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KR101383440B1 - 신경 성장 인자 길항제를 투여함으로써 골관절염 통증을 치료하는 방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

신경 성장 인자 길항제를 투여함으로써 골관절염 통증을 치료하는 방법 및 이를 함유하는 조성물 Download PDF

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KR101383440B1
KR101383440B1 KR1020107028307A KR20107028307A KR101383440B1 KR 101383440 B1 KR101383440 B1 KR 101383440B1 KR 1020107028307 A KR1020107028307 A KR 1020107028307A KR 20107028307 A KR20107028307 A KR 20107028307A KR 101383440 B1 KR101383440 B1 KR 101383440B1
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리나트 뉴로사이언스 코프.
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Abstract

본 발명은 항-NGF 항체 (예컨대 항-NGF 길항제 항체), 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이같은 항체 및/또는 폴리뉴클레오티드의 수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증이 포함되는 통증의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 관한 것이다.

Description

신경 성장 인자 길항제를 투여함으로써 골관절염 통증을 치료하는 방법 및 이를 함유하는 조성물{METHODS FOR TREATING OSTEOARTHRITIS PAIN BY ADMINISTERING A NERVE GROWTH FACTOR ANTAGONIST AND COMPOSITIONS CONTAINING THE SAME}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 출원 일련 번호 11/104,248 (2005년 4월 11일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이는 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
본 발명은 항-NGF 항체 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 길항제 예컨대 항체의 수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증이 포함되는 통증의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 관한 것이다.
신경 성장 인자 (NGF)는 최초로 확인된 뉴로트로핀이고, 말초 뉴런 및 중추 뉴런 모두의 발달 및 생존에서의 이의 역할이 잘 특성화되었다. NGF는 말초 교감 및 배아 감각 뉴런 및 전뇌기저부 콜린성 뉴런의 발달에 있어서 중요한 생존 및 유지 인자인 것으로 나타났다. [Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994)] 및 [Crowley et al., Cell 76: 1001-1011 (1994)]. NGF는 감각 뉴런에서 신경펩티드의 발현을 상향-조절하고 ([Lindsay and Harmer, Nature 337: 362-364 (1989)]), 이의 활성은 두개의 상이한 막-결합 수용체인 TrkA 티로신 키나제 수용체 및 p75 공통 뉴로트로핀 수용체 (때때로 각각 "고친화력" 및 "저친화력" NGF 수용체로 명명됨)를 통하여 매개된다. [Chao et al., Science 232:518-521 (1986)]. p75 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 족의 다른 구성원들과 구조적으로 관련된다 ([Chao et al., Science 232:518-521 (1986)]). NGF에 대한 개관을 위해서는, [Huang et al., Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001)]; [Bibel et al., Genes Dev. 14:2919-2937 (2000)] 참조. NGF, 및 NGF와 trkA 수용체의 복합체의 결정 구조가 결정되었다. [Nature 254:411 (1991)]; [Nature 401:184-188 (1996)] 참조.
신경계에서의 효과에 더하여, NGF는 신경계 이외의 프로세스에 점점 더 관련되었다. 예를 들어, NGF는 혈관 침투성을 증강시키고 ([Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201(1984)]), T- 및 B-세포 면역 응답을 증강시키며 ([Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)]), 림프구 분화 및 비만 세포 증식을 유도하고, 비만 세포로부터 가용성 생물학적 신호의 방출을 야기하는 것으로 나타났다 ([Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988)]; [Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986)]; [Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992)]; [Horigome, et al., J. Biol. Chem. 268:14881- 14887 (1993)]). 외인성으로 첨가된 NGF가 모든 이러한 효과를 가질 수 있는 것으로 나타났지만, 내인성 NGF가 생체 내에서 임의의 이러한 프로세스에서 중요한 것으로 거의 나타나지 않았다는 것을 주지하는 것이 중요하다 ([Torcia, et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)]). 따라서, 내인성 NGF의 생활성을 억제하는 것의 효과 (존재하는 경우)가 무엇인지가 명확하지 않다.
NGF는 비만 세포 ([Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)]), B-림프구 ([Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996)]), 각질 세포 ([Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268: 22838-22846)]), 평활근 세포 ([Ueyama, et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)]), 섬유모세포 ([Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)]), 기관지 상피 세포 ([Kassel, et al., Clin, Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)]), 신장 혈관 사이 세포 ([Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)]) 및 골격 근육 대롱 세포 ([Schwartz, et al., J Photochem. Photobiol. B66:195-200 (2002)])가 포함되는 다수의 세포 타입에 의해 생산된다. NGF 수용체는 신경계 외부의 다양한 세포 유형 상에서 발견되었다. 예를 들어, TrkA는 인간 단핵구, T- 및 B-림프구 및 비만 세포 상에서 발견되었다.
증가된 NGF 수준과 다양한 염증 상태 간의 연관성이 인간 환자뿐만 아니라 몇몇 동물 모델에서 관찰되었다. 여기에는 전신성 홍반 루푸스 ([Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)]), 다발성 경화증 ([Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)]), 건선 ([Raychaudhuri, et al., Acta Derm. l'enereol. 78:84-86(1998)]), 관절염 ([Falcim, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)]), 간질성 방광염 ([Okragly, et al., J. Urology 161:438-441 (1999)]) 및 천식 ([Braun, et al., Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)])이 포함된다.
일관되게, 말초 조직에서의 상승된 수준의 NGF가 통각과민 및 염증과 연관되고, 많은 형태의 관절염에서 관찰되었다. 류머티스 관절염에 걸린 환자의 윤활막은 높은 수준의 NGF를 발현하는 반면, 염증이 없는 윤활막에서는 NGF가 검출가능하지 않은 것으로 보고되었다 ([Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355(1992)]). 유사한 결과가 류머티스 관절염이 실험적으로 유도된 래트에서 나타났다 ([Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)]). 상승된 수준의 NGF가 비만 세포 수의 증가와 함께 트랜스제닉(transgenic) 관절염 마우스에서 보고되었다 ([Aloe, el al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)]). PCT 공개 공보 WO 02/096458에는 특정 성질이 있는 항-NGF 항체의 다양한 NGF 관련 장애 예컨대 염증 상태 (예를 들어, 류머티스 관절염)의 치료에서의 용도가 개시되어 있다. 인간 종양 괴사 인자-α (TNF-α) 유전자를 지니는 관절염 트랜스제닉 마우스 내로 주사된 정제된 항-NGF 항체가 비만 세포의 수의 감소, 뿐만 아니라 관절염 마우스의 윤활막 내의 히스타민 및 물질 P 수준의 감소를 야기하였다는 것이 보고되었다 ([Aloe et al., Rheumatol. Int. 14:249-252 (1995)]). NGF 항체의 외인성 투여가 관절염 마우스에서 발생하는 증강된 수준의 TNF-α를 감소시키는 것으로 나타났다 ([Manni et al., Rheumatol. Int. 18:97-102 (1998)]).
또한, NGF의 증가된 발현 및 고친화력 NGF 수용체 (TrkA)가 인간 골관절염 연골세포에서 관찰되었다 ([Iannone et al., Rheumatology 41:1413-1418 (2002)]).
설치류 항-NGF 길항제 항체가 보고되었다. 예를 들어, [Hongo et al, Hybridoma (2000) 19(3):215-227]; [Ruberti et al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5):559-568] 참조. 그러나, 설치류 항체가 인간에서 치료용으로 사용되는 경우, 상당한 수의 치료된 개체에서 인간의 항-마우스 항체 응답이 발생한다. 또한, 마우스 항체의 이펙터 기능은 인간 환경에서 덜 효과적인 것으로 증명되었다. 따라서, 인간화 항-NGF 길항제 항체를 포함하는 항-NGF 길항제 항체가 중대하게 요구된다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 간행물, 및 특허 출원은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
발명의 개요
본원에 개시된 본 발명은 신경 성장 인자에 대한 항체에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 인간 및 설치류 신경 성장 인자 ("NGF")에 특이적으로 결합하는, 인간화되고 친화력 성숙된 항체 E3이다. E3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1A (서열 1) 및 1B (서열 2)에 각각 제시된다. 항체 E3의 CDR 부분 (코티아(Chothia) 및 캐벗(Kabat) CDR 포함)이 도 1A 및 1B에 도해된다. E3 중쇄 및 경쇄, 및 개별적인 확장된 CDR의 아미노산 서열이 또한 하기에 제시된다 (하기의 "항체 서열" 참조).
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3 (본원에서 상호교환적으로 "E3"로 명명됨)의 단편 또는 영역을 포함하는 항체이다. 한 실시양태에서, 단편은 도 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄이다. 또다른 실시양태에서, 단편은 도 1A에 제시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄이다. 또다른 실시양태에서, 단편은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역을 함유한다. 또다른 실시양태에서, 단편은 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 ATCC PTA-4894호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄를 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄를 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4894호 또는 ATCC PTA-4893호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄; 및 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄를 포함하는 항체이다 (본원에서의 편의를 위해, 기탁된 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드(들)은 기탁 번호 ATCC PTA-4894호, PTA-4893호 및 PTA-4895호를 갖는 것으로 지칭된다). 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4894호 또는 ATCC PTA-4893호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4894호 또는 ATCC PTA-4893호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄의 경쇄 가변 영역; 및 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4894호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄에 의해 코딩되는 1개 이상의 CDR(들)을 포함하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 경쇄 카파 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 불활성인, 예를 들어 보체 매개 용해를 촉발하지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 9809951.8에 기술된 바와 같이 변형된다. 또다른 실시양태에서, 항체는 A330P331에서 S330S331 (야생형 IgG2a 서열에 관한 아미노산 번호매김)로의 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다. [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624].
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 1개 이상의 하기의 것들을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나 또는 항체가 아닐 수 있음)를 제공한다: a) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 1개 이상의 CDR(들); b) 도 1A에 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 CDR H3; c) 도 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 CDR L3; d) 도 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR; e) 도 1A에 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 f) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR. 본 발명은 임의의 1개 이상의 하기의 것들을 포함하는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나 또는 항체가 아닐 수 있음)를 또한 제공한다: a) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3로부터 유래된 1개 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 CDR(들); b) 도 1A에 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 CDR H3로부터 유래된 CDR; 및/또는 c) 도 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 CDR L3로부터 유래된 CDR. 일부 실시양태에서, CDR은 캐벗 CDR, 코티아 CDR, 또는 캐벗 CDR과 코티아 CDR의 조합물 (본원에서 "확장된" 또는 "조합된" CDR로 명명됨)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 임의의 본원에 기술된 CDR 배열 (조합, 변이 등 포함)을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 I34가 S, L, V, A 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S로 치환된 서열 9를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 본원에서의 편의를 위해, 이러한 문맥에서의 또는 아미노산과 관련된 "치환되다" 또는 "이다"는 소정의 위치에 대한 아미노산(들)의 선택을 지칭한다. 명백한 바와 같이, 치환 또는 선택은 서열목록 또는 도면에 도해된 아미노산일 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고, A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고, A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9의 CDR1 영역; M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10의 CDR2 영역; 및 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 인간화 항체가 포함되는 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11의 CDR3 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 항체 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12의 CDR1 영역; I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13의 CDR2 영역; 및 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 항체 중쇄를 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9의 CDR1 영역; M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10의 CDR2 영역; 및 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12의 CDR1 영역; I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13의 CDR2 영역; 및 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11의 CDR3 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 경쇄를 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9에 제시된 아미노산 서열; M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10에 제시된 아미노산 서열; 및 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 인간화 항체가 포함되는 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 항체 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12에 제시된 아미노산 서열; I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13에 제시된 아미노산 서열; 및 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 항체 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9에 제시된 아미노산 서열; M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10에 제시된 아미노산 서열; 및 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11에 제시된 아미노산 서열; 및 (b) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12에 제시된 아미노산 서열; I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13에 제시된 아미노산 서열; 및 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 G98이 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D 또는 T이고; Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T 또는 G이며; Y110이 임의의 아미노산인 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9의 CDR1 영역; (b) M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10의 CDR2 영역; 및 (c) Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체가 NGF에 결합하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12의 CDR1 영역; (b) I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13의 CDR2 영역; 및 (c) K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체가 NGF에 결합하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) (i) I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열 9의 CDR1 영역; (ii) M50이 M, I, G, Q, S 또는 L이고; A62가 A 또는 S이며; L63이 L 또는 V인 서열 10의 CDR2 영역; 및 (iii) Y100이 Y, L 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A 또는 T이고; Y106이 Y, R, T 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이며; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A 또는 Y이고; H32가 H, N 또는 Q인 서열 12의 CDR1 영역; (ii) I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열 13의 CDR2 영역; 및 (iii) S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이며; Y96이 Y 또는 R인 서열 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체가 NGF에 결합하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
달리 언급되지 않는 한, 한 위치에서의 아미노산의 선택 (예를 들어, 치환)은 임의의 다른 위치에서의 아미노산의 선택과 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 임의의 본원에 기술된 CDR 배열 (조합, 변이 등 포함)을 포함한다.
본원의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본원에서 사용된 가변 영역 번호매김은 순차적인 번호매김이다. 당업자는 다수의 항체 번호매김 시스템 (예컨대 캐벗 및 코티아 번호매김)이 존재한다는 것, 및 순차적인 번호매김을 또다른 번호매김 시스템, 예컨대 캐벗 번호매김 또는 코티아 번호매김으로 변환시키는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 서열 46 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR3 서열)을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 및 8에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 28 및/또는 29; (b) 서열 30 및/또는 31; (c) 서열 32 및/또는 33; (d) 서열 34 및/또는 35; (e) 서열 36 및/또는 37; (f) 서열 38 및/또는 39; 및 (g) 서열 40 및 41로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR 영역, 예컨대 CDRH1 및/또는 CDR H2 영역)을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 28, 30, 32, 34, 36, 38, 및 40으로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR H1 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 29, 31, 33, 35, 37, 39 및 41로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR H2 영역)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 및 8에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 18 및/또는 19; (b) 서열 20 및/또는 21; 및 (c) 서열 22 및/또는 23으로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR 영역, 예컨대 CDRL1 및/또는 CDR L2 영역)을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 18, 20, 및 22로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR L1 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 19, 21, 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR L2 영역)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 8에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 51 및/또는 52; (b) 서열 55 및/또는 56; (c) 서열 57 및/또는 58; (c) 서열 59 및/또는 60; (d) 서열 61 및/또는 62; (e) 서열 63 및/또는 64로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR 영역, 예컨대 CDRL3 및/또는 CDR H3 영역)을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 51, 55, 57, 59, 61, 및 63으로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR L3 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 52, 56, 58, 60, 62, 및 64로부터 선택된 아미노산 서열 (예컨대 CDR H3 영역)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 18, 19, 30 및 31에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 및 8에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 서열 61, 63, 18, 19, 30 및 31에 제시된 1개 이상의 아미노산 서열 (예컨대 CDR 영역)을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 고친화력으로 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합하는 항-NGF 항체 (예컨대 길항제 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 고친화력은 (a) 약 2 nM 미만 (예컨대 약 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값)의 KD, 및/또는 약 6×10-5 s-1보다 느린 koff로 NGF에 결합하는 것; 및/또는 (b) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 15 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하는 것 (감소 및/또는 차단); 및/또는 (c) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 1.5 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하는 것 (감소 및/또는 차단); 및/또는 (d) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 래트 NGF-의존적 생존을 약 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 15 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하는 것 (감소 및/또는 차단); 및/또는 (e) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 래트 NGF-의존적 생존을 약 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 1.5 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하는 것 (감소 및/또는 차단); 및/또는 (f) 및/또는 trkA 수용체보다 높은 친화력으로 NGF에 결합하는 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 약 2 nM 미만 (예컨대 약 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값)의 KD, 및/또는 약 6×10-5 s-1보다 느린 koff로 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합하고/하거나; (b) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 15 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하고/하거나; (c) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 1.5 pM의 NGF의 존재 하에)으로 억제하고/하거나; trkA 수용체보다 높은 친화력으로 NGF에 결합하는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 약 2 nM 미만의 KD로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 15 pM NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 100 pM 이하의 IC50으로 억제하고/하거나; (c) 약 1.5 pM NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 10 pM 이하의 IC50으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 약 100 pM 미만의 KD로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 15 pM NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 20 pM 이하의 IC50으로 억제하고/하거나; (c) 약 1.5 pM NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 2 pM 이하의 IC50으로 억제한다.
본원의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 마우스 모노클로날(monoclonal) 항체 911의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 구현예는 본 발명에서 특히 배제된다. Mab 911의 확장된 CDR 서열이 도 1A 및 1B, 및 서열 9-14에 제시된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 추가로 폴리펩티드 (예컨대 항체)가 단리된, 임의의 상기 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 실질적으로 정제된다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 친화력 성숙된다. 또다른 실시양태에서, 항체는 길항제 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 인간 프레임워크(framework) 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 1개 이상의 비-인간 프레임워크 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 2 nM 이하의 KD로 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-인간 아미노산 서열 (예컨대 가변 영역 서열, 예컨대 CDR 서열, 예컨대 프레임워크 서열)에 비해 1개 이상 (예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상)의 인간 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 어버이 폴리펩티드 아미노산 서열 (예컨대 항체 911 아미노산 서열, 예컨대 임의의 1개 이상의 서열 9-14)에 비해 적어도 1개 이상, 적어도 2개, 또는 그 이상 예컨대 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체의 결합 친화력이 어버이 항체 (예컨대 Mab 911)의 친화력에 비해 변화된다 (일부 실시양태에서, 증가된다). 또다른 실시양태에서, 항체의 결합 친화력은 NGF (예컨대 인간 NGF)에 대한 trkA 수용체의 결합 친화력보다 낮다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 친화력 성숙된 항체이다.
본 발명은 임의의 상기 실시양태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (단리된 폴리뉴클레오티드 포함)를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3 (본원에서 상호교환적으로 "E3"로 명명됨)의 단편 또는 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 단편은 도 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄이다. 또다른 실시양태에서, 단편은 도 1A에 제시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄이다. 또다른 실시양태에서, 단편은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역을 함유한다. 또다른 실시양태에서, 단편은 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 도 2 및 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 1개 또는 양쪽 모두를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 ATCC PTA-4894호의 E3 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 E3 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 PTA-4894호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역 및 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 PTA-4894호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 1개 이상의 CDR; 및/또는 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드에 코딩되는 1개 이상의 CDR을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항체 (항체 단편 포함) 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (발현 및 클로닝 벡터 포함) 및 숙주 세포를 제공한다.
본원의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 마우스 모노클로날 항체 911의 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 실시양태가 본 발명에 특히 포함된다. Mab 911의 확장된 CDR 서열이 도 1A 및 1B, 및 서열 9-14에 제시된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 E3 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 E3 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, E3 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)은 기탁 번호가 ATCC PTA-4893호 및/또는 ATCC PTA-4894호이고, E3 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 기탁 번호가 ATCC PTA-4895호인 숙주 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 PTA-4894호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역 및/또는 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 PTA-4894의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 1개 이상의 CDR; 및/또는 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 1개 이상의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3에 결합된 NGF의 복합체이다. 또다른 양상에서, 복합체가 단리된다. 또다른 양상에서, 복합체가 실질적으로 정제된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항체 또는 폴리펩티드에 결합된 NGF의 복합체이다. 또다른 양상에서, 복합체가 단리된다. 또다른 양상에서, 복합체가 실질적으로 정제된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (항체 예컨대 항체 E3 포함) 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물, 예컨대 항체 E3 또는 항체 E3의 단편을 포함하는 항체, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제조하는 단계; 항체 E3가 생산되도록 하는 조건 하에 숙주 세포 또는 이의 자손을 배양하는 단계; 및 항체 E3를 정제하는 단계를 포함하는, 항체 E3의 생성 방법이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 도 2 및 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 중 1개 또는 양쪽 모두를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호가 ATCC PTA-4893호 및/또는 ATCC PTA-4894호인, E3 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 기탁 번호가 ATCC PTA-4895호인, E3 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항체 E3의 생성 방법이고; 이때 일반적으로 항체의 회수 및/또는 단리가 이어진다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 (단일 경쇄 또는 중쇄로 별도로 발현될 수 있거나, 또는 경쇄 및 중쇄 모두가 단일 벡터로부터 발현될 수 있음)를 적절한 세포에서 발현시키는 것에 의한 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (예컨대 항체)의 생성 방법을 제공하고, 이때 일반적으로 당해 항체 또는 폴리펩티드의 회수 및/또는 단리가 이어진다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 개시된 폴리펩티드 (항체 예컨대 항체 E3 포함)를 사용하여 NGF (예컨대 인간 NGF)의 생물학적 활성을 길항하는 방법이다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 인간 신경 성장 인자를 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (항체 E3 포함)와 접촉시키는 것을 포함하고, 이에 의해 NGF 활성 (예컨대 인간 신경 성장 인자 활성)이 길항, 감소, 차단 또는 억제된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (항체, 예컨대 항체 E3 포함)를 사용하여 NGF를 검출하는 방법이다. NGF와 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (예컨대 항체 E3) 간의 복합체를 검출함으로써 NGF의 존재가 검출된다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조군과 관련된 또는 대조군과의 관련되지 않은 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 E3 또는 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드 (항체 포함) 또는 폴리뉴클레오티드 실시양태를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여함으로써 통증을 치료하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 통증은 수술 후 통증이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 개체에게 투여함으로써 개체에서 류머티스 관절염 통증을 예방 또는 치료하는 방법이다. 항-NGF 길항제 항체가 류머티스 관절염과 관련된 통증을 억제 또는 차단할 수 있다는 것이 본 발명에 따라 나타났다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체의 투여 후 약 24시간 이내에 통증이 경감된다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체의 투여 후 약 4일 이내에 통증이 경감된다. 일부 실시양태에서, 개체에서 염증 상태 개선의 징후가 관찰되기 전에 또는 이러한 징후의 부재 하에 통증이 경감된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 류머티스 관절염 통증의 발병률을 감소시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증을 경감시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증을 억제하고/하거나, 류머티스 관절염 통증을 완화시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증의 발병, 발달 또는 진행을 지연시키는 방법이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 류머티스 관절염과 관련된 염증성 악액질 (체중 감소)을 치료하는 방법이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 신경 성장 인자의 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 개체에게 투여함으로써 개체에서 골관절염 통증을 예방 또는 치료하는 방법이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 골관절염 통증의 발병률을 감소시키고/시키거나, 골관절염 통증을 경감시키고/시키거나, 골관절염 통증을 억제하고/하거나, 골관절염 통증을 완화시키고/시키거나, 골관절염 통증의 발병, 발달 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항체 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 골관절염에 걸린 개체에서 신체 기능을 개선시키는 방법을 제공한다
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항체 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 골관절염에 걸린 개체에서 경직을 개선시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 골관절염 통증의 치료를 위해, 항-NGF 길항제 항체의 투여 빈도는 1주일에 1번 내지 10주에 1번, 또는 이보다 덜 빈번한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 1개 이상의 본원에 기술된 조성물을 포함하는 키트 및 조성물을 제공한다. 일반적으로 적절하게 포장되고 적합한 사용설명서가 함께 제공되는 이러한 키트는 임의의 본원에 기술된 방법에 유용하다. 또한 본 발명은 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 항체) 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 임의의 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 의약으로서의 용도 및/또는 의약의 제조를 위한 용도의 상황에서의 여부와 상관없이 임의의 본원에 기술된 용도를 위한 임의의 조성물 및 키트를 또한 제공한다.
도 1A는 E3 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 ("6" 및 "5 + 친화력 성숙 H3"로 표지됨)을 나타낸다. 코티아 CDR 및 캐벗 CDR이 각각 밑줄이 쳐진 텍스트 및 진한 이탤릭체 텍스트로 도해된다. 도 1A는 하기의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열들의 정렬을 또한 나타낸다; (2) VH4-59 인간 생식계열 수용체 서열 ("VH4-59" 또는 "2"로 표지됨) (서열 69); (3) 마우스 항체 911의 확장된 CDR이 그래프트된 수용체 서열 ("CDR 그래프트" 또는 "3"으로 표지됨) (서열 70); (4) V71K 치환을 포함하는, CDR 그래프트 수용체 서열 ("3 + 1개의 프레임워크 돌연변이" 또는 "4"로 표지됨) (서열 71); (5) 친화력 성숙된 CDR H1 및 H2를 함유하는 클론 ("5" 또는 "4 + 친화력 성숙 H1, H2"로 표지됨) (서열 72); 및 항체 E3 (상기 기술된 바와 같음).
도 1B는 E3 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 ("5" 또는 "4 + 친화력 성숙 L3"로 표지됨)을 나타낸다. 코티아 CDR 및 캐벗 CDR이 각각 밑줄이 쳐진 텍스트 및 진한 이탤릭체 텍스트로 도해된다. 도 1B는 하기의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열들의 정렬을 또한 나타낸다: (2) O8 인간 생식계열 수용체 서열 ("O8" 또는 "2"로 표지됨) (서열 73); (3) 마우스 항체 911의 확장된 CDR이 그래프트된 수용체 서열 ("CDR 그래프트" 또는 "3"으로 표지됨) (서열 74); (4) CDR 그래프트 수용체 서열 ("3 + 친화력 성숙 L1, L2" 또는 "4"로 표지됨) (서열 75); (5) 친화력 성숙된 CDR L1 및 L2를 함유하는 클론 ("5" 또는 "4 + 친화력 성숙 L3"로 표지됨); 및 항체 E3 (상기 기술된 바와 같음).
도 2는 항체 E3의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (서열 76)를 나타낸다.
도 3은 항체 E3의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (서열 77)를 나타낸다.
도 4는 다양한 농도의 인간 및 래트 NGF의 존재 하에서의 E13.5 뉴런의 NGF-의존적 생존을 도해하는 그래프이다. X축은 NGF 농도 (ng/㎖)에 상응하고, Y축은 카운팅(counting)된 뉴런에 상응한다.
도 5는 0.04 ng/㎖의 인간 NGF (대략 1.5 pM; 하부 패널에 제시됨) 또는 0.4 ng/㎖의 인간 NGF (대략 15 pM; 상부 패널에 제시됨)의 존재 하에서의 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 다양한 농도의 Fab E3; 마우스 911 Fab; 및 Fab H19-L129 및 Fab 8L2-6D5에서의 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 생존이 평가되었다. 각각의 NGF 농도에서 각각의 Fab에 대해 IC50 (pM 단위)이 계산되었고, 표 9에 제시된다. Fab E3는 15 pM 인간 NGF의 존재 하에 약 21 pM의 IC50, 및 1.5 pM 인간 NGF의 존재 하에 약 1.2 pM의 IC50으로 인간 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. Fab 3C 및 H19-L129 또한 인간 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. 양쪽 패널 모두에서, X축은 항체 농도 (nM)에 상응하고, Y축은 카운팅된 뉴런에 상응한다. 1.5 pM의 NGF는 대략 IC50이었고, 15 pM은 포화 농도의 NGF를 나타냈다.
도 6은 0.04 ng/㎖의 래트 NGF (대략 1.5 pM; 하부 패널에 제시됨) 또는 0.4 ng/㎖의 래트 NGF (대략 15 pM; 상부 패널에 제시됨)의 존재 하에서의 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 다양한 농도의 Fab E3; 마우스 911 Fab; 및 Fab H19-L129 및 Fab 8L2-6D5에서의 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 생존이 상기 기술된 바와 같이 평가되었다. 각각의 NGF 농도에서 각각의 Fab에 대해 IC50 (pM 단위)이 계산되었고, 표 9에 제시된다. Fab E3는 15 pM 래트 NGF의 존재 하에 약 31.6 pM의 IC50, 및 1.5 pM 래트 NGF의 존재 하에 약 1.3 pM의 IC50으로 래트 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. Fab 3C 및 H19-L129 또한 래트 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. 1.5 pM의 NGF는 대략 IC50이었고, 15 pM은 포화 농도의 NGF를 나타냈다. 양쪽 패널 모두에서, X축은 항체 농도 (nM)에 상응하고, Y축은 카운팅된 뉴런에 상응한다.
도 7은 수술 24시간 후에 평가된 휴식기 통증을 도해하는 그래프이고, 0.02 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.6 ㎎/㎏, 또는 1 ㎎/㎏의 항-NGF 항체 E3로의 치료가 통증을 감소시켰음을 나타낸다. "*"는 음성 대조군으로부터의 통계적으로 유의한 차이 (p<0.5)를 가리킨다.
도 8은 수술 24시간 후에 평가된 휴식기 통증을 도해하는 그래프이고, 0.5 ㎎/㎏의 항-NGF 항체 E3로의 치료가 수술 2시간 후에 주사되었을 때 휴식기 통증을 유의하게 (p<0.005) 감소시켰음을 나타낸다.
도 9는 인간 NGF에 대한 마우스 항체 911 (Fab)의 결합 친화력의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 마우스 항체 911은 3.7 nM의 KD, 8.4×10-5 s-1의 koff 및 2.2×104Ms-1의 kon으로 NGF에 결합하였다.
도 10은 인간 NGF에 대한 항체 E3 (Fab)의 결합 친화력의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. E3는 약 0.07 nM의 KD (및 약 6.0×104Ms-1의 kon 및 약 4.2×10-5 s-1의 koff)로 인간 NGF에 결합하였다.
도 11은 NGF와 trkA (흑색 원으로 제시됨) 및 NGF와 p75 (백색 사각형으로 제시됨) 간에 검출된 결합 백분율에 의해 평가되는 바와 같이, NGF와 이의 수용체인 trkA 및 p75의 상호작용을 항체 E3가 차단한다는 것을 도해하는 그래프이다. X축은 항체 3E (Fab)의 농도에 상응하고, Y축은 NGF 결합 (최대 RU의 백분율)에 상응한다. 감소된 신호 (RU 단위로 측정됨)로 제시되는 바와 같이, 증가된 농도의 Fab E3이 NGF와 p75 및 trkA 모두의 상호작용을 차단하였다. 항체 E3 (Fab) 농도가 NGF 농도와 동일할 때, NGF 결합이 관찰되지 않았다 (0의 신호로 제시됨).
도 12는 전장 항체 E3 및 Fab E3의 인간 NGF 차단 능력을 도해하는 그래프이다. 인간 NGF 및 다양한 농도의 Fab E3 및 항체 E3의 존재 하에서의 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 생존을 평가하였다. X축은 NGF 결합 부위 (nM)에 상응하고, Y축은 삼차 (TG) 뉴런의 표준화된 카운트에 상응한다. 전장 항체 및 Fab의 농도가 NGF 결합 부위의 수에 대해 표준화되었을 때 (Fab는 오직 1개의 결합 부위를 갖고, 전장 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다), 전장 항체 E3 및 Fab 3E는 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 유사한 수준으로 억제하는 것을 나타냈다.
도 13은 0.4 ng/㎖ 인간 NGF (포화 상태)의 존재 하에 E13.5 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 다양한 농도 (20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, 및 0.0 nM)의 항체 E3 (흑색 삼각형; "3E"로 지칭됨), 항체 911 (흑색 원), 및 trkA 수용체 면역부착소 (회색 사각형; "trkA-Fc로 지칭됨)의 능력을 도해하는 그래프이다. X축은 항체의 농도 (nM)에 상응하고, Y 축은 카운팅된 뉴런에 상응한다. 이러한 결과는 항체 E3가 마우스 모노클로날 항-NGF 항체 911 또는 trkA 면역부착소보다 양호하게 NGF를 유의하게 차단하였음을 나타냈다.
도 14는 항-NGF 길항제 항체 E3 (도면에서 "3E"로 명명됨) 또는 Fab 911이, 200 nM의 항체 농도에서도, NT3, NT4/5 및 MSP에 의해 촉진된 뉴런 생존을 억제하지 않았음을 도해하는 그래프이다. 데이타는 각각의 실험에 대한 양성 대조군에서 관찰된 생존 (포화 NGF 농도의 존재 하에 성장된 삼차 뉴런의 100％ 생존)과 관련된 48시간 배양 후 평균 생존％ (평균 ± 표준 오차, 각각의 데이타 포인트에 대해 n=3)를 나타낸다. 다양한 농도 (20 nM, 2 nM, 또는 0.2 nM)의 E3 Fab (도면에서 "3E"로 명명됨) 및 마우스 항체 911 Fab가 뉴로트로핀의 부재 ("대조군"으로 명명됨), 400 pM NGF ("NGF-400pM"으로 명명됨), 10 nM NT3 ("NT3-10nM"으로 명명됨) 또는 600 pM MSP ("MSP-600pM"으로 명명됨)의 존재 하에 사용되었다.
도 15는 항-NGF 길항제 항체 E3 (Fab 또는 전장 항체) (도면에서 "3E"로 명명됨) 또는 마우스 항체 911 (Fab 또는 전장 항체)이, 200 nM의 항체 농도에서도, NT3, NT4/5 및 MSP에 의해 촉진된 뉴런 생존을 억제하지 않았음을 도해하는 그래프이다. 다양한 농도 (200 nM 및 80 nM)의 E3 Fab 및 전장 항체 및 마우스 항체 911 전장 항체 및 Fab가 뉴로트로핀의 부재 ("인자 없음"으로 명명됨), 400 pM NGF ("NGF-400pM"으로 명명됨), 10 nM NT3 ("NT3-10nM"으로 명명됨) 또는 600 pM MSP ("MSP-600pM"으로 명명됨)의 존재 하에 사용되었다.
도 16은 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3가 BDNF, NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진된 E17 결절성 뉴런의 생존을 억제하지 않았음을 도해하는 그래프이다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911이 또한 테스트되었고, 유사한 결과가 관찰되었다. 다양한 농도 (200 nM 또는 80 nM)의 전장 항체 E3 (도면에서 "3E"로 명명됨), Fab E3, 전장 항체 911, 또는 Fab 911이 뉴로트로핀의 부재 ("인자 없음"으로 명명됨), 400 pM BDNF ("BDNF-400pM"으로 명명됨), 400 pM NT4/5 ("NT4/5- 400pM"으로 명명됨) 또는 2.5 nM LIF ("LIF-2.5nM"으로 명명됨)의 존재 하에 테스트되었다.
도 17은 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3가 BDNF, NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진된 E17 결절성 뉴런의 생존을 억제하지 않았음을 도해하는 그래프이다. 다양한 농도 (200 nM, 20 nM, 2nM)의 Fab E3 (도면에서 "3E"로 명명됨), 또는 Fab 911이 뉴로트로핀의 부재 ("대조군"으로 명명됨), 400 pM BDNF ("BDNF-400pM"으로 명명됨), 400 pM NT4/5 ("NT4/5-400pM"으로 명명됨) 또는 2.5 nM LIF ("LIF-2.5nM"으로 명명됨)의 존재 하에 테스트되었다.
도 18은 제14일 및 제19일에 항-NGF 항체 (E3 및 911)를 투여한 후의 관절염 래트 (류머티스 관절염 모델)에서의 통각 응답을 나타내는 그래프이다. E3 (1 ㎎/㎏, 제14일 및 제19일에 정맥내), 911 (10 ㎎/㎏, 제14일 및 제19일에 정맥내), 또는 인도메타신 (인도메타신 3 ㎎/㎏, 10일에 걸쳐 매일 경구 투여)을 관절염 마우스에 투여하였다. 발성 강도 값은 평균 ± s.e.m으로서 mV 단위로 표현된다.
도 19는 제14일 및 제19일에 항-NGF 항체를 투여한 후의 관절염 래트 (류머티스 관절염 모델)에서의 체중에 대한 항-NGF 항체의 효과를 나타내는 그래프이다. E3 (1 ㎎/㎏, 제14일 및 제19일에 정맥내), 911 (10 ㎎/㎏, 제14일 및 제19일에 정맥내), 또는 인도메타신 (인도메타신 3 ㎎/㎏, 10일에 걸쳐 매일 경구 투여)을 관절염 마우스에 투여하였다. 체중 값은 평균 ± s.e.m으로서 g 단위로 표현된다.
도 20은 제14일 및 제18일에 여러 용량의 항-NGF 항체 E3 (0.003 ㎎/㎏, 0.03 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏)를 투여한 후의 관절염 래트 (류머티스 관절염 모델)에서의 통각 응답을 나타내는 그래프이다. 발성 강도 값은 평균 ± s.e.m으로서 mV 단위로 표현된다.
도 21은 제14일 및 제18일에 여러 용량의 항-NGF 항체 E3 (0.03 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏)를 투여한 후의 관절염 래트 (류머티스 관절염 모델)에서의 제14일 체중의 백분율 (제14일에 대해 표준화됨)에 대한 항-NGF 항체의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 제14일 및 제18일에 여러 용량의 항-NGF 항체 E3 (0.03 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏)를 투여한 후의 관절염 래트 (류머티스 관절염 모델)에서의 체중 손실에 대한 항-NGF 항체의 효과를 나타내는 그래프이다. 체중 값은 제0일에 대해 표준화되었다.
