KR101255337B1

KR101255337B1 - 온도 감응성 합성 고분자를 이용한 일산화질소 전달체

Info

Publication number: KR101255337B1
Application number: KR1020100096520A
Authority: KR
Inventors: 김원종; 이양기; 박귀덕; 김지훈; 한동근
Original assignee: 한국과학기술연구원; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-04
Filing date: 2010-10-04
Publication date: 2013-04-16
Also published as: CN103153342B; WO2012046994A3; KR20120035044A; US9212259B2; JP5689972B2; WO2012046994A9; WO2012046994A2; US20130189340A1; JP2013540132A; DE112011103342T5; CN103153342A

Abstract

일산화질소를 조절 방출할 수 있는 고분자 전달체를 개시한다. 본 발명의 일산화질소 전달체는 유기 고분자의 주사슬과 이 주사슬에 공유 결합으로 연결되어 있으며, 디아제늄디올레이트 작용기를 갖추고 있는 부사슬을 포함하는 중합체 분자이다. 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 상온에서 액체 등의 유동성이 있는 유체 상태로 존재하다가 생체내 pH 조건에서 임계 온도 이상으로 승온시 졸에서 겔로 상전이를 일으키는데, 이 상 전이의 임계 온도는 25~35℃의 범위에 있고, 상기 겔은 화학 가교 형성이 없이 이루어지는 수화겔(hydrogel)이다. 아울러 본 발명에서는 이러한 일산화질소 조절 방출용 전달체로 표면을 피복한 인공 체내 삽입물을 개시한다.

Description

온도 감응성 합성 고분자를 이용한 일산화질소 전달체{Nitric oxide delivery system using thermosensitive synthetic polymers}

본 발명은 일산화질소 전달체에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 일산화질소를 조절 방출할 수 있는 온도 감응성 일산화질소 방출 고분자에 관한 것이다.

본 발명은 2010년 4월 1일부터 2011년 2월 28일까지 한국과학기술연구원이 주관하는 대한민국 교육과학기술부의 미래 유망 파이오니아 연구 사업인 “Nitric oxide 방출 혈액 적합성 스텐트 개발”(과제 번호 20100002175)에 따른 결과물이다.

일산화질소(NO, nitric (mon)oxide)는 다양한 분야에서 유력한 효능을 나타내는 생체 조절 물질이다. 일산화질소는 미국 학술지 사이언스가 선정한 1992년의 “올해의 분자”였으며, 1998년 노벨 생리의학상의 주된 연구 내용이기도 하였다. 일산화질소는 인체내에서 신호 전달 물질 또는 면역 반응에 따른 산물로서 작용하는데, 그 효과는 혈관 확장, 신경 전달, 모발 주기(hair cycle)의 조절, 반응성 질소 함유 중간체의 생성, 발기 조절, 항균 효과, 항바이러스 효과 및 상처 치유 등 다방면에 걸친다.

이러한 일산화질소의 효능 중 혈관 확장 효과가 많은 관심을 끌고 있다. 혈관 내피에서는 일산화질소의 형태로 주위의 평활근에 이완하라는 신호를 전달하고, 이로써 혈관이 확장하고 더 많은 혈류가 흐르게 된다. 일산화질소는 또한 혈관 평활근의 수축과 성장을 막고 내피에서 혈소판의 응집과 백혈구 부착을 방지함으로써 혈관의 항상성 유지에 이바지한다.

스텐트 삽입을 동반하는 혈관 성형술(angioplasty)은 심장으로 향하는 혈관 속에 지방 덩어리가 축적된 환자들에게 시행하는 수술이다. 혈관 성형술에서는 혈관 속에 작은 풍선을 넣어 부풀게 함으로써 지방 덩어리를 혈관 벽으로 바싹 밀어 붙여 혈관 폭을 넓힌다. 그리고 스텐트라고 불리는 관 모양의 망상 골격(mesh scaffold)을 혈관 속에 삽입하여 강제로 혈관 폭을 유지한다. 일부 경우는 혈관벽이 다시 좁아지기 때문에 재수술을 받아야 하는 경우도 있다. 따라서 스텐트에서 세포 성장과 염증을 방지할 수 있는 일산화질소 등의 약물을 조절 방출할 수 있으면 이는 수술의 성공률을 높일 수 있는 좋은 방법이 된다.

스텐트 등의 인공 삽입물 표면에서 일산화질소를 방출할 수 있는 화합물은 여러 가지가 있다. 예를 들어 유기 질산염이나 에스테르, 철-니트로실 착물, 시드논이민(sydnonimine), C-니트로소 화합물, S-니트로소티올(S-nitrosothiol, R-S-NO)이 있다. S-니트로소티올의 경우 가장 많이 연구가 되어왔지만 이를 적용한 삽입물에서 일산화질소가 생체 내로 방출되지 않는 경우도 있으며 구리 이온(Cu⁺) 농도에 의하여 방출 속도가 영향을 받고, 물질 자체가 안정하지 못하여 순수한 상태로 얻어내기 어려운 단점을 가지고 있다.

따라서 최근에는 일산화질소를 더욱 효율적으로 방출할 수 있는 새로운 물질 및 방법에 대한 연구들이 진행되고 있다. 그리고 일산화질소 방출이 더욱 효과적이려면 이러한 인공 삽입물 표면에서 일어나는 방출의 속도를 조절할 수 있는 수단을 가지고 있어야 한다.

일산화질소는 고농도에서 독성을 갖고, 혈관 확장제이기 때문에 신체 내에 너무 많은 양이 존재하면 순환 시스템의 완벽한 붕괴를 일으킨다. 따라서 적절한 농도의 일산화질소를 주위 환경의 신호에 따라 적절한 속도로 방출하거나, 필요한 경우 방출을 억제·지연하되, 주변 환경의 원하지 않는 잡음성 신호에는 방출 특성이 영향을 받지 않는 일산화질소 방출용 전달체를 개발하면 인공 삽입물의 성능을 크게 향상시킬 수 있다. 기존의 일산화질소 전달체의 경우 초반에 방출되는 일산화질소의 양이 과다하여 지속적인 방출을 꾀하기 어려운 문제가 있었다.

본 발명의 기술적 과제는 일산화질소를 체내 삽입물 속에서 지연 방출·조절 방출할 수 있는 고분자 일산화질소 전달체를 개발하는 것이다. 본 발명의 또 다른 기술적 과제는 이러한 고분자 일산화질소 전달체를 표면에 갖춘 체내 인공 삽입물을 제공하는 것이다.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 일산화질소 조절 방출용 전달체를 제공한다. 본 발명의 일산화질소 전달체는 유기 고분자의 주사슬과 이 주사슬에 공유 결합으로 연결되어 있으며, 디아제늄디올레이트 작용기를 갖추고 있는 부사슬을 포함하는 중합체 분자이다. 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 상온에서 액체 등의 유동성이 있는 유체 상태로 존재하다가 생체내 pH 조건에서 임계 온도 이상으로 승온시 졸에서 겔로 상전이를 일으키는데, 이 상 전이의 임계 온도는 25~35℃의 범위에 있고, 상기 겔은 화학 가교 형성이 없이 이루어지는 수화겔(hydrogel)이다.

