KR101356707B1 - 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경 - Google Patents

Abstract

본 발명은 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경은 레이저 광을 출력하는 레이저 소스, 상기 레이저 소스에 출력되는 레이저 광을 측정 대상물에 조사하고, 상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 전달하기 위한 것으로, 갈바노 미러를 포함하는 다수의 광학계, 상기 광학계를 통해 측정 대상물에서 발생하는 형광의 투과 중심 파장을 결정하는 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter), 상기 제 1ATBF에서 투과된 반사광에서 투과 파장 대역폭을 결정하는 제 2ATBF, 상기 제 2ATBF에에서 전달되는 형광에 대해 펄스의 동기화 신호와 PMT로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고, 계산된 데이터를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 획득하는 하고, 상기 갈바노 미러로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리 상에 x, y 픽셀별로 감쇠 곡선을 저장하고, 픽셀별 exponential curve-fitting를 통해 형광 수명시간 이미지를 출력하는 TCSPC 유닛을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경 {Spectral fluorescence lifetime imaging microscope with the use of tunable bandpass filters}

본 발명은 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 설계 구조를 간소화시면서 파장의 선택성을 높여 보다 정밀 측정이 가능한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경에 관한 것이다.

분광 형광 수명시간 이미징 현미경(SLIM)은 기존의 형광 수명시간 이미징 현미경(FLIM)에 분광(Spectral) 이미징의 기능을 추가한 것이다. 형광의 수명시간을 측정하기 위한 방법으로는 시간 상관 단일 광자 계수법(TCSPC)이 이용된다. TCSPC를 이용한 FLIM은 공초점 현미경 시스템을 기반으로 한다. SLIM은 시편으로부터 나오는 형광을 분광매질을 통해 분광 시킨 후 파장에 따라 형광 수명시간을 측정하여 영상을 얻는 것이다. 이렇게 분광된 형광 신호로부터 수명시간을 측정함으로써 시편 내에 존재 하는 각기 다른 종류의 형광물질들을 더욱 효과적으로 분별하여 정확한 수명시간 측정이 가능해진다.

현재까지 개발된 SLIM에서는 프리즘, 회절격자와 같은 분산 광학계를 이용하여 형광을 분광시킨다. 이렇게 분광된 빛을 검출 하는 방식은 크게 2가지가 있다. 첫 번째는 다채널 PMT를 이용하여 분광된 빛을 동시에 검출하는 방법이다. 여러 개의 채널에서 동시에 신호를 측정한다는 점에서 속도가 빠를 수는 있지만 PMT의 채널 수가 한정되어 있고 채널이 불연속적으로 배열되어 있기 때문에 파장의 선택성이 떨어진다. 두 번째는 움직이는 슬릿을 이용하여 원하는 파장을 선택하는 방법이 있다. 이때 나머지 파장은 거울이 달린 슬릿에 반사되어 다른 채널로 들어가고 같은 방법으로 슬릿을 움직여 파장을 선택한다. 이와 같은 방법은 최대 5개까지의 채널 밖에 구현할 수 없다. 또한 채널 별로 PMT와 TCSPC 유닛이 각각 필요하기 때문에 시스템의 크기가 커지고 많은 비용이 소요된다.

만약 프리즘, 회절격자와 같은 분산 광학계를 사용하지 않는다면 이와 같은 단점들을 보완하고 시스템을 간단하게 설계할 수 있다. 공초점 현미경 시스템에서 descan된 평행광을 입사 각도에 따라 투과 파장 특성이 바뀌는 필터에 투과시킴으로써 간단하게 파장을 선택할 수 있다. 필터를 회전시킴에 따라 연속적인 파장 스캐닝이 가능하고 두 개의 필터를 나란히 배치함으로써 파장 투과 대역을 조절할 수 있으므로 파장의 선택성을 높일 수 있다.

