KR101321501B1

KR101321501B1 - 조류 대장균증 백신 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101321501B1
Application number: KR1020110095277A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김태은; 조선희; 김선중; 박영호
Original assignee: 주식회사 바이오포아
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-10-29
Also published as: KR20130031931A

Abstract

본 발명은 조류 병원성 대장균 분류방법, 병원성 대장균증 백신 조성물, 이의 제조방법 및 상기 백신 조성물을 투여하여 가금류에서 대장균증을 예방하거나 경감시키는 방법에 관한 것이다.

Description

조류 대장균증 백신 조성물 및 이의 제조방법 {Vaccine composition for the protection against avian colibacillosis and method for preparation thereof}

본 발명은 조류 대장균증 백신 조성물, 상기 백신 조성물을 투여하여 가금류에서 대장균증을 예방하거나 경감시키는 방법, 및 상기 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

가금의 대장균증은 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)에 의해 발생하는 중요 세균성 질병으로, 난각 오염에 의한 부화율 감소, 제대염, 기낭염, 두부 종창증(swollen head syndrome), 봉와직염, 수란관염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염 및 급성 패혈증 등 다양한 병증을 일으키며 피해의 정도에는 차이가 있으나 거의 모든 양계장에서 대장균증으로 인한 피해를 입고 있다. 대장균증의 예외 없는 발병은 양계장에서 항생제 사용의 주된 원인이 되고 있으며, 미국의 경우 대장균증에 의한 도계품의 품질 저하로 매년 18-20억불의 피해를 입는 것으로 보고되고 있다.

국내에서 조류 병원성 대장균 발생 빈도 및 경제적 피해를 예측할 만한 근거가 부족하나 서울대학교 조류질병학교실에 의뢰된 병성감정 사례를 종합해보면, 2003년 94예 중 14예 (14.9%), 2004년 166예 중 22예(13.3%)에서 조류 병원성 대장균 (단독 또는 바이러스와의 혼합 감염)이 분리 및 동정되었다. 상당수의 대장균 사례가 현장 진단 만으로 항생제 처치가 이루어지는 점을 감안하면, 실제 발생빈도는 월등 높을 것으로 예상된다. 국내 육계 산업(약 6천억 원) 에서 5%의 생산성 저하를 초래하는 것으로 추정하여도 연간 약 300억 원의 손실이 발생되는 것으로 추정된다.

대장균은 MLEE(multi-locus enzyme electrophoresis), ribotyping 및 MLST (multi-locus sequence typing)에 의해 네 가지 (A, B1, B2, D) 계통군(phylogenetic group)으로 분류되고 있다. 또한, 반수치사농도(LD₅₀)가 5 X 10⁶ 이하인 경우 LC (lethality class) 1로, 5 X 10⁶ 내지 5 X 10⁸인 경우 LC2 로, 5 X 10⁸ 이상인 경우 LC3로 분류하고 있다. 이 외에도, 혈청형, 항생제 내성, 또는 보유한 병원성 유전자의 종류나 빈도 등에 의하여도 대장균을 분류할 수 있다.

이와 관련하여, 대장균의 병원성 관련 유전자들은 부착관련 단백질, 철 이온 획득 관련 단백질, 용혈단백질, 숙주의 항균물질 저항 단백질, 독소를 코딩하는 것으로 분류된다. 예를 들어, fimC는 섬모(fimbriae)의 조합과 고정에 관여하며, tsh(temperature-sensitive hemagglutinin)는 조류 호흡기 부착에 관여하며 기낭염과 패혈증과 관련이 있고, iucD(iron uptake compound D), fyuA(ferric yersiniabactin uptake A), irp2(iron-repressible protein 2) 및 iroN(outermembrane siderophore receptor)은 철 이온 획득과 관련되어 있으며 iss(increased serum survival)는 보체 내성과 관련이 있고, hlyF (hemolysin F)는 혈구를 용혈시키며 ompT(outermembrane protein T)는 항균 펩티드인 프로타민(protamine)과 플라스미노겐(plasminogen)을 분해하는 역할을 한다. 이외에 lt (heat-labile toxin), st (heat-stable toxin), stx1(shiga toxin 1), stx2(shiga toxin 2) 및 vat(vacuolating autotransporter toxin)와 같은 독소가 알려져 있다.

조류 병원성 대장균은 분리된 국가와 조류 숙주에 따라 병원성 유전자 빈도에 차이가 있는 것으로 알려져 있고, 지금까지의 연구 대부분이 개별 병원성 유전자의 빈도에 초점을 맞추어 있었으나, 병원성 유전자들이 어떠한 조합으로 존재하는 지와 그 조합의 빈도에 대한 연구는 상대적으로 활발하게 이루어지지 않았다.

최근의 연구에 의하면 조류 병원성 대장균은 사람의 장외병원성대장균 (Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC)으로 통칭되는 요도감염대장균(uropathogenic E. coli) 및 신생아 뇌수막염 대장균(neonatal meningitis E. coli)과 계통군 (phylogenetic group), MLST (multilocus sequence typing) 분류, 병원성 유전자 및 게놈 구조상 유사하여 인수공통전염병의 원인으로 간주되고 있어 공중보건학적으로도 그 중요성이 부각되고 있다.

대장균증의 주요 치료 전략은 감염을 일으키는 소인 또는 환경적 인자를 제어하고 항생제를 조기 사용하는 것이다. 그러나 불행히도, 테트라사이클린, 카나마이신, 네오마이신, 세팔로틴, 스트렙토마이신 및 에리트로마이신 등에 대한 내성이 상당히 빈발하는 것으로 관찰되었고, 암피실린 및 클로르암페니콜에 대한 광범위한 내성 또한 관찰되었다. 또한 분리 대장균에 대한 항생제 내성 검사를 실시한 후 효과적인 항생제를 투약하더라도 항생제 내성 패턴이 다른 몇 종의 대장균이 혼합 감염되는 사례가 적지 않아 초기에만 효과를 보이다 재발하는 사례가 관찰되고 있어 항생제 치료에 한계가 있다.