이러한 수화겔을 얻기 위하여 상기 전달체 중 주사슬의 탄소 골격은 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 공중합체, 락트산/글리콜산 공중합체, 락트산/에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-에틸렌글리콜-에틸렌글리콜 공중합체, ε-카프롤락톤/에틸렌글리콜 공중합체, 3-히드록시부티르산/프로필렌글리콜 공중합체, 푸마르산화프로필렌/에틸렌글리콜 공중합체, 유기포스파젠/에틸렌글리콜 공중합체 또는 폴리펩티드계 블록 공중합체를 이용할 수 있다.

본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체에서 상기 부사슬은 폴리에틸렌이민, 폴리프로필이민, 폴리리신 등의 폴리펩티드 및 키토산 등의 생체 고분자 중에서 선택하는 중합체로 하면 적절하다.

한편 본 발명의 일산화질소 전달체는 수화겔 내부에 약리 효과 물질을 추가적으로 갖추고 있을 수 있다. 적절한 추가적 약리 효과 물질로는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 소염제, 비타민 C, 아세틸살리실산, 고지혈증제, 혈전 용해제, 항혈전제와 헤파린을 들 수 있다.

이러한 약리 효과 물질은 본 발명의 일산화질소 전달체와 직접 공유 결합으로 연결되지 않고 수화겔 내부에 단순 분산되어 있거나, 전달체 부사슬의 디아제늄디올레이트 작용기의 산소 원자에 공유 결합으로 연결된 결합체(conjugate) 형태일 수 있다.

아울러 본 발명에서는 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체로 표면을 전술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 일산화질소 조절 방출용 전달체를 제공한다. 본 발명의 일산화질소 전달체는 유기 고분자의 주사슬과 이 주사슬에 공유 결합으로 연결되어 있으며, 디아제늄디올레이트 작용기를 갖추고 있는 부사슬을 포함하는 중합체 분자이다. 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 상온에서 액체 등의 유동성이 있는 유체 상태로 존재하다가 생체내 pH 조건에서 임계 온도 이상으로 승온시 졸에서 겔로 상전이를 일으키는데, 이 상 전이의 임계 온도는 25~35℃의 범위에 있고, 상기 겔은 화학 가교 형성이 없이 이루어지는 수화겔(hydrogel)이다.

아울러 본 발명에서는 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체로 표면을 피복한 인공 체내 삽입물을 제공한다.

온도 감응성 수화겔 형태의 일산화질소 방출용 전달체 고분자를 제공함으로써 생체내 환경에서 일산화질소를 더 오랜 시간에 걸쳐 안정적이고 생체 적합성 있게 공급할 수 있다. 본 발명의 전달체와 이러한 전달체를 표면에 갖춘 인공 체내 삽입물은 동맥 경화 등 허혈성 장애의 치료, 발기 조절, 항균, 항바이러스 분야 및 상처 치유를 비롯한 의료·건강 용도에서 유용할 것으로 예상된다.

도 1은 본 발명의 한 실시 형태에서 일산화질소 전달체를 이룰 디아제늄디올레이트 작용기 함유 부사슬을 합성하는데 쓰이는 반응기의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 디아제늄디올레이트 작용기 함유 부사슬의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 디아제늄디올레이트 작용기 함유 부사슬의 자외선 스펙트럼을 측정한 그림이다.
도 4는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 디아제늄디올레이트 작용기 함유 부사슬의 일산화질소 방출 특성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 디아제늄디올레이트 작용기 무함유 주사슬-부사슬 복합체의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 디아제늄디올레이트 작용기 무함유 주사슬-부사슬 복합체의 겔화 특성을 온도와 농도에 따라 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 일산화질소 조절 방출용 전달체의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 일산화질소 조절 방출용 전달체의 일산화질소 방출 특성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 일산화질소 조절 방출용 전달체 겔이 혈관 근육 세포의 생장을 억제하는 특성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 더 상세하게 설명한다.

본 발명의 한 측면에서는 체내에 자리 잡을 어떠한 인공적인 장치 표면에 도포되었을 때, 온도 감응성 수화겔을 이룸으로써 일산화질소를 조절 방출할 수 있는 고분자 전달체를 개시한다.

본 발명의 다른 측면에서는 이러한 일산화질소 방출용 고분자 전달체를 표면에 갖춘 인공 체내 삽입물과 체내 삽입용 의료 장비를 개시한다.

본 명세서에서 “조절 방출”이란 일산화질소나 생체내 조건에서 일산화질소를 즉각적으로 생성할 수 있는, 활성 화합물을 인공 체내 삽입물이나 의료 장치의 표면에서 예정한 속도로 방출하는 것을 일컫는다. 조절 방출은 일산화질소나 이 러한 활성 화합물이 삽입물이나 의료 장치 표면으로부터 예측할 수 없이 간헐적으로 방출되거나 어떠한 생체 내 환경 조건에 접하였을 때 폭발적 방출(burst) 형태로 방출되지 않는다는 의미를 내포한다. 다만 온도 감응성 수화겔(thermosensitive hydrogel)이 상전이 온도 이하의 온도에 접하여 수화겔이 해체되어 수화겔 내부의 생체 활성 화합물이 직접 체내 조건에 노출되는 경우와 같이 미리 설계에 의하여 예정된 경우는 예외이다. 일산화질소나 전술한 활성 화합물의 조절 방출을 위한 전달체의 일부 실시 형태에서는 이러한 폭발적 방출이 삽입물이나 의료 장치를 배치한 초기에 일어난 뒤 완만한 속도의 방출이 이어지는 것이 바람직한 경우도 있다. 일산화질소 등의 방출 속도는 정상(定常) 상태(steady state)를 유지하는 방출(서방형(timed release) 또는 제0차 속도론적 방출로도 불린다), 즉 얼마간의 분량을 고르게 예정된 시간 동안 방출(초기 폭발적 방출이 있을 수도, 없을 수도 있음)하는 형태이거나, 한편으로 속도 구배(gradient)형 방출일 수도 있다. 구배형 방출이란 삽입물이나 의료 장치 표면에서 방출되는 일산화질소나 활성 화합물의 농도가 시간이 지나면서 변한다는 의미를 내포한다. 생체내 환경 조건에 직접 노출되었을 때, 일산화질소나 일산화질소를 즉각적으로 생성할 수 있는 활성 화합물의 수명은 매우 짧으므로, 수화겔 형태의 전달체가 이들 분자의 방출을 직접 노출된 경우보다 늦추는 방출 지연 효과를 발휘하는 지연 방출 형태라면 이 또한 본 발명에서 정의하는 조절 방출에 해당된다.

본 명세서에서 “수화겔(hydrogel)”이란 소형 분자(small molecule)가 아닌 유기 분자가 물 분산매 속에 현탁된 반고상(半固狀)의 조직체(network)로서, 이들 유기 분자 사이에 물리적 가교(physical crosslink)가 형성된 수불용성인 유기 분자의 조직을 이룬 것을 일컫는다.

