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KR101378194B1 - 안정한 단백질 제제 - Google Patents

안정한 단백질 제제 Download PDF

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KR101378194B1
KR101378194B1 KR1020087017544A KR20087017544A KR101378194B1 KR 101378194 B1 KR101378194 B1 KR 101378194B1 KR 1020087017544 A KR1020087017544 A KR 1020087017544A KR 20087017544 A KR20087017544 A KR 20087017544A KR 101378194 B1 KR101378194 B1 KR 101378194B1
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마니샤 엠. 달리
챨스 이. 달하임
수니타 보사디아
비제이 에이치. 나링레카르
라제쉬 비. 간디
마노 네루카르
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 일반적으로 CTLA4Ig 분자를 포함하는, 동결건조를 비롯한 안정한 제제, 및 면역계 질환 및 내성 유도의 치료를 위해, 여러 경로, 예를 들어 정맥내 (IV) 및 피하 (SC)와 같은 경로를 통해 투여하기 위한 액체 제제에 관한 것이다.
CTLA4Ig 분자, 안정화, 당, 이당류, 동결건조, 면역계 질환

Description

안정한 단백질 제제 {STABLE PROTEIN FORMULATIONS}
본 특허 출원은 2005년 12월 20일자로 출원된 미국 일련 번호 제60/752,150호를 우선권으로 청구하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 이들 공보의 개시물은 본원에 기재되고 청구된 본 발명일에 당업자에게 공지된 기술분야의 상태를 보다 상세히 기재하기 위해 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은 일반적으로 CTLA4Ig 분자를 포함하는, 동결건조를 비롯한 안정한 제제, 및 여러 경로, 예를 들어 정맥내 (IV) 및 피하 (SC)와 같은 경로를 통해 투여하기 위한 액체 제제에 관한 것이다.
지난 이십년간, 재조합 DNA 기술은 많은 단백질 요법의 상업화를 가져왔다. 대부분의 다른 경로에 의한 불량한 생체이용율, 임상 투여 도중 더 나은 조절, 및 더 빠른 제약 개발로 인해, 단백질 약물 전달의 가장 통상적인 경로는 정맥내 (IV) 투여였다. 잦은 투여 및 장기간 투여를 요하는 제품의 경우, 대안적 피하 (SC) 전달 경로가 보다 바람직하다. 예비충전된 주사기와 자가주입기 장치 기술이 접목될 경우 SC 전달은 가정에서의 투여 및 개선된 투여 순응도를 가능하게 한다.
1 mg/kg 또는 투여 당 100 mg 초과의 고투여량에 의한 치료는 종종 SC 경로에 의해 주어질 수 있는 작은 부피 (<1.5 ml)로 인해 100 mg/ml를 초과하는 농도의 제제의 개발을 요한다. 높은 농도에서는 응집하는 경향이 있는 단백질의 경우, 이러한 고농도 제제를 성취하는 것이 개발의 과제이다. 많은 부피가 투여될 수 있는 IV 전달 경로에서도, 밀리리터 당 수십 밀리그램의 단백질 농도가 고용량 요법에서 필요로 될 수 있으며, 이는 몇몇 단백질에 대해 안정성에 대한 과제를 부여할 수 있다.
단백질 용해도를 결정하는 원리는 작은 합성 분자의 경우보다 복잡하므로, 단백질 용해도 문제점을 극복하기 위해서는 상이한 전략을 취한다. 작전상, 단백질에 대한 용해도는 용액이 시각적으로 투명한 (즉, 단백질 침전물, 결정 또는 겔이 나타나지 않음) 채로 남아있게 하는 공동-용질의 존재하의 단백질의 최대량에 의해 설명될 수 있다. 이온 강도, 염 형태, pH, 온도 및 특정 부형제에 대한 단백질 용해도의 의존성은 기계적으로 벌크 물 표면 장력, 및 물 및 이온에 대한 단백질 결합 대 자가-회합의 변화에 의해 문헌 [Arakawa et al in Theory of protein solubility, Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985]; [Schein in Solubility as a function of protein structure and solvent components, BioTechnology 8(4):308-317, 1990]; [Jenkins in Three solutions of the protein solubility problem, Protein Science 7(2):376-382, 1998] 및 기타 문헌에서 설명되었다. 특정 부형제 또는 염으로의 단백질의 결합은 단백질 형태의 변화 또는 자가-상호작용 과 관련된 특정 아미노산의 차폐를 통해 용해도에 영향을 준다. 또한, 단백질은 특정 염, 아미노산 및 당에 의해 우선적으로 수화되며 (보다 압축된 형태로서 안정화됨), 이는 용해도의 변경을 가져온다.
2분자 충돌을 요하는 응집은 단백질 용액의 일차 분해 경로인 것으로 예상된다. 응집물 형태에 대한 농도의 관계는 회합 메카니즘 뿐만 아니라 응집물의 크기에 의존적이다. 단백질 응집은 공유결합 (예를 들어, 디술피드-연결된) 또는 비공유결합 (가역 또는 비가역) 회합을 가져올 수 있다. 비공유결합 회합에 의한 비가역 응집은 일반적으로 단백질의 천연 형태를 변형시키는 열, 기계적 프로세스 또는 화학적 프로세스에 의해 노출된 소수성 영역을 통해 일어난다. 단백질 응집은 예를 들어 면역원성으로 인해 단백질 활성, 약물동력학 및 안전성에 영향을 줄 수 있다.
응집을 최소화하는 전형적인 접근법은 충돌수를 감소시키기 위해 단백질의 이동성을 제한하는 것이다. 적절한 부형제에 의한 동결건조는 물 제거의 결과 가수분해 반응을 최소화하는 것의 추가된 이점과 함께 단백질 이동성을 감소시키고 형태적 가요성을 제한함으로써 응집에 대한 단백질 안정성을 개선시킬 수 있다. 동결건조보호제를 비롯한 적절한 부형제의 첨가는 최종 생성물의 저장 도중 뿐만 아니라 동결건조 프로세스 도중 응집물의 형성을 방지할 수 있다. 효과적인 보호를 위한 중요한 파라미터는 동결건조보호제 대 단백질의 몰 비율이다. 일반적으로 300:1 이상의 몰 비율이 적합한 안정성, 특히 실온 저장에 대한 적합한 안정성을 제공하는데 요구된다. 그러나, 이러한 비율은 점도를 바람직하지 않게 증가시킬 수도 있다.
동결건조는 적절한 안정성 및 삼투성을 갖는 제제의 설계를 가능하게 한다. 등장성은 SC 투여에 필수적으로 요구되는 것은 아니지만, 투여시 통증을 최소화하기 위해 바람직할 수 있다. 단백질 및 부형제 모두가 재구성 프로세스 도중 농축되기 때문에 친액물질의 등장성을 성취하는 것은 어렵다. 500:1의 부형제:단백질 몰 비율은 최종 단백질 농도가 >100 mg/ml로 표적화된 경우 고장성 제제를 가져올 것이다. 등장성 제제를 성취하는 것을 원한다면, 부형제:단백질의 더 낮은 몰 비율을 선택하는 것이 잠재적으로 덜 안정한 제제를 가져올 것이다.
성취가능한 가장 높은 단백질 농도를 결정하는 것은 단백질 형태의 불안정한 성질 및 그 자체, 표면 및 특정 용질과 상호작용하는 경향으로 인해 경험적인 실행으로 남아있다.
SC 제제로부터 이로울 수 있는 대상체의 예로는 잦은 투여 및 장기간 투여를 요하는 상태를 갖는 대상체, 예컨대 면역계 질환, 류머티스성 관절염 및 이식편 이식과 관련된 면역 장애가 있는 대상체를 들 수 있다. 류머티스성 관절염의 치료를 위한 시판되는 단백질 약물 제품으로는 휴미라(HUMIRA)®, 엔브렐(ENBREL)® 및 레미케이드(REMICADE)®를 들 수 있다.
휴미라® (애보트(Abbott))는 피하 투여를 위한 멸균의 보존제-비함유 용액으로서 1 ml 예비충전된 일회용 유리 주사기로 공급된다. 휴미라®의 용액은 투명 하고 무색이며, 약 5.2의 pH를 갖는다. 주사기 각각은 약물 제품 0.8 ml (40 mg)를 전달한다. 휴미라® 0.8 ml 각각은 아달리무맙 40 mg, 염화나트륨 4.93 mg, 일염기 인산나트륨 이수화물 0.69 mg, 이염기 인산나트륨 이수화물 1.22 mg, 시트르산나트륨 0.24 mg, 시트르산 일수화물 1.04 mg, 만니톨 9.6 mg, 폴리소르베이트 80 0.8 mg 및 주사용수 (USP)를 함유한다. 수산화나트륨은 pH의 조절을 위해 필요에 따라 첨가된다.
엔브렐® (암젠(Amgen))은 피하 주사를 위한 멸균의 보존제-비함유 용액으로서 1 ml 예비충전된 일회용 주사기로 공급된다. 엔브렐®의 용액은 투명하고 무색이며, pH 6.3 ± 0.2에서 제제화된다. 엔브렐® 일회용 예비충전된 주사기 각각은 에타네르셉트의 50 mg/ml 용액 0.98 ml를, 10 mg/ml 수크로스, 5.8 mg/ml 염화나트륨, 5.3 mg/ml L-아르기닌 히드로클로라이드, 2.6 mg/ml 일염기 인산나트륨 일수화물 및 0.9 mg/ml 이염기 인산나트륨 무수물과 함께 함유한다. 엔브렐®의 50 mg/ml 예비충전된 주사기 1개의 투여는 추천되는 바와 같이 바이알을 재구성하고 투여하는 경우 동결건조 엔브렐®의 25 mg 바이알 2개와 등가의 투여량을 제공한다. 엔브렐® 다회용 바이알은 멸균의 백색 보존제-비함유 동결건조 분말을 함유한다. 공급된 멸균 정균성 주사용수 (BWFI)(USP)(0.9％ 벤질 알콜 함유) 1 ml로 재구성하면, 에타네르셉트 25 mg, 만니톨 40 mg, 수크로스 10 mg 및 트로메타민 1.2 mg을 함유 하고 7.4 ± 0.3의 pH를 갖는 다회용 투명하고 무색의 용액을 수득한다.
레미케이드® (센토코르(Centocor))는 정맥내 주입을 위한 멸균의 백색 동결건조 분말로서 공급된다. 멸균 주사용수 (USP) 10 ml로 재구성하여 얻어지는 pH는 대략 7.2이다. 일회용 바이알 각각은 인플릭시맙 100 mg, 수크로스 500 mg, 폴리소르베이트 80 0.5 mg, 일염기 인산나트륨 일수화물 2.2 mg 및 이염기 인산나트륨 이수화물 6.1 mg을 함유한다. 보존제는 존재하지 않는다.
이식편 이식과 관련된 면역 장애의 치료를 위한 시판되는 단백질 약물 제품으로는 시물렉트(SIMULECT)® 및 제나팍스(ZENAPAX)®를 들 수 있다.
약물 제품 시물렉트® (노파르티스(Novartis))는 6 ml 무색 유리 바이알로 이용가능하고 10 mg 및 20 mg 강도로 이용가능한 멸균 동결건조물이다. 10-mg 바이알 각각은 바실릭시맙 10 mg, 일염기 인산칼륨 3.61 mg, 수소인산이나트륨 (무수물) 0.50 mg, 염화나트륨 0.80 mg, 수크로스 10 mg, 만니톨 40 mg 및 글리신 20 mg을 함유하며, 멸균 주사용수 (USP) 2.5 ml로 재구성된다. 20-mg 바이알 각각은 바실릭시맙 20 mg, 일염기 인산칼륨 7.21 mg, 수소인산이나트륨 (무수물) 0.99 mg, 염화나트륨 1.61 mg, 수크로스 20 mg, 만니톨 80 mg 및 글리신 40 mg을 함유하며, 멸균 주사용수 (USP) 5 ml로 재구성된다. 보존제는 첨가되지 않았다.
25 mg/5 ml 제나팍스® (로슈 래보러토리즈(Roche Laboratories))는 추가 희석 및 정맥내 투여를 위한 투명한 멸균의 무색 농축물로서 공급된다. 제나팍스®는 밀리리터 당 다클리주맙 5 mg 및 일염기 인산나트륨 일수화물 3.6 mg, 이염기 인산나트륨 7수화물 11 mg, 염화나트륨 4.6 mg, 폴리소르베이트 80 0.2 mg을 함유하고, pH를 6.9로 조절하기 위해 염산 또는 수산화나트륨을 함유할 수 있다. 보존제는 첨가되지 않았다.
CTLA4Ig 분자는 CD28-B7 상호작용을 억제함으로써 T 세포 동시자극을 방해한다. 그러므로, CTLA4Ig 분자는 면역계 질환, 예컨대 류머티스성 관절염 및 이식편 이식과 관련된 면역 장애에 대한 치료학적 용도를 제공할 수 있다.
면역계 장애의 치료를 위한, CTLA4Ig 분자를 포함하는 안정하고 효과적인 편리한 제제에 대한 요구가 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 B7-양성 세포 상의 B7 분자에 결합하는 CTLA4Ig 분자를 대상체에게 투여하여 이에 의해 내생성 B7 분자가 T-세포 상의 CTLA4 및/또는 CD28에 결합하는 것을 억제함으로써 면역계 질환을 치료하기 위한 제제를 제공한다.
본 발명의 동결건조 제제는 단백질 대 동결건조보호제 1:2 이상의 중량 비율로 CTLA4Ig 분자를 포함한다. 동결건조보호제는 바람직하게는 당, 보다 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스 또는 말토스이다. 또한, 동결건조 제제는 완충제, 계면활성제, 증량제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결건조 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스 또는 말토스의 양은 단백질 대 수크로스 또는 말토스 1:2 이상의 중량 비율, 바람직하게 는 단백질 대 수크로스 또는 말토스 1:2 내지 1:5의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 또는 말토스 약 1:2의 중량 비율이다.
본 발명의 피하 (SC) 제제는 수성 담체 중에 안정화 수준에서 당과 조합하여 100 mg/ml 이상의 단백질 농도에서, 바람직하게는 안정화 수준에서 당과 조합하여 125 mg/ml 이상의 단백질 농도에서 CTLA4Ig 분자를 포함한다. 당은 바람직하게는 단백질 대 당 1:1.1 이상의 중량 비율로 존재한다. 안정화제는 바람직하게는 SC 주사기를 통해 투여하기에 적합하지 않거나 바람직하지 않은 점도를 가져올 수 있는 양을 초과하지 않는 양으로 사용된다. 당은 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스이다. SC 제제는 또한 완충제, 계면활성제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, CTLA4Ig 분자 SC 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스의 양은 단백질 대 수크로스 1:1 이상의 중량 비율, 바람직하게는 단백질 대 수크로스 1:1.3 내지 1:5의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 약 1:1.4의 중량 비율이다.
본 발명의 액체 제제는 수성 담체 중에 안정화 수준에서 당과 조합하여 20 mg/ml 이상의 단백질 농도에서, 바람직하게는 안정화 수준에서 당과 조합하여 25 mg/ml 이상의 단백질 농도에서 CTLA4Ig 분자를 포함한다. 당은 바람직하게는 단백질 대 당 1:1 이상의 중량 비율로 존재한다. 당은 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 액체 제제는 또한 완충제, 계면활성제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 액체 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스의 양은 단백질 대 수크로스 1:1 이상의 중량 비율, 바람직하게는 단백질 대 수크로스 1:2 내지 1:10의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 약 1:2의 중량 비율이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 약물 제품을 함유하고 바람직하게는 그의 사용에 대한 지시사항을 제공하는 제조 물품이 제공된다.
또한 본 발명은 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제의 투여에 의한 내성 유도 및 면역계 질환의 치료 방법을 제공한다.
도 1은 CTLA4-Ig 분자에 대한 발현 카세트의 부분의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타낸다. 또한, 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다. 상기 발현 카세트로부터 생성될 수 있는 CTLA4-Ig 분자는 (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382, (iii) 서열 2의 27-383, 또는 (iv) 서열 2의 26-382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25-382, 또는 (vi) 서열 2의 25-383 잔기의 아미노산 서열을 갖는 분자를 포함한다. 발현 카세트는 하기 영역을 포함한다: (a) 온코스타틴 M 신호 서열 (서열 1의 뉴클레오티드 11-88; 서열 2의 아미노산 1-26); (b) 인간 CTLA4의 세포외 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 89-463; 서열 2의 아미노산 27-151); (c) 변형된 힌지 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열 2의 아미노산 152-166), 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 509-838; 서열 2의 아미노산 167-276), 및 인간 IgG1 CH3 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 839- 1159; 서열 2의 아미노산 277-383)을 비롯한 인간 IgG1 불변 영역의 변형된 부분 (서열 1의 뉴클레오티드 464-1159; 서열 2의 아미노산 152-383).
도 2는 신호 펩티드; 위치 +1의 메티오닌에서 시작하여 위치 +124의 아스파르트산에서 종결하거나, 또는 위치 -1의 알라닌에서 시작하여 위치 +124의 아스파르트산에서 종결하는 CTLA4의 돌연변이된 세포외 도메인; 및 Ig 영역을 포함하는, CTLA4-L104EA29Y-Ig ("L104EA29YIg" 및 "LEA29Y"라고도 공지됨)의 뉴클레오티드 서열 (서열 3) 및 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. 서열 3 및 4는 신호 펩티드; 위치 +27의 메티오닌에서 시작하여 위치 +150의 아스파르트산에서 종결하거나, 또는 위치 +26의 알라닌에서 시작하여 위치 +150의 아스파르트산에서 종결하는 CTLA4의 돌연변이된 세포외 도메인; 및 Ig 영역을 포함하는, L104EA29YIg의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다. L104EA29YIg는 (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382; (iii) 서열 4의 27-383 또는 (iv) 서열 4의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 4의 25-382, 또는 (vi) 서열 4의 25-383 잔기의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는,
"안정한" 제제 또는 약물 제품은 CTLA4Ig 분자가 저장시 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 일체성을 필수적으로 유지하는 제제 또는 제품이다. CTLA4Ig 분자 제제의 안정성은 선택된 기간 후 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 동결건조 및 저장 후 응집물 형성의 증가는 동결건조 CTLA4Ig 분자 제제의 불안정성에 대한 지표이다. 응집물 형성 외에도, 저장기간에 걸쳐 원래 투명도, 색 및 냄새의 보유는 CTLA4Ig 분자 용액의 안정성을 모니터링하는데 사용되는 지표이다. HMW 종은 CTLA4Ig 분자 이량체보다 더 큰 분자량을 갖는 다량체 (즉, 사량체, 육량체 등)이다. 전형적으로, "안정한" 약물 제품은 고분자량 종의 백분율 (HMW ％)의 증가에 의해 측정되는 응집의 증가가 제제를 1년 동안 2-8℃에서 저장시 약 5％ 미만, 및 바람직하게는 약 3％ 미만인 제품일 수 있다. 바람직하게는, 제조된 약물 제품은 HMW 종 약 25％ 미만, 바람직하게는 HMW 종 약 15％ 미만, 보다 바람직하게는 HMW 종 약 10％ 미만, 가장 바람직하게는 HMW 종 약 5％ 미만을 포함한다.
CTLA4Ig 분자의 단량체, 이량체 및 HMW 종은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분리될 수 있다. SEC는 분자를 분자 크기를 기준으로 분리한다. 상기 분리는 분자가 컬럼의 길이에 따라 이동하기 때문에 시차 분자 배제 또는 포함에 의해 달성된다. 그러므로, 분할은 컬럼 길이의 기능에 따라 증가한다. CTLA4Ig 분자 샘플은 병렬식으로 TSK 겔® G3000SWXL (300 mm x 7.8 mm) 및 TSK 겔® G3000SWXL (40 mm x 6.0 mm) 컬럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 미국 펜실바니아주 몽고메리 소재)이 장착된 2695 얼라이언스(Alliance) HPLC (워터즈(Waters), 미국 메사추세츠주 밀리포드 소재)를 사용하여 분리될 수 있다. 10 mg/ml (20 ㎕ 분취액)의 샘플은 1.0 ml/분의 유속에서 0.2 M KH2PO4, 0.9％ NaCl (pH 6.8)로 구성된 이동상을 사용하여 분리된다. 샘플은 워터즈의 2487 이중 파장 검출기를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 모니터링된다. 상기 시스템의 사용시, HMW 종은 7.5분 ± 1.0분의 체류 시간을 갖는다. 피크 각각은 피크 하 면적으로 통합된다. HMW 종 ％는 HMW 피크 면적을 총 피크 면적으로 나누어서 계산한다.
"재구성된" 제제는 수성 담체 중에 동결건조 제제를 용해시킴으로써 CTLA4Ig 분자가 재구성된 제제에 용해되도록 제조된 제제이다. 재구성된 제제는 이를 필요로 하는 환자에게 정맥내 (IV) 투여하기에 적합하다.