또한, 현재 가금의 대장균증 예방 백신으로서 허가를 받은 제품은 없는 실정이고, 대장균증의 피해를 본 농장에서 원인 대장균을 분리하여 백신을 제조하여 접종하는 자가백신이 유일한 대안이지만 이는 사후 대책이므로 피해를 사전에 예방할 수 없는 문제가 있다.

따라서, 문제가 되고 있는 다양한 조류 병원성 대장균들을 대표할 수 있는 균주를 함유하는 안전하고 효과적인 백신의 개발이 요구되고 있지만, 일반적으로 대장균은 병원성이 전혀 없는 것부터 급성 사망을 일으키는 것까지 그 종류가 매우 다양하여 백신으로서 유용한 대장균을 선별하는 것이 쉽지 않고, 또한 조류 병원성 대장균이라 하더라도 혈청형, 병원성, 항생제 내성, 계통학적 분류 등이 다양하여 백신 균주 선발에 어려움이 있다.

이에, 본 발명자들은 다양한 조류 병원성 대장균에 대한 방어 효능이 뛰어나고 범용적으로 사용할 수 있는 조류 대장균증 예방 백신을 개발하기 위해 노력한 결과, 다양한 대장균들의 특성을 분석하여 실제 닭에 접종하였을 때 높은 병원성이나 병변을 일으킬 수 있는 우수한 백신 종자 3주를 선발하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 대장균증에 걸린 닭에서 분리한 조류 병원성 대장균 101주를 대상으로 각각의 계통군(phylogenetic group)을 정하고, 병원성 유전자 보유 현황, 혈청형, 항생제 내성 및 시험계를 이용한 병원성 측정, 세포외막단백질(OMP) 프로필 및 지질다당류(LPS) 검사를 통해 중요 조류 병원성 대장균 3주를 선발하였다. 또한, 이들을 혼합한 사독백신을 제조하여 안전성과 효능을 평가한 결과 상기 사독백신의 안전성과 방어능이 우수하여 대장균증 백신으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인 하였고, 실제 농장에 적용한 결과 백신 접종군에서 뚜렷한 생산성 향상을 관찰함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 대장균증에 걸린 닭에서 분리한 조류 병원성 대장균 3주를 혼합한 대장균증 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 백신 조성물을 대장균증인 가금류에 투여하여 상기 가금류에서 대장균증을 예방하거나 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 대장균증 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 대장균증에 걸린 닭에서 분리한 조류 병원성 대장균 3주를 혼합한 조류 대장균증 백신 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주를 포함하는 조류 대장균증 백신 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주에 관한 것이다.

본 발명에서는 다양한 조류 병원성 대장균에 대한 방어 효능이 뛰어나고 범용적으로 사용할 수 있는 조류 대장균증 예방 백신을 제공하기 위하여, 1985년부터 2005년까지 국내에서 조류 대장균증에 걸린 닭에서 분리한 대장균 101주를 대상으로 각각의 계통군(A, B1, B2, D)을 결정하고 보유한 병원성 유전자 조합에 따라 27개의 분자병원성형(molecular pathotype, MP)으로 분류하였으며, 혈청형, 항생제 내성 및 시험계를 이용하여 병원성을 측정하고, 세포외막단백질(OMP) 프로필 및 지질다당류(LPS) 검사를 실시하였다(실시예 1 참조).

그 결과, 닭에서 중요한 항혈청인 O78 과 공중보건학적으로 중요한 O18을 포함하고, OMP와 LPS 패턴이 서로 다르며, 다수의 병원성 유전자를 보유하여 균주를 혼합했을 때 모든 병원성 유전자를 함유할 수 있으며, 다양한 항생제에 대한 내성 및 다약제 내성을 가져 이들에 대한 항체 생산 가능성이 높으며, 모든 종류의 lethality class를 포함하여, 실제 닭에 접종하였을 때 높은 병원성이나 병변을 일으킬 수 있는 균주로서, 최종적으로 E22, E89 및 E102 균주를 선발하게 되었다. 또한, 이들 균주를 각각 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 4월 4일로 기탁하고 각각 수탁번호 KACC91639P, KACC91640P 및 KACC91641P 를 부여받았다.

에스케리치아 콜라이 E22 균주(KACC91639P)는 계통군 B2이고, 반수치사율농도(LD₅₀)에 따라 LC2로 분류되었으며 암피실린, 엔로플로사신, 스트렙토마이신, 설포메독사졸/트리메도프림 및 테트라마이신에 대하여 내성을 가지며, 혈청형은 O18형이고, 병원성 유전자 iroN - fimC -ompT-hlyF-iucD-fyuA-irp2-tsh-vat 을 가지고 있어 MP24로 분류되었다.

에스케리치아 콜라이 E89 균주(KACC91640P)는 계통군 D이고, 반수치사율농도에 따라 LC1으로 분류되었으며 암피실린, 엔로플로사신, 스트렙토마이신 및 테트라마이신에 대하여 내성을 가지며, 혈청형은 사용한 항혈청으로는 결정되지 않았고, 병원성 유전자 iroN - fimC - ompT - hlyF -iucD-iss-fyuA-irp2-tsh을 가지고 있어 MP25로 분류되었다.

에스케리치아 콜라이 E102 균주(KACC91641P)는 계통군 B1이고, 반수치사율농도에 따라 LC3로 분류되었으나 피하접종 시 봉와직염이 뚜렷이 관찰되었고, 암피실린, 클로람페니콜, 엔로플로사신, 스트렙토마이신 및 테트라마이신에 대하여 내성을 가지며, 혈청형은 O78형이고, 병원성 유전자 iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2 - tsh을 가지고 있어 MP25로 분류되었다.

또한, 상기 세 균주는 도 2와 같은 OMP 프로필 및 도 3과 같은 LPS 프로필을 가지는 특징이 있다.

