KR101349667B1 - 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재의 제조방법은, 누에 유래 가수분해물을 용해하여 가수분해물 용액을 준비하는 제1단계, 상기 가수분해물 용액에 가교제를 첨가한 후, 15~30℃에서 0.5~2시간 동안 교반하여 반응시키는 제2단계 및, 상기 반응 후 급속냉동건조하는 제3단계로 구성된다.
본 발명에 의해, 세포증식효과가 우수한 가수분해물을 이용함으로써, 뛰어난 상처치유 효과 및 보습효과를 갖는 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법이 제공된다.

Description

누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법{MEDICAL WOUND DRESSING USING HYDROLYSATE FROM SILKWORM GLAND AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상처치유 효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법에 관한 것이다.

피부는 우리 몸 중 가장 큰 표면적을 차지하면서 면역 기능을 하는 기관으로서 외부의 미생물이나 자외선, 화학물질 등 여러 가지 유해 환경으로부터 보호하는 역할 및 인체의 수분증발을 억제함으로써 탈수를 방지하고 체온을 조절하는 역할을 한다. 또한, 물리적 자극에 강해야 하고 탄력성이 있어야 하며 인체가 생명체를 유지하는 동안 그 역할을 충분히 수행해야 한다.

이러한 피부에 화상이나 각종 외상에 의한 결손이 일어나게 되면, 그 보호 작용이 상실되어 기능의 장애를 초래하게 되고, 수분 손실 등에 따른 여러 가지 부작용과 외부로부터의 세균 감염 등을 일으켜 환부의 치료를 어렵게 하거나 이차적인 기능장애 또는 손상 등과 같은 추가적인 부작용을 초래하게 되어 심한 경우에는 생명연장에도 영향을 주게 된다.

따라서, 상처의 치료를 신속하게 하고 이차적인 각종 부작용을 최소화하기 위해서는 적절한 드레싱재를 이용한 상처 치료가 필수적이다.

현재 자가 치료용으로 판매되고 있는 드레싱재는 통상 부직포나 합성수지 필름 등에 접착제를 도포하고, 흡액성 패드를 상처부에 대응하도록 접착하여 고정한 형태를 갖고 있어, 값이 싸고 사용이 간편하다는 점에서는 우수하다. 그러나, 비방수 타입의 드라이 드레싱은 상처의 치유에 적절한 습윤 환경을 조성하지 못할 뿐만 아니라 상처 회복에 필요한 삼출액까지도 흡수하여 제거하는 단점이 있다. 또한, 방수 타입의 필름 드레싱도 삼출액이 적절하게 관리되지 않는 단점도 있다.

즉, 방수 타입이라 하더라도 종래의 상처 드레싱재는 삼출액이 상처부위에 수직 방향으로 이동하도록 설계되어 흡액 능력의 범위 내에서는 계속 흡수되기 때문에 삼출액의 저류(貯留)가 적절하게 제어되지 않는 것이다.

그리하여 상처부위에 습윤 환경, 상처 주위는 건조 환경이라는 상반된 조건을 만족시키기 위해서 피복재로 다공질체 등 투습도가 높은 재료를 사용한 드레싱재, 피복재에 도포하는 점착제층의 투습도를 높이기 위하여 친수성 물질 등을 배합한 드레싱재 및 점착제를 부분적으로 도포한 드레싱재 등 투습도 제어에 관한 것이 많이 공개되어 있다. 그러나, 모두 상처 주위의 양쪽, 혹은 상처 부위만의 투습도를 높이는 것들로, 상처 부위 자체의 습윤 환경을 유지하고 상처 주위는 건조 환경을 유지하는 거에 대해 연구된 바는 없다.

관련 선행기술로는 대한민국공개특허 제10-2009-0034173호(공개일: 2009년 04월 07일, 명칭: 실크 드레싱재)와 일본공개특허 특개2002-128691(공개일: 2002년 05월 09일, 명칭: 세리신 함유 소재, 그 제조방법 및 그 사용방법) 이 있다.

본 발명의 목적은 상처 부위 자체의 습윤 환경을 유지함과 동시에 상처치유 효과가 우수한 의료용 드레싱재 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다. 또한, 다양한 창상의 상태와 조건에 맞는 흡수속도를 가진 의료용 드레싱재 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 의료용 드레싱재는, 누에 실샘 유래 가수분해물을 포함하는 것이 특징이다.

