KR101251282B1

KR101251282B1 - 프로스타글란딘 합성을 억제하는 설폰아미드 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101251282B1
Application number: KR1020100101312A
Authority: KR
Inventors: 김상희; 이상국; 임채민; 이민희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2013-04-10
Also published as: KR20120088030A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적으로 허용가능한 염 및 이들을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 프로스타글란딘 E₂ 합성을 효과적으로 억제하는 설폰아미드 유도체와 이를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환, 염증성 질환, 알츠하이머병 또는 뇌질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

(1)
상기 식에서,
R은 O, N 또는 S를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로고리 중에서 선택된다.

Description

프로스타글란딘 합성을 억제하는 설폰아미드 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 {Sulfonamide derivatives to inhibit Prostaglandin E2 production and the pharmaceutical composition comprising the derivatives}

본 발명은 설폰아미드 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 프로스타글란딘 합성을 억제하는 헤테로고리 화합물의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능염 및 이들을 유효성분으로 포함하는 프로스타글란딘 E₂ 합성 효소 억제제 및 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

프로스타글란딘(prostaglandin)은 생체 내에서 합성된 생리활성물질로 장기나 체액 속에 널리 분포하면서 극히 미량으로 생리작용을 하며 PG라고 약칭한다. 1930년 미국의 산부인과 의사인 클츠록이 사람의 정액에 자궁을 수축 이완시키는 작용이 있다는 것을 보고하였고 후에 그 유효성분이 전립선(前立腺: prostate gland)에서 나온다고 생각하여 프로스타글란딘이라고 이름을 붙였다.

1950년대에 들어 스웨덴의 S. 베리스트룀이 양의 정낭선(精囊腺)에서 PG를 추출하고 결정화하는 데 성공하였으며, 현재는 화학적 합성도 한다. 생체 내에서는 지방산을 재료로 하여 효소의 작용으로 만들어진다. 종류는 A~H까지의 8족으로 분류되며 작용도 다양하다. E, F족에는 자궁을 수축시키는 작용을 하는 것도 있고, 분만유발(分娩誘發)·인공임신중절에 실용화되고 있다. 그 밖에 종류에 따라 모세혈관 확장작용, 위액분비 억제작용, 기관지 근육의 수축, 이완작용 등 다양한 생리적 작용이 있다.

PG 화합물은 탄소수가 20이고 고분자의 중앙에 5원환이 있는 프로스탄산을 기본골격으로 갖는다. 5원환의 수식 차이에 따라 A~J군으로, 또 2개의 곁사슬에 존재하는 2중결합 수에 따라 1~3가지 계열로 분류한다. 생체에서는 호르몬이나 신경전달물질 등의 수용체를 개재하는 자극 또는 허혈이나 경련 등의 자극에 응답하여 활성화되는 포스폴리파아제 A2에 의해 막인지질에서 유리되는 아라키돈산이 전구체가 된다.

아라키돈산은 아라키돈산 단계적 연쇄라는 산소첨가반응으로부터 시작하는 일련의 효소반응에 의해 PG만이 아니고 트롬복산(TX), 류코트리엔(LT), 리폭신(LX) 등 에이코사노이드로 총칭하는 다수의 생리활성물질로 변환된다. PG의 합성은 모든 조직이나 세포에서 PGH생성효소(시클로옥시게나아제)에 의해 아라키돈산으로부터 PGG2를 거쳐 PGH2를 생합성하고 또한 장기나 조직에 특이적인 이성화효소(PGD, PGE, PGI 생성효소) 및 환원효소(PGF생성효소)에 의해 2가지 계열인 프로스타글란딘 D2(PGD2), 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGF2α, 프로스타글란딘 I2 (프로스타사이클린)로 변환된다.

PG, TX의 합성경로는 그 초발효소로부터 시클로옥시게나아제라 하고 LT, LX의 합성경로를 리폭시게나아제라고 한다. PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2는 각각에 특이적인 세포막수용체가 있고 또한 PGE 수용체는 EP1, EP2, EP3, EP4의 4종의 아형이 있다. 이들 PG수용체는 모두가 G 단백질 공역수용체에서 아데닐산 고리화 효소계, 이노시톨 인지질 대사계, 혹은 Ca2+ 동원계를 매개로 하여 그 장기의 작용을 조절하는 국소호르몬으로서 여러 생리작용이나 병태에 관여한다. 작용이 끝나고 정맥혈로 들어간 PG는 폐에 많이 존재하는 15-히드록시 PG탈수소효소에 의해 빠르게 활성화된다.