도 23은 순차적 번호매김, 캐벗 번호매김 및 코티아 번호매김을 사용하여 번호가 매겨진, E3 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (도 23A) 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (도 23B)을 도해한다.
도 24는 제0일의 기준선과 비교하여 항-NGF 항체 E3의 투여 후 평균 일일 통증 강도에서의 변화를 도해한다. Y축은 제0일의 평균 일일 통증 강도와 비교된 평균 일일 통증 강도 (VAS 점수)에서의 감소에 상응한다. X축은 항-NGF 항체 E3의 투여 후 일수에 상응한다.
도 25는 항-NGF 항체 E3 투여 후의 평균 VAS 점수를 도해한다. "SE"는 표준 오차를 지칭한다.
도 26은 항-NGF 항체 E3의 투여 후 제2일부터 제14일까지, 및 제2일부터 제28일까지의 통증 강도 차이 합계 (SPID)에서의 최대 감소 백분율을 도해한다.
도 27은 여러 용량 (3 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏, 30 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏, 및 300 ㎍/㎏)의 항-NGF 항체 E3의 투여 후의 제1일부터 제28일까지의 WOMAC, 통증 서브스캐일, 신체 기능 서브스케일, 및 경직 서브스캐일에 대한 최소 제곱 평균 (LSM) 응답을 도해한다. "SE"는 표준 오차를 지칭한다. X축은 투여된 항-NGF 항체 E3의 용량에 상응한다. "*"는 던넷 테스트 하에 기준선과 비교했을 때 P < 0.05임을 가리킨다.
본원에 개시된 발명은 높은 친화력으로 NGF (예컨대 인간 NGF)에 결합하는 항-NGF 길항제 항체를 제공한다. 본 발명은 NGF에 결합하는 E3로부터 유래된 항체 및 폴리펩티드, 및 이러한 항체의 사용 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 신경 성장 인자 ("NGF")에 결합하는 인간화 항체 E3, 및 이러한 항체의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 NGF에 결합하는 E3 폴리펩티드 (항체 포함), 및 E3 항체 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에 개시된 발명은 치료적 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함으로써 개체에서 류머티스 관절염 통증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 또한 제공한다.
또한 본원에 개시된 발명은 치료적 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 투여함으로써 개체에서 골관절염 통증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 항체의 친화력을 조정하는 방법, 및 CDR 영역을 특성화하는 방법을 제공한다.
일반적인 기술
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이같은 기술은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
정의
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치한 1개 이상의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 이러한 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 임의의 클래스의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 이의 서브-클래스)를 포함하며, 항체는 임의의 특정한 클래스일 필요가 없다. 중쇄 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 칭해진다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 주지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 2사슬 Fv 종에서, 이러한 영역은 단단하게 비-공유결합으로 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 사슬 Fv 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2사슬 Fv 종에서와 유사한 이량체성 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결될 수 있다. 이러한 형상에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 특이성을 규정하도록 상호작용한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다 친화력이 낮기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서의 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다.
"모노클로날 항체"는 항원의 선택적 결합에 수반되는 아미노산 (천연 발생 및 비-천연 발생)으로 구성되는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 모노클로날 항체의 집단은 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 모노클로날 항체 및 전장 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 단편 (예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 필요한 특이성 및 항원에 결합하는 능력을 갖는 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체의 공급원 또는 항체가 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물 등)과 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미하고/하거나, 당업계에 공지되어 있거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조되었다. 인간 항체의 이러한 정의는 1개 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 1개 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 한 이같은 예는 마우스 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 ([Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381]; [Marks et al.,1991, J. Mol. Biol., 222:581]). 또한 인간 항체는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기술되어 있다. 별법적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이같은 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관 내에서 면역화될 수 있다). 예를 들어, [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)]; [Boerner et al., 1991, J Immunol., 147(1):86-95]; 및 미국 특허 5,750,373 참조.
"키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 한 부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 상동성인 반면, 사슬의 나머지 절편은 또다른 것에서의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 포유동물의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또다른 것으로부터 유도된 항체의 서열과 상동성이다. 이같은 키메라 형태에 대한 한가지 분명한 이점은, 예를 들어, 인간 세포 제제로부터 예를 들어 유래된 불변 영역과 함께 비-인간 숙주 유기생물로부터의 용이하게 입수가능한 하이브리도마 또는 B 세포를 이용하여 현재 공지된 공급원으로부터 가변 영역이 간편하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변 영역이 용이한 제조의 이점을 갖고, 특이성이 이의 공급원에 의해 영향받지 않으면서, 불변 영역이 인간인 것은 항체가 주사되었을 때 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 인간 대상에서 면역 응답을 덜 유발할 수 있을 것이다. 그러나, 정의는 이러한 특정 예에 한정되지 않는다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 이펙터 기능을 갖는다. 대표적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절 등을 포함한다. 이같은 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하고, 이같은 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 당업계 공지된 다양한 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"는 1개 이상의 아미노산 변형으로 인하여 천연 서열 Fc 영역의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 이펙터 기능이 유지된다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과 서열 동일성이 약 80％ 이상일 것이고, 더욱 바람직하게는 서열 동일성이 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 서열 동일성이 약 95％ 이상일 것이다.
본원에서 사용된 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (natural killer: NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 당해 분자의 ADCC 활성을 시험관 내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에서 기술된 것을 사용하여 평가할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다.
본원에서 사용된 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 세포질 도메인에 있어서 주로 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR는 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92]; [Capel et al., 1994, Immunomethods, 4: 25-34]; 및 [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에서 개관된다. "FcR"는 신생아 수용체 FcRn을 포함하는데, 이는 모계 IgG의 태아로의 전달을 담당한다 ([Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587]; 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어 항체)에 보체 시스템의 제1성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석법을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "E3", "3E", 및 "항체 E3"는 상호교환적으로 사용되어, 도 1A (서열 1) 및 1B (서열 2)에 각각 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 항체 E3의 CDR 부분 (코티아 및 캐벗 CDR 포함)이 도 1A 및 1B에서 도해된다. 도 2 및 3은 각각 도 1A 및 1B에서 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. E3의 생성 및 특성화는 실시예에 기술된다. NGF에 결합하고 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로(들)를 억제하는 능력; 및 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 능력이 포함되지만 이에 한정되지 않는 여러 생물학적 기능이 E3와 관련된다. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 1가지 이상의 이러한 특성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "E3"는 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 ATCC PTA-4894호의 E3 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 E3 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 면역글로불린을 지칭한다.
본원에서 사용된, 항체의 "면역특이적" 결합은 항체의 항원 결합 부위와 이같은 항체가 인식하는 특이적 항원 사이에서 발생하는 항원 특이적 결합 상호작용을 지칭한다 (즉, 항체가 ELISA 또는 기타 면역분석법에서 단백질과 반응하고, 관련되지 않은 단백질과는 검출가능하게 반응하지 않는다).
항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)하는 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 이같은 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다. 별법적인 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더욱 빈번하게, 더욱 급속하게, 더 큰 지속력으로, 및/또는 더 큰 친화력으로 반응하거나 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 일컬어진다. 항체는, 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 큰 지속력으로 결합하는 경우, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, 한 NGF 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 NGF 에피토프 또는 비-NGF 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 큰 지속력으로 이러한 에피토프에 결합하는 항체이다. 이러한 정의를 판독함으로써, 예를 들어, 제1표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)가 제2표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 또한 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미하지만, 반드시 그러한 것은 아니다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 임의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개입될 수 있다. 또한 이 용어는 천연적으로, 또는 개재, 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어, 1개 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 당업계에 공지된 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기재로 하기 때문에, 폴리펩티드가 단일 사슬 또는 회합 사슬로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분의 접합에 의해서, 추가로 변형될 수 있다. 또다른 유형의 변형은, 예를 들어, "캡(cap)", 1개 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 인터뉴클레오티드(internucleotide) 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 결합 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하를 띠는 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)이 있는 것, 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 당 내에 통상 존재하는 임의의 히드록실 기가 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 예를 들어 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합이 제조되도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 또는 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑 기 모어이티로 치환될 수 있다. 또다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소고리형 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체 예컨대 메틸 리보시드가 예를 들어 포함되는, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스의 유사한 형태를 또한 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 결합이 별법적인 결합 기로 대체될 수 있다. 이러한 별법적인 결합 기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") [식중 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 결합을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다]로 대체된 실시양태가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각은 초가변 영역으로 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각 사슬에서의 CDR은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. CDR을 결정하기 위한 2가지 이상의 기술이 존재한다: (1) 종-교차 서열 가변성을 기초로 하는 접근법 (즉, [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 하는 접근법 ([Chothia et al. (1989) Nature 342:877]; [Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)]). 본원에서 사용된 CDR은 상기 접근법 중 하나 또는 양쪽 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
항체의 "불변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "신경 성장 인자" 및 "NGF"는 NGF의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 신경 성장 인자 및 이의 변이체를 지칭한다. 본원에서 사용된 NGF는 인간, 개, 고양이, 말, 또는 소를 포함하는 모든 포유류 종의 천연 서열 NGF를 포함한다.
"NGF 수용체"는 NGF에 의해 결합되거나 활성화되는 폴리펩티드를 지칭한다. NGF 수용체는 인간, 개, 고양이, 말, 영장류, 또는 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 포유류 종의 TrkA 수용체 및 p75 수용체를 포함한다.
본원에서 사용된 "항-NGF 길항제 항체" (상호교환적으로 "항-NGF 항체"로 명명됨)는 NGF에 결합하여 NGF의 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로(들)를 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-NGF 길항제 항체는 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포성 응답의 도출과 같은, NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단하거나, 길항하거나, 억제하거나 감소시키는 (현저하게를 포함) 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "항-NGF 길항제 항체"는 이에 의해 NGF 자체, NGF 생물학적 활성 (임의 양상의 수술 후 통증을 매개하는 이의 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소, 또는 중화되는 모든 앞서 확인된 용어, 제목 및 기능적 상태 및 특성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합하고 NGF 이량체화 및/또는 NGF 수용체 (예컨대 p75 및/또는 trkA)에 대한 결합을 방지한다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 NGF에 결합하고 trkA 수용체 이량체화 및/또는 trkA 자가인산화를 방지한다. 항-NGF 길항제 항체의 예가 본원에서 제공된다.
NGF의 "생물학적 활성"은 NGF 수용체에 결합하고/결합하거나 NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 일반적으로 지칭한다. 비제한적으로, 생물학적 활성은 하기 능력 중 임의의 1가지 이상을 포함한다: NGF 수용체 (예컨대 p75 및/또는 trkA)에 결합하는 능력; trkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화를 촉진하는 능력; NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화시키는 능력; 뉴런 형태학의 변화, 시냅스 형성(synaptogenesis), 시냅스 기능, 손상 후 신경전달물질 및/또는 신경펩티드 방출 및 재생을 포함 (뉴런의 경우, 말초 및 중추 뉴런 포함)하는, 세포 분화, 증식, 생존, 성장, 및 세포 생리학에서의 기타 변화를 촉진하는 능력; 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 생존을 촉진하는 능력; 및 수술 후 통증을 포함하는 통증을 매개하는 능력.
본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 50％ 이상 순수한 (즉, 오염물이 없는), 더욱 바람직하게는 90％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 95％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 98％ 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 99％ 이상 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수용체일 수 있거나 수용체인 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우연적, 또는 고의적 돌연변이로 인하여 원래의 어버이 세포와 반드시 완전하게 동일할 필요는 없다 (형태학적으로 또는 게놈 DNA 상보성 면에서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 "치료"는 유리하거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 원하는 임상 결과는 하기의 것들 중 1가지 이상을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다; 급성, 만성, 염증성, 신경병증성, 수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증, 또는 골관절염 통증을 포함하는 임의 양상의 통증의 개선 또는 경감. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 원하는 임상적 결과는 하기의 것들 중 1가지 이상을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: 중증도의 감소를 포함하여, 임의 양상의 통증을 포함하는 통증과 관련된 1가지 이상의 증상의 경감 (예컨대 통증 기간의 단축, 통증 감도 또는 감각의 감소).
약물, 화합물, 또는 제약 조성물의 "유효량"은 통증 감각의 경감 또는 감소와 같은 임상 결과를 포함하는 유리하거나 원하는 결과를 일으키는데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 제약 조성물의 유효량은 수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증, 및/또는 골관절염 통증을 포함하는 통증을 치료하고/하거나, 이를 경감시키고/시키거나, 이의 강도를 감소시키고/시키거나, 이를 예방하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, "유효량"은 휴식 시의 통증 (휴식기 통증) 또는 기계적으로 유도된 통증 (운동 후의 통증 포함), 또는 양쪽 모두를 감소시킬 수 있고, 절개, 절단, 인열 또는 손상 전, 중 또는 후에, 및/또는 고통스러운 자극 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 임상 환경에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 제약 조성물의 유효량은 또다른 약물, 화합물, 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 1가지 이상의 치료제를 투여하는 환경에서 "유효량"이 고려될 수 있고, 1가지 이상의 다른 작용제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면, 단일 작용제가 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
통증의 "발병률을 감소시키는 것"은 중증도를 감소시키는 것 (마취제가 예를 들어 포함되는, 이러한 상태에 일반적으로 사용되는 또다른 약물 및/또는 치료법에 대한 필요성 및/또는 양 (예를 들어, 이에 대한 노출)을 감소시키는 것을 포함할 수 있음), 기간을 감소시키는 것 및/또는 빈도를 감소시키는 것 (예를 들어, 개체에서 수술 후 통증을 지연시키거나 이에 대한 시간을 증가시키는 것을 포함) 중 임의의 것을 의미한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 이의 응답의 관점에서 다양할 수 있고, 따라서, 예를 들어, "개체에서 류머티스 관절염 통증 또는 골관절염 통증의 발병률을 감소시키는 방법"은 항-NGF 길항제 항체의 투여가 이러한 특정 개체에서의 발병률의 감소를 야기할 수 있다는 합리적인 예상을 기초로 항-NGF 길항제 항체를 투여하는 것을 반영한다.
통증 또는 통증의 1가지 이상의 증상 (예컨대 류머티스 관절염 또는 골관절염 통증)을 "경감시키는 것"은 항-NGF 길항제 항체를 투여하지 않는 것과 비교하여 통증의 1가지 이상의 증상의 감소 또는 개선을 의미한다. "경감"은 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 또한 포함한다.
통증 또는 통증의 1가지 이상의 증상 (예컨대 류머티스 관절염 또는 골관절염 통증)을 "완화시키는 것"은 본 발명에 따른 항-NGF 길항제 항체로 치료된 개체 또는 개체 집단에서 수술 후 통증의 1가지 이상의 바람직하지 않은 임상 징후의 정도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, 통증의 발달을 "지연시키는 것"은 통증, 예컨대 수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증, 또는 골관절염 통증의 진행을 미루고/미루거나, 지체시키고/시키거나, 느리게 하고/하거나, 저지하고/하거나, 안정화시키고/시키거나, 지연시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료될 개체에 따라서, 시간의 길이가 달라질 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은, 개체에서 통증이 발달되지 않는다는 점에서, 사실상 방지를 포함할 수 있다. 증상의 발달을 "지연시키는" 방법은, 이러한 방법을 이용하지 않는 것과 비교할 때, 소정의 시간 프레임 내에 증상이 발달할 가능성을 감소시키고/시키거나 소정의 시간 프레임 내에 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 전형적으로 이같은 비교는 통계적으로 유의한 수의 대상을 사용하는, 임상 연구를 기초로 한다.
본원에서 사용된 "통증"은 급성 및 만성 통증, 및 염증 성분이 있는 임의의통증을 포함하는 임의의 병인의 통증을 지칭한다. 통증의 예로는 수술 후 통증, 시술 후 통증 (치과 통증 포함), 편두통, 두통 및 삼차신경통, 화상, 상처 또는 신장 결석과 관련된 통증, 외상 (외상성 두부 손상 포함)과 관련된 통증, 신경병증 통증, 근골격 장애 예컨대 류머티스 관절염, 골관절염, 강직 척추염, 혈청-음성 (비-류머티스) 관절병증, 비-관절 류머티즘 및 관절주위 질환과 관련된 통증, 및 암 ("돌발성 통증" 및 말기 암과 관련된 통증 포함), 말초 신경병증 및 대상포진 후 신경통과 관련된 통증이 포함된다. 염증 성분이 있는 통증의 예로는 (상기 기술된 것들 중 일부에 더하여) 류머티즘 통증, 점막염과 관련된 통증, 및 월경통이 포함된다.
"수술 후 통증" (상호교환적으로 "절개 후" 또는 "외상 후"으로 명명됨)은 개체의 조직 내로의 절단, 천공, 절개, 인열, 또는 상처와 같은 외부의 외상으로부터 생기거나 초래되는 통증을 지칭한다 (침해성 또는 비-침해성 여부와 상관 없이, 모든 수술 과정으로부터 발생하는 것을 포함). 본원에서 사용된 수술 후 통증은 외부적인 물리적 외상 없이 발생하는 (생기거나 유래되는) 통증을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 수술 후 통증은 내부 또는 외부 (주변 포함) 통증이고, 상처, 절단, 외상, 인열 또는 절개는 우연히 발생하거나 (외상성 상처), 또는 고의적으로 발생할 수 있다 (수술적 절개). 본원에서 사용된 "통증"은 통각 및 통증의 감각을 포함하며, 통증 점수 및 당업계에 주지된 기타 방법을 이용하여 통증을 객관적 및 주관적으로 평가할 수 있다. 본원에서 사용된 수술 후 통증은 무해자극 통증 (즉, 정상적으로 유해하지 않은 자극에 대한 증가된 응답) 및 통각과민 (즉, 정상적으로 유해하거나 불쾌한 자극에 대하여 증가된 응답)을 포함하고, 이어서 이것은 천연에서 열적 또는 물리적 (촉감)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 통증은 열적 민감성, 물리적 민감성 및/또는 휴식기 통증으로 특성화된다. 일부 실시양태에서 수술 후 통증은 기계적으로 유도된 통증 또는 휴식기 통증을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 수술 후 통증은 휴식기 통증을 포함한다. 통증은, 당업계에 주지된 바와 같이, 1차 또는 2차 통증일 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고, 진단용 또는 모니터링 분석법에서 사용될 수 있다. 상기 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액체 샘플, 고체 조직 샘플 예컨대 생검 표본 또는 이로부터 유래된 조직 배양물 또는 세포, 및 이의 자손을 포함한다. 상기 정의는 획득 후 임의의 방식으로, 예컨대 시약으로의 처리, 가용화, 또는 특성 성분, 예컨대 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 강화, 또는 구획화 목적으로 반-고체 또는 고체 매트릭스 내에 매입시키는 것에 의해 조작된 샘플을 또한 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 배양 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생체액, 및 조직 샘플을 또한 포함한다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물에는 농장 동물 (예컨대 소), 운동용 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 당해 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 응축제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵생물세포, 예컨대 프로듀서(producer) 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 구성 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.
본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합될 때 상기 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 하고, 대상의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 임의의 표준 제약 담체 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀션 예컨대 유/수 에멀션, 및 각종 유형의 습윤화제가 포함된다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 또는 생리식염수 (0.9％)이다. 이같은 담체를 포함하는 조성물은 주지된 통상적인 방법에 의해 제형된다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).
본원에서 사용된 용어 "Koff"는 항원/항체 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프(off) 속도 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "Kd"는 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하도록 의도된다.
항체 E3, E3-유래 항체, 조성물, 및 사용 방법
E3 조성물, E3 유래 조성물, 및 조성물의 제조 방법
본 발명은 E3 항체 또는 폴리펩티드; 및 E3 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 포함한다. 본원에서 사용된 조성물은 NGF에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드 (항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음), 및/또는 NGF에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 1가지 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물들은 적절한 부형제, 예컨대 완충제를 포함하는 제약상 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 단리된 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 또한 포함한다. 본 발명은 실질적으로 순수한 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 또한 포함한다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 임의 (1가지 이상)의 하기 특성들에 의해 특성화된다: (a) NGF에 결합하는 능력; (b) NGF 신호전달에 의해 매개되는 NGF 생물학적 활성 및/또는 하류 경로(들)을 감소시키고/시키거나 억제하는 능력; (c) 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 감소시키고/시키거나 억제하는 능력; (d) NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF에 대한 임의의 현저한 교차-반응성의 부재; (e) 통증 (수술 후 통증 포함)을 치료 및/또는 예방하는 능력; (f) NGF의 소거를 증가시키는 능력; (g) 키나제 수용체 활성화 분석법 (KIRA) (미국 특허 6,027,927 참조)을 예를 들어 이용하여 검출되는 바와 같은, trkA 수용체의 활성화를 감소시키거나 억제하는 능력.
어버이 마우스 항-NF 모노클로날 항체 911과 비교하여, 높은 친화력 및 느린 해리 동력학으로 인간 NGF에 결합하는 항체 E3의 결합 성질이 하기에 요약된다. E3는 어버이 마우스 항체 911보다 약 50배 더 높은 결합 친화력으로 인간 NGF에 결합한다.
Figure 112010083030010-pat00001
E3 항체 및 관련 항체는, 시험관내 분석법 (실시예 2 및 3 참조)에 의해 평가되는 바와 같이, 인간 NGF를 길항하는 강한 능력을 또한 나타낸다. 예를 들어, 항체 E3는 15 pM의 인간 NGF의 존재 하에 약 21 pM, 1.5 pM의 인간 NGF의 존재하에 약 1.2 pM의 IC50으로 마우스 E13 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 길항한다.
따라서, 또다른 양상에서, 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 하기의 능력에 의해 추가로 확인 및 특성화된다: (h) 낮은 해리 동력학과 함께 인간 NGF에 대한 고친화력 결합 (일부 실시양태에서, 약 2 nM 미만의 KD, 및/또는 약 6×10-5s-1 미만의 koff) 및/또는 (i) 약 15 pM의 NGF (일부 실시양태에서, 인간 NGF)에서 약 100 pM 이하의 IC50 및/또는 약 1.5 pM의 NGF에서 약 20 pM 이하의 IC50으로 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제(차단)하는 능력.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 NGF에 결합하고, 또다른 척추동물 종 (일부 실시양태에서, 포유류)으로부터의 NGF에 현저하게 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NGF, 뿐만 아니라 또다른 척추동물 종 (일부 실시양태에서, 포유류)으로부터의 1가지 이상의 NGF에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 NGF에 결합하고, 또다른 뉴로트로핀 (예컨대 관련 뉴로트로핀, NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF)과 현저하게 교차-반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 NGF, 뿐만 아니라 1가지 이상의 또다른 뉴로트로핀에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 말 또는 개와 같은 포유류 종의 NGF에 결합하지만, 또다른 포유동물 종으로부터의 NGF에 현저하게 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 ATCC PTA-4894호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄를 포함하는 항체이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 숙주 세포에 의해 생산되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄를 포함하는 항체이다. 본 발명은 또한 E3 및 등가의 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 단일 사슬 (ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 필요한 특이성의 항원 (NGF) 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 E3의 다양한 제형을 포함한다. E3의 항체 및 폴리펩티드 단편 (항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)이 포함되는 E3의 등가 항체, 및 E3의 폴리펩티드 단편을 포함하는 폴리펩티드가 임의 (1가지 이상)의 상기 기술된 기준에 의해 확인 및 특성화된다.
따라서, 본 발명은 하기의 것들 중 임의의 것, 또는 하기의 것들 중 임의의 것을 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다: (a) 항체 E3; (b) 항체 E3의 단편 또는 영역; (c) 도 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄; (c) 도 1A에 제시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄; (d) 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역(들); (e) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 1개 이상의 CDR (1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (f) 도 1A에 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 CDR H3; (g) 도 1B에서 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 CDR L3; (h) 도 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (i) 도 1A에서 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 (k) (b) 내지 (j) 중 임의의 하나를 포함하는 항체. 본원에서의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 마우스 모노클로날 항체 911의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 실시양태는 본 발명에서 명확하게 배제된다. Mab 911의 확장된 CDR 서열이 도 1A 및 1B, 및 서열 9-14에 제시된다.
항체 E3의 CDR 부분 (코티아 및 캐벗 CDR 포함)이 도 1A 및 1B에서 도해되고, 하기의 아미노산 서열로 구성된다: (a) 중쇄 CDR 1 ("CDR H1") GFSLIGYDLN (서열 3); (b) 중쇄 CDR 2 ("CDR H2") IIWGDGTTDYNSAVKS (서열 4); (c) 중쇄 CDR 3 ("CDR H3") GGYWYATSYYFDY (서열 5); (d) 경쇄 CDR 1 ("CDR L1") RASQSISNNLN (서열 6); (e) 경쇄 CDR 2 ("CDR L2") YTSRFHS (서열 7); 및 (f) 경쇄 CDR 3 ("CDR L3") QQEHTLPYT (서열 8). CDR 영역의 결정은 당업계의 기술에 속한다. 일부 실시양태에서, CDR은 캐벗 및 코티아 CDR의 조합물 ("조합된 CDR" 또는 "확장된 CDR"로 또한 명명됨)일 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 캐벗 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 E3의 1개 이상의 CDR, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 CDR과 실질적으로 상동성인 (또는, 일부 실시양태에서 E3의 모든 6개의 CDR과 상동성이거나, 또는 E3로부터 유래된) 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에는 E3의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR과 실질적으로 상동성이거나 E3로부터 유래된 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 갖는 항체가 포함된다. 본 발명의 목적을 위해, 결합 특이성 및/또는 전반적인 활성 (통증을 치료 및/또는 예방하는 것, 또는 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 것에 관한 것일 수 있음)은, 비록 활성의 정도가 E3에 비교하여 변할 수 있지만 (더 크거나 더 작을 수 있음), 일반적으로 유지되는 것으로 이해된다.
본 발명은 E3의 서열의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산 서열 중 임의의 것을 갖는 E3의 아미노산 서열 (도 1A 및 1B에 제시됨)을 포함하고, 이때 3개 이상의 아미노산은 E3의 가변 영역으로부터의 것인 폴리펩티드 (항체일 수 있거나 또는 항체가 아닐 수 있음)를 또한 제공하고, 단 마우스 모노클로날 항체 911의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 구성된 실시양태는 명확하게 배제된다. Mab 911의 확장된 CDR 서열이 도 1A 및 1B, 및 서열 9-14에서 제시된다. 한 실시양태에서, 가변 영역은 E3의 경쇄로부터의 것이다. 또다른 실시양태에서, 가변 영역은 E3의 중쇄로부터의 것이다. 또다른 실시양태에서, 5개 (또는 그 이상)의 인접 아미노산은 도 1A 및 1B에 제시된 E3의 상보성 결정 부위 (CDR)로부터의 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 E3의 서열의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산 서열 중 임의의 것을 갖는 E3의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 E3 서열은 CDRH1의 L29, CDRH2의 I50, CDRH3의 W101 및/또는 CDRH3의 A103 아미노산 잔기; 및/또는 CDRL1의 S28, CDRL1의 N32, CDRL2의 T51, CDRL3의 91E 및/또는 CDRL3의 H92 아미노산 잔기 중 임의의 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 단 마우스 모노클로날 항체 911의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 구성된 실시양태는 명확하게 배제된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 명백한 바와 같이, 순차적 아미노산 번호매김 계획이 가변 영역 내의 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용된다 (즉, 각각의 가변 영역 내의 아미노산 서열이 순차적으로 번호매김된다). 당업계에 주지된 바와 같이, 2개의 항체 또는 폴리펩티드, 예컨대 E3 항체와 E3 변이체 (또는 E3 변이체일 것으로 추정되는 폴리펩티드)를 비교하는 경우에 캐벗 및/또는 코티아 번호매김 시스템이 유용하다. 예를 들어, E3와 또다른 폴리펩티드를 비교하는데 사용하기 위하여, 원하는 경우, 순차적 번호매김을 코티아 및/또는 캐벗 번호매김으로 전환하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 도 23은 순차적, 코티아 및 캐벗 번호매김을 이용하여 번호매김된 E3 가변 영역을 도해한다. 또한, 비교를 용이하게 하게 위해, 프레임워크 잔기는 일반적으로 (그러나 항상은 아님) 대략 동일한 수의 잔기를 갖는 것으로 일반적으로 이해된다. 그러나, CDR은 크기가 다양할 수 있다 (즉, 1개 이상의 아미노산 잔기의 삽입 및/또는 결실이 있을 수 있다). E3 항체와 후보물 E3 변이체를 비교할 때 (예를 들어, 항체 E3의 서열 (이에 대해 정렬됨)에서 더 긴 후보물 서열로부터의 CDR 영역의 경우), 하기의 단계를 따를 수 있다 (또다른 방법이 당업계에 공지되어 있음). 후보물 항체 서열이 E3 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 정렬된다. 정렬은 수동으로, 또는 통상적으로 허용되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다. 대부분의 Fab 서열에 공통인 일부 아미노산 잔기를 이용함으로써 정렬이 용이해질 수 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄는 각각 전형적으로 2개의 시스테인을 갖고, 이는 종종 보존된 위치에서 발견된다. 후보물 변이체 항체의 아미노산 서열이 더 길거나 (즉, 아미노산 잔기가 삽입됨), 또는 더 짧을 (즉, 아미노산 잔기가 결실됨) 수 있는 것으로 이해된다. 추가적 잔기의 삽입을 나타내기 위해, 예를 들어, 잔기 34 abc와 같이, 잔기 번호에 첨자가 부가될 수 있다. 예를 들어, 잔기 33 및 35에 대해 E3 서열과 정렬되지만, 잔기 35와 정렬될 잔기가 없는 후보물 서열에 대해서, 잔기 35는 간단하게 잔기에 할당되지 않는다. 또다른 접근법에서, 길이가 상이한 CDR들을 비교할 때 구조적으로 등가 (예를 들어, 항원-항체 복합체에서 동일한 위치)인 아미노산 사이에서 비교가 이루어질 수 있는 것으로 일반적으로 주지되어 있다. 예를 들어, 코티아 번호매김 ([Al-Lazikani et al, 상기 문헌])은, 일반적으로 (그러나 모든 경우에 그러하지는 않음), 구조적으로 정확한 위치에 삽입 및 결실을 놓는다. 구조적 등가물은 또한 X선 결정학 또는 이중 돌연변이 사이클 분석법을 이용하여 추론 또는 실증될 수 있다 ([Pons et al. (1999) Prot. Sci. 8:958-968] 참조).
NGF (예컨대 hNGF)에 대한 항-NGF 항체의 결합 친화력은 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75 nM 및 약 0.18 내지 약 0.72 nM이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 초과이다. 한 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 pM 내지 22 pM이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1 nM 미만 또는 약 0.07 nM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 4 nnM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM 중 임의의 것 내지 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 또는 약 40 pM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2nM, 약 1.5 nM, 약 1nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM 중 임의의 것이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 초과이다.
NGF에 대한 항체의 결합 친화력은 당업계에 주지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. NGF에 대한 항체의 결합 친화력을 결정하는 한 방법은, 실시예에 기술된 바와 같이, 항체의 단일관능성 Fab 단편의 친화력을 측정하는 것에 의한 것이다. 단일관능성 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체 (예를 들어, IgG)가 파파인으로 절단될 수 있거나 또는 재조합에 의해 발현될 수 있다. 항체의 항-NGF Fab 단편의 친화력을, 실시예에 기술된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 (BIAcore3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 (BIAcore, INC, Piscaway NJ))에 의해 결정할 수 있다. 이러한 프로토콜은 인간 NGF, 또다른 척추동물 (일부 실시양태에서, 포유류)의 NGF (예컨대 마우스 NGF, 래트 NGF, 영장류 NGF)가 포함되는 임의 종의 NGF에 대한 항체의 결합 친화력을 결정하는데 사용하기에, 뿐만 아니라 또다른 뉴로트로핀, 예컨대 관련 뉴로트로핀 NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 함께 사용하기에 적절하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩티드는 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 15 pM의 NGF의 존재하에)으로 억제할 수 있다 (감소 및/또는 차단). 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩티드는 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 1.5 pM의 NGF의 존재하에) 억제할 수 있다 (감소 및/또는 차단). 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩티드는 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 래트 NGF-의존적 생존을 약 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 또는 그 이하 중 임의 값의 IC50 (약 15 pM의 NGF의 존재하에)으로 억제할 수 있다 (감소 및/또는 차단). 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩티드는 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 래트 NGF-의존적 생존을 약 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 그 이하 중 임의의 값의 IC50 (약 1.5 pM의 NGF의 존재하에)으로 억제할 수 있다 (감소 및/또는 차단). 마우스 E13 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 실시예 2에 기술된다.
본 발명은 임의의 이러한 항체 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있고, 이들 중 일부는 실시예에서 설명된다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해성 또는 기타 분해에 의해, 상기 설명된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 아미노산 약 50개 이하의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 간편하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 시판된다. 예를 들어, 고체상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 E3 항체가 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415 참조. 가교제가 수반되는 방법을 포함하여, 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 키메라 또는 하이브리드 항체가 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써, 면역독소가 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 포함된다.
또다른 별법에서, 당업계에 주지된 절차를 이용하여 항체가 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 E3의 가변 영역 및 경쇄 영역 (도 1A 및 1B에 제시됨)을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서의 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝된다. 또다른 실시양태에서, 도 2 및 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 또는 증식을 위해 1개 이상의 벡터 내로 클로닝된다. 당해 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 그 후 숙주 세포가 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에서 추가로 설명된다. 식물이나 유액(milk)에서 재조합적으로 항체를 발현시키는 방법이 개시되었다. 예를 들어, [Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756]; [Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol 13:65]; 및 [Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231:147] 참조. 항체의 유도체, 예를 들어, 인간화 항체, 단일 사슬 항체 등의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 본 발명의 항체, 예컨대 E3의 단일 사슬 가변 영역 단편 ("scFv")을 또한 포함한다. 단일 사슬 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시킴으로써 제조된다. [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]. 연결 펩티드의 예는 (GGGGS)3 (서열 15)이고, 이는 한 가변 영역의 카르복시 말단과 또다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm를 가교시킨다. 또다른 서열의 링커가 고안되어 사용되었다 ([Bird et al. (1988)]). 이어서 링커가 추가적인 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 사슬 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵생물 또는 대장균과 원핵생물인 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 당해 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 통상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv를 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 단리할 수 있다.
또다른 형태의 단일 사슬 항체, 예컨대 디아바디(diabody)가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인이 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 생성된, 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체인 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하였고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 ([Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539]).
이중특이적 항체를 제조하기 위한 한 접근법에 따라서, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 1개 이상의 융합물 내에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 원한다면, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들이 별도의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 생물 내로 공동 형질감염된다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 경우에 실시양태들에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 더욱 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우 또는 비율이 특별한 의미를 갖지 않는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
한 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 있는 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다. 이러한 접근법은 PCT 공개 공보 WO 94/04690 (1994년 3월 3일 공개)에서 기술되어 있다.
2개의 공유결합으로 연결된 항체를 포함하는 이종접합체 항체 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 원치 않는 세포에 면역계를 표적화시키기 위해 (미국 특허 4.676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해서 (PCT 출원 공개 공보 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089), 이같은 항체가 사용되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적절한 가교제 및 기술은 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 4,676,980에 기술되어 있다.
항체는, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은, 그리고 본원에 기술된 바와 같은 인간화 항체일 수 있다.
항체는 PCT 공개 공보 WO 99/58572 (1999년 11월 18일 공개)에 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 이러한 항체는, 표적 분자에 지시된 결합 도메인에 더하여, 인간 면역글로불린 중쇄의 모든 또는 일부 불변 도메인과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 현저한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 이펙터 도메인이 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 반응 및 기타 부작용을 피하기 위하여, 장기간의 항체 요법에서 사용하는데 특히 적절하다.
본 발명은 성질에 현저하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 등가인 항체 및 활성이 증강 또는 감소된 변이체를 포함하여, 항체 E3에 대한 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 당업계의 일상적인 실행이고, 실시예에서 추가로 예시된다. 변형된 폴리펩티드의 예로는 아미노산 잔기가 치환 (보존적 치환 포함)되거나, 기능적 활성을 현저하게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산이 1개 이상 결실 또는 첨가되거나, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용된 폴리펩티드 "변이체"는 폴리펩티드의 면역반응성이 실질적으로 감소되지 않도록 하는 1개 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이라는 점에서 천연 단백질과 상이한 폴리펩티드이다. 즉, 항원에 특이적으로 결합하는 변이체의 능력은 천연 단백질에 비하여 증강 또는 불변될 수 있거나, 또는 천연 단백질에 비하여 50％ 미만, 바람직하게는 20％ 미만으로 감소될 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 확인된 폴리펩티드에 대하여 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 동일성 (본원에 기술된 바와 같이 결정됨)을 나타낸다.