본 발명은 상기 분리된 병원성 대장균 3주를 포함하는 대장균증에 대한 백신 조성물을 제공하며, 이러한 백신 조성물은 다양한 조류 병원성 대장균 항원을 포함하고 있으므로 다양한 조류 병원성 대장균에 대한 방어 효능이 뛰어난 특징이 있다.

본 발명에서 용어, "조류 대장균증"은 조류 병원성 대장균(Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)에 의해 발생하며, 난각 오염에 의한 부화율 감소, 제대염, 기낭염, 두부 종창증, 봉와직염, 수란관염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염 및 급성 패혈증 등 다양한 병증을 일으키는 세균성 질병을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 사독 백신 조성물이다.

본 발명에서 용어, "사독 백신"은 불활화 백신, 불활성화 백신, 사균 백신 또는 사백신 등으로 용어를 대체할 수 있으며, 물리적 또는 화학적 처리에 의해 사멸시킨 균을 포함하는 백신을 말한다. 불활화된 세균은 생약독화 세균에 비해 안전하다는 장점이 있다. 본 발명의 사독 백신은 겔 백신과 오일 백신을 모두 포함하며, 공지된 방법으로 용이하게 제조 가능하다. 예컨대 백신 균주를 포름알데히드 또는 포르말린(37% 포름알데히드) 처리, 자외선 또는 X-선에 의한 조사, 또는 열처리에 의해 불활화 함으로써 제조할 수 있다.

보다 바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 열처리에 의해 불활화한 사독 백신 조성물이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 열처리 백신 접종군 및 포름알데히드 처리 백신 접종군 모두 백신 접종 3주 후 병원성이 높은 대장균을 공격 접종하였을 때 1주일 후 0%의 폐사율을 보여 방어능이 우수하였고, 두 백신 접종군 모두 대조군 대비 임상증상이 관찰되지 않았고 폐사도 일어나지 않아 안전한 것으로 판단되었다. 또한, 내부 장기의 병변 예방 효능은 열처리 백신이 포르말린 포름알데히드 불활화 백신보다 우수하였고, 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion) 제조 후에도 보다 균질하여 사독오일백신 제조에 최적이었으므로, 열처리 백신이 보다 바람직한 양태로 제공될 수 있다. 나아가, 본 발명의 백신 조성물을 실제 농장에 적용한 결과 백신 접종군에서 무접종군 대비 높은 산란율을 보였으므로, 뚜렷한 생산성 향상에 기여할 수 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 2 참조).

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 면역증강제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 면역증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다(Warren et al., 1986,Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 면역증강제는 임의의 다양한 면역증강제를 포함하며, 전형적인 면역증강제로는 프로인트 면역증강제(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 상기 면역증강제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 오일 면역증강제를 포함할 수 있다.

유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)에 사용하기에 적합한 오일 면역증강제로는, 예를 들어 미네랄 오일 또는 대사 가능한 오일이 있다. 미네랄 오일로는, 예를 들어 베이올(Bayol®), 마르콜(Marcol®) 및 드라케올(Drakeol®) 을 예시할 수 있다. 대사 가능한 오일로는, 예를 들어 땅콩유 및 대두유 등의 식물유, 어유 스쿠알란 및 스쿠알렌 등의 동물유, 및 토코페롤 및 그 유도체를 예시할 수 있다

또한, 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 대장균증인 가금류에 투여하여 상기 가금류에서 대장균증을 예방하거나 경감시키는 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 가금류는 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추라기, 꿩 또는 비둘기를 포함하며, 바람직하게는 닭, 오리, 거위 또는 칠면조, 보다 바람직하게는 닭을 포함한다.

본 발명의 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 바람직하게, 본 발명의 백신 조성물의 면역학적 유효량이 약 10⁶내지 10⁹ CFU이다. 그러나 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 동물의 나이, 성별, 체중, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대장균증 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은

1) 수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주를 배양 및 혼합하는 단계;

2) 상기 균주 혼합액을 열처리 하는 단계; 및

3) 상기 열처리된 균주 혼합액에 오일을 첨가하는 단계;

를 포함하는 조류 대장균증 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 단계 1)은 선발된 백신 균주를 배양 및 혼합하는 단계로서, 균주의 배양은 정지 배양, 관류 배양, 진동 배양, 회전관 배양, 회전병 배양, 현탁 배양, 마이크로 캐리어 배양 등이 당업자의 선택에 따라 채용될 수 있고, 다양한 상업적 이용이 가능한 동물 세포 배양 장치가 이용될 수 있다.

상기 단계 2)는 균주 혼합액에 열처리를 하여 균주를 불활화시키는 단계로서, 바람직하게는 50 내지 70℃ 에서 30 내지 120분간 처리할 수 있고, 보다 바람직하게는 약 65℃에서 약 90분간 처리할 수 있다. 백신균의 불활화도는, 예컨대 백신 1mL 를 일반배지에 도포하였을 때 집락이 관찰되지 않는 것으로 확인할 수 있다.