PG A, B, C군은 PGE군으로, PGJ군은 PGD군의 자연분해물로서 PGA계열이나 PGD2대사물인 Δ12-PGJ2로서 세포에 이입, 핵에 도달하여 항종양작용을한다. PGH생성효소는 구성형 효소와 염증기인 물질로 유도되는데 그 유도에는 글루코코르티코이드를 억제하는 2종류의 유도형 효소가 있다. 이 효소활성유도와 아라키돈산의 유리단계를 PG 생합성단계라고 생각되며 비스테로이드성 항염증약제의작용은 PGH생성효소의 활성 억제에 의해 일어난다.

프로스타글란딘의 과다생성은 염증, 알츠하이머 병, 고혈압, 심장마비, 암 발생 등 여러 가지 생리학적 변화를 일으킬 수 있다. 따라서 프로스타글란딘의 합성을 억제할 수 있는 물질은 프로스타글란딘과 연관된 여러가지 질병들에 대한 치료제로서 개발이 가능하다.

도 1과 도 2에는 프로스타글란딘의 생합성 경로가 나타나 있다. 프로스타글란딘의 생합성 경로 중 속도제한단계(rate limiting step)는 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘의 첫 번째 전구체인 프로스타글란딘 H₂(PGH₂)로 변환되는 과정이며, 이 과정은 싸이클로옥시지나아제(COX) 라는 효소에 의해 매개된다. 이후 PGH₂는 PGG₂를 거쳐 다양한 프로스타그란딘류를 생합성하게된다. COX는 COX-1, COX-2, 2가지의 이소폼(isoform)이 있으며, COX-1는 모든 세포에 존재하는 반면에 COX-2는 성장인자나 종양생성인자, 그외 다른 여러 가지 생리학적 변화나 염증상태에서 발현되는 효소이다.

COX-2에 의해 매개되는 PGE2를 포함한 여러 가지 대사체들은 염증, 통증, 암발생 등과 연관이 있으므로 COX-2 억제제는 항염증, 항암 등을 위한 치료제로 사용될 수 있으며 선택적인 COX-2 억제제는 퇴행성 신경질환 등의 예방목적으로도 사용될 수 있다.

현재까지 알려진 COX-2 억제제 중 가장 잘 알려져 있는 화합물로는 Coxibs로 통칭되는 celecoxib와 refecoxib가 있으나, 그러나 최근 이들의 부작용이 알려지면서 새로운 화합물의 개발이 요구되고 있다.

또한 COX-2억제제 활성을 갖는 화합물 중, 비고리형 중심 구조(acyclic central system)을 갖는 화합물들이 알려져 있는데, 스틸벤 유도체들 또한 COX 억제 활성을 갖는다고 알려져 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 프로스타글란딘 E₂ 합성 억제 활성을 갖는 설폰아미드 유도체 및 그 약학적 허용가능 염을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염을 유효성분으로 포함하는 프로스타글란딘 E₂ 합성 효소 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식 등의 면역성질환과 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성간질환, 자궁내막증, 만성골반염, 만성장염 등의 염증성 질환, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염 등 염증으로 인한 종양 그리고 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌질환과 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환과 같은 혈관성질환 등의 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 첫 번째 기술적 과제를 해결하기 위하여 하기 화학식 (1)로 표시되는 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

(1)

상기 식에서,

R은 O, N 또는 S를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로고리 치환기이다.

본 발명에 따른 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체에서, 상기 R은 하기 식 (2) 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

(2)

이때, X는 각각 독립적으로 O, N 또는 S의 헤테로 원자 중의 하나일 수 있으며, X가 2 이상인 경우 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

특히 본 발명은 하기 화학식 (2)로 표시되는 설폰아미드 유도체인 것이 더욱 바람직하다.

(1c)

본 발명은 두 번째 기술적 과제를 해결하기 위하여, 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로스타글란딘 E₂ 합성 효소 억제제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세 번째 기술적 과제를 해결하기 위하여, 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 이때 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 예를 들어, 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식 등의 면역성질환과 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성간질환, 자궁내막증, 만성골반염, 만성장염 등의 염증성 질환, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염 등 염증으로 인한 종양 그리고 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌질환과 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환과 같은 혈관성질환 중의 하나일 수 있다.