상기 가수분해물은 누에를 동결건조하여 얻은 실샘을 용해한 액체로부터 원심분리한 상등액에서 추출된 것이 특징이다.

상기 드레싱재는 콜라겐을 더 포함하기도 하며, 이때 콜라겐은 포유류 유래 또는 인간 탯줄 유래인 것이 특징이며 또한 제1형 콜라겐을 사용하는 것이 특징이다.

여기서 콜라겐은 상기 가수분해물의 중량대비 1 내지 3 배인 것이 특징이다.

본 발명의 의료용 드레싱재의 제조방법은, 누에 실샘 유래 가수분해물을 용해하여 가수분해물 용액을 준비하는 제1단계, 상기 가수분해물 용액에 가교제를 첨가한 후, 15~30℃에서 0.5~2시간 동안 교반하여 반응시키는 제2단계 및, 상기 반응 후 급속냉동건조하는 제3단계로 구성된다.

상기 제2단계에서 상기 가수분해물 용액에 콜라겐을 더 혼합하는 것이 특징이며, 이때 상기 콜라겐은 상기 가수분해물 용액의 중량대비 1 내지 3 배인 것이 특징이다.

상기 제1단계의 가수분해물은 상기 제1단계의 가수분해물은 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고 그 분리된 실샘을 용해한 후 원심분리하여 얻은 상등액에 알칼리를 첨가한 후, 가수분해한 다음 중화 및 탈염과정을 거쳐 얻는 것이 특징이다.

또한, 상기 가수분해는 15~30℃에서 이루어진 것이 특징이다.

또한, 상기 제2단계에서 사용된 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)이며, 바람직하게는 가수분해물 용액 부피대비 0.1~0.5부피%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용하는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로 사용가능한 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용함으로써, 습윤 환경을 유지함은 물론, 공극 사이에서 세포이동이 가능하므로 경미한 상처는 물론 광범위한 창상까지 범용적으로 적용될 수 있는 의료용 드레싱재가 제공된다.

또한, 세포증식효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용함으로써, 상처치유 효과를 갖으며 상처에 적절한 습윤 환경을 제공할 수 있어 상처치유를 촉진시켜 주는 의료용 드레싱재가 제공된다.

도 1은 본 발명의 의료용 드레싱재를 전자현미경(SEM)을 통해 나타낸 도면.
도 2는 비타민 C 대비 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물 용액의 항산화력 측정 후 생물학적 유효 농도 범위(IC₅₀: the half maximal inhibitory concentration) 설정을 나타낸 도면.
도 3은 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물과 콜라겐의 혼합용액에 대한 항산화능을 나타낸 도면.
도 4는 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물과 콜라겐의 복합 의료용 드레싱재의 용매에 대한 외형 유지능을 나타낸 도면.
도 5a는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.1중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 팽윤도를 나타낸 도면.
도 5b는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.5중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 팽윤도를 나타낸 도면.
도 6a는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.1중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 안정성을 나타낸 도면.
도 6b는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.5중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 안정성을 나타낸 도면.
도 7a는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.1중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 분해도를 나타낸 도면.
도 7b는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 0.5중량%가 함유된 본 발명의 의료용 드레싱재의 분해도를 나타낸 도면.
도 8 및 도 9는 마우스 등의 창상부위에서 시간에 따른 피부조직의 재생여부를 나타낸 도면.
도 10은 마우스 등의 창상부위에서 시간에 따른 피부조직의 재생여부를 H&E 염색을 통해 비교한 도면.
도 11은 마우스 등의 창상부위에서 시간에 따른 피부조직의 콜라겐 합성 및 재생여부를 Trichrome 염색을 통해 비교한 도면.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용한 의료용 드레싱재의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 가수분해물 용액 준비

누에 실샘을 용해하여 가수분해물 용액을 준비한다. 이때 실샘은 물에 잘 녹기 때문에 물로 용해하는 것이 좋다.

상기 가수분해물은 누에 실샘에서 분리된 것이면 모두 가능하며, 바람직하게는 누에 실샘 초미세분말에서 분리된 것을 사용한다.