"등장성" 제제는 인간 혈액과 필수적으로 동일한 삼투압을 갖는 제제이다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsmol/KgH2O의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "고장성"은 인간 혈액의 삼투압보다 높은 삼투압을 갖는 제제를 기재하는데 사용된다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 얼음-동결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.
용어 "완충제"는 수용액에 첨가시 산 또는 알칼리를 첨가하는 경우, 또는 용매로 희석하는 경우 pH의 변화에 대해 용액을 보호할 수 있는 1종 이상의 성분을 지칭한다. 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있는 경우, 인산염 완충제 이외에 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제 등이 사용될 수 있다.
"산"은 수용액에서 수소 이온을 제공하는 물질이다. "제약상 허용되는 산"으로는 제제화되는 방식 및 농도에서 무독성인 무기산 및 유기산을 들 수 있다.
"염기"는 수용액에서 히드록실 이온을 제공하는 물질이다. "제약상 허용되는 염기"로는 제제화되는 방식 및 농도에서 무독성인 무기 염기 및 유기 염기를 들 수 있다.
"동결건조보호제"는 당해 단백질과 조합되는 경우 동결건조 및 후속적 저장시 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 방지하거나 또는 감소시키는 분자이다.
"보존제"는 박테리아 작용을 감소시키는 작용제이며, 본원에서 임의로 제제에 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는 예를 들어 다회용 (다용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다. 잠재적 보존제의 예로는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물) 및 벤제토늄 클로라이드를 들 수 있다. 다른 유형의 보존제로는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸이 포함된다.
"계면활성제"는 소수성 부분 (예를 들어, 알킬 쇄) 및 친수성 부분 (예를 들어, 카르복실 및 카르복실레이트 기) 둘 모두를 함유하는 표면 활성 분자이다. 계면활성제는 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 본 발명의 제제에 사용하기에 적합한 계면활성제로는 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(Poloxamer) (예를 들어 폴록사머 188); 소르비탄 에스테르 및 유도체; 트리톤; 나트륨 라우렐 술페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타딘; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우르아미도프로필-코크아미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일- 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿠아트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 미국 뉴저지주 페이터슨 소재), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
"약물 물질"은 최종 약물 제품의 제제에 사용되는 출발 물질을 지칭한다. 전형적인 CTLA4Ig 약물 물질 조성물은 단백질 농도 20 mg/ml 내지 60 mg/ml, pH 7 내지 8, 및 HMW 종 ％ < 5％를 포함한다.
"제제화된 벌크 용액"은 용기 충전 전의 최종 제제, 예컨대 동결건조용 바이알 충전 전의 제제화된 용액, 또는 SC 주사용 주사기 충전 전의 제제화된 용액을 지칭한다.
"약물 제품"은 동결건조 약물 제품과 같이 사용 전에 재구성되거나; 또는 액체 약물 제품과 같이 사용 전에 추가로 희석되거나; 또는 SC 용액 약물 제품과 같이 사용될 수 있는, 용기에 패키징된 최종 제제를 지칭한다.
용어 "CTLA4-Ig" 또는 "CTLA4-Ig 분자" 또는 "CTLA4Ig 분자"는 서로 구별없이 사용되며, CTLA4 세포외 도메인 또는 그의 부분 및 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 분자를 지칭한다. 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역은 야생형, 또는 돌연변이체 또는 변형된 인간 또는 마우스를 비롯한 포유동물일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 추가의 단백질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 또한 폴리펩티드의 다량체 형태, 예컨대 이량체, 사량체 및 육량체를 지칭할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 또한 CD80 및/또는 CD86에 결합할 수 있다.
용어 "B7-1"은 CD80을 지칭하고; 용어 "B7-2"는 CD86을 지칭하고; 용어 "B7"은 B7-1 및 B7-2 (CD80 및 CD86) 둘 모두를 지칭한다. 용어 "B7-1-Ig" 또는 "B7-1Ig"는 CD80-Ig를 지칭하고; 용어 "B7-2-Ig" 또는 "B7-2Ig"는 CD86-Ig를 지칭한다.
한 실시양태에서, "CTLA4Ig"는 (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382; (iii) 서열 2의 27-383, 또는 (iv) 서열 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25-382, 또는 (vi) 서열 2의 25-383 잔기의 아미노산 서열을 갖는 단백질 분자를 지칭한다. 단량체 형태의 이들 단백질은 본원에서 "서열 2 단량체," 또는 "서열 2를 갖는" 단량체로서 지칭될 수 있다. 이들 서열 2 단량체는 이량체화될 수 있으며, 이러한 이량체 조합으로는 예를 들어: (i)과 (i); (i)과 (ii); (i)과 (iii); (i)과 (iv); (i)과 (v); (i)과 (vi); (ii)와 (ii); (ii)와 (iii); (ii)와 (iv); (ii)와 (v); (ii)와 (vi); (iii)과 (iii); (iii)과 (iv); (iii)과 (v); (iii)과 (vi); (iv)와 (iv); (iv)와 (v); (iv)와 (vi); (v)와 (v); (v)와 (vi); 및 (vi)과 (vi)을 들 수 있다. 이들 상이한 이량체 조합은 또한 서로 회합하여 사량체 CTLA4Ig 분자를 형성할 수 있다. 이들 단량체, 이량체, 사량체 및 기타 다량체는 본원에서 "서열 2 단백질," 또는 "서열 2를 갖는" 단백질로서 지칭될 수 있다 (서열 2에 나타낸 CTLA4Ig를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약 규정하에 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 블러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1991년 5월 31일에 기탁되고, ATCC 관리 번호 ATCC 68629를 부여받았으며; 서열 2에 나타낸 CTLA4Ig를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주는 ATCC 확인 번호 CRL-10762로 1991년 5월 31일에 기탁되었다). 본원에서 사용되는 "아바타셉트(Abatacept)"는 서열 2 단백질을 지칭한다.
한 실시양태에서, CTLA4-L104EA29Y-Ig (종종 "LEA29Y" 또는 "L104EA29Y"라고 공지됨)는 서열 1에 나타낸 CTAL4-Ig 분자와 구조가 유사한 유전자 조작된 융합 단백질이다. L104EA29Y-Ig는 변형된 인간 CTLA4의 기능적 세포외 결합 도메인 및 IgG1 부류의 인간 이뮤노글로불린의 Fc 도메인을 갖는다. 두가지 아미노산 변형, 즉 서열 2의 위치 130인 위치 104에서의 루이신의 글루탐산으로의 아미노산 변형 (L104E), 및 서열 2의 위치 55인 위치 29에서의 알라닌의 티로신으로의 아미노산 변형 (A29Y)은 CTLA4 도메인의 B7 결합 영역에서 만들어져서 L104EA29Y를 생성한다. 서열 3 및 4는 신호 펩티드; 위치 +27의 메티오닌에서 시작하여 위치 +150의 아스파르트산에서 종결하거나, 또는 위치 +26의 알라닌에서 시작하여 위치 +150의 아스파르트산에서 종결하는 CTLA4의 돌연변이된 세포외 도메인; 및 Ig 영역을 포함하는, L104EA29YIg의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다. L104EA29Y-Ig를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약 규정하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 2000년 6월 20일에 기탁되었다. 여기에 ATCC 관리 번호 PTA-2104가 부여되었다. L104EA29Y-Ig는 또한 2006년 8월 22일에 허여된 미국 특허 제7,094,874호 및 WO 01/923337 A2호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
포유동물 세포에서 L104EA29YIg의 발현은 N-및 C-말단 변이체의 생성을 가져올 수 있으며, 이렇게 생성된 단백질은 (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382; (iii) 서열 4의 27-383 또는 (iv) 서열 4의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 4의 25-382, 또는 (vi) 서열 4의 25-383 잔기의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 단량체 형태의 이들 단백질은 본원에서 "서열 4 단량체," 또는 "서열 4를 갖는" 단량체로서 지칭될 수 있다. 이들 단백질은 이량체화될 수 있으며, 이러한 이량체 조합으로는 예를 들어 (i)과 (i); (i)과 (ii); (i)과 (iii); (i)과 (iv); (i)과 (v); (i)과 (vi); (ii)와 (ii); (ii)와 (iii); (ii)와 (iv); (ii)와 (v); (ii)와 (vi); (iii)과 (iii); (iii)과 (iv); (iii)과 (v); (iii)과 (vi); (iv)와 (iv); (iv)와 (v); (iv)와 (vi); (v)와 (v); (v)와 (vi); 및 (vi)과 (vi)이 포함될 수 있다. 이들 상이한 이량체 조합은 또한 서로 회합하여 사량체 L104EA29YIg 분자를 형성할 수 있다. 이들 단량체, 이량체, 사량체 및 기타 다량체는 본원에서 "서열 4 단백질," 또는 "서열 4를 갖는" 단백질로서 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 "벨라타셉트(Belatacept)"는 서열 4 단백질을 지칭한다.
CTLA4 - Ig 단량체 및 다량체
CTLA4-Ig 분자는 예를 들어 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 기타 다량체 형태의 CTLA4-Ig 단백질을 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 CTLA4의 하나 이상의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 갖는 단백질 융합물을 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 예를 들어 CTLA4 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 대한 야생형 또는 돌연변이체 서열을 가질 수 있다. CTLA4-Ig 단량체는 단독으로 또는 이량체, 사량체 또는 기타 다량체 형태로 글리코실화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 이량체 또는 기타 다량체 분자의 특정 백분율 이상을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체가 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 99.5％ 초과인 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 약 95％ 내지 약 99.5％ 및 CTLA4-Ig 사량체 약 0.5％ 내지 약 5％를 포함하는 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 CTLA4-Ig 이량체 약 98％, CTLA4-Ig 사량체 약 1.5％ 및 CTLA4-Ig 단량체 약 0.5％를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 단량체 분자가 실질적으로 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. CTLA4-Ig 단량체 분자가 실질적으로 없다는 것은 단량체를 1％, 0.5％ 또는 0.1％ 미만으로 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 사량체, 육량체 등과 같이 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체가 실질적으로 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체 분자가 실질적으로 없다는 것은 이량체 형태보다 큰 CTLA4-Ig 다량체를 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％ 또는 0.1％ 미만으로 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 예를 들어 (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382, (iii) 서열 2의 27-383, 또는 (iv) 서열 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25-382, 또는 (vi) 서열 2의 25-383의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 CHO 세포에서 발현된 경우, 발현된 우세한 단량체 형태는 야생형 인간 CTLA4의 N-말단 아미노산 잔기에 상응하는 메티오닌의 N-말단 아미노산 잔기 (서열 2의 잔기 27)를 갖는다. 그러나, 서열 1은 또한 온코스타틴 M 신호 서열에 대한 코딩 서열 (서열 1의 뉴클레오티드 11-88)을 포함하기 때문에, 서열 1로부터 발현된 단백질은 온코스타틴 M 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 세포질로부터의 단백질 배출 프로세스 중에, 또는 세포 밖으로의 분비 중에 발현된 단백질로부터 절단된다. 그러나, 상기 절단은 아미노산 잔기 26과 27 사이의 절단 (잔기 27의 N-말단을 가져옴)과는 대조적으로, 아미노산 잔기 25와 26 사이의 절단 (잔기 26의 N-말단, 즉 "Ala 변이체"를 가져옴), 또는 아미노산 잔기 24와 25 사이의 절단 (잔기 2의 N-말단, 즉 "Met-Ala 변이체"를 가져옴)과 같은 N-말단 변이체를 가져올 수 있다. 예를 들어, Met-Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물 중에 약 1％로 존재할 수 있으며, Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물 중에 약 8 내지 10％로 존재할 수 있다. 또한, 서열 1로부터 발현된 단백질은 불완전한 프로세싱으로 인한 C-말단 변이체를 가질 수 있다. 우세한 C-말단은 서열 2의 잔기 382의 글리신이다. CTLA4-Ig 분자의 혼합물에서, C-말단에 리신 (서열 2의 잔기 383)을 갖는 단량체는 예를 들어 약 4 내지 5％로 존재할 수 있다.
CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 2의 아미노산 27-151를 코딩하는 서열 1의 뉴클레오티드 89-463의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 인간 CTLA4의 돌연변이체 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 1의 뉴클레오티드 89-463에 대한 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있으며, 이에 따라 보존적 아미노산 변화가 생성된다. 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 1의 뉴클레오티드 89-463과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 불변 영역은 불변 영역의 부분일 수 있으며, 상기 불변 영역은 야생형 또는 돌연변이체 서열을 가질 수 있다. 상기 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로부터 유래될 수 있다. 상기 불변 영역은 이뮤노글로불린의 경쇄 또는 중쇄로부터 유래될 수 있다. 불변 영역이 IgG, IgD 또는 IgA 분자로부터 유래된 경우, 불변 영역은 하기 불변 영역 도메인을 하나 이상 포함할 수 있다: CL, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3. 불변 영역이 IgM 또는 IgE로부터 유래된 경우, 불변 영역은 하기 불변 영역 도메인을 하나 이상 포함할 수 있다: CL, CH1, CH2, CH3 또는 Ca4. 한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG, IgD, IgA, IgM 또는 IgE로부터 유래된 불변 영역 도메인을 하나 이상 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 변형된 인간 IgG1 힌지 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열 2의 아미노산 152-166)을 포함하며, 여기서 서열 2의 아미노산 잔기 156, 162 및 165의 세린은 야생형 서열에 존재하는 시스테인으로부터 조작되었다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 변형된 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 CH3 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 509-838 및 서열 2의 아미노산 167-276을 갖는 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인; 서열 1의 뉴클레오티드 839-1159 및 서열 2의 아미노산 277-383을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 2006년 8월 22일에 허여된 미국 특허 제7,094,874호 및 공보 제US20030083246호 및 제US20040022787호로 공개된 미국 특허 출원의 도 7, 8 또는 9 중 임의의 하나 이상에 나타낸 서열을 갖는 단량체를 포함하며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 사량체 분자는 CTLA4-Ig 폴리펩티드의 2개의 쌍 또는 2개의 이량체를 포함하며, 여기서 폴리펩티드 각각은 하기 아미노산 서열 중 하나를 갖는다: (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382, (iii) 서열 2의 27-383, 또는 (iv) 서열 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25-382, 또는 (vi) 서열 2의 25-383. 폴리펩티드의 쌍 또는 이량체의 구성원 각각은 다른 구성원에 공유결합으로 결합되어 있으며, 폴리펩티드의 2개의 쌍은 서로 비공유결합으로 회합되어 사량체를 형성한다. 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다.
다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4-Ig 이량체 (여기서, 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 갖음)의 결합력보다 2배 이상 큰 결합력으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 야생형 CTLA4의 결합 친화도 또는 결합력보다 2배 이상 큰 결합력으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 이러한 보다 큰 결합력은 하기 기재된 면역 장애 및 다른 질환을 치료하는데 높은 효능에 기여할 수 있다. 또한, 보다 크거나 또는 개선된 결합력은 약물의 보다 큰 효력의 결과를 가져올 수 있다. 예를 들어, CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 치료 조성물은 보다 큰 결합력을 가질 것이며, 그러므로 CTLA4-Ig 단량체를 갖는 치료 조성물의 동일한 양보다 더 큰 효력을 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 (여기서, 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 갖음)와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 많이 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 야생형 CTLA4 분자와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 많이 억제할 수 있다.
T 세포 증식은 당업계에 공지된 표준 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식을 분석하는 가장 통상적인 방법 중 하나는 TCR에 대한 항원 또는 효능적 항체를 통해 T 세포를 자극하고, 예를 들어 T 세포의 증식에서 역가측정된 티미딘 (3H-TdR)의 혼입, 또는 T 세포를 배양물로 증식시킴으로써 방출된 사이토카인의 양을 측정하는 것이다. T 세포 활성화 또는 증식시 CTLA4-Ig 분자의 억제 효과는 이에 의해 측정될 수 있다.
CTLA4-Ig 분자의 친화도는 CD80, CD86, 또는 CD8OIg 또는 CD86Ig 융합 단백질을 비롯한 단일 리간드에 대한 분자의 결합 강도이다. 리간드에 대한 CTLA4-Ig의 친화도는 예를 들어 표면 플라즈먼 기술에 기초한 결합 상호작용 분석 (BIA)을 사용하여 측정될 수 있다. 결합 강도의 측정 외에도, 이는 회합율 및 해리율 상수와 같은 결합 동력학의 실제 시간 결정을 허용한다. 표면 매트릭스가 공유결합으로 부착된, 얇은 금속 필름으로 코팅된 유리 슬라이드로 구성된 센서 칩은 상호작용체 중 하나, 즉 CTLA4-Ig 또는 리간드 중 하나로 코팅되어 있다. 다른 상호작용체를 함유하는 용액은 그의 표면 상으로 유동하도록 한다. 연속 광 빔을 표면의 다른 측면을 향하게 하고, 그의 반사각을 측정한다. CTLA4-Ig가 리간드에 결합시, 광 빔의 공명각이 변화한다 (이는 센서의 반응부에 인접한 매질의 굴절률에 의존적이기 때문이며, 이는 다시 배지 중 용해된 물질의 농도와 직접 서로 관련되어 있음). 이는 후속적으로 컴퓨터를 사용하여 분석된다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 결합 실험은 비아코어 장치 (비아코어 아게(BIAcore AG), 스웨덴 업살라 소재) 상의 표면 플라즈먼 공명 (SPR)에 의해 수행될 수 있다. CTLA4-Ig는 비아코어 센서 칩 상의 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 일차 아민기에 의해 공유결합으로 커플링되며, 이에 의해 CTLA4-Ig를 센서 칩에 고정시킬 수 있다. 대안으로, 항-불변 영역 항체는 Ig 단편을 통해 CTLA4-Ig를 센서 표면으로 간접적으로 고정시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 리간드를 칩에 첨가하여, 리간드에 대한 CTLA4-Ig 결합을 측정한다. 친화도 측정은 예를 들어 문헌 [van der Merwe, P. et al., J. Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
CTLA4-Ig 분자의 결합력은 또한 측정될 수 있다. 결합력은 여러 부위에서 2개의 분자 또는 세포가 서로 결합하는 강도의 총합으로서 정의될 수 있다. 결합력은 분자 상의 한 부위가 그의 리간드에 결합하는 강도인 친화도와는 구별된다. 이론에 얽매이지 않고, CTLA4-Ig 분자의 고결합력은 T-세포 증식 및 활성화시 CTLA4-Ig 분자에 의한 억제의 증가된 효력을 가져올 수 있다. 결합력은 예를 들어 두가지 카테고리의 고체상 검정법, 즉 a) 경쟁적 억제 검정법 및 b) 용출 검정법에 의해 측정될 수 있다. 이들 두가지 방법 모두에서, 리간드는 고체 지지체에 부착된다. 경쟁적 억제 검정법에서, CTLA4-Ig 분자를 그 후 상이한 농도의 유리 리간드와 함께 고정된 농도에서 용액에 첨가하고, 고체상 결합을 50％만큼 억제하는 리간드의 양을 결정한다. 필요한 리간드가 적을수록, 결합력은 더 강하다. 용출 검정법에서, 리간드를 용액에 첨가한다. 평형 상태를 얻은 후, 카오트로프(chaotrope) 또는 변성제 (예를 들어, 이소티오시아네이트, 우레아 또는 디에틸아민)를 상이한 농도로 첨가하여, CTLA4-Ig/리간드 상호작용을 방해한다. 그 후, 용출을 저항하는 CTLA4-Ig의 양을 ELISA에 의해 결정한다. 결합력이 더 강할수록, 특정량의 CTLA4-Ig를 용출하는데 더 많은 카오트로프 작용제가 필요하다. CTLA4-Ig 분자의 불균질 혼합물의 상대적 결합력은 결합된 CTLA4-Ig 분자의 50％를 용출하는데 필요한 용출제의 농도와 동일한, 결합력 인덱스 (AI)로서 표시될 수 있다. 데이타의 정밀한 분석은 상이한 농도의 용출제에서 용출된 CTLA4-Ig의 백분율을 결정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 CTLA4Ig 분자의 제조 방법
CTLA4Ig 분자의 발현은 원핵 세포에서 일어날 수 있다. 원핵생물은 가장 흔히 박테리아의 여러 균주에 의해 표시된다. 박테리아는 그램 양성 또는 그램 음성일 수 있다. 전형적으로, 그램-음성 박테리아, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)가 바람직하다. 다른 미생물 균주가 또한 사용될 수 있다.
상기 기재된 CTLA4Ig 분자를 코딩하는 서열은 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 외래 서열을 발현시키도록 설계된 벡터에 삽입될 수 있다. 이들 벡터는 본원에서 전사 개시를 위한 프로모터를 포함하며, 임의로 리보솜 결합 부위 서열과 함께 오퍼레이터를 포함하는 것으로 정의된, 통상적으로 사용되는 원핵 제어 서열을 포함할 수 있으며, 베타-락타마제 (페니실린아제) 및 락토스 (lac) 프로모터 시스템 (문헌 [Chang, et al., (1977) Nature 198:1056]), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057]) 및 람다 유래 PL 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위 (문헌 [Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128])로서 통상적으로 사용되는 프로모터를 포함한다.
