KR101325186B1

KR101325186B1 - 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제

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Publication number: KR101325186B1
Application number: KR1020080007032A
Authority: KR
Inventors: 최영철; 김선회; 김지영; 김미나; 이의진; 이은주; 이미영; 정소림; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2013-11-07
Also published as: KR20090081125A

Abstract

본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 항암제는 암세포의 성장 및 전이를 유발시키는 메트 유전자 및 하위 작동기인 ERK2 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

마이크로 RNA, miR-199a, miR-199a*, 항암제

Description

이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제{An Anticancer Agent Comprising Double-stranded miRNAs as an Active Ingredient}

본 발명은 암세포 성장 및 전이를 억제하는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.

특정 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제의 개발과 표적 검증을 위한 중요한 도구가 된다. 종래에는 특정 유전자를 억제하기 위하여 특정 유전자에 대한 전이유전자(transgene)를 도입하는 기술을 사용하였으며, 이 기술은 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이유전자를 도입하는 방법(참조: Sheehy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988; Smith, et al., Nature, 334:724-726, 1988)과 프로모터를 기준으로 정방향(sense) 으로 전이유전자를 도입하는 방법을 사용하였다(참조: Napoli, et al., Plant Cell, 2:279-289, 1990; van der Krol, et al., Plant Cell, 2:291-299, 1990; 미국특허 제 5,034,323호; 미국특허 제 5,231,020호; 및, 미국특허 제 5,283,184호).

마이크로 RNA(microRNA: 이하, 'miRNA'라 함)는 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오티드(nucleotide: 이하, 'nt'라 함)를 가지는 짧은 단일가닥 리보핵산(RNA)으로, 세포내에서 발현되어 여러 유전자의 발현을 조절하고(참조: Bartel DP., Cell, 116(2):281-97, 2004; He L., Hannon GJ., Nat. Rev. Genet., 5(7):522-31, 2004), 현재까지 인간에서 약 500종의 miRNA가 발견되었으며, 약 1000종까지 존재할 것으로 예측되고 있다(참조: Bentwich, et al., Nat. Rev. Genet., 37(7):766-70, 2005; Berezikov, et al., Cell, 120(1):21-4, 2005).

miRNA는 세포내에서 자연적으로 만들어지며, 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 드로샤(drosha) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단되면, 핵에서 세포질로 이동하고, 세포질내에서 다이서(dicer) 효소에 의하여 단일 가닥의 miRNA로 만들어진다(참조: Lee, et al., Nature, 425(6956):415-9, 2003; Gregory, et al., Nature, 432(7014):235-40, 2004; Yi, et al., Genes & Dev., 17:30113016, 2003; Bohnsack, et al., RNA, 10:185191, 2004; Hutvagner, et al., Science, 293:834838, 2001; Ketting, et al., Genes & Dev., 15: 26542659, 2001).

이러한 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제 또는 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제한다. 또한, 하나의 miRNA가 여러 종류의 mRNA를 조절하는 것이 가능하기 때문에, 인간 유전자의 30%가 miRNA에 의해 조절될 것이라고 보고되었다(참조: Lewis, et al., Cell, 120(1):15-20, 2005).

최근에는 많은 종류의 암에서 miRNA 발현에 변화가 있어, 암 발병 기작과 강한 연관성이 있을 것으로 예측되었고, 여러 종류의 miRNA가 암 억제인자 또는 발암인자로 작용하고 있음이 밝혀졌다(참조: Iorio, et al., Cancer Res., 65(16):7065-70, 2005; Yu, et al., DNA Cell Biol., 26(5):283-92, 2007; Soifer, et al., Mol. Ther., 15(12):2070-2079, 2007). 예를 들어, miRNA의 일종인 let-7 miRNA는 정상 세포에서는 RAS 발암 유전자의 활성을 억제하고, 폐암세포에서는 발현이 억제되어 RAS 발암 유전자를 활성화시키며(참조: Johnson, et al., Cell, 120(5):635-47, 2005), miR-15 및 miR-16은 정상 세포에서는 발암 유전자인 Bcl2의 발현을 억제하고, 혈액암의 일종인 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) 환자의 골수세포에서는 발현이 억제되어 상기 Bcl2의 발현량을 증가시킴으로써, 상기 백혈병을 심화시키는 것으로 보고되었다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005).