상기 가수분해물은 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)이 혼합된 상태의 실샘이 상온에서 용해가 되는 실크 단백질을 가수 분해하여 얻은 것이므로 피브로인과 세리신 모두 혼합된 상태이다. 특히 상기 가수분해물은 물에 용이하게 용해되기 위해 수용성인 것이 특징이다.

이러한 가수분해물의 수득방법에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

첫째, 누에를 먼저 동결건조하여 실샘을 분리한다.

이때 누에의 종으로 Bombix mori 종을 사용하나, 이에 국한한 것은 아니며, 일반적으로 실샘을 수득할 수 있는 누에로 여겨지는 모든 종은 사용가능하나, 그 중 세포증식효과가 우수하며 사육시간 및 인건비를 감소시켜 가수분해물을 수득하기 위해 상기 누에는 숙잠을 사용하는 것이 바람직하다.

둘째, 상기 분리된 실샘을 초미세분말로 가공하여 물에 용해한 후, 원심분리하여 얻은 상등액을 사용한다.

이때, 상기 실샘은 초미세분말 상태일 경우 성분변화를 최소화할 수 있도록 상온(15~30℃)에서 용이하게 용해가 이루어질 수 있다.

또한, 상기 실샘은 초미세분말상태에서 물로 용해하는 것은, 용해시 물분자와 접촉면적이 최대화되어 용해가 잘 이루어지며, 실온에서 용해된 실샘 단백질만을 분리할 수 있기 때문이다. 이에 더욱 바람직하게는 상기 실샘 초미세분말의 입자 크기는 600~800mesh 인 것이 좋다.

셋째, 상기 얻은 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해한다.

알칼리로 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는 것이 좋다. 이는, 수산화나트륨(NaOH)으로 인해 상기 상등액이 분자량이 작은 펩타이드(peptide)로 분해가 이루어지도록 해주기 때문이다.

바람직하게는 NaOH를 사용시 최종 농도가 0.2~1M이 되도록, 더욱 바람직하게는 1M 이 되도록 첨가한 후, 상온(15~30℃)에서 0.5~1시간 정도, 더더욱 바람직하게는 30분간 가열하여 가수분해한다. 다시 말해, 상기 누에 실샘은 상온에서도 모두 분해가 가능하므로, 기존에 고온 처리시 수득된 가수분해물의 특성이 일부 변형되는 것을 방지할 수 있으면서, LiBr과 같은 유해한 용매를 사용하지 않아도 가수분해물의 분리가 가능함을 의미한다.

넷째, 상기 가수분해 후 중화 및 탈염과정을 거쳐 누에 실샘 유래 가수분해물을 수득한다.

이때, 중화과정은 산을 첨가하여 이루어지며 바람직하게는 인산을 사용하며, pH가 7.0~7.5 정도가 될 때까지 첨가하여 중화한다.

상기 탈염과정으로는 통상적인 탈염 방법으로 모두 사용가능하나, 물질이 분자량 수천 이상인 고분자의 경우는 염류와의 분자크기 차이를 이용하는 여러 가지 방법, 즉 겔여과, 한외여과, 투석 등으로 이루어진다.

이렇게 수득된 본 발명의 가수분해물은 무혈청 첨가효과가 우수하며, 세포증식효과가 우수하여 혈청대체제로 사용가능하며 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로도 사용가능하다.

2. 본 발명의 의료용 드레싱재 제조

상기 가수분해물 용액에 가교제를 첨가한 후, 15~30℃에서 0.5~2시간 동안 교반하여 반응시키며 그 후 급속냉동건조하여 의료용 드레싱재를 제조한다.

상기 가교제(corss linking agent)는 선상고분자화합물분자를 상호간에 화학결합으로 결합시켜서 3차원 망상구조의 고분자화합물로 만드는 물질을 일컫는 것으로서, 수지(樹脂)에 경도(硬度)나 탄력성 등 기계적 강도와 화학적 안정성을 부여해준다.

이에, 상기 가교제로는 일반적으로 당업계에 알려진 모든 가교제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GA)를 사용하는 것이 좋다. 특히 다양한 창상의 상태와 조건에 맞는 흡수속도를 갖도록 하기 위해 바람직하게는 상기 가수분해물 용액 부피대비 0.1~1.0 부피%의 GA를, 보다 바람직하게는 0.1~0.5 부피%의 GA를 사용하는 것이 좋다.