항체 DNA 내로 적합한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 항체의 아미노산 서열 변이체가 제조될 수 있다. 이같은 변이체는, 예를 들어, 본원에 기술된 서열 1 또는 2의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 이러한 잔기 내로의 삽입 및/또는 이러한 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어지고, 단 최종 구축물은 원하는 특성을 지닌다. 또한 아미노산 변화는 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 항체의 번역후 프로세스를 변경시킬 수 있다.
돌연변이유발 또는 변형에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 칭해지고, [Cunningham and Wells, 1989, Science, 244:1081-1085]에 기술된다. 표적 잔기의 잔기 또는 기를 확인하고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음전하로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시켜서, 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 그 후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 또다른 변이체를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되는 동안, 돌연변이 자체의 성질이 예정될 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 변이체가 원하는 활성에 대하여 스크리닝된다. 본원에 기술된 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발이 돌연변이유발 또는 변형에 적절한 항체 내의 위치를 확인하는데 또한 사용될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔지의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입물의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 택에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 또다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합되는 것을 포함한다.
치환 변이체에서는 항체 분자 내 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 상이한 잔기가 이 위치에 삽입된다. 치환적 돌연변이유발에 대하여 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 구현된다. 보존적 치환이 "보존적 치환"의 제목 하에 표 1에 제시된다. 이같은 치환으로 생물학적 활성에서의 변화가 초래되면, 표 1에서 "대표적인 치환"이라 명명된, 또는 아미노산 클래스에 관하여 하기에 추가로 기술된 바와 같은, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 치환
원래의 잔기 보존적 치환 대표적인 치환
Ala (A) Val Val; Leu; Ile
Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn
Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu; Asn
Cys (C) Ser Ser; Ala
Gln (Q) Asn Asn; Glu
Glu (E) Asp Asp; Gln
Gly (G) Ala Ala
His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신
Leu (L) Ile 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr; Phe
Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신
항체의 생물학적 성질에서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류된다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 클래스 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환시킴으로써 이루어진다.
항체의 적절한 형상을 유지하는데 수반되지 않은 임의의 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로, 또한 치환되어 분자의 산화적 안정성이 개선되고 비정상적인 가교가 방지될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
아미노산 변형은 1개 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서 가변 영역과 같은 영역을 완전히 다시 디자인하는 것까지의 범위일 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화력 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR3 도메인에서 이루어진다. 또다른 실시양태에서, CDR 도메인은 CDRH3 및/또는 CDRL3이다.
변형은 또한 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드, 뿐만 아니라 또다른 후번역 변형, 예컨대 여러가지 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화가 있는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 ([Jefferis and Lund, 1997, Chem, Immunol. 65:111-128]; [Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능 ([Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem, 29:4175-4180]), 및 당단백질의 일부분 간의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 형상 및 제시된 3-차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 ([Hefferis and Lund, 상기 문헌]; [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]). 또한 올리고당은 특정한 인식 구조를 기초로 하여 소정의 당단백질을 특정 분자에 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 또한 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 발현이 테트라사이클린-조절된 CHO 세포는 ADCC 활성이 개선된 것으로 보고되었다 ([Umana et al., 1999, Mature Biotech, 17:176-180]).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변형은 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 기초를 이루는 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수도 있다. 글리코실화는 항체의 발현에 사용된 숙주 세포에 주로 의존적이다. 잠재적인 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용된 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변형을 예상할 수 있다 (예를 들어, [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).
숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자에는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소공급, pH, 정제 계획 등이 포함된다. 올리고당 생산에 수반되는 특정 효소를 도입하거나 과발현시키는 것을 포함하여 특정한 숙주 생물에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하기 위하여 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화가, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (Endo H)를 이용하여, 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포가 특정 유형의 다당류의 프로세싱에서 결함이 있도록 유전공학적으로 처리될 수 있다. 이러한 기술 및 유사 기술은 당업계에 주지되어 있다.
또다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역분석을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 당업계의 확립된 절차를 이용하여 변형된 E3 폴리펩티드가 제조되고, 당업계에 공지된 표준 분석법을 사용하여 스크리닝될 수 있으며, 이러한 분석법의 일부가 하기 및 실시예에 기술된다.
또다른 항체 변형은 PCT 공개 공보 WO 99/58572 (1999년 11월 18일 공개)에 기술된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이러한 항체는, 표적 분자에 지시된 결합 도메인에 더하여, 인간 면역글로불린 중쇄의 모든 또는 일부 불변 도메인과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 현저한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 반응 및 기타 부작용을 피하기 위하여, 장기간의 항체 요법에서 사용하는데 특히 적절하다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 (예컨대 E3) 또는 폴리펩티드로부터의 1개 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 도 1B에 제시된 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 도 1A에 제시된 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같은 E3의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 E3의 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 항체 E3의 CDR H3 및/또는 CDR L3를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDRH1의 L29, CDRH2의 I50, CDRH3의 W101 및/또는 CDRH3의 A103 아미노산 잔기; 및/또는 CDRL1의 S28, CDRL1의 N32, CDRL2의 T51, CDRL3의 91E 및/또는 CDRL3의 H92 아미노산 잔기 중 임의의 1개 이상을 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, E3 융합 단백질은 1개 이상의 E3 항체, 및 천연 분자에 부착되지 않은 또다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또다른 영역으로부터의 동종 서열 또는 이종 서열을 함유한다. 대표적인 이종 서열은 "택(tag)" 예컨대 FLAG 택 또는 6His 택을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 택은 당업계에 주지되어 있다.
E3 융합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 E3 융합 단백질은 본원에 기술된 재조합 방법을 사용하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 제조될 수 있지만, 화학 합성이 예를 들어 포함되는, 당업계에 공지된 기타 수단에 의해 또한 제조될 수 있다.
본 발명은 고체 지지체 (예컨대 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된 (예를 들어, 연결된) E3 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 단순함을 위하여, 일반적으로 E3 또는 항체가 언급될 것이고, 단 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 NGF 결합 실시양태에 적용된다. 일반적으로 접합은 본원에 기술된 바와 같은 성분들을 연결시키는 것을 지칭한다. 연결 (일반적으로, 적어도 투여를 위해 근접한 관계로 이러한 성분들을 고정시킴)은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 작용제와 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우, 작용제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는, 다른쪽의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할로겐화물과, 또는 양호한 이탈기 (예를 들어, 할로겐화물)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화제 (별법적으로 "표지"라고 명명됨), 예컨대 형광성 분자, 방사성 분자 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 당업계에 공지되어 있고, 이는 일반적으로 신호를 (직접 또는 간접적으로) 제공한다. 따라서, 본 발명은 표지된 항체 및 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 능력, 예컨대 NGF 결합; NGF 생물학적 활성의 감소 또는 억제; E13.5 마우스 삼차 뉴런의 NGF-유도 생존의 감소 및/또는 차단이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 테스트될 수 있고, 이의 일부가 실시예에 기술된다.
본 발명은 항체 E3, 및, 본 명세서에서 명백한 바와 같은, 본원에 기술된 임의의 또는 모든 항체 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함) 및 키트를 또한 제공한다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 항체 및 폴리펩티드 (도 1A 및 1B에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 포함)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 또한 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기의 것들 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 조성물 (제약 조성물 포함))를 제공한다: (a) 항체 E3; (b) 항체 E3의 단편 또는 영역; (c) 도 1B에 제시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄; (d) 도 1A에 제시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄; (e) 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역(들); (f) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 1개 이상의 CDR (1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 도 1A에 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 도 1B에서 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 도 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 도 1A에서 제시된 항체 E3의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (k) 도 1A 및 1B에 제시된 항체 E3의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 또는 (l) (b) 내지 (k) 중 임의의 것을 포함하는 항체. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 도 2 및 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4893호 또는 ATCC PTA- 4894호의 E3 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 E3 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁 번호 ATCC PTA-4894호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역 및 (b) 기탁번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 기탁번호 ATCC PTA-4894호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 1개 이상의 CDR; 및/또는 (b) 기탁 번호 ATCC PTA-4895호의 폴리뉴클레오티드 내에 코딩되는 1개 이상의 CDR을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항체 (항체 단편 포함) 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기술된 E3 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 임의의 본원에 기술된 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 도 2 및 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함한다. 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여가 본원에서 추가로 기술된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
임의의 이같은 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스(antisense))이거나 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드가 또다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만, 반드시 연결될 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이같은 서열의 변이체를 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비하여 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에서 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 바람직하게는 약 70％이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90％ 이상의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 두 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 설명되는 바와 같이 최대 일치를 위하여 정렬되는 경우 동일하다면, "동일한" 것으로 언급된다. 두 서열 간의 비교는 비교 창(window)에서 서열들을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 창"은 약 20개 이상의 인접한 위치, 일반적으로 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 인접한 위치의 수가 동일한 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 디폴트 파라메터를 사용하여, 바이오인포매틱스 소프트웨어의 Lasergene 수트 내의 Megalign 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다 (DNASTAR, Inc., Madison, WI). 이러한 프로그램은 하기의 참고문헌들에 기술된 여러 정렬 계획을 포함한다: [Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; [Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153]; [Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17]; [Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105]; [Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; [Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; [Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "％ 서열 동일성"은 20개 이상 위치의 비교 창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교함으로써 결정되고, 이때 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 20％ 이하, 일반적으로 5 내지 15％, 또는 10 내지 12％의 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. ％는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치의 총수 (즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 ％ 서열 동일성을 산출함으로써 계산된다.
변이체는, 또한 또는 별법적으로, 천연 유전자, 또는 이의 일부 또는 보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 이같은 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열 (또는 상보성 서열)에 온건하게 엄격한 조건 하에 혼성화할 수 있다.
적절한 "온건하게 엄격한 조건"은 5×SSC, 0.5％ SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세정하고; 50℃-65℃, 5×SSC에서 하룻밤 동안 혼성화시킨 후; 0.1 ％ SDS를 함유하는 각각의 2×, 0.5× 및 0.2×SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 세정을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안에, 42℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 함께, 변성화제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 갖는 50% (v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC (0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5× 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2× SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 55℃에서 50% 포름아미드로 세정한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고도 엄격성 세척을 사용하는 것이다. 당업자는, 프로브 길이 등과 같은 인자에 적응시키기 위해 필요하다면, 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인지할 것이다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로, 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드들 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한의 상동성을 지닌다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인하여 달라진 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 명확하게 구현된다. 또한, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 변경될 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대 혼성화, 증폭 및/또는 데이타베이스 서열 비교)을 이용하여 확인될 수 있다.
화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 주지되어 있고, 본원에 상세하게 기술될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공된 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 사용하여, 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위하여, 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내에 삽입할 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접적인 섭취, 세포내이입, 형질감염, F-짝짓기 또는 전기천공에 의하여 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 주지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어 [Sambrook et al. (1989)] 참조.
별법적으로, PCR은 DNA 서열이 재생산되도록 한다. PCR 기술은 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994)]에 기술되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 이용하여 이를 적절한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어, [Sambrook et al., (1989)]에 기재된 바와 같이, 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적절한 클로닝 벡터가 표준 기술에 따라서 구축될 수 있거나, 또는 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용되도록 의도되는 숙주 세포에 따라서 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는자가-복제 능력을 일반적으로 가질 것이고/이거나, 특정 제한효소에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있으며, 벡터를 함유하는 클론을 선별하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 지닐 수 있다. 적절한 예로는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUCl9, Bluescript (예를 들어, pBSSK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28이 포함된다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 기타 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene, 및 Invitrogen과 같은 판매업자로부터 입수가능하다.
일반적으로 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 발현 벡터가 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포 내에서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적절한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 공보 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기의 것들 중 1가지 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기원; 1개 이상의 마커 유전자; 적절한 전사 제어 요소 (예를 들어 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현 (즉, 번역)을 위하여, 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈이 또한 일반적으로 요구된다.
전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 유전자총(microprojectile bombardment); 리포솜 매개 감염(lipofection); 및 감염 (예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 방법의 임의의 것에 의해, 당해 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 좌우된다.
본 발명은 임의의 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 당해 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 포유류 숙주 세포의 비-제한적인 예로는 COS, HeLa 및 CHO 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. PCT 공개 공보 WO 87/04462 참조. 적절한 비-포유류 숙주 세포에는 원핵생물 (예컨대 대장균 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)) 및 효모 (예컨대 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis))가 포함된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내의 상응하는 당해 내인성 항체 또는 단백질 (존재하는 경우)보다 약 5배 더 높은 수준, 더욱 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 더욱 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. NGF에 특이적으로 결합하는 것에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역분석법 또는 FACS에 의해 실행된다. 당해 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.
E3 및 E3 유래 항체를 이용하는 방법
NGF에 결합하는 항체 E3는 NGF의 존재 또는 부재를 확인 또는 검출하는데 사용될 수 있다. 단순함을 위하여, 일반적으로 E3 또는 항체가 언급될 것이고, 단 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 NGF 결합 실시양태 (예컨대 폴리펩티드)에 적용된다. 일반적으로 검출은 NGF에 결합하는 본원에 기술된 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것 및 NGF와 NGF에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, E3) 간의 복합체의 형성을 수반한다. 이같은 복합체의 형성은 생체 외 또는 생체 내에서 일어날 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조군과 관련된 또는 대조군과 상관없는 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
폴리펩티드에 결합하는 항체를 이용하는 면역분석법, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사성면역분석법 (RIA) 등; 및 코딩된 폴리펩티드에 대한 기능적 분석법, 예를 들어 결합 활성 또는 효소 분석법이 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 다양한 공지된 방법이 검출에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출가능하게 표지된다.
E3 및 유도체의 진단적 사용
본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 변경된 또는 비정상적인 NGF 발현 (일부 실시양태에서, 증가 또는 감소된 NGF 발현 (정상 샘플에 비하여), 및/또는 부적절한 발현, 예컨대 정상적으로는 NGF 발현이 결여된 조직(들) 및/또는 세포(들)에서의 발현 존재, 또는 정상적으로는 NGF가 발현되는 조직(들) 또는 세포(들)에서의 NGF 발현 부재)과 관련된 질환, 용태 또는 장애의 검출, 진단 및 모니터링에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는, 예를 들어, NGF에 대한 변경된 또는 비정상적인 민감성 또는 응답성과 관련된 질환에서, NGF 발현의 검출에 추가로 유용하다. 일부 실시양태에서, NGF 발현에 대한 변경된 또는 비정상적인 민감성 또는 응답성을 특징으로 하거나 이와 관련된 질환, 장애 (예를 들어, NGF가 성장 및/또는 전이를 촉진하는 암)에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터의 샘플에서 NGF 발현이 검출된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 NGF 발현이 변경되었거나 비정상적인 것으로 의심되는 개체의 표본 (샘플)을 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키고, NGF의 수준이 대조군 또는 비교 표본의 수준와 상이한지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 심장 부정맥, 알츠하이머병, 및/또는 자율 기능장애가 있는 개체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체의 표본 (샘플)을 접촉시키고 NGF 발현 의 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 NGF 발현에 대한 민감성 또는 반응성이 변경되었거나 비정상적인 것을 특징으로 하거나 이와 관련된 질환, 장애에 걸린 것으로 의심된다. 일부 실시양태에서, 개체는 소세포폐암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 난소 암종, 간세포 암종, 또는 흑색종이 있는 개체이다.
진단 용도를 위해, 전형적으로 항체는 방사성 동위원소, 형광성 표지, 및 각종 효소-기질 표지가 포함되지만 이에 한정되지 않는 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 표지를 항체에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 표지될 필요가 없고, 본 발명의 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 본 발명의 항체의 존재가 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침전 분석법에서 사용될 수 있다. [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
또한 항체는 생체내 진단 분석법, 예컨대 생체내 조영에 사용될 수 있다. 일반적으로, 면역섬광조영술(immunoscintiography)을 이용하여 당해 세포 또는 조직이 국소화될 수 있도록 항체가 방사성핵종 (예컨대 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 또는 3H)으로 표지된다.
당업계에 주지된 기술에 따라서, 항체는 병리학에서 염색 시약으로 또한 사용될 수 있다.
치료적 목적으로 E3 및 유도체를 사용하는 방법
항체 E3는 NGF의 생물학적 활성을 감소시키고/시키거나 차단하는데 유용하다. 이러한 길항성 활성은 내인성 NGF 생산과 관련된 병리학적 용태, 예컨대 통증의 치료에 유용한 것으로 여겨진다. 일반적으로, 이러한 실시양태에서, 유효량이 개체에 투여된다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 개시된 폴리펩티드 (항체 E3와 같은 항체 포함)를 이용하여 인간 NGF의 생물학적 활성을 길항하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 신경 성장 인자를 임의의 본원에 기술된 폴리펩티드(항체 E3 포함)와 접촉시킴으로써, 인간 신경 성장 인자 활성이 길항, 감소, 차단 또는 억제되는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 통증 (예컨대 수술 후 통증 또는 류머티스 관절염 통증)이 있는 개체에 E3로의 치료가 제공된다.
단순함을 위하여, 일반적으로 E3 또는 항체가 언급될 것이고, 단 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 E3 변이체 항체 및 폴리펩티드)에 적용된다.
E3 또는 E3의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, 등), 예컨대 단일 사슬 (ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 필요한 특이성의 항원 NGF 인식 부위를 포함하는 E3의 임의의 또다른 변형된 형상의 다양한 제형이 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, E3 항체 또는 E3의 다양한 제형은 순수하게 투여될 수 있다. 또다른 실시양태에서, E3 또는 E3의 다양한 제형 (임의의 본원에 기술된 조성물 실시양태 포함) 및 제약상 허용가능한 부형제가 투여되고, 다양한 제형 내에 존재할 수 있다. 제약상 허용가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는, 비교적 비활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 경도를 제공할 수 있거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적절한 부형제에는 안정화제, 습윤화 및 유화제, 오스몰농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증강제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 부형제, 뿐만 아니라 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제형이 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 작용제들은 주사 (예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여에 대하여 제형되지만, 또다른 투여 형태 (예를 들어, 구강, 점막, 흡입을 통하여, 설하 등)가 또한 사용될 수 있다. 따라서, E3 항체 및 이의 등가물은 바람직하게는 제약상 허용가능한 비히클 예컨대 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합된다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시간조절 및 반복은 특정 개체 및 이러한 개체의 병력에 좌우될 것이다. 일반적으로, 임의의 하기 용량이 사용될 수 있다: 체중 1 ㎏ 당 약 50 ㎎ 이상의 용량; 체중 1 ㎏ 당 약 10 ㎎ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 3 ㎎ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎎ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 750 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 500 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 250 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 100 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 50 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 10 ㎍ 이상; 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 이상, 또는 이보다 낮은 투여량. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라서, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료가 지속된다. 대표적인 투여 요법은 약 2 ㎎/㎏의 최초 투여 후, 항-NGF 항체를 약 1 ㎎/㎏의 지속 용량으로 매주 투여하는 것 또는 약 1 ㎎/㎏의 지속 용량으로 격주로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 실행자가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라, 또다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 반감기와 같은 실험적인 고려사항이 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
일부 개체에서, 1회를 초과하는 투여가 요구될 수 있다. 투여 빈도는 요법의 진행에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 치료될 통증의 유형 및 중증도, 작용제가 예방 또는 치료의 목적으로 투여되는지 여부, 사전 요법, 환자의 병력 및 작용제에 대한 응답, 및 주치의의 재량을 기초로 결정 또는 조정될 수 있다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-NGF 길항제 항체 (예컨대 E3)를 투여할 것이다. 일부 경우에, E3 항체의 지속적인 연속 방출 제형이 적합할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, E3 항체 (또는 폴리펩티드)의 투여량은 1회 이상의 투여가 제공된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 증가되는 투여량의 E3가 개체에게 제공된다. E3 또는 기타 등가 항체의 효능을 평가하기 위해, 질환 증상 (예를 들어, 통증)의 마커가 모니터링될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 항체 (예를 들어 E3) 또는 폴리펩티드의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 당업자에게 공지된 기타 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 미리 선택된 기간의 시간에 걸쳐서 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 간격을 둔 투여일 수 있는데, 예를 들어 통증 발생 전, 동안 또는 후, 통증 발생 전, 동안, 전 및 후, 동안 및 후, 또는 전, 동안 및 후일 수 있다. 투여는 상처, 절개, 외상, 수술 및 수술 후 통증을 일으킬 수 있는 임의의 기타 이벤트 전, 동안 및/또는 후에 이루어질 수 있다.
기타 제형에는 리포솜과 같은 담체가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 적절한 전달 형태가 포함된다. 예를 들어, [Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859] 참조. 리포솜형 제제에는 시토펙틴(cytofectin), 다층 소포 및 단층 소포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드가 존재할 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 이같은 조성물은 1가지 이상, 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상의 상이한 항체를 함유할 수 있다. 항체들의 혼합물은, 당업계에서 항체들이 종종 나타내는 바와 같이, 더 넓은 범위의 개체 집단을 치료하는데 유용할 수 있다.
임의의 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 (예컨대 항체 E3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 원하는 세포 내에서의 임의의 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 (예를 들어 항체 E3)의 전달 및 발현에 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터가 E3 항체 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는데 사용될 수 있음이 명백하다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있고, 예컨대 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내, 피부, 설하, 또는 흡입 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여에는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국부적 투여가 포함되는 국소 또는 전신 투여가 포함된다. 당업자는 생체 내에서의 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471 참조.
임의의 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 (예컨대 항체 E3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술이, 예를 들어, [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202]; [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 ㎎의 DNA의 범위로 투여될 수 있다. 약 500 ng 내지 약 50 ㎎, 약 1 ㎍ 내지 약 2 ㎎, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA의 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜 동안 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, [Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148] 참조). 내인성 포유류 또는 이종 프로모터를 이용하여 이같은 코딩 서열의 발현이 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성성이거나 또는 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 주지되어 있다. 대표적인 바이러스-기재 비히클에는 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 5,219,740; 4,777,127; 영국 특허 2,200,651; 및 유럽 특허 0 345 242 참조), 알파바이러스-기재 벡터 (예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 산림 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수알레 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 기술된 바와 같이 사멸 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
사멸 아데노바이러스에 연결되거나 단독으로 이에 연결되지 않은 다가양이온성 응축 DNA (예를 들어, [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조); 리간드-연결 DNA (예를 들어, [Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985] 참조); 진핵생물 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 5,814,482; PCT 공개 공보 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합이 포함되지만 이에 한정되지 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또한 사용될 수 있다. 대표적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 공보 WO 90/11092 및 미국 특허 5,580,859에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 5,422,120; PCT 공개 공보 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 유럽 특허 0 524 968에 기술되어 있다. 추가적인 접근법이 [Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 모든 방법과 관련하여, 항-NGF 길항제 항체에 관한 언급은 1개 이상의 이러한 작용제를 포함하는 조성물을 또한 포함한다. 이러한 조성물은 적절한 부형제, 예컨대 완충제가 포함되는 제약상 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 당업계에 주지되어 있다. 본 발명은 단독으로, 또는 또다른 통상적인 치료 방법과 함께 사용될 수 있다.
류머티스 관절염 통증을 치료 또는 예방하기 위해
항-NGF 길항제 항체를 사용하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 인간 및 비-인간 포유동물이 포함되는 개체에서 류머티스 관절염 통증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 류머티스 관절염 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 항-NGF 길항제 항체는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기술된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 개체에서 류머티스 관절염 통증의 발병률을 감소시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증을 경감시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증을 억제하고/하거나, 류머티스 관절염 통증을 완화시키고/시키거나, 류머티스 관절염 통증의 발병, 발달 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 류머티스 관절염에 걸린 개체에서 통증의 발달 또는 통증 에피소드 전에 투여된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-NGF 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 류머티스 관절염과 관련된 염증성 악액질 (체중 손실)을 치료하는 방법을 제공한다 ([Roubenoff et al., Arthritis Rheum. 40(3):534-9 (1997)]; [Roubenoff et al., J. Clin. Invest. 93(6):2379-86 (1994)]).
류머티스 관절염 통증의 진단 또는 평가는 당업계에 잘 확립되어 있다. 평가는 다양한 통증 척도를 사용하는 통증의 환자 특성화와 같이 당업계에 공지된 측정법을 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, [Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79(2):231-52]; [Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55] 참조. 미국 류머티스 학회 (ACR: American College of Rhematology) ([Felson, et al., Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6):729-740]), 건강 평가 설문지 (HAQ: Health Assessment. Questionnaire) ([Fries, et al., (1982) J. Rheumatol. 9:789-793]), 파울러스 척도(Paulus Scale) ([Paulus, et al., Arthritis and Rheumatism (1990) 33:477-484]), 및 관절염 영향 측정 척도 (AIMS: Arthritis Impact Measurement Scale) ([Meenam, et al., Arthritis and Rheumatology (1982) 25:1048-1053])와 같이 질환 상태를 측정하는데 통상적으로 사용되는 척도가 또한 존재한다. 항-NGF 길항제 항체는 임의의 적절한 경로를 통해 개체에 투여될 수 있다. 여러 투여 경로의 예가 본원에 기술된다.
통증 해소는 해소의 시간 경로에 의해 특성화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 통증 해소는 항-NGF 길항제 항체의 투여 후 약 24시간 이내에 관찰된다. 또다른 실시양태에서, 통증 해소는 항-NGF 길항제 항체의 투여 후 약 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 4일 이내에 관찰된다. 또다른 실시양태에서, 통증 해소는 류머티스 관절염과 관련된 염증 상태의 개선의 징후를 관찰하기 전에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 통증의 빈도 및/또는 강도가 감소되고/되거나, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질이 증가된다.
이러한 방법을 위해 NGF 길항제 (항-NGF 항체 포함)를 제조하고 이용하는 것은 하기 섹션 ("NGF 길항제", "항-NGF 길항제 항체"; "기타 NGF 길항제"; "NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 확인"; "본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물"; "NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 항체)의 투여")에서 기술된다.
골관절염 통증을 치료 또는 예방하기 위해
항-NGF 길항제 항체를 사용하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 인간 및 비-인간 포유동물이 포함되는 개체에서 골관절염 통증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 골관절염 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 항-NGF 길항제 항체는 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 기술된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 골관절염 통증의 발병률을 감소시키고/시키거나, 골관절염 통증을 경감시키고/시키거나, 골관절염 통증을 억제하고/하거나, 골관절염 통증을 완화시키고/시키거나, 골관절염 통증의 발병, 발달 또는 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 골관절염에 걸린 개체에서 통증의 발달 또는 통증 에피소드 전에 투여된다.
골관절염 통증의 진단 또는 평가는 당업계에 잘 확립되어 있다. 평가는 다양한 통증 척도를 사용하는 통증의 환자 특성화와 같이 당업계에 공지된 측정법을 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, [Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79(2):231-52]; [Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55] 참조. 예를 들어, WOMAC 보행 통증 척도(Ambulation Pain Scale) (통증, 경직 및 신체 기능 포함) 및 100 mm 시각 상사 척도 (VAS: Visual Analogue Scale)를 사용하여, 통증을 평가하고 치료에 대한 응답을 사정할 수 있다.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 임의의 적절한 경로를 통해 개체에 투여될 수 있다. 여러 투여 경로의 예가 본원에 기술된다.
일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 1주에 한번, 2주에 한번, 3주에 한번, 4주에 한번, 5주에 한번, 6주에 한번, 7주에 한번, 8주에 한번, 9주에 한번, 10주에 한번, 15주에 한번, 20주에 한번, 25주에 한번, 또는 30주에 한번 투여된다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 1개월에 한번, 2개월에 한번, 3개월에 한번, 4개월에 한번, 5개월에 한번, 또는 6개월에 한번 투여된다.
통증 해소는 해소의 시간 경로에 의해 특성화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 통증 해소는 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 투여 후 약 24시간 이내에 관찰된다. 또다른 실시양태에서, 통증 해소는 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 투여 후 약 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 4일 이내에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 통증의 빈도 및/또는 강도가 감소되고/되거나, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질이 증가된다. 일부 실시양태에, 골관절염에 대한 통증 해소는 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 단일 투여 후 약 7일 이상, 약 14일 이상, 약 21일 이상, 약 28일 이상, 약 35일 이상, 약 42일 이상, 약 49일 이상, 약 56일 이상, 약 63일 이상, 약 70일 이상, 약 77일 이상, 약 84일 이상, 약 180일 이상 또는 이보다 더 긴 기간 동안 제공된다.
이러한 방법을 위해 NGF 길항제 (항-NGF 항체 포함)를 제조하고 이용하는 것은 하기 섹션 ("NGF 길항제", "항-NGF 길항제 항체"; "기타 NGF 길항제"; "NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 확인"; "본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물"; "NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 항체)의 투여")에서 기술된다.
NGF 길항제
본 발명의 방법 (류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증에 관련됨)은 "NGF" 길항제를 사용하고, 이는 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포성 응답의 도출과 같은, NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키는 (현저하게를 포함) 임의의 분자를 지칭한다. 용어 "길항제"는 어떠한 생물학적 작용의 특정 메카니즘도 의미하지 않고, NGF와의 모든 가능한 약리학적, 생리학적, 및 생화학적 상호작용 및 다양한 상이하고 화학적으로 다른 조성물들에 의해 달성될 수 있는 결과를 명백하게 포함하고 포괄하는 것으로 간주된다. 대표적인 NGF 길항제에는 항-NGF 항체, NGF에 대해 지시된 안티-센스 분자 (NGF를 코딩하는 핵산에 대해 지시된 안티-센스 분자 포함), NGF 수용체 (예컨대 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)에 대해 지시된 안티-센스 분자 (TrkA 및/또는 p75를 코딩하는 핵산에 대해 지시된 안티-센스 분자 포함), NGF 억제 화합물, NGF 구조 유사체, NGF에 결합하는 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, NGF에 결합하는 p75 수용체의 우성-음성 돌연변이, 항-p75 항체 및 키나제 억제제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "길항제"는 이에 의해 NGF 자체, NGF 생물학적 활성 (임의의 양상의 통증을 매개하는 이의 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소, 또는 중화되는 모든 앞서 확인된 용어, 제목, 및 기능적 상태 및 특성을 포함하는 것으로 명백히 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예를 들어, 항체)는 NGF와 결합 (물리적으로 상호작용)하고/하거나, NGF 수용체 (예컨대 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)와 결합하고/하거나, 하류 NGF 수용체 신호전달을 감소 (방해 및/또는 차단)시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF와 결합 (물리적으로 상호작용)한다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF에 결합하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 PCT WO 2004/026329에 기술된 펩티드 또는 변형된 펩티드 (예컨대 Fc 도메인에 융합된 NGF 결합 펩티드)이다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF 수용체 (예컨대 TrkA 수용체 또는 p75)에 결합한다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 하류 NGF 수용체 신호전달을 감소 (저해 및/또는 차단)시킨다 (예를 들어, 키나제 신호화의 억제제). 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 방출을 억제 (감소)한다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소가 아닌 (즉, TrkA 면역부착소 이외의 것인) NGF 길항제이다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 것이다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소 이외의 것이며, 항-NGF 항체 이외의 것이다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF (예컨대 hNGF)에 결합하고, NT-3, NT4/5 및/또는 BDNF와 같은 관련된 뉴로트로핀에는 현저하게 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 유해한 면역 응답과 관련되지 않는다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간화 항체 (예컨대 본원에 기술된 항체 E3)이다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 항체 E3 (본원에 기술된 바와 같음)이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 실시양태에서는 E3로부터의 6개 CDR 전부). 또다른 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 도 1A에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 1) 및 도 1B에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 2)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 비활성인, 예를 들어, 보체 매개 용해를 유발하지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않는 불변영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 불변영역은 [Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 9809951.8에 기술된 바와 같이 변형된다.
항-NGF 길항제 항체
본 발명의 방법 (류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증에 관련됨)은 항-NGF 길항제 항체를 사용하고, 이는 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포성 응답의 도출과 같은, NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키는 (현저하게를 포함) 임의의 항체 분자를 지칭한다.
항-NGF 길항제 항체는 하기 특성들 중 임의의 1가지 이상을 나타내야 한다: (a) NGF에 결합하고, NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 하류 경로를 억제함; (b) 임의 양상의 류머티스 관절염 통증 또는 골관절염 통증을 예방하거나, 경감시키거나, 또는 치료함; (c) NGF 수용체 활성화 (TrkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화 포함)를 차단하거나 감소시킴; (d) NGF의 소거를 증가시킴; (e) NGF 합성, 생산 또는 방출을 억제 (감소)시킴. 항-NGF 길항제 항체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 01/78698, WO 01/64247, 미국 특허 5,844,092, 5,877,016, 및 6,153,189; [Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000)]; [Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993)]; GenBank 접속 번호 U39608, U39609, L17078, 또는 L17077을 참조한다.
본 발명의 목적을 위하여, 항체는 NGF 및/또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 하류 경로를 억제하는 방식으로 NGF와 작용한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간 NGF를 인식한다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간 NGF에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NT-3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 같은 관련된 뉴로트로핀에 현저하게 결합하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 NGF에 결합할 수 있고, NGF가 생체 내에서 이의 TrkA 및/또는 p75 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 억제할 수 있고/있거나 NGF가 이의 TrkA 및/또는 p75 수용체를 활성화시키는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간화 항체 (예컨대 본원에 기술된 항체 E3)이다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, WO 2005/019266 참조. 한 실시양태에서, 항체는 인간 NGF 상의 1개 이상의 에피토프를 인식하는 인간 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 인간 NGF 상의 1개 이상의 에피토프를 인식하는 마우스 또는 래트 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 영장류, 개, 고양이, 말, 및 소로 구성되는 군으로부터 선택된 NGF 상의 1개 이상의 에피토프를 인식한다. 추가적인 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 MAb 911, MAb 912 및 MAb 938 중 임의의 1개 이상으로부터 선택된 항체와 본질적으로 동일한 NGF 에피토프 6에 결합한다 ([Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)] 참조). 또다른 실시양태에서, 항체는 Mab 911과 동일한 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 면역학적으로 비활성인 (예를 들어, 보체 매개 용해 또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유발하지 않음) 불변 영역을 포함한다. ADCC 활성은 미국 특허 5,500,362에 개시된 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 9809951.8에 기술된 바와 같이 변형된다.
일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 항체 "E3"로 명명된 인간화 마우스 항-NGF 모노클로날 항체, 임의의 본원에 기술된 E3 관련 항체, 또는 임의의 이의 단편이고, 이들은 NGF 길항제이다.
본 발명에서 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 사슬 (ScFv), 이의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 또다른 변형된 형상의 면역글로불린 분자 (항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유결합으로 변형된 항체 포함)를 포함할 수 있다. 항체는 마우스, 래트, 인간, 또는 임의의 또다른 기원일 수 있다 (키메라 또는 인간화 항체 포함).
항-NGF 길항제 항체의 NGF (예컨대 hNGF)에 대한 결합 친화력은 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75 nM 및 약 0.18 내지 약 0.72 nM일 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 pM 내지 22 pM이다. 한 실시양태에서, 결합 친화력은 약 23 pM 내지 약 100 pM이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10 nM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1 nM 미만 또는 약 0.07 nM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM 또는 약 50 pM 중 임의의 것 내지 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 또는 약 40 pM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중의 임의의 것, 또는 약 50 pM 미만이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중 임의의 것 미만이다. 또다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 초과이다.