따라서, 본 발명은 분광 형광 수명시간 현미경을 구성함에 있어, 구조를 간소시켜 설계 단순화와 비용절감을 실현할 수 있으며, 두 개의 ATBF를 이용하여 파장의 선택성을 높일 수 있는 분광 형광 수명시간 이미지 현미경을 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 레이저 광을 출력하는 레이저 소스, 상기 레이저 소스에 출력되는 레이저 광을 측정 대상물에 조사하고, 상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 전달하기 위한 것으로, 갈바노 미러를 포함하는 다수의 광학계, 상기 광학계를 통해 측정 대상물에서 발생하는 형광의 투과 중심 파장을 결정하는 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter), 상기 제 1ATBF에서 투과된 반사광에서 투과 파장 대역폭을 결정하는 제 2ATBF, 상기 제 2ATBF에에서 전달되는 형광에 대해 펄스의 동기화 신호와 PMT로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고, 계산된 데이터를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 획득하고, 상기 갈바노 미러로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리 상에 x, y 픽셀별로 감쇠 곡선을 저장하고, 픽셀별 exponential curve-fitting를 통해 형광 수명시간 이미지를 출력하는 TCSPC 유닛을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 광학계는, 상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 반사시키는 이색성 거울, 상기 레이저 소스에서 출력되는 레이저 광을 상기 측정 대상물에 조사되도록 중계하는 스캔렌즈와 튜브렌즈 및 상기 측정 대상물에 레이저 광을 조사시키는 상기 대물렌즈를 포함한다.

또한, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF는, 0 ~ 60° 회전 구동시켜 투과 중심 파장과 투과 파장 대역폭을 결정한다.

또한, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF를 통해 투과 중심 파장의 범위는 480nm ~ 550nm, 회전 각도에 따른 투과 파장 대역폭은 5 ~ 20nm에 해당하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF는, 입사 각도에 따른 투과 중심 파장의 관계식이 아래 수학식을 통해 결정한다.

<수학식>

여기서,

: 입사각도,

: 유효 굴절률.

또한, 상기 PMT의 유효구경 내에 레이저 빔이 집광시키기 위해 볼록렌즈를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 구성되고 작용되는 본 발명은 분광 형광 수명시간 이미지 현미경의 구조를 매우 간소화시킬 수 있기 때문에 설계가 용이하게 고가의 광학계 부품을 절감시킬 수 있는 이점이 있다.

또한, ATBF를 이용하여 투과 파장 중심과 투과 파장 대역폭을 제어함으로써, 회전 각도를 조절하여 파장 대역폭을 가변시킴으로써 파장의 선택성을 높일 수 있다.

결과적으로, 분광 형광 수명시간 이미징 현미경의 구조 설계를 단순화 시킴에 따라 비용절감을 실현하고, 고정밀 측정이 가능한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분광 형광 수명시간 이미징 현미경을 개략적으로 나타낸 구성도,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 하나의 ATBF를 사용하였을 시 파장의 투과 특성을 나타낸 도면,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 두 개의 ATBF를 사용하였을 시 파장의 투과 특성을 나타낸 도면,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 ATBF를 사용하였을 때 발생하는 횡방향 축이동과 볼록렌즈를 이용하여 이를 집광시켜주는 것을 나타낸 도면.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경의 바람직한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경은, 레이저 광을 출력하는 레이저 소스, 상기 레이저 소스에 출력되는 레이저 광을 측정 대상물에 조사하고, 상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 전달하기 위한 것으로, 갈바노 미러를 포함하는 다수의 광학계, 상기 광학계를 통해 측정 대상물에서 발생하는 형광의 투과 중심 파장을 결정하는 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter), 상기 제 1ATBF에서 투과된 반사광에서 투과 파장 대역폭을 결정하는 제 2ATBF, 상기 제 2ATBF에에서 전달되는 형광에 대해 펄스의 동기화 신호와 PMT로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고, 계산된 데이터를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 획득하고, 상기 갈바노 미러로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리 상에 x, y 픽셀별로 감쇠 곡선을 저장하고, 픽셀별 exponential curve-fitting를 통해 형광 수명시간 이미지를 출력하는 TCSPC 유닛을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 분광 형광 수명시간 이미징 현미경(SLIM)을 구현함에 있어서 새로운 형태의 분광 기법을 설계하는 것이다. 이는 빛의 입사 각도에 따라 투과 파장의 특성이 바뀌는 Angle-tuned bandpass filter(ATBF)를 이용한 것이다. ATBF는 Fabry-Ferot 간섭계의 일종으로 입사 각도에 따란 투과 중심 파장의 관계식은 다음과 같다.