본 발명에 따른 설폰아미드 유도체는 IC₅₀ 값이 0.013 μM으로서, 종래에 프로스타글란딘 합성 억제에 이용되던 화합물들에 비해 30 - 40배 이상의 억제 효과를 나타낸다. 따라서 이에 따라 프로스타글란딘 E₂의 합성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병, 예를 들어 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식 등의 면역성질환과 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성간질환, 자궁내막증, 만성골반염, 만성장염 등의 염증성 질환, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염 등 염증으로 인한 종양 그리고 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌질환과 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환과 같은 혈관성질환을 위한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

도 1과 도 2는 프로스타글란딘의 생합성 경로를 보여주는 모식도이다.
도 3은 COX-2(Protein Data Bank code 1CX2)의 활성 부위 내에서 화학식 (1c)의 docking 모형을 보여주는 도면이다. 구체적으로 화학식 (1c)(붉은색)와 SC-558(회색)을 겹친 상태의 모형으로서, 수소 결합과 그 가능성이 있는 부분은 붉은 색 점선과 오렌지색 실선으로 각각 표시되어 있다. 핵심이 되는 아미노산 잔기는 녹색으로 표시되어 있으며. 활성 부위 잔기만 표시함으로써 명확히 하였다.
도 4는 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응(PT-PCR) 분석을 이용하여 조사한 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS) 유발된 마우스 대식세포 RAW264.7 세포에서의 COX-2 mRNA 발현에 있어서, 화합물 (1c)의 억제 효과를 보여주는 도면이다. RAW264.7 세포(5ｘ105 cells/ml)는 24시간 동안 배양한 후 화학식 (1c)의 화합물 첨가 없이, 또는 여러 가지 농도의 화학식 (1c)의 화합물과 함께 1 mg/ml의 LPS로 5시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 분리하여 1mg의 RNA를 역전사에 사용하였다. Taq DNA 폴리머라제 및 특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 cDNA를 얻었다. PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 전기영동법으로 분리하고, SYBR Gold로 염색한 후 UV transilluminator로 관찰하였다.
도 5는 본 발명에 따른 화학식 (1c)의 NMR 그래프이다.

이하 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 (1)로 표시되는 것이 특징이다.

(1)

상기 식에서,

R은 O, N 또는 S를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로고리 치환기 중에서 선택된다.

(2)

본 발명의 일실시예에 의하면, 하기 화학식 (1c)로 표시되는 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염이 프로스타글란딘 E2의 억제에 더욱 바람직하다.

(1c)

본 발명에 따른 프로스타글란딘 E₂ 합성 효소 억제제는 상기 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것이 특징이다.

또한 본 발명에 따른 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물은 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 설폰아미드 유도체는 그대로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 약학 조성물에 사용할 수 있다.　이러한 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산의 염일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.　 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.　 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.　 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.　 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

한편 본 발명에 따른 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물이 사용될 수 있는 질병 즉, 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병으로는 예를 들어, 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식 등의 면역성질환 중의 하나이거나, 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성간질환, 자궁내막증, 만성골반염, 만성장염 등의 염증성 질환, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염을 포함하는 염증으로 인한 종양 중의 하나일 수 있으며, 알츠하이머병, 파킨슨병을 포함하는 뇌질환 또는 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환을 포함하는 혈관성질환 중의 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하에서 합성예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.

합성예 1

상기 식에서, 반응 조건은 하기와 같다.

(a) n-BuLi, THF, rt; aqueous workup (5a, E/Z=2:1, 68%; 5b, E/Z=2.1:1, 65%; 5c, E/Z=2.2:1, 75%; 5d, E/Z=2.3:1, 70%);

(b) I₂, 헵탄, reflux;

(c) 옥손, THF, rt; isolation (2a, 75%; 2b, 70%; 2c, 100%; 2d, 80%);

(d) LDA, (요오드메틸)트리메틸실란, THF, -78^oC to rt; aqueous workup (7a, 42%; 7b, 42%; 7c, 50%; 7d, 51%);

(e) TBAF, THF, reflux;

(f) H₂NOSO₃H, rt (3a, 52%; 3b, 48%; 3c, 60%; 3d, 48%)

상기 반응식에 도시된 바와 같이, 시판되는 4-메틸티오벤즈알데히드로부터 본 발명에 따른 화합물을 합성했다. 포스포늄브로마이드 4a-d와 4-메틸티오벤즈알데히드를 n-부틸리튬의 존재하에서 반응시켜 상기 화학식 5a 내지 5d의 혼합물(E/Z 비율은 약 2:1)을 얻었다. 화학식 5의 E/Z 혼합물은 헵탄을 환류시키면서 촉매량의 요오드와 함께 가열하면 E-아이소머로 전환된다. 옥손(oxone) 수용액을 사용하여 화학식 5의 E-아이소머의 SMe 치환체를 산화시킴으로써 본 발명에 따른 메틸설폰 생성물인 화학식 6a 내지 6d의 화합물을 얻을 수 있었다.