상기 단계 3) 은 상기 열처리된 균주 혼합액에 오일을 첨가하는 단계이다. 오일 면역증강제로는 미네랄 오일 또는 비미네랄 오일을 사용할 수 있으며, 균주 혼합액과 오일을 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 4:6 또는 3:7의 중량비로 혼합할 수 있다. 오일 에멀젼 제조 후 광학현미경 하에서 전체적으로 균질도를 평가하여, 세부적으로는 세균 크기(0.5 um x 2 um)의 에멀젼보다 큰 에멀젼이 존재하는지 여부를 확인하여 백신의 품질을 평가할 수 있고, 에멀젼 한 방울을 수면 위에 떨어뜨렸을 때 퍼지지 않는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제조 과정 중에 본 발명의 불활성 균주의 바람직한 적정값를 얻기 위해 적당한 희석제로 희석하거나, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 기타 면역증강제가 첨가될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 백신은　다양한 조류 병원성 대장균 항원을 포함하고 있어 다양한 조류 병원성 대장균에 대한 방어효능이 뛰어나고, 사전에 범용성의 백신을 접종하므로 대장균에 의한 피해를 사전에 예방할 수 있고, 개별 농장의 시간과 노력을 줄여줄 수 있을 것으로 기대된다. 또한 해마다 증가하고 있는 다약제 내성 대장균으로 인한 항생제 비용 지출 절감과 나아가 무항생제 계육 및 계란 생산을 위한 방안을 제시해 줄 것으로 기대되고, 인수공통전염병의 위험성을 갖는 대장균 예방을 통해 식품안전성 증진에 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 E22, E79, E31, E26, ATCC11775 및 ATCC43896 균주의 혈청형 검사 결과를 나타낸다.
도 2는 E22, E31, E64, E89, E102 및 E143 균주의 OMP 프로필을 나타낸다.
도 3은 E22, E31, E64, E89, E102, E143, ATCC11775, ATCC23525, E35 및 E79 균주의 LPS 염색 결과를 나타낸다.
도 4(a) 는 공격접종 후 백신 무접종군에서 봉와직염이 발생함을 나타내는 사진이고(붉은 화살표가 봉와직염 병변을 나타냄), 도 4(b)는 열처리 백신 접종군에서 무병변이 관찰됨을 나타내는 사진이다.
도 5(a)는 DHJ 육용 종계 농장에서 대장균 백신 접종군(100515, 백신1)과 무접종군 (090424, 대조1)간 산란율을 비교한 그래프이며, RO 표준은 해당 품종의 종계가 최적의 상태에서 도달할 수 있는 평균 산란율을 나타낸다. 도 5(b)는 MK 육용 종계 농장에서 대장균 백신 접종군(100601, 백신2)과 무접종군 (090526, 대조2)간 산란율을 비교한 그래프 이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백신 후보 균주 선발

1-1. 백신 후보 균주의 수집

1985년부터 2005년까지 서울대학교 조류질병학실에서 분리한 101주의 조류 병원성 대장균 균주들을 제공받아 본 발명에 사용하였다.

1-2. 계통군 결정( phylogenetic grouping )

대장균의 병원성 정도를 계통군으로 예측할 수 없으나 대장균을 분류하는 일반적인 방법이므로 Clermont 등의 방법을 수정하여 실시하였다. 즉, chuA 유전자 유무를 확인하기 위해 chuAF (5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3', 서열번호 1) 및 chuAR(5'- TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3', 서열번호 2) 프라이머, yjaA 유무를 확인하기 위해 yjaMF (5'-TGAAGTGTCAGGAGAYGCTG-3', 서열번호 3) 및 yjaMR (5'- ATGRAGAATGCGTTCCTCAAC-3', 서열번호 4) 프라이머, TspE4C2 유무를 확인하기 위해 TspE4C2F (5'-GAGTAATGTCGGG GCATTCA-3', 서열번호 5) 및 TspE4C2MR (5'- CGCGYCAACAAAGTATTRCG-3', 서열번호 6) 프라이머를 각각 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 10 x buffer 2㎕, dNTPs (2.5mM each) 2㎕, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA 중합효소 (5U/㎕; iNtRON Biotechnology Co., Seoul, ROK) 0.2㎕, DW 12.8㎕ 및 주형 DNA (50ng/㎕) 1㎕ 이었고, 온도는 94 -3분, (94℃-30초, 50℃-20초, 72℃-1분)x40회, 72℃-5분간 반응하였다. 그 결과 계통군 A는 39.5%(34/86), B1은 23.3%(20/86), B2는 22.1%(19/86), D는 15.1%(13/86)의 빈도를 보였으며, E22 균주는 계통군 B2, E89 균주는 계통군 D, 및 E102 균주는 계통군 B1 을 나타내었다.

1-3. 항생제 내성 검사

상기 실시예 1-1의 백신 후보 대장균을 OD₆₀₀=1.0으로 키운 후 1/10 로 희석하여(5 X 10⁷CFU/㎖) 한천 플레이트(Mueller Hinton agar plate) 당 1ml 을 넣고 500㎕ 정도를 회수한 후 플레이트를 충분히 말렸다. 암피실린(Ampicillin; Ap) 10㎍, 클로람페니콜(Chloramphenicol; Cm) 30㎍, 겐타마이신(Gentamicin; Gm) 120㎍, 엔로플로사신(Enrofloxaxin; ENR) 5㎍, 스트렙토마이신(Streptomycin, Sm) 10㎍, 설포메독사졸/트리메도프림(Sulfomethoxazole /trimetoprim; SXT) 25㎍, 및 테트라마이신(Tetracycline; Tc) 30㎍ 디스크를 준비하여 대장균이 접종된 플레이트에 올린 후 밤새 배양한 다음 억제대를 읽었다.

또한, 스트렙토마이신과 테트라사이클린 내성과 관련된 strA - strB와 tetA, tetB, 그리고 다약제 내성과 관련된 class 1 integron 검출을 위해 PCR을 수행하였다. 프라이머로는 strABF 5'-TATCTGCGATTGGACCCTCTG-3'(서열번호 7) 및 strABR 5'-CATTGCTCATCATTTGATCGGCT-3' (서열번호 8); tetAF, 5'-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3' (서열번호 9) 및 tetAR, 5'-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3' (서열번호 10); tetBF, 5'-TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG-3' (서열번호 11) 및 tetBR, 5'-GTA ATGGGCCAATAACACCG-3' (서열번호 12); integron 5'CS, 5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3' (서열번호 13) 및 integron 3'CS, 5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3' (서열번호 14)을 사용하였다.

PCR 반응액은 10 x buffer 2㎕, dNTPs (2.5mM each) 2㎕, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA 중합효소(5U/㎕; iNtRON Biotechnology Co., Seoul, ROK) 0.2㎕, DW 12.8㎕ 및 주형DNA (50ng/㎕) 1㎕ 이었고, 온도는 94℃-3분, (94℃-30초, 50℃-20초, 72℃-4분)x40회, 72℃-5분간 반응하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 균주 별로 다양한 항생제 내성을 나타내었다. 하기 표에서 R (resistant)은 항생제 내성을 나타내고, I (intermediate)는 중정도의 내성을 나타내고, S (susceptible)는 항생제 감수성을 나타낸다.