본 명세서에서 “온도 감응성(thermosensitive) 수화겔”이란 실온 이하의 온도에서는 수화겔을 형성할 유기 분자가 물 분산매 속에서 유체, 용액, 졸(sol) 등의 유동성 있는 유체로 존재하다가 임계 온도 이상의 소정의 온도 구간에 해당하는 온도로 승온하면 상전이를 일으켜, 화학적 가교(chemical crosslink)가 없는 수화겔을 형성하는 것들을 일컫는다. 온도 감응성 수화겔은 그 구성 유기 분자의 종류에 따라 온도가 증가하며 졸(등의 유체)→겔의 거동을 나타내거나, 더 복잡하게 졸(등의 유체)→겔→ 졸(등의 유체)와 같은 거동을 나타낼 수도 있으며, 이는 구체적으로 pH와 유기 분자의 농도에도 영향을 받을 수 있다.

본 발명에서 “공중합체”란 특별히 지정하지 않을 경우, 선형 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그라프트 공중합체, 별 모양(star) 공중합체 등 모든 형태를 망라한다. 또한 특별히 지정하지 않을 경우 그 구성 모노머나 반복 단위의 반복 형태 수는 제한이 없다. 예를 들어 에틸렌글리콜 유래 반복 단위를 EG, 프로필렌글리콜 유래 반복 단위를 PG라고 표시한다면, 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 공중합체라고 하였을 때 여기에는 평균 조성이 (EG)_m(PG)_n형태인 랜덤 공중합체는 물론, (EG)_m(PG)_n 조성의 2블록 공중합체, (EG)_l(PG)_m(EG)_n 조성의 3블록 공중합체 등도 포함된다는 의미이다. 또한 예를 들어 락트산-글리콜산-에틸렌글리콜 공중합체에는 락트산 (또는 락타이드) 유래 반복 단위를 L, 글리콜산 (또는 글리콜라이드) 유래 반복 단위를 G라고 하였을 때, 평균 조성이 (G)_l(EG)_m(L)_n 와 같은 조성의 3블록 공중합체는 물론 G 반복 단위와 L 반복 단위가 혼합된 블록(G/L)과 에틸렌글리콜 블록을 포함하는 (EG)_l(G/L)_m(EG)_n 과 같은 조성의 3블록 공중합체도 포함된다. 여기서 예로 든 l, m, n은 양수이다.

본 명세서에서 “인공 체내 삽입물” 또는 줄여서 “(체내) 삽입물”이란 사람 또는 포유동물을 포함한 동물의 체내에서 일산화질소 방출로 생리 효과를 볼 수 있는 위치에 자리 잡으며, 그 표면에 일산화질소 조절 방출용 전달체를 갖출 수 있는 모든 물건을 가리킨다. 이러한 삽입물은 체내에 그 일부분이 삽입되어 있는 이상 반드시 그 물건의 전부가 체내에 존재할 필요는 없는데, 예를 들어 관이나 전선 등의 연결부가 체외로 빠져 나와 있을 수 있다. “체내 삽입용 의료 장비” 또는 줄여서 “(체내) 의료 장비”도 본 명세서에서 전술한 “인공 체내 삽입물”에 준하며, 사람이나 동물의 치료, 시술, 수술, 진단, 검사를 위한 장비를 망라한다. 체내 의료 장비도 그 전체 또는 일부, 예를 들어 의료 장비 전체 중 감지부(probe)나 센서 부분만이 소정의 기간 동안 체내에 삽입되어도 무방하다.

본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 주사슬과 이 주사슬에 화학 결합으로 연결된 부사슬을 포함하여 이루어지는 중합체이다. 화학 결합은 일반적인 경우 공유 결합이지만, 예를 들어 비오틴-아비딘 상호작용과 같이 비공유결합성 분자간 힘이라도 공유 결합에 준하는 강도를 지닌 것은 본 발명에서 주사슬과 부사슬을 잇는 화학 결합에 포함된다. 본 발명의 전달체에서 부사슬은 생체내 조건에 노출되었을 때 일산화질소를 방출할 수 있는 디아제늄디올레이트(diazeniumdiolate) 작용기를 그 측쇄 또는 주탄소 골격의 일부로 갖추고 있다.

본 발명의 전달체는 화학 결합으로 연결된 디아제늄디올레이트 작용기를 가지며, 실온 이하의 온도에서는 졸(sol)이나 유탁액, 용액, 분산액, 액체 등 유동성 있는 상태로 존재하다가, 체내 환경, 즉 체내의 통상적인 pH와 온도 조건에 접하면 상전이를 일으켜 수화 겔을 형성한다. 따라서 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 온도 감응성 수화겔을 형성하는 고분자로서 액상으로 원하는 자리에 투여할 수 있는 이른바 제자리형(in situ) 겔을 만들 수 있어 편리하다.

겔은 고체의 응집적인 특성과 액체의 확산 수송의 성질을 모두 갖추고 있는 다공성 탄성 고체이다. 이러한 겔의 특성은 활성 물질의 조절 방출에 있어서 매우 유리하다. 수화겔은 자연적인 생체 연질 조직과 성질이 유사하며 이들과 상생성이 좋기 때문에 체내 삽입물에 쓰이기에 이상적이다. 일산화질소 발생 작용기를 갖춘 본 발명의 전달체는 인공 체내 삽입물이나 체내 삽입용 의료 장비의 표면에 원하는 농도와 두께로 용이하게 도포할 수 있고, 이 삽입물이나 의료 장비가 체내에 삽입되면 수화겔을 이루어 반응성이 높고 안정성이 낮은 일산화질소가 급격히 감소하지 않고 서서히 방출되게 하는 역할을 맡는다.

본 발명의 한 실시 형태에서 이러한 전달체는 그 주사슬의 탄소 골격이 수화겔의 형성에 주된 역할을 맡는다. 바람직한 한 구체적 실시 형태에서 주사슬을 이루는 중합체는 부사슬에 연결되어 전달체를 완성하는 경우는 물론, 부사슬에 연결되지 않은 독립적 중합체로 존재할 때에도 온도 감응성 수화겔을 형성할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체 주사슬의 탄소 골격을 이룰 수 있는 중합체들의 예를 그 구성 모노머 중심으로 일부만 나타내자면, 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 공중합체, 락트산/글리콜산 공중합체, 락트산/에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-프로필렌글리콜-에틸렌글리콜 공중합체, ε-카프롤락톤/에틸렌글리콜 공중합체, 3-히드록시부티르산/프로필렌글리콜 공중합체, 푸마르산화프로필렌/에틸렌글리콜 공중합체, 유기포스파젠/에틸렌글리콜 공중합체, 폴리펩티드계 블록 공중합체 또는 이들 각각을 두 종류 이상 포함하여 연결된 공중합체를 들 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서는 주사슬의 탄소 골격이 생분해성 중합체인 것이 좋다. 혹은 본 발명의 다른 실시 형태에서는 주사슬의 탄소 골격이 비생분해성 중합체에 생분해를 촉진 또는 유도하기 위한 작용기(예를 들어 에스테르 작용기)를 포함하는 반복 단위를 덧붙인 중합체이거나 당류 등 생체 분자의 결합체(conjugate)일 수도 있다. 이러한 덧붙인 중합체나 생체 분자의 결합체의 주사슬을 지니는 전달체도 온도 감응성 수화겔을 이룰 수 있어야 하는 점은 물론이다. 이 경우 위의 비생분해성 중합체를 전술한 공중합체 중에서 선택할 수 있다는 점은 자명할 것이다.