이러한 발현 벡터는 또한 복제 개시점, 및 항생제에 내성을 부여하는 베타-락타마제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자와 같은 선별가능한 마커를 포함할 것이며, 이에 따라 벡터는 박테리아에서 복제할 수 있으며, 플라스미드를 운반하는 세포는 항생제, 예컨대 앰피실린 또는 카나마이신의 존재하에 성장하는 경우를 위해 선택될 수 있다.
발현 플라스미드는 CaCl2-쇼크 (문헌 [Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110] 및 [Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)]) 및 전기천공법을 비롯한 여러 표준 방법 (이에 제한되지 않음)을 통해 원핵 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 실시에 따라, 진핵 세포는 또한 적합한 숙주 세포이다. 진핵 세포의 예로는 임의의 동물 세포 (일차 세포 또는 무한증식 세포), 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 및 식물 세포를 들 수 있다. 골수종, COS 및 CHO 세포는 숙주로서 사용될 수 있는 동물 세포의 예이다. 특정 CHO 세포로는 DG44 (문헌 [Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556]; [Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909]), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On 세포주 (클론테크(Clontech)), ECACC 85050302라고 지칭되는 CHO (CAMR, 영국 윌트셔 솔리즈버리 소재), CHO 클론 13 (GEIMG, 이탈리아 제노바 소재), CHO 클론 B (GEIMG, 이탈리아 제노바 소재), ECACC 93061607이라고 지칭되는 CHO-K1/SF (CAMR, 영국 윌트셔 솔리즈버리 소재), 및 ECACC 92052129라고 지칭되는 RR-CHOK1 (CAMR, 영국 윌트셔 솔리즈버리 소재)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예시적 식물 세포로는 담배 (전체 식물, 세포 배양, 또는 가골(callus)), 옥수수, 대두 및 쌀 세포가 포함된다. 옥수수, 대두 및 쌀 종자가 또한 허용된다.
상기 기재된 CTLA4Ig 분자를 코딩하는 핵산 서열은 또한 진핵 숙주에서 외래 서열을 발현시키도록 설계된 벡터에 삽입될 수 있다. 벡터의 조절 요소는 특정 진핵 숙주에 따라 다양할 수 있다.
발현 벡터에 사용하기 위한, 통상적으로 사용되는 진핵 제어 서열에는 예를 들어 CMV 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육종 바이러스 (ASV) (πLN 벡터)와 같은 포유동물 세포에 상용성이 있는 프로모터 및 제어 서열이 포함된다. 다른 통상적으로 사용되는 프로모터로는 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터 유래된 초기 및 후기 프로모터 (문헌 [Fiers, et al., (1973) Nature 273:113]), 또는 다른 바이러스 프로모터, 예컨대 폴리오마, 아데노바이러스 2 및 소 파필로마 바이러스로부터 유래된 프로모터가 포함된다. hMTII (문헌 [Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802])과 같은 유도가능한 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
진핵생물에서 CTLA4Ig 분자를 발현시키기 위한 벡터는 또한 인핸서 영역이라 지칭되는 서열을 운반할 수 있다. 이들은 유전자 발현을 최적화하는데 중요하며, 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견된다.
진핵 숙주 세포를 위한 발현 벡터의 예로는 포유동물 숙주 세포를 위한 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (마니아티스(Maniatis)); pIRES (클론테크); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (스트라타겐(Stratagene))), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (스트라타겐)), pCDNA-3 (인비트로겐(Invitrogen)) 또는 그의 변형된 형태, 아데노바이러스 벡터; 아데노-관련 바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (스트라타겐))가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
CTLA4Ig 분자를 코딩하는 핵산 서열은 진핵 숙주 세포의 게놈으로 통합되고, 숙주 게놈이 복제할 때 복제할 수 있다. 대안으로, CTLA4Ig 분자를 운반하는 벡터는 염색체외 복제를 허용하는 복제 개시점을 함유할 수 있다.
사카로미세스 세레비시아에에서 핵산 서열을 발현시키기 위해, 내생성 효모 플라스미드로부터의 복제 원점, 2μ 서클이 사용될 수 있다 (문헌 [Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307]). 대안으로, 자율 증식을 촉진할 수 있는 효모 게놈으로부터의 서열이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39]; [Tschemper et al., (1980) Gene 10:157] 및 [Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300] 참조).
효모 벡터에 대한 전사 제어 서열에는 당분해 효소의 합성을 위한 프로모터가 포함된다 (문헌 [Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149]; [Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900]). 당업계에 공지된 추가의 프로모터로는 CDM8 벡터에 제공된 CMV 프로모터 (문헌 [Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221]); 3-포스포글리세레이트 키나제를 위한 프로모터 (문헌 [Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073]), 및 기타 당분해 효소를 위한 프로모터가 포함된다.
환경적 자극 또는 세포의 성장 배지에 의해 조절될 수 있기 때문에 다른 프로모터가 유도가능하다. 이들 유도가능한 프로모터로는 열 쇼크 단백질, 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 이화작용과 관련된 효소, 및 말토스 및 갈락토스 사용에 관여하는 효소에 대한 유전자로부터의 프로모터가 포함된다.
조절 서열은 또한 코딩 서열의 3' 말단에 위치할 수 있다. 이들 서열은 메신저 RNA를 안정화하는 작용을 할 수 있다. 이러한 터미네이터는 여러가지 효모-유래 및 포유동물 유전자에서 코딩 서열 후의 3' 비번역 영역에서 발견된다.
식물들 및 식물 세포에 대한 예시적 벡터로는 아그로박테리움(Agrobacterium) Ti 플라스미드, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV), 및 토마토 골든 모자이크 바이러스 (TGMV)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
포유동물 세포는 인산칼슘의 존재하 형질감염, 미세주사, 전기천공법을 비롯한 방법 (이에 제한되지 않음)에 의해, 또는 바이러스 벡터에 의한 형질도입을 통해 형질전환될 수 있다.
식물 및 효모 게놈으로 외래 DNA 서열을 도입하는 방법으로는 (1) 기계적 방법, 예컨대 단일 세포 또는 원형질체로의 DNA의 미세주사, DNA의 존재하에 세포를 유리 구슬와 함께 볼텍싱하거나, 또는 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 구를 세포 또는 원형질체로 슛팅하는 방법; (2) 폴리에틸렌 글리콜 처리 또는 고전압 전기 펄스의 처리를 통해 거대분자가 투과될 수 있는 세포막을 제조함으로써 DNA를 도입하는 방법 (전기천공법); 또는 (3) 세포막에 융합된 리포솜 (cDNA 함유)의 사용이 포함된다.
미국 특허 출원 US 공보 번호 제20050019859호 및 미국 특허 출원 US 공보 번호 제20050084933호는 동물 또는 포유동물 세포 배양에 의한, 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 생성물의 제조 방법을 교시하며, 이는 본원에 참고로 도입된다.
세포 배양 프로세스의 단백질 생성 단계 후, CTLA4Ig 분자를 당업자에 의해 이해되는 기술을 이용하여 세포 배양 배지로부터 회수한다. 특히, CTLA4Ig 분자를 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수한다.
배양 배지를 초기에 원심분리하여, 세포 잔해 및 미립자를 제거한다. 후속적으로, IgG와 같은 오염물을 제거하기 위해 원하는 단백질을 당업계에 잘 확립된 하기 비제한적인 정제 절차에 의해 오염 DNA, 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제한다: SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 에탄올 침전; 면역친화도 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 역상 HPLC; QAE 또는 DEAE와 같은 음이온-교환 수지 또는 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-75™ 컬럼을 사용한 겔 여과; 및 단백질 A 세파로스(Sepharose)™ 컬럼. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF), 또는 프로테아제 억제제 칵테일 혼합물의 첨가는 또한 정제 동안 단백질분해성 분해를 억제하는데 유용할 수 있다. 당업자는 당해 단백질, 예를 들어 당단백질에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양에서 발현시 단백질의 형질 변화를 고려하는 변경을 필요로 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
정제 기술 및 당단백질의 탄수화물 기의 선택 방법은 또한 본 발명의 문맥상 유용하다. 예를 들어, 이러한 기술로는 선택된 탄수화물에 따라 양이온- 또는 음이온-교환 수지를 이용하는 이온-교환 크로마토그래피 (보다 염기성이거나 또는 보다 산성인 분획물이 수집됨) 또는 HPLC가 포함된다. 이러한 기술의 사용은 또한 오염물의 동반 제거를 가져올 수 있다.
정제 방법은 또한 포유동물 세포주의 세포 배양 배지에 잠재적으로 존재할 수 있는 바이러스 및/또는 레트로바이러스를 불활성화시키고/거나 제거하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 카오트로프, 예컨대 우레아 또는 구아니딘, 세제, 추가의 한외여과/투석여과 단계, 통상적인 분리, 예컨대 이온-교환 또는 크기 배제 크로마토그래피, pH 극치, 열, 프로테아제, 유기 용매 또는 이들의 임의의 조합 (이에 제한되지 않음)으로 처리하는 것을 비롯한 많은 바이러스 청소 단계가 이용가능하다.
정제된 CTLA4Ig 분자는 저장 또는 추가 프로세싱 전에 농도 및 완충제 교환을 필요로 한다. 폴 필트론(Pall Filtron) TFF 시스템은 이전 정제 컬럼으로부터 용출 완충제를 농축시키고 약물 물질에 바람직한 최종 완충제로 교환하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 농축되고 투석여과 단계로 처리된, 정제된 CTLA4Ig 분자는 2-L 바이오테이너(Biotainer)® 병, 50-L 바이오프로세스 백 또는 임의의 다른 적합한 용기로 충전될 수 있다. 이러한 용기 내의 CTLA4Ig 분자는 동결 전에 약 60일 동안 2-8℃에서 저장될 수 있다. 정제된 CTLA4Ig 분자의 2-8℃에서의 장기간 저장은 HMW 종의 비율의 증가를 유발할 수 있다. 그러므로, 장기간 저장의 경우, CTLA4Ig 분자는 저장 전에 약 -70℃에서 동결되고 약 -40℃의 온도에서 저장될 수 있다. 동결 온도는 약 -50℃ 내지 약 -90℃로 다양할 수 있다. 동결 시간은 다양할 수 있으며, CTLA4Ig 분자를 함유하는 용기의 부피, 및 동결기에 놓인 용기의 개수에 따라 크게 달라질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CTLA4Ig 분자는 2-L 바이오테이너® 병에 놓인다. 동결기에 4개 미만의 2-L 바이오테이너® 병이 놓인 경우, 약 14 내지 18 시간 이상의 동결 시간이 필요로 될 수 있다. 4개 이상의 병이 놓인 경우, 약 18 내지 24 시간 이상의 동결 시간이 필요로 될 수 있다. 동결된 CTLA4Ig 분자를 함유한 용기를 약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서 저장한다. 약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서의 저장 시간은 다양할 수 있으며, 18 시간만큼 짧을 수 있다. 동결된 약물 물질은 약물 제품의 제제의 제어 방법으로 해동될 수 있다.
공동 계류중인 2005년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/752,267호 및 2006년 10월 5일에 출원된 동 제06/849,543호, 및 2006년 12월 19일에 출원된 PCT 특허 출원 대리인 정리 번호 제10734 PCT호 (발명의 명칭이 세포주, 조성물, 및 상기 조성물의 제조 방법이고, 발명자가 키르크 라이스터(Kirk Leister)임)는 동물 또는 포유동물 세포 배양에 의한 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 생성물의 제조 방법을 교시하며, 이는 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 동결건조 제제
본 발명의 동결건조 제제는 CTLA4Ig 분자를 단백질 대 동결건조보호제 1:2 이상의 중량 비율로 포함한다. 동결건조보호제는 바람직하게는 당, 보다 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스 또는 말토스이다. 동결건조 제제는 또한 완충제, 계면활성제, 증량제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
제제 개발 연구 중에, CTLA4Ig 분자의 용액-상태 안정성 및 동결건조 고체-상태 안정성에 대한 여러 부형제의 효과가 평가되었다.
안정화제의 부재하에 동결건조 CTLA4Ig 분자의 불안정성은 제제 중 동결건조보호제의 포함에 대한 필요성을 강조하였다. 초기 스크리닝 연구는 약물 제품이 말토스 및 수크로스와 같은 당, 및 아르기닌 및 리신와 같은 아미노산의 존재하에 안정하였음을 나타내었다. 만니톨과 같은 폴리올, 및 덱스트란 40과 같은 다당류는 약물 제품의 안정성에 유해하였다. 바람직한 동결건조보호제는 이당류 말토스 및 수크로스이다.
실시예 VI에는 말토스의 존재하에 50℃에서 저장된, 동결건조 아바타셉트 약물 제품의 안정성 연구가 기재되어 있다. 고분자량(HMW) 종의 증가는 안정성-표시 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 검정법을 사용하여 모니터링하였다. 결과는 동결건조 고체-상태 형태의 CTLA4Ig 분자의 안정성이 말토스의 존재하에 향상된다는 것을 나타낸다.
동결건조 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스 또는 말토스의 양은 단백질 대 수크로스 또는 말토스 1:2 이상의 중량 비율, 바람직하게는 단백질 대 수크로스 또는 말토스 1:2 내지 1:5의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 또는 말토스 약 1:2의 중량 비율이다.
필요하다면, 동결건조 전에 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기를 첨가함으로써 고정한다. 바람직한 제약상 허용되는 산은 염산이다. 바람직한 염기는 수산화나트륨이다.
제제 개발 중에, 동결건조 약물 제품의 안정성은 pH의 기능으로서 연구되었다. 실시예 VI에는 동결건조 아바타셉트 약물 제품에 대한 안정성 연구가 pH의 기능으로서 기재되어 있다. 용액 pH는 동결건조 전에 6 내지 8로 조절하였다. 샘플을 안정하게 두고, 구성된 제품 바이알은 안정성-표시 크기-배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 검정법을 사용하여 여러 시점에서 고분자량 종의 증가에 대해 모니터링하였다. 2-8℃의 추천되는 저장 조건 하에, HMW 종의 형성률의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 초기 개발 중에 만들어진 용액-상태 안정성 데이타는 최대 안정성의 pH가 7 내지 8임을 나타내었다. 동결건조 약물 제품에 허용되는 pH 범위는 7 내지 8이며, 바람직한 표적 pH는 7.5이다.
다른 측면에서, 염 또는 완충제 성분은 약 10 mM 이상, 바람직하게는 10 내지 200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되며, "염기를 생성하는" 금속 또는 아민과 함께 여러 공지된 산 (무기산 및 유기산)으로부터 유래된다. 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있는 경우, 인산염 완충제 이외에 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제 등이 사용될 수 있다.
"증량제"는 동결건조 혼합물에 질량을 추가시키고, 동결건조 케이크의 물리적 구조에 기여하는 화합물이다 (예를 들어, 개방구 구조를 유지하는 필수적으로 균일한 동결건조 케이크의 형성을 촉진함). 증량제의 예로는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨이 포함된다. 본 발명의 동결건조 제제는 이러한 증량제를 함유할 수 있다.
보존제는 본원에서 임의로 박테리아 작용을 감소시키기 위해 제제에 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는 예를 들어 다회용 (다용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다.
당업자는 특정 치료에 필요한 투여량 및 투여 스케쥴에 따라 바이알에 충전될 약물 제품의 양을 선택할 것이다. 예를 들어, 바이알 당 CTLA4Ig의 농도는 50 내지 300 mg/바이알, 바람직하게는 100 내지 250 mg/바이알의 범위일 수 있다.
동결건조 아바타셉트 약물 제품의 전형적인 조성은 하기 표 1에 나열되어 있다.
동결건조 아바타셉트 (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성
성분 양 (mg/바이알)a
아바타셉트 262.5
말토스 일수화물 525
일염기 인산나트륨 일수화물b 18.1
염화나트륨b 15.3
염산 pH 7.5로 조절
수산화나트륨 pH 7.5로 조절
a 바이알, 바늘, 주사기 손실에 대한 5％ 과충전량을 포함한다.
b 이들 성분은 아바타셉트 약물 물질 용액에 존재한다.
동결건조 벨라타셉트 약물 제품의 전형적인 조성은 하기 표 2에 나열되어 있다.
동결건조 벨라타셉트 100 mg/바이알 약물 제품의 조성
성분 양/바이알 (mg)a
벨라타셉트 110a
수크로스 220
일염기 인산나트륨 일수화물 15.18
염화나트륨 2.55
1N 수산화나트륨 pH 7.5로 조절
1N 염산 pH 7.5로 조절
a 바이알 각각은 재구성된 용액의 바이알, 바늘 및 주사기 정체에 대한 10％ 과충전량을 함유한다.
동결건조 약물 제품은 수성 담체로 구성된다. 본원에서 당해 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에게 투여시 안전하고 무독성임), 동결건조 후 액체 제제의 제조에 유용한 담체이다. 희석제의 예로는 멸균 주사용수 (SWFI), 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충된 용액 (예를 들어, 인산염-완충된 염수), 멸균 염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 동결건조 약물 제품은 멸균 주사용수 (USP)(SWFI) 또는 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)으로 구성된다. 구성 중에, 동결건조 분말은 급속히 용해하여 투명한 무색 용액을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 동결건조 약물 제품은 멸균 주사용수 (USP)(SWFI) 또는 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP) 10 ml에 의해 약 25 mg/ml로 구성된다. 구성된 용액은 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)에 의해 1 내지 10 mg/ml의 약물 제품 농도로 추가로 희석된다. 주사를 위해 희석된 약물 제품은 등장성이고, 정맥내 주입에 의해 투여하기에 적합하다.
초기 임상 개발 중에, 동결건조 약물 제품의 구성된 용액은 비경구 생성물의 제조 및 투여에 통상적으로 사용되는 일회용 실리콘처리된 주사기와 비상용성인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 구성된 약물 제품 용액은 10 내지 15분 초과 동안 이들 주사기에 저장시 실같은 젤라틴성 입자를 형성하였다. 또한, 연구는 상기 부적합성이 이들 주사기의 윤활제로서 사용되는 실리콘 오일 (디메틸실록산)과 약물 제품의 상호작용으로 인한 것임을 나타내었다. 이들 입자의 형성은 사용 시간에 걸친 약물 제품 용액의 효력에 영향을 주지 않았다. 실리콘 비함유 주사기는 약물 제품 구성, 및 바이알로부터 정맥내 백으로의 구성된 용액의 이동에 사용하기에 바람직하다.
대안으로, 계면활성제는 구성된 약물 제품의 실리콘처리된 주사기와의 상호작용을 감소시키거나 또는 방지하기 위해, 예를 들어 충분한 양으로 제제에 첨가될 수 있다.
동결건조 제제에 대한 추천되는 저장 조건은 2-8℃이며, 추천되는 저장기간은 12개월 이상이다.
동결건조 제제의 제조
동결건조 약물 제품의 제조 방법은 동결건조를 위한 제제화된 벌크 용액의 배치(batch), 무균 여과, 바이알의 충전, 동결건조기 챔버에서의 바이알의 동결, 이어서 동결건조, 마개씌우기 및 캡핑을 포함한다.
실시예 III 및 IV에는 동결건조 아바타셉트 및 벨라타셉트 약물 제품의 제조가 각각 기재되어 있다.
제제화된 벌크 용액을 전형적으로 고정된 단백질 농도에서 고정시켜, 원하는 바이알 충전 부피가 변하지 않도록 유지할 수 있다. 동결건조보호제의 첨가 중에, 혼합기 속도는 배치 용액에서의 발포를 최소화하고, 10 내지 20분 내에 동결건조보호제가 완전히 용해되도록 하기 위해 250 ± 50 rpm에서 제어된다. 제제화된 벌크 용액은 동결건조 전에 2-8℃ 또는 실온 및 32시간 이상 동안 실내광 하에 저장될 수 있다.
제제화된 벌크 용액은 CTLA4Ig 분자의 열 감수성으로 인해 최종적으로 멸균되지 않는다. 제제화된 벌크 용액은 동결건조용 바이알에 충전하기 전에 직렬식 2개의 0.22-㎛ 밀리포어 밀리팩(Millipore Millipak)® 멸균 등급 필터를 사용함으로써 멸균될 수 있다.
상기 제품을 위해 선택된 동결건조 주기는 생성물 품질의 악화 없이 1차 및 이차 건조 단계 중에 효율적인 승화 및 증발을 갖기 위해 최적화된다.
동결건조 분말의 급속 용해를 보조하고, 약물 제품의 구성 중에 과도한 포움 형성을 방지하기 위해, 동결건조 바이알은 동결건조 주기의 마지막에 500 ± 100 ㎛ 챔버 압력하에 마개씌워진다.