또한, 상기와 같이 제조된 본 발명의 의료용 드레싱재는 누에 실샘 유래 가수분해물을 포함하여 이루어진 드레싱재로써, 이들의 외형을 더 잘 유지하면서 더 높은 보습력을 갖기 위해 콜라겐을 더 혼합하기도 한다.

이때, 상기 콜라겐은 드레싱재의 외형유지능을 나타내도록 해주는 콜라겐 종류는 모두 사용가능하며, 바람직하게는 포유류 유래 또는 인간 탯줄 유래된 콜라겐을 사용하며, 특히 19가지 형태의 콜라겐 중 프롤린(proline)의 함량이 가장 풍부한 제1형 콜라겐을 사용하는 것이 좋다.

상기 콜라겐의 함량은 상기 가수분해물 용액의 중량대비 1배 미만으로 혼합될 경우, 수분에 의한 상기 드레싱재의 외형유지력이 다소 떨어지게 되며, 3배초과로 혼합될 경우 3배 넣은 경우와 별 다른 차이점을 나타내지 않아 경제적으로 맞지 않으므로 상기 콜라겐은 상기 가수분해물의 중량대비 1 내지 3 배로 혼합되는 것이 바람직하다.

이와 같이 본 발명의 의료용 드레싱재는 기존의 부직포나 거즈 드레싱재의 단점인 건조환경 유지, 낮은 흡수능 등을 개선한 드레싱재로서, 공극 사이에서 세포이동이 가능하므로 경미한 상처는 물론 광범위한 창상에까지 범용적으로 적용될 수 있으며, 또한, 세포성장과 증식에 필요한 영양분의 공급이 원활히 이루어지며, 상처에 적절한 습윤 환경을 제공함으로써 상처치유를 촉진시켜주어 뛰어난 상처치유 효과를 나타낸다.

하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물 수득

실크 원료로 숙잠을 준비하고 이를 동결건조하였다.

상기 동결 건조물을 통해 실샘을 분리하고 이 분리된 실샘을 초저온 분쇄기 (cryogenic mill)에 투여하여 초미세분말로 가공하였다.

이렇게 가공된 누에실샘 초미세분말을 상온(15~30℃)에서 30 분간 교반하면서 용해한 후, 이를 원심분리한 다음 상등액만을 취하고 여기에 NaOH를 첨가하되, 최종 1M이 되도록 상기 상등액에 첨가하여 24℃에서 30분간 교반하였다.

그 다음 인산을 이용하여 pH가 7이 되도록 중화한 후, 한외여과 (ultrafiltration) 방법으로 탈염하였다.

그 후 다시 동결건조하여 본 발명에서 사용되는 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물을 수득하였다.

<실시예 2 내지 8> 본 발명의 의료용 드레싱재 제조

상기 실시예 1에서 수득된 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물 분말을 준비하였다.

상기 수용성 가수분해물 분말의 중량대비 4%(w/v)의 증류수로 상기 수용성 가수분해물 분말을 용해하여 수용성 가수분해물 용액을 준비하였으며, 따로 1중량%의 콜라겐 용액을 하기 실시예 9와 같이 제조하여 준비하였다.

상기 준비된 수용성 가수분해물 용액과 콜라겐 용액은 하기 표 1과 같이 혼합하여 준비하였다.

		글루타르알데히드 (glutaraldehyde)	실시예1의 수용성 가수분해물 분말 :콜라겐(collagen)
실시예1	도 1A	0.1%	1 : 0
비교예1	도 1B		0 : 1
실시예2	도 1C		1 : 1
실시예3	도 1D		3 : 1
실시예4	도 1E		1 : 3
실시예5	도 1F	0.5%	1 : 0
비교예2	도 1G		0 : 1
실시예6	도 1H		1 : 1
실시예7	도 1I		3 : 1
실시예8	도 1J		1 : 3

그 다음 상기 준비된 용액에 가교제인 0.5%(w/v) 또는 0.1%(w/v)의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 각각 첨가하고, 이를 20℃에서 균일하게 1시간 동안 교반하여 반응시키며, -80℃에서 냉동한 다음 건조하여 의료용 드레싱재들을 제조하였다.