NGF에 대한 항체의 결합 친화력을 결정하는 한 방법은 항체의 단일관능성 Fab 단편의 친화력을 측정하는 것에 의한 것이다. 단일관능성 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체 (예를 들어, IgG)가 파파인으로 절단될 수 있거나 또는 재조합에 의해 발현될 수 있다. 항체의 항-NGF Fab 단편의 친화력을 표면 플라스몬 공명 (BIAcore3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 (BIAcore, INC, Piscaway NJ))에 의해 결정할 수 있다. 공급자의 사용설명서에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 이용하여 CM5 칩을 활성화시킬 수 있다. 인간 NGF (또는 임의의 기타 NGF)를 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 내로 희석하여, 0.005 ㎎/㎖의 농도로 활성화된 칩 상에 주입할 수 있다. 각각의 칩 채널을 가로지르는 가변성 유동 시간을 이용하여, 2가지 범위의 항원 밀도가 달성될 수 있다: 상세한 동력학 연구용의 100-200 응답 유닛 (RU) 및 스크리닝 분석용 500-600 RU. 칩을 에탄올아민으로 차단할 수 있다. 재생 연구는 Pierce 용출 완충제 (제품 번호 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) 및 4M NaCl (2:1)의 혼합물이 200회가 넘는 주입에 대하여 칩 상의 hNGF의 활성을 유지시키면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다는 것을 나타냈다. HBS-EP 완충제 (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ 계면활성제 P29)가 BIAcore 분석법용 러닝(running) 완충제로서 사용된다. 정제된 Fab 샘플의 일련의 희석물 (0.1-10× 추정 KD)을 1분 동안 100 ㎕/분으로 주입하고, 최대 2시간의 해리 시간을 허용한다. Fab 단백질의 농도는 공지된 농도 (아미노산 분석에 의해 결정됨)의 Fab를 기준으로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기천공에 의해 결정된다. BIAevaluation 프로그램을 이용하여 데이타를 1:1 Langmuir 결합 모델 ([Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110])에 핏팅(fitting)시킴으로써 동력학 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)가 동시에 수득된다. 평형 해리 상수 (KD) 값은 koff/kon으로 계산된다. 이러한 프로토콜은 인간 NGF, 또다른 척추동물 (일부 실시양태에서, 포유류)의 NGF (예컨대 마우스 NGF, 래트 NGF, 영장류 NGF)가 포함되는 임의의 NGF에 대한 항체의 결합 친화력을 결정하는데 사용하기에, 뿐만 아니라 또다른 뉴로트로핀, 예컨대 관련 뉴로트로핀 NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 함께 사용하기에 적절하다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 NGF에 결합하고, 또다른 척추동물 종 (일부 실시양태에서, 포유류)으로부터의 NGF에 현저하게 결합하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 항체는 인간 NGF, 뿐만 아니라 또다른 척추동물 종 (일부 실시양태에서, 포유류)로부터의 1가지 이상의 NGF에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 NGF에 결합하고, 다른 뉴로트로핀 (예컨대 관련 뉴로트로핀, NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF)과 현저하게 교차-반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 NGF, 뿐만 아니라 1가지 이상의 다른 뉴로트로핀에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 말 또는 개와 같은 포유류 종의 NGF에 결합하지만, 또다른 포유류 종으로부터의 NGF에 현저하게 결합하지 않는다.
에피토프(들)은 연속적 또는 비-연속적일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 [Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227(2000)]에 기술된 바와 같이 MAb 911, MAb 912 및 MAb938로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 본질적으로 동일한 hNGF 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 Mab 911과 본질적으로 동일한 hNGF 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 Mab 909와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. [Hongo et al., 상기 문헌]. 예를 들어, 에피토프는 하기의 것들 중 1개 이상을 포함할 수 있다: hNGF의 가변 영역 1 (아미노산 23-35) 내의 잔기 K32, K34 및 E35; hNGF의 가변 영역 4 (아미노산 81-88) 내의 잔기 F79 및 T81; 가변 영역 4 내 잔기 H84 및 K88; hNGF의 가변 영역 5 (아미노산 94-98)와 hNGF의 C-말단 (아미노산 111-118) 사이의 잔기 R103; hNGF의 전(前)-가변 영역 1 (아미노산 10-23) 내의 잔기 E11; hNGF의 가변 영역 2 (아미노산 40-49)와 hNGF의 가변 영역 3 (아미노산 59-66) 사이의 Y52; hNGF의 C-말단 내의 잔기 L112 및 S113; hNGF의 가변 영역 3 내의 잔기 R59 및 R69; 또는 hNGF의 전-가변 영역 1 내의 잔기 V18, V20, 및 G23. 또한, 에피토프는 hNGF의 가변 영역 1, 가변 영역 3, 가변 영역 4, 가변 영역 5, N-말단 영역, 및/또는 C-말단 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항체는 hNGF의 잔기 R103의 용매 접근용이성을 현저하게 감소시킨다. 상기 기술된 에피토프는 인간 NGF에 관한 것이지만, 당업자는 인간 NGF의 구조를 다른 종의 NGF와 정렬하여 이러한 에피토프들에 대한 가능한 대응물을 확인할 수 있는 것으로 이해된다.
한 양상에서, NGF를 억제할 수 있는 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 마우스 항체, 키메라 항체)를 NGF의 전장(全長) 또는 부분 서열을 발현하는 면역원을 사용하여 제조할 수 있다. 또다른 양상에서, NGF를 과발현하는 세포를 포함하는 면역원이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 면역원의 또다른 예는 전장 NGF 또는 NGF 단백질의 일부를 함유하는 NGF 단백질이다.
항-NGF 길항제 항체는 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 숙주 동물 면역화의 경로 및 일정은, 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, 항체 자극 및 생산에 관한 확립된 통상적인 기술을 따른다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기술된다.
인간을 포함하는 임의의 포유류 대상 또는 이들로부터의 항체 생산 세포가 인간을 포함하는 포유류의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로 작용하도록 조작될 수 있는 것으로 생각된다. 전형적으로, 본원에 기술된 것을 포함하여, 소정량의 면역원이 숙주 동물에게 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족내, 및/또는 피부내 접종된다.
하이브리도마는 [Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497]의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 이용하여, 또는 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의하여 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 Salk Institute의 Cell Distribution Center (Calif., USA)로부터의 것들이 포함되지만 이에 한정되지 않는 입수가능한 골수종 세포주가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원(fusogen)을 이용하여, 또는 당업자에게 주지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프구 세포를 융합시키는 것을 수반한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선별 성장 배지, 예컨대 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장시켜, 혼성화되지 않은 어버이 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 혈청이 보충되지 않은, 임의의 본원에 기술된 배지가 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 또다른 별법적인 세포 융합 기술로서, EBV 불멸화 B 세포가 본 발명의 항-NGF 모노클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 원한다면, 하이브리도마를 확장 및 서브클로닝하고, 상청액을 통상적인 면역분석 절차 (예를 들어, 방사성면역분석법, 효소 면역분석법, 또는 형광 면역분석법)에 의해 항-면역원 활성에 대하여 분석한다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 NGF에 특이적인 모노클로날 항체 또는 이의 일부를 생산하는 어버이 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포함한다.
이같은 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 성장될 수 있다. 원한다면, 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 젤 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 초여과에 의해, 모노클로날 항체를 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 상에 제제를 러닝시키고, 원하는 항체를 면역원으로부터 용출 또는 방출시킴으로써, 원치 않는 활성 (존재하는 경우)을 제거할 수 있다. 2관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글리타르알데히드, 숙신 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR [식중 R 및 R1은 상이한 알킬 기이다]를 사용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 갑상선글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합된, 인간 NGF, 또는 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 숙주 동물을 면역화시킴으로써, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단이 산출될 수 있다.
원한다면, 당해 항-NGF 길항제 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열분석한 후, 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위하여 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 당해 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에서 유지될 수 있고, 그후 숙주 세포가 추후의 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 별법적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 또는 항체의 친화력 또는 기타 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서의 임상 실험 및 치료에서 사용되는 경우 면역 응답을 피하기 위해, 불변 영역이 인간 불변 영역과 더욱 유사하도록 조작될 수 있다. NGF에 대한 더 큰 친화력 및 NGF 억제에서의 더 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항-NGF 길항제 항체에 이루어질 수 있고, NGF에 대한 이의 결합 능력이 여전히 유지될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
모노클로날 항체를 인간화시키는 4가지 일반적 단계가 있다. 이는 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계, (2) 인간화 항체를 디자인하는 단계, 즉 인간화 프로세스 동안 사용할 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제적인 인간화 방법론/기술, 및 (4) 인간화 항체의 형질감염 및 발현이다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370 참조.
인간 불변 도메인에 융합된 설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 이의 관련 상보성 결정 영역 (CDR)를 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 다수의 "인간화" 항체 분자가 기술되었다. 예를 들어, [Winter et al. Nature 349:293-299 (1991)], [Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989)], [Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987)], 및 [Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)] 참조. 또다른 참고문헌에 적합한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간의 지지 프레임워크 영역(FR)에 그래프트된 설치류 CDR이 기술되어 있다. 예를 들어, [Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988)], 및 [Jones et al. Nature 321:522-525 (1986)] 참조. 또다른 참고문헌에 재조합적으로 덧대어진 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치류 CDR이 기술되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 0519596 참조. 이러한 "인간화" 분자는 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치 않는 면역학적 응답을 최소화하도록 디자인되고, 이때 상기 응답은 인간 수용자에서 이러한 모이어티를 치료적으로 적용하는 것의 기간 및 유효성을 제한한다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역학적으로 비활성이도록 (예를 들어, 보체 용해를 유발하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 공보 PCT/GB99/01441; 영국 특허 출원 9809951.8 참조. 또한 이용될 수 있는, 항체를 인간화시키는 또다른 방법이 [Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991)] 및 미국 특허 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861; 및 PCT 공개 공보 WO01/27160에 개시되어 있다.
또다른 별법으로, 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 시판되는 마우스를 사용하여 완전한 인간 항체를 수득할 수 있다. 더욱 바람직한 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 더욱 확실한(robust) 면역 응답이 생산되도록 디자인된 트랜스제닉 동물이 인간화 항체 또는 인간 항체의 생성에 또한 사용될 수 있다. 이같은 기술의 예는 Xenomouse™ (Abgenix, Inc.(Fremont, CA)) 및 HuMAb-Mouse? 및 TC Mouse™ (Medarex, Inc.(Princeton, NJ))이다.
별법적으로, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 항체를 재조합적으로 제조하고 발현시킬 수 있다. 또다른 별법으로, 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)] 참조. 별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553(1990))이 면역화되지 않은 제공자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 필라멘트성 박테리오파지의 주(major) 또는 부(minor) 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame)으로 클로닝되어, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 선택한 결과로, 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 성질의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 개관을 위해, 예를 들어 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)] 참조. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소규모 무작위 조합 라이브러리로부터의 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 제공자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 항원 (자가-항원 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체가 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술을 본질적으로 따라서 단리될 수 있다. 천연 면역 응답에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 더 높은 친화력을 부여할 것이고, 고친화력 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 접종(challenge) 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "사슬 셔플링(shuffling)"으로 공지된 기술을 사용함으로써 이러한 천연적인 프로세스가 모방될 수 있다 ([Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). 이러한 방법에서, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역화되지 않은 제공자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 천연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 연속적으로 대체함으로써, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화력이 개선될 수 있다. 이러한 기술은 친화력이 pM-nM 범위인 항체 및 항체 단편이 생산되도록 한다. 초대형 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 어머니(the mother-of-all libraries)"로 또한 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 [Waterhouse et al.,Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)]에 기술되었다. 유전자 셔플링은 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 또한 사용될 수 있으며, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화력 및 특이성을 가진다. "에피토프 각인"으로도 칭해지는 이러한 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 설치류-인간 키메라가 생성된다. 항원에 대해 선택한 결과로, 기능적 항원-결합 부위가 복원될 수 있는 인간 가변 영역이 단리되고, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 나머지 설치류 V 도멘인을 대체하기 위해 프로세스가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 공보 WO 93/06213 (1993년 4월 1일 공개) 참조). CDR 그래프트에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
상기 논의가 인간화 항체에 관련된 것이지만, 논의된 일반적인 원리는, 예를 들어, 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서의 사용을 위해 항체를 주문제작하는데 적용가능될 수 있다는 것이 명백하다. 본원에 기술된 항체 인간화의 1가지 이상의 양상, 예를 들어, CDR 그래프트, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이가 조합될 수 있다는 것이 또한 명백하다.
먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) 내에서 항체를 재조합적으로 발현시킴으로써 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 또다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 유액에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 유액에서 재조합적으로 항체를 발현시키는 방법은 개시되어 있다. 예를 들어, [Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001)]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995)]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147 (1999)] 참조. 항체의 유도체, 예를 들어 인간화 항체, 단일 사슬 항체 등의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
면역분석법 및 유세포측정 분류 기술 예컨대 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 또한 사용하여, NGF에 특이적인 항체를 단리할 수 있다.
항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 비활성일 수 있다. 주지된 담체의 예로는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 개질 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철광이 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위하여 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 또다른 적절한 캐리어를 알고 있거나, 또는 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 심근을 표적화하는 모이어티를 포함한다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써). 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 (예컨대 PCT 공개 공보 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내로 놓을 수 있고, 이어서 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 벡터가 형질감염되어, 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체의 합성이 달성된다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 87/04462 참조. 예를 들어, 상동성 마우스 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 ([Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 전체 또는 일부 코딩 서열을 공유결합으로 연결시킴으로써, DNA가 또한 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에서의 항-NGF 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
항-NGF 길항제 항체는 당업계에 주지된 방법을 이용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑(mapping)"이다. [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harb또는 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 제11장에 예를 들어 기술된 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해석하는 것, 경쟁 분석법, 유전자 단편 발현 분석법, 및 합성 펩티드를 기재로 한 분석법을 포함하여, 단백질 상의 에피토프 위치를 맵핑하고 특성화하는 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 추가적인 예에서, 에피토프 맵핑이 항-NGF 길항제 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어, Pepscan Systems (Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad, The Netherlands)으로부터 시판된다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 신축물에 함유된 것일 수 있거나, 또는 필수적으로 단일 신축물 내에 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형상적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 아미노산 약 4-6개 이상의 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), 항-NGF 길항제 항체와의 결합 분석에 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 항-NGF 길항제 항체가 결합하는 에피토프를 NGF 서열로부터 유도된 중첩 펩티드를 사용하여 항-NGF 길항제 항체에 의한 결합을 결정함으로써 전체적인 스크리닝에 의해 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 분석법에 따라서, NGF를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특정 유전자 구조에 의해 단편화시키고, NGF의 발현된 단편과 테스트될 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어, 방사성 아미노산의 존재하에, PCR에 의해 생산된 후, 시험관 내에서 전사되고 단백질로 번역된다. 그 후, 방사성 표지된 NGF 단편에 대한 항체의 결합을 면역침전 및 젤 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 이용하여 특정 에피토프가 또한 확인될 수 있다. 별법적으로, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리를 테스트 항체에 결합하는 것에 대해 간단한 결합 분석으로 테스트할 수 있다. 추가적인 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑(swapping) 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/되거나, 충분하고/하거나, 필수적인 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, NGF 폴리펩티드의 다양한 단편이 밀접하게 관련되었지만 항원성이 다른 단백질 (예컨대 뉴로트로핀 단백질 족의 또다른 구성원)로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 돌연변이 NGF를 사용하여 도메인 스와핑 실험이 수행될 수 있다. 돌연변이 NGF에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 NGF 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
항-NGF 길항제 항체를 특성화하는데 사용될 수 있는 또다른 방법은 동일한 항원, 즉 NGF 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 또다른 항체와의 경쟁 분석법을 이용하여, 항-NGF 길항제 항체가 또다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 분석법은 당업자에게 주지되어 있다. 본 발명에 대한 경쟁 분석법에서 사용될 수 있는 항체의 예로는 [Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)]에 기술된 바와 같은 MAb 911, 912, 938이 포함된다.
발현 벡터를 사용하여 항-NGF 길항제 항체의 발현을 지시할 수 있다. 당업자는 생체 내에서의 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471 참조. 발현 벡터의 투여에는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국부적 투여가 포함되는 국소 또는 전신 투여가 포함된다. 또다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 심장 동맥, 심방, 심실, 또는 심장막 내로 직접 투여된다.
발현 벡터 또는 서브게놈(subgenomic) 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술이, 예를 들어, [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202;] [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 ㎎의 DNA의 범위로 투여될 수 있다. 약 500 ng 내지 약 50 ㎎, 약 1 ㎍ 내지 약 2 ㎎, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA의 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜 동안 또한 사용될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, [Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148] 참조). 내인성 포유류 또는 이종 프로모터를 이용하여 이같은 코딩 서열의 발현이 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성성이거나 또는 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 주지되어 있다. 대표적인 바이러스-기재 비히클에는 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 5,219,740; 4,777,127; 영국 특허 2,200,651; 및 유럽 특허 0 345 242 참조), 알파바이러스-기재 벡터 (예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 산림 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수알레 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 기술된 바와 같이 사멸 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
사멸 아데노바이러스에 연결되거나 단독으로 이에 연결되지 않은 다가양이온성 응축 DNA (예를 들어, [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조); 리간드-연결 DNA (예를 들어, [Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985] 참조); 진핵생물 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 5,814,482; PCT 공개 공보 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합이 포함되지만 이에 한정되지 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또한 사용될 수 있다. 대표적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 공보 WO 90/11092 및 미국 특허 5,580,859에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 5,422,120; PCT 공개 공보 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기술되어 있다. 추가적인 접근법이 [Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581]에 기술되어 있다.
기타 NGF 길항제
항-NGF 항체 이외의 기타 NGF 길항제가 사용될 수 있다 (류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증과 관련됨). 본 발명의 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 기능적 NGF의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있는 1가지 이상의 안티-센스 분자를 포함한다. NGF의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있고, 공개적으로 입수가능한 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다. 예를 들어, [Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020]; 접속 번호 NM 002506; [Ullrich et al., Nature 303:821-825(1983) 참조. 다른 폴리뉴클레오티드와 교차-반응하지 않으면서 NGF mRNA와 특이적으로 결합할 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것은 일상적이다. 대표적인 표적화 부위에는 개시 코돈, 5' 조절 영역, 코딩 서열 및 3' 비번역 영역이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 10개 내지 100개의 뉴클레오티드, 약 15개 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 18개 내지 25개의 뉴클레오티드, 또는 그 이상이다. 올리고뉴클레오티드는 당업계에 주지된, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합 및 2'-O 당 변형과 같은 골격 변형을 포함할 수 있다. 대표적인 안티센스 분자에는 미국 공보 20010046959에 기술된 NGF 안티센스 분자가 포함된다; 또한 http://www.rna-tec.com/repair.htm. 참조).
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 기능적 NGF 수용체 (예컨대 TrkA 및/또는 p75)의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있는 1가지 이상의 안티-센스 분자를 포함한다. [Woolf et al., J. Neuroscie (2001) 21(3):1047-55]; [Taglialetela et al., J Neurochem (1996) 66(5):1826-35]. TrkA 및 p75의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있고, 공개적으로 입수가능한 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다.
별법적으로, NGF 발현 및/또는 방출 및/또는 NGF 수용체 발현이 유전자 녹다운, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi, 또는 리보자임, 당업계에 주지된 방법들을 사용하여 감소될 수 있다. 하기의 사이트를 참조한다.
http://www.macalester.edu/~montgomery/RNAi.html;
http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topicID=6.topic;
http://www.highveld.com/ribozyme.html.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 1가지 이상의 NGF 억제 화합물을 포함한다. 본원에 사용된 "NGF 억제 화합물"은 NGF 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거, 억제하거나, 중화시키거나 또는 폐지시키는, 항-NGF 항체 이외의 화합물을 지칭한다. NGF 억제 화합물은 하기 특성들 중 임의의 1가지 이상을 나타내야 한다: (a) NGF에 결합하고, NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 하류 경로를 억제함; (b) 임의 양상의 통증 (예컨대 골관절염 통증)을 예방하거나, 경감시키거나, 또는 치료함; (c) NGF 수용체 활성화 (TrkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화 포함)를 차단하거나 감소시킴; (d) NGF의 소거를 증가시킴; (e) NGF 합성, 생산 또는 방출을 억제 (감소)시킴. 대표적인 NGF 억제 화합물에는 미국 공보 20010046959에 기술된 소형 분자 NGF 억제제; PCT 공개 공보 WO 00/69829에 기술된 바와 같은, NGF가 p75에 결합하는 것을 억제하는 화합물; [Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310 (2):505-11 (2004)]에 기술된 바와 같은 PD90780 [7-(벤졸릴아미노)-4,9-디히드로-4-메틸-9-옥소-피라졸로[5,1-b]퀴나졸린-2-카르복실산]; PCT 공개 공보 WO 98/17278에 기술된 바와 같은, NGF가 TrkA 및/또는 p75에 결합하는 것을 억제하는 화합물이 포함된다. NGF 억제 화합물의 추가적인 예로는 PCT 공개 공보 WO 02/17914 및 WO 02/20479, 및 미국 특허 5,342,942; 6,127,401; 및 6,359,130에 기술된 화합물이 포함된다. 추가적인 대표적인 NGF 억제 화합물은 NGF의 경쟁적 억제제인 화합물이다. 미국 특허 6,291,247 참조. 또한, 당업자는 또다른 소형 분자 NGF 억제 화합물을 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, NGF 억제 화합물은 NGF에 결합한다. 대표적인 표적화(결합) 부위는 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체에 결합하는 NGF의 부분, 및 수용체-결합 영역에 인접하고 수용체-결합 부분의 정확한 3-차원 형상을 부분적으로 담당하는 NGF의 부분들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또다른 실시양태에서, NGF 억제 화합물은 NGF 수용체 (예컨대 TrkA 및/또는 p75)에 결합하여 NGF 생물학적 활성을 억제한다. 대표적인 표적화 부위는 TrkA 및/또는 p75의 NGF에 결합하는 부분들이다.
소형 분자를 포함하는 실시양태에서, 소형 분자는 분자량이 100 내지 20,000달톤, 500 내지 15,000 달톤, 또는 1000 내지 10,000 달톤 중 임의의 것일 수 있다. 소형 분자의 라이브러리가 시판된다. 흡입, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내 또는 피내를 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 소형 분자를 투여할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 NGF 길항제가 소형 분자인 경우, 이는 1회 내지 3회 이상의 용량으로 나뉘어서 환자의 체중 1 ㎏ 당 0.1 내지 300 ㎎의 비율로 투여될 것이다. 정상 체중의 성인 환자에 대해서, 용량 당 1 ㎎ 내지 5 g의 용량 범위가 투여될 수 있다.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 1가지 이상의 NGF 구조 유사체를 포함한다. 본 발명에서 "NGF 구조 유사체"는 NGF의 구조의 일부와 유사한 3-차원 구조를 갖고 시험관 내 또는 생체 내에서 생리학적인 조건 하에 NGF 수용체에 결합하고, 이때 결합이 NGF 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 억제하는 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, NGF 구조 유사체는 TrkA 및/또는 p75 수용체에 결합한다. 대표적인 NGF 구조 유사체로는 PCT 공개 공보 WO 97/15593에 기술된 2고리형 펩티드; 미국 특허 6,291,247에 기술된 고리형 펩티드; 미국 특허 6,017, 878에 기술된 고리형 화합물; 및 PCT 공개 공보 WO 89/09225에 기술된 NGF-유래 펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어 PCT 공개 공보 WO 98/06048에 기술된 방법에 의해, NGF-수용체 결합의 분자 모델링을 통해 적절한 NGF 구조 유사체가 또한 디자인 및 합성될 수 있다. NGF 구조 유사체는 단량체, 또는 개선된 친화력 및 생물학적 효과를 수득하기 위해 동일한 또는 상이한 구조물들이 임의로 바람직하게 조합된 이량체/올리고머일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체의 1가지 이상의 우성-음성 돌연변이체를 포함하는 NGF 길항제를 제공한다. 당업자는, 수용체가 NGF에 결합하여 NGF를 포획하는 "싱크(sink)"로서 작용하도록, 예를 들어, TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이체를 제조할 수 있다. 그러나, 우성-음성 돌연변이체는 NGF에 결합했을 때 TrkA 수용체의 정상적인 생활성을 갖지 않을 것이다. 대표적인 우성-음성 돌연변이에는 하기의 참고문헌에 기술된 돌연변이체들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 10884]; [Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123]; [Liu et al., J Neurosci 1997, 17, 8749]; [Klein et al., Cell 1990, 61, 647]; [Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963]; [Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975]; 및 [Lamballe et al., EMBO J 1993, 12, 3083] (각각의 이러한 참고문헌은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다). 우성-음성 돌연변이체는 단백질 형태로, 또는 우성-음성 돌연변이체, 예를 들어 돌연변이 TrKA 수용체가 생체 내에서 발현되도록 발현 벡터의 형태로 투여될 수 있다. 단백질 또는 발현 벡터는 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내, 피내, 또는 흡입과 같은 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여에는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국부적 투여가 포함되는 국소 또는 전신 투여가 포함된다. 당업자는 생체 내에서의 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471 참조.
또한, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술이, 예를 들어, [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202;] [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542]; [Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기술되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 ㎎의 DNA의 범위로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 500 ng 내지 약 50 ㎎, 약 1 ㎍ 내지 약 2 ㎎, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA의 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜 동안 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, [Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148] 참조). 내인성 포유류 또는 이종 프로모터를 이용하여 이같은 코딩 서열의 발현이 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성성이거나 또는 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 주지되어 있다. 대표적인 바이러스-기재 비히클에는 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 5,219,740; 4,777,127; 영국 특허 2,200,651; 및 유럽 특허 0 345 242 참조), 알파바이러스-기재 벡터 (예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 산림 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수알레 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 기술된 바와 같이 사멸 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
사멸 아데노바이러스에 연결되거나 단독으로 이에 연결되지 않은 다가양이온성 응축 DNA (예를 들어, [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조); 리간드-연결 DNA (예를 들어, [Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985] 참조); 진핵생물 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 5,814,482; PCT 공개 공보 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합이 포함되지만 이에 한정되지 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또한 사용될 수 있다. 대표적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 공보 WO 90/11092 및 미국 특허 5,580,859에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 5,422,120; PCT 공개 공보 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 특허 0524968에 기술되어 있다. 추가적인 접근법이 [Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581]에 기술되어 있다.
임의의 본원에 기술된 단백질-기재 NGF 길항제 (예를 들어, 항-NGF 항체, TrkA 면역부착소 등)의 발현을 지시하도록 발현 벡터가 사용될 수 있다는 것이 또한 명백하다. 예를 들어, NGF 및/또는 NGF 생물학적 활성을 차단 (부분 차단 내지는 완전 차단)할 수 있는 또다른 TrkA 수용체 단편이 당업계에 공지되어 있다.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 1가지 이상의 TrkA 면역부착소를 포함한다. 본원에 사용된 TrkA 면역부착소는 TrkA 수용체의 세포외 도메인과 면역글로불린 서열을 포함하는 가용성 키메라 분자를 지칭하고, 이는 TrkA 수용체의 결합 특이성을 보유하고 (trkA 수용체의 결합 특이성을 실질적으로 보유함), NGF에 결합할 수 있다.
TrkA 면역부착소는 당업계에 공지되어 있고, TrkA 수용체에 대한 NGF의 결합을 차단하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 미국 특허 6,153,189 참조. [Brennan et al.]은 수술-후 통증의 래트 모델에서의 TrkA 면역부착소의 투여를 보고하였다. [Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880 (1998)] 참조. 한 실시양태에서, TrkA 면역부착소는 NGF에 결합할 수 있는 TrkA 세포외 도메인으로부터의 TrkA 수용체 아미노산 서열 (또는 이들의 일부) (일부 실시양태에서는 TrkA 수용체의 결합 특이성을 실질적으로 보유하는 아미노산 서열)과 면역글로불린 서열의 융합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, TrkA 수용체는 인간 TrkA 수용체 서열이고, 융합물은 면역글로불린 불변 도메인 서열과의 융합물이다. 또다른 실시양태에서, 면역글로불린 불변 도메인 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열이다. 또다른 실시양태에서, 2개의 TrkA 수용체-면역글로불린 중쇄 융합물의 회합으로 (예를 들어, 디술피드 결합(들)에 의한 공유결합을 통해), 동종이량체성 면역글로불린-유사 구조가 초래된다. 면역글로불린 경쇄가 디술피드 결합된 이량체 내의 TrkA 수용체-면역글로불린 키메라 중 1개 또는 2개 모두와 추가로 회합되어, 동종삼량체성 또는 동종사량체성 구조가 산출될 수 있다. 적절한 TrkA 면역부착소의 예로는 미국 특허 6,153,189에 기술된 것들이 포함된다.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF와 TrkA 수용체의 물리적 상호작용 및/또는 하류 신호전달을 차단하고/하거나, 억제하고/하거나, 변경시키고/시키거나 감소시킬 수 있는 1가지 이상의 항-TrkA 항체를 포함하고, 이에 의해 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다. 항-TrkA 항체는 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 항-TrkA 항체에는 PCT 공개 공보 WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924 및 미국 공보 20010046959에 기술된 것들이 포함된다.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF와 p75 수용체의 물리적 상호작용 및/또는 하류 신호전달을 차단하고/하거나, 억제하고/하거나, 감소시킬 수 있는 1가지 이상의 항-p75 항체를 포함하고, 이에 의해 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다.
또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 TrkA 및/또는 p75 수용체 활성과 관련된 하류 키나제 신호전달을 억제할 수 있는 1가지 이상의 키나제 억제제를 포함한다. 대표적인 키나제 억제제는 K252a 또는 K252b이며, 이들은 당업계에 공지되어 있고, [Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992)]; [Knusel et al., J Neurochemistry 57:955-962 (1991)]; [Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988)]; [Hirata et al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135 요약 및 <12th Collective Chemical Substance Index>, p. 34237, c.3 (5-7), 55-60, 66-69), p. 34238, c.1 (41-44), c.2 (25-27, 32-33), p.3423, c.3 (48-50, 52-53) 참조]; 및 미국 특허 6,306,849에 기술되어 있다.
임상의의 조사에 의해 다수의 또다른 카테고리의 NGF 길항제가 확인될 것으로 예상된다.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 확인
항-NGF 길항제 항체가 포함되는 NGF 길항제를 NGF 생물학적 활성의 감소, 경감 또는 중화가 검출 및/또는 측정되는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 확인 또는 특성화할 수 있다. PCT WO 04/065560에 기술된 방법을 사용할 수 있다. 또다른 방법, 예를 들어, 미국 특허 5,766,863 및 5,891,650에 기술된 키나제 수용체 활성화 (KIRA) 분석법을 사용하여 항-NGF 작용제를 확인할 수 있다. 이러한 ELISA-유형 분석법은 수용체 단백질 티로신 키나제 (이후 "rPTK"), 예를 들어 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 자가인산화를 측정함으로써 키나제 활성의 정성적 또는 정량적 측정에 적절할 뿐만 아니라, 선택된 rPTK, 예를 들어 TrkA의 잠재적인 길항제의 확인 및 특성화에 적절하다. 첫번째 분석 단계에는 키나제 수용체, 예를 들어 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 인산화가 수반되는데, 이때 수용체는 진핵생물 세포의 세포 막 내에 존재한다. 수용체는 내인성 수용체, 또는 수용체를 코딩하는 핵산일 수 있거나, 또는 수용체 구축물이 세포 내로 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 세포가 고체 상에 부착되도록 제1 고체상 (예를 들어, 제1 분석 플레이트의 웰)이 이같은 세포 (일반적으로 포유동물 세포주)의 실질적으로 균질한 집단으로 코팅된다. 종종, 세포가 부착성이고, 따라서 제1 고체상에 자연적으로 부착된다. "수용체 구축물"이 사용되는 경우, 이는 키나제 수용체와 플래그(flag) 폴리펩티드의 융합물을 일반적으로 포함한다. 플래그 폴리펩티드는 분석법의 ELISA 부분에서, 포획제, 종종 포획 항체에 의해 인식된다. 그 후, 분석물, 예컨대 후보물 NGF 길항제 (항-NGF 길항제 항체 포함)이 부착성 세포가 있는 웰에 NGF와 함께 첨가하되어, 티로신 키나제 수용체 (예를 들어, TrkA 수용체)가 NGF 및 분석물에 노출된다 (또는 이와 접촉된다). 이러한 분석법은 TrkA가 이의 리간드인 NGF에 의해 활성화되는 것을 억제하는 길항제 (항체 포함)의 확인을 가능하게 한다. NGF 및 분석 대상 물질에 노출된 후, 부착 세포가 용해 완충제 (가용화 세제를 포함함) 및 부드러운 진탕을 이용하여 가용화됨으로써, 세포 용해물이 방출되고, 이는 농축 또는 정화될 필요 없이 분석법의 ELISA 부분에 직접 적용될 수 있다.
그 후, 이렇게 제조된 세포 용해질을 분석법의 ELISA 단계에 적용되도록 준비시킨다. ELISA 단계의 제1단계로서, 제2 고체 상 (일반적으로 ELISA 미량역가 플레이트의 웰)이 티로신 키나제 수용체, 또는 수용체 구축물의 경우 플래그 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 포획제 (종종 포획 항체)로 코팅된다. 제2 고체상의 코팅은 포획제가 2차 고체상에 부착하도록 수행된다. 포획제는 일반적으로 모노클로날 항체이지만, 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, 폴리클로날 항체가 또한 사용될 수 있다. 그 후, 수득된 세포 용해물을 부착된 포획제에 노출시키거나 이와 접촉시켜서, 수용체 또는 수용체 구축물을 제2 고체상에 부착시킨다 (또는 제2 고체 상 내에 포획시킨다). 그 후, 포획된 수용체 또는 수용체 구축물을 남기면서 결합되지 않은 세포 용해물이 제거되도록, 세정 단계가 수행된다. 그 후, 부착 또는 포획된 수용체 또는 수용체 구축물을 티로신 키나제 수용체 내의 인산화된 티로신 잔기를 확인하는 항-포스포티로신 항체에 노출시키거나 또는 이와 접촉시킨다. 한 실시양태에서, 항-포스포티로신 항체는 비-방사성 착색 시약의 색 변화를 촉매하는 효소에 접합된다 (직접 또는 간접적으로). 따라서, 수용체의 인산화를 후속적인 시약의 색 변화에 의해 측정할 수 있다. 효소가 항-포스포티로신 항체에 직접 접합될 수 있거나, 또는 접합 분자 (예를 들어, 비오틴)가 항-포스포티로신 항체에 접합될 수 있고, 이어서 효소가 접합 분자를 통해 항-포스포티로신 항체에 결합될 수 있다. 마지막으로, 포획된 수용체 또는 수용체 구축물에 대한 항-포스포티로신 항체의 결합이, 예를 들어, 착색 시약의 색 변화에 의해 결정된다.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 후보물 작용제를 NGF와 함께 인큐베이션하고, 하기 특성들 중 임의의 1가지 이상을 모니터링함으로써 또한 확인될 수 있다: (a) NGF에 결합하고, NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 하류 경로를 억제함; (b) NGF 수용체 활성화 (TrkA 이량체화 및/또는 자가인산화 포함)를 억제하거나, 차단하거나 감소시킴; (c) NGF의 소거를 증가시킴; (d) 임의 양상의 류머티스 관절염 통증 또는 골관절염 통증을 치료 또는 예방함; (e) NGF 합성, 생산 또는 방출을 억제 (감소)시킴. 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)는 후보물 작용제를 NGF와 함께 인큐베이션하고, 결합 및/또는 부수적인 NGF의 생물학적 활성의 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 분석은 정제된 NGF 폴리펩티드(들)를 사용하여, 또는 NGF 폴리펩티드(들)를 천연적으로 발현하거나 이를 발현하도록 형질감염된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 분석은 NGF 결합에 대하여 공지된 항-NGF 길항제 항체와 경쟁하는 후보물 작용제 (에컨대 항체)의 능력이 평가되는 경쟁적 결합 분석이다. 분석은 ELISA 포맷을 포함하여 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 후보물 작용제를 NGF와 함께 인큐베이션시키고, 결합 및 부수적인 trkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화 억제를 모니터링함으로써 확인된다.
최초의 확인 이후, 후보물 항-NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 활성이 표적화된 생물학적 활성을 테스트하는 것으로 공지된 생물학적 분석법에 의해 추가로 확인 및 정련될 수 있다. 별법적으로, 생물학적 분석법을 사용하여 후보물을 직접 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, NGF는 응답성 세포에서 다수의 형태학적으로 인지가능한 변화를 촉진한다. 이러한 변화에는 PC12 세포의 분화를 촉진하고 이러한 세포로부터의 신경돌기의 성장을 증강시키는 것 ([Greene et al., Proc Natl Acad Sci USA. 73(7):2424-8,1976]), 반응성 감각 및 교감 신경절의 체외이식으로부터 신경돌기 성장을 촉진함 ([Levi-Montalcini, R. and Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534-569, 1968]) 및 NGF 의존적 뉴런 예컨대 배아 후근 신경절, 삼차 신경절, 또는 교감 신경절 뉴런의 생존을 촉진하는 것 (예를 들어, [Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977)]; [Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993)])이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, NGF 생물학적 활성의 억제에 대한 분석은 NGF 응답성 세포를 NGF + 후보물 NGF 길항제 (항-NGF 길항제 항체 포함)와 같은 분석물과 함께 배양하는 것을 수반한다. 적합한 시간 후에, 세포 응답이 분석될 것이다 (세포 분화, 신경돌기 성장 또는 세포 잔존).
[Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)]에 기술된 바와 같은 배아 래트 후근 신경절 생존의 생물학적 분석법에서 NGF 매개 생존을 억제하는 후보물 작용제의 능력을 모니터링함으로써 NGF의 생물학적 활성을 차단하거나 중화하는 후보물 NGF 길항제 (항-NGF 길항제 항체 포함)의 능력이 또한 평가될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물
본 발명의 방법에 사용된 조성물 (류머티스 관절염 통증 및 골관절염 통증에 관련됨)은 유효량의 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 항체)를 포함하고, 일부 실시양태에서는 제약상 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 임의의 본원에 기술된 방법에서 사용된다. 이같은 조성물의 예, 뿐만 아니라 제형 방법이 상기 및 하기 섹션에 또한 기술된다. 한 실시양태에서 조성물은 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서 조성물은 1가지 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 NGF와 결합 (물리적으로 상호작용)하는 길항제 (예를 들어, 항체), NGF 수용체 (예컨대 TrkA 및/또는 p75 수용체)와 결합하는 길항제, 및 하류 NGF 수용체 신호전달을 감소 (저해 및/또는 차단)시키는 길항제 중 임의의 1가지 이상으로부터 선택된 1가지 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 TrkA 면역부착소가 아닌 (즉, TrkA 면역부착소 이외의 것인) 임의의 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 항-NGF 항체 이외의 것인 임의의 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 TrkA 면역부착소 이외의 것이고 항-NGF 항체 이외의 것인 임의의 NGF 길항제를 포함한다. 또다른 실시양태에서 NGF 길항제는 NGF 합성, 생산 또는 방출을 억제한다 (감소시킨다). 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하고, 관련된 뉴로트로핀 (NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과 현저하게 교차반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 유해한 면역 응답과 관련되지 않는다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대해 지시된 안티-센스 분자 (NGF를 코딩하는 핵산에 대해 지시된 안티-센스 분자 포함), NGF 수용체 (예컨대 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)에 대해 지시된 안티-센스 분자, NGF 억제 화합물, NGF 구조 유사체, NGF에 결합하는 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간 NGF를 인식한다. 일부 실시양태에서 항-NGF 항체는 인간 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간화 항체 (예컨대 본원에 기술된 항체 E3)이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 원치 않는 또는 바람직하지 않은 면역 응답, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 유발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 실시양태에서는 E3로부터의 6개 CDR 전부).
조성물이 1가지를 초과하는 NGF 길항제를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 조성물은 한 클래스의 NGF 길항제의 1가지를 초과하는 구성원 (예를 들어, NGF의 상이한 에피토프를 인식하는 항-NGF 항체들의 혼합물), 뿐만 아니라 여러 클래스의 NGF 길항제의 구성원 (예를 들어, 항-NGF 항체 및 NGF 억제 화합물)을 포함할 수 있다. 또다른 대표적인 조성물은 동일한 에피토프(들)을 인식하는 1가지를 초과하는 항-NGF 항체, NGF의 상이한 NGF 에피토프에 결합하는 여러 종의 항-NGF 항체, 또는 상이한 NGF 억제 화합물을 포함한다.
본 발명에서 사용된 조성물은, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]). 제약상 허용가능한 부형제는 하기에 추가로 기술된다.
또한 NGF 길항제 및 이의 조성물은 작용제의 유효성을 증강시키고/시키거나 보완하는 작용을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다. 골관절염 통증에 대해, NGF 길항제는 1가지 이상의 또다른 진통제, NSAIDS, 또는 스테로이드와 함께 투여될 수 있다. 진통제에는 아세트아미노펜, 트라마돌, 캅사이신 (국부용)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. NSAIDS의 예는 아스피린이 포함되는 아세틸화 살리실레이트; 살살레이트, 디프루니살이 포함되는 비-아세틸화 살리실레이트; 에토돌락, 디클로페낙, 인도메타신, 케토롤락, 나부메톤이 포함되는 아세트산; 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 나프록센 소듐, 옥사프로진이 포함되는 프로피온산; 메클로페나메이트, 메페남산이 포함되는 페나메이트; 페닐부타존, 피록시캄; 셀레콕십, 에토리콕십, 발데콕십, 로페콕십, 루미라콕십이 포함되는 COX-2 억제제이다. 스테로이드의 예는 관절내 코르티코스테로이드 (IAC)이다.
류머티스 관절염 통증의 치료를 위해, NGF 길항제는 1가지 이상의 다른 진통제, NSAIDS, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손), 또는 기타 질환 변형 항-류머티스 약물과 함께 투여될 수 있다. 질환 변형 항-류머티스 약물의 예는 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 레플루노미드, TNF 억제제, 가용성 인터류킨-1 수용체, 금-접합체, 세포독성제 (아자티프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A)이다.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 투여
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 임의의 적절한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다 (류머티스 관절염 및 골관절염에 대해). 본원에 기술된 예는 이용가능한 기술을 제한하도록 의도되지 않고 이용가능한 기술의 실례라는 것이 당업자에게 명백하여야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여 (예를 들어 볼루스(bolus)로서 또는 경시적인 연속 주입에 의해), 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 설하, 윤활액내, 통기, 경막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 개체에게 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어, 정맥내 투여일 수 있거나, 국소화될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기가 포함되는, 시판되는 액체 제형용 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 직접 분무될 수 있고, 동결건조된 분말이 재구성 후 분무될 수 있다. 별법적으로, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 탄화불소 제형 및 계량 용량 흡입기를 이용하여 에어로졸화될 수 있거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
한 실시양태에서, NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)는 부위-지정 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-지정 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예로는 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 다양한 이식성 저장소 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 내재 카테터, 또는 침 카테터, 합성 그래프트, 외피 랩(adventitial wrap), 션트(shunt) 및 스텐트(stent) 또는 기타 이식가능한 장치, 부위 지정 담체, 직접 주입, 또는 직접 적용이 포함된다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 00/53211 및 미국 특허 5,981,568 참조.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)의 다양한 제형이 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)는 순수하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체) 및 제약상 허용가능한 부형제는 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 제약상 허용가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는, 비교적 비활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태나 조도를 제공할 수 있나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적절한 부형제로는 안정화제, 습윤화 및 유화제, 오스몰농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증강제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 부형제, 뿐만 아니라 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제형이 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 작용제들은 주사 (예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여에 대하여 제형된다. 따라서, 이러한 작용제들은 제약상 허용가능한 비히클 예컨대 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시간조절 및 반복은 특정 개체 및 이러한 개체의 병력에 좌우될 것이다.
항-NGF 항체는 주사 (예를 들어, 복막내, 정맥내, 피하, 근육내 등)을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또한 항-NGF 항체는, 본원에 기술된 바와 같이, 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-NGF 항체의 투여를 위해, 최초의 후보물 투여량은 약 2 ㎎/㎏일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급된 인자들에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 3 ㎍/㎏ 내지 30 ㎍/㎏ 내지 300 ㎍/㎏ 내지 3 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상 중 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 항-NGF 항체는 약 1 ㎍/㎏, 약 10 ㎍/㎏, 약 20 ㎍/㎏, 약 50 ㎍/㎏, 약 100 ㎍/㎏, 약 200 ㎍/㎏, 약 500 ㎍/㎏, 약 1 ㎎/㎏, 또는 약 2 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라서, 원하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 통증이 감소될 때까지 치료가 지속된다. 대표적인 투여 요법은 약 2 ㎎/㎏의 최초 투여 후, 항-NGF 항체를 약 1 ㎎/㎏의 지속 용량으로 매주 투여하는 것 또는 약 1 ㎎/㎏의 지속 용량으로 격주로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 실행자가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라, 또다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 일주일에 1-4회 투여하는 것이 고려된다. 덜 빈번한 투여가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 2주에 한번, 3주에 한번, 4주에 한번, 5주에 한번, 6주에 한번, 7주에 한번, 8주에 한번, 9주에 한번, 10주에 한번, 15주에 한번, 20주에 한번, 25주에 한번 또는 그 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 1개월에 한번, 2개월에 한번, 3개월에 한번, 4개월에 한번, 5개월에 한번, 6개월에 한번 또는 그 이상으로 투여된다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여량 요법 (사용된 NGF 길항제(들) 포함)은 경시적으로 변할 수 있다.
무릎의 골관절염으로 인한 중간 내지 심한 통증이 있는 환자에서 수행된 연구 (실시예 9에 요약됨)는 3 내지 300 ㎍/㎏ 범위의 투여량이 다양한 기간 동안 통증 해소를 제공하였음을 나타냈다. 테스트된 모든 투여량 (3, 10, 30, 100, 및 300 ㎍/㎏)이 적어도 7일 동안 통증 감소를 일으켰다; 더 높은 투여량으로는 28일 이상으로 통증 해소가 연장되었다 (도 24). 100 ㎍/㎏의 용량은 80일 이상의 통증 해소를 일으켰다 (도 25).
일반적으로, 항체가 아닌 경우, NGF 길항제는 (일부 실시양태에서) 1회 내지 3회의 용량으로 나뉘어서 환자의 체중 1 ㎏ 당 약 0.1 내지 300 ㎎의 비율로, 또는 본원에 개시된 바와 같이, 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자에 대해, 약 0.3 내지 5.00 ㎎/㎏ 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시간조절 및 반복은 특정 개체 및 이러한 개체의 병력, 뿐만 아니라 개별적인 작용제의 성질 (예컨대 작용제의 반감기, 및 당업계에 주지된 기타 고려사항)에 좌우될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, NGF 길항제 (항-NGF 길항제 항체 포함)의 적합한 투여량은 사용된 NGF 길항제 (또는 이의 조성물), 치료될 통증의 유형 및 중증도, 작용제가 예방 또는 치료의 목적으로 투여되는지 여부, 사전 요법, 환자의 병력 및 작용제에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료의 진행에 따라서 변할 수 있다.
반감기와 같은 실험적인 고려사항이 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격되는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법의 진행에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 통증의 치료 및/또는 억제 및/또는 경감 및/또는 지연을 기초로 한다. 별법적으로, NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 지속적인 연속 방출 제형이 적합할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 투여량은 NGF 길항제가 1회 이상 투여된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체에게 증가되는 투여량의 NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)를 제공한다. NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 효능을 평가하기 위해, 통증의 지표가 이어질 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 당업자에게 공지된 기타 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 투여는 미리 선택된 기간의 시간에 걸쳐서 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 간격을 둔 투여일 수 있는데, 예를 들어 통증 발생 전, 동안 또는 후; 통증 발생 전; 통증 발생 동안; 통증 발생 전 및 후; 통증 발생 동안 및 후; 통증 발생 전 및 동안; 또는 통증 발생 전, 동안 및 후일 수 있다.
일부 실시양태에서, 1가지를 초과하는 NGF 길항제, 예컨대 항-NGF 길항제 항체가 존재할 수 있다. 1가지 이상, 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 또는 이를 초과하는 상이한 NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이러한 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)들은 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는다. 또한 NGF 길항제는 작용제의 유효성을 증강시키고/시키거나 보완하는 작용을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 NGF 길항제 (예를 들어 항-NGF 길항제 항체)의 치료적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 NGF 길항제 (예를 들어, 항체)를 선택적인 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트리할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸린 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체)를 함유하는 리포솜은 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포솜이미국 특허 5,013,556에서 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로의 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜이 한정된 구멍 크기의 필터를 통과하여 압출되어, 원하는 직경의 리포솜이 산출된다.
또한 활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적절한 예로는 길항제 (예컨대 항체)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 7-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제형은 무균성이어야 한다. 이는, 예를 들어, 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 NGF 길항제 (예를 들어, 항-NGF 길항제 항체) 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트가 있는 컨테이너, 예를 들어 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여를 위하여, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌약과 같은 단위 투여 제형일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어, 통상적인 정제화 성분 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산2칼슘 또는 검, 및 기타 제약 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 비-독성인 이의 제약상 허용가능한 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물이 형성된다. 이러한 예비제형 조성물을 균질한 것으로 지칭하는 경우, 이는 조성물이 동일하게 효과적인 단위 투여 제형 예컨대 정제, 알약 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균등하게 분산된 것을 의미한다. 그 후, 이러한 고체 예비제형 조성물이 0.1 내지 약 500 ㎎의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기술된 유형의 단위 투여 제형으로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환약이 코팅되거나 또다른 방식으로 조제되어, 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 제형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 이때 후자는 전자를 덮어싸는 형태이다. 위에서의 붕해를 저지하는 작용을 하고, 내부 성분이 손상되지 않은 채로 십이지장 내로 통과하도록 하거나 이의 방출이 지연되도록 작용하는 장용성 층에 의해 두 성분이 분리될 수 있다. 다양한 재료가 이같은 장용성 층 또는 코팅물에 사용될 수 있고, 이같은 재료에는 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 재료의 혼합물이 포함된다.
적절한 계면활성제로는, 특히, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, Tween™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄 (예를 들어, Span™ 20, 40, 60, 80 또는 85)이 포함된다. 계면활성제를 포함하는 조성물은 간편하게는 0.05 내지 5％ 계면활성제를 포함할 것이며, 0.1 내지 2.5％일 수 있다. 필요하다면, 또다른 성분, 예를 들어, 만니톨 또는 기타 제약상 허용가능한 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
적절한 에멀션은 Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ 및 Lipiphysan™과 같은 시판되는 지방 에멀션을 이용하여 제조될 수 있다. 미리 혼합된 에멀션 조성물에 활성 성분이 용해될 수 있거나, 또는 별법적으로 활성 성분이 오일 (예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유)에 용해되고, 인지질 (예를 들어, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합 시 에멀션이 형성될 수 있다. 에멀션의 등장성을 조정하기 위해, 또다른 성분, 예를 들어, 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 적절한 에멀션은 전형적으로 20％ 이하의 오일, 예를 들어 5 내지 20％를 함유할 것이다. 지방 에멀션은 0.1 내지 1.0 ㎛, 특히 0.1 내지 0.5 ㎛의 지방 액적을 포함할 수 있고, pH는 5.5 내지 8.0의 범위일 수 있다.
에멀션 조성물은 NGF 길항제 (예컨대 신경 성장 인자 항체)를 Intralipid™ 또는 이의 성분 (대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 통기용 조성물은 제약상 허용가능한 수성 또는 유기 용매 또는 이의 혼합물 내의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같은 적절한 제약상 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소적 또는 전신적 효과를 위해 경구 경로 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여될 수 있다. 무균성인 것이 바람직한 제약상 허용가능한 용매내의 조성물이 기체를 이용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 또는 분무 장치가 안면 마스크, 텐트 또는 간헐성 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물이, 바람직하게는 경구적으로 또는 비강을 통해, 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 투여될 수 있다.
치료 효능은 당업계에 주지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 항체 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트
본 발명은 또한 검출 및/또는 치료에서 사용하기 위한 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키트를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 키트는 항체 E3를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 임의의 본원에 기술된 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 양상에서, 키트는 통증 (수술 후 통증, 류머티스 관절염 통증, 및 골관절염 통증을 포함)이 있는 개체를 치료하는 것을 예를 들어 포함하는, 임의의 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 적절한 포장물로 존재하고, 임의의 본원에 기술된 방법에서의 항체의 사용에 대한 사용설명서 및 완충제와 같은 추가적인 성분을 선택적으로 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 통증 치료를 위한 사용설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 항-NGF 길항제 항체 및 개체에서 류머티스 관절염 통증을 치료 및/또는 예방하기 위한 사용설명서를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 NGF 길항제 (예컨대 항-NGF 길항제 항체) 및 개체에서 골관절염 통증을 치료 및/또는 예방하기 위한 사용설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 항체 E3이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 E3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 임의의 본원에 기술된 방법에서의 폴리뉴클레오티드의 사용에 대한 사용설명서를 추가로 포함한다.
항체의 친화력을 조정하는 방법 및 CDR을 특성화하는 방법
본 발명자들은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 명명된, 항체의 CDR을 특성화하고/하거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화력을 변경 (예컨대 개선)시키는 신규 방법을 개발하였다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 하기와 같이 작용한다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치가 당업계에 인지된 방법을 사용하여 2개 또는 2개 초과 (예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나), 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 위치마다 치환되는 경우). 일반적으로, 라이브러리는 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 또한 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복잡성에 따라 좌우됨)을 표적 폴리펩티드에 대한 결합 친화력에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가되었거나, 감소되었거나 또는 없는 후보물을 확인한다. 결합 친화력을 결정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 일부 실시양태에서, 약 2배 이상의 결합 친화력의 차이를 검출하는 BIAcore 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 결합 친화력이 결정된다. BIAcore는 출발 항체가 비교적 높은 친화력, 예를 들어 약 10 mM 이하의 KD로 결합하는 경우 특히 유용하다. BIAcore 표면 플라스몬 공명을 이용하는 스크리닝이 본원의 실시예에 기술된다.
또다른 실시양태에서, 키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 섬광 근접 분석법, ELISA, ORIGEN 면역분석법 (IGEN), 형광 켄칭(quenching), 형광 전이, 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결합 친화력을 결정할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 적절한 생물학적 분석을 이용하여 결합 친화력이 스크리닝된다.
일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치가 당업계에 인지된 돌연변이유발 방법 (이중 일부가 본원에 기술됨)을 이용하여 모든 20가지의 천연 아미노산으로 대체된다 (일부 실시양태에서, 한번에 하나씩). 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나), 각각은 20개 구성원의 복잡성을 갖는다 (모두 20가지의 아미노산이 위치마다 치환되는 경우).
일부 실시양태에서, 스크리닝되는 라이브러리는 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 내에 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 라이브러리는 하나의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상 위치에서의 치환을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 라이브러리는 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 위치에서의 치환을 포함하는데, 상기 치환은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR에서 발견된다. 일부 실시양태에서, 낮은 중복(redundancy) 코돈을 이용하여 치환이 제조된다. 예를 들어, [Balint et al., (1993) Gene 137 (1):109-18)]의 표 2 참조.
일부 실시양태에서, CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3이다. 또다른 실시양태에서, CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및/또는 CDRH3 중 1개 이상이다. 일부 실시양태에서, CDR은 캐벗 CDR, 코티아 CDR, 또는 확장된 CDR이다.
결합이 개선된 후보물을 서열분석함으로써, 개선된 친화력이 초래되는 CDR 치환 돌연변이체 ("개선된" 치환으로 또한 명명됨)가 확인될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 이러한 방법을 사용하는 것은, 동일한 아미노산 위치에서의 추측된 18개의 다른 치환으로는 결합이 초래되지 않는 경우에도 (즉, 항체 기능의 상실), 결합을 개선시키는 단일한 치환을 확인하도록 한다. 결합하는 후보물을 또한 서열분석함으로써, 결합이 유지되는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 여러 라운드의 스크리닝이 수행된다. 예를 들어, 결합이 개선된 후보물 (각각 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함함)은 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR 내의 아미노산 위치)에서 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 적어도 함유하는 함유하는 2차 라이브러리의 디자인에 또한 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선별이 하기에 추가로 논의된다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은, 결합이 개선되었거나, 동일하거나, 감소되었거나 없는 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관련된 정보를 제공하는 한, CDR을 특성화하는 수단을 또한 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20가지의 아미노산으로 변화되었을 때 결합을 유지한다면, 상기 위치는 항원 결합에 있어서 필요할 것 같지 않은 위치로 확인된다. 반대로, 만일 CDR의 한 위치가 적은 백분율의 치환에서만 결합을 유지한다면, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법으로 다수의 상이한 아미노산 (모든 20가지의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보가 생성된다. 이러한 양상은 실시예 1에 논의 및 예시된다.
일부 실시양태에서, 친화력이 개선된 후보물들이 2차 라이브러리 내에 조합되는데, 2차 라이브러리는 이러한 위치에서의 개선된 아미노산, 원래의 아미노산을 포함하고, 원하는 스크리닝 또는 선별 방법을 사용하여 허용된, 또는 원하는 라이브러리의 복잡성에 따라, 이러한 위치에서의 추가적인 치환을 더 포함할 수 있다. 또한, 원한다면, 인접 아미노산 위치가 적어도 2가지 이상의 아미노산으로 무작위화될 수 있다. 인접 아미노산의 무작위화는 돌연변이 CDR에서의 추가적인 입체형상적 유연성을 허용할 수 있고, 이어서 이러한 유연성은 더 많은 수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 첫번째 스크리닝 라운드에서 개선된 친화력을 나타내지 않은 위치에서의 치환을 또한 포함한다.
BIAcore 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하는 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이가 포함되는 당업계에 공지된 임의의 선별 방법을 사용하는 선별이 포함되는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 결합 친화력이 개선되었고/되었거나 변경된 라이브러리 구성원에 대해 2차 라이브러리가 스크리닝 또는 선별된다.
항체의 친화력을 조정하고 CDR을 특성화하는 방법의 이점
상기 방법은 결합을 개선 또는 유지시키는 아미노산 치환을 확인하기 위해 CDR 아미노산 위치를 예비-스크리닝하는데 유용하다. 중요한 잔기, 결합을 개선시키는 치환 및/또는 항체 기능을 유지시키는 치환의 의 예비-확인은 친화력 성숙 라이브러리가 효율적으로 디자인 및 스크리닝되도록 한다.
본 방법은 CDR을 특성화하는데 또한 유용하고, 항원에 결합하는 것에 대한 CDR 내의 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 포괄적인 정보를 제공한다. 본 발명은 결합을 개선시키는 치환을 확인하는데 또한 사용될 수 있다.
각 위치가 무작위화 (일부 실시양태에서, 한번에 하나씩)될 수 있는 소형 라이브러리를 사용하는 것은 상세한 동력학 정보를 제공하는 BIAcore와 같은 민감한 방법을 이용하여 치환 돌연변이체가 스크리닝되도록 한다. 스크리닝 방법은 대형 라이브러리가 스크리닝되는 경우 일반적으로 비실용적이다. 대신, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이와 같은 선별 방법이 결합이 유지된 클론을 확인하는데 통상적으로 사용된다. 파지 디스플레이 및 ELISA 분석법은 클론으로부터 제조된 단백질 샘플의 농도에 크게 좌우될 수 있고, 따라서 결합 친화력이 증가된 클론을 확인하기보다는, 발현이 증가되었거나, 안정성이 증가되었거나 또는 독성이 감소된 클론을 향해 크게 편향되는 경향이 있다. 또한, 클론의 발현 수준에서의 차이가 결합 친화력에서의 소규모 개선을 차폐할 수 있다. 이러한 단점은 결합 친화력이 높은 항체가 출발 물질로 사용되는 경우에 특히 심각한데, 이는 스크리닝이 충분히 엄격하도록 하기 위해 매우 낮은 수준의 항원이 사용되어야 하기 때문이다.
반대로, 본 발명의 방법, 예컨대 각 위치에서의 무작위화 (일부 실시양태에서, 한번에 한 위치씩)는 소정의 위치에서 예를 들어 모든 20가지의 아미노산의 치환의 도입 및 치환 효과의 특성화를 허용한다. 이러한 분석법은 소정의 위치에서 얼마나 많은 치환이 허용 (즉, 항체 결합 유지)되는지에 관한 정보를 제공하고, 차례로 이러한 정보는 항체 기능에 대한 각각의 아미노산의 중요성에 관한 정보를 제공한다. 또한, 개선된 결합이 초래되는 치환이, 소정의 위치에서의 다수의 또는 대부분의 치환으로 비-기능적 (비-결합) 항체가 초래되는 상황에서도, 확인될 수 있다. 반대로, 중요한 CDR 위치를 확인하는데 통상적으로 사용되는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발은 알라닌 치환이 결합을 허용하는지 또는 방해하는지 여부에 관한 정보를 제공한다. 일반적으로, 알라닌 치환이 결합을 방해하는 위치는 친화력 돌연변이 라이브러리로부터 제거된다. 그러나, 다수의 경우에, 알라닌은 CDR 위치에서 불량한 치환일 수 있다.
본 방법은 단일 CDR 돌연변이의 확인 및 이의 효과의 특성화를 또한 허용한다. 반대로, 파지 디스플레이와 같은 방법에서는 다수의 돌연변이가 동시에 도입 및 선별되고, 따라서 양성 돌연변이가 특정 클론 내에 존재하는 해로운 돌연변이의 존재에 의해 차폐될 위험이 잠재적으로 증가된다.
본 방법이 개선된 결합 친화력을 초래하는 적은 수의 돌연변이 (예를 들어, 단일 CDR 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 돌연변이)의 확인을 허용하는 한, 본 방법은 원래의 (출발) 항체의 결합 특이성을 유지시키면서 친화력을 개선시키는데 또한 유용하다. 반대로, 파지 디스플레이와 같은 방법은 전형적으로 한번에 다수의 돌연변이를 이용하여 결합 친화력을 개선시키고, 이는 항체의 특이성을 변화시키고/시키거나 원치 않는 교차-반응성을 증가시키는 결과를 초래할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만, 이를 한정하지는 않는다.
실시예
실시예 1: 마우스 길항제 항-NGF 항체 911의 인간화 및 친화력 성숙
A. 일반적인 방법
하기의 일반적인 방법을 본 실시예에서 사용하였다.
라이브러리 생성
[Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press] (pp. 277-291 참조)에 기술된 바와 같은 축퇴성 올리고뉴클레오티드로의 PCR 카세트 돌연변이에 의해 라이브러리가 생성되었다. 도핑(doping) 코돈 NNK를 사용하여, 한 아미노산의 위치를 20가지의 가능한 아미노산이 포함되도록 무작위화시켰다. 한 아미노산의 위치를 특정한 성질이 있는 아미노산의 부분집합만을 포함하도록 무작위화시키기 위하여, [Balint et al, (1993) Gene 137(1):109-18]에 기술된 바와 같이 도핑 코돈이 사용되었다. [Innis et al, (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications] (pp. 177-183 참조)에 기술된 바와 같이 재조합 PCR을 사용하여 부위 지정 돌연변이유발을 수행하였다.
소규모 Fab 제조
96웰 플레이트에서의 소규모 발현이 Fab 라이브러리 스크리닝에 대해 최적화되었다. Fab 라이브러리로 형질전환된 대장균으로부터 시작하여, 콜로니를 피킹(picking)하여 마스터 플레이트 (한천 LB + 앰피실린 (50 ㎍/㎖) + 2％ 글루코스) 및 작업 플레이트 (2 ㎖/웰, 96웰; 1.5 ㎖의 LB + 앰피실린 (50 ㎍/㎖) + 2％ 글루코스를 함유하는 플레이트) 모두에 접종하였다. 양쪽 모두의 플레이트를 30℃에서 8-12시간 동안 성장시켰다. 마스터 플레이트는 4℃에 보관하고, 작업 플레이트로부터의 세포를 5000 rpm에서 펠렛화시키고, 1 ㎖의 LB + 앰피실린 (50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG로 재현탁시켜, Fab의 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간 발현시킨 후, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 이어서 500 ㎕의 HBS-EP 완충제 (100 mM HEPES 완충제 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.005 ％ P20, 3 mM EDTA)에 재현탁시켰다. HBS-EP에 재현탁된 세포의 용해가 동결 (-80℃) 후 37℃에서의 해동의 1회 사이클에 의해 달성되었다. 세포 용해물을 30 분 동안 5000 rpm에서 원심분리하여 Fab를 함유한 상청액으로부터 세포 잔해물을 분리하였다. 그 후, 상청액을 BIAcore 플라즈몬 공명 장치에 주입하여 각각의 Fab의 친화력 정보를 수득하였다. DNA 서열 분석, 및 하기에 기술된 바와 같은 대규모 Fab 생산 및 상술된 특성화를 위해서, Fab를 발현하는 클론을 마스터 플레이트로부터 구출하였다.
대규모 Fab 제조
상세한 동력학 파라미터를 수득하기 위해, 대형 배양물로부터 Fab가 발현되어 정제되었다. 200 ㎖의 LB + 앰피실린 (50 ㎍/㎖) + 2％ 글루코스를 함유하는 삼각 플라스크에 선별된 Fab-발현 대장균 클론으로부터의 하룻밤 배양물 5 ㎖를 접종하였다. 클론을 OD550 nM 1.0이 달성될 때까지 30℃에서 인큐베이션한 후, 배지를 200 ㎖의 LB + 앰피실린 (50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG로 대체함으로써 유도시켰다. 30℃에서 5시간 동안 발현시킨 후, 원심분리에 의해 세포를 펠렛화시키고, 이어서 10 ㎖ PBS (pH 8)에 재현탁시켰다. 동결/해동 (각각 -80℃ 및 37℃에서)의 2회 사이클에 의해 세포의 용해가 수득되었다. 세포 용해물의 상청액을 PBS (pH 8)로 평형화된 Ni-NTA 수퍼플로우(superflow) 세파로스 (Qiagen, Valencia. CA) 컬럼에 로딩한 후, 5배 부피의 PBS (pH 8)로 세정하였다. 각각의 Fab가 상이한 분획의 PBS (pH 8) + 300 mM 이미다졸로 용출되었다. Fab를 함유한 분획을 풀링(pooling)하고, PBS에서 투석한 후, 친화력 특성화 전에 ELISA로 정량하였다.
전장 항체 제조
전장 항체의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 2가지 포유류 발현 벡터 (경쇄용 Eb.911.E3 또는 Eb.pur.911.3E, 및 중쇄용 Db.911.3E; 본원에 기술됨)에서 클로닝하고, 일시적인 발현을 위해 HEK 293 세포 내로 리포펙테민을 사용하여 형질감염시켰다. 표준 방법을 사용하여, 단백질 A를 사용하여 항체를 정제하였다.
Biacore 분석법
항-NGF Fab 및 모노클로날 항체의 친화력을 BIAcore3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 (BIAcore, INC, Piscaway NJ)을 사용하여 결정하였다. CM5 칩을 제조업자의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. 인간 NGF를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.0)으로 희석하고, 0.005 ㎎/㎖의 농도로 활성 칩에 주입하였다. 각각의 칩 채널을 가로지르는 가변성 유동 시간을 이용하여, 2가지 범위의 항원 밀도가 달성되었다: 상세한 동력학 연구용의 100-200 응답 유닛 (RU) 및 스크리닝 분석용 500-600 RU. 칩을 에탄올아민으로 차단하였다. 재생 연구는 Pierce 용출 완충제 (제품 번호 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) 및 4M NaCl (2:1)의 혼합물이 200회가 넘는 주입에 대하여 칩 상의 hNGF의 활성을 유지시키면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다는 것을 나타냈다. HBS-EP 완충제 (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ 계면활성제 P29)가 모든 BIAcore 분석법용 러닝 완충액으로서 사용되었다.
스크리닝 측정법
라이브러리로부터의 Fab 클론의 친화력을 결정하도록 스크리닝 BIAcore 측정법이 최적화되었다. 소형 배양 용해물의 상청액을 2 분 동안 50 ㎕/분으로 주입하였다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 단일한 지수 해리 속도 (koff)을 측정하는데 10 내지 15 분의 해리 시간이 사용되었다. 라이브러리를 생성시키는데 사용된 주형 (클론 8L2-6D5, koff 1×10-3 s-1)과 동일한 범위의 koff 속도를 나타낸 샘플을 확인용으로 주입하고, 더 양호한 koff 값이 수득되도록 45 분까지의 해리 시간이 허용되었다. 개선된 (더 느린) koff 값을 나타내는 클론이 대규모로 발현되었고, 전체적인 동력학 파라메터 kon 및 koff가 정제된 단백질 상에서 결정되었다. 이러한 분석법으로 약 2배 이상인 친화력에서의 차이를 검출할 수 있었다.
친화력 결정 측정법
정제된 Fab 샘플의 일련의 희석물 (0.1-10× 추정 KD)을 1분 동안 100 ㎕/분으로 주입하였고, 최대 2시간의 해리 시간이 허용되었다. 공지된 농도 (아미노산 분석에 의해 결정됨)의 Fab를 기준으로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기천공에 의해 Fab 단백질의 농도가 결정되었다. BIAevaluation 프로그램을 이용하여 데이타를 1:1 Langmuir 결합 모델 ([Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6. 99-110])에 핏팅시킴으로써 동력학 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)가 동시에 수득되었다. 평형 해리 상수 (KD) 값은 koff/kon으로 계산되었다.
B. 마우스 길항제 항-NGF 항체 911의 인간화 및 친화력 성숙
마우스 길항제 항-NGF 항체 911 ([Hongo et al, (2000) Hybridoma 19(3):215-227] 참조)이 인간화 및 친화력 성숙에 대해 선별되었다. Mab 911은 높은 친화력으로 인간 및 래트 NGF에 결합하고, 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 또는 BDNF와 현저한 교차반응성을 나타내지 않는다. [Hongo, 동일 문헌] 참조. 상기 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법을 사용하여 마우스 Mab 911의 파파인-절단 Fab 단편의 친화력을 결정하였다. 마우스 Mab 911의 파파인-절단 Fab 부분은 약 10 nM의 KD로 인간 NGF에 결합하였다.
인간화 및 친화력 성숙을 하기와 같이 여러 단계로 수행하였다:
(1) CDR-그래프트 주형의 제조. 항체 911의 확장된 경쇄 CDR (즉, 캐벗 및 코티아 CDR 영역 모두 포함함)을 JK2와 함께 인간 생식계열(germline) 수용체 서열 O8에 그래프트시키고, 항체 911의 확장된 중쇄 CDR을 JH4와 함께 인간 생식계열 수용체 서열 VH4-59에 그래프트시켰다. 인간 생식계열 수용체 서열의 아미노산 서열이 도 1A 및 1B에 제시된다. 아미노산 번호매김은 순차적이다. 상기에 언급된 단백질 프레임워크를 사용하여, 마우스 CDR과 함께 인간 프레임워크를 코딩하는 합성 유전자에 대해 DNA 서열을 디자인하였다. 이러한 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 hVH 및 hVL로 각각 명명하였다. 코돈은 대장균 및 햄스터 사용용으로 최적화되었다. 전체 길이의 hVL 및 hVH에 확장된 여러 중첩 올리고뉴클레오티드 (염기 69-90개의 길이)를 각각의 사슬에 대한 2개의 짧은 플랭킹(flanking) 프라이머와 함께 사용하여, 본질적으로 [Prodromou et al, (1992) Protein Eng 5(8):827-9]에 기술된 바와 같은 재귀적 PCR에 의해 2개의 유전자를 별도로 합성하였다. 정확한 길이의 생성된 DNA 단편을 젤 정제한 후, 대장균 2시스트론성(bicistronic) 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. 항체의 발현은 [Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press] (p. 2.10의 Vector pComb3X 참조)에 기술된 것과 유사하게 IPTG 유도성 lacZ 프로모터의 제어 하에 놓였지만, 하기의 추가적인 도메인의 부가 및 발현이 변형에 포함되었다; 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (GenBank 접속 번호 CAA09181 참조) 및 IgG2a 인간 면역글로불린의 CHI 불변 도메인 (GenBank 접속 번호 P01859).
8L2-4D5로 명명된, CDR-그래프트 항체 ("주형"으로 또한 명명됨)의 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1A 및 1B에 또한 제시된다. 상기 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법을 사용하여 8L2-4D5의 친화력을 결정하였다. 8L2-4D5는 약 38 nM의 KD로 인간 NGF에 결합하였다.
(2) 점 돌연변이의 프레임워크 서열 내로의 도입. [Innis et al, (1995) PCR strategies, San Diego, Academic press]에 기술된 바와 같은 재조합 PCR 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 V71K 치환을 CDR-그래프트 중쇄 내로 도입하였다. 이러한 치환은 인간 프레임워크 잔기를 상응하는 마우스 프레임워크 잔기로 대체시킨다. 생성된 항체를 8L2-6D5로 명명하였고, 8L2-6D5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1A에 제시된다. 상기 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법을 사용하여 8L2-6D5의 친화력을 결정하였다. 8L2-6D5의 Fab 단편은 약 15 nM의 Kd로 인간 NGF와 결합하였다. 8L2-6D5를 친화력 성숙용 주형으로 선택하였다.
(3) CDR L1, L2, H1 및 H2의 인간화 및 친화력 성숙. CDR L1, L2, H1 및 H2에 인간화 및 친화력 성숙이 적용되었다. 코티아 정규 구조를 기초로 하는 CDR의 구조에 필수적이지 않은 CDR L1, L2, H1 및 H2 내의 아미노산 위치가 확인되었고 ([Al-Lazikani et al (1997) J. Mol. Biol. 273(4):927-48] 참조); 하기와 같이 무작위화되었다. [Balint et al, (1993) Gene 137(1):109-18]에 기술된 바와 같은 도핑 코돈을 사용하여, [Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press]에 기술된 바와 같은 축퇴성 올리고뉴클레오티드로의 PCR 카세트 돌연변이를 사용하여, 표 2에 제시된 경쇄 돌연변이 또는 중쇄 돌연변이, 및 그래프트 (마우스) CDR L3 또는 CDR H3를 각각 함유하는 2가지 라이브러리를 제조하였다. 일반적으로, 항체 911 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열과 인간 생식계열 항체 서열의 정렬을 기초로, 아미노산 잔기가 인간 항체에서 더욱 통상적인 잔기로 변경되었다. CDR H2 잔기 50인 메티오닌을 제외하고는 야생형 (치환되지 않은) 아미노산 잔기가 라이브러리 내에 또한 제시되었고, 이때 야생형 메티오닌은 라이브러리 내에 제시되지 않았다. 메티오닌 잔기는 산화된다; 따라서 이러한 잔기의 대체는 생성된 항체의 안정성을 개선시킬 것으로 예상되었다. 상기 기술된 바와 같이, Fab의 라이브러리가 벡터 pComb3X + 인간 CH1 및 Cκ 영역 내로 클로닝되었다.