본 발명의 더욱 구체적인 실시 형태에서 주사슬의 탄소 골격은 블록 공중합체이다. 대표적인 블록 공중합체로는 ABA형 블록 공중합체가 있으며 온도 감응성 수화겔을 형성할 수 있는 고분자로서 ABA형보다 더 복잡한 형태의 블록 공중합체도 많은 사례가 알려져 있다.

수화겔을 형성할 수 있는 ABA형 블록 공중합체는 대개 친수성 블록 또는 분절(segment)과 소수성 블록 또는 분절을 함께 갖추고 있다. 승온시 수화겔을 형성하는 온도 감응성 고분자는 대부분 화학 가교를 포함하고 있지 않아서 온도에 따라 가역적으로 겔을 형성 또는 해체하며, 높은 온도에서 수화겔을 형성하는 원동력은 고온 하에서 소수성 상호작용의 크기 증가이다. 이러한 고분자들은 대개 자기 조립하고 물리적 가교를 형성한다.

수화겔을 형성할 수 있는 유기 고분자에 관하여는 이 분야에 잘 알려져 있으므로 여기서 더 이상 상술하지는 않는다. 이 분야의 당업자라면 일산화질소 전달체의 구체적인 용도에 맞추어 적절한 상전이 온도에서 상전이하고, 수화겔 상태로 유지되는 온도 영역이 적절한 범위에 있는 고분자를 전술한 종류의 공중합체 중에서 선택하고, 필요한 경우 변형하여 설계할 수 있을 것이다.

본 발명의 전달체의 주사슬에 쓰일 수 있는 블록 공중합체의 적절한 예를 일부만 들자면, 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 (PEG-PPG-PEG) 3블록 공중합체가 있다. 시판되는 이 3블록 공중합체로는 독일 BASF사의 pluronic F127(상표명)이 있는데, 그 평균 조성은 (EG)₉₉-(PG)₆₅-(EG)₉₉(분자량 12,600)이다. 플루로닉 F127은 미국 식품의약청(FDA)에서 인간에게 사용을 승인한 생적합성, 생흡수성 고분자이다.

본 발명의 더욱 구체적인 실시 형태에서는 전달체의 주사슬이 전술한 PEG-PPG-PEG 3블록 공중합체이며, 그 중에서 그 분자량이 4600~12600 범위에 있는 것을 사용하면 적절하다.

본 발명의 전달체에서 부사슬은 주사슬에 화학 결합으로 연결되는 중합체이며, 일산화질소를 생성·방출하는 디아제늄디올레이트 작용기를 그 중합체 사슬의 골격 의 일부로 포함하거나, 측쇄 작용기로서 포함한다.

본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체의 주사슬은 온도 감응성 수화겔을 형성하는 역할을 하므로 일산화질소를 생성할 수 있는 작용기를 포함하기 힘들다. 일산화질소는 빛, 열, 습도 조건이 최적에서 벗어날 경우 극히 반응성이 높다(labile). 따라서 적절한 길이여서 수화겔 형성을 방해하지 않고, 일산화질소를 생성·방출할 수 있는 작용기를 가지는 부사슬을 상기 주사슬에 화학 결합으로 연결하면 일산화질소의 체내 방출 시간을 늘릴 수 있다.

본 발명 전달체의 부사슬에서 일산화질소를 방출하는 작용기인 디아제늄디올레이트(diazeniumdiolate)는 노노에이트(NONOate)로도 불리는데, 그 일반식은 RR'N-N(O)=NOR"으로 나타낼 수 있다. 디아제늄디올레이트 화합물은 고체 형태로 안정하게 보관할 수 있으며, 물에 대한 용해도가 높고, 노노에이트 작용기가 연결된 나머지 부분의 구조에 따라 방출 속도와 방식 등의 방출 형태를 조절할 수 있다. 그리고 생체 온도와 pH 조건에서 분해될 뿐만 아니라, pH에 따라 다양한 방출 형태를 가지며 한 단위의 디아제늄디올레이트 작용기 당 2분자의 일산화질소를 방출하므로 전달체에 포함시켰을 때 상대적으로 높은 농도의 일산화질소 발생이 가능하다는 장점이 있다.

디아제늄디올레이트는 다음 화학식 1에 나타낸 것처럼 2급 아민에 일산화질소를 반응시켜 얻을 수 있다.

디아제늄디올레이트 작용기를 포함하는 부사슬을 제조하려면, 부사슬로서 그 사슬 골격 속에 2급 아민 질소를 포함하거나(즉 위 화학식 1에서 R¹-N-R²이 사슬의 주된 길이 방향을 따라 그 속에서 연결되어 있는 경우), 혹은 그 측쇄에 2급 아민 질소를 지니는 올리고 중합체를 사용할 수 있다.

본 발명의 한 실시 형태에서는 2급 아민 질소를 함유하는 이러한 올리고 중합체를 먼저 주사슬에 화학 결합으로 연결한 다음, 연결된 유기 고분자에 일산화질소를 반응시킨다.

디아제늄디올레이트는 위 화학식 1의 R¹과 R²에 해당하는 작용기를 조절함으로써 일산화질소 방출 특성을 조절할 수 있다. 그리고 화학식 1에 나타내었듯이, 디아제늄디올레이트는 전자 밀도가 집중되어 있는 산소 원자를 가지고 있으므로, 부사슬내 디아제늄디올레이트의 산소 원자에 다른 약리 활성 물질을 연결한 결합체(conjugate) 형태로 일산화질소 외의 다른 활성 물질을 전달체 내에 포함하게 할 수도 있다.

본 발명의 한 실시 형태에서는 부사슬의 탄소 골격을 폴리에틸렌이민, 폴리프로필아민, 폴리리신 등의 폴리펩티드 및 키토산 등의 생체 고분자 중에서 선택할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서 부사슬은 폴리에틸렌이민 골격이며, 그 중에서도 가지친 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)인 것이 바람직하다. 본 발명의 한 구체적 실시 형태에서 부사슬로는 (주사슬에 연결되지 않고 독립적으로 존재하는 경우를 가정하였을 때의) 분자량이 25000 이하인 폴리에틸렌이민 중합체를 사용하면 적당하다. 분자량이 위 범위에 있으면 세포 내에서 독성을 방지할 수 있어서 바람직하기 때문이다. 더욱 바람직한 실시 형태에서는 상기 폴리에틸렌이민 중합체의 분자량이 12000 이하이다.