상기 의료용 드레싱재를 SEM(주사형 전자 현미경)을 통해 확인한 바 도 1과 같이 나타났다. 즉, 도 1J에 나타나 있듯이 본 발명의 의료용 드레싱재는 상기 실시예 1에서 수득된 누에 실샘 초미세분말유래 수용성 가수분해물과 콜라겐이 가교제로 인해 상호간에 화학결합으로 결합되어 3차원 망상구조로 이루어져 있으며 0.5% 글루타르알데히드를 첨가한 경우에 전자현미경(SEM)상 공극(입자 사이의 틈)이 가장 높게 나타났다.

<실시예 9> 인간 탯줄 유래 콜라겐의 제조

동결된 탯줄을 상온에서 해동시켰다. 탯줄을 1~2cm 길이로 절단한 후, 정제수로 세척하였다.

70% 에탄올 용액을 처리한 후, 4℃에서 24시간 반응시켰다.

정제수로 세척한 후, 3% H₂O₂ 용액을 처리하고 4℃에서 12~24시간 마그네틱 바를 이용하여 교반하였다.

정제수로 2회 이상 세척하고 0.5M 아세트산 용액을 넣어 블렌더(blender)와 균질기(homogenizer)를 사용하여 조직을 분쇄하였다.

펩신을 처리하고 4℃에서 24시간 반응시켰다. 10,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다.

원심분리 후, NaOH를 사용하여 수거한 상층액의 pH를 7로 맞추어 펩신 효소의 활성을 제거하였다.

pH를 조정한 용액에 염화나트륨(NaCl)을 처리하고 염화나트륨이 다 녹을 때까지 교반 후, 4℃에서 콜라겐이 염석이 되어 침전이 되도록 12~24시간 정치하였다.

10,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 후, 염석이 된 콜라겐 펠렛 (pellet)을 분리하여 한외여과 장치(ultrafiltration system)로 탈염 및 농축하였다. 최종적으로 여과방법으로 제균하고 동결 건조하여 보관하였다.

<비교예 1> 콜라겐 용액만으로 이루어진 의료용 드레싱재1 제조

상기 실시예 9의 콜라겐을 용액상태 1%(w/v)로 준비한 후, 0.1%(w/v)의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하고, 20℃에서 균일하게 1시간 동안 교반하여 반응시키며, -80℃에서 냉동한 다음 건조하여 콜라겐 용액으로만 이루어진 의료용 드레싱재1을 제조하였다.(표 1)

<비교예 2> 콜라겐용액만으로 이루어진 의료용 드레싱재2 제조

상기 비교예 1과 같은 방법으로 제조하되, 0.5%(w/v)의 글루타르알데히드를 사용하여 콜라겐용액으로만 이루어진 의료용 드레싱재2를 제조하였다.(표 1)

<실험예 1> 항산화 효과측정

상기 실시예 1에서 수득된 수용성 가수분해물 1%(10mg/ml) 용액과 콜라겐 1%(10mg/ml) 용액을 준비하여 항산화능을 분석하였다.

이때, 항산화능의 측정을 위하여 DPPH 분석(assay)을 수행하였다.

즉, 수용성 가수분해물과 콜라겐 용액을 각각 40㎕를 준비한 후, 메탄올에 용해한 0.2mM DPPH 160㎕를 넣고 빛을 차단한 후 30℃에서 30분간 반응시켰다.

반응이 완료된 샘플은 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 3회에 걸쳐 실시하였으며 공란(blank)과 대조군(control) 값을 이용하여 생물학적 유효농도 범위(IC₅₀: the half maximal inhibitory concentration)를 분석하였다.

그 결과 도 2에 나타나 있듯이, 비타민C의 IC₅₀ 값은 0.1±0.1㎍/㎖, 누에 실샘 가수분해물의 IC₅₀ 값은 73.8±7.4㎍/㎖, 누에고치 유래 세리신(S사 제품)은 202.9±34.1㎍/㎖으로 본 발명의 누에 실샘 가수분해물의 항산화력이 더 높음을 알 수 있었다.

또한, 도 3에 나타나 있듯이, 2%(20mg/ml) 수용성 가수분해물과 1%(10mg/ml) 콜라겐 용액을 1:1로 혼합한 혼합액의 항산화력은 양성 대조군으로 사용된 비타민 C(vitamin C)와 비교한 결과, 약 75% 정도로 나타내는 것으로 혼합액 중에서 가장 높은 항산화력을 나타내는 것으로 확인되었다.