한편, 상기 각각의 암세포에 상기 각 miRNA를 도입하면, 상기 각 암세포들이 사멸하거나 또는 암세포의 성장이 현저하게 억제됨이 보고되었다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005; Takamizawa, et al., Cancer Res., 64(11):3753-6, 2004). 이와 같이 miRNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제하는 개념은 특정 세포내에서 특정한 유전자의 발현을 억제시켜, 이에 의한 변화를 관찰함으로써, 특정 세포에서의 유전자 기능을 규명하는 연구에 유용할 뿐 아니라, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 특정한 유전자의 기능을 억제하여, 해당 질병을 치료하는 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있는 바, 시험관내(in vitro) 연구 및 실험 동물을 이용한 연구를 수행한 결과, miRNA를 이용하여 목적 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하였다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005; Takamizawa, et al., Cancer Res., 64(11):3753-6, 2004; Akao, et al., Biol. Pharm. Bull., 29(5):903-6, 2006; Scott, et al., J. Biol. Chem., 282(2):1479-86, 2007; Chan, et al., Cancer Res., 65(14):6029-33, 2005; Si, et al., Oncogene, 26(19):2799-803, 2007; Krutzfeldt, et al., Nature, 438(7068):685-9, 2005). 예를 들면, 미국특허공개 제 2007/0232553호에는 miR-146a와 miR-146b를 도입하여 인터루킨-1 수용체결합 인산화효소(IL-1 receptor associated kinase 1, IRAK1)와 종양괴사인자 수용체 결합인자 6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)의 발현을 억제하여 면역 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 미국특허공개 제 2006/0189557호에는 마이크로 RNA를 암세포에 도입하여 RAS 발암유전자를 억제하여 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 국제특허공개 WO 06133022호에는 miR17 클러스터의 miRNA들을 억제하여 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있다.

아울러, 암세포는 세포자살(apoptosis)의 속도가 감소하고 세포주기가 비정상적으로 변화되기 때문에, 세포주기를 정상화시키거나 또는 세포자살 속도를 회복시켜서, 목적하는 암세포의 성장을 억제하는 표적 치료법(targeted therapy)이 새 로운 항암치료 방법으로 대두되고 있다. 상기 표적 치료법에 이용되는 의약은 대체로 다양한 암세포 성장인자들의 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)의 기능을 억제시켜서, 결과적으로는 암세포의 성장 또는 증식을 저해한다. 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)의 치료제인 글리벡(Glivec™)은 백혈병에서 항상 활성화되어 있는 BCR-ABL 결합단백질의 수용체 티로신 키나제의 ATP 결합부위에 결합하여 티로신의 인산화를 억제하여 암세포의 성장을 저해하고, 유방암에 대한 면역 치료제인 허셉틴(Herceptin™)은 Her-2의 수용체 티로신 키나제에 의한 인산화를 억제하여 암세포의 증식을 저해한다(참조: Fabbro, et al., Pharmacol. Ther., 93(2-3):79-98, 2002; Radford, Curr. Opin. Investig. Drugs, 3(3):492-9, 2002; Miles, Breast Cancer Res., 3(6):380-4, 2001).