균주	항생제　 디스크 검사							PCR			인테그론 (integron)
균주	Ap	Cm	Gm	ENR	Sm	SXT	Tc	strAB	tetA	tetB	인테그론 (integron)
E22	R	I	I	R	R	R	R	-	-	-	-
E31	I	S	I	I	R	S	R	+	-	+	-
E64	R	S	R	S	I	R	I	-	-	-	-
E89	R	S	I	R	R	S	R	-	+	-	-
E102	R	R	I	R	R	S	R	+	+	-	-
E143	R	I	I	R	R	R	R	+	+	-	-

1-4. 혈청형 검사

한천 플레이트(Maconkey agar plate)에 세균을 접종하고(streaking), 단일 콜로니(single colony)를 취하여 LB 배지(broth) 3㎖ 에 배양한 후, TSA 한천 플레이트에　1㎖ 를 도말하고 밤새 배양하였다. 다음으로, TSA 한천 플레이트 상의 균을 모아 0.85% NaCl 로 1회 세척하였다. 모아진 균액이 OD₆₀₀=3.6 이 되도록 조정한 후, 위의 균액을 튜브에 담고 1시간 가열(boiling) 한 후 실온에 정치하여 냉각(cooling) 하였다. 다음으로, 항원과 혈청을 다음 표 2와 같은 비율로 만들어 96웰 플레이트의 하나의 웰당 50㎕씩 첨가하여 37℃ 배양기(incubator)에서 밤새 배양 후 결과를 읽었다.

항원	0.85% NaCl	포름알데히드	크리스탈 바이올렛 (1%)	1/4 희석
250ul	740ul	5ul	5ul	50ul/웰
혈청	1% NaN3 in 0.85% NaCl	-	-	1/8 희석
125ul	875ul	-	-	50ul/웰

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, E22 균주의 혈청형은 O18형, E79 균주는 O20형, E31 균주는 O26형으로 각각 판명되었고, 같은 방법으로 혈청형을 조사한 결과 E89는 사용한 항혈청과는 반응하지 않아 혈청형이 결정되지 않았고, E102는 O78형 이었다.

1-5. 병원성 유전자 검사

대장균 균주에서 다음과 같은 병원성과 관련된 유전자의 분포를 PCR과 염기서열분석법에 의해 조사하였다. 조사한 유전자는 다음과 같다: fimC, tsh, iucD, fyuA, irp2, iroN, hlyF, ompT, lt, st, stx1, stx2, vat.

우선, 대장균을 OD₆₀₀=1.0으로 키우고 1/5 로 희석한 후(1X10⁸CFU/㎖) 원심분리 하여 상층액을 제거하고 세균을 모았다. 세균의 전체 DNA는 G-spin(for bacteria, iNtRON Biotechnology, 대한민국) 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다.

병원성 유전자의 유무를 알아보기 위해 아래 표 3의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 10×buffer 2㎕, dNTPs (2.5mM each) 2㎕, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA 중합효소 (5U/㎕; iNtRON Biotechnology Co., Seoul, ROK) 0.2㎕, DW 12.8㎕ 및 주형DNA (50ng/㎕) 1㎕ 이었고, 온도는 94℃-3분, (94℃-30초, 50℃-20초, 72℃-1분)x40회, 72℃-5분간 반응하였다.

유전자	프라이머 서열(5'-3')	Amplicon size (bp)	서열번호
fimC	F: GGAAATAACATTCTGCTTGC R: TTTGTTGCATCAAGAATACG	288	15 16
fyuA	F: CAACATCGTCACCCAGCAG R: CGCAGTAGGCACGATGTTGTA	949	17 18
hlyF	F: GGCGATTTAGGCATTCCGATACTC R: ACGGGGTCGCTAGTTAAGGAG	599	19 20
irp2	F: AAGGATTCGCTGTTACCGGAC R: TCGTCGGGCAGCGTTTCTTCT	280	21 22
iroN	F: AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG R: GACGCCGACATTAAGACGCAG	667	23 24
iss	F: AGCAACCCGAACCACTTGATG R: TAATAAGCATTGCCAGAGCGG	329	25 26
iucD	F: GTGAGTTGTACCACCGTTTT R: CCATTCCAGAGTGAAGTCAT	278	27 28
lt	F: ATGAGTACTTCGATAGAGG R: ATG GTATTCCACCTA ACGC	279	29 30
ompT	F: ATCTAGCCGAAGAAGGAGGC R: CCCGGGTCATAGTGTTCATC	559	31 32
st	F: TCTGTATTGTCTTTTTCACCTTTC R: TTAATAGCACCCGGTACAAGC	165	33 34
stx1A	F: CAGTTAATGTGGTGGCGAAG R: CTGCTAATAGTTCTGCGCATC	895	35 36
stx2A	F: CTTCGGTATCCTATTCCCGG R: GGATGCATCTCTGGTCATTG	482	37 38
tsh	F: GGGAAATGACCTGAATGCTGG R: CCGCTCATCAGTCAGTACCAC	420	39 40
vat	F: TCCTGGGACATAATGGTCAG R: GTGTCAGAACGGAATTGT	981	41 42

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 균주별로 다양한 병원성 유전자 조합을 가지고 있었고, 그에 따라 27개의 분자병원성형(molecular pathotype, MP)으로 분류되었으며 이들 중 MP19는 21.8% 이었고, MP25는 22.8%를 차지하여 가장 빈발하는 MP25 임을 알 수 있었다.