1. 중쇄 H1/H2 라이브러리 :
CDR-H1
I34가 F, L, V, S, P, T, A, 또는 I로 변화되었다
N35가 N, T, S, 또는 Y로 변화되었다
CDR-H2
M50이 모두 20개의 천연 아미노산으로 변화되었다
A62가 A 또는 S로 변화되었다
L63이 L 또는 V로 변화되었다
2. 경쇄 L1/L2 라이브러리
CDR-L1
S26이 S, A, V, 또는 F로 변화되었다
D28이 D, A, S, 또는 Y로 변화되었다
H32가 H, N, K, D, E, Q, 또는 Y로 변화되었다
CDR-L2
Y50이 Y, D, A, 또는 S로 변화되었다
I51이 I, T, A, 또는 V로 변화되었다
F54가 F 또는 L로 변화되었다
S56이 S 및 T로 변화되었다
친화력 스크리닝 실험을 위해, 각각의 라이브러리를 추가로 상응하는 CDR-그래프트 경쇄 및 중쇄와 쌍을 이루게 하였고 (예를 들어서, H1/H2 라이브러리가 CDR-그래프트 경쇄와 쌍을 이룸), 항체를 발현시키고, 제조업자의 사용설명서에 따라서, 그리고 상기 기술된 바와 같이 BIACORE 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 (BIAcore, Inc. Piscaway NJ)을 사용하여 각각의 클론의 인간 NGF에 대한 친화력을 스크리닝하였다. koff, kon 및 KD를 결정하였다. 일반적으로 친화력에서의 대부분의 변동이 koff 속도에서 나타나기 때문에, 더 나아가 koff 속도는 항체 농도에 비의존적이기 때문에, 항체 클론을 koff 속도를 기초로 순위를 매겼다.
결합된 클론의 서열을 결정하였고, 결합된 클론의 서열이 표 3에 제시된다.
Figure 112010083030010-pat00002
<표 3(계속)>
Figure 112010083030010-pat00003
<표 3(계속)>
Figure 112010083030010-pat00004
하기의 치환을 함유하는 CDR에서 결합이 유지되었다:
CDR-H1
I34: S, L, V, I 및 A가 결합하였다.
N35: N, T 및 S가 결합하였다.
CDR-H2
M50: M, I, G, Q, S, L이 결합하였다.
A62: A 및 S가 결합하였다.
L63: L 및 V가 결합하였다.
CDR-L1
S26: S, 및 F가 결합하였다.
D28: D, S, A, Y가 결합하였다.
H32: H, N, Q가 결합하였다.
CDR-L2
Y50: Y가 결합하였다.
I51: I, T, V, A가 결합하였다.
F54: F가 결합하였다.
S56: S 및 T가 결합하였다.
하기의 치환을 함유하는 CDR이 일반적으로 결합 친화력을 기초로 선별되었고, H19-L129로 명명된 단일 클론 내로 조합되었다:
CDR-H1: I34L; N35N (변화 없음)
CDR-H2: M50I; A62A (변화 없음); L63V
CDR-L1: S26S (변화 없음); D28S; H32N
CDR-L2: Y50Y (변화 없음); I51T; F54F (변화 없음); S56S (변화 없음)
이러한 돌연 변이들이 그래프트된 H3 및 L3 CDR을 또한 포함하는, H19-L129로 명명된 단일 클론 내로 조합되었었다 (H 및 L 사슬을 PCR에 의해 증폭시키고, PCR 생성물 및 벡터 (pRN8)를 제한 효소로 절단하고, 3단편 결찰을 수행함으로써). H19-L129의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 도 1A 및 1B에 제시되고, 표 4는 CDR L1, L2, H1 및 H2의 아미노산 서열을 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법을 사용하여 결정했을 때, H19-L129는 약 1 nM의 KD로 NGFDP 결합하였다.
Figure 112010083030010-pat00005
(4) H3 및 L3 CDR의 친화력 성숙. H3 및 L3 CDR의 친화력 성숙이 2단계로 수행되었다. 먼저, "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 명명된 프로세스에서, 그 위치에서의 돌연변이로 인간 NGF에 대한 증가된 결합 친화력을 초래하는 아미노산 위치를 확인하기 위해, H3 및 L3 내의 각각의 아미노산 잔기를 개별적으로 예비스크리닝하였다. 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 ("소형 라이브러리 무작위화 분석법"으로 또한 명명됨)의 결과를 기초로, H3 및 L3 내의 아미노산 위치의 부분집합을 친화력 성숙 라이브러리의 제조용으로 선별하고, 친화력 성숙 라이브러리를 본원에 기술된 바와 같은 BIAcore를 사용하여 인간 NGF에 대한 친화력에 대해 스크리닝하였다. 이러한 기술은 일반적으로 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
(a) 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발
H3 및 L3 CDR 내의 각각의 아미노산 위치를 인간 NGF에 대한 결합 친화력 증가를 초래하는 치환에 대해 개별적으로 예비스크리닝하였다. 개선된 결합, 동일한 결합, 더 불량한 결합 또는 무결합이 초래된 임의의 소정의 위치에서의 아미노산 치환 빈도는 다수의 상이한 아미노산 (모든 20가지의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 제공하였다. 증가된 결합 친화력이 초래되는 아미노산 치환이 또한 확인되었다. 이러한 스크리닝의 결과를 기초로, CDR H3 및 L3 내의 아미노산 위치의 부분집합을 친화력 성숙 라이브러리의 제조용으로 선별하였다.
한번에 하나씩 L3 및 H3 CDR의 각각의 아미노산이 모든 20 가지의 아미노산으로 무작위화된 개별적인 Fab 라이브러리들을 제조하여, 여러 개 (경쇄에 대해 5개의 라이브러리 및 중쇄에 대해 13개의 라이브러리)의 소형 라이브러리가 생성되었고, 각각의 라이브러리는 각각의 아미노산 위치에서 20가지 아미노산 가능성의 복잡성을 갖는다. 모든 경우에, 천연 (즉, 변화되지 않은) 아미노산이 라이브러리 내에 제시된다. 20가지의 가능한 아미노산을 포함하도록 한 아미노산 위치를 무작위화시키기 위해 도핑 코돈 NNK를 사용하여, [Kay et al. (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press]에 기술된 바와 같은 축퇴성 올리고뉴클레오티드로의 PCR 카세트 돌연변이유발에 의해서 라이브러리가 제조되었다. CDR 그래프트 항체의 친화력이 낮을수록 스크리닝 동안 H3 및 L3 돌연변이체들의 친화력 차이가 더 쉽게 검출되기 때문에, 8L2-6D5 (프레임워크 돌연변이 V71K가 있는 CDR 그래프트 항체)가 라이브러리 구축용 주형으로서 작용하였다. 따라서, 라이브러리 내의 각각의 구성원은 1개의 아미노산 치환이 있는 CDR3 (H3 또는 L3), 및 5개의 그래프트 CDR을 함유하였다.
상기에 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법을 사용하여 각각의 소형 라이브러리로부터 20-80 개의 클론을 스크리닝하였다. BIAcore 칩의 한 채널에서 NGF에 대한 결합 친화력에 대해, 그리고 중쇄 C 말단의 his 택을 검출하는 센서 칩의 또다른 채널에서 펜타-his 택 항체에의 결합에 의해 Fab의 존재에 대해, BIAcore에 의해 샘플을 동시에 분석하였다. 분류에 koff를 사용하여, 단백질이 발현된 클론을 동일한 친화력을 갖는 것, 더 불량한 친화력을 갖는 것, 더 양호한 친화력을 갖는 것 또는 결합이 없는 것으로 분류하였다: 이러한 분석의 결과가 표 5에 제시된다.
Figure 112010083030010-pat00006
친화력이 개선된 모든 클론의 서열을 결정하여, 증가된 친화력이 초래된 아미노산 치환의 빈도 및 신원을 나타냈다. 또한, 치환이 반드시 결합 친화력을 증가시키지는 않았지만, 소정의 위치에서 허용된 아미노산 서열 치환을 확인하기 위해, 8L2-6D5과 유사한 친화력이 유지된 소수의 클론을 각각의 라이브러리로부터 선별하였다. 이러한 분석의 결과가 표 6에 요약된다.
Figure 112010083030010-pat00007
몇몇 돌연변이에서 증가된 결합 친화력이 초래되었다. 적어도 하기의 돌연변이에서 8L2-6D5 주형과 비교하여 현저하게 증가된 결합 친화력이 초래되었다: (H_Y101W (CDR 서열 GGYWYGTSYYFDY (서열 46)); H_S105A (CDR 서열 GGYYYGTAYYFDY (서열 47)); H_S105T (CDR 서열 GGYYYGTTYYFDY (서열 48));H_G103A (CDR 서열 GGYYYATSYYFDY (서열 49); 및 L_S91E (CDR 서열 QQEKTLPYT (서열 50)).
이러한 실험의 결과는 친화력 돌연변이 라이브러리의 생성을 위한 아미노산 위치의 선별을 안내하는데 사용되었다.
이러한 실험은, 표 5에 제시된 바와 같이, 개선된 결합, 동일한 결합, 더 불량한 결합 또는 결합 없음이 초래된 임의의 소정의 위치에서의 아미노산 치환의 빈도에 관한 정보를 또한 제공하였다. 이러한 정보는 다수의 상이한 아미노산 (모든 20가지의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 아미노산 위치, 및 소수의 아미노산 또는 매우 소수의 아미노산 (일부 실시양태에서는 가능한 아미노산 없음)으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 허용하였다. 이러한 결과는 결합 친화력을 증가시킨 아미노산 치환을 또한 나타냈다.
(b) 친화력 성숙
이어서, 소형 라이브러리 무작위화 분석법 (상기)의 결과를 사용하여, H3 및 L3 CDR의 친화력 성숙을 위한 H3 및 L3 라이브러리의 제조를 위한 잔기를 선별하였다. CDR H3의 잔기 Y101 및 G103, 및 CDR L3의 잔기 S91 및 K92가 H3 및 L3 CDR의 친화력 성숙을 위한 H3 및 L3 라이브러리의 제조를 위해 선별되었다.
이러한 라이브러리는 H3 및 L3 내의 돌연변이를 동시에 CDR-그래프트 클론 8L2-6D5에서, 그리고 별도로 H19-L129의 배경에서 조합하였고, 80개의 상이한 클론의 다양성을 가졌다. 표 7은 치환에 선별된 아미노산 잔기 및 각각의 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다.
치환에 선별된 H3 및 L3 내의 돌연변이, 및 각각의 위치에서 치환된 아미노산
CDR-H3:
Y101이 Y 및 W, C로 변화되었다. (주: 한 축퇴된 올리고뉴클레오티드에서의 코돈 TRF의 사용으로 또한 코돈 C가 생성되었기 때문에 C가 포함되었다).
G103이 A,P, S로 변화되었다.
CDR-L3:
S91이 E로 변화되었다.
K92가 모든 20가지의 아미노산으로 변화되었다. A, R, K, 및 H가 결합하였다.
각각의 폴리펩티드는 Fab으로 발현되었고, 96개의 개별적인 클론의 인간 NGF에 대한 친화력이 제조업자의 사용설명서에 따라서, 그리고 상기 기술된 바와 같은 BIACORE 분석법을 사용하여 각각의 라이브러리에 대해 스크리닝되었다. 이러한 분석의 결과가 표 8에 제시된다.
Figure 112010083030010-pat00008
결합 친화력을 기초로, 최상의 클론인 E3 (상호교환적으로 "3E"로 명명됨) 및 3C를 추가적인 특성화용으로 선별하였다. E3는 CDR-H3: Y101W, G103A; 및 CDR-L3: S91E, K92H의 CDR 치환을 포함하였고, 이것은 하기의 L1, L2, H1 및 H2 돌연변이를 또한 포함하는 단일 클론 내로 조합되었다:
CDR-H1: I34L:
CDR-H2: M50I; L63V;
CDR-L1: D28S; H32N;
CDR-L2: I51T.
E3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 도 1A 및 1B에 제시된다. 3C는 CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: Y101W; G103A의 CDR 치환을 포함하였고, 이것은 클론 3E에 대해 기술된 L1, L2, H1 및 H2 돌연변이를 또한 포함하는 단일 클론 내로 조합되었다.
3E 및 3C 서열이 Fab 및 전장 항체의 생산을 위해 포유류 발현 벡터 내로 클로닝되었고, HEK293 세포에서 발현되었고, Ni-NTA 또는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 순수한 단백질이 아미노산 분석에 의해 정확히 정량되었다.
Fab E3 및 3C의 인간 NGF에 대한 결합 친화력을, 100 RU NGF가 재결합 효과를 방지하기 위해 칩 상에서 사용된 것을 제외하고는, 제조업자의 사용설명서에 따라서, 그리고 상기 기술된 바와 같이 BIA코어 분석을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 여러 농도의 항체(Fab)가 100 RU의 인간 NGF가 고정된 CM5 칩 상에 2분 동안 주입되었고, 1800 초 동안 해리되었다. 마우스 항체 911 (Fab)가 대조군으로서 분석되었다. 제조업자의 사용설명서에 따라 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다. 항체 E3 및 911의 분석 결과가 도 9 및 10에 제시된다. E3 는 약 0.07 nM의 KD (및 약 6.0e5 M-1s-1의 kon, 및 약 4.2e-5 s-1의 koff)로 인간 NGF에 결합하였다. 3C는 약 0.35 nM (약 1.4E-5의 koff)의 KD로 인간 NGF에 결합하였다. 대조적으로, 마우스 항체 911은 3.7 nM의 KD, 8.4×10-5 s-1의 koff 및 2.2×104 Ms-l의 kon로 NGF에 결합하였다.
항체 E3 (상호교환적으로 3E로 명명됨)가 높은 결합 친화력을 기초로 추가적인 분석용으로 선별되었다. NGF와 NGF 수용체 trkA 및 p75의 상호작용을 방지하는 E3의 능력을 테스트하기 위해, 2.5 nM의 인간 NGF를 0 내지 50 nM의 항체 E3 (Fab)와 예비혼합하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 260 RU의 p75 (채널 2) 및 600 RU의 trkA (채널 3)을 함유하는 BIA코어 CM5 칩에 10 ㎕/분으로 주입하였고, 백분율 결합을 결정하였다. 이러한 분석의 결과가 도 11에 제시된다. 증가된 농도의 Fab E3은, 감소된 신호 (RU로 측정됨)로 나타난 바와 같이 NGF와 p75 및 trkA의 상호작용을 차단하였고, 이는 Fab E3가 인간 NGF과 trkA 및 p75 모두와의 상호작용을 차단한다는 것을 가리킨다. 항체 E3 (Fab) 농도가 NGF 농도와 동일할 때 (약 2.5 nM NGF 농도), NGF 결합이 관찰되지 않았다 (0의 신호로 나타나는 바와 같음). NGF의 농도가 항체 3E 농도와 동일할 때 0 퍼센트 NGF-수용체 결합이 발생하였다는 사실은 2.5 nM NGF이 NGF에 대한 E3의 kD보다 적어도 10배 더 높고, 평형 상태였다는 것을 시사하였다.
실시예 2: 마우스 E13.5 삼차 뉴런 생존 분석법을 사용한 항-NGF 항체의 NGF-차단 능력의 평가
시험관 내에서 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 항체의 능력을 측정함으로써, NGF 활성을 차단하는 Fab E3 또는 전장 항체 E3의 능력이 평가되었다. 삼차 신경절은 안면 영역의 신경이 통하게 하는 피부 감각 뉴런으로 구성된다. 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 생존은, NGF가 이러한 뉴런의 생존을 지지하는데 필요하기 때문에, 항-NGF 길항제 항체의 NGF-차단 활성을 평가하기 위한 민감한 분석법이다. 예를 들어, 포화 농도의 NGF에서, 생존은 배양시 48시간까지 100％에 가깝다. 대조적으로, NGF의 부재 하에서는 5％ 미만의 뉴런이 48시간까지 생존한다.
생존 분석이 하기와 같이 수행되었다: 시간에 맞춰 교미시킨 임신한 스위스 웹스터(Swiss Webster) 암컷 마우스를 C02 흡입에 의해 안락사시켰다. 자궁뿔을 제거하고, 배아 단계 E13.5의 배아를 추출하여 단두시켰다. 삼차 신경절을 전기분해에 의해 날카로와진 텅스텐 바늘을 사용하여 절개하였다. 그 후, 신경절을 트립신처리하고, 기계적으로 해리시키고, 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 96-웰 플레이트 내의 무혈청 규정 배지 내에 웰 당 200-300개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
삼차 뉴런에 다양한 용량의 항-NGF 항체 Mab 911 (Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 및 3C; 및 0.4 ng/㎖ (~15 pM; 이러한 농도는 생존을 위한 NGF의 포화 농도를 나타냈다) 및 0.04 ng/㎖ (~1.5 pM; 이러한 농도는 대략적인 IC50이다) 농도의 인간 또는 래트 NGF를 첨가함으로써 항-NGF Fab 또는 항체의 차단 활성을 평가하였다. 배양 48시간 후, 세포가 하기와 같은 Biomek FX 액체 취급 워크스테이션 (Beckman Coulter) 상에서 수행된 자동화 면역세포화학 프로토콜에 적용되었다: 4％ 포름알데히드, 5％ 수크로스, 및 PBS를 사용하여 고정시킴; PBS 내의 0.3％ Triton X-100을 사용하여 투과시킴; PBS 내의 0.11％ BSA, 5％ 정상 염소 혈청을 사용하여 비-특이적 결합 부위를 차단함; 및 1차 및 2차 항체와 함께 순차적으로 인큐베이션하여 뉴런을 검출함. 1차 항체는 확립된 뉴런 표현형 마커인 단백질 유전자 생성물 89.5 (PGP9.5, Chemicon)에 대한 토끼 폴리클로날 항체였다. 2차 항체는, 배양물 내에 존재하는 모든 세포의 핵을 표지시키는 핵 염료 Hoechst 33342 (Molecular Probes)과 함께, Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 항체 (Molecular Probes)였다. 이미지 획득 및 이미지 분석은 Discovery-I/GenII Imager (Universal Imaging Corporation)에서 수행하였다. 이미지는 Alexa Fluor 488 및 Hoechst 33342에 대해 2가지 파장에서 자동적으로 획득되었고, 핵 염색은 모든 웰에 존재하기 때문에, 핵 염색이 Imager의 이미지-기반 자동-초점 시스템에 대한 기준점으로 사용된다. 적합한 목표 및 웰 당 이미지화된 위치의 수가 각 웰의 전체 표면을 커버하도록 선택되었다. 자동화 이미지 분석은 배양 48시간 후 각 웰에 존재하는 뉴런의 수를 항-PGP9.5 항체로의 이들의 특이적 염색을 기초로 카운팅하도록 설정되었다. 주의깊은 이미지 쓰레스홀딩(thresholding) 및 선택성 필터를 기초로 하는 형태학 및 형광성 강도의 적용으로 웰 당 뉴런이 정확하게 카운팅되었다.
이러한 실험의 결과는 Fab E3가 높은 친화력으로 NGF 활성을 차단하였음을 나타냈다. 결과가 도 4-6 및 표 9에 제시된다.
도 4는 다양한 농도의 인간 및 래트 NGF의 존재 하에서의 E13.5 뉴런의 NGF-의존적 생존을 도해하는 그래프이다.
도 5는 0.04 ng/㎖의 인간 NGF (대략 1.5 pM; 하부 패널에 제시됨) 또는 0.4 ng/㎖의 인간 NGF (대략 15 pM; 상부 패널에 제시됨)의 존재 하에서의 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 1.5 pM의 NGF는 생존을 촉진하는 NGF의 대략적인 EC50이었고, 15 pM은 NGF의 포화 농도를 나타냈다. 다양한 농도의 Fab E3; 마우스 911 Fab; 및 Fab H19-L129 및 Fab 8L2-6D5에서의 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 생존이 상기 기술된 바와 같이 평가되었다. 각각의 NGF 농도에서 각각의 Fab에 대해 IC50 (pM 단위)이 계산되었고, 표 9에 제시된다. Fab E3는 15 pM 인간 NGF의 존재 하에 약 21 pM의 IC50, 및 1.5 pM 인간 NGF의 존재 하에 약 1.2 pM의 IC50으로 인간 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. Fab 3C 및 H19-L129 또한 인간 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다.
도 6은 0.04 ng/㎖의 래트 NGF (대략 1.5 pM; 하부 패널에 제시됨) 또는 0.4 ng/㎖의 래트 NGF (대략 15 pM; 상부 패널에 제시됨)의 존재 하에서의 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 1.5 pM의 NGF는 대략적인 EC50이었고, 15 pM은 NGF의 포화 농도를 나타냈다. 다양한 농도의 Fab E3; 마우스 Fab 911; 및 Fab H19-L129 및 Fab 8L2-6D5에서의 E13.5 마우스 삼차 뉴런의 생존이 상기 기술된 바와 같이 평가되었다. 각각의 NGF 농도에서 각각의 Fab에 대해 IC50 (pM 단위)이 계산되었고, 표 9에 제시된다. Fab E3는 15 pM 래트 NGF의 존재 하에 약 31.6 pM의 IC50, 및 1.5 pM 래트 NGF의 존재 하에 약 1.3 pM의 IC50으로 인간 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다. Fab 3C 및 H19-L129 또한 래트 NGF-의존적 삼차 뉴런 생존을 강하게 차단하였다.
Figure 112010083030010-pat00009
다른 실험에서, 본 발명자들은 0.4 ng/㎖ (포화 농도)의 인간 NGF의 존재 하에서 E13.5 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 전장 항체 E3 및 Fab 3E의 능력을 비교하였다. 분석 결과가 도 12에 제시된다. 전장 항체 E3와 Fab 3E는, 전체 항체 및 Fab의 농도가 NGF 결합 부위의 수에 대해 표준화되었을 때 (Fab은 1개의 결합 부위를 갖고, 전체 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다), 유사한 수준의 NGF-의존적 생존 억제를 나타내었다. 이러한 결과는 NGF 이량체에 대한 전장 항체의 결합으로 인한 결합력(avidity)의 효과가 없음을 나타냈다.
또다른 실험에서, 본 발명자들은 0.4 ng/㎖ (포화 조건)의 존재 하에 E13.5 뉴런의 NGF-의존적 생존을 억제하는 다양한 농도 (20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, 및 0.0 nM)의 항체 E3, 항체 911, 및 trkA 수용체 면역부착소 (면역글로불린 Fc 도메인, CH2-CH3와 융합된 NGF 수용체 trkA의 세포외 도메인으로 구성됨)의 능력을 비교하였다. 이러한 결과가 도 13에 제시된다. 이러한 결과는 항체 E3가 항체 911 또는 trkA 면역부착소보다 양호하게 NGF를 유의하게 차단하였음을 나타냈다.
실시예 3: 마우스 삼차 및 결절성 뉴런 생존 분석법을 사용한 항-NGF 항체 E3의 특 이성의 평가
포화 농도의 NGF, NGF-관련 뉴로트로핀 NT3, 또는 NGF와 관련이 없는 뉴로트로핀 인자인 대식세포 자극 단백질 (MSP)의 존재 하에 시험관 내에서 마우스 E17/18 삼차 뉴런의 생존을 억제하는 항체의 능력을 측정함으로써, NGF 활성을 특이적으로 차단하는 항체 E3의 능력이 평가되었다. 마우스 E17/18 삼차 뉴런의 생존은, E13.5 TG 뉴런의 생존을 지지하는데 필요한 NGF의 수준보다 더 높은 농도에서 NGF가 이러한 뉴런의 생존을 지지하는데 필요하기 때문에, 항-NGF 길항제 항체의 NGF-차단 활성을 평가하기 위한 민감한 분석법이다. 이러한 뉴런의 생존은 NT3 또는 MSP에 의해 또한 지지된다; 따라서, 이러한 뉴런의 생존은 항-NGF 길항제 항체가 NT3 또는 MSP을 또한 차단하는지 여부를 평가하기 위한 민감한 분석법이다.
NGF 활성을 특이적으로 차단하는 항체 E3의 능력은 포화 농도의 BDNF 또는 NT4/5의 존재 하에 마우스 결절성 E17 뉴런의 생존을 억제하는 항체의 능력을 측정함으로써 또한 평가되었다. 결절성 뉴런의 생존은 BDNF 또는 NT4/5에 의해 지지된다; 따라서, 이러한 뉴런의 생존은 항-NGF 길항제 항체의 BDNF 또는 NT4/5-차단 능력을 평가하기 위한 민감한 분석법이다.
생존 분석법은 하기와 같이 수행되었다: 시간에 맞춰 교미된 임신 스위스 웹스터 암컷 마우스를 C02 흡입에 의해 안락사시켰다. 자궁뿔을 제거하고, 배아 (배아 제17일 또는 제18일)를 추출하여 단두시켰다. 삼차 및 결절성 신경절을 절개하여 깨끗하게 하였다. 그 후, 신경절을 트립신처리하고, 기계적으로 해리시키고, 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 4-웰 플레이트 (Greiner) 내의 무혈청 규정 배지 내에 웰 당 100-300개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
E17/18 삼차 뉴런을 뉴로트로핀 인자를 첨가하지 않고 (음성 대조군), 또는 포화 농도의 인간 NGF (400 pM 및 15pM) (양성 대조군); NT3 (400 pM); 또는 MSP (600 pM)의 존재 하에 성장시켰다. 다양한 농도의 E3 및 911 Fab 및 전장 항체를 포함하는 이중 배양을 설정하였다. Fab 및 전장 항체의 농도는 결합 부위 당 지시되었다 (예를 들어, 전장 항체는 2개의 결합 부위를 함유하는 반면, Fab은 1개의 결합 부위를 함유한다).
E17 결절성 뉴런을 뉴로트로핀 인자를 첨가하지 않고 (음성 대조군), 또는 포화 농도의 BDNF (400 pM) (양성 대조군) 또는 NT4/5 (400 pM) 또는 NGF와 관련이 없는 성장 인자 ILF (인터류킨 억제 인자)의 존재 하에 성장시켰다. 이러한 실험의 목표는 항체의 특이성을 테스트하는 것이기 때문에, 고농도의 뉴로트로핀이 사용되었다. 항체 E3 및 911이 첨가되었거나 첨가되지 않은 이중 배양을 설정하였다. 48시간 배양 후, 각각의 조건 하에 각각의 웰 내에서 생존한 뉴런의 총수를 상-대조 현미경을 사용하여 수동 카운팅에 의해 확인하였다.
이러한 실험의 결과는 E3 및 911 항체가 E18 삼차 뉴런에 대한 NGF의 생존 촉진 효과를 완전하게 차단하였음을 나타냈다. 대조적으로, E3 및 911 항체는 NT3 또는 MSP에 의해 촉진된 삼차 뉴런의 생존, 또는 BDNF 또는 NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진된 결절성 뉴런의 생존에 대한 효과가 없었다. 이러한 결과는 항체 E3가 NGF에 대해 선택적인 특이성을 가졌다는 것을 나타냈는데, 이러한 항체들과 다른 NGF 관련 뉴로트로핀 (NT3, NT4/5, BDNF) 사이에서는 NGF 차단에 효과적인 농도보다 1000-배 내지 10,000-배 더 높은 농도에서 어떠한 상호작용도 검출되지 않았기 때문이다. 또한, 이러한 결과는 항체 또는 Fab E3의 첨가시 NGF-의존적 뉴런의 NGF-보충 배양물에서 나타난 뉴런 사망이 이러한 항체들과 NGF 사이의 특이적 상호작용 때문이었고, 일반화된 독성 효과 때문이 아니었음을 나타냈다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911이 또한 테스트되었고, 유사한 결과가 관찰되었다. 사용된 고농도의 뉴로트로핀으로 인해, 항체 E3와 911 모두 이들의 적정 조건에 매우 근접하였고, NGF에 대한 이러한 항체들의 결합 친화력 차이는 이러한 조건 하에 덜 명백할 것이기 때문에 유사한 수준으로 NGF에 결합할 것으로 예상되었음이 주지된다.
이러한 실험의 결과가 도 14, 15, 16, 및 17에 제시된다. 데이타는 각각의 실험에 대한 양성 대조군에서 관찰된 생존 (예를 들어, 각각, 포화 NGF 농도의 존재 하에 성장된 삼차 뉴런의 100％ 생존, 및 포화 BDNF 농도의 존재 하에 성장된 결절성 뉴런의 100 ％ 생존)과 관련된 48시간 배양 후 평균 생존％ (평균 ± 표준 오차, 각각의 데이타 포인트에 대해 n=3)를 나타낸다. 도 14-15는 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3가, 200 nM의 항체 농도에서도, NT3 및 MSP에 의해 촉진된 생존을 억제하지 않았음을 나타내는 그래프이다. 대조적으로, 20 nM의 항체 E3 또는 Fab 3E 및 Fab 911은 NGF-도출 생존을 전적으로 차단하였다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911이 또한 테스트되었고, 유사한 결과가 관찰되었다. 특히, 도 14는 뉴로트로핀의 부재 ("대조군"으로 명명됨), 400 pM NGF ("NGF-400pM"으로 명명됨), 10 nM NT3 ("NT3-10nM"으로 명명됨) 또는 600 pM MSP ("MSP-600pM"으로 명명됨)의 존재 하에서의 E18 삼차 뉴런의 생존에 대한 다양한 농도 (20 nM, 2 nM, 또는 0.2 nM)의 E3 Fab (도면에서 "3E"로 명명됨) 및 마우스 항체 911 Fab의 효과의 비교를 나타내는 그래프이다. 도 15는 뉴로트로핀의 부재 ("인자 없음"으로 명명됨), 400 pM NGF ("NGF-400pM"으로 명명됨), 10 nM NT3 ("NT3-10nM"으로 명명됨) 또는 600 pM MSP ("MSP-600pM"으로 명명됨)의 존재 하에 E17 삼차 뉴런의 생존에 대한 다양한 농도 (200 nM 및 80 nM)의 E3 Fab 및 전장 항체 및 마우스 항체 911 전장 항체 및 Fab의 효과의 비교를 도해하는 그래프이다.
도 16-17은 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3가 BDNF, NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진된 E17 결절성 뉴런의 생존을 억제하지 않았음을 도해하는 그래프이다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911이 또한 테스트되었고, 유사한 결과가 관찰되었다. 특히, 도 16은 뉴로트로핀의 부재 ("인자 없음"으로 명명됨), 400 pM BDNF ("BDNF-400pM"으로 명명됨), 400 pM NT4/5 ("NT4/5- 400pM"으로 명명됨) 또는 2.5 nM LIF ("LIF-2.5nM"으로 명명됨)의 존재 하에 E17 결절성 뉴런의 생존에 대한 다양한 농도 (200 nM 또는 80 nM)의 전장 항체 E3 (도면에서 "3E"로 명명됨), Fab E3, 전장 항체 911, 또는 Fab 911의 효과의 비교를 나타내는 그래프이다. 도 17은 뉴로트로핀의 부재 ("대조군"으로 명명됨), 400 pM BDNF ("BDNF-400pM"으로 명명됨), 400 pM NT4/5 ("NT4/5-400pM"으로 명명됨) 또는 2.5 nM LIF ("LIF-2.5nM"으로 명명됨)의 존재 하에 E17 결절성 뉴런의 생존에 대한 다양한 농도 (200 nM, 20 nM, 2nM)의 Fab E3 (도면에서 "3E"로 명명됨), 또는 Fab 911의 효과의 비교를 나타내는 그래프이다.
실시예 4: 포유류 발현 벡터의 제조 및 포유류 세포에서의 항체 E3의 발현
3가지 포유류 발현 벡터가 디자인되었고, 포유류 세포에서의 항체 E3의 발현에 사용하기 위해 구축었다.
벡터 Db.911.3E는 E3 항체의 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG2a 불변 영역을 포함하는 발현 벡터이고, 중쇄의 일시적인 또는 안정적인 발현에 적절하다. Db.911.3E는 하기의 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다: 마우스 거대세포바이러스 프로모터 영역 (뉴클레오티드 1-612); 합성 인트론 (뉴클레오티드 619-1507); DHFR 코딩 영역 (뉴클레오티드 707-1267); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드 (뉴클레오티드 1525-1602); 항체 3E 중쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1603-1965); A330P331에서 S330S331으로의 돌연변이를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역 (야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한 아미노산 번호매김; [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참조); SV40 후기 폴리아데닐화 신호 (뉴클레오티드 2974-3217); SV40 인핸서 영역 (뉴클레오티드 3218-3463); 파지 fl 영역 (뉴클레오티드 3551-4006) 및 베타 락타마제 (AmpR) 코딩 영역 (뉴클레오티드 4443-5300). Db.911.3E는 2003년 1월 8일에 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-4895호가 할당되었다.
벡터 Eb.911.3E는 E3 항체의 경쇄 가변 영역 및 인간 카파 사슬 불변 영역을 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 일시적인 발현에 적절하다. Eb.911.3E는 하기의 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다: 마우스 거대세포바이러스 프로모터 영역 (뉴클레오티드 1-612); 인간 EF-1 인트론 (뉴클레오티드 619-1142); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드 (뉴클레오티드 1173-1150); 항체 E3 경쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 1251-1571); 인간 카파 사슬 불변 영역 (뉴클레오티드 1572-1892); SV40 후기 폴리아데닐화 신호 (뉴클레오티드 1910-2153); SV40 인핸서 영역 (뉴클레오티드 2154-2399); 파지 fl 영역 (뉴클레오티드 2487-2942) 및 베타 락타마제 (AmpR) 코딩 영역 (뉴클레오티드 3379-4236). Eb.911.3E는 2003년 1월 8일에 ATCC에 기탁되었고 ATCC 기탁 번호 PTA-4893호가 할당되었다.
벡터 Eb.pur.911.3E은 E3 항체의 경쇄 가변 영역 및 인간 카파 불변 영역을 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 안정적인 발현에 적절하다. Eb.pur.911.3E는 하기의 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다: 마우스 거대세포바이러스 프로모터 영역 (뉴클레오티드 1-612); 인간 EF-1 인트론 (뉴클레오티드 619-1758); pac 유전자 (퓨로마이신R) 코딩 영역 (뉴클레오티드 739-1235); 인간 hsp70 5'UTR 영역 (뉴클레오티드 1771-1973); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드 (뉴클레오티드 1985-2062); 항체 E3 경쇄 가변 영역 (뉴클레오티드 2063-2383); 인간 카파 사슬 불변 영역 (뉴클레오티드 2384-2704); SV40 후기 폴리아데닐화 신호 (뉴클레오티드 2722-2965); SV40 인핸서 영역 (뉴클레오티드 2966-3211); 파지 fl 영역 (뉴클레오티드 3299-3654) 및 베타 락타마제 (AmpR) 코딩 영역 (뉴클레오티드 4191-5048). Eb.pur.911.E3는 2003년 1월 8일에 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-4894호가 할당되었다.
일시적인 세포 발현을 하기와 같이 수행하였다: 150 ㎜ 접시 내의 CHO 및 HEK293T 세포를 일시적으로 25 ㎍의 각각의 플라스미드 (즉, 중쇄를 함유하는 플라스미드 1개 및 경쇄를 함유하는 플라스미드 1개)로 공동-형질감염시켰다. DNA를 제조업자의 사용설명서에 따라 100 ㎕ 리포렉타민 2000 (Invitrogen)과 혼합하였다. DNA-지질 복합체를 혈청 또는 항생물질이 없는 DMEM/F12 배지에서 5시간 동안 세포와 접촉시켰다. 이러한 인큐베이션 후, 발현을 위해 배지를 2일 동안 어떠한 첨가제도 없는 Opti-MEM (Invitrogen)으로 바꾸었다. 항체를 함유하는 세포 상청액을 순차적으로 4회까지 수확하고, 이어서 배지를 교체하였다. 상청액을 MapSelect 단백질 A 수지 (Amersham biosciences 17-5199-02)을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 0.3M 글리신, 0.6M NaCl 완충액 (pH 8)에서 단백질 A 수지에 항체를 결합시킨 후, 0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 3)으로 용출시켰다. 항체를 함유하는 분획을 즉각적으로 1M Tris 완충액 (pH 8.0)으로 중화시켰다. 그 후, 항체 분획을 투석하여, PBS에서 농축시켰다.