상술한 수용체 티로신 키나제 중 하나인 메트 수용체(Met receptor)는 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)에 대한 수용체로서, 세포 성장, 운동성(motility), 침윤(invasion), 전이(metastasis) 등에 관여한다고 알려져 있다(참조: Gherardi, E., Stoker, M., Cancer Cells, 3(6):227-32, 1991; Birchmeier, et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4(12):915-25, 2003). 상기 메트 단백질은 많은 암세포에서 유전자의 증폭 또는 돌연변이에 의해 활성화되기 때문에, 이를 억제하여 범용적으로 암세포의 성장 및 전이를 저해하려는 연구가 활발히 진행되어 왔다(참조: Benvenuti, S., Comoglio, PM., J. Cell Physiol., 213(2):316-25, 2007; Takayama, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94(2):701-6, 1997; Schmidt, et al., Nat. Rev. Genet., 16(1):68-73, 1997; Kuniyasu, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 189(1):227-32, 1992; Kijima, et al., Oncology, 62(1):60-5, 2002; Miller, et al., Oncogene, 25(3):409-18, 2006). 상기 저해방법으로는 항체나 펩티드와 같은 수용체의 길항제 또는 티로신 키나제 억제제 등의 사용이나, 안티센스 RNA(antisense RNA)나 siRNA 등을 이용한 메트 단백질의 발현억제 등이 고려되었으나(참조: Matsumoto, K., Nakamura, T., Front Biosci., 13:1943-51, 2008; Burgess, et al., Cancer Res., 166(3):1721-9, 2006; Kim, et al., Clin. Cancer Res., 12(4):1292-8, 2006; Smolen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 103(7):2316-21, 2006; Kong-Beltran, et al., Cancer Cell, 6(1):75-84, 2006; Michieli, et al., Cancer Cell, 6(1):61-73, 2004; Shinomiya, et al., Cancer Res., 64(21):7962-70, 2004; Taulli, et al., Cancer Res., 66(9):4742-9, 2006; Lutterbach, et al., Cancer Res., 67(5):2081-8, 2007; Corso, et al., Oncogene, 6; 1-10, 2007; Salvi, et al., Int. J. Oncol., 31(2):451-60, 2007), 현재까지 그 성과는 미미한 수준으로, 메트 단백질의 발현을 조절하여 효과적으로 암세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 메트 단백질의 발현을 조절하여 효과적으로 암세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 공지된 miRNA의 일종인 miR-199a 및 miR-199a*를 모방체(mimetic) 형태로 직접 암세포에 도입시킬 경우, 암세포내의 메트 유전자의 발현을 억제시켜서 암세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명은 본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 항암제는 암세포의 성장 및 전이를 유발시키는 메트 유전자 및 하위 작동기인 ERK2 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 miRNA는 목적하는 유전자의 발현을 억제시키는 효과를 나타내므로, 목적하는 유전자가 활발하게 발현되는 세포에서, 정상세포보다 낮은 수준으로 나타나는 miRNA는 목적하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 가능성이 있다는데 주목하여, 메트 유전자의 발현을 억제하는 방법을 개발하고자 하였다. 구체적으로, 휴지기 상태의 세포에 비하여 메트 유전자가 활발하게 발현되는 성장기의 세포에서 낮은 수준으로 발현되는 miRNA를 스크리닝하였다.

그 결과, miRNA인 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)가 휴지기 세포보다 성장기 세포에서 그의 수준이 저하되고, 상기 각 miRNA의 수준을 폐암세포에서 측정한 결과, 매우 낮은 수준으로 존재함을 알 수 있었다. 또한, 상기 각 miRNA를 성장기 세포에 처리한 결과, 메트 유전자의 발현이 현저하게 감소하고, 이에 따라 성장기 세포가 정상적으로 성장하지 못함을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 상기 각 miRNA를 암세포에 처리하면, 메트 단백질의 발현이 억제되어 암세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있을 것으로 예측하였다.

이어, miRNA는 이중가닥 RNA 형태로 합성되고, 단일가닥으로 분리된 후에야 세포내에서 실질적으로 활성을 나타내므로, 본 발명자들은 상기 miR-199a 또는 miR-199a*를 실제적으로 이용할 수 있도록, 상기 각 miRNA의 염기서열(sense) 및 이에 대하여 상보적인 각각의 안티센스(antisense) 염기서열을 포함하는 이중가닥의 형태로 상기 각 miRNA를 제조하고자 하였다. 이때, 상기 miR-199a 또는 miR- 199a*에 상보적인 염기서열을 갖는 안티센스 염기서열은 miRNA의 안정성을 증대시킬 수 있는 3' 오버행(overhang)을 포함하도록 하였다.

또한, 상기 miR-199a 또는 miR-199a*과 완벽하게 상보성을 갖는 안티센스를 포함하는 이중가닥 miRNA를 사용한 경우보다는, 3' 또는 5' 말단의 일부가 미스매치된 안티센스를 포함하는 이중가닥 miRNA가 보다 효과적으로 메트 단백질의 발현을 억제할 수 있음을 확인하고, 이를 반영하여 안티센스 서열을 결정하였다.