그 다음 단계 반응을 진행하여 메틸설폰기를 이에 대응하는 설폰아미드기로 전환시켰다. LDA(리튬 디이소프로필아마이드) 및 (요오드메틸)트리메틸실란으로 화학식 6a 내지 6d의 화합물을 처리하면 트리메틸실릴에틸 설폰 중간체인 화학식 7의 화합물이 형성된다. TBAF로 탈실릴화반응을 시키고, 그 결과 얻어진 설피닉산염을 히드록실아민-O-설폰산으로 처리하여 목적 화합물인 화학식 (1)의 설폰아미드를 적정량 얻을 수 있었다.

실험예 1

(1) 생물학적 방법

배양된 리포폴리사카라이드 ( LPS ) 유발된 마우스 대식세포 RAW264 .7 내의 COX -2에 의한 PGE ₂ 축적의 측정:

프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 레벨은, 상기에 나타낸 바와 같이, 효소-면역측정법(enzyme-immunometric assay)에 의해 측정되었다. RAW264.7 대식 세포들은 5%의 CO₂ 가습 공기로 37^oC의 온도에서 페니실린 스트렙토마이신과 10%의 FBS로 채워진 DMEM내에서 유지하였다. COX-2에 대한 시험 물질의 억제 활성을 평가하기 위하여, 상기 세포들을 96-웰 배양 플레이트내에 250 μM의 아스피린 존재하에서 2시간 동안 부착하게 하였고, 새로운 배지로 바꿔준 후, 22시간 동안 더 배양하였다. 상기 부착된 세포들을 PBS로 2회 세척하였고, 그런 다음 1mg/mL의 LPS로 새로운 배지에서 배양하였다. 상기 시험물질들을 각각의 웰에 동시에 첨가하였다. 추가로 20시간 더 배양시킨 후, 상기 배지를 제거하고 PGE₂ 효소 면역 측정법(EIA)에 의해 분석하였다. 상기 분석에서, 100% 활성은 적어도 3회 이상 반복 측정한 것으로부터, 20시간 동안 LPS의 부재 및 존재하에서의 PGE₂ 축적의 차이에 의해 정의된다.

상기 억제(%)는 하기의 식으로 표시된다.

[1-(샘플의 PGE₂ 레벨/운반 처리된 대조구의 PGE₂ 레벨]

RAW264 .7 세포 내의 COX -2 mRNA 의 역전사 -중합효소 연쇄반응( RT - PCR ) 분석:

RAW264.7세포들: RAW264.7 세포들(5 x 10⁶ 세포들-10 cm 디쉬)을 다양한 농도의 테스트 샘플과 LPS(1μg/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. PBS로 2회 세척한 후에, 총 RNA를 RNA 분리 키트(미국, 미조리, 세인트 루이스, 시그마 케미컬사제, 트리졸 용액(Tri-reagent)) 를 이용하여 세포 펠렛(cell pellet)으로부터 분리하였다. RNA의 총량은 260 nm의 흡광도에 의해 측정되었다.

1μg의 RNA를 조류 골수아세포증 바이러스(avian myeloblastosis virus; AMV) 역전사효소와 올리고(dT)₁₅ 프라이머(미국, 위스콘신, 메디슨, 프로메가사 제)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 상기 PCR 샘플(50 ?L의 반응 혼합물)은 50mM KCl, 5mM MgCl₂, 0.16mM dNTP, 5.0 유닛의 Taq DNA 중합효소(미국, CA, 발렌시아, Qiagen), 및 10mM Tris-HCl (pH 8.3)내의 20pmol의 감지 및 항감지 프라이머(sense and antisense primers)로 이루어진다. COX-2용 상기 감지 및 항감지 프라이머는, 각각 5'-GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC-3' 및 5'-ATGGTCAGTAGACTTTTACAGCTA-3'이었다. 액틴용 감지 및 항감지 프라이머는, 각각 5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3' 및 5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'이었다. 상기 PCR 증폭은 다음의 조건 하에서 수행하였다: 증폭기(GeneAmp PCR Systems 2400; PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 94 ^oC에서 15초 동안 27주기 변성, 1시간 동안 55^oC에서 어닐링, 1시간 동안 72 ^oC에서 연장. 증폭된 PCR 생성은 2% 아가로오스겔에서 계속해서 실시되었고, SYBR 금 염색에 의해 눈에 보이게 하였다.