본 발명의 다른 실시 형태에서는 상기 가지친 폴리에틸렌이민이 주사슬 골격과의 화학적 결합을 위한 측쇄를 가지 부분에 포함한다. 더 구체적인 실시 형태에서 이 측쇄는 일급 알킬렌아민이다. 더 특정적인 실시 형태에서는 이 알킬렌아민은 bPEI의 사슬 골격의 일부를 이루는 질소 원자에 알킬렌아민의 탄소 원자를 통하여 연결되어 있다. 여기서 이 가지친 폴리에틸렌이민은 가지 없는 에틸렌이민 반복 단위와 더불어 가지친 에틸렌이민 반복 단위를 함께 포함하는 것이 용해도 측면에서 바람직하다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 부사슬을 이루는 가지친 폴리에틸렌이민으로는 아래 화학식 2와 같은 형태의 중합체를 사용할 수 있다.

화학식 2의 가지친 폴리에틸렌이민의 적절한 분자량 범위는 25000 이하, 더 바람직하게는 12000이하이고, x:y는 보통 판매되는 물질이 1:2이다.

본 발명의 한 실시 형태에서 일산화질소 전달체에서 부사슬을 이루는 bPEI에 디아제늄디올레이트 작용기를 얼마나 많이 도입하여야 하는지는 특별한 제한이 없다. 2급 아민 작용기 중 디아제늄디올레이트로 변환되는 비율은 전형적인 경우에 50% 이상 정도이나, 반드시 이 비율에 구애받는 것은 아니다. 보통의 경우 가능한 한 디아제늄디올레이트의 변환율을 높게 하는 것이 바람직한 때가 많지만 궁극적으로는 이 분야의 평균적 기술자가 전달체에서 원하는 최종적인 일산화질소 방출 특성에 따라 디아제늄디올레이트화 반응 조건을 적당하게 조절함으로써 가감이 가능하다.

본 발명의 한 특정 실시 형태에서는 상기 화학식 2의 가지친 폴리에틸렌이민을 부사슬의 중간체로, PEG-PPG-PEG 3블록 공중합체를 주사슬의 중간체로 사용하며, 상기 가지친 폴리에틸렌이민의 측쇄 1급 아민의 질소와 3블록 공중합체 말단의 산소를 클로로포름산 에스테르(chloroformate ester)를 사용하여 카르밤산 연결부(carbamate linkage)로 이어줄 수 있다.

본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체는 생체내 온도와 pH 조건에서 수화겔을 형성하는데, 여기서 생체내 온도와 pH 조건에 해당하는 값은 당업자가 필요에 따라 적절한 범위에서 설정할 수 있다. 예를 들어 인체를 기준으로 할 때, 생체내 온도와 pH 조건은 승온시 졸에서 겔로 상전이를 일으키는 상전이의 임계 온도가 25~35℃의 범위이고, pH가 5.5~8.0인 것이 적당하다.

통상적으로 수화겔 형성을 위하여 전달체를 상전이 임계 온도 이하에서 삽입물 또는 의료 장비의 표면에 물 분산액 형태로 도포하게 된다. 일산화질소 조절 방출용 전달체는 물 분산매 속에서 그 농도에 따라서도 수화겔 상전이 온도가 달라질 수 있다. 도포를 위한 적절한 분산 농도 역시 이 분야의 평균적 기술자가 수화겔에서 원하는 기계적, 화학적 물성과 방출 속도 특성에 맞춰 적절하게 정할 수 있다. 모든 전달체 고분자에 대하여 일괄적으로 적절한 분산 농도를 제시할 수는 없고, 사용한 구체적인 물질에 따라 달라지지만 대개 10~30% 농도 범위에서 분산하면 적당하다. 구체적인 예를 들자면 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 주사슬과 1급 에틸렌아민 측쇄를 지니는 가지친 폴리에틸렌이민 부사슬로 이루어진 일산화질소 전달체의 경우는 pH 5.5~8.0에서 분산액 전체 중량 기준으로 전달체가 15~25 중량%를 차지하도록 하여 분산액을 제조하면 적절하다.

본 발명의 일산화질소 전달체는 일산화질소 외에도 다른 약리 효과 물질을 더 포함할 수 있다. 이러한 약리 효과 물질은 전달체 고분자에 화학 결합으로 연결된 결합체(conjugate) 형태로 고정될 수도 있고, 수화겔 속에 화학 결합 없이 단순 분산되어 있을 수도 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서는 약리 효과 물질이 부사슬 디아제늄디올레이트 작용기의 산소 원자에 공유 결합되어 고정된다. 적절한 고정 방식으로는 예를 들어 O-알킬화가 있다. 또 다른 실시 형태에서는 디아제늄디올레이트의 음전하에 양전하를 띠는 약리 효과 물질 또는 그 유도체가 전기적으로 결합되어 있다. 본 발명의 다른 실시 형태에서는 상기 약리 효과 물질이 전달체를 분산하는 분산매(물 또는 수용액) 속에 포함되고, 수화겔 형성 후 서서히 방출된다.

본 발명의 추가적 약리 효과 물질은 특별히 한정되지 않으나, 혈전 형성이나 혈액 응고를 방지하는 물질, 항산화제, 소염제, 상처 치유 촉진 물질 등을 포함하면 일산화질소 방출형 스텐트 등의 용도에 본 발명의 전달체가 쓰였을 때 상승 효과를 낼 수 있어 바람직하다. 이러한 경우에 해당하는 약리 효과 물질의 예를 일부만 들자면, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 소염제, 비타민 C, 아세틸살리실산, 고지혈증제, 혈전 용해제, 항혈전제와 헤파린이 있다.

본 발명의 다른 측면에서는 전술한 일산화질소 조절 방출용 전달체로 표면을 피복한 인공 체내 삽입물과 체내 삽입용 의료 장비를 개시한다.

이러한 피복 인공 체내 삽입물과 체내 삽입용 의료 장비는 일산화질소의 조절 방출이 삽입물이나 의료 장비 본연의 효과를 향상시키는데 도움이 되는 경우는 물론, 오로지 일산화질소 또는 일산화질소와 추가적 약리 효과 물질 방출 자체를 목적으로 하는 경우를 모두 망라한다. 특히 일산화질소는 혈관 평활근의 이완 효과 외에도 상처 치유 촉진과 신경 전달 조절 효과가 있으며, 특히 살균, 살바이러스 효과도 있다. 바이러스 중에서 사람 파필로마바이러스(hPV)에 대한 살바이러스 효과가 뛰어나다.

또한 본 발명의 전달체는 혈액에 접촉하는 화학 센서의 기능을 보조하는 용도로 쓰이거나 그 자체가 일산화질소의 농도를 측정하는 화학 센서의 일부로 기능할 수도 있다. 이 경우에는 디아제늄디올레이트 작용기를 지니지 않고 2급 아민을 갖춘 부사슬을 포함하는 주사슬-부사슬 중합체를 삽입물이나 의료 장비 표면에 도포할 수 있다. 수화겔 속으로 스며든 체내에서 생성된 일산화질소가 주사슬-부사슬 중합체 속의 2급 아민과 반응하여 디아제늄디올레이트를 생성함으로써 본 발명의 전달체가 얼마나 생성되는지 정량함으로써 본 발명의 전달체를 화학 센서로 사용할 수 있다.