즉, 이러한 높은 항산화력은 생체 적합한 의료용 소재의 드래싱재로서의 가능성을 나타내는 것이므로, 상기 수용성 가수분해물 또는 상기 수용성 가수분해물과 콜라겐의 혼합액은 의료용 소재의 드래싱재로 사용가능함을 알 수 있다.

<실험예 2> 본 발명의 의료용 드레싱재의 외형 유지능 확인

의료용 소재로 사용하기 위해 제작된 드레싱재는 여러 용매에서도 형태와 모양을 유지해야함으로 제작된 드레싱재에 용매를 첨가하여 외형적 형태와 물성을 관찰하였다.

상기 실시예 1 내지 8의 본 발명의 의료용 드레싱재를 준비하고, 이를 비교하기 위해 비교예 1, 2를 준비하여 각각의 용매(증류수 또는 40% 에탄올) 1㎖ 씩 첨가한 후 형태와 물성 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타나 있듯이, 상기의 용매에서 모양과 형태를 유지하는 드레싱재는 수용성 가수분해물 : 콜라겐 = 1 : 3 비율에서 가장 외형이 잘 유지됨을 알 수 있었으며 이에, 본 발명의 드레싱재로 수용성 가수분해물과 콜라겐이 1 : 3 비율로 혼합된 것이 가장 좋음을 알 수 있다.

<실험예 3> 본 발명의 의료용 드레싱재의 공극율 확인

실시예 1 내지 8의 본 발명의 의료용 드레싱재의 공극율을 확인하기 위해, 먼저 지지체의 무게를 측정한 후(W) 각 지지체를 일정량의 물(V ₁ )이 담긴 튜브에 넣고 지지체에 의해 늘어난 물의 양(V ₂ )을 기록하였다.

그 다음 지지체를 제거하고 난 후 남아있는 물의 양 (V ₃ )을 기록하고 다음의 공식에 의해 공극률(e)을 측정하였다.

e (%) = [(V ₁ -V ₃ )/(V ₂ - V ₃ )] ×100

그 결과, 하기 표 2와 같이 나타났다.

공극율(Cross-linker)	비계 구성물 Scaffold composition (wt% ratio) 수용성 가수분해물:콜라겐	평균 공극율 average porosity (%)
glutaraldehyde % 0.1	1:0	78.6 ± 10.1
	0:1	65.5 ± 1.7
	1:1	79.5 ± 2.5
	3:1	78.1 ± 2.7
	1:3	61.2 ± 3.4
glutaraldehyde % 0.5	1:0	81.2 ± 1.7
	0:1	64.6 ± 2.9
	1:1	79.5 ± 0.7
	3:1	79.9 ± 4.9
	1:3	64.1 ± 3.6

상기 표 2에 나타나 있듯이, 수용성 가수분해물의 공극률이 78.6 ± 10.1%로써 콜라겐만 함유되어있을 경우보다 높게 나타났다. 또한, 수용성 가수분해물의 비율이 증가함에 따라 공극률의 변화는 없었으나 콜라겐의 비율이 높아짐에 따라 공극률이 점점 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한 가교제의 농도는 공극률에 크게 영향이 없는 것으로 확인되었다.

즉, 콜라겐의 비율에 따른 공극률의 변화는 공극 사이에서 세포 이동을 도와줄 것으로 기대하며 넓은 지역으로 세포가 부착하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.

<실험예 4> 본 발명의 의료용 드레싱재의 팽윤율 확인

본 발명인 실시예 1 내지 8의 의료용 드레싱재에 대해 팽윤율을 확인하였다.

대조구로 비교예 1,2의 의료용 드레싱재에 대해 팽윤율을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타나 있듯이 가교제의 농도에 의한 변화는 크게 차이가 보이지 않으나 0.5% GA 에서 0.1% GA 보다 전체적으로 조금 낮아 보이는 경향이 있었다.

가장 팽윤도가 낮은 것은 수용성 가수분해물 : 콜라겐 = 1 : 3 드레싱재로 나타났으며 이러한 현상은 콜라겐 함량이 높을수록 팽윤도가 낮게 나타나고 있는 것을 보여 준다.

이러한 현상은 매우 조밀하게 드레싱재가 제작되어 있다는 것을 의미하며 드레싱재내의 용액의 흡수가 매우 천천히 일어난다고 볼 수 있는 반면, 팽윤도가 높게 나타나는 드레싱재는 용액의 흡수가 매우 잘 일어나며 드레싱재 내로 세포성장과 증식에 필요한 영양분의 공급이 원활할 것으로 생각된다.