여기서,

: 입사각도,

: 유효 굴절률.

공초점 현미경 시스템에서 시편으로부터 발생한 형광이 중계 광학계를 지나면 평행광이 된다. 이 평행광을 ATBF에 통과시키고 ATBF를 0도에서 60도까지 회전시킴으로써 원하는 파장 대역을 선택할 수 있다. 그러나 ATBF의 투과 파장의 대역폭은 20nm으로 고정되어 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 두 개의 ATBF를 나란히 배치한다. 그러면 두 ATBF의 투과 파장 대역이 겹치는 부분만 통과하므로 투과 파장의 대역폭을 줄일 수 있다.

또한 ATBF의 상대적인 각도를 조절함으로써 투과 파장 대역폭을 5nm에서 20nm까지 조절이 가능하다.

평행광이 ATBF에 비스듬한 각도로 입사하게 되면 횡방향으로 빔 경로의 이동이 발생한다. 그러면 형광 신호가 온전히 PMT의 검출부로 들어가지 못한다. 이를 해결하기 위해 볼록렌즈를 삽입하여 횡방향으로 축 이동이 발생하더라도 빛을 한 초점으로 집광될 수 있도록 하였고 그 위치에 PMT를 배치하였다.

도 1은 분광 형광 수명시간 이미징 현미경을 개략적으로 나타낸다. 공초점 모듈은 기존의 공초점 현미경이 이용가능하다. 시간 도메인에서 TCSPC 방법을 이용하여 형광의 수명시간을 측정하기 위해서는 펄스 레이저(1)를 사용한다. 레이저(1)는 이색성 거울(2)을 통과하여 갈바노 미러(3)에 의해 스캐닝 되어 스캔렌즈(4)와, 튜브렌즈(5)로 구성된 중계 광학계를 거치며 대물렌즈(6)를 통과하여 시편(7)을 조명한다. 이 때 시편으로부터 발생하는 형광신호는 다시 대물렌즈(6)와 중계 광학계(5), (4)를 거쳐 갈바노 미러(3)에 반사되어 평행광이 된다. 이 형광 신호는 이색성 거울(2)에 반사되어 광검출부로 입사한다.

이때, 첫 번째 ATBF(8)를 회전시켜 투과 중심 파장을 선택하고 두 번째 ATBF(9)를 회전시켜 투과 파장 대역폭의 크기를 결정한다. 이렇게 분광된 형광 신호는 볼록렌즈(10)에 의해 집광되고 PMT(11)의 유효 구경 내에 입사한다. 이 때 TCSPC 유닛(12)은 레이저로부터 발생하는 펄스의 동기화 신호와 PMT(11)로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고 그 정보를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 얻는다. 그리고 갈바노 미러(3)로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리상에 x, y 픽셀 별로 각 감쇠곡선을 저장시키고 PC(13)에서 픽셀별로 exponential curve-fitting을 수행하여 형광 수명시간 이미지를 출력한다.

도 2는 한 개의 ATBF를 사용하였을 시 파장 투과 특성을 나타낸 것이다. 0도에서 60도까지 회전함에 따라 투과 중심 파장은 480nm에서 550nm까지 변한다. 특정 각도에서의 투과 파장 대역폭은 5 ~ 20nm이다.

도 3은 두 개의 ATBF를 나란히 배치하였을 경우의 파장 투과 특성을 나타낸 것이다. 각 ATBF의 투과 파장 영역이 겹치는 부분에서만 투과가 일어난다. 따라서 두 ATBF의 상대적인 각도를 조절함으로써 투과 파장 대역폭을 조절하고 파장의 선택성을 높인다.

도 4는 현미경의 분광 광학계 부분을 나타낸 것이다. 평행광의 첫 번째 ATBF(8)와 두 번째 ATBF(9)를 지남에 따라 횡방향의 축이동이 발생함을 나타내었다. 그러나 PMT(11) 앞에 볼록렌즈(10)를 배치함으로써 어느 방향의 축이동이 발생하더라도 PMT의 유효구경에 빛이 집광되도록 설계하였다.