본 발명의 체내 삽입물 또는 의료 장비의 예를 일부만 들자면 스텐트, 카테터, 피하 이식편(subcutaneous implant), 화학 센서, 도관(lead), 심장 박동기(pacemaker), 이식 혈관편(vascular graft), 상처용 드레싱(dressing), 남성기 삽입물(penile implant), 삽입용 심박 발생 장치(implantable pulse generator, IPG), 삽입용 심장 제세동기(除細動器 cardiac defibrillator)와 신경 흥분기(nerve stimulator)가 있다.

체내 삽입물 또는 의료 장비의 표면에 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체를 피복하는 방법은 이 분야에서 널리 알려져 있는 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 이 분야의 평균적 기술자라면 적절하게 용도에 맞게 응용할 수 있으므로 여기서 상술하지 않는다. 예를 들어 체내 삽입물이나 의료 장비를 전달체 용액 속에 침지하여 표면을 피복할 수 있다. 그밖에 체내 삽입물이나 의료 장비를 표면 처리하여 더 밀접한 피복을 할 수도 있다.

[실시예]

이하 제조예와 실험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 아래 실시예는 본 발명을 예시로써 상세하게 설명하기 위한 것이며, 어떠한 경우라도 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다.

디아제늄디올레이트 작용기를 포함하는 가지친 폴리에틸렌이민( bPEI - NONOate )

1급 아민 측쇄를 가지는 반복 단위와 에틸렌이민의 공중합체인 가지친 폴리에틸렌이민(bPEI)(중량 평균 분자량 600, 10000, 25000)을 (미국 Polysciences사, 아미노기의 비율은 약 1급:2급:3급=25:50:25) 각각 0.5 g씩 100 mL 들이 비이커에 넣고 10 mL의 메탄올과 20 mL의 테트라하이드로퓨란(THF)을 가하고 30분 동안 교반하면서 녹였다.

각 bPEI 내 함유된 1급~3급 전체 아민의 양과 같은 당량인 메톡시화나트륨(NaOMe, 0.63 g)을 메탄올 10 mL에 녹이고, 이를 위 bPEI를 담은 비이커 속에 넣어 주었다. 이 반응 비이커들을 반응기 속에 넣고 20 psi의 아르곤 기체로 두 번 배기(purging) 시킨다. 그 후 반응기에 80 psi의 일산화질소를 넣어주고 3일간 반응시킨다. 도 1은 이러한 반응에 사용되는 반응기를 나타낸 모식도이다. 생성된 bPEI-NONOate는 디에틸에테르로 침전시켜 분리하였다.

화학식 3은 bPEI-NONOate의 생성 과정을 나타낸 반응식이다. 화학식 3에서 2급 아민 반복 단위(반복 단위 수 y) 중 일부는 염기하에서 일산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트 작용기로 바뀌고(반복 단위 수 z) 나머지는 반응하지 않고 2급 아민으로 남는다(반복 단위 수 w).

생성된 bPEI - NONOate 의 특성 분석

1)디아제늄 디올레이트 작용기 형성 확인

얻은 각각의 bPEI-NONOate가 실제로 디아제늄디올레이트 작용기를 가지는지는 핵자기 공명(NMR)을 통해서 정량하였다. 도 2는 위 반응 생성물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다. 화학식 3의 왼쪽 bPEI 분자에서 3급 아민의 α-수소(도 2에서 a 위치)는 ¹H-NMR에서 δ 2.6 ppm에 나타나지만, 디아제늄디올레이트 작용기가 생성되면 종전 3급 아민의 α-수소이던 도 2의 b 위치의 수소는 δ 3.1 ppm에 신호가 나타나게 된다. 도 2에 나타낸 것과 같이, 생성물의 NMR 스펙트럼을 분석한 결과 bPEI의 2급 아민 중에서 분자량 600인 bPEI(bPEI600)의 경우는 15.3%(도 2(a)), 분자량 10000인 bPEI(bPEI10K)의 경우는 13.8%(도 2(b)), 분자량 25000인 bPEI(bPEI25K)의 경우는 16.0%(도 2(c))가 디아제늄디올레이트로 전환되었음을 확인하였다. 이하의 명서세 기재에서 도 2(a)의 스펙트럼으로 확인한 분자량 600의 bPEI 디아제늄디올레이트는 bPEI600-NONOate, 도 2(b)의 스펙트럼으로 확인한 분자량 10,000의 bPEI 디아제늄디올레이트는 bPEI10K-NONOate, 도 2(c)의 스펙트럼으로 확인한 분자량 10,000의 bPEI 디아제늄디올레이트는 bPEI25K-NONOate로 각각 줄여서 일컫는다.

2) 디아제늄디올레이트의 분광 분석.

bPEI의 2급 아민으로부터 디아제늄디올레이트 작용기가 생성되면 자외선 흡광 분석에서 일반적으로 250~260 nm 부근에서 흡수 피크가 나타난다. 도 3은 200~400 nm에서 합성한 bPEI-NONOate들의 자외선 스펙트럼을 측정한 그림이다. 도 3에서 bPEI600, bPEI10K와 bPEI25K는 각각 반응 전의 분자량 600, 10000 및 25000의 bPEI이고, bPEI600-NO, bPEI10K-NO와 bPEI25K-NO는 해당 디아제늄디올레이트화물을 가리킨다. 자외선 분광 결과 상기 세 가지 bPEI-NONOate는 반응 전의 bPEI와는 달리 250~260 nm에서 빛을 흡수하는 것을 확인하였다.

3) 일산화질소 방출 분석.

일산화질소 방출 분석은 일반적인 검출 방법인 Griess 분석법(H. H. H. W. Schmidt and M. Kelm, in Methods in Nitric Oxide Research, ed. M. Feelish and J. S. Stamler, Wiley & Sons, New York, 1996. 참조)를 이용하였다. 반응성이 큰 일산화질소는 반응 용매 속의 산소나 수분과 반응하여 이산화질소를 낳고 이 이산화질소는 술판일아미드(sulfanilamide)와 반응하여 활성화되며, 다시 이 활성화된 물질은 나프틸렌디아민과 반응하여 548 nm의 빛을 흡수하는 아조 화합물을 생성한다.

이러한 원리를 사용하여 위에서 합성한 세 가지 bPEI-NONOate를 분석한 결과를 는 도 4에 정리하였다. 도 4의 약어 설명은 위 도 3과 동일하다. bPEI-NONOate 분자량에 따라서 일산화질소의 방출에 두드러진 차이가 있지는 않았는데, bPEI 분자량 10,000의 bPEI-NONOate가 초반 방출량이 가장 많았고, 가장 빠르게 방출하였고, 약 24시간 동안 방출하였다. bPEI 분자량 25,000의 bPEI-NONOate는 초반 방출량이 두번째로 많았고, 약 11시간 동안 방출하였다. bPEI 분자량 600인 bPEI-NONOate는 초반 방출량이 가장 적었으며, 가장 오랜 시간 동안(54시간) 천천히 방출하였다. 따라서 다음 실험을 위해서는 bPEI600-NONOate를 선택하였다.