분자병원성형 (MP)	병원성 유전자	빈도	균주(혈청형/계통군)
MP1	iroN - ompT	1.0%	E68(A)
MP2	iroN - fimC - ompT	3.0%	E19(D), E31 (O78/A), E127 (O18/B1)
MP3	iroN - fimC - hlyF	1.0%	E18(A)
MP4	iroN - fimC - ompT - hlyF	3.0%	E10(A), E51(A), E103 (O78/A)
MP5	iron - fimC - ompT - tsh	1.0%	E21(B1)
MP6	iroN - fimC - hlyF - iss	2.0%	E136(B1), E145(A)
MP7	iroN - fimC - iucD - iss	1.0%	E43 (O78/B2)
MP8	iroN - ompT - hlyF - iss	1.0%	E66(D)
MP9	iroN - iucD - fyuA - irp2	1.0%	E20(A)
MP10	iroN - fimC - ompT - hlyF - iss	11.9%	E11(B1), E24 (O78/A), E55(D), E84(A), E90(D), E95(B2), E101, E114 (O78), E116(B1), E117(A), E118, E125 (O78)
MP11	iroN - fimC - ompT - fyuA - irp2	1.0%	E36 (O78/A)
MP12	iroN - ompT - hlyF - iucD - iss	1.0%	E26 (O115/A)
MP13	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - tsh	5.9%	E5(B1), E16(B1), E17(B1), E25(B1), E29(B1), E141
MP14	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss	2.0%	E132, E142
MP15	iroN - fimC - ompT - iss - fyuA - irp2	1.0%	E144
MP16	iroN - ompT - iucD - fyuA - irp2 - tsh	1.0%	E28 (O78/D)
MP17	iroN - ompT - iucD - iss - fyuA - irp2	1.0%	E41(A)
MP18	iroN - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2	1.0%	E133(A)
MP19	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - tsh	21.8%	E1(A), E12(B1), E13(B1), E14(B1), E15 (A), E48(B2), E52(B2), E53(B1), E69 (B1), E70(B2), E79(O20/B1), E86(A), E109(D), E110(B2), E111(B2), E112(A), E115(O78/A), E119(B2), E120(B2), E124 (B2), E131, E138(A)
MP20	iroN - fimC - ompT - iss - fyuA - irp2 - vat	1.0%	E129 (O1)
MP21	iroN - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2	3.0%	E32(A), E33(A), E37(D)
MP22	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - tsh	1.0%	E146
MP23	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - fyuA - irp2 - tsh	2.0%	E39(B1), E104 (O78/B1)
MP24	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - fyuA - irp2 - tsh - vat	2.0%	E22 (O18/B2), E35 (O18/D)
MP25	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2 - tsh	22.8%	E27(A), E30(O78/A), E42(A), E49 (O78/B2), E61 (O78/B2), E62(B2), E75 (O78/B1), E89(D), E91(A), E102, (O78/B1), E105(O78/A) E106(O78/A), E107(O78), E108(O78/A), E113(A), E123(O78/A), E126(D), E130(B2), E135(A), E137, E139(A), E140, E143
MP26	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2 - vat	3.0%	E23(D), E38(D), E64(B2)
MP27	iroN - fimC - ompT - hlyF - iucD - iss - fyuA - irp2 - tsh - vat	4.0%	E9(B2), E59(B2), E65(B2), E88(D)

1-6. OMP ( outer membrane protein ) 프로필 조사

대장균을 OD₆₀₀=1.0으로 20㎖ 키운 후 원심분리하여 세포를 모으고(1 X 10¹⁰CFU) 동량의 PBS용액으로 1회 세척하였다. 다시 원심분리하여 세포를 모으고 2㎖ 버퍼Ⅰ(50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM MgCl₂, 2% SDS) 용액에 부유하여 37℃/18시간 배양하였다. 다음으로, 12,000rpm/30분/20℃ 의 조건으로 원심분리하여 세포를 400㎕ 버퍼Ⅱ(50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM MgCl₂, 5mM EDTA, 1% SDS, 0.05% 2-머캅토에탄올) 용액에 부유하여 37℃ 에서 2시간 배양하였다. 다음으로, 12,000rpm/30분/20℃ 의 조건으로 원심분리하여 세포를 200㎕ 버퍼 Ⅲ(50mM Tris-HCl pH8.0,　5mM EDTA, 0.2% SDS, 0.4M NaCl) 용액에 부유하여 37℃ 에서 2시간 배양하였으며, 다시 12,000rpm/30분/20℃ 의 조건으로 원심분리하여 상등액을 모아 OMP 를 준비하였다.

OMP 를 도은 염색(silver staining) 하기 위하여, 상기에서 추출한 OMP를 5X 로딩 버퍼와 섞은 후 1분간 끓이고 트리스-글라이신 SDS 젤(12%)에 18㎕ 씩 로딩한 후 160vol/60mA로 80분간 전기영동 하였다. Fix Solution에서 5분간 젤을 배양한 후 증류수로 2회 세척하였으며, 젤을 Oxidize Solution에서 20분간 배양하고, 증류수를 수 회 교체하며 30분간 세척하였다. 그 후, Staing Solution에 10분간 배양하고 증류수를 수 회 교체하며 15분간 세척하였고, Developing Solution을 넣어 밴드가 나타나는지 확인하고 밴드가 나타나면 Stop Solution을 넣어 반응을 종료하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, E22, E89, E102의 OMP PAGE 밴드 패턴 상 뚜렷한 차이를 보여 주어 OMP의 조성에 차이가 있음을 알 수 있었다.

1-7. LPS ( Lipopolysaccharide ) 검사

OD₆₀₀=1.0으로 키운 대장균 배양액 2ml을 원심분리하여 세포를 모으고, 용해 버퍼 1㎖을 넣고 볼텍스(vortex) 하였다. 클로로포름 200㎕ 첨가 후 다시 볼텍스하고, 실온에서 10분 배양하였다. 다음으로, 13,000rpm/15분/4℃ 의 조건에서 원심분리하여 상층액 400㎕를 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고, 정제 버퍼 800㎕를 첨가하고 혼합하였다. -20℃에서 10분 배양 후, 원심분리 13,000rpm/15분/4℃ 의 조건에서 원심분리하여 상층액을 버리고, LPS 펠렛에 75% EtOH 1㎖을 첨가하여 세척한 후, 얻어진 LPS 펠렛을 건조시키고, 10mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0) 40㎕를 첨가하여 용해시키고, 프로테이나제 K(40㎎/㎖) 5㎕를 첨가하고 55℃에서 1시간 반응시켜 LPS 를 추출하였다.