(2) 분자 모델링 방법

COX-2의 3차원적 구조에 대한 좌표를 단백질 데이터 뱅크로부터 얻었다 (http://www.rcsb.org/pdb/, entry code 1CX2). 화합물 (1c)의 3D 구조를 SYBYL 7.0 (Tripos Associates, Saint Louis, MO, USA)을 사용하여 생성하였다.³ 회전가능한 결합을 위해 여러 개의 다른 비틀림각으로 화합물 (1c)의 모델링된 구조를 Guesteiger-Hukel charges로 공액경사법(conjugate gradient method)에 의해 최소화하였고, 상기 최소화된 구조를 데이터베이스에 넣었다. 억제제를 도킹(docking)하기 위해서, 1CX2의 단백질 구조를 포웰(powell method) 방법에 의해 최소화하였다. 상기 활성 부위(site)는 결정화된 기준 리간드(reference ligand)인 SC-558로부터 10.1 Å의 반경을 갖는 포켓으로 정의되고, 코어 서브포켓(core subpocket)은 2.9 Å 반경을 갖는 포켓으로 정의된다. 억제제는 데이터베이스 내의 복수의 리간드로 FlexX 스위트 모듈(suite module)을 사용하여 도킹하였다. 상기 생성된 COX-2-억제제 복합물을 억제제와 활성 부위 잔류물 사이의 상호작용 에너지를 반사시키는 드럭스코어(drugscore)에 따라 오더링하였다. 또한, Flexidock은 최초 위치로 플렉스X-도킹된 좌표(FlexX-docked coordinates)로 수행하였다. 각각의 모듈은, 도킹 결과를 확실하게 확인하기 위하여 5회 이상 실시하였다.

(3) 평가 결과

상기 실시예에서 합성된 화합물에 대해 리포폴리사카라이드(LPS) 유발된 마우스 대식세포 RAW264.7 내의 PGE₂ 생성에 있어서의 억제 활성을 평가했다. 하기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 합성된 설폰 유도체들 중에서는 2-티에닐기를 함유하고 있는 화학식 6c의 화합물이 IC₅₀ = 0.38 μM로 가장 효과적인 억제 활성을 보여주었다. 한편 p-SO₂NH₂를 갖는 설폰아미드 유도체의 효과는 헤테로고리 구조와 깊은 관련이 있다는 사실이 밝혀졌다. 3-티에닐기를 포함하고 있는 화학식 1d의 설폰아미드 유도체는 이 분석 평가에서 설폰 화합물 6d와 거의 동등한 결과를 보여주었다.

또한 2-티에닐 설폰아미드 유도체 1c는 가장 효과적인 억제 활성을 보여주었는데 IC₅₀ 값이 0.013 μM이었다. 이 효능은 유사한 고리구조를 갖는 설폰유도체 6c의 억제 활성에 비해서는 30배 이상 증가한 것이다. 하기 표 1에는 리포폴리사카라이드(LPS) 유발된 마우스 대식세포 RAW264.7 내의 PGE₂ 생성에 있어서의 설폰아미드 유도체의 억제 활성 측정 결과가 정리되어 있다.

화합물	R	IC₅₀ (μM)*
비교예(6a)	Me	1.18
비교예(6d)	Me	0.52
실시예(1c)	NH₂	0.013
실시예(1d)	NH₂	0.44

* IC₅₀ 값은 tripliate 테스트로 측정되었다.

본 발명자는 가장 가능성이 높은 유도체인 화학식 (1c)의 화합물을 가지고 COX-2 상호작용에 대해 분자 모델링 실험을 수행하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 화합물 (1c)와 COX-2의 docking 연구는 화합물(1c)와 SC-558 (a celecoxib analogue)의 경우 설폰아미드기의 공간 위치가 일부 겹쳐지고, 그것들의 벤젠설폰아미드기는 거의 중첩된다는 것을 보여준다. 화합물 (1c)의 Ar-SO₂NH₂기는 COX-2 결합부위(Gly519, Phe518, Ala516, Gln192, Arg513 및 His90)에 연결된 아미노산 잔기와 상호작용한다. Ar-SO₂NH₂기의 두 개의 산소원자는 His90 및 Arg513(거리 = 2.87Å )의 주쇄 NHs와 2개의 수소결합을 형성한다. 또한 SO₂NH₂기의 질소와 Gln192 (거리 = 3.72 Å/ Phe518 (거리 = 3.84 Å/Leu352 (거리 = 4.12 Å)에 있는 주쇄 카르보닐기 사이에도 수소 결합이 가능하다는 것이 관찰되었다. 이러한 관찰 결과는 헤테로고리 설폰아미드가 COX-2 결합부위 내에서 바람직하게 상호작용한다는 것을 암시한다.