디아제늄디올레이트 작용기가 없는 주사슬 - 부사슬 복합체

(1) F127-bPEI의 합성

분자량이 12,600인 Pluronic F127(BASF사 등록 상표) 10.0 g을 250 mL 들이 둥근바닥플라스크에 넣고 이를 염화메틸렌 70 mL에 녹인 다음 질소로 배기시켰다. 1.29 g의 클로로포름산파라니트로페닐(p-Nitrophenyl chloroformate, p-NPC)을 염화메틸렌 70 mL에 녹이고 적하 깔때기(dropping funnel) 속에 넣는다. Pluronic F127을 질소 상태에서 교반하면서 여기에 p-NPC를 떨어뜨리며 반응시키고 12시간 동안 진행하여 말단 활성화된 플루로닉 F127을 얻는다. 이 생성물의 분리는 디에틸에테르 침전법을 사용하였다. 이어서 말단 활성화된 플루로닉 F127에 bPEI를 반응시켜 그 말단에 bPEI를 연결할 수 있다. 전체 반응식을 아래 화학식 4에 정리하였다. 화학식 4에서 F127-bPEI는 bPEI가 말단에 결합된 플루로닉 F127을 가리킨다.

더 구체적으로, 전술한 NPC-말단 활성화된 플루로닉 F127에 대하여 bPEI600을 과량으로 반응시키되, 당량비를 각각 1:1.5(F127-bPEI0.8), 1:3(F127-bPEI1.0), 1:10(F127-bPEI1.3)으로 하여 디아제늄디올레이트 작용기를 포함하지 않는 세 가지 주사슬-부사슬 복합체를 생성하였다.

F127-bPEI0.8은 다음과 같은 방법으로 합성하였다. bPEI600 43 mg(1.5 당량)을 100 mL 들이 둥근바닥플라스크에 넣고 20 mL의 염화메틸렌과 1 mL의 트리에틸렌이민 속에 녹인 후 질소로 배기하였다. 전술한 말단 활성화 플루로닉 F127 0.6 g(1 당량)을 20 mL의 염화메틸렌에 녹이고 적하 깔때기 속으로 옮겼다. bPEI를 얼음 중탕의 질소 분위기에서 교반하면서 상기 말단 활성화 플루로닉 F127을 떨어뜨리며 반응시키고 12시간 동안 진행하여 F127-bPEI0.8를 얻었다. 합성된 F127-bPEI는 MWCO dialysis 10000의 분리막으로 투석하여 불순물을 제거하고, 동결 건조하여 최종 생성물을 수득한다. F127-bPEI1.0과 F127-bPEI1.3은 각각 bPEI(MW 600) 86 mg(3 당량), 289 mg(10 당량)과 말단 활성화 플루로닉 F127 0.6 g(1 당량)을 사용한 것 외에는 F127-bPEI0.8과 동일한 방법으로 얻을 수 있다.

생성된 F127- bPEI 의 특성 분석

(1) 플루로닉 F127과 bPEI의 결합 확인

위와 같이 하여 얻은 세 가지 주사슬-부사슬 복합체에서 플루로닉 F127이 bPEI와 카르밤산 연결부를 통하여 연결되었는지 여부는 ¹H-NMR을 통해서 정량하였다. 주사슬-부사슬 복합체의 핵자기 공명 스펙트럼은 도 5에 나타내었다. 도 5에서 a와 c로 표시하였듯이, 일반적으로 플루로닉 F127은 ¹H-NMR에서 크게 메틸 수소(a)와 메틸렌 수소(c)가 구별되어 나타난다. 프로필렌글리콜 유래 반복 단위의 메틸 수소 a는 δ 1.15 ppm에서, 나머지 메틸렌 수소 c는 δ 3.2~4.0 ppm에서 신호를 볼 수 있다. 또한 bPEI의 탄소 결합 수소(b)는 ¹H-NMR에서 δ 2.6 ppm 부근에 나타난다. 도 5의 (1)은 반응하지 않은 플루로닉 F127, (2)는 생성된 F127-bPEI0.8, (3)은 생성된 F127-bPEI1.0, (4)는 생성된 F127-bPEI1.3의 ¹H-NMR 스펙트럼을 각각 가리킨다. 도 5의 NMR을 통해서 분석한 결과, 플루로닉 F127의 주사슬의 말단 히드록시기 중에서 F127-bPEI0.8은 40.0%, F127-bPEI1.0은 50.0%, F127-bPEI1.3은 62.5%가 bPEI에 결합하고 있음을 확인하였다.

2) 젤 형성 확인

플루로닉 F127과 bPEI의 주사슬-부사슬 복합체도 플루로닉 F127처럼 온도 감응성 수화겔을 형성할 수 있는지, 그리고 그렇다면 겔화 특성에 어떠한 변화가 있는지 살펴보기 위해서 겔화 시험을 수행하였다. 여러 가지 농도(질량 퍼센트)로 물에 분산한 주사슬-부사슬 복합체를 주위 온도를 바꿔가며 뒤집어 보았을 때 용액이 흐르면 용액(졸) 상태라고 하며 흐르지 않으면 겔 상태로 판단함으로써 온도와 농도에 따른 졸-겔 여부를 기록하였다(inverted gelation test). 시험 결과는 도 6에 그래프로 나타내었다. 생성된 주사슬-부사슬 복합체 모두는 플루로닉 F127보다 더 낮은 농도에서도 겔을 형성할 수 있었다. 안정성 면에서는 F127-bPEI0.8, F127-bPEI1.0, F127-bPEI1.3순으로 안정한 겔을 형성하였다. 따라서 세 복합체 모두 전달체를 만드는데 적합한 전구체에 해당된다.

디아제늄디올레이트 작용기를 가지는 전달체 F127- bPEI - NONOate

(1) F127-bPEI-NONOate의 합성

F127-bPEI 0.46 g을 100 mL 들이 비이커에 넣고 5.3 M의 메톡시화나트륨 0.23 mL와 메탄올 2.07 mL, 테트라하이드로퓨란 2.3 mL를 넣어 주었다. 이 반응 비이커를 도 1에 나타낸 반응기 속에 넣고 20 psi의 아르곤으로 두 번 배기하였다. 그 후 80 psi의 일산화질소를 넣어주고 3일 동안 반응시켰다. 이 반응의 생성물을 디에틸에테르로 침전시켜 분리하였다. 반응식은 화학식 5에 나타내었다.