이에, 팽윤도에 의한 적절한 드레싱재의 선정은 조직공학적 측면에서 사용목적에 따라 다를 것으로 생각된다.

<실험예 5> 본 발명의 의료용 드레싱재의 안정성 확인

수용성 가수분해물과 콜라겐의 각 단백질의 용출이 얼마나 발생하는지 측정하기 위해 본 발명인 실시예 1 내지 8의 가교제 사용에 따르는 의료용 드레싱재에 대해 안정성을 확인하였다.

대조구로 비교예 1,2의 의료용 드레싱재에 대해 안정성을 확인하였다.

즉, 각 지지체에 10㎖의 물을 첨가하고 시간별로 물 안에 포함된 단백질의 양을 측정하였다.

상기 측정 샘플을 얻게 되면 브래드퍼드(Bradford) 시약과 균일하게 섞은 후 10분간 상온에서 반응시켰다.

반응이 끝난 샘플은 흡광도 595nm에서 측정한 후 시간별로 지지체에서 용출되는 단백질의 양을 확인하였다.

그 결과 도 6에 나타나 있듯이, 수용성 가수분해물의 함량이 높을수록 단백질 용출이 시간에 따라 더 많이 일어남을 확인하였다.

이러한 것은 콜라겐보다 수용성 가수분해물 중에 가교되지 못한 수용성 가수분해물이 용출되는 것으로 생각된다. 수용성 가수분해물 : 콜라겐 = 1 : 3 비율의 드레싱재는 다른 비율의 드레싱재에 비하여 안정한 구조로 생각된다.

<실험예 6> 본 발명의 의료용 드레싱재의 분해도 확인

콜라게네이즈(Collagenase)에 의해 수용성 가수분해물과 콜라겐 드레싱재의 혼합물이 분해되는 정도를 확인하였다. 각 드레싱재를 PBS(pH 7.4)에 미리 하룻동안 처리하였으며, 분해 정도를 확인하기 위해서 콜라게네이즈 10U^-1을 처리하고 37℃에서 시간별로 관찰하였다.

그 다음 일정 시간이 지난 후 지지체를 꺼내서 건조한 후 무게를 측정하였다. 지지체의 분해 되는 정도는 다음의 공식에 의해 계산하였다.

% weight loss = 100 × (W ₀ - W _t )/W ₀

W ₀ 는 동결 건조된 지지체의 무게를 나타내며 W _t 는 일정 시간이 지난 후 건조된 지지체의 무게를 나타낸다.

그 결과, 도 7에 나타나 있듯이 드레싱재 내에 콜라겐의 함량에 따라 분해되는 정도가 다르게 나타났다.

즉, 수용성 가수분해물과 콜라겐이 3 : 1일 경우에 시간이 지남에 따라 분해 정도가 가장 높게 일어났다.

<실험예 7> 본 발명의 의료용 드레싱재의 비열등성 효력시험(마우스 모델)

생후 5주된 암컷 마우스(BALB/c-nu Slc)의 등 부위에 직경 8mm의 바이옵시 펀치를 이용하여 창상 모델을 만든 후 자가치유를 방지하기 위하여 직경 11mm의 침니를 도 8과 같이 창상 주위에 삽입하였다. 이 후 본 발명의 드레싱재를 도포한 후 시간에 따른 창상부위의 피부조직의 재생여부를 비교하였다.

음성 대조군으로는 아무 처리하지 않았으며, 양성 대조군으로는 시중에 판매중인 메디폼을 사용하였다.

실험군으로 본 발명의 드레싱재를 수용성 가수분해물로 제조된 것, 콜라겐으로 제조된 것 그리고 수용성 가수분해물과 콜라겐을 1 : 3으로 혼합한 것을 사용하였다.

창상모델에 각각의 드레싱재를 덮어준 후 창상 조직 주위에 공기 중에서 유입되는 세균이나 먼지 등의 침입을 방지하기 위하여 테가덤으로 고정시키고 시간에 따라 피부조직의 재생여부를 비교하였다.