LPS 를 도은 염색(silver staining) 하기 위하여, 상기 추출한 LPS를 2X 로딩 버퍼와 섞은 후 1분간 끓이고 트리스-글라이신SDS 젤(12%)에 18㎕ 씩 로딩한 후 160vol/60mA로 70분간 전기영동 하였다. Fix Solution에서 5분간 젤을 배양한 후 증류수로 2회 세척하였고, 젤을 Oxidize Solution에서 20분간 배양하고, 증류수를 수 회 교체하며 30분간 세척하였다. 그 후, Staing Solution에 10분간 배양하고 증류수를 수 회 교체하며 15분간 세척하였고, Developing Solution을 넣어 밴드가 나타나는지 확인하고 밴드가 나타나면 Stop Solution을 넣어 반응을 종료하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, E22, E89, E102의 LPS PAGE 밴드 패턴 상 뚜렷한 차이를 보여 주었다.

1-8. 병원성 검사

2주령의 산란계 수평아리에 E9, E22, E29, E30, E43, E64, E89, E102, E104, E115, E129, E138을 7일령 병아리의 피하로 접종하여 lethality class를 알아본 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, E64와 E89는 LC1으로 병원성이 높았고, E22, E104, E138은 LC2로 중간 정도의 병원성을 보였으며 E29, E30, E43, E102, E115, E129는 LC3로 급성적인 폐사가 높지 않았으나 전형적인 다발성 장막염과 봉와직염을 보여 병원성이 있었다.

균주(분자병원성형/혈청형/계통군)	Lethality classes (LC) (Lesion)
E64 (MP26/UT/B2)	LC1
E89 (MP25/UT/D)	LC1
E22 (MP24/O18/B2)	LC2
E104 (MP23/O78/B1)	LC2
E138 (MP19/UT/A)	LC2
E9 (MP27/UT/B2)	LC3
E29 (MP13/UT/B1)	LC3
E30 (MP25/O78/A)	LC3
E43 (MP7/O78/B2)	LC3 (polyserositis)
E102 (MP25/O78/B1)	LC3 (polyserositis/cellulitis)
E115 (MP19/O78/A)	LC3 (polyserositis/cellulitis)
E129 (MP20/O1/ND)	LC3

1-9. 백신 균주의 선발

상기 실시예 1-1 내지 1-8 의 결과를 토대로 하여, 닭에서 중요한 항혈청인 O78 과 공중보건학적으로 중요한 O18을 포함하고, OMP와 LPS 패턴이 서로 다르며, 다수의 병원성 유전자를 보유하여 균주를 혼합했을 때 모든 병원성 유전자를 함유할 수 있으며, 다양한 항생제에 대한 내성 및 다약제 내성을 가져 이들에 대한 항체 생산 가능성이 높으며, 모든 종류의 lethality class를 포함하여, 실제 닭에 접종하였을 때 높은 병원성이나 병변을 일으킬 수 있는 균주를 선발한 결과, E22, E89 및 E102 균주를 조류 대장균증 백신 제조를 위한 균주로 최종 선발하였다.

실시예 2. 백신의 효능 평가

2-1. 사독 백신의 제조

한천 배지(Maconkey agar plate)에 E22, E89 및 E102 균주를 키우고 다음날 하나의 집락을 취하여 LB 배지(broth) 200ml 에 배양하였다. 5L 발효기에 LB 배지 3.5L를 준비하여, 미리 배양해둔 백신 균주를 최종 OD₆₀₀=0.05가 되도록 접종하고 OD₆₀₀=2.0이 되도록 배양한 후 각각의 백신 균주가 5.0X10⁸CFU/㎖이 되도록 조정하였고 각각을 2㎖씩 혼합하여 혼합 균주액을 2개 튜브에 만들었다. 이를 2배 용량의 PBS로 1회 세척 후 PBS 12㎖에 부유하였고, 한 튜브는 65℃ water bath에서 90분간 열처리를 하고, 다른 튜브는 포름알데히드를 최종 0.3%가 되도록 첨가하여 실온에서 18시간 동안 튜브를 로테이션하며 대장균을 불활화시켰다. 불활화 이후 대장균 혼합액 1ml을 고체배지에 발라 완전히 불활화 되었는지 확인하였고, 불활화시킨 대장균 혼합액에 백신제조용 오일을 4:6의 비율로 첨가하여 오일 에멀젼 백신을 제조하였다.

2-2. 방어능 평가

2주령 갈색 산란계를 세 그룹으로 나누어, 한 그룹은 백신을 접종하지 않고(27수) 나머지 두 그룹은 각각 실시예 2에서 제조한 열처리 백신(1dose혼합 사균당 1x10⁸CFU, 24수) 및 포름알데히드 처리 백신(1dose혼합 사균당 1x10⁸CFU, 26수)을 근육 접종하였다. 백신 접종 3주 후 병원성이 높은 대장균 E89 및 E143 을 수당 10⁹이 되도록 근육에 각각 공격접종하고 1주일 후 폐사율 및 병변을 확인하였다. 이 때, 공격 균주 E89의 접종량은 1.8 X 10⁹,　E143은 1.7 X 10⁹이었다.

그 결과, 표 6 에 나타낸 바와 같이, 백신 무접종군에서는 각각 100%(E89 공격군)와 84.6%(E143 공격군)의 폐사율을 보인 반면, 열처리 백신 접종군 및 포름알데히드 처리 백신 접종군에서는 0%의 폐사율을 보였다. 또한, 표 7에 나타낸 바와 같이, 내부 장기의 병변 예방 효능은 열처리 백신이 포름알데히드 불활화 백신보다 우수하였다.