실시예 5: 항-NGF 항체 E3는 수술 후 통증을 치료하는데 효과적이다
본 발명자들은 수술 후 통증을 모방하는 통증 모델을 사용하여 항체 E3로의 치료의 효능을 평가하였다. 항체 E3는 A330P331에서 S330S331으로의 돌연변이를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역 (야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한 아미노산 번호매김; [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참조); 인간 경쇄 카파 불변 영역; 및 표 1A 및 1B에서 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하였다.
동물. 체중이 220-240 그램인 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley 래트)를 Harlan (Wisconsin)으로부터 구입하여, 수술 전 1주일 동안 동물 설비에 순응시켰다.
수술. 수술은 [Brennan, et al. Pain 64:493-501 (1996)]에 기술된 절차를 기초로 하였다. 동물을 공기 혼합물 내의 2％ 이소플루란으로 마취시키고, 이를 수술 동안 노즈 콘(nose cone)을 통해 유지시켰다. 오른쪽 뒷발의 발바닥 표면을 포비돈-요오드 패드로 준비시키고, 뒤꿈치 가장자리로부터 0.5 cm에서 시작하여 발가락 쪽으로 확장되도록, 피부와 근막을 통과하여 1-cm 중심 종방향 절개를 만들었다. 측정은 굽힌 위치에서 유지된 발로 자를 사용하여 이루어졌다. 발바닥 근육을 구부러진 집게를 사용하여 들어올리고, 종방향으로 절개하였다. 근육은, 기시점과 종지부 사이에서, 이의 전체 깊이를 통과하여 절개되었다. 거즈 패드를 통해 적용된 압력에 의해 수술 동안 출혈이 제어되었다. 2개의 매트리스 봉합사 (5-0 에틸론 블랙 모노필라멘트)로 상처를 봉합하였다. 이러한 봉합사를 5-6 회 매듭지었고, 첫번째 매듭은 느슨하게 묶였다. 상처 부위에 바시트라신 용액을 면봉으로 칠하였다. 깨끗한 우리에서 동물을 2시간 이상 동안 회복 및 휴식시킨 후, 거동 테스트를 시작하였다.
휴식기 통증 평가. 누적 통증 점수를 사용하여 체중 부하와 관련된 통증을 평가하였다. 동물의 발의 아랫쪽을 점검할 수 있도록 플랫폼 (높이: 18') 상에 들어올려진 깨끗한 플라스틱 우리 내의 플라스틱 그물 (그리드: 8 ㎟) 상에 놓았다. 20분의 순응 기간 후, 체중 부하를 0 내지 2의 등급으로 평가하였다. 발이 창백해지거나 그물에 대해 눌리면 0점이 주어졌고, 이는 전체 체중 부하를 가리킨다. 피부의 창백해짐 또는 만입 없이, 단지 피부가 그물을 접촉하는 것을 발이 선호하면, 1점이 주어졌다. 발이 완전히 그물과 떨어져 유지되면 2점이 주어졌다. 래트가 휴식 시 움직이지 않으면 발을 움찔하는 것이 2점으로 간주되었다. 얻어진 각각의 동물을 30분 동안 5분 마다 1분 동안 관찰하였다. 1/2-시간 수득된 6개의 점수의 총합 (0-12)을 사용하여, 절개된 발에서의 통증을 평가하였다. 2점의 빈도를 또한 계산하여, 심각한 통증의 발생을 평가하는데 사용하였다. 각 동물을 수술 24시간 전 (기준선), 그리고 수술 2시간 후, 24시간 후, 48시간 후 및 72시간 후에 테스트하였다. 이러한 실험의 결과가 도 1에 제시되고, 이는 항-NGF 마우스 항체 911 35 ㎎/㎏으로 치료된 동물에서 관찰된 누적 휴식기 통증 점수를 나타낸다. 이러한 결과는 항-NGF 항체로의 치료가 수술-후 휴식기 통증을 현저하게 감소시켰음을 나타냈다. 체중 부하는 동물이 얼마나 사지를 사용하려 하였는지와 양호하게 상관되었고, 따라서 통증 해소의 효과적인 척도였다.
E3 항체를 다양한 항체 농도 (동물 체중의 1 킬로그램 당 0.004, 0.01, 0.02, 0.1, 0.6, 및 1 ㎎)로 절개 15시간 전에 복강내 (i.p.) 주사하였다. 음성 대조군은 항체를 받지 않았지만, 식염수가 복강내 주사되었다. 0.01 ㎎/㎏의 펜타닐이 수술 24시간 후에 테스트 30 분전에 양성 대조군으로서 복강내 주사되었다. 각각의 실험에서 각각의 조건에 대해 8마리 동물이 수반되었고 (군 당 n=8), 대조군에는 56마리의 동물이 있었다. 수술을 수행하였고, 누적 통증 점수를 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 휴식기 통증이 수술 24시간 후에 평가되었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 인간화 항-NGF 항체 E3는 0.02 ㎎/㎏ 내지 1 ㎎/㎏ 투여량으로 투여되었을 때 수술 후 휴식기 통증을 유의하게 감소시켰다 (p < 0.05). "*"는 대조군으로부터의 현저하게 유의한 차이를 나타낸다 (p < 0.05). 0.02 ㎎/㎏으로의 치료는 적어도 0.01 ㎎/㎏ 펜타닐로의 치료만큼 효과적으로 통증 거동을 경감시켰다. 이러한 용량의 펜타닐은 이러한 강력한 아편유사제의 정상적인 인간 용량의 10배이다.
또다른 실험에서, 수술 후 투여되었을 때 수술 후 통증을 감소시키는데 있어서의 E3 항체의 효능이 테스트되었다. 항체 E3 (0.5 ㎎/㎏)를 수술 2시간 후에 정맥내(i.v.) 주사하였다. 대조군은 항체를 받지 않지만, 식염수가 정맥내 주사되었다. 수술을 수행하였고, 누적 통증 점수로 표현되는 휴식기 통증을 수술 24시간 후에 평가하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 항-NGF 항체로의 치료는 항체가 절개 2시간 후에 투여되었을 때 절개 24시간 후에 휴식기 통증을 유의하게 (p < 0.05) 감소시켰다. 이러한 결과는 수술 후 투여되었을 때 E3 항체가 수술 후 통증을 효과적으로 경감시켰음을 나타냈다.
실시예 6: 류머티스 관절염의 래트 모델에서의 항-NGF 길항제 항체 911의 진통 효 과의 평가
래트에서의 완전 프로인트 보강제 (CFA: complete Freund's adjuvant)-유도 만성 관절염에서의 항-NGF 항체 911 ([Hongo et al., Hybridoma 19(3):215-227 (2000)] 참조)의 진통 효과를, 기준 물질로서 사용된 인도메타신과 비교하여, 발성 테스트를 사용하여 연구하였다.
실험 단계를 시작할 때 체중이 150 g 내지 220 g인 50마리의 수컷 루이스(Lewis) 래트 (LEWIS LEW/Crl Ico) (Charles River Belgium)가 본 연구에 포함되었다. 모든 동물을 온도 (19.5-24.5℃), 상대 습도 (45-65 ％) 및 12-h 밝음/어두움 사이클이 제어되는 방에서 실험하기 전에 적어도 5일 동안 유지시켰고, 연구 기간에 걸쳐 여과된 수돗물 및 표준 펠렛화 실험실 사료 (U.A.R., France)에 자유롭게 접근시키면서 거주시켰다. 동물은 개별적으로 꼬리에서 확인되었다.
제0일 (D0)에, 꼬리 내로 미네랄 오일 내의 미코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum) (Difco, USA) 현탁액 (10 ㎎/㎖) 0.05 ㎖를 피내 주사함으로써 래트에서 관절염이 유도되었다. 제14일 (D14)에, 관절염 래트가 뒷발을 부드럽게 굽혔을 때 발성하는 이의 능력에 따라서, 그리고 각각의 뒷발과 앞발에 대한 염증 점수 ([Kuzuna et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 23:1184-1191 (1975)]; [Pearson et al., Arthritis Rheum. 2:440-459 (1959)] 참조)를 사용하여 평가된 이의 관절염 지수에 의해 연구에 포함되었다. 하기의 기준을 기초로 동물의 점수를 매겼다: 0점: 정상적인 양상; 1점: 홍반; 2점: 약간의 부종이 있는 홍반; 3점: 관절강직 없이 강한 염증; 4점: 관절강직. 부드럽게 굽혔을 때 발성할 수 있고 2점 또는 3점을 나타내는 동물들만이 연구에 포함되었다.
각각 래트 10마리의 4개의 군이 연구에 포함되었다. 군 1 (비히클)에 대해서, 제14일 (D14)에, 선별 후, 래트에게 비히클 (식염수)를 정맥내 투여하였다. 제18일 (D18)에, 뒷발의 부드러운 굽힘에 의해 통각 강도를 평가하였고, 발성 수준의 강도를 각각의 동물에 대해 기록하였다. 군 2 (4일)에 대해서, D14일에, 선별 후, 래트에게 911 (10 ㎎/㎏)을 정맥내 투여하였다. 제18일 (D18)에, 뒷발의 부드러운 굽힘에 의해 통각 강도를 평가하였고, 발성 수준의 강도를 각각의 동물에 대해 기록하였다. 군 3 (24시간)에 대해서, CFA의 주사 후 제17일에, 래트에게 911 (10 ㎎/㎏)을 정맥내 투여하였다. 24시간 후 뒷발의 부드러운 굽힘에 의해 통각 강도를 평가하였고, 발성 수준의 강도를 각각의 동물에 대해 기록하였다. 군 4 (인도메타신)에 대해서, 제18일 (D18)에, 인도메타신 (10 ㎎/㎏)의 경구 투여 1시간 후에 뒷발의 부드러운 굽힘에 의해 통각 강도를 평가하였다. 또한 발성 수준의 강도를 각각의 동물에 대해 기록하였다. 테스트 물질은 5 ㎖/㎏의 부피 하에 정맥내 경로에 의해 맹검 및 무작위 방식으로 투여되었고, 인도메타신은 10 ㎖/㎏의 부피 하에 경구 경로에 의해 투여되었다.
항-NGF 항체 911의 진통 효과가 표 10에 제시된다. 결과는 mV (평균±SEM) 단위로 각각의 동물에 대해 기록된 발성 수준의 강도로 평가된 통각 강도, 및 비히클-치료 군의 평균 값으로부터 계산된 통각 강도의 변화％로서 각각의 군에 대해 표현된다. 치료 군과 비히클 군 사이의 통계적 유의성은 일원 분산 분석 후 잔차 분산을 사용하여 던넷 테스트(Dunnett's test)로 결정되었다 (P < 0.05).
Figure 112010083030010-pat00010
표 10에 나타난 바와 같이, 항-NGF 항체 911은 항체의 단일 투여 24시간 후 또는 4일 후 류머티스 관절염의 래트 모델에서 통증을 유의하게 감소시켰다.
실시예 7: 류머티스 관절염의 래트 모델에서의 항-NGF 길항제 항체 E3 및 911의 약 리학적 효과
내부 양성 대조군 물질로서 사용된 인도메타신과 비교하여, 래트에서의 완전프로인트 보강제 (CFA)-유도 만성 관절염의 모델에서 항-NGF 길항제 항체 E3 및 911의 약리학적 효과 (항-염증 및 진통 효과)를 연구하였다. E3 및 911의 진통 효과는 통각 응답을 측정함으로써 평가되었다. 항-염증 효과는 발 부피, 관절염 지수 (염증 점수), 체중 및 뒷발 중량에 의해 평가되었다. 발 사이토카인 수준 (IL-6, IL-1β, TNF-α 및 TGF-β1), 혈청 내의 순환 TGF-β1, E3 및 911 혈장 농도, 생물학적 파라미터 및 X-선 방사선촬영법을 실험의 말기에 수행하였다.
실험 프로토콜
1. 연구 디자인
80마리의 수컷 5주령 루이스 래트 (LEWIS Lew/Ico) (Charles River Laboratories- Belgium)가 본 연구에 포함되었다. 이들을, 연구 기간에 걸쳐 여과된 수돗물 및 표준 펠렛화 실험실 사료 (SAFE, France)에 자유롭게 접근시키면서, 온도 (19.5-24.5℃) 및 상대 습도 (45-65 ％)가 제어된, 12-시간 밝음/어두움 주기의 방에서 거주시켰다. 동물 설비에 수용시킬 때, 이들을 우리 당 5마리씩 거주시켰고, 모든 테스트 전에 10일 순응 기간이 관찰되었다. 동물은 개별적으로 꼬리에서 확인되었다.
10마리 동물 (5-주령 수컷 루이스 래트 - LEWIS Lew/Ico (Charles River Laboratories-Belgium))의 5개의 군 각각이 본 연구에 포함되었다: 군 1: 비-관절염 래트 / 식염수 (비히클), 정맥내 볼루스, n=10; 군 2: 관절염 래트 / 식염수 (비히클), 정맥내 볼루스, n=10; 군 3: 관절염 래트 / 인도메타신 3 ㎎/㎏, 10 일에 걸쳐서 매일 경구, n=10; 군 4: 관절염 래트 / E3, 1 ㎎/㎏, 정맥내 볼루스, n=10; 군 5: 관절염 래트 / 911, 10 ㎎/㎏, 정맥내 볼루스, n=10. 용량은 유리 활성 물질의 관점에서 표현되었다 (㎎/㎏). E3 및 911는 모액에서 원하는 농도로 식염수에서 즉석에서 제조되었다. E3 1 ㎎/㎏: 3.41 ㎖의 모액 (0.88 ㎎/㎖) q.s.p. 15 ㎖의 식염수. 911 10 ㎎/㎏: 12 ㎖의 모액 (2.5 ㎎/㎖) q.s.p. 15 ㎖의 식염수. 모든 희석 용액을 (정맥내 주사 전에) 0.20 μm의 무균 필터 유닛을 사용하여 멸균시켰다. 각각의 정맥내 주사 전에 희석 용액의 pH 및 삼투압 값을 측정하였다. 첫번째 정맥내 주사 전에, 식염수, E3, 및 911에 대한 삼투압 (mosm/L)은 각각 278, 269, 및 308이었고; 식염수, E3, 및 911에 대한 pH는 각각 5.93, 6.76, 6.71이었다. 두번째 정맥내 주사 전에, 식염수, E3, 및 911에 대한 삼투압 (mosm/L)은 각각 280, 270, 및 309였고; 식염수, E3, 및 911에 대한 pH는 각각 5.86, 6.72, 및 6.59였다.
E3 또는 911 또는 식염수를 5 ㎖/㎏의 부피로 코드화된 무작위 순서로 관절염 유도 후 제14일 및 제19일에 정맥내 볼루스 주사에 의해 투여하였다. 비-관절염 군에게는 5 ㎖/㎏의 부피로 제14일 및 제19일에 식염수의 정맥내 볼루스 주사를 제공하였다. 인도메타신을 1％ 메틸셀룰로오스 중에서 즉석 제조하였다. 인도메타신을 10 ㎖/㎏의 부피로 코드화된 무작위 순서로 관절염 유도 후 제14일부터 제23일까지 10일에 걸쳐서 하루에 한번 경구 경로 (p.o.)에 의해 투여하였다.
2. 관절염 유도
제0일 (D0)에, 미코박테리움 부티리쿰 현탁액 0.05 ㎖를 꼬리 내로 피내 주사함으로써 70마리의 래트에서 관절염이 유도되었다. 일군의 래트 10마리는 어떠한 피내 주사도 맞지 않았다 (비-관절염 래트). 제14일 (D14)에, 하기의 기준을 사용하여 관절염 래트가 연구에 포함되었다: 비-관절염 군에서의 평균 발 부피 (왼쪽 및 오른쪽 발 부피의 평균)와 비교하여 0.30 ㎖ 이상의 평균 발 부피 (왼쪽 및 오른쪽 발 부피의 평균)의 증가를 나타낸 래트가 모두 포함되었다 (하기에 기술된 바와 같이 발 부피 측정); 부드러운 굽힘 시 발성을 나타낸 래트가 모두 포함되었다 (하기에 기술된 바와 같이 통각 응답 측정); 각각의 뒷발에서 2-3점의 관절염 지수 점수를 나타낸 래트가 모두 포함되었다 (0점, 1점 또는 4점의 동물은 폐기되었다) (하기 기술된 바와 같이 관절염 점수 측정).
3. 체중
제0일부터 제24일까지 하루에 한번 동물을 칭량하였다 (치료 전의 주말인 날 D1, D2, D8, D9, D10 동안은 제외). 모든 측정은 D14 (오전 7:30-9:00) 및 D24 (오전 7:30-8:00)를 제외하고는 오전 9:00와 12:00 사이에 수행하였다.
3. 발 부피 측정
각각의 래트 (관절염 및 비-관절염 래트)의 오른쪽 및 왼쪽 뒷발 부피를 체적변화유량계를 사용하여 측정하였다. 측정은 하기의 시간에 수행되었다 (관절염 유도 후): 제14일 (정맥내 볼루스 또는 경구 투여 전); 및 제24일 (마지막 정맥내 볼루스 주사 5일 후 또는 마지막 경구 투여 24시간 후). 모든 측정은 오전 9:00와 12:00 사이에 수행되었다. 모든 데이타를 수집하였고, WinDas 소프트웨어에 의해 보관하였다.
4. 관절염 지수
각각의 뒷발과 앞발에 대한 염증 점수를 사용하여 관절염 지수를 평가하였다 (관절염 래트): 0점: 정상적인 양상; 1점: 홍반; 2점: 약간의 부종이 있는 홍반; 3점: 관절강직 없이 강한 염증; 4점: 관절강직. 이러한 평가를 하기의 시간에 수행하였다 (관절염 유도 후): 제14일 (정맥내 볼루스 또는 경구 투여 전); 및 제24일 (마지막 정맥내 볼루스 주사 5일 후 또는 마지막 경구 투여 24시간 후). 모든 측정은 오후 2:00와 3:00 사이 (D14), 오전 8:00와 9:00 사이 (D24)에 수행되었다. 모든 데이타를 수집하였고, WinDas 소프트웨어에 의해 보관하였다.
5. 통각 응답의 측정 (발성 테스트)
시술자의 손가락으로 4 내지 5초의 간격으로 2번 반복해서 오른쪽 및 왼쪽 뒷발을 부드럽게 굽힘으로써 통각 응답을 평가하였다 (관절염 래트). 발성 수준의 강도를 각각의 뒷발에 대해 각각의 동물들에 대해 기록하였다 (2번: 오른쪽 뒷발에서: s1 및 s3; 2번: 왼쪽 뒷발에서: s2 및 s4). 이러한 평가는 하기의 시간에 수행되었다 (관절염 유도 후): 제14일 (정맥내 볼루스 또는 경구 투여 전); 제18일 (두번째 정맥내 볼루스 주사 전 또는 경구 투여 1시간 후); 및 제24일 (마지막 정맥내 볼루스 주사 5일후 또는 마지막 경구 투여 24시간 후). 모든 측정은 D14 (오전 7:30-9:00) 및 D24 (오전 7:30-9:00)를 제외하고는 오전 9:00와 12:00 사이에 수행되었다.
6. E3 또는 911 농도 및 순환하는 TGF-β 및 혈액학적 파라미터의 측정을 위한 혈액 수집
제24일에 (발 부피 및 관절염 지수 측정 및 테스트 발성 후), 이소푸란 (산소 및 질소 산화물의 혼합물 내)을 사용하는 일반적인 마취 하에, 혈액 샘플 (약 800-1000 ㎕)을 안와후 공동으로부터 마이크로피펫으로의 모세관 작용에 의해 수집하였다.
E3 또는 911 농도의 측정 (군 2, 4 및 5): 혈액 샘플의 일부를 Li-Heparin을 함유하는 튜브 (얼음 상에 유지됨)에 수집하여, 10분 동안 2500-3000g에서 원심분리하였다. 혈장 샘플 (100 ㎕ 이상)을 수득하고, 액체 질소에서 동결시키고, -80℃에서 보관하였다. 한 샘플이 약간 용혈되었다 (비히클-치료된 관절염 래트 #36).
순환 TGF-β1의 측정 (군 1-2-3-4-5): 혈액 샘플의 일부를 주위 온도에서 혈청 제조를 위해 마이크로 튜브에 수집하였다. 샘플 수집 후, 혈액을 혼합하고 30분 동안 응고시킨 후, 원심분리하였다. 튜브를 약 6000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 각각의 혈청 샘플 (100 ㎕ 이상, 래트 #52 및 #53 제외)을 분취하고, TGF-β1 분석을 위해 샘플을 활성화시킬 때까지 -20℃에서 보관하였다. 이러한 분취물 (50개의 바이알)이 연구 말기로부터 시작하여 6개월의 기간 동안 유지되었다. 일부 샘플은 약간 용혈되었다 (비히클-치료된 비-관절염 래트: #2, #5, #9, #10; 비히클 치료된 관절염 래트: #53, #63,; E3-치료된 관절염 래트 #31, #51; 911-치료된 관절염 래트: #52, #62, #64). TGF-β1 수준을 인간 TGF-β1 ELISA 키트 (ref. DB100, Batch 212258 및 213610, R&D Systems-France)를 사용하여 측정하였다.
혈액학적 파라미터를 위한 혈액 수집 (군 1-2-3-4-5: 50개의 바이알): 혈액 샘플의 일부를 K3-EDTA을 함유하는 튜브에 수집하였다 (100 ㎕ 이상). 수집일에 파라미터의 결정을 수행하였고, 샘플은 보관되지 않았다. 적혈구, 백혈구, 혈소판, 헤모글로빈, 적혈구용적률이 포함되는 혈액학적 파라미터를 혈액학 세포 카운터로 측정하였다 (D24). 일부 혈액학적 파라미터는 응고된 샘플로 인해 측정되지 않았다 (비히클-치료된 비-관절염 래트: #10; E3-치료된 관절염 래트: #59, # 67; 911-치료된 관절염 래트: #16).
7. 발 사이토카인 수준
제24일 (마지막 정맥내 볼루스 주사 5일 후 또는 마지막 경구 투여 24시간 후)에 (X-선 방사선촬영법 후), 각각의 동물 뒷발 (관절염 및 비-관절염 래트)을 칭량하고, 표지된 폴리에틸렌 바이알에 수집하였다. 조직 샘플을 액체 질소에서 동결시키고, -80℃에서 보관하였다.
관절 균질화물의 제조: 동결된 뒷발을 Bio-Pulverizer를 사용하여 분쇄하였다. 그 후, 분말화된 뒷발을 50 ㎕의 항-프로테아제 칵테일이 보충된 3 ㎖ PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 원심분리 튜브 상에 놓고, Ultra-Turrax 균질화기 (최대 속도의 50％)를 사용하여 얼음 상에서 균질화시켰다. 그 후, 균질화물을 2000×g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 0.2 ㎛ Sartorius 필터를 통해 여과시하고, 분취하여, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
사이토카인 수준 측정: TNF-α (래트 TNF-α ELISA 키트, ref. RTA00, Batch 213718, R&D Systems, France), IL-1β (래트 IL-1β ELISA 키트, ref. RLB00, Batch 212435, R&D Systems, France), IL-6 (래트 IL-6 ELISA 키트, ref. R6000, Batch 211773,214008 및 214362, R&D Systems, France), 및 TGF-β1 (인간 TGF-β1 ELISA 키트, ref. DB100, Batch 212258 및 213610, R&D Systems, France)의 사이토카인 수준을 제조업자의 절차에 따라 이중으로 결정하였다. 뒷발 균질화물의 분취물이 -80℃에서 보관되었다.
8. X-선 분석
제24일에, 혈액 수집 후 동물을 희생시키고, 관절 병변의 평가를 위해 X-선 방사선촬영법 (뒷발)이 수득되었다. X-선 분석은 양쪽 뒷발에서의 관절 진무름, 관절 공간, 골막 이상에 초점이 맞춰졌다. 모든 방사선촬영법은 7개의 상이한 항목을 살펴봄으로써 분석되었다: 연조직 손상, 기형, 광물질손실, 관절 공간, 진무름, 골형성 및 골막성 반응. 각각의 동물에 대해서, 첫번째 6개 항목은 더 불량한 뒷발을 살펴봄으로써 독립적으로 분석되었다. 골막성 반응은 꼬리를 살펴봄으로써 분석되었다. 각각의 항목에 대해서, 점수는 0 (정상) 내지 4 (최대 손상)이다. 따라서 전체 점수는 0 내지 28이 된다. 방사선촬영법 해석은 동물 (치료 여부)에 대해 아무것도 모르는 동일한 판독자에 의해 수행되었다.
9. 관찰
한 동물(# 65)이 미지의 이유로 인해 인도메타신 투여 후 D23에 사망하였다 (D23에 투여하기 전에).
10. 결과의 분석 및 표현
모든 결과는 각각의 시점에서 각각의 군에서 10마리 래트의 평균 ± S.E.M.으로 보고되었다. 발 부피는 오른쪽 및 왼쪽 발 부피의 평균 값으로부터 계산된 ㎖로 표현되었다. 관절염 지수는 4개의 발 각각에 대해 수득된 점수의 합계로부터 계산되었다. 통각 응답은 mV로 각각의 동물에 대해 기록된 발성 수준의 강도에 의해 평가되었다 (4개의 값 (2회/발)의 평균). 통각 응답의 억제％는 비히클-치료된 관절염 군의 평균 값으로부터 계산되었다 [(비히클-치료된 군의 평균값 - 치료된 관절염 군의 평균 값 / 비히클-치료된 관절염 군의 평균 값) * 100]. 체중은 그램으로 표현되었다. 뒷발 (왼쪽 및 오른쪽) 중량은 그램으로 표현되었다. 각각의 뒷발의 사이토카인 수준 (IL-6, IL-1β, TNF-α 및 TGF-β1)은 pg/㎖으로 표현되었다. TGF-β1의 순환 수준은 pg/㎖으로 표현되었다. 각각의 파라미터 (광물질손실, 진무름, 골막성 반응, 연조직 손상, 공간 관절, 골형성 기형)에 대한 방사성 지수 및 총 방사성 지수 (전체 점수)는 각각의 파라미터에 대해 수득된 점수의 합계로부터 계산되었다. 동일한 분산 또는 정규성 테스트가 실패했을 때 스튜던트(Student) t 테스트 또는 맨-휘트니 랭크 섬 테스트(Mann-Whitney Rank Sum test)에 의해 비히클-치료된 군 (관절염 래트)과 비히클-치료된 군 (비-관절염 래트)의 값 사이의 편차의 군-간 유의성이 평가되었다. 비히클-치료된 군 (관절염 래트)과 E3- 및 911-및 인도메타신-치료된 군의 값 사이의 편차의 군-간 유의성은 일원 분산 분석 ANOVA에 이어서 쌍을 이루지 않은 던넷 t 테스트에 의해 평가되었다. P≤ 0.05의 확률이 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계적 분석은 Sigmastat™ 소프트웨어에 의해 수행되었다.
결과
1. 통각 응답 (발성 테스트)
표 11 및 도 18에서 나타난 바와 같이, D14에, 통각 응답은 비히클-, 인도메타신-, E3-, 및 911-치료된 관절염 군에서 각각 4147±331, 4386±235, 4644±367 및 4468±143이었다. 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후에 비히클-치료된 관절염 군에 비해 D18과 D24에 각각 약 -3768 mV (억제％: 71 ％) 및 -4353 mV (억제％: 74 ％)만큼 통각 응답을 강하게, 그리고 유의하게 감소시켰다 (D18: 1511±398 대 5279±326 mV; D24: 1552±508 대 5905±345 mV). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 D18 및 D24에 각각 약 -4167 mV (억제％: 79 ％) 및 -5905 mV (억제％: 100 ％)만큼 통각 응답을 강하게, 그리고 유의하게 감소시켰다 (D18: 1112±401 대 5279±326 mV; D24: 0±0 대 5905±345 mV). 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내 2 일)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 D18 및 D24에 각각 약 -3932 (억제％: 74 ％) 및 -5358 mV (억제％: 91 ％)만큼 통각 응답을 강하게, 그리고 유의하게 감소시켰다 (D18: 1347±492 대 5279±326 mV; D24: 547±307 대 5905±345 mV).
Figure 112010083030010-pat00011
2. 체중
표 12 및 도 19에 나타난 바와 같이, 관절염 확립으로 인해 D0에서 D14로 체중 증가에서의 두드러진 감소가 비-관절염 래트에 비해 관절염 래트에서 관찰되었다. D14 (선택일)에, 관절염 래트는 비-관절염 래트와 비교하여 체중의 유의한 감소를 나타냈다 (289±2 대 217±4 g) (스튜던트 t 테스트 P < 0.05). 그러나, 모든 관절염 군에서 체중 (D14)에서의 어떠한 유의한 변화도 검출되지 않았다 (던넷 t 테스트 P > 0.05). 체중은 인도메타신-치료된 군 (10일 동안 3 ㎎/㎏/일)에서 D17에서 D24로 적당하게, 그리고 유의하게 증가되었고, 비히클-치료된 관절염 군과 비교하여 D24에 최대 약 43 g이었다 (261±5 대 218±3 g). E3 치료 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내) 후, 체중이 D17에서 D24로 적당하게, 그리고 유의하게 증가되었고, 비히클-치료된 관절염 군과 비교하여 D24에서 최대 약 46 g이었다 (264±5 g 대 218±3 g). 911 치료 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내) 후, 체중이 D18에서 D24로 적당하게, 그리고 유의하게 증가되었고, 비히클-치료된 관절염 군과 비교하여 D24에서 최대 약 47 g이었다 (265±7 대 218±3 g).
Figure 112010083030010-pat00012
3. 발 부피
D14에, 발 부피의 관점에서 균질한 군을 수득하기 위하여 무작위화를 수행하였다. 표 13에 나타난 바와 같이, D14에, 뒷발 부피 (오른쪽 및 왼쪽 발 부피의 평균)가 비-관절염 군에서의 부피보다 관절염 군에서 유의하게 더 컸다 (2.10±0.05 대 1.44±0.02 ㎖ (스튜던트 t 테스트 P < 0.05)). 인도메타신 (10일 동안 3 ㎎/㎏/일 경구)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 약 -0.75 ㎖만큼 발 부피를 유의하게 감소시켰다 (D24) (1.59±0.03 ㎖ 대 2.34±0.08 ㎖). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 약 0.37 ㎖만큼 발 부피를 약간, 그리고 유의하게 증가시켰다 (2.71±0.09 ㎖ 대 2.34±0.08mL). 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 약 0.36 ㎖만큼 발 부피를 약간, 그리고 유의하게 증가시켰다 (2.70±0.11 ㎖ 대 2.34±0.08 ㎖).
Figure 112010083030010-pat00013
4. 관절염 지수
표 14에 나타난 바와 같이, D14에, 관절염 지수는 비히클-. 인도메타신-, E3-, 및 911-치료된 관절염 군에서 각각 10.1±0.8, 8.7±0.6, 10.2±0.4 및 9.4±0.7이었다. 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후 비히클-치료된 관절염 군에 비해 최대 약 -8.0만큼 관절염 지수를 강하게, 그리고 유의하게 감소시켰다 (2.7±0.7 대 10.7±0.6). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 관절염 지수에 영향을 미치지 않았다 (11.4±0.4 대 10.7±0.6). 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)는 비히클-치료된 관절염 군에 비해 관절염 지수에 영향을 미치지 않았다 (10.9±0.7 대 10.7±0.6).
Figure 112010083030010-pat00014
5. 발 사이토카인 수준
표 15에 나타낸 바와 같이, D24에, 왼쪽 및 오른쪽 발 사이토카인 수준이 비히클-치료된 비-관절염 군과 비교하여 최대 약 3.5배 (IL-1β), 4배 (TNF-α) 및 1.8배 (TGF-β1)만큼 비히클-치료된 관절염 군에서 증가되었다. IL-6 수준에 대해서는, 2개의 군 사이에 유의한 차이가, 오른쪽 및 왼쪽 발에서, 관찰되지 않았다. 관절염 군의 사이토카인 수준은 왼쪽 및 오른쪽 발에서 유사하였다: IL-6, IL-1β, TNF-α 및 TGF-β1에 대해 각각 259.7±38.5 대 219.2±32.4, 4802.8±365.5 대 4007.1±380.4, 17.8±1.6 대 18.6±1.9 및 9735.0±1219.8 대 9161.4±846.1 pg/㎖. 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후 비히클-치료된 관절염 군에 비해 약 1.3배만큼 오른쪽 발에서 TGF-β1 수준을 약간, 그러나 유의하게 감소시켰지만 (7057.4±335.6 대 9161.4±846.1), IL-6, TNF-α 또는 IL-1β 수준은 변형시키지 않았다. 유사하지만 유의하지 않은 효과가 왼쪽 발에서 관찰되었다. E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)는 비히클-치료된 관절염 군에 비해 양쪽 발에서 IL-6, IL-1β, TNF-α 또는 TGF-β1 수준에 영향을 미치지 않았다. 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 오른쪽 발에서 IL-1β 수준을 증가시켰다 (6215.3±666.7 대 4007.1±380.4). 911은 양쪽 발에서 다른 사이토카인 수준에는 효과가 없었다.
Figure 112010083030010-pat00015
6. 순환 TGF-β1의 측정
표 16에 나타난 바와 같이, D24에, 혈청 TGF-β1 수준이 비히클-치료된 비-관절염 군에 비해 비히클-치료된 관절염 군에서 증가되었다 (81715.7±1984. 1 대 60269.9±2142.8). 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후 비히클-치료된 관절염 군에 비해 약 1.5배만큼 혈청 TGF-β1 수준을 유의하게 감소시켰다 (57222.2±3194.1 대 81715.7±1984.1). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내) 및 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)은, E3- 및 911-치료된 군에서의 사이토카인 수준이 비히클-치료된 비-관절염 군에서 관찰된 것들과 필적하도록 (각각 69408.8±3926.7 및 67214.5±3649.4, 대 60269.9±2142.8), 혈청 TGF-β1 수준을 유의하게 감소시켰다.
Figure 112010083030010-pat00016
7. 혈액학적 파라미터
표 17에 나타난 바와 같이, 백혈구 및 혈소판과 같은 혈액학적 파라미터는 비히클-치료된 비-관절염 래트에 비해 비히클-치료된 관절염 래트에서 더 컸던 반면 (스튜던트 t 테스트 P < 0.05), 적혈구, 헤모글로빈 및 적혈구용적률은 변하지 않았다 (스튜던트 t 테스트 P > 0.05). 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후에 비히클-치료된 관절염 군에 비해 혈액 파라미터에 영향을 미치지 않았다. E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 혈액 파라미터에 영향을 미치지 않았다. 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내 )은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 혈액 파라미터에 영향을 미치지 않았다.
Figure 112010083030010-pat00017
7. 뒷발 중량
표 18에 나타난 바와 같이, 왼쪽 및 오른쪽 뒷발 중량이 비히클-치료된 비-관절염 래트보다 비히클-치료된 관절염 래트에서 더 컸다 (각각 3.43±0.11 대 1.98±0.01 및 3.32±0.12 대 1.99±0.02 g) (스튜던트 t 테스트 또는 맨-휘트니 P < 0.05). 인도메타신은 3 ㎎/㎏/일 경구 투여 (10일 동안) 후 비히클-치료된 관절염 군에 비해 뒷발 중량을 유의하게 감소시켰다 (왼쪽 뒷발: 2.23±0.04 대 3.43±0.11 g; 오른쪽 뒷발: 2.20±0.05 대 3.32±0.12 g). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 왼쪽 뒷발 중량만을 유의하게 증가시켰다 (왼쪽 뒷발: 3.86±0.14 대 3.43±0.11 g; 오른쪽 뒷발: 3.72±0.13 대 3.32±0.12 g). 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 오른쪽 뒷발 중량만을 유의하게 증가시켰다 (왼쪽 뒷발: 3.73±0.12 대 3.43±0.11 g; 오른쪽 뒷발: 3.83±0.15 대 3.32±0.12 g).