당업자는 제조 및 주사 중에 바이알, 바늘, 주사기에 정체되는 양에 대한 보상을 위해 용기를 과충전해야 할 필요성을 인식할 것이다. 예를 들어, 아바타셉트 약물 제품 250 mg/ml 바이알 각각은 재구성 및 회수 손실을 고려하여 약물 제품의 5％ 과잉공급량을 함유한다.
액체 피하 제제
당업자는 잦은 장기간 요법을 필요로 하는 환자에서의 IV 제제의 불편을 인식할 것이다. 환자는 1시간 만큼 길게 지속될 수 있는 IV 주입을 통해 약물을 투여받기 위해 병원으로 자주 방문해야 한다. 결과적으로, 집에서 자가투여될 수 있는 SC 제제는 이러한 환자에게 매우 이로울 것이다.
피하 투여의 경우, 높은 단백질 농도를 갖는 투여량 형태가 바람직하다. 1 mg/kg 초과 (투여 당 >100 mg)의 고투여량에 의한 치료는 SC 경로에 의해 제공될 수 있는 작은 부피 (<1.5 ml)로 인해 100 mg/ml 초과의 농도의 제제의 개발을 요한다. 고분자량 종의 형성에 대해 고농도에서 장기간 안정성을 최적화하기 위해, 본 발명의 액체 SC 제제의 용액 상태 안정성에 대한 여러 부형제의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다.
본 발명의 SC 제제는 수성 담체 중에 안정화 수준에서 당과 조합하여 100 mg/ml 이상의 단백질 농도에서, 바람직하게는 안정화 수준에서 당과 조합하여 125 mg/ml 이상의 단백질 농도에서 CTLA4Ig 분자를 포함한다. 당은 바람직하게는 단백질 대 당 1:1.1 이상의 중량 비율로 존재한다. 안정화제는 바람직하게는 SC 주사기를 통해 투여하기에 적합하지 않거나 바람직하지 않은 점도를 가져올 수 있는 양을 초과하지 않는 양으로 사용된다. 당은 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스이다. SC 제제는 또한 완충제, 계면활성제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
SC 제제의 안정성 프로파일은 당, 다당류, 아미노산, 계면활성제, 중합체, 시클로덱스트란, 단백질 등을 비롯한 여러 안정화제의 존재하에 평가되었다. 평가된 모든 부형제 중에서, 당, 예컨대 수크로스, 만니톨 및 트레할로스는 고분자량 종의 형성에 대한 우수한 안정화 효과를 가졌다.
실시예 V 및 VIII에는 수크로스의 존재하에 여러 온도에서 여러 기간 동안 저장된, SC 벨라타셉트 및 아바타셉트 약물 제품 각각의 안정성 연구가 기재되어 있다. 고분자량 종의 증가는 안정성-표시 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 검정법을 사용하여 모니터링하였다. 결과는 SC 제제 중 CTLA4Ig 분자의 안정성이 수크로스의 존재하에 향상된다는 것을 나타낸다. 수크로스에 의한 안정화는 보다 높은 수크로스:단백질 중량 비율에서 우수하였다. 이들 연구를 기초로, 과도한 고장성을 갖는 SC 용액을 가져오지 않고 최적 안정성을 제공하는 비율에서 안정화제로서 수크로스를 선택하였다.
SC 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스의 양은 단백질 대 수크로스 1:1 이상의 중량 비율, 바람직하게는 단백질 대 수크로스 1:1.3 내지 1:5의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 약 1:1.4의 중량 비율이다.
필요하다면, 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기를 첨가함으로써 고정한다. 바람직한 제약상 허용되는 산은 염산이다. 바람직한 염기는 수산화나트륨이다.
제제 개발 중에, SC 약물 제품의 안정성은 pH의 기능으로서 연구되었다. 실시예 V에는 SC 벨라타셉트 약물 제품에 대한 안정성 연구가 pH의 기능으로서 기재되어 있다. SC 제제 pH는 7 내지 8.2로 조절하고, 샘플을 안정하게 두고, 약물 제품은 안정성-표시 크기-배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 검정법을 사용하여 여러 시점에서 고분자량 종의 증가에 대해 모니터링하였다. 2-8℃의 추천되는 저장 조건 하에, 3개월 후에 HMW 종의 형성률의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
응집 이외에, 탈아미드화는 발효, 수거/세포 청징화, 정제, 약물 물질/약물 제품 저장 중에 및 샘플 분석 중에 일어날 수 있는 펩티드 및 단백질의 통상적인 생성물 변형이다. 탈아미드화는 가수분해를 통해 생성될 수 있는 숙신이미드 중간체를 형성하는, 단백질로부터 NH3가 손실되는 것이다. 숙신이미드 중간체는 모 펩티드의 17 u 질량 감소를 가져온다. 후속적 가수분해는 18 u 질량 증가를 가져온다. 숙신이미드 중간체의 단리는 수성 조건 하에서의 불안정성으로 인해 어렵다. 이와 같이, 탈아미드화는 전형적으로 1 u 질량 증가로서 검출가능하다. 아스파라진의 탈아미드화는 아스파르트산 또는 이소아스파르트산을 생성시킨다. 탈아미드화율에 영향을 미치는 파라미터로는 pH, 온도, 용매 유전 상수, 이온 강도, 일차 서열, 국소 폴리펩티드 형태 및 삼차 구조를 들 수 있다. 펩티드 쇄의 Asn에 인접한 아미노산 잔기는 탈아미드화율에 영향을 미친다. 단백질 서열에서 Asn 다음의 Gly 및 Ser는 탈아미드화에 대한 보다 높은 감수성을 가져온다.
예비 실험실 규모 안정성 연구는 탈아미드화가 pH 7.8에서 SC 아바타셉트 제제를 사용하여 24개월의 펩티드 맵핑 시험 방법의 기준 수준을 초과할 것이라고 제안한다. 60％ 습도에서 2-8℃ 및 25℃ 둘 모두의 온도하에 6개월에서의 데이타는 pH 7.8에서의 SC 아바타셉트 샘플과 비교하여 탈아미드화율이 pH 7.2에서 더 낮고 pH 8에서 더 높았음을 나타내었다. 실시예 IX 및 XII에는 6.3 내지 7.2 범위의 pH에서 SC 약물 제품 제제에서의 탈아미드화를 평가하도록 설계된 실험실 규모 pH 연구가 기재되어 있다.
SC 약물 제품에 대해 허용되는 pH 범위는 6 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7.8, 보다 바람직하게는 6 내지 7.2이다.
다른 측면에서, 염 또는 완충제 성분은 10 mM 이상, 바람직하게는 10 내지 200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되며, "염기를 생성하는" 금속 또는 아민과 함께 여러 공지된 산 (무기산 및 유기산)으로부터 유래된다. 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있는 경우, 인산염 완충제 이외에 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제 등이 사용될 수 있다.
실시예 VIII에는 아바타셉트 SC 약물 제품에 대한 완충제 강도의 효과가 기재되어 있다. 안정성은 100 mg/mL 아바타셉트 약물 제품 농도에서 pH 7.5에서 5mM 인산염 완충제와 비교시 10 mM 인산염 완충제에서 우수하였다. 또한, 10mM 인산염 완충제의 보다 큰 완충 능력은 5mM 완충제와 비교시 제제의 우수한 pH 제어를 제공하였다.
본원에서 당해 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에게 투여시 안전하고 무독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 담체이다. 담체의 예로는 멸균 주사용수 (SWFI), 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충된 용액 (예를 들어, 인산염-완충된 염수), 멸균 염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있다.
보존제는 본원에서 임의로 박테리아 작용을 감소시키기 위해 제제에 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는 예를 들어 다회용 (다용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다.
동결건조 약물 제품에서 논의된 바와 같이, CTLA4Ig 분자는 표준 주사기에서 발견되는 실리콘과 비상용성이다, 즉 이는 실리콘과 상호작용하여 육안으로 확인되는 미립자를 형성하며, 이에 의해 환자가 실리콘 비함유 주사기를 사용하도록 제한된다. SC 제제는 임의로 실리콘의 존재하에 육안으로 확인되는 미립자의 형성을 방지하는 계면활성제를 포함할 수 있다.
실시예 V 및 VIII에는 벨라타셉트 및 아바타셉트 약물 제품 각각의 용액 안정성에 대한 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 188의 효과가 기재되어 있으며, 계면활성제는 SC 제제 중 CTLA4Ig 분자의 안정성에 대한 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 상이한 수준의 폴록사머 188를 평가하였으며, 4 mg/ml 내지 8 mg/ml, 바람직하게는 8 mg/ml의 농도가 제제 중 실리콘 관련 미립자 형성을 방지하는데 적합하다는 것이 밝혀졌다.
벨라타셉트 SC 약물 제품, 125 mg/ml (100 mg/바이알) 약물 제품의 전형적인 조성은 하기 표 3에 제공된다.
벨라타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (100 mg/바이알)의 조성
성분 양 (mg/바이알)b
벨라타셉트 140.0
수크로스 190.4
폴록사머 188 8.96
일염기 인산나트륨 일수화물 0.371
이염기 인산나트륨 무수물 1.193
주사용수 1.12 ml로 적량
b 바이알, 바늘, 주사기 손실에 대한 40％ 과충전량을 포함한다.
아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (125 mg/바이알)의 전형적인 조성은 하기 표 4에 제공된다.
아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (125 mg/바이알)의 조성
성분 양 (mg/바이알)c
아바타셉트 175
수크로스 238
폴록사머 188 11.2
일염기 인산나트륨 일수화물 0.20
이염기 인산나트륨 무수물 1.36
주사용수 1.4 ml로 적량
c 바이알, 바늘, 주사기 손실에 대한 40％ 과충전량을 포함한다.
주사기에 충전된 아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml의 전형적인 조성은 하기 표 5에 제공된다.
아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (125 mg/주사기)의 조성
성분 양 (mg/주사기)
아바타셉트 125
수크로스 170
폴록사머 188 8.0
일염기 인산나트륨 일수화물 0.143
이염기 인산나트륨 무수물 0.971
주사용수 1 ml로 적량
SC 제제에 대한 추천되는 저장 조건은 2-8℃이며, 추천되는 저장기간은 12개월 이상이다.
아바타셉트 SC 약물 제품 및 매칭 플라시보의 밀도는 메틀러-톨레도(Mettler-Toledo) 밀도계를 사용하여 주변 온도에서 결정하였다. 측정은 5 mL 샘플을 사용하여 삼중으로 수행하였다. 아바타셉트 SC 제제의 밀도는 1.1 g/cc인 것으로 밝혀졌으며, 플라시보 제품의 밀도는 1.065 g/cc인 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, SC CTLA4Ig 제제의 밀도는 약 1.0 g/cc 내지 약 1.2 g/cc, 바람직하게는 약 1.0 g/cc 내지 약 1.15 g/cc, 보다 바람직하게는 약 1.095 g/cc 내지 약 1.105 g/cc이다.
아바타셉트 SC 제제의 점도는 주변 온도에서 브룩필드(Brookfield) 전류계를 사용하여 결정하였다. 9.3 cps의 기준 표준을 측정에 사용하였다. 125 mg/mL 아바타셉트 농도에서의 SC 약물 제품의 점도는 13 ± 2 cps인 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 125 mg/mL에서의 SC CTLA4Ig 제제의 점도는 약 9 내지 약 20 cps, 바람직하게는 약 9 내지 약 15 cps, 보다 바람직하게는 12 내지 약 15 cps이다.
SC 아바타셉트 약물 제품 및 플라시보 제제의 몰삼투압농도는 증기압 방법을 사용하여 측정하였다. 데이타는 125 mg/mL의 농도에서 아바타셉트 SC 제제의 몰삼투압농도가 770 ± 25 mOsm/kgH2O인 것을 나타낸다. 전형적으로, 125 mg/mL에서 SC CTLA4Ig 제제의 몰삼투압농도는 약 250 내지 약 800 mOsm/kgH2O, 바람직하게는 약 700 내지 약 800 mOsm/kgH2O, 보다 바람직하게는 약 750 내지 약 800 mOsm/kgH2O이다.
SC 제제의 제조
SC 제제를 위해 개발된 제조 방법은 전형적으로 당 및 계면활성제와의 배합, 이어서 무균 멸균 여과 및 바이알 또는 주사기로의 충전, 임의로 투석여과 (완충제 교환), 및 한외여과 단위를 사용한 약물 물질의 농축을 포함한다.
실시예 I 및 II에는 SC 벨라타셉트 및 아바타셉트 약물 제품 각각의 제조가 기재되어 있다.
당업자는 제조 및 주사 중에 바이알, 바늘, 주사기에 정체되는 양에 대한 보상을 위해 용기를 과충전해야 할 필요성을 인식할 것이다. 예를 들어, 회수 손실을 고려하고 벨라타셉트 약물 제품 100 mg을 함유하는 용액 0.8 ml가 바이알로부터 회수될 수 있다는 것을 보상하기 위해 약물 제품의 40％ 과잉공급량이 SC 액체 제제의 바이알 각각에 도입된다.
액체 제제
IV 제제는 특정 경우, 예컨대 환자가 이식 후 IV 경로를 통해 모든 약물을 투여받으며 병원에 있는 경우에 바람직한 투여 경로일 수 있다. 당업자는 제조자 및 의료 전문가 모두에 대한 동결건조 제제의 문제점 및 위험을 인식할 것이다. 재구성과 관련된 의료 전문가에 대한 위험 및 문제점으로는 IV 제제를 조제하는데 필요한 의료 전문가의 시간 뿐만 아니라 오염, 발포 및 제품 손실을 들 수 있다. 또한, 장비 및 종업원 시간에 대한 제조자의 비용은 제조 방법에서 동결건조 단계를 제거함으로써 감소될 수 있다. 이들 이유 모두는 IV 사용을 위한 액체 제제를 설계하는데 충분히 동기부여를 한다.
개발되는 바람직한 액체 제제는 제1 구성 후 동결건조 약물 제품을 약 25 mg/ml의 단백질 농도로 모방하는 제제일 것이다. 그 후, 획득된 액체 제제는 또한 사용시 의료 전문가에 의해 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)으로 1 내지 10 mg/ml의 원하는 약물 제품 농도로 희석될 것이다. 주사를 위해 희석된 약물 제품은 등장성이며, 정맥내 주입에 의해 투여하기에 적합하다.
상기 논의된 바와 같이, 액체 제제의 장기간 안정성은 단백질 약물 제품에 대한 논점이다. 고분자량 종의 형성에 대한 용액의 장기간 안정성을 확신하기 위해, 본 발명의 액체 제제의 용액 상태 안정성을 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다.
본 발명의 액체 제제는 수성 담체 중에 안정화 수준에서 당과 조합하여 20 mg/ml 이상의 단백질 농도에서, 바람직하게는 안정화 수준에서 당과 조합하여 25 mg/ml 이상의 단백질 농도에서 CTLA4Ig 분자를 포함한다. 당은 바람직하게는 단백질 대 당 1:1 이상의 중량 비율로 존재한다. 당은 바람직하게는 이당류, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 액체 제제는 또한 완충제, 계면활성제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
액체 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스의 양은 단백질 대 수크로스 1:1 이상의 중량 비율, 바람직하게는 단백질 대 수크로스 1:2 내지 1:10의 중량 비율, 보다 바람직하게는 단백질 대 수크로스 약 1:2의 중량 비율이다.
필요하다면, 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기를 첨가함으로써 고정한다. 바람직한 제약상 허용되는 산은 염산이다. 바람직한 염기는 수산화나트륨이다.
제제 개발 중에, 액체 약물 제품의 안정성은 7.5의 표적 pH에서 연구되었다. 실시예 VII에는 7.5의 pH에서 액체 벨라타셉트 약물 제품에 대한 안정성 연구가 기재되어 있다. 액체 제제 pH는 7.5로 조절하고, 샘플을 안정하게 두고, 약물 제품은 안정성-표시 크기-배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 검정법을 사용하여 여러 시점에서 고분자량 종의 증가에 대해 모니터링하였다. 2-8℃의 추천되는 저장 조건 하에, HMW 종의 형성률의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
응집 이외에, 탈아미드화 및 단편형성은 발효, 수거/세포 청징화, 정제, 약물 물질/약물 제품 저장 중에 및 샘플 분석 중에 일어날 수 있는 펩티드 및 단백질의 통상적인 생성물 변형이다. 예비 실험실 규모 안정성 연구는 탈아미드화가 펩티드 맵핑 시험 방법의 기준 수준 (5％ T26a 또는 T26b (％T30) 최대 초과로 상승)을 초과할 것이며, 단편형성은 2-8℃에서 저장된 벨라타셉트(pH 7.5에서 20 mg/ml)를 사용하여 24개월에서의 SDS-PAGE 시험 방법의 기준 수준 (96％ 주요 밴드 최소 미만으로 하락)을 초과할 것이라고 제안한다. 액체 제제로부터의 데이타 (상기 SC 데이타 참조)는 본 발명의 제제의 pH가 저하되기 때문에 상기 제제에서 발견되는 탈아미드화율이 감소한다는 것을 나타낸다.
액체 약물 제품에 대해 허용되는 pH 범위는 6 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7.8, 보다 바람직하게는 6 내지 7.2이다.
다른 측면에서, 염 또는 완충제 성분은 약 10 mM 이상, 바람직하게는 10 내지 200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되며, "염기를 생성하는" 금속 또는 아민과 함께 여러 공지된 산 (무기산 및 유기산)으로부터 유래된다. 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있는 경우, 인산염 완충제 이외에 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제 등이 사용될 수 있다.
본원에서 당해 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에게 투여시 안전하고 무독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 담체이다. 담체의 예로는 멸균 주사용수 (SWFI), 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충된 용액 (예를 들어, 인산염-완충된 염수), 멸균 염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있다.
보존제는 본원에서 임의로 박테리아 작용을 감소시키기 위해 제제에 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는 예를 들어 다회용 (다용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다.
동결건조 약물 제품에서 논의된 바와 같이, CTLA4Ig 분자는 표준 주사기에서 발견되는 실리콘과 비상용성이다, 즉 이는 실리콘과 상호작용하여 육안으로 확인되는 미립자를 형성하며, 이에 의해 의료 전문가가 실리콘 비함유 주사기를 사용하는 것이 제한된다. 액체 제제는 임의로 실리콘의 존재하에 육안으로 확인되는 미립자의 형성을 방지하는 계면활성제를 포함할 수 있다.
벨라타셉트 액체 약물 제품, 20 mg/ml (250 mg/바이알) 약물 제품의 전형적인 조성은 하기 표 6에 제공된다.
벨라타셉트 액체 약물 제품 20 mg/ml (250 mg/바이알)의 조성
성분 양a (mg/바이알)
벨라타셉트 260
수크로스 520
일염기 인산나트륨 일수화물 18.1
염화나트륨 15.3
염산 pH 7.5로 조절
수산화나트륨 pH 7.5로 조절
주사용수 13 ml로 적량
a 바이알, 바늘 및 주사기 손실에 대한 4％ 과충전량을 포함한다.
액체 제제에 대한 추천되는 저장 조건은 2-8℃이며, 추천되는 저장기간은 12개월 이상이다.
액체 제제의 제조
액체 약물 제품의 제조 방법은 전형적으로 당 및 임의로 계면활성제와의 배합, 이어서 무균 여과 및 바이알로의 충전, 마개씌우기 및 캡핑을 포함한다.
제제화된 벌크 용액을 전형적으로 고정된 단백질 농도에서 고정시켜, 원하는 바이알 충전 부피가 변하지 않도록 유지할 수 있다. 약물 물질로의 당의 첨가 중에, 혼합기 속도는 배치 용액에서의 발포를 최소화하고, 10 내지 20분 내에 당이 완전히 용해되도록 하기 위해 250 ± 50 rpm에서 제어된다. 제제화된 벌크 용액은 충전 전에 2-8℃ 또는 실온에서 24시간 이상 동안 실내광 하에 저장될 수 있다.
벌크 용액은 CTLA4Ig 분자의 열 감수성으로 인해 최종적으로 멸균되지 않는다. 벌크 용액은 바이알에 충전하기 전에 직렬식 2개의 0.22-㎛ 밀리포어 밀리팩® 멸균 등급 필터를 사용함으로써 멸균될 수 있다.
당업자는 제조 및 주사 중에 바이알, 바늘, 주사기에 정체되는 양에 대한 보상을 위해 용기를 과충전해야 할 필요성을 인식할 것이다. 예를 들어, 벨라타셉트 약물 제품 20 mg/mL (250 mg/바이알)의 바이알 각각은 재구성 및 회수 손실을 고려하여 약물 제품의 4％ 과잉공급량을 함유한다.
제조 물품
본 발명의 다른 실시양태에서, 약물 제품을 함유하고 바람직하게는 그의 사용에 대한 지시사항을 제공하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험 튜브를 들 수 있다. 용기는 유리, 플라스틱 또는 금속과 같은 여러 물질로부터 형성될 수 있다.