이에 따라, 상기 miR-199a 또는 miR-199a*의 염기서열 및 본 발명자들이 결정한 상기 각 miRNA에 상보적인 안티센스 RNA의 염기서열은 다음과 같다:

miRNA 염기서열

miR-199a

5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (MIMAT0000231, 서열번호 1)

miR-199a*

5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (MIMAT0000232, 서열번호 2)

miR-199a(서열번호 1)에 대응하는 안티센스(antisense) RNA :

5'-ACAGGUAGUCUGAACACUGGGUU-3' (서열번호 3)

5'-ACAGGUAGUCUGAACACUGUAUU-3' (서열번호 4)

miR-199a*(서열번호 2)에 대응하는 안티센스(antisense) RNA :

5'-CCAAUGUGCAGACUACUGUACA-3' (서열번호 5)

5'-CCAAUGUGCAGACUACUAUACA-3' (서열번호 6)

상기 서열 중에서, miR-199a(서열번호 1)는 서열번호 3의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a 모방체-1) 또는 서열번호 4의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a 모방체-2)를 형성할 수 있고, miR-199a*(서열번호 2)는 서열번호 5의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a* 모방체-1) 또는 서열번호 6의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a* 모방체-2)를 형성할 수 있다.

본 발명자들은 상기 형성된 각각의 이중가닥 miRNA를 실험실적 조건에서 암세포에 도입시킬 경우, 세포내에서 메트 단백질의 양이 저하되고, 암세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었다.

아울러, 암세포를 이식한 실험동물에 상기 각 이중가닥 miRNA들을 피하주사하여 도입시킬 경우, 실험동물의 체내에서 암세포가 사멸하거나 또는 이의 증식이 억제됨을 확인하였으므로, 본 발명의 이중가닥 miRNA를 항암제의 유효성분으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 상기 각 이중가닥 miRNA 중에서도 199a* 모방체-2는 암세포의 증식을 가장 효과적으로 억제할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.

결국, 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이때, 이중가닥 miRNA는 특별히 이에 제한되지 않으나, miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것, miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것, miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것 또는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 사용함이 바람직하다.

한편, 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 주사용 조성물과 혼합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다. 이때, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나, 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유하며, 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 겔 제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 경피흡수용 점착제제는 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 이중가닥 miRNA의 제조

공지된 방법에 따라, 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 RNA를 합성하고, 이들을 결합시켜 이중가닥 miRNA를 제조하였다(참조: Sinha, et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984).

즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA) 및 합성촉매로서 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 사용하여, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캡핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 각각의 RNA를 합성하고, 다이소젤(Daisogel C18, Daiso, Japan)을 사용하는 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan) 및 MALDI-TOF 질량 흡광분석 기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 각각의 RNA를 분리하여 수득하였다.

그런 다음, 서열번호 1과 3, 서열번호 1과 4, 서열번호 2와 5 및 서열번호 2와 6의 RNA를 각각 혼합하고, 이들을 90℃로 10분동안 가열한 다음 상온까지 서서히 냉각시켜서, 하기와 같은 각각의 이중가닥 miRNA를 제조하였다.

miR-199a에 대한 이중가닥 miRNA-1(199a 모방체-1):

센스 RNA 가닥 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (서열번호 1),

안티센스 RNA가닥 3'-UUGGGUCACAAGUCUGAUGGACA-5' (서열번호 3)

miR-199a에 대한 이중가닥 miRNA-2(199a 모방체-2):

센스 RNA 가닥 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (서열번호 1),

안티센스 RNA가닥 3'-UUAUGUCACAAGUCUGAUGGACA-5' (서열번호 4)

miR-199a*에 대한 이중가닥 miRNA-1(199a* 모방체-1):

센스 RNA 가닥 5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (서열번호 2),

안티센스 RNA가닥 3'-ACAUGUCAUCAGACGUGUAACC-5' (서열번호 5)

miR-199a*에 대한 이중가닥 miRNA-2(199a* 모방체-2):

센스 RNA 가닥 5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (서열번호 2),

안티센스 RNA가닥 3'-ACAUAUCAUCAGACGUGUAACC-5' (서열번호 6)

실시예 2: 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 각각의 이중가닥 miRNA를 폐암세포 및 구강암세포에 도입하여, 각각의 형질전환된 암세포를 제조하였다.