이상, 본 발명의 원리를 예시하기 위한 바람직한 실시예와 관련하여 설명하고 도시하였지만, 본 발명은 그와 같이 도시되고 설명된 그대로의 구성 및 작용으로 한정되는 것이 아니다. 오히려, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능함을 당업자들은 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 그러한 모든 적절한 변경 및 수정과 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.

1 : 레이저
2 : 이색성 거울
3 : 갈바노 미러
4 : 스캔렌즈
5 : 튜브렌즈
6 : 대물렌즈
7 : 시편
8 : 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter)
9 : 제 2ATBF(Angle-tuned bandpass filter)
10 : 볼록렌즈
11 : PMT
12 : TCSPC
13 : 단말기

Claims (9)

1. 레이저 광을 출력하는 레이저 소스;
   상기 레이저 소스에 출력되는 레이저 광을 측정 대상물에 조사하고, 상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 전달하기 위한 것으로, 갈바노 미러를 포함하는 다수의 광학계;
   상기 광학계를 통해 측정 대상물에서 발생된 형광의 투과 중심 파장을 결정하는 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter);
   상기 제 1ATBF에서 투과된 형광에서 투과 파장 대역폭을 결정하는 제 2ATBF;
   상기 제 2ATBF에에서 전달되는 반사광에 대해 펄스의 동기화 신호와 PMT로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고, 계산된 데이터를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 획득하고, 상기 갈바노 미러로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리 상에 x, y 픽셀별로 감쇠 곡선을 저장하고, 픽셀별 exponential curve-fitting를 통해 형광 수명시간 이미지를 출력하는 TCSPC 유닛을 포함하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
2. 제 1항에 있어서, 상기 광학계는,
   상기 측정 대상물에서 발생하는 형광을 반사시키는 이색성 거울;
   상기 레이저 소스에서 출력되는 레이저 광을 상기 측정 대상물에 조사되도록 중계하는 스캔렌즈와 튜브렌즈; 및
   상기 측정 대상물에 레이저 광을 조사시키는 대물렌즈;를 포함하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
3. 제 1항에 있어서, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF는,
   0 ~ 60° 회전 구동시켜 투과 중심 파장과 투과 파장 대역폭을 결정하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 제 1ATBF와 제 2ATBF를 통해 투과 중심 파장의 범위는 480nm ~ 550nm, 회전 각도에 따른 투과 파장 대역폭은 5 ~ 20nm에 해당하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF는,
   입사 각도에 따른 투과 중심 파장의 관계식이 아래 수학식을 통해 결정되는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
   <수학식>
   

   

   
   여기서,

   

   : 입사각도,

   

   : 유효 굴절률.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 PMT의 유효구경 내에 레이저 빔이 집광시키기 위해 볼록렌즈를 더 포함하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
7. 측정 대상물에서 발생한 형광의 투과 중심 파장을 결정하는 제 1ATBF(Angle-tuned bandpass filter);
   상기 제 1ATBF에서 투과된 반사광에서 투과 파장 대역폭을 결정하는 제 2ATBF;
   상기 제 2ATBF에에서 전달되는 반사광에 대해 펄스의 동기화 신호와 PMT로부터 검출된 형광의 단일 광자 신호와의 시간차를 계산하고, 계산된 데이터를 시간축에 대하여 누적시켜 감쇠곡선 형태의 히스토그램을 획득하고,
   상기 측정 대상물에서 발생한 형광을 갈바노 미러에 의해 수신한 후 상기 갈바노 미러로부터 pixel, line, frame 동기 신호를 입력받아 메모리 상에 x, y 픽셀별로 감쇠 곡선을 저장하고, 픽셀별 exponential curve-fitting를 통해 형광 수명시간 이미지를 출력하는 TCSPC 유닛을 포함하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
8. 제 7항에 있어서, 상기 제 1ATBF와 제 2ATBF는,
   입사 각도에 따른 투과 중심 파장의 관계식이 아래 수학식을 통해 결정되는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.
   <수학식>
   

   

   
   여기서,

   

   : 입사각도,

   

   : 유효 굴절률.
9. 제 7항에 있어서,
   상기 제 1ATBF와 제 2ATBF를 통해 투과 중심 파장의 범위는 480nm ~ 550nm, 회전 각도에 따른 투과 파장 대역폭은 5 ~ 20nm에 해당하는 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경.

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