용기는 동결건조 제제 또는 액체 제제를 보유한다. 용기 상에 있거나 또는용기와 결합된 표지는 재구성 및/또는 사용에 대한 지시사항을 표시할 수 있다. 예를 들어, 표지는 25 mg/ml 벨라타셉트 약물 제품이 상기 기재된 바와 같은 단백질 농도로 희석된다는 것을 표시할 수 있다. 또한, 표지는 SC 제제가 피하 투여에 유용하거나 또는 피하 투여용으로 적용됨을 표시할 수 있다. 제제를 보유하는 용기는 반복 투여, 예를 들어 피하 제제의 반복 투여 (예를 들어, 2 내지 6회 투여)를 허용하는 다회용 바이알일 수 있다. 대안으로, 용기는 예를 들어 피하 제제를 함유하는 예비충전된 주사기일 수 있다.
제조 물품은 예를 들어 동결건조 제제에 적합한 담체를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다.
제조 물품은 또한 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용에 대한 지시사항을 포함하는 팩키지 삽입물을 비롯한 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 도구를 포함할 수 있다.
실리콘 비함유 주사기는 바람직하게는 동결건조 약물 제품의 재구성, 및/또는 바이알로부터 정맥내 백으로의 구성된 용액의 이동과 같은 경우에 계면활성제 비함유 약물 제품에 사용되며, 약물 제품 바이알에 공동-패키징될 수 있다.
사용 방법
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제를 투여하는 것을 포함하는, 면역계 질환 또는 내성 유도의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 면역계 질환은 CD80/CD86-양성 세포와 CD28- 및/또는 CTLA4-양성 세포의 상호작용에 의해 매개된다. 추가 실시양태에서, T 세포 상호작용이 억제된다. 면역계 질환으로는 자가면역 질환, 면역증식성 질환 및 이식편-관련 장애가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 방법은 대상체에게 CD80- 및/또는 CD86-양성 세포와 T 세포의 상호작용을 조절하기 위해 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제를 투여하는 것을 포함한다. 이식편-관련 질환의 예로는 이식편대숙주 질환 (GVHD) (예를 들어, 골수 이식으로부터 발생하거나 또는 내성 유도를 가져올 수 있음), 이식편 이식 거부, 만성 거부, 및 고형 기관, 피부, 섬세포, 근육, 간세포, 뉴런을 비롯한 조직 또는 세포 동종이계이식편 또는 이종이식편과 관련된 면역 장애를 들 수 있다. 면역증식성 질환의 예로는 건선; T 세포 림프종; T 세포 급성 림프모세포성 백혈병; 고환 혈관중심성 T 세포 림프종; 양성 림프구성 맥관염; 및 자가면역 질환, 예컨대 루푸스 (예를 들어, 홍반성 루푸스, 신장염 루푸스), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액부종, 그레이브스병, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 애디슨병, 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병, 유형 I 당뇨병), 양호한 파스튜어 증후군, 중증근무력증, 천포창, 크론병, 교감성 안염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 저혈소판증, 원발성 담관성 경화증, 만성 작용 간염, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 류머티스성 질환 (예를 들어, 류머티스성 관절염), 다발성 근육염, 경피증, 및 혼합 결합 조직 질환을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 이식 조직의 수용자인 대상체에 의한 고형 기관 및/또는 조직 이식 거부의 억제 방법을 제공한다. 전형적으로, 조직 이식에서, 이식편의 거부는 T 세포에 의한 이식편의 외래물질로서의 인식을 통해 개시된 후, 이식편을 파괴하는 면역 반응이 개시된다. 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제는 T 림프구 증식 및/또는 사이토카인 분비의 억제에 의해 감소된 조직 파괴를 가져올 수 있으며, 항원-특이적 T 세포 무반응성의 유도는 전신성 면역억제에 대한 필요없이 장기간 이식편 허용을 가져올 수 있다. 추가로, 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제는 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크롤리무스, 바실릭시맙 및/또는 기타 생물제제 (이에 제한되지 않음)를 비롯한 다른 약제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서의 이식편대숙주 질환의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 제제를 단독으로, 또는 IL-2, IL-4 또는 γ-인터페론에 반응성인 추가의 리간드와 함께 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 CTLA4Ig 분자 SC 제제는 공여자 T 세포의 동종반응을 억제하기 위해 골수 이식 수용자에게 투여될 수 있다. 대안으로, 골수 이식편 내의 공여자 T 세포는 이식 전에 수용자의 동종항원에 생체외 내성화될 수 있다.
본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제에 의한 T 세포 반응의 억제는 또한 자가면역 장애의 치료에 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 자가항원에 대해 반응성이며, 질환 병리와 관련된 자가항체 및 사이토카인의 생성을 촉진하는 T 세포의 부적절한 활성화로부터 기인한다. 자가면역 장애를 앓고 있거나 또는 걸리기 쉬운 대상체에서 CTLA4Ig 분자 제제의 투여는 자가반응성 T 세포의 활성화를 방지할 수 있으며, 질환 증상을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 상기 방법은 또한 대상체에게 본 발명의 제제를 단독으로, 또는 IL-2, IL-4 또는 γ-인터페론에 반응성인 추가의 리간드와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제제에 대한 투여 및 투여량 요법의 가장 효과적인 방식은 질환의 중증도 및 경과상태, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 실시에 따라, 대상체의 치료를 위한 유효량은 약 0.1 내지 약 10 mg/대상체 체중 kg일 수 있다. 또한, 유효량은 약 1 내지 약 10 mg/대상체 체중 kg일 수 있다.
본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제는 대상체에서 내생성 B7 (예를 들어, CD80 및/또는 CD86) 분자가 그의 각 리간드에 결합하는 것을 차단하는데 충분한 양으로 및 시간 동안 (예를 들어, 시간의 길이 및/또는 수회) 대상체에게 투여될 수 있다. 내생성 B7/리간드 결합의 차단은 그에 의해 CD28-및/또는 CTLA4-양성 세포와 B7-양성 세포 (예를 들어, CD80-및/또는 CD86-양성 세포) 간의 상호작용을 억제한다. CTLA4Ig 분자의 투여량은 영향받는 조직의 유형, 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도, 대상체의 건강, 및 작용제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 비롯한 많은 인자에 따라 달라진다. 따라서, 작용제의 투여량은 대상체 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있으며, 미국 특허 출원 US 공보 번호 제US 2003/0083246호 및 미국 특허 출원 US 공보 번호 제US 2004/0022787호는 류머티스성 관절염과 같은 류머티스성 질환의 치료를 위한, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CTLA4Ig에 대한 투여량 및 투여 스케쥴을 교시한다. 상기 문헌 모두는 본원에 참고로 도입된다.
유효량의 CTLA4Ig 분자는 필요에 따라 대상체에게 시간/일/주/월/년 당 1회 또는 수회로 매일, 매주, 매월 및/또는 매년 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 유효량의 CTLA4Ig 분자는 초기에 1개월 동안 2주마다 1회 투여된 후, 매월 1회 투여될 수 있다.
CTLA4Ig 분자의 유효량은 약 0.1 내지 100 mg/대상체 체중 kg의 양이다. 다른 실시양태에서, 유효량은 약 0.1 내지 20 mg/대상체 체중 kg의 양이다. 특정 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 약 2 mg/대상체 체중 kg이다. 다른 특정 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 약 10 mg/대상체 체중 kg이다. 다른 특정 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 60 kg 미만 체중의 대상체에 대해 500 mg, 60 내지 100 kg 체중의 대상체에 대해 750 mg, 및 100 kg 초과 체중의 대상체에 대해 1000 mg이다.
2005년 4월 6일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/668,774호, 및 2006년 4월 6일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제11/399,666호는 이식편 이식과 관련된 면역 장애의 치료를 위한, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LEA29YIg에 대한 투여량 및 투여 스케쥴을 교시한다. 상기 문헌 모두는 본원에 참고로 도입된다.
전형적으로, 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제의 투여량은 체중을 기준으로 하며, 투여 요법은 표적 혈청 최저치 프로파일에 의해 지시될 수 있다. 전형적으로, 이식후 처음 3 내지 6개월에 걸쳐 약 3 ㎍/mL 내지 약 30 ㎍/mL의 본 발명의 LEA29YIg 분자의 표적 최저치 혈청 농도는 동종이계이식편의 기능을 유지하는데 충분할 것이며, 바람직하게는 약 5 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL이다. 전형적으로, 유지 단계 중 본 발명의 LEA29YIg 분자의 표적 최저치 혈청 농도는 약 0.2 ㎍/mL 내지 약 3 ㎍/mL, 바람직하게는 약 0.25 ㎍/mL 내지 약 2.5 ㎍/mL이다.
본 발명의 LEA29YIg 분자는 약 0.1 내지 약 20.0 mg/환자 체중 kg, 전형적으로 약 1.0 내지 약 15.0 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, L104EA29YIg는 이식 후 고위험 기간인 초기 단계 중에 10 mg/환자 체중 kg으로 투여되고, 5 mg/환자 체중 kg의 유지 투여량으로 감소될 수 있다.
본 발명의 CTLA4Ig 분자는 30분 내지 1시간 이상의 정맥내 주입을 통해 투여될 수 있다. 대안으로, 일회 내지 다회 피하 주사는 필요 투여량을 전달할 수 있다. 전형적으로, 30분 정맥내 주입은 환자가 병원에 있고 모니터링을 위해 의료 전문가를 방문하는 스케쥴이 있는 동안의 치료 초기 단계 중에 사용되는 투여 경로이다. 피하 주사는 유지 단계 중에 사용되는 전형적인 투여 방식이며, 이에 의해 환자는 정맥내 주입을 위해 의료 전문가를 방문하는 회수를 감소시킴으로써 그의 정상적인 스케쥴로 돌아갈 수 있다.
실시예 10에는 건강한 대상체 및 류머티스성 관절염 (RA)이 있는 환자에서의 동결건조 IV CTLA4Ig 제제의 약물동력학이 기재되어 있다. RA 환자 및 건강한 대상체에서의 아바타셉트의 약물동력학은 비교가능한 것으로 보인다. RA 환자에서, 다회 정맥내 주입 후, 아바타셉트의 약물동력학은 2 mg/kg 내지 10 mg/kg의 투여량 범위에 걸쳐 Cmax 및 AUC의 비례적 증가를 나타내었다. 10 mg/kg에서, 혈청 농도는 60일에 24 mcg/mL의 평균 (범위) 최저치 농도 (약 1 내지 약 66 mcg/mL)에서 정상-상태에 도달한 것으로 보였다. RA 환자에서 1개월 간격으로 10 mg/kg으로 연속적 반복 치료시 아바타셉트의 전신 축적은 나타나지 않았다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 충분히 이해될 것이다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 모든 인용물은 개시된 내용 전체가 본원에 참고로 도입된다.
실시예 I
벨라타셉트 SC 125 mg/ml (100 mg/바이알) 약물 제품을 피하 투여에 적합한, 비발열원성의 바로 사용가능한 멸균 용액으로 제제화하였다.
벨라타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (100 mg/바이알)을 2.2 kg 규모 (1500개의 바이알)로 제조하였다. 배치식은 하기 표 7에 제공된다.
대표적 배치식
성분 배치 당 양 (g)
벨라타셉트 약물 물질b 250.0
수크로스 340.0
폴록사머 188 16.0
일염기 인산나트륨 일수화물 0.662
이염기 인산나트륨 무수물 2.13
주사용수 2.2 kg으로 적량
총 배치 크기 (kg) 2.2 kg a
a 총 배치 크기 2.2 kg (2 L). 용액의 밀도는 (20℃ 내지 25℃에서) 1.10 g/ml이다.
b 벨라타셉트 약물 물질: 단백질 농도 25 mg/ml, 25mM 인산나트륨, 10mM 염화나트륨, pH 7.5, <5％ HMW 종
벨라타셉트 SC 약물 제품, 125 mg/ml (100 mg/바이알) 약물 제품의 제조 방법은 pH 7.5의 25mM 인산나트륨, 10mM 염화나트륨 완충제로부터 10 mM 인산나트륨 pH 7.5 완충제로의 벌크 약물 물질의 완충제 교환, 이어서 완충제의 제거에 의한 약 25 mg/ml 내지 약 150 mg/ml의 단백질 농축을 포함한다. 완충제 교환은 새로운 10 mM 인산나트륨 pH 7.5 완충제에 대한 벌크 약물 물질의 5회 투석여과, 이어서 완충제 제거에 의한 약 150 mg/ml로의 단백질 농축에 의해 달성하였다. 스테인레스 스틸 펠리콘(Pelicon) 미니 필터 홀더 (밀리포어)에는 공급부 상의 스테인레스 스틸 압력 게이지 및 막 밸브, 농축액 포트 및 투과액 포트를 장착하였다. 펠리콘 미니 모듈로 사용되는 2개의 여과 카세트에는 30 kDa 명목상 분자량 컷오프 한계를 갖는 0.1 ㎡ 면적 바이오맥스 폴리에테르술폰 막을 장착하였다. 여과 카세트는 제조자의 추천에 따라 설치하였다. 약물 물질을 위한 공급 용기는 자기 교반 막대가 장착된 4 리터 유리 용기였다. 마스터플렉스(MasterFlex) 고성능 실리콘 배관은 공급 용기를 필터 홀더 및 투과물 라인에 연결하는데 사용하였다. 공급 라인에 설치된 연동형 펌프에 의해 공급부 유동을 제공하였다. 그 후, 수크로스 및 폴록사머 188을 농축된 단백질 용액에 용해시키고, 최종 배치 중량을 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5)으로 조절하였다. 벌크 용액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과하고, 멸균의 발열원을 제거한 5-cc 유형 I 플린트 유리 바이알에 충전하고, 20 mm 고무 마개로 마개씌우고, 20 mm 알루미늄 플립-오프 밀봉부로 밀봉하였다. 벨라타셉트 SC 약물 제품, 125 mg/ml (100 mg/바이알) 약물 제품의 조성은 하기 표 8에 제공된다.
벨라타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (100 mg/바이알)의 조성
성분 양 (mg/바이알)d
벨라타셉트 140.0
수크로스 190.4
폴록사머 188 8.96
일염기 인산나트륨 일수화물 0.371
이염기 인산나트륨 무수물 1.193
주사용수 1.12 ml로 적량
d 바이알, 바늘 및 주사기 손실에 대한 40％ 과충전량을 포함한다.
실시예 II
아바타셉트 SC 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품을 피하 투여에 적합한, 비발열원성의 바로 사용가능한 멸균 용액으로 제제화하였다. 아바타셉트 SC 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 배치는 5-L 규모 (3,500 바이알)로 제조하였다. 배치식은 하기 표 9에 제공된다.
배치식
성분 양 (gm)
아바타셉트 약물 물질a 625
수크로스 850
폴록사머 188 40
일염기 인산나트륨 일수화물 0.715
이염기 인산나트륨 무수물 4.86
주사용수 5.0 L로 적량
총 배치 크기 (L) 5.0
a 아바타셉트 약물 물질: 단백질 농도 50 mg/ml, 25mM 인산나트륨, 50mM 염화나트륨, pH 7.5, <5％ HMW 종
상기 실시예 I에 기재된 바와 같이, 아바타셉트 SC 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 제조 방법은 pH 7.5의 25mM 인산나트륨, 50mM 염화나트륨으로부터 10 mM 인산나트륨 pH 7.8 완충제로의 벌크 약물 물질의 완충제 교환, 이어서 완충제의 제거에 의한 약 50 mg/ml 내지 약 150 mg/ml의 단백질 농축을 포함한다. 수크로스 및 폴록사머 188을 농축된 단백질 용액에 용해시키고, 최종 배치 중량을 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.8)으로 조절하였다. 벌크 용액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과하고, 멸균의 발열원을 제거한 5-cc 유형 I 플린트 유리 바이알에 충전하고, 20 mm 고무 마개로 마개씌우고, 20 mm 알루미늄 플립-오프 밀봉부로 밀봉하였다.
아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml (125 mg/바이알)의 조성은 하기 표 10에 제공된다.
아바타셉트 SC 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 조성
성분 양 (mg/바이알)e
아바타셉트 175
수크로스 238
폴록사머 188 11.2
일염기 인산나트륨 일수화물 0.20
이염기 인산나트륨 무수물 1.36
주사용수 1.4 ml로 적량
e 바이알, 바늘 및 주사기 손실에 대한 40％ 과충전량을 포함한다.
실시예 III
아바타셉트 (동결건조)(250 mg/바이알) 약물 제품은 정맥내 (IV) 투여에 적합한, 멸균의 비발열원성 친액물질이다. 일회용 바이알 각각은 사용시 멸균 주사용수 (USP)로 구성되고 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)으로 추가로 희석되는, 아바타셉트 250 mg를 함유한다.
115 리터 배치 크기에 대한 배치식은 하기 표 11에 제공된다.
배치식
성분 양 (kg)
아바타셉트 약물 물질a 4.6
말토스 일수화물 9.2
염산 pH 7.5로 조절
수산화나트륨 pH 7.5로 조절
주사용수 119.6로 적량b
a 아바타셉트 약물 물질: 단백질 농도 50 mg/ml, 25mM 인산나트륨, 50mM 염화나트륨, pH 7.5, <5％ HMW 종
b 제제화된 벌크 용액 밀도 = 대략 1.04 g/ml
필요량의 아바타셉트 약물 물질을 혼합기가 장착된 세정되고 멸균된 스테인레스 스틸 배합 용기에 첨가하였다. 5℃ 내지 25℃의 용액 온도를 유지하면서 약물 물질 용액을 250 ±50 rpm에서 혼합하였다.
필요량의 말토스 일수화물 분말을 배합 용기에 첨가하였다. 15℃ 내지 25℃에서 최소 10분 동안 용액을 혼합하였다.
필요하다면 미리 제조된 1N 수산화나트륨 용액 또는 1N 염산 용액을 사용하여, 용액 pH를 7.3 내지 7.7로 조절하였다. 배치는 주사용수 (USP)를 사용하여 최종 배치 중량 (최종 적량)에 이르게하고, 최소 8분 동안 용액을 혼합하였다. 제제화된 벌크 용액을 pH에 대해 샘플링하였다.
제제화된 벌크 용액을 1개의 0.45-㎛ 필터로 예비여과하였다. 0.45-㎛ 필터 여과 후 제제화된 벌크 용액은 생균수(bioburden) 및 박테리아 내독소 (BET)에 대해 샘플링하였다.
예비여과된 제제화된 벌크 용액은 충전 전에 직렬식 2개의 0.22-㎛ 필터로 멸균 여과하였다.
멸균 여과된 제제화된 벌크 용액을 충전하고, 전자동 충전/마개씌우기 기기에 의해 20 nm-다이쿄(Daikyo) 회색 부틸 마개로 부분적으로 마개씌웠다. 15-cc 유형 I 플린트 배관 유리 바이알을 세척하고, 멸균/발열원제거하였다.
충전되고 부분적으로 마개씌워진 약물 제품 바이알을 동결건조하였다. 아바타셉트 약물 제품의 동결건조 중에 사용되는 동결 건조 주기의 요약은 하기 표 12에 제공된다.
아바타셉트 동결건조 약물 제품에 대한 동결 건조 주기
프로세스 파라미터 프로세스에서의 제어
하중 온도 5 ± 3℃
동결 (셀프 램프(Shelf Ramp)) 2.5시간에 5℃로부터 -45℃까지
동결 4시간 동안 -45 ± 3℃에서 유지
일차 건조 (셀프 램프) 2시간에 -45℃로부터 -19℃까지
일차 건조 (진공) 100 ± 20 ㎛
일차 건조 84시간 동안 -19 ± 2℃에서 유지
중간 건조 (셀프 램프) 2시간에 -19℃로부터 0℃까지
중간 건조 8시간 동안 0 ± 3℃에서 유지
이차 건조 (셀프 램프) 2시간에 0℃로부터 30℃까지
이차 건조 (진공) 100 ± 20 ㎛
이차 건조 12시간 동안 30℃에서 유지
마개씌우기 30 ± 3℃
마개씌우기 (진공) 500 ± 100 ㎛
비하중 전에 저장 4시간 이상 동안 20 ± 3℃
동결건조 주기의 마지막에, 멸균 여과된 질소를 사용하여 챔버 압력을 500 ㎛으로 올리고, 바이알 마개씌우기를 진공하에 수행하였다. 마개씌운 바이알을 4시간 이상 동안 동결건조기 내부에 두었다. 동결건조되고 마개씌워진 바이알을 캡핑 기기에 의해 HEPA 여과된 공기하에 20-mm 알루미늄의 백색 플립-오프 밀봉부로 밀봉하였다. 밀봉된 바이알을 외부 바이알 세척기에 의해 탈이온수로 세척하였다. 세척된 약물 제품 바이알을 2-8℃에서 저장하였다.
동결건조 아바타셉트 (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성은 하기 표 13에 나열되어 있다.