Figure 112010083030010-pat00018
8. X-선 분석
표 19에 나타난 바와 같이, 비히클-치료된 비-관절염 래트에서 0.0±0.0의 총점이 관찰되었다. 비히클-치료된 관절염 래트는 광물질손실 (2.4±0.3), 진무름 (2.7±0.3), 연조직 손상 (3.1±0.2) 및 공간 관절 (3.3±0.2)에 대한 높은 점수, 골막성 반응 (1.0±0.3), 골형성 (0.8±0.2) 및 기형 (1.8±0.2)에 대한 적절한 점수로 총점이 15.1±1.3이었다. 인도메타신 (3㎎/㎏/일, 10일 동안 경구 투여)은 비히클-치료된 관절염 래트에 비해 약 10.7만큼 총점을 강하게, 그리고 유의하게 감소시켰다 (4.4±0.9 대 15.1±1.3). E3 (D14 및 D19에 1 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 총점에 영향을 미치지 않았다 (14.2±1.3 대 15.1±1.3). 911 (D14 및 D19에 10 ㎎/㎏ 정맥내)은 비히클-치료된 관절염 군에 비해 총점에 영향을 미치지 않았다 (15.4±1.0 대 15.1±1.3).
Figure 112010083030010-pat00019
결론
상기 기술된 실험 조건하에서, E3 (1 ㎎/㎏ 정맥내, 2 일: D14 및 D19) 및 911 (10 ㎎/㎏ 정맥내, 2 일: D14 및 D19)은 강한 진통 효과를 나타냈지만, 이러한 관절염 모델에서 유의한 항-염증 효과를 나타내지 않았다.
실시예 8: 류머티스 관절염의 래트 모델에서의 여러 용량의 항-NGF 항체 E3의 효과
관절염 래트에서 통증 감소를 일으키는 E3의 능력을 E3 투여와 통증 감소 사이의 용량 응답 관계를 시험함으로써 더욱 연구하였다. 래트를 상기 기술된 바와 같이 관절염을 유도하는 보강제로 처리하였다. 보강제가 주사되지 않은 10마리의 래트가 비-관절염 대조군으로서 사용되었다. 보강제 주사 14일 후, 상기 언급된 기준을 기초로 동물들이 연구에 허가되었고, 래트 10마리의 군 8개로 무작위화되어 발성 응답 강도에 대해 테스트되었다. 그 후, 상기 기술된 바와 같이 이들에게 제14일에 식염수, 또는 0.003 ㎎/㎏, 0.01 ㎎/㎏, 0.03㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 E3 항체를 투여하였다. 제16일, 제18일, 제20일, 및 제24일에 동물들을 이의 발성 응답에 대해 테스트하였다. 발성 테스트 후 제18일에 식염수 또는 동일한 용량의 E3를 동물에게 다시 투여하였다. 또한 제14일에 시작하여 각각의 날에 동물을 칭량하였다. 따라서, 동물에게 소정의 용량의 항체 또는 식염수가 제14일 및 제18일에 2회 투여되었고, 제14일, 제16일, 제18일, 제20일, 및 제24일에 통증에 대해 5회 평가되었다. 데이타가 표 20-22 및 도 20-22에 제시된다.
Figure 112010083030010-pat00020
통증에 의해 유도된 발성 (표 20에 제시된 데이타)에 대한, 다양한 용량의 항-NGF 항체 E3로 동물을 치료하는 것의 효과를 2원 ANOVA를 사용함으로써 통계적으로 분석하여, 비히클로 치료된 관절염 동물과 소정의 용량의 항체 E3로 치료된 것들 사이에 쌍을 이루어 수득된 결과들을 비교하였다. 테스트된 모든 수준의 E3에서 매우 유의한 효과가 있었다 (p < 0.0001). 테스트된 테스트된 가장 낮은 용량 (0.003 ㎎/㎏의 E3)에서도, 발성에서의 차이가 유의하였다 (p < 0.0001).
표 20 및 도 20에 나타난 바와 같이, 상기 실험과 일치하여, 1 ㎎/㎏의 항체 E3로의 치료는 통증의 신속하고 확실한(robust) 해소를 나타냈다. 2일 (테스트된 가장 빠른 시점) 내에, 발성 강도가 90％까지 떨어졌다. 비록 더 낮은 용량에서 통증 해소가 명백해지는데 다소 더 오래 걸렸지만, 더 낮은 농도의 E3로의 치료 또한 확실한 통증 해소를 제공하였다. 테스트된 가장 높은 용량을 제외한 모든 용량의 제24일에 효능에서의 명백한 감소는 피험 래트에 의한 면역 응답에 2차적인 혈장 E3 수준의 실제 수준에서의 감소로 인한 것일 것이다. 0.003 ㎎/㎏ 정도로 낮은 용량이 이러한 모델에서 적어도 부분적인 통증 해소를 제공하는 것이 명백하다.
Figure 112010083030010-pat00021
Figure 112010083030010-pat00022
체중에 대한, 다양한 용량의 항-NGF 항체 E3로 동물을 치료하는 것의 효과를 2원 ANOVA를 사용함으로써 통계적으로 분석하여, 비히클로 치료된 관절염 동물과 소정의 용량의 항체 E3로 치료된 것들 사이에 쌍을 이루어 수득된 결과들을 비교하였다. 제14일의 체중에 대해 표준화된 데이타 (표 21)를 사용하여, 0.03 ㎎/㎏ 용량의 E3로 체중에서 유의한 변화가 초래되었다 (p < 0. 005). 모든 더 높은 용량의 E3에서, 치료된 관절염 동물과 치료되지 않은 관절염 동물 간의 차이는 유의하였다 (p ≤ 0.0001). 제0일의 체중에 대해 표준화된 데이타 (표 22)를 사용하여, 0.03 ㎎/㎏ 용량의 E3로 체중에서 유의한 변화가 초래되었다 (p < 0.002). 모든 더 높은 용량의 E3에서, 치료된 관절염 동물과 치료되지 않은 관절염 동물 간의 차이는 유의하였다 (p < 0.0001).
다시 앞서의 연구와 일치하여, E3로 치료된 래트는 식염수로 치료된 관절염 래트보다 덜 명백한 체중 손실을 나타냈다 (표 22 및 도 22). 실제로, 높은 용량의 항체 E3로 치료된 래트는 더 이르게 체중 손실을 회복하고 있었고, 실제로 비-관절염 코호트보다 더 빠르게 체중이 증가되고 있었다 (표 21 및 도 21).
실시예 9. 무릎의 골관절염으로 인한 중간 내지 심한 통증이 있는 환자에서의 항-NGF 항체 E3의 효과
이러한 무작위화되고, 위약에 의해 제어되는, 이중 맹검식의 용량-에스컬레이션 연구에서, 단일 정맥내 용량 (3 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏, 30 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏, 또는 300 ㎍/㎏)의 항-NGF 항체 E3의 진통 효과가 무릎의 골관절염으로 인한 중간 내지 심한 통증이 있는 환자에서 위약과 비교되었다. 무릎의 골관절염으로 인한 중간 내지 심한 통증을 겪고 있지만 다른 면에서는 전체적으로 건강한 성인 남성 및 여성 (35세 내지 65세)이 연구에 등록되었다. 스크리닝 기간 동안, 환자들에게 항-NGF 항체 E3을 투여하기 적어도 14일 전에 NSAID, 시클로옥시게나제 유형-2 (COX-2) 억제제 및 아편제와 같은 관절염 약물을 중단하도록 요구하였다. 실험실에서의 발견 또는 과거의 병력을 기초로 약간 제한하면서 아세트아미노산 또는 이부프로펜의 구조 약물을 사용하는 것을 환자들에게 허용하였다. 일부 환자들은 연구 동안 구조 약물을 섭취하였지만, 항-NGF 항체 E3의 투여 전후로 2일 동안은 구조 약물이 소비되지 않았다.
24명의 환자가 허용되었고, 제-1일, 제1일 및 제2일의 연구일에 입원환자로 평가되었다. 제1일 아침에 항-NGF 항체 E3를 투여하였다. 전자 다이어리를 사용하여, 진료소 및 집에서의 인덱스 무릎 통증 및 구조 약물 사용을 기록하였다. 10명의 환자를 위약으로 치료하였다. 24명의 환자를 항-NGF 항체 E3로 치료하였다: 3 ㎍/㎏ (코호트 1), 10 ㎍/㎏ (코호트 2), 및 30 ㎍/㎏ (코호트 3)의 용량 수준 당 4명의 환자; 및 100 ㎍/㎏ (코호트 4) 및 300 ㎍/㎏ (코호트 5)의 용량 수준 당 6명의 환자. 사용된 위약은 무균 0.9％ 염화나트륨 주사액 USP (생리식염수). 항-NGF 항체 E3는 10 mM 히스티딘, 275 mM 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 20의 수용액 (pH 6.0) 내의 10 ㎎/㎖ 항체로 구성된 동결 액체 제형이었다. 정맥내 투여 1시간 전에, 동결 항체를 해동시키고, 염화나트륨 주사액 USP 내로 희석하였다. 각각의 환자에 대한 부피를 대상의 제-1일의 체중 및 할당된 용량 수준을 기초로 계산하여고, 이는 코호트 1에 대해 3-6 cc, 코호트 2에 대해 10-20 cc, 코호트 3에 대해 30-60 cc, 및 코호트 4 및 코호트 5에 대해 100 cc 범위였다. 코호트 1 및 2에 대해, 항체 E3가 저속 IV 볼루스에 의해 3 내지 5분에 걸쳐 투여된 후, 5 cc의 염화나트륨 주사액 염화나트륨 주사액 USP의 IV 플러시(flush)가 이어졌다. 코호트 3-5에 대해, 항체 E3가 100 cc/시로 주입 펌프를 통해 투여된 후, 5 cc의 염화나트륨 주사액 염화나트륨 주사액 USP의 IV 플러시 및 IV의 정지가 이어졌다. 각각의 코호트 내에서, 위약 (염화나트륨 주사액 USP)이 항체 E3와 동일한 방식으로 저속 볼루스 또는 연속 주입에 의해 투여되었다..
2일 동안의 입원 후, 환자를 집으로 돌려보냈다. 용량 수준 코호트에 따라, 항체 E3 투여 후 28일 동안 (코호트 1, 2, 및 3), 또는 항체 E3 투여 후 181일까지 (코호트 4 및 5), 환자들을 평가하였다. 모든 환자에서 181일 동안 주기적인 안전 평가를 수행하였다.
투여 전 및 항체 E3의 투여 후 여러 시점에 진통 효과를 평가하였다. 101 포인트의 분해능이 있는 0-100 범위의 인가된 전자 VAS가 현재의 인덱스 무릎 통증에 사용되었다. 환자들은 하루에 4번 신호를 보냈고, 그 순간 인덱스 무릎에서의 관절염 통증 수준을 가리키도록 교육되었다. 101 포인트의 분해능이 있는 0-100 범위의 인가된 전자 VAS가 보행 동안의 인덱스 무릎 통증에 또한 사용되었다. 보행 동안의 인덱스 무릎 통증에 대한 VAS는 4번째의 현재의 인덱스 무릎 통증 VAS와 동시에 매일 완료되었다.
데이타 수집용 전자 다이어리가 제-8일에 지급되었고, 제-8일에서 제-2일까지 전자 다이어리 순응도의 7-일 스크리닝 평가가 수행되어, 소정의 대상에 대해 전자 다이어리를 사용하는 것에서의 성공이 결정되었다. 하루에 4회의 다이어리를 완료하도록 대상을 교육하였다. 스크리닝 기간 동안 기록된 평균 VAS가 효능 평가를 위한 기준선으로 사용된다.
WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Scale) 3.1 골관절염 지수 버젼 VA.1ⓒ가 또한 관절염 통증의 평가에 사용되었다. WOMAC 3.1™은 3개의 도메인으로 나누어진 24개의 질문으로 구성된다: 통증 (5개의 질문), 경직 (2개의 질문), 및 신체 기능 (17개의 질문). [Bellamy et al., J. Rheumatol 15:1833-40 (1988)]; 및 [Bellamy, Semin. Arthritis Rheum. 18:14-7 (1989)]. 신체 기능 도메인은 일상적인 생활의 활동을 수행하는 능력의 정보를 제공한다. 101 포인트의 분해능이 있는 0-100 범위의 인가된 전자 VAS를 사용하여, 지정된 진료소 방문 동안 전자 다이어리 상에서 환자가 테스트를 직접 수행하였다. 구성 질문의 VAS 점수의 평균을 결정함으로써 각각의 도메인의 점수를 매겼다. 3개의 도메인 각각으로부터의 점수의 평균을 결정함으로써 총 WOMAC 3.1™의 점수를 매겼다. 또한 전자 다이어리를 통하여 사용된 구조 약물을 보고하도록 환자에게 요구하였다.
여러 용량 수준에 대해 통증 강도 차이 (PID: pain intensity difference) 또는 통증 강도 차이 합계 (SPID: summed pain intensity difference)로 표현되는, 기준선 (스크리닝 기간 동안의 통증 수준)으로부터의 변화로서 결과가 평가되었다. 활성 측정에서의 기준선으로부터의 변화를 치료를 주요 인자로 하고 기준선 통증을 공변량으로 하여 공분산 (ANCOVA) 모델을 사용하여 분석하였다. 평균 및 평균 변화에 대해, 항체 E3와 위약을 던넷 테스트를 사용하여 비교하였다. 터키-시미네라-헤세(Tukey-Ciminera-Heyse) 경향 테스트를 사용하여 용량-응답 관계를 평가하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 테스트된 모든 용량에서 항-NGF 항체 E3의 단일 투여 후 평균 일일 통증 강도에서의 감소가 관찰되었다. 일반적으로, 통증 강도를 감소시키는 것에서의 효과는 낮은 용량 (3 ㎍/㎏ 및 10 ㎍/㎏)으로 치료된 군보다 높은 용량 (30 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏ 및 300 ㎍/㎏)으로 치료된 군에서 더 오래 지속되었다. 도 25에 나타난 바와 같이, 100 ㎍/㎏의 E3의 투여 후 통증 강도 감소가 적어도 80일 동안 지속되었다.
하기의 표 23은 기준선 수준과 비교하여 제2일-제8일, 제2일-제14일, 제2일-제21일, 및 제2일-제28일 동안의 각각의 용량의 E3에 대한 통증 강도 차이 합계 (SPID)를 나타낸다. ANCOVA가 통계학적 분석에 사용되었다. 표 23은 항-NGF 항체 E3의 단일 투여 후 통증 감소가 통계적으로 유의하였음 (p < 0.05)을 가리킨다.
Figure 112010083030010-pat00023
도 26에 나타난 바와 같이, 항-NGF 항체 E3의 단일 투여에 의한 SPID에서의 최대 감소 백분율이 테스트된 모든 E3 용량에 대해 제2일부터 제14일까지 약 45％ 내지 약 65％에 도달하였고, 10 ㎍/㎏, 30 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏, 및 300 ㎍/㎏ E3 용량에 대해 제2일에서 제28일까지 약 45％ 내지 약 60％에 도달하였다.
도 27에 나타난 바와 같이, 항-NGF 항체 E3의 투여는 제1일부터 제28일까지 WOMAC 점수를 또한 감소시켰다. 통증, 신체 기능 및 경직 점수가 100 ㎍/㎏ 용량의 E3에서 유의하게 감소되었다. 이러한 데이타는 항-NGF 항체의 단일 투여가 통증을 감소시킬 뿐만 아니라, 또한 골관절염이 있는 환자에서 신체 기능 및 경직을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
생물학적 물질의 기탁
하기의 물질들이 <American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA)> (ATCC)에 기탁되었다:
물질 ATCC 접속 번호 기탁일
Eb.911.3E E3 경쇄 PTA-4893 2003년 1월 8일
Eb.pur.911.3E E3 경쇄 PTA-4894 2003년 1월 8일
Db.911.3E E3 중쇄 PTA-4895 2003년 1월 8일
벡터 Eb.911.3E는 E3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고; 벡터 Eb.pur.911.3E은 E3 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 벡터 Db. 911.3E은 E3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
이러한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다 (부다페스트 조약). 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조건 하에, 그리고 Rinat Neuroscience Corp.와 ATCC 간의 협약을 조건으로 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 상기 협약은 관련된 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시 (어느 것이든지 먼저인 것), 기탁된 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 공중이 입수할 수 있는 것을 보장하고, 35 USC 122항 및 이에 따른 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 CFR 1.14항 포함)에 따라 자격이 있는 것으로 미국 특허상표청장에 의해 결정된 이가 자손을 입수할 수 있는 것을 보장한다.
본 출원의 특허권자는 기탁된 물질의 배양물이 적절한 조건 하에 배양되었을 때 사망하거나, 손실되거나 파괴되면, 물질이 공고시에 즉시 동일한 또다른 것으로 대체될 것이라는 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수가능성은 어떠한 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 발명을 실행하는 자격증으로 해석되지 않아야 한다.
항체 서열
중쇄 가변 영역 (캐벗 CDR에는 밑줄이 쳐진다; 코티아 CDR은 진한 이탤릭체 이다)
Figure 112010083030010-pat00024
경쇄 가변 영역 (캐벗 CDR에는 밑줄이 쳐진다; 코티아 CDR은 진한 이탤릭체 이다)
Figure 112010083030010-pat00025
E3 중쇄의 확장된 CDR
CDRH1: GFSLIGYDLN (서열 3)
CDRH2: IIWGDGTTDYNSAVKS (서열 4)
CDRH3: GGYWYATSYYFDY (서열 5)
E3 경쇄의 확장된 CDR
CDRL1: RASQSISNNLN (서열 6)
CDRL2: YTSRFHS (서열 7)
CDRL3: QQEHTLPYT (서열 8)
마우스 모노클로날 항체 911의 확장된 CDR
911 중쇄의 확장된 CDR
CDRH1: GFSLIGYDIN (서열 9)
CDRH2: MIWGDGTTDYNSALKS (서열 10)
CDRH3: GGYYYGTSYYFDY (서열 11)
911 경쇄의 확장된 CDR
CDRL1: RASQDISNHLN (SEQID N0: 12)
CDRL2: YISRFHS (서열 13)
CDRL3: QQSKTLPYT (서열 14)
E3 중쇄 아미노산 서열 (전장)
Figure 112010083030010-pat00026
3E 경쇄 아미노산 서열 (전장 항체)
Figure 112010083030010-pat00027
3E 중쇄 뉴클레오티드 서열 (전장 항체)
Figure 112010083030010-pat00028
3E 중쇄 가변 도메인 뉴클레오티드 서열
Figure 112010083030010-pat00029
3E 경쇄 뉴클레오티드 서열 (전장 항체)
Figure 112010083030010-pat00030
3E 경쇄 가변 도메인 뉴클레오티드 서열
Figure 112010083030010-pat00031
본원에 기술된 예 및 실시양태는 단지 설명의 목적이고, 다양한 변형 또는 변화가 이에 비추어 당업자들에게 시사될 것이고, 본 출원의 취지 및 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA04893 20030108 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA04894 20030108 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA04895 20030108
서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

  1. 유효량의 항-신경 성장 인자(항-NGF) 길항제 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하고, 골관절염에 걸린 개체에서 경직을 개선하기 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 개체가 인간인 제약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 1주일에 1번 내지 12주에 1번의 투여 빈도로 투여되는 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 8주일에 1번 투여되는 제약 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 1개월에 1번, 2개월에 1번, 3개월에 1번, 4개월에 1번, 5개월에 1번, 또는 6개월에 1번 투여되는 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 3 ㎍/㎏ 내지 1 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 투여되는 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 100 ㎍/㎏ 또는 300 ㎍/㎏의 용량으로 투여되는 제약 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 정맥내 또는 피하 투여되는 제약 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 모노클로날 항체인 제약 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 인간화 항체인 제약 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 인간 NGF에 결합하는 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 설치류 NGF에 추가로 결합하는 제약 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가
    (a) 2 nM 미만의 KD로 NGF에 결합하거나;
    (b) 15 pM 인간 NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 100 pM 이하의 IC50으로 억제하거나;
    (c) 1.5 pM NGF의 존재 하에 IC50을 측정했을 때 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 인간 NGF-의존적 생존을 10 pM 이하의 IC50으로 억제하거나, 또는 (a) 내지 (c)의 조합을 만족하고,
    여기서 상기 항체는 항체 MAb 911과 동일한 인간 NGF 에피토프에 결합하는 것인 제약 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가
    (a) 서열 1의 중쇄 가변 영역으로부터의 3개의 CDR, 및 서열 2의 경쇄 가변 영역으로부터의 3개의 CDR을 포함하거나, 또는
    (b) 상기 (a)에 따른 항체와 인간 NGF와의 결합에서 경쟁하는
    것인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가
    (a) 서열 3에 제시된 CDR1 영역;
    (b) 서열 4에 제시된 CDR2 영역; 및
    (c) 서열 5에 제시된 CDR3 영역
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (a) 서열 6에 제시된 CDR1 영역;
    (b) 서열 7에 제시된 CDR2 영역; 및
    (c) 서열 8에 제시된 CDR3 영역
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 서열 1 및 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체가 서열 16 및 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체인 제약 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 유효량의 항-신경 성장 인자(항-NGF) 길항제 항체, 및 유효량의 항-NGF 항체를 골관절염에 걸린 개체에게 투여하는 것에 대한 사용설명서를 포함하는, 상기 개체에서 경직을 개선하기 위한 키트.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102746399B (zh) * 2002-12-24 2016-03-02 里纳特神经系统学公司 抗ngf抗体及其使用方法
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
AU2011201157C1 (en) * 2002-12-24 2017-09-07 Rinat Neuroscience Corp. Anti-NGF antibodies and methods using same
US7569364B2 (en) * 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
EP2364728A1 (en) 2003-07-15 2011-09-14 Amgen, Inc Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors
ITRM20030601A1 (it) * 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
ME00226B (me) * 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
EP2129401B8 (en) * 2006-12-21 2020-01-15 Amgen Inc. Stable buffered formulations containing polypeptides
US8309088B2 (en) * 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
KR101709488B1 (ko) 2007-08-10 2017-02-24 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 인간 신경성장인자에 대한 고친화성 인간 항체
US8298536B2 (en) 2008-03-04 2012-10-30 Pfizer Limited Methods of treating inflammatory pain
NZ588554A (en) 2008-04-29 2013-03-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256246B2 (en) * 2008-06-03 2013-07-18 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ603698A (en) 2008-07-08 2014-03-28 Abbvie Inc Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010022398A1 (en) * 2008-08-22 2010-02-25 Isaac Melamed Diagnosis and treatment of neuro-inflammatory disorders
WO2010032220A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Pfizer Inc. Stable liquid antibody formulation
US10260070B2 (en) 2008-09-24 2019-04-16 Ribomic Inc. Aptamer for NGF and use thereof
RU2712166C2 (ru) 2008-12-22 2020-01-24 Де Юниверсити Оф Мельбурн Лечение боли
DK2448970T3 (da) 2009-05-04 2014-10-06 Abbvie Res B V Antistoffer mod nervevækstfaktor (ngf) med forbedret in vivo-stabilitet
CN102740884A (zh) 2009-08-28 2012-10-17 瑞纳神经科学公司 通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法
DK2542257T3 (en) 2010-03-01 2017-10-16 Bayer Healthcare Llc OPTIMIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST Tissue FACTOR ROAD INHIBITOR (TFPI)
CN102892430A (zh) 2010-03-17 2013-01-23 雅培研究有限公司 抗神经生长因子（ngf）抗体组合物
CA2794199C (en) 2010-03-24 2017-11-14 Shionogi & Co., Ltd. Aptamer for ngf and use thereof
SG188190A1 (en) 2010-08-03 2013-04-30 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP3333188B1 (en) 2010-08-19 2022-02-09 Zoetis Belgium S.A. Anti-ngf antibodies and their use
KR20130139884A (ko) 2010-08-26 2013-12-23 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
WO2012075340A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alderbio Holdings Llc Anti-ngf compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
WO2012170452A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
ES2663968T3 (es) 2011-08-11 2018-04-17 Astellas Pharma Inc. Anticuerpo anti-NGF humano nuevo
KR102021626B1 (ko) * 2011-09-28 2019-09-16 후지모토 세이야쿠 가부시키가이샤 Ngf에 대한 압타머 및 그의 용도
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
JP2015503592A (ja) * 2012-01-05 2015-02-02 ビーチ ツリー ラボ、インコーポレイテッド 神経成長因子の投与による疼痛処置方法
JP6242350B2 (ja) 2012-03-14 2017-12-06 レヴィセプト エルティーディーＬｅｖｉｃｅｐｔ Ｌｔｄ Ｐ７５ｎｔｒニューロトロフィン結合タンパク質の治療用途
WO2013184871A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Zoetis Llc Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
ES2666126T3 (es) * 2012-06-08 2018-05-03 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anticuerpos anti-TrkA humanizados con sustituciones de aminoácidos
US20150183885A1 (en) * 2012-06-08 2015-07-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
MY194330A (en) 2012-11-01 2022-11-28 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
MX2015013166A (es) 2013-03-15 2015-12-11 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-1 beta y/o il-17.
GB201316592D0 (en) 2013-09-18 2013-10-30 Levicept Ltd Fusion protein
KR102489452B1 (ko) * 2014-02-02 2023-01-16 메디뮨 리미티드 Ngf 길항제 도메인 및 tnfa 길항제 도메인으로 구성된 키메라 단백질
IL247853B (en) * 2014-03-21 2022-08-01 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Antibodies which are antagonists against a peptide relating to the calcitonin gene and methods of using them
GB201412748D0 (en) * 2014-07-17 2014-09-03 Levicept Ltd Therapeutic use of P75NTR neurotrophin binding protein
MA41097A (fr) * 2014-12-05 2017-10-10 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticorps anti-trka à propriétés inhibitrices améliorées et dérivés desdits anticorps destinés à être utilisés pour traiter les douleurs osseuses
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
GB201504691D0 (en) 2015-03-19 2015-05-06 Levicept Ltd Fusion protein
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MA46951A (fr) 2016-11-29 2019-10-09 Regeneron Pharma Composition pharmaceutique destinée à prévenir une dépendance aux opioïdes
EP3765499A1 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Zoetis Services LLC Anti-ngf antibodies and methods thereof
MX2021001549A (es) 2018-08-10 2021-04-13 Regeneron Pharma Una composicion farmaceutica para el tratamiento seguro y efectivo del dolor de rodilla y/o cadera.
JP2020117502A (ja) * 2019-01-28 2020-08-06 ファイザー・インク 変形性関節症の徴候および症状を処置する方法
CN113924315B (zh) * 2019-06-10 2022-06-28 山东博安生物技术股份有限公司 抗β-NGF纳米抗体及其应用
WO2023092052A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for reducing centralized pain
WO2023212586A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040237124A1 (en) * 2002-12-24 2004-11-25 Jaume Pons Anti-NGF antibodies and methods using same
WO2005019266A2 (en) * 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
SU975016A1 (ru) 1979-12-17 1982-11-23 Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена Болеутол ющее средство
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
WO1989009225A1 (en) 1988-03-28 1989-10-05 The Regents Of The University Of California Nerve growth factor peptides
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
ATE277193T1 (de) 1989-03-21 2004-10-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
WO1991002805A2 (en) 1989-08-18 1991-03-07 Viagene, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5656435A (en) 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ZA911974B (en) 1990-03-21 1994-08-22 Res Dev Foundation Heterovesicular liposomes
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5147294A (en) 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
FR2669336B1 (fr) 1990-11-20 1993-01-22 Adir Nouveaux derives d'oxazolo pyridines, leurs procedes de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
AU663725B2 (en) 1991-08-20 1995-10-19 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
US5342942A (en) 1992-06-09 1994-08-30 Warner-Lambert Company Pyrazoloquinazolone derivatives as neurotrophic agents
JPH09507741A (ja) 1992-06-10 1997-08-12 アメリカ合衆国 ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
CA2145641C (en) 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
US5409944A (en) 1993-03-12 1995-04-25 Merck Frosst Canada, Inc. Alkanesulfonamido-1-indanone derivatives as inhibitors of cyclooxygenase
WO1994023697A1 (en) 1993-04-22 1994-10-27 Depotech Corporation Cyclodextrin liposomes encapsulating pharmacologic compounds and methods for their use
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
WO1995000655A1 (en) 1993-06-24 1995-01-05 Mc Master University Adenovirus vectors for gene therapy
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
ATE215989T1 (de) 1993-09-15 2002-04-15 Chiron Corp Rekombinanter alphavirus vektor
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
RU2160093C2 (ru) 1993-11-16 2000-12-10 Скайефарма Инк. Везикулы с регулируемым высвобождением активных ингредиентов
AU698975B2 (en) 1993-11-23 1998-11-12 Genentech Inc. Kinase receptor activation assay
AU697142B2 (en) 1993-11-23 1998-10-01 Genentech Inc. Protein tyrosine kinases named Rse
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5844092A (en) 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
CA2158977A1 (en) 1994-05-09 1995-11-10 James G. Respess Retroviral vectors having a reduced recombination rate
US6291247B1 (en) 1994-05-11 2001-09-18 Queen's University At Kingston Methods of screening for factors that disrupt neurotrophin conformation and reduce neurotrophin biological activity
US5475995A (en) 1994-05-16 1995-12-19 Livingston; George G. Truck spare tire locking rod
GB9514160D0 (en) 1994-07-25 1995-09-13 Zeneca Ltd Aromatic compounds
US5616601A (en) 1994-07-28 1997-04-01 Gd Searle & Co 1,2-aryl and heteroaryl substituted imidazolyl compounds for the treatment of inflammation
US5521213A (en) 1994-08-29 1996-05-28 Merck Frosst Canada, Inc. Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2
US5593994A (en) 1994-09-29 1997-01-14 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Prostaglandin synthase inhibitors
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5552422A (en) 1995-01-11 1996-09-03 Merck Frosst Canada, Inc. Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents
US5604253A (en) 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5510368A (en) 1995-05-22 1996-04-23 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl-3-indoleacetic acids as antiinflammatory drugs
US5639780A (en) 1995-05-22 1997-06-17 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
WO1997015593A1 (en) 1995-10-25 1997-05-01 Queen's University At Kingston Neurotrophin antagonists
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
WO1997042338A1 (en) 1996-05-06 1997-11-13 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
UA67725C2 (en) 1996-06-03 2004-07-15 Cephalon Inc K-252a derivatives and a method for improvement of functioning and cell survival enhancement
GB9616105D0 (en) 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
AU728523C (en) 1996-10-21 2001-08-09 Nps Pharmaceuticals, Inc. Neurotrophin antagonist compositions
US6284794B1 (en) 1996-11-05 2001-09-04 Head Explorer Aps Method for treating tension-type headache with inhibitors of nitric oxide and nitric oxide synthase
DE19732928C2 (de) 1997-07-31 2000-05-18 Gruenenthal Gmbh Verwendung substituierter Imidazolidin-2,4-dion-Verbindungen als Schmerzmittel
AU9692198A (en) 1997-10-10 1999-05-03 Kevin J. Donahue Gene delivery compositions and methods
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6127401A (en) 1998-06-05 2000-10-03 Cephalon, Inc. Bridged indenopyrrolocarbazoles
US6652864B1 (en) * 1998-12-21 2003-11-25 Asilomar Pharmaceuticals, Inc. Compounds for intracellular delivery of therapeutic moieties to nerve cells
CA2364484A1 (en) 1999-03-09 2000-09-14 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
US6468990B1 (en) 1999-05-17 2002-10-22 Queen's University At Kingston Method of inhibiting binding of nerve growth factor to p75 NTR receptor
US6492380B1 (en) 1999-05-17 2002-12-10 Queen's University At Kingston Method of inhibiting neurotrophin-receptor binding
IT1306704B1 (it) 1999-05-26 2001-10-02 Sirs Societa Italiana Per La R Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf.
US6399780B1 (en) 1999-08-20 2002-06-04 Cephalon, Inc. Isomeric fused pyrrolocarbazoles and isoindolones
US6849425B1 (en) * 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US6548062B2 (en) 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
FR2807660A1 (fr) 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
US7022484B2 (en) 2000-06-08 2006-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for treating neuropathological states and neurogenic inflammatory states and methods for identifying compounds useful therein
GB0020504D0 (en) 2000-08-18 2000-10-11 Univ Bristol Therapeutic method
US6630500B2 (en) 2000-08-25 2003-10-07 Cephalon, Inc. Selected fused pyrrolocarbazoles
AU2001288374A1 (en) 2000-09-01 2002-03-22 Glaxo Group Limited Substituted oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
CN101653604A (zh) * 2001-05-30 2010-02-24 基因技术股份有限公司 抗ngf抗体用于治疗各种疾病
WO2002102232A2 (en) 2001-06-14 2002-12-27 The Regents Of The University Of California A novel signaling pathway for the production of inflammatory pain and neuropathy
WO2003022261A1 (en) 2001-09-13 2003-03-20 Miller Kenneth E Method of alleviating pain
US20040038874A1 (en) 2002-08-22 2004-02-26 Osemwota Omoigui Method of treatment of persistent pain
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
AU2003284010A1 (en) * 2002-10-04 2004-05-04 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating cardiac arrhythmia and preventing death due to cardiac arrhythmia using ngf antagonists
UA80447C2 (en) * 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
ATE497391T1 (de) * 2002-10-08 2011-02-15 Rinat Neuroscience Corp Verfahren zur behandlung von postoperativen schmerzen durch verabreichung eines antikörpers gegen nervenwachstumsfaktor und diesen enthaltende zusammensetzungen
AU2003304238A1 (en) * 2002-10-08 2005-01-13 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody and compositions containing the same
US7569364B2 (en) * 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
WO2004065560A2 (en) 2003-01-18 2004-08-05 Rinat Neuroscience Corp. Methods of screening for modulators of nerve growth factor
WO2004073653A2 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating pain by administering a nerve growth factor antagonist and an nsaid and compositions containing the same
AU2005243247B2 (en) * 2004-04-07 2012-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist
CA2595800C (en) * 2005-01-24 2014-07-08 Cambridge Antibody Technology Limited. Specific binding members for ngf
DK2448970T3 (da) 2009-05-04 2014-10-06 Abbvie Res B V Antistoffer mod nervevækstfaktor (ngf) med forbedret in vivo-stabilitet

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040237124A1 (en) * 2002-12-24 2004-11-25 Jaume Pons Anti-NGF antibodies and methods using same
WO2005019266A2 (en) * 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hybridoma 19(3): 215-227 (2000) *
Rheumatology 41: 1413-1418(2002) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3272358A1 (en) 2018-01-24
EP1871416A2 (en) 2008-01-02
JP2013100335A (ja) 2013-05-23
US9340610B2 (en) 2016-05-17
EP1871416B1 (en) 2012-07-18
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KR20100135336A (ko) 2010-12-24
TW200716672A (en) 2007-05-01
RU2429013C2 (ru) 2011-09-20
SI2305711T1 (sl) 2017-12-29
AR055323A1 (es) 2007-08-15
WO2006110883A8 (en) 2007-11-08
MX2007012627A (es) 2008-01-11
HK1186127A1 (zh) 2014-03-07
TW201242979A (en) 2012-11-01
US7569364B2 (en) 2009-08-04
PT2305711T (pt) 2017-10-03
ZA200708362B (en) 2009-12-30
JP5689141B2 (ja) 2015-03-25
IL239170B (en) 2018-07-31
ES2641787T3 (es) 2017-11-13
PL2305711T3 (pl) 2017-12-29
KR20070119748A (ko) 2007-12-20
US8540990B2 (en) 2013-09-24
HK1121038A1 (en) 2009-04-17
US20130302325A1 (en) 2013-11-14
PT1871416E (pt) 2012-09-25
IL239170A0 (en) 2015-07-30
RU2007137102A (ru) 2009-05-20
AU2006235559A1 (en) 2006-10-19
WO2006110883A2 (en) 2006-10-19
EP2305711A2 (en) 2011-04-06
WO2006110883A3 (en) 2007-03-29
CA2604443A1 (en) 2006-10-19
US20110033447A1 (en) 2011-02-10
CN103143016A (zh) 2013-06-12
ES2389960T3 (es) 2012-11-05
US20080182978A1 (en) 2008-07-31
CN101217978B (zh) 2012-02-08
JP5340724B2 (ja) 2013-11-13
EP2305711A3 (en) 2011-05-25
EP2305711B1 (en) 2017-08-02
NZ583780A (en) 2011-12-22
IL186403A0 (en) 2008-01-20
CN101217978A (zh) 2008-07-09
IL186403A (en) 2015-11-30
NZ562229A (en) 2010-04-30
HUE034482T2 (hu) 2018-02-28
DK2305711T3 (en) 2017-09-25
CA2604443C (en) 2018-04-03
AR106702A2 (es) 2018-02-07
JP2008535929A (ja) 2008-09-04
DK1871416T3 (da) 2012-08-06
BRPI0610463A2 (pt) 2010-06-22
SI1871416T1 (sl) 2012-09-28
AU2006235559B2 (en) 2009-07-09

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