먼저, 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 및 구강암세포(KB)를 10%(v/v) 우태아 혈청, 100units/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA)에서 6-웰 플레이트의 각 웰당 2.5 X 10⁵개의 세포를 분주하여, 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에서 24시간 동안 배양하였다.

한편, 실시예 1에서 제조한 각각의 이중가닥 miRNA를 최종 농도 100nM(100 pmol/ml)이 되도록 250㎕ Opti-MEM 배지와 혼합한 시약 1 및 3.5㎕ RNAiMAX(Invitrogen, USA)와 250㎕ Opti-MEM 배지를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 시약 2를 각각 수득하고, 상기 시약 1 및 2를 동량으로 혼합한 다음, 상온에서 20분동안 반응시켜서 형질전환 용액을 수득하였다.

상기 배양된 폐암세포(A549) 및 구강암세포(KB)를 Opti-MEM 배지(GIBCO/Invitrogen, USA)로 세척하고, 상기 수득한 형질전환 용액 500㎕와 Opti-MEM 배지 500㎕를 분주한 다음, 6시간 동안 배양하고, 배지를 RPMI 배양배지 2.0㎖ 로 교체하고, 다시 72시간 동안 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 배양하여, 각각의 형질전환 세포를 제조하였다.

실시예 3: 이중가닥 miRNA의 폐암세포 사멸 및 폐암세포 증식억제 효과

본 발명의 이중가닥 miRNA가 암세포의 사멸 및 증식을 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

즉, 상기 실시예 2에서 제조한 이중가닥 miRNA로 형질전환된 각각의 폐암세포를 현미경으로 세포형태를 관찰하고(참조: 도 1a), 상기 각 폐암세포를 세포자살이 유도되는 세포의 세포막 외면을 염색할 수 있는 형광염료인 애넥신 V(annexin V)로 염색한 후 이들의 형광발색의 정도를 관찰하여 세포사멸의 정도를 판단하였으며(참조: 도 1B), 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 상기 각 폐암세포의 세포수를 측정하고, 대조군의 세포수에 대한 비율로서 각 폐암세포의 생존율을 산출하였다(참조: 도 1c). 이때, 대조군으로는 세포내에서 단백질의 발현을 전혀 억제하지 못하는 NC 모방체(negative control mimic, CN-001000-01; Dharmacon Inc., USA)로 형질전환된 암세포를 사용하였다.

도 1a는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포형태를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1a에서 보듯이, 199a 모방체-1(서열번호 1 및 3), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 및 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)가 형질전환된 실험군의 경우, 형질전환되지 않은 대조군과 비교하였을 때, 둥근 형태의 단일세포(round form single cell)로 존재하고 있는 세포가 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 상호 부착(adhesion)되어 성장하는 암세포의 성질에 부합하지 않는 현상이므로, 상기 결과는 암세포가 사멸하는 것으로 분석되었다.

또한, 도 1b는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포자살 현상이 유도된 세포를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1b에서 보듯이, 세포자살이 유도되는 세포의 세포막 외면을 염색하는 형광염료인 애넥신 V(annexin V)에 의해 염색되어진 세포의 수가 대조군 NC보다 실험군에서 더 많이 관찰되었다. 이러한 사실에 의해, 세포사멸이 유도되었음을 확인할 수 있었으며, 특히, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)에 의한 사멸 효과가 199a 모방체-1(서열번호 1 및 3) 또는 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)에 의한 것보다 우수함을 알 수 있었다.

아울러, 도 1c는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 헤마사이토미터를 이용하여 세포수를 측정한 결과, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 처리한 실험군의 경우, 대조군을 처리한 세포에 비하 여 세포수가 현저히 적어 암세포 증식이 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.

상기 각 결과를 종합하면, 본 발명의 이중가닥 miRNA는 폐암세포를 사멸시키거나 또는 폐암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내므로, 항암제의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 메트와 어크2(ERK2) 단백질에 대한 웨스턴 블럿(Western blot) 분석

실시예 2에서 제조된 각각의 형질전환된 폐암세포를 대상으로 하여, 메트와 어크2 단백질에 대한 항체를 이용하여, 웨스턴 블럿을 수행하였다.