동결건조 아바타셉트 (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성
성분 양 (mg/바이알)a
아바타셉트 262.5
말토스 일수화물 525
일염기 인산나트륨 일수화물b 18.1
염화나트륨b 15.3
염산 7.5로 조절
수산화나트륨 7.5로 조절
a 바이알, 바늘, 주사기 손실에 대한 5％ 과충전량을 포함한다.
b 이들 성분은 아바타셉트 약물 물질 용액에 존재한다.
실시예 IV
벨라타셉트 (동결건조)(100 mg/바이알) 약물 제품은 정맥내 (IV) 투여에 적합한 멸균의 비발열원성 친액물질이다. 일회용 바이알 각각은 사용시 멸균 주사용수 (USP) 4.2 ml로 구성되어 25 mg/ml의 농도가 얻어지는, 벨라타셉트 100 mg를 함유한다. 이는 사용시 5％ 덱스트로스 주사액 (USP) 또는 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)으로 1 mg/ml만큼 낮은 농도로 추가로 희석될 수 있다.
약물 제품 제조를 위한 배치 크기는 20 리터 내지 120 리터로 다양할 수 있다. 66 리터 (12,000 바이알)의 배치 크기를 대한 대표적 배치식은 하기 표 14에 제공된다.
66 리터 (12,000 바이알)의 배치 크기에 대한 배치식
성분 양 (kg)
벨라타셉트 약물 물질a 1.32
고순도의 낮은 내독소의 수크로스 2.64
일염기 인산나트륨 일수화물 0.18
염화나트륨 0.03
1N 수산화나트륨/ 또는 1N 염산 pH 7.5로 조절
주사용수 배치 중량으로 적량
a 벨라타셉트 약물 물질: 단백질 농도 25 mg/ml, 25mM 인산나트륨, 10mM 염화나트륨, pH 7.5, <5％ HMW 종
벨라타셉트 동결건조 약물 제품을 상기 실시예 III에 기재된 바와 같이 제조하였다.
동결건조 벨라타셉트 약물 제품 100 mg/바이알의 조성은 하기 표 15에 나열되어 있다.
동결건조 벨라타셉트 100 mg/바이알 약물 제품의 조성
성분 양/바이알 (mg)
벨라타셉트 110a
고순도의 낮은 내독소의 수크로스 220
일염기 인산나트륨 일수화물 15.18
염화나트륨 2.55
1N 수산화나트륨 pH 7.5로 조절
1N 염산 pH 7.5로 조절
a 바이알 각각은 재구성된 용액의 바이알, 바늘 및 주사기 정체에 대한 10％ 과충전량을 포함한다.
실시예 V
상이한 온도에서 여러 기간 동안 제제를 안정하게 둠으로써 벨라타셉트 약물 제품의 SC 액체 제제의 안정성 연구를 수행하였다.
수크로스의 효과
벨라타셉트 약물 제품의 용액 안정성에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다. 샘플을 -70℃, 8℃ 및 25℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 평가된 단백질 대 수크로스의 비율은 1:1, 1:1.7 및 1:1.75이었다. 벨라타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 용액에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 결과는 하기 표 16에 나타낸다.
100 mg/ml에서의 벨라타셉트 약물 제품에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과
저장 조건 시간/월 고분자량 종 ％
대조군 a 1:1 1:1.75 1:1.7
초기 0 1.11 1.07 1.05 1.06
-70℃ 3 1.18 1.09 1.07 1.09
8℃ 1 1.22 1.10 1.08 1.07
2 1.34 1.15 1.08 1.09
3 NA 1.24 1.15 1.17
6 1.78 1.39 1.23 1.24
9 2.02 1.53 1.34 1.34
12 2.06 1.49 1.26 1.24
25℃/60％RH 0 1.11 1.07 1.05 1.06
1 2.73 1.83 1.48 1.56
2 3.98 2.41 1.84 1.87
3 4.88 3.02 NA 2.23
6 7.44 4.56 3.21 NA
a 10 mM 인산나트륨 완충제 중 벨라타셉트 약물 제품, 100 mg/ml, pH 7.5
연구의 결과는 수크로스 대 단백질 비율의 증가가 단백질 안정성을 개선시킨다는 것을 나타내었다. 1:1.36 (wt.:wt.)의 단백질 대 수크로스 비율을 SC 용액의 개발을 위해 선택하였으며, 이는 상기 비율이 과도한 고장성을 갖는 약물 제품을 유발하지 않고 최적 안정성을 제공하였기 때문이다.
계면활성제의 효과
벨라타셉트 약물 제품의 용액 안정성에 대한, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 188과 같은 시판되는 제품 중 여러 계면활성제의 효과를 평가하였다. 폴록사머 188은 4, 6 및 8 mg/ml의 수준에서 평가하였고, 폴리소르베이트 80은 1 및 2 mg/ml의 최종 제제 농도에서 평가하였다. 샘플을 -70℃, 8℃ 및 25℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 결과는 하기 표 17에 나타낸다.
벨라타셉트 약물 제품 (100 mg/ml)에 대한 여러 수준 및 유형의 계면활성제의 효과
저장 조건 시간/월 고분자량 종 ％
대조군 a 폴록사머 188
mg/ml		 폴리소르베이트 80
mg/ml
4 6 8 1 2
초기 0 1.11 1.06 1.07 1.07 1.08 1.08
-70℃ 3 1.18 1.09 NA 1.09 1.11 1.15
8℃ 1 1.22 1.10 1.08 1.09 1.10 1.12
2 1.34 1.09 1.10 1.11 1.12 1.12
3 NA 1.19 1.18 1.18 1.21 1.28
6 1.78 1.27 1.23 1.25 1.29 1.30
9 2.02 1.34 1.33 1.34 1.42 1.40
12 2.06 1.28 1.25 1.27 1.38 1.36
25℃/60％RH 0 1.11 1.06 1.07 1.07 1.08 1.08
1 2.73 1.52 1.52 1.52 1.55 1.55
2 3.98 1.91 1.89 1.89 1.99 1.97
3 4.88 2.31 2.29 2.24 2.56 2.50
6 7.44 3.39 4.05 NA 3.89 3.90
a 단백질:수크로스 (1:1.7), 100 mg/ml, pH 7.5
계면활성제의 효과의 결과는 계면활성제가 벨라타셉트 약물 제품 용액의 안정성에 유의한 효과를 갖지 않았음을 제안하였다. 평가된 폴록사머 188의 수준 중에서 8 mg/ml의 농도가 제제 중 실리콘 관련 미립자의 형성을 방지하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.
pH 의 효과
벨라타셉트 SC (125 mg/ml, 단백질:수크로스 1:1.36, 8 mg/ml 플루로닉(Pluronic) F68) 약물 제품의 안정성을 pH의 기능으로서 평가하였다. 용액 pH는 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산에 의해 7 내지 8.2로 조절하였다. 샘플을 2-8℃ 및 25℃/60％RH 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 분석 시험은 고분자량 (HMW) 종의 증가를 모니터링하기 위해 pH 및 SE-HPLC를 포함하였다. 이들 결과는 하기 표 18에 요약되어 있다.
벨라타셉트 SC 약물 제품*에 대한 pH의 효과
조건 시간/월 고분자량 종％
pH 7.0 pH 7.4 pH 7.8 pH 8.2
초기 0 1.31 1.18 1.16 1.28
2-8℃

 1 1.34 1.23 1.25 1.44
2 1.42 1.29 1.31 1.56
3 1.48 1.35 1.36 1.59
25℃/60％RH

 1 2.09 2.62 2.13 2.52
2 7.04 5.68 5.89 6.40
3 9.98 6.13 NA 7.81
* 단백질:수크로스 (1:1.36), 125 mg/ml, + 8 mg/ml 플루로닉 F68
2-8℃의 추천되는 저장 조건하에서는 HMW 종의 형성율의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 용액-상태 안정성 데이타는 최대 안정성의 pH가 7 내지 8인 것으로 나타내었다. 이를 기초로, 7.5의 표적 pH를 갖는 7 내지 8의 pH 범위를 상기 제제를 위해 선택하였다.
몰삼투압농도
상이한 단백질 농도에서 및 제조 방법의 개별 단계로부터의, 여러 완충제 중 벨라타셉트 약물 제품 용액의 몰삼투압농도는 증기압 방법을 사용하여 측정하였다. 이들 결과는 하기 표 19에 요약되어 있다.
여러 완충제 및 농도에서의 벨라타셉트 약물 제품 용액의 몰삼투압농도 결정
벨라타셉트/완충제/부형제 단백질농도
(mg/ml)		 인산나트륨 염화나트륨 몰삼투압농도
(mOsm/kg)
벨라타셉트 API, 그 자체 25 25 mM 10 mM 89
벨라타셉트, 투석여과 단계 25 10 mM - 40
벨라타셉트 투석여과/농축 단계 138 10 mM - 58
수중 벨라타셉트 25 - - 17
수중 벨라타셉트 100 - - 27
벨라타셉트:수크로스 (1:1) 100 10 mM - 424
벨라타셉트:수크로스 (1:1.7) 100 10 mM - 737
벨라타셉트:수크로스 (1:1.75) 100 10 mM - 769
벨라타셉트:수크로스 (1:2) 100 10 mM - 870
벨라타셉트:수크로스 (1:1.36) 125 10 mM - 770
교반 / 진탕의 효과
100 mg/ml 및 125 mg/ml 농도에서의 벨라타셉트 SC 약물 제품의 용액 안정성에 대한 교반의 효과를 결정하였다. 5 cc 배관 바이알 중 대략 1 ml를 함유하는 용액의 분취액을 2-8℃에서 손목 팔 진탕기의 속도 3에서 진탕하였다. 진탕기의 온도는 냉각실에 진탕기를 위치시켜 2-8℃에서 유지하였다. 샘플을 적절한 시간 간격에서 회수하고, pH 및 시각적 외관에 대해 분석하고, 동일한 시간의 샘플을 또한 교반 30일 후 생활성에 대해 평가하였다.
30일 이하 동안 100 mg/ml 및 125 mg/ml 농도에서 교반된 샘플은 2-8℃에서 교반시 HMW 종의 수준, SDS-PAGE 프로파일, 펩티드 맵핑, B7 결합 검정, pH, 외관 또는 단백질 농도의 변화를 나타내지 않았다.
다중 동결/해동의 효과
벨라타셉트 SC 약물 제품 제제의 안정성에 대한 다중 동결 및 해동의 효과는 7.0 내지 8.2 범위의 pH를 갖는 샘플에서 연구하였다. pH 7.0, 7.4, 7.8 및 8.2에서의 벨라타셉트 SC 약물 제품 제제 (125 mg/ml)의 대략 10 ㎕ 분취액을 30 ml 날젠(Nalgene) PETG 용기에 분배하였다. 바이알을 -70℃에서 저장한 후, 주변 온도 (25℃)에서 10분 동안 해동함으로써 다중 동결 및 해동을 수행하였다. 상기 주기를 5일 동안 반복하였다. 바이알의 내용물을 각 동결/해동 주기 후 pH, HMW 종 ％ 및 외관에 대해 분석하였다.
5회의 동결/해동 주기 동안 샘플에서 pH, 외관 또는 고분자량 종 내용물 ％의 변화가 관찰되지 않았다.
추천되는 저장 조건
벨라타셉트 SC 약물 제품 100 mg/바이알 (125 mg/ml)에 대한 추천되는 저장 조건은 2-8℃이며, 추천되는 저장기간은 12개월 이상이다.
주사기-능력 연구
주사기-능력 연구는 2-8℃ 조건에서 벨라타셉트 SC 약물 제품 (125 mg/ml)으로 수행하였다. 1 ml 및 0.5 mL 주사기의 여러 바늘 크기를 평가하였다. 주사기 충전 시간 및 전달력은 하기 표 20에 기록되어 있다.
2-8℃에서의 벨라타셉트 SC 약물 제품 125 mg/ml 주사기 능력 연구
주사기 크기 바늘 크기 충전 시간 (초) 전달력
1 mL 27G 1/2" 25 중등도
바늘이 꽂힌 1 mL (인슐린) 28G 1/2" 52 중등도
바늘이 꽂힌 1 mL (인슐린) 29G 1/2" 50 중등도
바늘이 꽂힌 0.5 mL (인슐린) 30G 42 (1 mL에 대해 94) 높음
주사기-능력 연구를 기초로 한 결과는 표 20에 나타낸다. 바이알로부터 상기 제품의 회수에는 21 게이지 x 1½ 인치 멸균 피하 바늘이 추천되고, 후속적 투여에는 27 게이지 x ½ 인치 바늘이 추천된다.
실시예 VI
상이한 온도에서 여러 기간 동안 제제를 안정하게 둠으로써 아바타셉트 약물 제품의 동결건조 제제의 안정성 연구를 수행하였다.
말토스의 효과
아바타셉트 약물 제품의 안정성에 대한 여러 수준의 말토스의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다. 샘플을 50℃에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 단백질 대 말토스의 비율은 1:1, 1:2 및 1:5으로 평가되었다. 아바타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 고체상태에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 결과는 하기 표 21에 나타낸다.
50℃에서의 아바타셉트 약물 제품의 동결건조 고체-상태 안정성에 대한 말토스의 효과
SE-HPLC에 의한 고분자량 종의 수준 (면적 ％)
시간 (주) 말토스 없음 약물 대 말토스 중량 비율
1:1 1:2 1:5a
초기 0.9 0.7 0.6 2.0
2 5.4 3.7 2.0 NA
4 8.0 5.9 2.7 2.4
6 10.2 6.8 3.3 NA
8 11.7 7.5 3.9 2.9
a 1:5 약물-대-말토스 중량 비율을 갖는 약물 제품의 안정성은 초기 개발 중에 50 mg/바이알 강도로 평가하였다. 본 연구에서 사용된 약물 물질 제품번호는 상기 표의 다른 결과에 대해 사용된 제품번호와는 상이하였다. 이는 이들 샘플 중 고분자량 종의 상이한 초기 수준에 대한 원인이다.
결과는 동결건조 고체-상태 형태의 아바타셉트 약물 제품의 안정성이 말토스의 존재하에 향상된다는 것을 나타낸다. 또한, 아바타셉트의 안정화에 유용한 말토스의 최소량은 1:2 단백질 대 말토스 중량 비율인 것으로 결정되었다.
pH 의 효과
동결건조 아바타셉트 약물 제품 (250 mg/바이알, 단백질:말토스 1:2)의 안정성을 pH의 기능으로서 평가하였다. 용액 pH는 1N 수산화나트륨 또는 1N 염산에 의해 6 내지 8로 조절하였다. 샘플을 2-8℃ 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 분석 시험은 고분자량 (HMW) 종의 증가를 모니터링하기 위해 pH 및 SE-HPLC를 포함하였다. 이들 결과는 하기 표 22에 요약되어 있다.
고분자량 (HMW) 종의 형성률에 대한 pH의 효과
시간 (월) 여러 pH 값에서의 SE-HPLC에 의한 HMW 종 수준 (면적 ％)
6.0a 6.5a 7.0 7.5 8.0
초기 0.6 0.6 2.0 2.0 2.0
1 0.5 0.6 2.0 2.0 2.0
2 0.7 0.7 2.0 2.0 2.0
3 0.7 0.7 2.1 2.1 2.1
6 NA NA 1.8 1.7 1.8
12 0.8 0.8 1.9 1.8 1.9
a pH 6.0 및 6.5 샘플에 대해 사용된 약물 물질 제품번호는 pH 7.0. 7.5 및 8.0 샘플에 대해 사용된 제품번호와는 상이하였다. 이는 이들 샘플 중 고분자량 종의 상이한 초기 수준에 대한 원인이다.
2-8℃의 추천되는 저장 조건하에 HMW 종의 형성률의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 초기 개발 중에 형성된 용액-상태 안정성 데이타는 최대 안정성의 pH가 7 내지 8인 것으로 나타냈다.
실시예 VII
상이한 온도에서 여러 기간 동안 제제를 안정하게 둠으로써 벨라타셉트 (20 mg/ml) 약물 제품의 액체 제제의 안정성 연구를 수행하였다.
수크로스의 효과
20 mg/ml에서의 벨라타셉트 액체 약물 제품의 용액 안정성에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다. 샘플을 8℃, 25℃/60％ 습도 및 30℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 평가된 단백질 대 수크로스의 비율은 벨라타셉트 20 mg/mL으로 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10 단백질:수크로스 비율이었다. 벨라타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 용액에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 이들 연구의 결과는 하기 표 23에 요약하고 나타낸다.
액체 벨라타셉트 약물 제품 20 mg/ml에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과
조건 시간/월 고분자량 종 ％
1:1 1:2 1:5 1:10
초기 0 0.37 0.37 0.39 0.37
8℃ 1 0.39 0.39 0.38 0.36
2 0.40 0.41 0.38 0.37
3 0.43 0.39 0.36 0.36
4 0.44 0.42 0.40 0.37
6 0.58 0.47 0.41 0.39
9 0.54 0.45 0.42 0.39
12 0.52 0.45 0.44 0.51
25℃/60％RH 1 0.61 0.62 0.66 0.50
2 1.25 0.99 0.58 0.53
3 1.40 1.00 0.80 0.57
4 1.72 1.40 1.10 0.74
6 4.29 2.70 2.09 1.18
9 -* 5.59 4.15 2.33
30℃/60％RH 0.5 1.13 0.91 0.75 0.54
1 1.77 2.03 1.25 0.84
2 3.01 2.90 1.78 1.10
3 4.32 11.24 5.55 1.75
* 샘플은 증발로 인해 분석에 이용가능하지 않음
연구의 결과는 수크로스 대 단백질 비율의 증가는 단백질 안정성을 개선시키는 것으로 나타내었다. 1:2 (wt.:wt.)의 단백질 대 수크로스 비율을 액체 용액의 개발에 선택하였으며, 이는 상기 비율이 과도한 고장성을 갖는 약물 제품을 가져오지 않고 최적 안정성을 제공하기 때문이다.
안정성 연구
3개의 액체 벨라타셉트 배치는 제조하고, 2-8℃ 및 25℃/60％ RH 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 단백질 대 수크로스의 중량 비율은 1:2였다. 벨라타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 액체 제제에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 안정성 데이타는 하기 표 24에 요약되어 있다.
액체 벨라타셉트 약물 제품의 안정성
조건 시간(월)
 벨라타셉트 약물 물질
(25 mg/mL)
대조군		 단백질:수크로스 (1:2),
20 mg/mL pH 7.5
HMW 종 ％
배치 1 배치 2 배치 3
초기 0 0.40 0.37 0.43 0.91
5℃ 1 0.44 0.39 0.45 0.90
2 0.47 0.41 0.46 0.90
3 0.47 0.39 0.62 0.91
4 0.54 0.42 NA 0.92
6 0.63 0.47 0.57 0.94
9 0.64 0.45 0.51 1.0
12 0.64 0.45 0.56 NA
25℃/60％ RH 1 0.61 0.62 0.60 1.04
2 1.25 0.99 0.90 1.23
3 1.40 1.00 1.18 1.53
4 1.72 1.40 1.60 1.79
6 4.29 2.70 3.09 2.44
데이타는 12개월에 2-8℃에서 수크로스를 함유하지 않은 벨라타셉트 약물 물질에서 0.2％ 증가와 비교하여 액체 제제 중 고분자량 종의 오직 0.1 ％ 증가만을 나타낸다. 이들 결과는 또한 수크로스의 첨가가 고분자량 종의 형성을 감소시키는 것을 보조하는 것으로 나타낸다.
실시예 VIII
상이한 온도에서 여러 기간 동안 제제를 안정하게 둠으로써 아바타셉트 약물 제품의 SC 제제의 안정성 연구를 수행하였다.
완충제 강도의 효과
SC 아바타셉트 약물 제품 (100 mg/ml)의 안정성은 완충제 강도의 기능으로서 평가하였다. 완충제 시스템은 5 또는 10mM 인산염 완충제이었다. 샘플을 2-8℃ 및 30℃/60％RH 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 분석 시험은 고분자량 (HMW) 종의 증가를 모니터링하기 위해 pH 및 SE-HPLC를 포함하였다. 이들 결과는 하기 표 25에 요약되어 있다.
아바타셉트 약물 제품 (100 mg/ml, pH 7.5)에 대한 완충제 강도의 효과
저장 조건
 시간/월
 고분자량 종 ％
10mM 인산염 완충제 중 5mM 인산염 완충제 중
초기 0 1.30 1.47
2-8℃ 1 1.49 1.74
2 1.60 1.98
3 1.73 2.23
30℃/60％RH 0 1.30 1.47
0.5 8.73 14.39
1 14.63 23.24
2 25.26 32.25
10 mM 인산염 완충제 중 아바타셉트 SC 약물 제품의 안정성은 100 mg/mL 아바타셉트 농도에서 pH 7.5의 5mM 인산염 완충제와 비교하여 우수하였다. 또한, 10mM 인산염 완충제의 높은 완충 능력은 5mM 완충제와 비교하여 제제의 우수한 pH 제어를 제공하였다. 데이타를 기초로, 10mM 인산염 완충제를 제제 개발을 위해 선택하였다.