실험군	접종량(CFU) /경로	공격 균주	시험 계수	공격 후 일간 누적 폐사 수							병변		폐사율(%)
실험군	접종량(CFU) /경로	공격 균주	시험 계수	1	2	3	4	5	6	7	경증	중증	폐사율(%)
무접종	-	E89	14	8	13	13	13	13	14	14	-	-	100
무접종	-	E143	13	5	9	9	9	11	11	11	0/2	2/2	84.6
열처리 백신	1dose 10⁸/IM	E89	12	0	0	0	0	0	0	0	1/12	0/12	0.0
열처리 백신	1dose 10⁸/IM	E143	12	0	0	0	0	0	0	0	1/12	0/12	0.0
포름알데히드 처리백신	1dose 10⁸/IM	E89	13	0	0	0	0	0	0	0	4/13	0/13	0.0
포름알데히드 처리백신	1dose 10⁸/IM	E143	13	0	0	0	0	0	0	0	5/13	0/13	0.0

백신	공격		대장균분리(Li)	병변
백신	공격		대장균분리(Li)	간 병변	봉와직염	심낭염
열처리 백신	E89	12수	0/12	0/12	0/12	1/12
열처리 백신	E143	12수	0/12	0/12	0/12	1/12
포름알데히드 처리백신	E89	13수	0/13	2/13	1/13	0/13
포름알데히드 처리백신	E143	13수	0/13	5/13	4/13	0/13
무접종	E89	14수	-	-	-	-
무접종	E143	13수	0/2 (기낭에서 1/1 분리)	0/2	2/2	0/2

2-3. 안전성 평가

2주령 갈색산란계 수평아리 15수에 실시예 2-1에서 제조한 사독오일백신을 수당 10 dose(5x10⁹CFU) 로 근육 주사하였고, 무접종 대조군 15수와 동일한 공간에 사육하며 임상증상 및 폐사유무를 1주일간 관찰하였다. 그 결과 대조군 대비 뚜렷한 임상증상이 관찰되지 않았고, 폐사도 일어나지 않아 본 발명의 사독백신은 안전한 것으로 판단되었다.

또한, 2주령 갈색산란계 수평아리에 열처리한 사독오일백신과 포름알데히드 처리한 사독오일백신 1dose를 접종 1일 후에 무접종 대조군의 시험계들과 체온을 비교한 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 열처리 사독오일백신 군의 경우 40.9℃ 내지 41.99℃, 포름알데히드 처리 사독오일백신의 경우 40.93℃ 내지 41.93℃, 및 무접종 대조군의 경우 41.21℃ 내지41.88℃ 로써 정상체온인 40.6℃ 내지 41.7℃를 보였고, 시험군 간 평균 체온의 유의적인 차이를 보이지는 않아 (P<0.05), 본 발명의 사독백신은 안전한 것으로 판단되었다.

시험군	열처리 사독오일백신	포름알데히드 처리 사독오일백신	무접종 대조군
시험계 체온 (℃)	41.77	41.4	41.88
	41.78	41.37	41.14
	41.88	41.54	41.39
	41.33	41.52	41.71
	41.71	40.93	41.59
	41.99	41.57	41.78
	41.64	41.48	41.4
	41.97	41.94	41.62
	41.64	41.69	41.75
	41.92	41.75	41.29
	41.45	41.58	41.69
	41.53	41.45	41.47
	41.81	41.6	41.79
	41.43	41.29	41.51
	41.75	41.01	41.53
	41.53	-	41.25
	41.46	-	41.62
	40.9	-	41.21
	41.29	-	41.39
	-	-	41.51
평균 체온(℃)	41.62	41.47466667	41.526
표준편차	0.27	0.26	0.21

2-4. 대장균 백신이 육용 종계 생산성에 미치는 영향

DHJ 육용 종계 농장에서 대장균 백신 접종군(100515, 백신1)과 무접종군 (090424, 대조1)간 산란율을 비교한 결과, 백신 접종군의 경우 무접종군 대비 높은 산란율을 보이고 있어 뚜렷한 생산성 향상을 보였다. RO 표준은 해당 품종의 종계가 최적의 상태에서 도달할 수 있는 평균 산란율을 의미하며 백신 접종군은 27주와 33주 사이에는 RO 표준보다 오히려 높은 산란율을 나타냈다(도 5a 참조).

또한, MK 육용 종계 농장에서 대장균 백신 접종군(100601, 백신2)과 무접종군 (090526, 대조2)간 산란율을 비교한 결과, 백신 접종군의 경우 25주와 36주 사이에 무접종군 대비 높은 산란율을 보이고 있어 뚜렷한 생산성 향상을 보였다(도 5b 참조). 이러한 결과는 선발된 대장균 혼합 백신이 실제 농장에서 효과적이라는 사실을 입증하는 것으로 백신주 선발이 성공적으로 이루어졌음을 증명하는 결과이다.

농업생명공학연구원

KACC91639P

20110404

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농업생명공학연구원

KACC91641P

20110404

서열목록 전자파일 첨부

Claims

수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주를 포함하는 조류 대장균증 백신 조성물.
제1항에 있어서, 열처리에 의하여 불활화된 백신 조성물.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 백신 조성물.
제3항에 있어서, 상기 면역증강제는 오일 면역증강제인 백신 조성물.
제1항의 백신 조성물을 대장균증인 가금류에 투여하여 상기 가금류에서 대장균증을 예방하거나 경감시키는 방법.
제5항에 있어서, 상기 가금류가 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 및 비둘기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 백신 조성물의 면역학적 유효량이 약 10⁶ 내지 10⁹ CFU 인 방법.
1) 수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주, 수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주 및 수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주를 배양 및 혼합하는 단계;
2) 상기 균주 혼합액을 열처리 하는 단계; 및
3) 상기 열처리된 균주 혼합액에 오일을 첨가하는 단계;
를 포함하는 제1항의 조류 대장균증 백신 조성물을 제조하는 방법.
수탁번호 KACC91639P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E22 균주.
수탁번호 KACC91640P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E89 균주.
수탁번호 KACC91641P 의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) E102 균주.