F127-bPEI-NONOate의 특성 확인

1) 디아제늄디올레이트 작용기 형성 확인

F127-bPEI1.3-NONOate에 디아제늄디올레이트 작용기가 생성되었는지 여부는 NMR을 통해서 정량하였다. 그 핵자기 공명 스펙트럼은 도 7에 나타내었다. 일반적으로 F127-bPEI는 ¹H-NMR에서 세 곳에서 피크를 나타낸다. 플루로닉 F127의 프로필렌글리콜 유래 반복 단위의 메틸 수소(도 7의 a)가 δ 1.15 ppm에서 나타나게 되며 나머지 메틸렌 수소(도 7의 c)들은 δ 3.2~4.0 ppm에서 피크가 나타난다. 또한 일반적으로 bPEI의 메틸렌 수소(도 7의 b)들은 ¹H-NMR에서 δ 2.6 ppm 부근에 나타나지만 메틸렌 수소 중 디아제늄디올레이트 작용기의 α-위치 수소(도 7의 d)는 δ 2.9 ppm 부근에서 나타나게 된다.

도 7에서 (1)은 생성된 F127-bPEI0.8-NONOate, (2)는 생성된 F127-bPEI1.0-NONOate, (3)은 생성된 F127-bPEI1.3-NONOate의 ¹H-NMR 스펙트럼을 각각 가리킨다. NMR을 통해서 분석한 결과, 전달체 형성 과정에서 반응 전 복합체의 2급 아민기 중 F127-bPEI0.8-NONOate의 경우는 35.1%, F127-bPEI1.0-NONOate의 경우는 33.1%, F127-bPEI1.3-NONOate의 경우는 35.1%가 각각 디아제늄디올레이트 작용기로 전환되었음을 확인하였다.

2) 수화겔 형성 실험

F127-bPEI-NONOate 전달체에 대하여 온도 감응성 수화겔 형성 실험을 수행한 결과, 도 6에 나타낸 F127-bPEI 복합체의 경우와 유사하게 수화겔을 형성하는 것을 확인하였다(데이터 미도시). 전술한 세 종류의 F127-bPEI-NONOate 모두가 F127-bPEI와 마찬가지로 온도 감응성 수화겔을 안정적으로 형성하였다.

3) 일산화질소 방출 분석.

bPEI-NONOate에서와 마찬가지로 Griess 분석법으로 수화겔을 형성한 F127-bPEI-NONOate 전달체의 일산화질소의 방출을 분석하였다. 도 8에 분석 결과를 정리하였다. F127-bPEI600-NONOate의 경우 총 방출되는 일산화질소의 반감기가 1분 이내(도 8)였지만 F127-bPEI1.0-NONOate와 F127-bPEI1.3-NONOate의 경우 반감기가 약 1.6 시간 내지 2.4 시간이 되어, 100배 이상의 느린 속도로 방출하였다.

4) 세포 독성 시험

전술한 세 종류의 F127-bPEI-NONOate 중에서 가장 넓은 영역에서 수화겔을 형성하고, 일산화질소의 방출의 반감기도 긴 F127-bPEI1.3-NONOate를 가지고 세포 독성 실험(일본 도진도社의 CCK-8 키트로 분석)을 하였다. 시험군에서는 혈관 내피 세포주인 사람 탯줄 정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)) 또는 혈관 평활근(SMC) 세포주인 관상 동맥 평활근 세포(Coronary Artery Smooth Muscle Cell)를 F127-bPEI1.3-NONOate 수화겔 상에서 배양하고 세포 수를 측정하였다. 대조군에서는 같은 세포들을 일반 24 well 플레이트 위에서 배양하였다. 시험 결과는 도 10에 나타내었다.

도 9의 그래프를 보면 혈관 평활근 세포주 관상 동맥 평활근 세포는 대조군 조건에서보다 F127-bPEI1.3-NONOate 수화겔 상에서 생장이 63.5%나 저하되었다. 하지만 혈관 내피 세포주 HUVEC는 대조군 조건과 F127-bPEI1.3-NONOate 수화겔 위의 생장률이 거의 비슷하였다.

도 9의 결과를 통하여 본 발명의 일산화질소 조절 방출용 전달체가 혈관 내피 세포와 혈관 근육 세포에 차별적인 생리 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 일산화질소 전달체를 여러 가능 용도 중 스텐트에 사용할 경우 재협착을 안전하고 효율적으로 방지할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.

이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 당업자에게 본 발명을 상세히 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미 한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다.

Claims

일산화질소 조절 방출용 전달체에 있어서,
상기 일산화질소 조절 방출용 전달체는
유기 고분자의 주사슬;
상기 주사슬에 공유 결합으로 연결되며, 디아제늄디올레이트 작용기를 갖추고 있는 부사슬;을 포함하는 중합체이고,
상기 주사슬의 골격은 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 공중합체, 락트산/글리콜산 공중합체, 락트산/에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-에틸렌글리콜 공중합체, 락트산-글리콜산-프로필렌글리콜-에틸렌글리콜 공중합체, ε-카프롤락톤/에틸렌글리콜 공중합체, 3-히드록시부티르산/프로필렌글리콜 공중합체, 푸마르산화프로필렌/에틸렌글리콜 공중합체, 및 유기포스파젠/에틸렌글리콜 공중합체로 이루어지는 군에서 선택하는 블록 공중합체이고,
상기 부사슬의 골격은 폴리에틸렌이민, 폴리프로필이민 및 폴리리신으로 이루어지는 군에서 선택하는 중합체이고,
상기 일산화질소 조절 방출용 전달체의 중합체는 승온시 졸에서 겔로 상전이를 일으키되, 이 상전이의 임계 온도가 25~35℃의 범위에 있고, 상기 임계 온도 이상의 온도와 생체내 pH 조건에서 화학 가교가 없는 수화겔(hydrogel)을 형성하는 일산화질소 조절 방출용 전달체.
제1항에 있어서,
상기 주사슬의 골격은 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 공중합체인 것을 특징으로 하는 일산화질소 조절 방출용 전달체.
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제1항에 있어서,
상기 일산화질소 조절 방출용 전달체가 수화겔 내부에 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 소염제, 비타민 C, 아세틸살리실산, 고지혈증제, 혈전 용해제, 항혈전제 및 헤파린으로 이루어지는 군에서 선택하는 하나 이상의 약리 효과 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화질소 조절 방출용 전달체.
제4항에 있어서, 상기 약리 효과 물질은 상기 일산화질소 조절 방출용 전달체에 공유 결합으로 연결되지 않고 수화겔 내부에 단순 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 일산화질소 조절 방출용 전달체.
제4항에 있어서, 상기 약리 효과 물질은 디아제늄디올레이트 작용기의 산소 원자에 공유 결합으로 연결된 결합체(conjugate)인 것을 특징으로 하는 일산화질소 조절 방출용 전달체.
제1항의 일산화질소 조절 방출용 전달체로 표면을 피복한 인공 체내 삽입물.
제7항에 있어서, 상기 인공 체내 삽입물은 스텐트, 카테터, 도관(lead), 피하 이식편(subcutaneous implant), 화학 센서, 심장 박동기(pacemaker), 이식 혈관편(vascular graft), 상처용 드레싱(dressing), 남성기 삽입물(penile implant), 삽입용 심박 발생 장치(implantable pulse generator, IPG), 삽입용 심장 제세동기(除細動器 cardiac defibrillator) 및 신경 흥분기(nerve stimulator)로 이루어지는 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 인공 체내 삽입물.