당의 효과
아바타셉트 SC 약물 제품의 용액 안정성에 대한 여러 당의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다. 샘플을 2-8℃ 및 30℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 평가된 당은 수크로스, 트레할로스 및 만니톨이었다. 아바타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 용액에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 결과는 하기 표 26에 나타낸다.
100 mg/ml (pH 7.5)에서의 아바타셉트 SC 약물 제품에 대한 여러 당의 효과
저장 조건 시간/월 고분자량 종 ％
대조군 a 1:1
수크로스		 1:1
트레할로스		 1:1
만니톨b
초기 0 1.30 1.18 1.20 1.20
2-8℃ 1 1.49 1.37 1.38 1.25
2 1.60 1.40 1.41 1.26
3 1.73 1.45 1.48 1.60
6 2.10 1.54 N/A N/A
11.5 2.57 N/A N/A N/A
30℃/60％RH 0 1.30 1.18 1.20 1.30
0.5 8.73 4.31 4.34 3.59
1 14.63 7.20 8.09 5.72
2 25.26 11.97 14.21 10.14
a 10 mM 인산나트륨 완충제 100 mg/ml (pH 7.5)에서의 아바타셉트 약물 제품
b pH 7.8에서의 만니톨 제제
연구의 결과는 수크로스, 트레할로스 및 만니톨 세가지 당 모두가 당을 함유하지 않은 대조군과 비교하여 아바타셉트에 대해 우수한 안정화를 제공한 것으로 나타내었다. 30℃의 가속된 조건하의 연구의 결과는 만니톨이 수크로스 및 트레할로스와 비교하여 아바타셉트에 대해 우수한 안정화를 제공한 것으로 나타내었다. 수크로스는 트레할로스보다 약간 우수하였다. 동결하에, 세가지 당 모두에 의한 안정화는 유의하게 상이하진 않았다. 만니톨 제제가 수크로스 제제의 2배의 삼투성을 갖기 때문에 수크로스를 선택 당으로서 선택하였다. 안정화를 위해 수크로스를 선택하면, 동일한 삼투성을 성취하는데 동일한 비율의 만니톨보다 2배만큼의 수크로스를 첨가해야 하나, 동일한 비율의 만니톨보다 응집에 대한 매우 큰 안정화를 성취하게 한다. 1:1.36 (wt.:wt.)의 단백질:수크로스 비율을 SC 약물 제품의 개발에 선택하였으며, 이는 상기 비율이 과도한 고장성을 갖는 약물 제품을 가져오지 않고 최적 안정성을 제공하기 때문이다.
수크로스의 효과
아바타셉트 SC 약물 제품의 용액 안정성에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과를 평가하는 제제 개발 연구를 수행하였다. 샘플을 2-8℃ 및 30℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 평가된 단백질 대 수크로스의 비율은 1:1 및 1:2이었다. 아바타셉트의 고분자량 (HMW) 종의 형성은 용액에서의 단백질 안정성을 결정하는데 사용하였다. 결과는 하기 표 27에 나타낸다.
100 mg/ml, pH 7.5에서의 아바타셉트 SC 약물 제품에 대한 여러 수준의 수크로스의 효과
저장 조건
 시간/월
 고분자량 종 ％
대조군 a 1:1 1:2
초기 0 1.30 1.18 1.17
2-8℃ 1 1.49 1.37 1.33
2 1.60 1.40 1.21
3 1.73 1.45 1.23
6 2.10 1.54 1.29
11.5 2.57 N/A N/A
30℃/60％RH 0 1.30 1.18 1.17
0.5 8.73 4.31 2.41
1 14.63 7.20 3.69
2 25.26 11.97 6.59
a 10 mM 인산나트륨 완충제, 100 mg/ml, pH 7.5에서의 아바타셉트 약물 제품
연구의 결과는 수크로스 대 단백질 비율의 증가가 단백질 안정성을 개선시킨다는 것을 나타내었다. 1:1.36 (wt.:wt.)의 단백질:수크로스 비율을 RTU 용액의 개발을 위해 선택하였으며, 이는 상기 비율이 과도한 고장성을 갖는 약물 제품을 유발하지 않고 최적 안정성을 제공하였기 때문이다.
계면활성제의 효과
아바타셉트 SC 약물 제품의 용액 안정성에 대한 시판되는 제품의 여러 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80 (트윈® 80) 및 폴록사머 188(플루로닉® F68)의 효과를 평가하였다. 폴록사머 188은 4 및 8 mg/ml의 수준에서 평가하였고, 폴리소르베이트 80은 1 및 2 mg/ml의 최종 제제 농도에서 평가하였다. 샘플을 2-8℃ 및 25℃/60％ 습도 조건에서 안정하게 두고, 여러 시점에서 모니터링하였다. 결과는 하기 표 28에 나타낸다.
125 mg/ml에서의 아바타셉트 SC 약물 제품에 대한 여러 수준 및 유형의 계면활성제의 효과
고분자량 종 ％
저장 조건 시간/월 대조군 a 폴록사머 188
mg/ml
 폴리소르베이트 80
mg/ml
4 8 1 2
초기 0 1.05 1.05 1.06 1.07 1.10
2-8℃



 1 0.98 0.99 0.99 1.01 1.02
2 1.02 1.03 1.04 1.05 1.07
3 1.06 1.07 1.08 1.08 1.09
6 1.23 1.27 1.28 1.25 1.32
9 1.30 1.35 1.36 1.34 1.36
25℃/60％RH



 0 1.05 1.05 1.06 1.03 1.04
1 1.92 1.94 1.92 1.97 2.02
2 2.69 2.71 2.68 2.75 2.80
3 3.74 3.92 3.67 3.84 3.84
5 5.12 5.16 5.03 5.05 5.03
a 단백질:수크로스 (1:1), 125 mg/ml, pH 7.8
계면활성제의 효과의 결과는 계면활성제가 아바타셉트 SC 약물 제품의 안정성에 유의한 부정적 효과를 갖지 않았음을 제안하였다. 평가된 폴록사머 188의 수준 중에서 8 mg/ml의 농도가 제제 중 실리콘 관련 미립자의 형성을 방지하는데 적합한 것을 밝혀졌다.
몰삼투압농도
상이한 단백질 농도에서 및 제조 방법의 개별 단계로부터의, 여러 완충제 중 아바타셉트의 몰삼투압농도는 증기압 방법을 사용하여 측정하였다. 이들 결과는 하기 표 29에 요약되어 있다.
여러 완충제 및 농도에서의 아바타셉트 SC 용액의 몰삼투압농도 결정
아바타셉트/완충제/부형제 단백질농도
(mg/ml)		 인산나트륨 염화나트륨 몰삼투압농도
(mOsm/kg)
아바타셉트 약물 물질 50 25 mM 50 mM 151
아바타셉트, 투석여과 단계 50 10 mM - 32
아바타셉트 투석여과/농축 단계 155 10 mM - 49
10 mM pH 7.8 인산염 완충제 - 10 - 35
수중 아바타셉트 100 10 mM - 51
아바타셉트:수크로스 (1:1) 100 10 mM - 567
아바타셉트:수크로스 (1:1.75) 100 10 mM - 766
아바타셉트:수크로스 (1:2) 100 10 mM - 913
아바타셉트:수크로스 (1:1.36) 125 10 mM - 782
교반 / 진탕의 효과
100 mg/ml 및 125 mg/ml 농도에서의 아바타셉트 SC 약물 제품의 용액 안정성에 대한 교반의 효과를 결정하였다. 5 cc 배관 바이알 중 대략 1 ml를 함유하는 용액의 분취액을 2-8℃에서 손목 팔 진탕기의 속도 3에서 진탕하였다. 진탕기의 온도는 냉각실에 진탕기를 위치시켜 2-8℃에서 유지하였다. 샘플을 적절한 시간 간격에서 회수하고, pH 및 시각적 외관에 대해 분석하고, 동일한 시간의 샘플을 또한 교반 30일 후 생활성에 대해 평가하였다.
30일 이하 동안 100 mg/ml 및 125 mg/ml 농도에서 교반된 샘플은 2-8℃에서 교반시 HMW 종의 수준, SDS-PAGE 프로파일, 펩티드 맵핑, B7 결합 검정, pH, 외관 또는 단백질 농도의 변화를 나타내지 않았다.
추천되는 저장 조건
아바타셉트 SC 약물 제품 125 mg/주사기 (125 mg/ml)에 대한 추천되는 저장 조건은 2-8℃이며, 추천되는 저장기간은 12개월 이상이다.
실시예 IX
탈아미드화 및 응집은 CTLA4Ig 분자의 두가지 관찰된 분해 경로이다. 본 프로토콜은 6.3 내지 7.2의 pH 범위, 구체적으로 pH 6.3, 6.6, 6.9, 7.2에서 SC 약물 제품 제제를 평가하도록 설계된 실험실 규모 pH 안정성 연구를 약술한다. 본 연구의 목적은 탈아미드화 및 고분자량 종의 형성과 관련하여 CTLA4Ig SC 제제에 대한 최소 18개월의 저장기간을 획득할, 최적의 낮은 pH 제제를 확인하는 것이다. 본 연구에서 사용되는 SC 약물 제품 제제는 하기 표 30에 기재되어 있다.
pH 6.9에서의 SC 약물 제품 제제 조성
성분 양 mg/1.0 ml
아바타셉트 125
수크로스 170
폴록사머 188 8
일염기 인산나트륨 일수화물 0.638
이염기 인산나트륨 무수물 0.475
주사용수 1.0 mL로 적량
아바타셉트 SC 약물 제품은 pH 6.3, 6.6, 6.9, 7.2에서 제제화하였다. 약물 제품은 상기 기재된 바와 같이 수크로스 및 폴록사머 188로 제제화하며, 최종 배치 농도는 10 mM 인산염 완충제 (pH 6.9)로 조절하였다. pH는 1N HCl을 사용하여 6.3 및 6.6로 각각 하향 적정하였다. 대안으로, pH는 1N NaOH에 의해 6.9, 7.2 및 7.65 이하로 적정하였다. 약물 제품을 1-mL 긴 피지올리스(Physiolis)™ 주사기 (1.0 ml 충전 부피)에 충전하고, 2-8℃, 15℃, 60％ 습도에서의 25℃, 및 35℃에서 안정한 곳에 두었다. 샘플은 갈색 광보호 백으로 덮거나 또는 상기 백에 삽입함으로써 언제나 빛으로부터 보호되어야 한다.
2-8℃에서 저장된 약물 제품은 0, 2, 4, 6, 12 18, 24개월에 및 임의로 9개월에 샘플링하였다. 15℃에서 저장된 약물 제품은 1, 2, 4, 6개월에 및 임의로 9개월에 샘플링하였다. 25℃ 및 60％ 습도에서 저장된 약물 제품은 1, 2, 4 및 6개월에 샘플링하였다. 35℃에서 저장된 약물 제품은 1, 2 및 4개월에 샘플링하였다. 2-8℃에서 저장된 샘플은 외관 (초기 및 최종 샘플만), pH (초기, 4개월 및 최종 샘플만), A280 (초기, 4개월 및 최종 샘플만), 크기 배제 HPLC, SDS-PAGE, 트립신 소화 펩티드 맵핑 (TPM), 비아코어 B7 결합 (초기, 4개월 및 최종 샘플만 또는 필요에 따라) 및 등전점전기 이동(IEF) (초기 및 최종 샘플만)에 대해 시험하였다. 15℃ 및 25℃ 및 60％ 습도에서 저장된 샘플은 A280 (초기, 4개월 및 최종 샘플만), 크기 배제 HPLC, SDS-PAGE 및 트립신 소화 펩티드 맵핑 (TPM)에 대해 시험하였다. 35℃에서 저장된 샘플은 크기 배제 HPLC, SDA-PAGE 및 트립신 소화 펩티드 맵핑(TPM)에 대해 시험하였다.
비-통상적인 시험 방법은 초기 시점, 4개월, 12개월 및 연구의 마지막에 안정성 샘플을 추가로 특징화하는데 사용될 것이다. 이들 방법 중 몇몇은 또한 경향 또는 예상치 못한 결과가 관찰되는 경우 특정 샘플을 시험하는데 사용할 수 있다. 비-통상적인 방법으로는 다각 광 산란을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS), 동력학 결합 (SPR), 질량 분광법, CD, AUC, 시차 주사 열량계 (DSC), FFF, FTIR, 크기 배제 HPLC (변성됨) 및 SDS-PAGE (은 염색)을 들 수 있다.
실시예 X
PK 하위연구를 2B상의 다기관, 무작위, 이중-맹검, 플라시보-대조 연구에 도입하여, 메톡트렉세이트를 투여받는 동안 활성 류머티스성 관절염이 있는 대상체에게 정맥내 투여된 두가지 상이한 투여량의 아바타셉트의 안전성 및 임상 효능을 평가하였다. 본 평행 설계 연구에서, 대상체는 MTX와 함께 두가지 상이한 투여량의 아바타셉트 (2 및 10 mg/kg) 또는 플라시보를 투여받았다. 아바타셉트는 동물 또는 포유동물 세포 배양에 의한 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 생성물의 제조 방법을 교시하는, 공동 계류중인 2005년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/752,267호에 기재된 바와 같이 제조하고, 아바타셉트 200 mg을 함유하는 개별 바이알에 본원에 기재된 바와 같은 동결건조 형태로 공급하였다. 아바타셉트를 1, 15 및 30일, 및 이후 30일마다 1년 동안 대상체에게 IV 투여하였다. 다중 투여량 PK는 부위-특이적 PK 하위연구에 등록된 대상체로부터 60ㅇ리부터 90일까지의 투여 간격 동안 얻어진 혈청 농도 대 시간 데이타로부터 유도하였다. PK 하위연구에서 대상체에 대해, 혈액 샘플을 60일에 투여 전에 수집하고, 30분 (아바타셉트 주입의 종료에 상응함)에 60일에 개시하여, 주입 개시 후 4시간에, 및 이후 매주 90일까지 PK 프로파일에 대해 수집하였다. 총 90명의 대상체가 PK 하위연구에 참여하기 위해 등록하였다. 그러나, 60일부터 90일까지의 투여 간격 사이의 완전한 PK 프로파일은 29명의 대상체 (2 mg/kg에서 투여된 15명의 대상체; 10 mg/kg에서 투여된 14명의 대상체)로부터 얻어졌다.
PK 파라미터의 요약은 하기 표 31에 나타낸다. 연구로부터의 결과는 Cmax 및 AUC(TAU) (TAU = 30일) 둘 모두가 투여량에 비례적으로 증가되었음을 나타내었다. 1:5의 비율로 증가되는 명목상 투여량에 대해, AUC(TAU)에 대한 기하 평균은 1:5.0의 비율로 증가된 반면, Cmax의 기하 평균은 1:5.2의 비율로 증가되었다. 또한, T-HALF, CLT 및 Vss 값은 투여량에 독립적인 것으로 보였다. 이들 RA 대상체에서, 평균 T-HALF, CLT 및 Vss 값은 각각 대략 13일, 약 0.2 mL/h/kg 및 약 0.07 L/kg이었다. 작은 Vss는 아바타셉트가 주로 세포외 체액 부피로 한정된다는 것을 나타낸다. 첫번째 주입후 2주 및 4주에 투여한 후, 이후 1개월에 1회 투여하는 투여 개요를 기초로, 아바타셉트에 대한 정상-상태는 세번째 월투여량에 의해 도달되었다. 또한, 투여 개요의 결과로서, 혈청 농도는 처치의 최초 2개월 동안 정상-상태 최저치 농도보다 높았다. 60일, 90일 및 180일에서의 최저치 (Cmin) 값의 비교는 아바타셉트가 매월 투여 후 추적되지 않는 것으로 보인다는 것을 나타내었다. 2 및 10 mg/kg 아바타셉트의 매월 IV 투여량을 투여받은 모든 대상체에 대한 평균 Cmin 정상-상태 값은 각각 4.4 내지 6.7 mcg/mL, 및 22.0 내지 28.7 mcg/mL의 범위이었다.
류머티스성 관절염 대상체에서의 다발성 PK 연구의 요약
연구
프로토콜
(국가)		 제품 ID
(배치/제품번호#)		 연구
목적		 연구
설계		 대상체수
(남성/여성)


 나이
(평균, 범위)

 처치 용량
(mg/kg)

 아바타셉트의 약동학 파라미터
기하 평균 (CV％)
 평균 (SD)
Cmax (㎍/mL) AUC(TAU)
(㎍.h/mL)		 T-HALF
(일)		 CLT
(mL/h/kg)		 Vss
(L/kg)
IM101100
(USA)
PK
하위연구
2상		 C00157
C00196
C98283		 아바타셉트의 정맥내 투여 용량의 효능, 안전성, 다중 투여량 PK 및 면역원성의 분석 무작위, 이중-맹검, 플라시보-대조, 다중 투여량 연구
30분 IV 주입
 29
(18/11)		 54
(34-83)
 2.0
(N=15)		 54.9
(29)		 9573.5
(30)		 13.5
(5.9)		 0.23
(0.13)		 0.07
(0.04)
10.0
(N=14)		 284.2
(23)		 47624.2
(31)		 13.1
(5.3)		 0.22
(0.09)		 0.07
(0.03)
아바타셉트의 약물동력학은 단일 10 mg/kg 정맥내 주입 후 건강한 성인 대상체에서, 및 다중 10 mg/kg 정맥내 주입 후 RA 환자에서 연구하였다 (표 32 참조).
10 mg/kg 정맥내 주입(들) 후 건강한 대상체 및 RA 환자에서의 약물동력학 파라미터 (평균, 범위)
PK 파라미터 건강한 대상체
(10 mg/kg 단일 투여 후)
n=13		 RA 환자
(10 mg/kg 다중 투여 후a)
n=14
피크 농도 (Cmax)[mcg/mL] 292 (175-427) 295 (171-398)
최종 반감기 (t1 /2) [일] 16.7 (12-23) 13.1 (8-25)
전신 청소율 (CL) [mL/h/kg] 0.23 (0.16-0.30) 0.22 (0.13-0.47)
분포 부피 (Vss) [L/kg] 0.09 (0.06-0.13) 0.07 (0.02-0.13)
a 다중 정맥내 주입은 1일, 15일, 30일 및 이후 매월 투여되었다.
RA 환자 및 건강한 대상체에서의 아바타셉트의 약물동력학은 비교가능한 것으로 보였다. 다중 정맥내 주입 후 RA 환자에서, 아바타셉트의 약물동력학은 2 mg/kg 내지 10 mg/kg의 투여량 범위에 걸쳐 Cmax 및 AUC의 비례적 증가를 나타냈다. 10 mg/kg에서, 혈청 농도는 24 (1-66) mcg/mL의 평균 (범위) 최저치 농도로 60일까지 정상-상태에 도달한 것으로 보였다. RA 환자에서 1개월 간격으로 10 mg/kg으로 연속적 반복 처치시 아바타셉트의 전신 축적은 나타나지 않았다.
RA 환자에서의 집단 약물동력학 분석은 체중의 증가와 함께 아바타셉트의 청소율이 높아지는 경향이 있었음을 밝혀내었다. 나이 및 성별 (체중에 대해 보정시)은 청소율에 영향을 미치지 않았다. 메톡트렉세이트 (MTX), 비스테로이드성 소염제 (NSAID), 코르티코스테로이드 및 TNF 차단제의 동반 투여는 아바타셉트 청소율에 영향을 미치지 않았다.
아바타셉트에 대한 혈청 분석
혈청 샘플을 효소-연결된 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 총 25회의 분석 실행으로 아바타셉트에 대해 분석하였다. 모든 분석 결과는 ELISA 방법이 연구 샘플 중 아바타셉트의 정량에 정밀하고 정확하다는 것을 나타내는, 샘플 분석 전에 확립된 허용 기준을 충족시켰다. 혈청 중 아바타셉트에 대한 표준 곡선 파라미터 및 평균 QC 데이타의 요약은 하기 표 33에 나타낸다. 아바타셉트에 대한 분석 QC의 집단간 가변성 및 집단내 가변성은 각각 4.5％ 및 3.5％ CV이었다. 분석 QC 샘플의 평균 관찰 농도는 명목상 값으로부터 ± 8.9％ 미만의 편차를 가졌다 (표 33).
