조를 위한 숙신산 발효 배지에 질소원으로 사용하였다.
실시예 4: 다양한 질소원에 따른 배양특성
일반적으로, 질소원에 포함된 영양원이 세포성장에 중요한 영향을 끼친다고 보고되어 있으므로, 상기 실시예 3에 따른 미세조류 가수분해물과 기타 다양한 질소원에 대하여 각각 회분식 배양을 수행하여 질소원의 종류에 따른 발효시 숙신산 생산성에 대한 영향을 분석하였다.
균주로는 혐기적 미생물인 악티노바실루스 숙시노겐스 130Z (ATCC 55618)를 사용하였고, 배양기에서 본배양을 하기 전, 10.0g/L의 포도당, 5g/L의 효모추출물(제조사:BD 시약명: Bacto™ Yeast Extract), 9.6g/L의 NaH2PO4·2H2O, 10.0g/L의 NaHCO3, 15.5g/L의 K2HPO4으로 구성된 전배양 배지를 조제한 다음, 혐기적 배양을 위하여 100㎖ 플라스크 내부의 산소가 완전히 빠져나가도록 탄산가스를 3~5분 동안 주입하며 산소를 배출(purge)시켜 준 플라스크에 균을 접종하고, pH 7.0, 38℃에서 16시간 동안 200rpm으로 교반하면서 전배양을 하였다.
다음으로, 90.0g/L의 포도당, 15.0g/L의 질소원(상기 실시예 3에서 얻어진 미세조류 가수분해물, 대두 분해물(Bacto™ Tryptic Soy Broth, BD), 소이톤(Bacto™ Soytone, BD), 트립톤(Bacto™ Tryptone, BD), 펩톤(Bacto™ Peptone, BD), 맥아추출물(Bacto™ Malt Extract, BD), 옥수수 침지액(Corn steep liquor, Sigma), 콘 스팁 솔리드(Corn steep solids, Sigma)), 9.6g/L의 NaH2PO4·2H2O, 10.0g/L의 NaHCO3, 15.5g/L의 K2HPO4로 구성된 본배양 배지를 조제하고 본 배양시 pH를 6.0 내지 7.0 사이로 유지(본배양 배지의 초기 pH는 7.0 정도이며 80.0 g/L MgCO3을 주입하여 pH 6 이상으로 유지)하고, 또한 탄산 공급을 하기 위하여 80.0g/L의 MgCO3을 배지에 주입하였다. 상기 배지에 실시예 4-1에서 전배양된 미생물 균주를 10% (v/v)로 접종하고, 38℃에서 200rpm 속도로 미생물을 배양하였다. 총 70시간 동안 배양을 진행하였으며, 발효액로부터 배지를 채취하여 배양액 내의 숙신산, 초산, 개미산 및 포도당의 양을 유기산 및 당류를 분석할 수 있는 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, 미국)을 이용한 HPLC 방법(이동상: 5mM H2SO4, 오븐온도: 40 ℃, 유속: 0.3 mL/min, 시료 주입량: 5ul, RI(시차굴절률) 검출(Dionex RI-101))으로 측정하여 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 3에 따른 미세조류 가수분해물을 배양원료(질소원)로 이용하여 숙신산 발효를 수행하였을 때, 숙신산 생산 농도가 22.2g/L로 가장 높게 나타나 다른 질소원에 비해 현저히 높은 숙신산 생산성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 미세조류 가수분해 생성물의 농도에 따른 배양특성
숙신산 발효 배양에 있어서, 질소원으로 사용한 미세조류 가수분해물의 농도에 따른 숙신산 생산량을 비교 하기 위하여, 미세조류 가수분해물의 양을 15 내지 60g/L로 변화시키면서 상기 실시예 4와 동일한 배양조건하에서 회분식 배양을 수행하였다.
총 70시간 동안 배양을 진행하였으며, 시간별로 배양기로부터 배지를 채취하여 미세조류 농도에 따른 배양액 내의 숙신산, 초산 및 개미산의 농도를 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타냈다.
도 3은, (◆)는 숙신산; (■)는 초산; 및 (▲)는 개미산의 농도를 나타내고 있으며, 60.0g/L의 미세조류 농도에서 배양시간에 따른 유기산의 생산량을 나타낸 그래프이다.
하기 표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, 전처리를 통하여 얻어진 상기 실시예 3의 미세조류 가수분해물의 농도가 증가할수록 숙신산의 생산 농도 또한 더욱 증가하는 반면, 발효 부산물로 생성되는 개미산의 농도는 일정하게 유지되는 것으로 나타났다. 이처럼 질소원인 미세조류 가수분해물의 농도 증가에 따른 숙신산 생산 농도의 증가량 대비 부산물의 비율은 낮아져서 숙신산의 생산 효율을 현저히 증대시킬 수 있음을 확인하였다.
Microalgae 농도 (g/L) 15 20 40 60
숙신산 20.8 26.0 39.2 43.2
초산 4.0 4.2 5.9 7.5
개미산 2.8 2.5 3.1 2.5

Claims (9)

  1. (1) 미세조류의 추출 잔여물을 초음파 처리하여 세포를 파쇄하는 단계;
    (2) 상기 세포 파쇄된 미세조류의 추출 잔여물을 효소 가수분해하는 단계; 및,
    (3) 상기 단계 (2)의 결과 얻어진 미세조류 추출 잔여물의 가수분해물을 질소원으로 포함하는 발효배지에서 숙신산 발효 미생물을 배양하는 단계를 포함하는,
    숙신산 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미세조류는 오란티오키트리움 속 (Aurantiochytrium sp.), 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.), 클로렐라 속 (Chlorella sp.), 스피룰리나 속 (Spirulina sp.), 듀날리엘라 속 (Dunaliella sp.), 난노크로롭시스 속 (Nannochloropsis sp.), 보트리오코커스 속 (Botryococcus sp.), 트라우스토키트리움 속 (Thraustochytrium sp.), 자포노키트리움 속 (Japonochytrium sp.), 울케니아 속 (Ulkenia sp.), 크립테코디니움 속 (Crypthecodinium sp.), 할리프토로스 속 (Haliphthoros sp.), 클라미도모나스 속 (Chlamydomonas sp.) 및 포르피리디움 속 (Porphyridium sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 초음파 처리는 15 내지 30 kHz 및 110 내지 150W로 1 내지 3 시간 동안 수행하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는
    단백질 가수분해 효소를 사용하여 55 내지 60℃에서 24 내지 30시간 동안 수행하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 발효 미생물은 루멘박테리아, 대장균, 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 자이모모나스 속(Zymomonas sp.), 숙시니비브리오 속(Succinivibrio sp.), 및 루미노코커스 속(Ruminococcus sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 발효 미생물은 악티노바실루스 속 (Actinobacillus sp.), 맨하이미아 속 (Mannheimia sp.), 및 언에어로바이오스피리륨 속 (Anaerobiospirillum sp.)으로 구성된 군에서 선택된 루멘박테리아인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 발효 미생물의 배양은 혐기성 조건하에 pH 6.0 내지 7.0, 및 38 내지 40 ℃에서 60 내지 70 시간 동안 이루어지는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 발효배지는 상기 미세조류의 추출 잔여물의 가수분해물을 배지 리터당 15 내지 60g으로 포함하는 것인 방법.
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