구체적으로, 형질전환한 후 72시간이 경과한 폐암세포로부터 단백질 추출키트(CelLytic-M cell lysis reagent, Sigma, USA)를 이용하여, 전체 세포내 단백질을 추출하였다. SDS 샘플 완충용액(Santa Cruz Biotechnology, USA)을 추출된 전체 단백질 30㎍에 처리한 후, 4 내지 20% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하였다. 이어, 항-메트와 항-어크2 단일클론 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)를 1차 항체로 하고, 호스래디시페록시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 항-마우스(메트) 또는 항-래빗(어크2) 항체(Pierce, USA)를 2차 항체로 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(참조: 도 2).

도 2는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 세포에서 발현된 메트(Met) 및 어크2(ERK2)의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴블롯 사진이다. 도 2에서 보듯이, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 처리한 경우, 메트와 어크2 단백질의 발현량이 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 구강암세포가 이식된 누드마우스에서 이중가닥 miRNA의 구강암세포 증식억제 효과

생체내에서도 이중가닥 miRNA가 암세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

실시예 1에서 제조한 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 이용하여, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물 또는 대조군인 NC 이중가닥 RNA로 형질전환된 인간 구강암세포(KB)를 24시간 배양한 후, 3 X 10⁶개의 세포를 24마리의 누드마우스(BALB/c SIC-nu/nu Mice, female, SLC Inc., Japan)의 좌측 경배부에 각 시료당 6두씩 피하주사하여 이종이식을 시행하였다. 이때, 누드마우스는 생후 5-6주령의 체중이 평균 18g 내외의 암컷을 사용하였다.

종양크기는 이식 후, 5일, 9일, 12일, 14일, 16일 및 19일에 측정하였고, 장경과 단경을 측정하여 '평균 종양크기 = [(단경)x(단경)]x(장경)/2 (mm³)'로 계산하 였으며, 각 실험군과 대조군의 날짜별 종양크기를 평균하여 그래프로 나타내고 각 그룹 간의 종양크기 차이를 확인하였다(참조: 도 3). 이때, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물이 형질전환된 암세포 접종군 또는 대조군인 NC 이중가닥 RNA가 형질전환된 암세포 접종군 간의 종양크기 변화의 통계적 유의성 검증은 컴퓨터 프로그램(One way ANOVA)으로 분석하였고, 사후검증은 쉐페의 다중비교 검정(Scheffe's multiple comparison test, SPSS software ver.12, SPSS Inc., USA)을 이용하였으며, 유의확률(P value)이 0.05이하일 때, 통계적 유의성이 있는 것으로 인정하였다.

도 3은 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스에서 시간의 경과에 따른 종양크기의 변화를 나타내는 그래프로서, (◇)는 199a 모방체-2에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내고, (●)는 199a* 모방체-2에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내며, (▲)는 199a 모방체-2와 199a* 모방체-2의 동량 혼합물에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내고, (□)는 대조군을 나타낸다.

도 3에서 보듯이, 이식 후 6일까지는 각 실험군에서 큰 차이를 확인할 수 없었으나, 6일 이후, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물이 형질전환된 암세포 접종군의 종양크기가 대조군의 종양크기와 비교하 여 현격히 작은 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)만을 형질전환시킨 암세포 접종군에서 종양성장의 현저한 억제활성을 확인할 수 있었다.

도 1a는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포형태를 나타내는 현미경 사진이다.

도 1b는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포자살 현상이 유도된 세포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 1c는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 세포에서 발현된 메트(Met) 및 어크2(ERK2)의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴블롯 사진이다.

도 3은 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스에서 시간의 경과에 따른 종양크기의 변화를 나타내는 그래프이다.

<110> bioneer <120> miRNAs for Inhibiting Tumour Cell Proliferation and Metastasis <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 1 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 2 uacaguaguc ugcacauugg uu 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 3 acagguaguc ugaacacugg guu 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 4 acagguaguc ugaacacugu auu 23 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 5 ccaaugugca gacuacugua ca 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 6 ccaaugugca gacuacuaua ca 22

Claims

miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암 제.
제 5항에 있어서,

이중가닥 miRNA는 miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는

항암제.
제 5항에 있어서,

이중가닥 miRNA는 miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는

항암제.
제 5항에 있어서,

이중가닥 miRNA는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는

항암제.
제 5항에 있어서,

이중가닥 miRNA는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는

항암제.