인간 혈청 중 아바타셉트의 분석에 대한 품질 제어 데이타의 요약
명목상 농도 낮음
(3.000 ng/mL)		 중간
(12.500 ng/mL)		 높음
(24.000 ng/mL)
평균 관찰 농도 2.866 13.608 24.526
편차％ -4.5 8.9 2.2
실행간 정확도 (CV％) 4.5 2.8 3.0
실행내 정확도 (CV％) 2.4 3.5 2.9
총 변차 (CV％) 5.1 4.5 4.2
n 75 75 75
실행 수 25 25 25
실시예 XI
본 연구의 목적은 건강한 대상체에서 50 내지 150 mg 범위의 단일 SC 투여 후 벨라타셉트의 PK를 분석하고; 피하 투여된 벨라타셉트의 PK에 대한 주사된 용액의 농도 및 주사 부피의 효과를 분석하고; 벨라타셉트의 단일 SC 투여량의 안전성 및 내성 (주사 부위 평가 포함)을 분석하고; 피하 투여된 벨라타셉트의 면역원성을 분석하는 것이다.
면역원성
이는 건강한 대상체에서의 이중-맹검, 무작위, 플라시보-대조, 평행 군, 단일-용량 연구이다. 총 42명의 대상체를 6개의 처치군 중 하나에 무작위로 배치하였다. 7명의 대상체의 각 군내에서, 벨라타셉트 또는 플라시보의 단일 SC 주사를 투여받는 대상체를 1일에 5:2 비율로 무작위로 배치하였다. 대상체는 ≤ 100 kg의 체중일 것을 요구받았다. 6개의 처치군은 하기 표 34에 기재되어 있다.
처치군
처치군 벨라타셉트 또는 플라시보의 투여량 주사 부피 주사된 용액의 농도
1 50 mg 0.4 mL 125 mg/mL
2 75 mg 0.6 mL 125 mg/mL
3 100 mg 0.8 mL 125 mg/mL
4 150 mg 1.2 mL 125 mg/mL
5 50 mg 1.0 mL 50 mg/mL
6 75 mg 1.0 mL 75 mg/mL
1일 투여의 28일 내에 적격인가를 결정하기 위해 대상체를 스크리닝 평가하였다. 대상체는 MLR을 비롯한 기준선 평가를 위해 투여 하루 전 (-1일)에 임상 실험실에 입실하였다. 대상체는 5일에 처치 후 평가가 완료될 때까지 임상 실험실에 남아있었고, 그 후 연구로부터 귀가시킬 때까지 각 연구 방문을 위해 임상 실험실로 되돌아갔다.
1일에 대상체는 무작위로 처치받았으며, 단일 SC 투여량의 벨라타셉트 또는 플라시보를 투여받고, 상세한 PK 및 면역원성 샘플링을 수행받았다. 모든 대상체는 그의 앞 넓적다리에 SC 주사를 받았다. 연구 약물 투여 후, 연구자는 국소 자극 및 염증의 징후에 대해 주사 부위를 분석하였다.
연구에 걸쳐 선택 시간에 물리적 시험, 생체 징후 측정, 및 임상 실험실 평가를 수행하였다. PK 분석 및 면역원성의 평가를 위해 연구 약물 투여 후 56일 이하 동안 혈액 샘플을 수집하였다. 대상체를 연구에 걸쳐 AE에 대해 모니터링하였다. 연구 동안 각 대상체로부터 대략 265 mL의 혈액을 채혈하였다.
모든 투여 군에 대해 투여 및 추적 조사를 동시에 수행하였다. 단일 투여량 초과를 투여받은 대상체는 없었다. 완전히 연구되지 않은 대상체 (AE에 대해 중단된 대상체는 제외)는 대체하였다.
이는 단일 투여량 연구이다. 대상체 각각은 연구 약물이 투여되는 일로부터 최대 28일 전인 스크리닝 기간을 거쳤다. 대상체 각각은 연구 약물이 투여되는 일로부터 56일(±2일) 후에 마지막 방문때까지 연구에 남아있었다. 시험받는 마지막 대상체의 마지막 방문을 연구의 종료일로 고려하였다.
동물 또는 포유동물 세포 배양에 의한 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 생성물의 제조 방법을 교시하는, 공동 계류중인 2006년 10월 5일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/849543호에 기재된 바와 같이 및 본원에 기재된 바와 같이 제조된 벨라타셉트 100 mg/바이알 (125 mg/mL)은 SC 투여에 적합한 크기의 통상적인 주사기 및 바늘을 사용하여 회수 및 투여를 위해 유리 바이알에 제공된 바로 사용가능한 액체 제품이다. 회수 손실을 고려하여 충분한 과량의 벨라타셉트를 바이알 각각에 도입하여, 100 mg을 함유하는 용액 0.8 mL이 SC 투여를 위해 회수될 수 있도록 하였다.
벨라타셉트 주사 100 mg/바이알 (125 mg/mL)은 IV 주입용으로 의도되지 않았다.
병력, 물리적 시험, 12-리드 심전도 및 임상 실험실 평가에 의해 결정된 건강한 대상체는 연구에 참여하기에 적격이었다. 본 연구는 남성 및 여성을 포함하였다. 대상체는 연령 18세 이상이고 무작위로 체중 ≤100 kg이어야 한다. 여성 대상체는 수유하고 있어도 안되고 임신한 상태여도 안되며, 투여 전에 1개월 이상 동안, 연구 동안 및 연구 종료 후 4주까지 허용되는 피임법을 사용해야 한다. 가임기 여성은 연구 투약의 투여 전에 24 시간 내에 음성 혈청 임신 시험을 받아야 한다. 대상체는 임신에 대한 잠재적 위험에 대해 주의받아야 한다. 남성 대상체는 그의 파트너에 대한 임신 위험을 최소화하기 위해 연구 동안 및 연구 종료 후 4주 이하 동안 적절한 피임법을 사용해야 한다. 포함 및 제외 기준의 상세한 목록에 대해 섹션 5를 참조한다.
등록 전에 4주 내에 받은 투약은 CRF에 기록해야 한다. 특정 임상적 사건의 치료를 위해 연구자에 의해 처방되지 않는 한, 연구 중에는 경구 피임약을 제외하고는 동반 투약 (처방의약품, 일반의약품 또는 본초약)은 투여되지 않았다. 임의의 동반 요법은 CRF에 기록해야 한다.
SC 주사 후 벨라타셉트의 PK는 혈청 농도 대 시간 데이타로부터 유도하였다. 분석되는 단일-투여 PK 파라미터로는
Cmax 최대 관찰된 혈청 농도
Tmax 최대 관찰된 혈청 농도의 시간
AUC(0-T) 시간 0으로부터 최종 정량화 농도의 시간까지의 면적하 혈청 농도-시간 곡선
AUC(INF) 시간 0으로부터 무한 시간까지 외삽된 면적하 혈청 농도-시간 곡선
반감기 혈청 반감기
CLT/F 겉보기 총 체내 청소율
VSS/F 정상 상태에서의 겉보기 분포 부피
개별 대상체 PK 파라미터 값은 유효한 PK 분석 프로그램인 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재의 이나페이스 코포레이션 (Innaphase Corp)의 이툴박스 키네티카(eToolbox Kinetica) 프로그램에 의해 비-구획 방법에 의해 유도하였다. 투여량 표준화된 AUC를 또한 보고하였다.
혈청 샘플을 시간에 따라 수집하고, 두가지 ELISA 검정법을 사용하여 벨라타셉트에 대한 항체 역가 존재에 대해 분석하였다. 한 검정법은 전체 분자에 대한 반응을 분석하고, 다른 한 검정법은 LEA29Y-T 부분만을 분석하였다.
연구 투약받은 모든 대상체는 안전성 및 PD 데이타 세트에 포함시켰다. 임의의 패널 중 플라시보를 투여받은 대상체는 주사 부위 평가를 제외한 PD 평가 및 안전성 평가에 대한 단일 플라시보 치료군으로 모았다. 벨라타셉트를 투여받은 대상체로부터의 모든 이용가능한 데이타는 PK 데이타 세트에 포함시키고, 요약 통계 및 통계적 분석에 포함시켰다.
기준선은 -1일로 고려하였다. 성별 및 인종의 빈도 분포는 처치 (주사 부피 및 투여량)에 의해 도표작성하였다. 연령, 체중 및 키에 대한 요약 통계는 처치에 의해 도표작성하였다.
모든 기록된 AE를 나열하고, 바람직한 기간, 시스템 기관 부류 및 처치에 의해 도표작성하였다. 생체 징후 및 임상 실험실 시험 결과를 나열하고 처치에 의해 요약하였다. 임의의 유의한 물리적 시험 발견 및 임상 실험실 결과를 나열하였다. 주사 부위 평가 (홍반, 열, 종창, 통증 및 소양증)를 처치 및 중증도에 의해 도표작성하였다. 플라시보 대상체를 투여군으로 모으고, 주사 부위 평가를 위해서 독립적으로 분석하였다.
요약 통계는 처치에 의해 PK 파라미터에 대해 도표작성하였다. 기하 평균 및 변동 계수는 Cmax, AUC(0-T) 및 AUC(INF)에 대해 표시하였다. 중간값, 최소값 및 최대값을 Tmax에 대해 표시하였다. 평균 및 표준 편차를 다른 PK 파라미터를 위해 제공하였다. SC 투여 후 투여량에 대한 의존성을 분석하기 위해, Cmax 및 AUC(INF) 대 투여량의 분산 플롯을 제공하였다. 벨라타셉트의 PK에 대한 효과를 분석하기 위해, 주사 부피를 가로축으로 하는 AUC(INF) 및 Cmax의 분산 플롯을 제작하였다. 또한, Cmax 및 AUC(INF) 대 고정된 부피에 대한 투여량, 및 Cmax 및 AUC(INF) 대 투여량 내의 부피의 분산 플롯을 이용가능한 경우 제공하였다.
항-벨라타셉트 및 항-LEA29Y-T 항체 값, 및 기준선 (1일-0시)으로부터의 그의 변화에 대한 처치 및 연구일에 의해 요약 통계를 도표작성하였다. 면역원성과 노출 간의 가능한 관련성을 연구하기 위해, 항-벨라타셉트 및 항-LEA29Y-T 항체 대 벨라타셉트 농도의 변화 플롯을 제공하였다.
PK 및 면역원성 혈액 샘플링 스케쥴은 하기 표 35에 요약되어 있다.
약물동력학 및 면역원성 혈액 샘플링 스케쥴
연구일 시간 (투여에 대한)
시:분		 PK 면역원성
1 00.00 (예비용량)
01:00
02:00
06:00
12:00		 X
X
X
X
X		 X a
2 24:00
36:00		 X
X
3 48:00
60:00		 X
X
4 72:00
84:00		 X
X
5 96:00 X
6 120:00 X
7 144:00 X
8 168:00 X
14 X X
21 X
28 X X
35 X X
42 X X
56 X X
a 약물을 투여하기 전에 1일 면역원성 (항-벨라타셉트 항체) 샘플을 회수해야 한다. 28일, 35일, 42일 및 56일의 샘플은 ±2일 내에 회수할 수 있다.
상기 표 35에는 PK 평가를 위해 수행되는 샘플링 스케쥴이 나열되어 있다. 직접 혈관천공을 통해 또는 염수 락(lock)으로부터 예비표지된 적색 및 회색 탑 (SST) 바큐테이너(Vacutainer)®튜브로 혈액 샘플 (샘플 당 약 3 mL)을 수집하였다. 혈액 수집을 위해 염수 락 시스템을 사용하는 경우, 내재 카테터를 통해 대략 0.5 mL의 혈액을 회수하고, 각 PK 샘플을 얻기 전에 버려야 한다. PK 검체를 얻으면, 혈액은 15 내지 30분 동안 실온에서 바큐테이너® 튜브에서 혈전을 형성할 것이다. 혈전생성 후, 샘플을 냉동 원심분리기 (4℃)에서 1500 x g에서 15분 동안 원심분리해야 한다. 원심분리가 완료되면, 각 PK 샘플 시점으로부터 0.5 mL 이상의 혈청을 파이펫에 의해 제거하고, 예비표지된 나사 마개, 폴리프로필렌, PK 저장 및 수송 튜브로 이동시켜야 한다. 각 샘플 시점에서 혈청을 분취하는데 깨끗한 파이펫을 사용해야 한다. PK 혈청 샘플을 함유하는 폴리프로필렌 튜브는 최대 1개월 동안 -20℃ 이하에서 및 그후 -70℃에서 동결 저장할 수 있다.
샘플 수집으로부터 혈청의 동결까지 허용된 시간은 12시간이다. 감수성 유효한 효소 면역검정법 (EIA)은 혈청 중 벨라타셉트의 농도를 측정하는데 사용하였다.
표 35에는 면역원성 평가를 위해 수행되는 샘플링 스케쥴이 나열되어 있다. 혈청 샘플을 방문 1일, 14일, 28일, 35일, 42일 및 56일에 얻었다. 1일 면역원성 (항-벨라타셉트) 샘플은 연구 약물의 투여 전에 취해야 한다. 항-벨라타셉트 및 항-LEA29Y-T 항체의 존재에 대해 샘플을 분석하였다. 각 검체에 대해, 직접 혈관천공을 통해 또는 염수 락 (내재 카테터)로부터 예비표지된 적색 및 회색 탑 (SST) 바큐테이너®튜브로 혈액 샘플 (샘플 당 약 3 mL)을 수집하였다. 혈액 수집을 위해 염수 락 시스템을 사용하는 경우, 내재 카테터를 통해 대략 0.5 mL의 혈액을 회수하고, 각 면역원성 샘플을 얻기 전에 버려야 한다. 검체를 얻으면, 혈액은 15 내지 30분 동안 실온에서 바큐테이너? 튜브에서 혈전을 형성할 것이다. 혈전생성 후, 샘플을 냉동 원심분리기 (4℃)에서 1500 x g에서 15분 동안 원심분리해야 한다. 원심분리가 완료되면, 1 mL 이상의 혈청을 파이펫에 의해 제거하고, 예비표지된 나사 마개, 폴리프로필렌, 혈청 샘플 저장 및 수송 튜브로 이동시켜야 한다. 혈청 샘플을 함유하는 폴리프로필렌 튜브는 -20℃ 이하에서 동결 저장해야 한다. 혈청 중 벨라타셉트의 항체 역가를 측정하는데 두가지 감수성 유효한 효소결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하였다. 한 검정법은 전체 분자에 대한 항체 역가를 분석하고, 다른 한 검정법은 LEA29Y-T 부분만에 대해 분석하였다.
실시예 XII
탈아미드화, 단편형성 및 응집은 LEA29YIg 분자의 관찰된 분해 경로이다. 본 프로토콜은 6.3 내지 7.5 범위의 pH에서 벨라타셉트 SC 약물 제품 제제를 평가하도록 설계된 추가의 실험실 규모 pH 안정성 연구를 개요한다. 본 연구의 목적은 벨라타셉트 SC 제제에 대한 최대 18개월의 저장기간을 획득할 최적 pH 제제를 확인하는 것이다.
본 연구에서, 벨라타셉트 SC 제품을 pH 6.3, 6.6, 6.9, 7.2 및 7.5에서 제제화하였다. 약 25 mg/mL에서의 벨라타셉트 약물 물질을 약 100 mg/mL으로 일차 농축시키고, pH 6.9에서 10mM 인산염 완충제로 투석여과한 후, 이차 농축시켜, >160 mg/mL의 약물 제품 중간체 (DPI)를 얻었다. DPI를 수크로스 및 폴록사머 188로 제제화하고, 최종 배치 농도를 10 mM 인산염 완충제 (pH 6.9)에 의해 조절하였다. 연구 설계에 개요된 바와 같이 제제화된 벌크를 5개의 하위배치로 하위분할하였다. 하위배치의 pH는 1N HCl을 사용하여 각각 6.3 및 6.6로 하향 적정하였다. 추가 2개의 하위배치의 pH는 1N NaOH에 의해 6.9, 7.2 및 7.5 이하로 적정하였다. 제품 배치는 1-mL 긴 피지올리스™에 충전하였다. 샘플은 갈색 광보호 백으로 덮거나 또는 상기 백에 삽입함으로써 언제나 빛으로부터 보호되어야 한다. 본 연구에 사용된 SC 약물 제품 제제는 하기 표 36에 기재되어 있다.
pH 6.9에서의 SC 약물 제품 제제 조성
성분 1.0 mL 당 양
(mg)
벨라타셉트 125
수크로스 170
폴록사머 188 8
일염기 인산나트륨 일수화물 0.638
이염기 인산나트륨 무수물 0.475
주사용수 1.0 mL 적량
2-8℃에서 저장된 약물 제품은 0, 2, 4, 6, 12 18, 24개월에 및 임의로 9개월에 샘플링하였다. 15℃에서 저장된 약물 제품은 1, 2, 4, 6개월에 및 임의로 9개월에 샘플링하였다. 25℃ 및 60％ 습도에서 저장된 약물 제품은 1, 2, 4 및 6개월에 샘플링하였다. 35℃에서 저장된 약물 제품은 1, 2 및 4개월에 샘플링하였다. 2-8℃에서 저장된 샘플은 외관 (초기 및 최종 샘플만), pH (초기, 4개월 및 최종 샘플만), A280 (초기, 4개월 및 최종 샘플만), 크기 배제 HPLC, SDS-PAGE, 트립신 소화 펩티드 맵핑 (TPM), 비아코어 B7 결합 (초기, 4개월 및 최종 샘플만 또는 필요에 따라) 및 등전점전기 이동(IEF) (초기 및 최종 샘플만)에 대해 시험하였다. 15℃ 및 25℃ 및 60％ 습도에서 저장된 샘플은 A280 (초기, 4개월 및 최종 샘플만), 크기 배제 HPLC, SDS-PAGE 및 트립신 소화 펩티드 맵핑 (TPM)에 대해 시험하였다. 35℃에서 저장된 샘플은 크기 배제 HPLC, SDA-PAGE 및 트립신 소화 펩티드 맵핑(TPM)에 대해 시험하였다.
비-통상적인 시험 방법은 초기 시점, 4개월, 12개월 및 연구의 마지막에 안정성 샘플을 추가로 특징화하는데 사용될 것이다. 이들 방법 중 몇몇은 또한 경향 또는 예상치 못한 결과가 관찰되는 경우 특정 샘플을 시험하는데 사용될 수 있다. 비-통상적인 방법으로는 다각 광 산란을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS), 동력학 결합 (SPR), 질량 분광법, CD, AUC, 시차 주사 열량계 (DSC), FFF, FTIR, 크기 배제 HPLC (변성됨) 및 SDS-PAGE (은 염색)을 들 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY DALI, MANISHA DAHLHEIM, CHARLES E. BORSADIA, SUNITA NARINGREKAR, VIJAY H. GANDHI, RAJESH B. NERURKAR, MANOJ <120> STABLE PROTEIN FORMULATIONS <130> 10739 WO PCT <140> PCT/US06/62297 <141> 2006-12-19 <150> 60/752,150 <151> 2005-12-20 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1152 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PRIMER-CTLA4Ig <400> 1 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE-CTLA4Ig <400> 2 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PRIMER-L104EA29YIg <400> 3 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 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1152 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE-L104EA29YIg <400> 4 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

Claims (77)

125 mg/ml의 CTLA4Ig 분자, 수크로스, 락토스, 말토스, 만니톨, 트레할로스 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 당, 및 제약상 허용되는 수성 담체를 포함하고, 6 내지 8 범위의 pH 및 9 내지 20 cps의 점도를 가지며, 당:단백질의 중량 비율이 1.1:1 또는 그 이상인, 피하 투여용 제제.
제1항에 있어서, 당이 수크로스, 만니톨 또는 트레할로스인 제제.
삭제
제1항에 있어서, 당이 수크로스인 제제.
삭제
제4항에 있어서, 수크로스:단백질의 중량 비율이 1.3:1 내지 1.5:1인 제제.
제4항에 있어서, 수크로스:단백질의 중량 비율이 1.4:1인 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 6 내지 7.8 범위의 pH를 갖는 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 완충제를 추가로 포함하는 제제.
제9항에 있어서, 완충제가 10 mM 이상의 양의 인산염 완충제인 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 제제.
제11항에 있어서, 계면활성제가 8 mg/ml의 양의 폴록사머(Poloxamer) 188인 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA4Ig 분자가 위치 27의 메티오닌 또는 위치 26의 알라닌에서 시작하여 위치 383의 리신 또는 위치 382의 글리신에서 종결하는 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것인 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 27의 메티오닌 또는 위치 26의 알라닌에서 시작하여 위치 383의 리신 또는 위치 382의 글리신에서 종결하는 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 125 mg/ml의 양의 CTLA4Ig 분자, 170 mg/ml의 양의 수크로스, 완충제 및 멸균 주사용수를 포함하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 12개월 이상 동안 2 내지 8℃에서 저장시 안정한 제제.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 면역계 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
제16항에 있어서, 면역계 질환이 자가면역 질환, 면역증식성 질환 또는 이식편-관련 장애로부터 선택된 것인 제약 조성물.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 이식편대숙주 질환 또는 류머티스성 관절염을 치료 또는 예방하거나 고형 기관 또는 조직 이식 거부를 억제하기 위한 제약 조성물.
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