PGE2 생성 억제를 유도하는 분자 메카니즘을 이해하기 위하여, COX-2 mRNA 발현에 있어서의 화합물 (1c)의 억제 효과를 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응(PT-PCR) 분석을 이용하여 조사하였다. 5시간 동안 LPS로 처리한 결과 COX-2 mRNA 의 발현이 급격히 증가되었으며, 도 5에 나타난 바와 같이 농도 의존적인 방식으로 화합물 (1c)의 처리에 의해 유도가 억제되었다. 이러한 관찰 결과에 기초하여, LPS 유발된 PGE₂에 대한 설폰아미드 유도체 (1c)의 억제 효과는 COX-2 mRNA 발현의 억제와 부분적으로라도 상관 관계가 있을 것이라고 가정할 수 있을 것이다. 그러나 COX-2 mRNA 발현에 있어서의 화학식 (1c)의 억제 효과는 PGE ₂ 생성의 IC₅₀ 값에 완전히 도달하지 않았기 때문에, 직접적인 COX-2 mRNA 억제 활성과 같은 다른 메카니즘도 배제할 수는 없을 것이다. 따라서 리포폴리사카라이드(LPS) 유발된 마우스 대식세포 RAW264.7 에서 본 발명에 따른 설폰아미드 유도체에 의한 PGE₂ 생성의 억제는 COX-2 발현의 다른 억제 또는 COX-2 효소 활성의 직접적인 억제에 기인한 것일 수도 있다고 생각된다.

이러한 결과에 따르면, COX-2 활성 조절을 목적으로 하는 vicinal 디아릴 설폰아미드 유도체류에 의한 심혈관계 부작용에 대한 주의가 최근에 부각되고 있음에도 불구하고, 심혈관 부작용을 감소시키는 새로운 탬플릿을 탐구할 필요가 있다는 것을 보여준다. 본 연구는 가능성 있는 조절물질을 확인하기 위하여, 일련의 헤테로고리 유도체를 제조하여, COX-2-매개된 PEG₂ 생성에 있어서의 그 효과를 평가하였다.

특히 본 발명에 따라 화학식 (1c)로 표시되는 (E)-4-(2-(티오펜-3-일)비닐) 벤젠설폰 아미드가 염증을 유발하는 PGE₂의 과량생성에 대해 효과적인 억제 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌으며, 이는 PGs에 의해 매개되는 질병의 치료를 위한 신규 치료제로 작용할 수 있을 것으로 예상된다. 또한 본 발명에서는 PG 합성의 신종 억제제의 연구와 개발에 가치 있는 설폰아미드 유도체들의 구조-활성 연관관계도 확인할 수 있었다.

Claims

하기 화학식 (1)로 표시되는 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적으로 허용가능한 염:

(1)
상기 식에서,
R은
,
,
,
중에서 선택된다.
삭제
제1항에 있어서,
하기 화학식 (1c)로 표시되는 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염:

(1c)
삭제
제1항에 따른 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
상기프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식, 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성 간질환, 자궁 내막증, 만성 골반염, 만성 장염, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 알레르기 질환, 바이러스로 인한 천식 등의 면역성질환 중의 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 만성 치주질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 신장질환, 만성간질환, 자궁내막증, 만성골반염, 만성장염 등의 염증성 질환, 호지킨병, 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염을 포함하는 염증으로 인한 종양 중의 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병을 포함하는 뇌질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 죽상동맥경화증, 고혈압성 심장질환을 포함하는 혈관성질환 중의 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 따른 화학식 (1)의 설폰아미드 유도체 또는 그 약학적 허용가능 염을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
상기프로스타글란딘 E₂의 합성 또는 그 대사에 관여하는 질병은 면역성 질환, 염증성 질환, 염증으로 인한 종양, 뇌질환, 혈관성 질환 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.