그 결과, 도 8에 나타나 있듯이, 10일 후에 재생된 피부 조직을 확인한 결과 실험군에서 음성 대조군에 비하여 조직생성이 잘 이루어지고 있음을 확인하였다.

<실험예 8> 본 발명의 의료용 드레싱재의 비열등성 효력시험(마우스 모델)의 조직학적 분석

드레싱재 도포 15일 후 테가덤과 침니를 조심스럽게 제거한 후 4% 중성 완충 포르말린(ral buffered formalin)에 24시간 진탕 고정하였다. 고정 후 혈액이 제거된 상태에서 피부 재생정도를 확인한 결과 도 9에 나타나 있듯이 수용성 가수분해물과 콜라겐을 1:3으로 제조한 드레싱재가 양성 대조군과 가장 유사하게 피부가 재생되는 것을 확인하였다.

조직학적 분석을 위하여 고정된 피부 조직을 50% 알콜부터 농도 상승 순으로 100% 까지 각각 1시간씩 탈수하였으며 자일렌 용액으로 1시간 동안 치환하였다.

치환된 조직에 파라핀 용액을 침투하기 위하여 60℃ 오븐에서 24시간 침투 시킨 후 파라핀 블록용 틀에 조직을 넣고 새로운 파라핀을 넣어서 포매하였다.

조직 절편기를 이용하여 5~6m 두께로 포매된 조직을 잘라 슬라이드 글라스 위에 올려놓았으며 슬라이드 글라스에서 조직이 떨어지는 것을 방지하기 위하여 37℃에서 24시간 동안 건조시킨 후 염색(ematoxyline-Eosin)을 진행하였다.

그 결과 도 10에 나타나 있듯이 창상 치유 3일째부터 수용성 가수분해물과 콜라겐 1:3으로 제조한 드레싱재에서 피하조직 위로 새로운 조직이 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며 15일에는 정상 조직은 아니지만 치유를 위한 재생의 과정으로 변형된 형태로 조직재생이 음성대조군에 비해 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.

트리코롬 염색 결과 도 11에 나타나 있듯이, 음성대조군에 비해 수용성 가수분해물과 콜라겐 1 : 3으로 제조한 드레싱재에서 시간이 지남에 따라 피부 각질화가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었으며 표피 아래에 분포하는 콜라겐 섬유가 더 치밀하게 관찰되는 것을 확인하였다. 이는 피부의 구조와 탄력을 유지시켜 원래 상태의 피부로 재생되고 있음을 의미한다.

이와 같이, 본 발명의 의료용 드레싱재는 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로 사용가능한 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용함으로써, 습윤 환경을 유지함은 물론, 공극 사이에서 세포이동이 가능하므로 경미한 상처는 물론 광범위한 창상까지 범용적으로 적용될 수 있다.

또한, 세포증식효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물을 이용함으로써, 상처치유 효과를 갖으며 상처에 적절한 습윤 환경을 제공할 수 있어 상처치유를 촉진시켜 주게 된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

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10. 누에 실샘 유래 가수분해물을 용해하여 가수분해물 용액을 준비하는 제1단계;
    상기 가수분해물 용액에 가교제를 첨가한 후, 15~30℃에서 0.5~2시간 동안 교반하여 반응시키는 제2단계; 및,
    상기 제2단계 반응 후 급속냉동건조하는 제3단계;를 포함하는,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 제1단계의 가수분해물은 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고 그 분리된 실샘을 용해한 후 원심분리하여 얻은 상등액에 알칼리를 첨가한 후, 가수분해한 다음 중화 및 탈염과정을 거쳐 얻은 것을 특징으로 하는,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 가수분해는 15~30℃에서 이루어진 것을 특징으로 하는,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
13. 제10항에 있어서,
    상기 제2단계에서 사용된 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)인,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
14. 제10항에 있어서,
    상기 제2단계에서 사용된 가교제는 가수분해물 용액 부피대비 0.1~0.5 부피%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)인 것을 특징으로 하는,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
15. 제10항 내지 제14항 중 선택된 어느 한항에 있어서,
    상기 제2단계에서 상기 가수분해물 용액에 콜라겐을 더 혼합하는,
    의료용 드레싱재의 제조방법.
    
16. 제15항에 있어서,
    상기 콜라겐은 상기 가수분해물 용액의 중량대비 1 내지 3 배인 것이 특징인,
    의료용 드레싱재의 제조방법.

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